KR101297942B1 - 글루카곤형 펩티드의 합성 - Google Patents

글루카곤형 펩티드의 합성 Download PDF

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Abstract

GLP-1 펩티드의 신규 합성 방법에 관한 발명이다.

Description

글루카곤형 펩티드의 합성 {SYNTHESIS OF GLUCAGON-LIKE PEPTIDE}
본 발명은 펩티드 약물 합성, 즉 GLP-1 펩티드 아고니스트를 합성하는 신규 방법 분야에 관한 것이다.
당뇨병 약물의 신규 계열인, GLP-1 또는 글루카곤형 펩티드 1 아고니스트는 치료용 화합물의 유망한 신규 계열이다. 표준 고체상 펩티드 합성 기술에 의한 그의 제조는, 기본적으로 인간 GLP-1은 글루카곤에 대한 서열과 관련되어 자연적으로 발생하는 것이지만, 모두 쉬운 것은 아니다. 천연 GLP-1의 다양하고, 미세하게 변형된 조작 서열 변이체는 잠재력을 증가시키는 목적으로 문헌에 기재되고 있다.
상기 GLP-1 펩티드의 제조는 WO 05/027978 및 WO 02/90388에 기재되어 있다; 그러나, 아주 기본인 것이나 다름없는 표준 Fmoc 고체상 방법이 펩티드 합성을 위해 사용되고 있다.
본 발명의 출원인은 양호한 수율을 얻지 못하는 선행 기술의 접근이 산업적 제조를 위해 받아들여지지 않는다는 것을 발견했다. 명백하게 서열 의존적인 각각의 커플링 단계가 매우 비효율적인 것으로 발견되었다.
본 발명의 목적은 GLP-1 펩티드 아고니스트를 합성하는 개선되거나 다른 방법을 고안하는 것이다.
상기 목적은 고체상 합성 시, 특정 내부 서열 위치에서 단지 단일 Fmoc-아미노산을 대신하여 Fmoc-유사프롤린 디펩티드 단위를 사용하는 것을 포함하는 본 발명의 방법에 의해서 설명된다.
본 발명에 따라서, 하기의 a 및 b 단계를 포함하는, GLP-1 또는 GLP-1 아고니스트 펩티드를 제조하는 방법이 고안되었고, 여기서 상기 펩티드는 하기의 화학식
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- Val - Ser - Ser -Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-R5-(R6)w-(R7)z-B
또는 화학식
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- Val - Ser -B
또는 화학식
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- Val - Ser - Ser -B
또는 화학식
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- Val - Ser - Ser -Tyr-Leu-Glu-Gly-B
또는 화학식
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- Val - Ser - Ser -Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-B
또는 화학식
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp- Val - Ser - Ser -Tyr-Leu-Glu-Rδ-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-Gly-B
중의 것이다:
(식 중,
B = -OH 또는 -NH2,
A = H-, Ac-, Boc-, Fmoc-,
R1 = His, D-His, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 또는 α-메틸-히스티딘,
R2 = -Ala, D-Ala, -Val, D-Val, Gly, Aib (α-아미노이소부틸산),
R3 = Glu, Asp, Met, Leu, 바람직하게는 Glu 또는 Asp, 가장 바람직하게는 Asp,
R4 = -Lys 또는 Arg,
R5 = -Gly, Aib, Ala, D-Ala,
R6 = Arg, Lys 또는 Gly,
R7 = Arg, Lys 또는 Gly, 바람직하게는 Lys 또는 Gly,
R8 = Gly 또는 Aib,
여기서, 독립적으로 x, y, w, z은 0 또는 1이고, 단, x=1인 경우 y=1이고, 단, z=1인 경우 w=1이고,
여기서, 개별적인 아미노산은 임의로 보호기를 가질 수 있다),
a. Fmoc-보호된, 임의로 추가로 적절하게 측쇄 보호된, 선형방식으로 아미노산 또는 유사프롤린 디펩티드를 포함하는 디펩티드의 단계적인 커플링에 의해 고체상에 펩티드를 합성하는 단계, 단, 각각 -Val-Ser- 및/또는 Val-Ser-Ser로 읽고, 상기 제시된 서열 화학식에서 굵은 글씨로 강조된 특정 하나의 적절한 서열 위치에서, 일차 유사프롤린 디펩티드가 성장하는 펩티드쇄에 커플링되고, 여기서 유사프롤린 디펩티드는 Fmoc-Val-Ser(ψMe , Mepro)-OH, Fmoc-Val-Ser(ψH, Hpro)-OH, Fmoc-Ser(P)-Ser(ψMe , Mepro)-OH 및 Fmoc-Ser(P)-Ser(ψH, Hpro)-OH (여기서, P는 물에서 TFA 80%이상의 강한 산성 조건하에 절단되는 산-절단성 측쇄 보호기이고, 바람직하게 P는 하기에 정의되는 약한 산성 조건하에서는 절단되지 않고, 가장 바람직하게는 P는 tert-부틸 또는 트리틸임)로 이루어진 군으로부터 선택됨,
b. 고체상으로부터 펩티드를 절단하고, 임의로 펩티드쇄를 탈보호하는 단계.
바람직한 구현예에서, Fmoc 글리시딜 잔기 또는 Fmoc-아미노글리시딜 잔기로서 커플링될 수 있는 하나 이상의 글리시딜 잔기는 추가로 그의 골격 Nα에 N-(o,p-디알콕시-벤질) 또는 N-(o-히드록시-p-알콕시-벤질) 또는 N-(o-아실옥시-p-알콕시-벤질)로 N-보호되고, 여기서, 알콕시 및 아실옥시는 각각 독립적으로 C1-C4-알콕시 및 C1-C4-아실옥시이고, 단, 상기 글리시딜 잔기가 서열 -Gly-Thr(ψMe,Mepro)- 또는 -Gly-Thr(ψH,Hpro)-에 포함되지 않고, 또 다른 유사프롤린 또는 Nα-보호된 글리시딜 잔기로부터 두 개의 삽입되는 아미노산 잔기에 의해 공간이 생기는 것을 특징으로 하는 방법이 제공된다.
바람직한 구현예에서, 두 개의 유사프롤린 디펩티드가 사용되고, 여기서 이차는 상기 일차의 것으로부터 네 개 이상의 삽입되는 아미노산 잔기에 의해 간격이 생기고, 바람직하게는 Fmoc-Gly-Thr(ψMe,Mepro)-OH 인 것을 특징으로 하는 방법이 제공된다.
다른 바람직한 구현예에서, 오직 하나의 유사프롤린 디펩티드 단위가 합성에 사용되고, 바람직하게는 Fmoc-Val-Ser(ψMe,Mepro)-OH는 성장하는 펩티드 사슬에 커플링되기 위해 사용된다.
GLP-1 펩티드의 활성은 서열, 대부분 잔기의 일부 보존 가능한 치환을 허용하는 대부분의 주변 서열 요소에서 매우 변화될 여지가 있다. 따라서 현저히 작은 변화는 여전히 생물학적 안정성 또는 수용체 결합, 및 그에 따른 약물학적 활성에 대한 효과를 예측할 수 있을 것이다. 상기에 대한 우수한 검토가 Sarrauste de Menthiere 등의, European J. Medicinal Chemistry 39, 2004:473-480에 제시되었다. GLP-1 펩티드족의 코어 서열 부분은 임의의 변화를 사실상 허용하지 않는다.
선형 고체상 합성 또는 상기 코어 부분을 포함하는 부분 펩티드의 전체 길이는 심지어 반복되는 커플링시에도 거의 불가능한 정도까지 완전히 비효율적인 개별적인 커플링 단계의 거대한 문제와 직면한다. 커플링 시간 연장, 커플링 온도 상승 등은 증가된 라세미화 또는 원하지 않는 부생성물의 위험이 수반된다.
여러 저자에 의해 수용액에서 천연 GLP-1-펩티드의 이차 구조를 분석하였고 (Sarrauste, supra, and Adelhorst 등의 J. Biol. Chem. 269 (1994), 6275-6278)는 원편광 이색성 분광법 (예를 들어, Chen 등 의, (1974) Determination of the helix and beta form of proteins in aqueous solution by circular dichroism. Biochemistry 13, 3350-3359, Greenfield, N. and Fasman, G. D. (1969) Computed circular dichroism spectra for the evaluation of protein conformation. Biochemistry 8, 4108-4116), 불규칙적이고 나선형인 구조의 매우 넓은 영역을 제외하고는, 펩티드 골결의 응집을 야기하는 β-시트 구조를 매우 낮은 함량 (10%)으로 발견하였다. 적용된 분광학적 방법은 상기 구조 요소에 해당하는 GLP-1 서열 부분을 할당하는 것을 허용하지 않는다. 응집 및 고체상 합성에서 그로 인한 문제는 일반적으로 당업계에서 β-시트 구조의 확장된 영역의 발생과 연관되는 것으로 믿어진다. 낮은 β-시트 구조 함량은 길이가 10 aa 이상인 대부분의 펩티드에 일반적이고, 합성 방법에서 임의의 특수한 문제와 연관되지 않는다.
현재 Fmoc-유사프롤린 디펩티드 단위가 시판된다; 그의 합성이 기재되었다 (예를 들어, Ruckle 등 의, Tetrahedron 1999, 55(37): 11281-11288; Keller 등 의, 1998, J. Am. Chem. Soc. 120:2714-2720). 상기 유사프롤린 펩티드는 상기 서열 위치에서 일부 서열 -Val-Ser- 또는 -Ser-Ser-에 대해 유사프롤린 디펩티드를 사용하도록 하는 일부 서열 -Val-Ser-Ser- 또는 특정 중심 서열 단편 또는 서열 위치에 하나 이상의 중심 세린 잔기를 도입하기 위해 사용되며, 이것은 결국 일부 서열 -Gly-Thr- 또는 -Phe-Thr-, 바람직하게는 일부 서열 -Gly-Thr-에 이차 유사프롤린 잔기를 도입하는 것과 함께 본 발명의 요점이다. 본 발명의 상기 유사프롤린은 Ser 또는 Thr로부터 유도된 N-Fmoc-펩티딜-(4S)-1,3-옥사졸리딘 카르복실레이트이고, 본 발명의 범주에서 하기 화학식 I의 일반적인 구조를 갖는다:
Figure 112008063716184-pct00001
(식 중, K는 Ser, Val, Phe, Gly로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기이고, Ser가 하기에 정의된 것과 같이 강한 산성 조건 하에서 절단되는 측쇄-보호 기 P를 추가로 가진다 ; R11, R12는 독립적으로 H, 메틸 또는 에틸이고, R10은 H 또는 메틸임. 치환기 R11 및 R12의 특성은 펩티드 아미드 결합의 시스/트랜스 이성질체화에 영향을 미치고, 옥사졸리딘은 그의 일부이므로 유사프롤린의 효과는 합성시 성장하는 펩티드쇄의 구조에 긍정적인 영향을 미침).
유사프롤린 부분으로 피로글루탐산을 사용하는 것이 또한 적절하나, 특정 커플링 및 탈보호 화학 (Tomasini, C. 등의, Tetrahedron letters 2001, 42:5211-5214)을 요구하는 본 발명의 범주에서 덜 바람직하다.
더욱 바람직하게는, 상기에서 명시된 것과 같이 GLP-1 서열에서 두 개의 중심 Ser 잔기 위치 중 어느 하나에서 오직 상기 일차 유사프롤린 잔기가 본 발명의 합성 방법으로 사용되었다. 상기 의미는 합성시 이차 유사프롤린 디펩티드 단위가 사용되지 않았다는 것이다. 가장 바람직하게는 상기 일차 유사프롤린 디펩티드는 본 발명에 따른 고체상 합성에서 사용되는 Fmoc-Val-Ser(ψMe , Me)-OH이다.
본 발명의 특정 유사프롤린 디펩티드의 부재에서 GLP-1 펩티드를 합성하기 위해 탐색된 비교예가 본 발명에 부여되는 객관적인 기술 문제를 예증하는 실험적 부분에서 설명된다.
펩티드 합성을 위한 커플링제는 당업계에 잘 알려져 있다 (Bodansky, M. , Principles of peptide Synthesis, 2nd ed. Springer Verlag Berlin/Heidelberg, 1993 참조; 또한 거기에서 커플링 첨가제 또는 보조제의 역할을 논의한 것을 참조). 커플링제는 혼합된 무수물 (예를 들어, T3P: 프로판 인산 무수물) 또는 활성 에스테르 또는 산 할로겐화물 (예를 들어, ICBF, 이소부틸-클로로포르미에이트)과 같은 다른 아실화제일 수 있거나 그것은 카르보디이미드 (예를 들어, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드, 디이소프로필-카르보디이미드), 활성 벤조트리아진-유도체 (DEPBT: 3-(디에톡시포스포릴옥시)-1,2,3-벤조트리아진-4(3H)-온) 또는 벤조트리아졸의 우로늄 또는 포스포늄 염 유도체일 수 있다.
최고 수율, 짧은 반응 시간 및 신장률이 변하는 동안 라세미화에 대한 보호의 관점에서, 더욱 바람직하게는 반응이 염기의 존재에서 수행됨에 따라서, 커플링제가 유리 카르복실산 작용의 활성화가 가능한 벤조트리아졸의 우로늄 염 및 포스포늄 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이다. 상기 우로늄 또는 포스포늄 커플링 염의 적절하고 또한 바람직한 예는 예를 들어, HBTU (O-1H-벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), BOP (벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트), PyBOP (벤조트리아졸-1-일-옥시-트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트), PyAOP, HCTU (O-(1H-6-클로로-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), TCTU (O-1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트), HATU (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), TATU (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트), TOTU (O-[시아노(에톡시카르보닐)메틸렌아미노]-N,N,N',N"-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트), HAPyU (O-(벤조트리아졸-1-일)옥시비스-(피롤리디노)-우로늄 헥사플루오로포스페이트이다.
바람직하게는, 염기성 시약은 펩티드의 α-아미노 작용기 또는 아미노산 또는 아미노산 유도체를 제외한, 그의 컨쥬게이트 산이 pKa 7.5 내지 15, 더욱 바람직하게는 pKa 7.5 내지 10의 pKa 값을 갖는 약한 염기이고, 여기서 염기가 바람직하게는 사차, 입체적 장애 아민이다. 상기 및 추가로 바람직한 예는 Hunig-염기 (N,N-디이소프로필에틸아민), 직선 또는 분지의 C1-C4 알킬을 갖는 N,N'-디알킬아닐린, 2,4,6-트리알킬피리딘, 2,6-트리알킬피리딘 또는 N-알킬-모르폴린이고, 더욱 바람직하게는 N-메틸모르폴린 (NMM) 또는 콜리딘 (2,4,6-트리메틸피리딘)이고, 가장 바람직하게는 콜리딘이다.
또한 커플링 첨가제, 특히 벤조트리아졸형의 커플링 첨가제를 사용하는 것이 알려져 있다 (Bodansky, supra 참조). 그의 사용은 매우 활성화된 이전에 상기 언급된 우로늄 또는 포스포늄 염 커플링제를 사용할 때 특히 바람직하다. 그러므로 커플링제 첨가제는 활성화된 에스테르를 형성할 수 있는 친핵성 히드록시 화합물이 더욱더 바람직하고, 더욱 바람직하게는 산성, 친핵성 N-히드록시 작용기를 갖고, 여기서 N은 이미드 또는 N-아실 또는 N-아릴 치환 트리아제노이고, 가장 바람직하게는 커플링 첨가제는 N-히드록시-벤조트리아졸 유도체 (또는 1-히드록시-벤조트리아졸 유도체) 또는 N-히드록시-벤조트리아진 유도체이다. 상기 커플링 첨가제 N-히드록시 화합물이 광범위하게 WO 94/07910 및 EP-410 182에 기재되어있고, 그의 각각의 명세서는 본원에서 참조로서 인용된다. 예는 예를 들어, N-히드록시-숙신이미드, N-히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 (HOOBt), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt) 및 N-히드록시-벤조트리아졸 (HOBt)이다. N-히드록시-벤조트리아진 유도체가 특히 바람직하고, 가장 바람직한 구현예에서, 커플링제 첨가제는 히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진이다.
커플링 첨가제의 암모늄염 화합물이 알려져있고, 커플링 화학에서 그의 용도가 예를 들어, US4806641에 기재된다.
또한 예를 들어, Arg의 공유 측쇄 보호에 대한 옵션으로 합성시 Arg 측쇄의 보호를 위한 이온-결합제로서 HOBt와 같이, 커플링 보조제로서 그의 역할을 수반하여 사용되는 것이 가능하다. 그러한 경우에, 충분히 높은 HOBt의 농도는 고체상 합성의 모든 주기적인 진행 단계를 통해 유지되어야만 한다.
특히 더욱더 바람직한 구현예에서, 우로늄 또는 포스포늄 염 커플링제는 우로늄 염 시약이고, 바람직하게는 HCTU, TCTU 또는 HBTU이고, 훨씬 더 바람직하게는 반응에서 N-히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진 또는 그의 염과 조합으로 사용된다. 상기 구현예는 염기에 불안정한 Nα-보호기의 제거 후, 펩티드 합성의 사슬 연장 단계에서 사용되는 것이 주로 바람직하나, 측쇄 고리화시 락탐화 반응을 위해서도 잘 사용될 수 있다.
본 발명의 범주에서, HCTU 및 TCTU는 이러한 화합물이 당업계에서는 통상적으로 이해되는 것처럼, 용어 '우로늄 염 시약'에 의해 포함되는 것으로서 정의되는 것을 언급하는 것이고, 가능한 유사한 것은 결정 구조 분석 (O. Marder, Y. Shvo, and F. Albericio "HCTU and TCTU: New coupling Reagents: Development and Industrial Applications", Chimica Oggi 2002, 20:37-41)으로 우로늄 부분보다 이소니트로소 부분을 포함하는 것으로 나타나고, 헤테로시클릭 코어 상의 N-아미디노 치환기는 대신 구아니듐 구조로 성장한다. 본 발명의 범주에서, 상기 화합물의 계열은 본 발명에 따른 우로늄 염 시약의 '구아니듐형 하위 계열'로 언급된다.
염기에 불안정한 Nα의 탈보호는 예를 들어, N-메틸 모르폴린 (NMP), 디클로로메탄 (DCM) 또는 디메틸포름아미드 (DMF)에서 20%의 피페리딘으로 당업계에서 일반적으로 행해지는 것과 같이 수행될 수 있다. 유기 무극성 비양자성 용매는 고체상 합성의 모든 단계에 대해 당업계에서 일반적으로 적용된다. NMP가 바람직한 용매이다.
Fmoc 아미노산 또는 디펩티드는 예를 들어, 카이저 시험 (Kaiser Test)에 의해 측정될 수 있는 것과 같이 반응성의 고체상 결합 아미노 작용기의 eq 당 상기 Fmoc 아미노산 시약의 바람직하게는 보통 1-3 eq., 더욱 바람직하게는 1-2 eq로 커플링된다. 커플링 온도는 특히 포스포늄 또는 우로늄형 커플링제를 사용하는 경우, 일반적으로 15 내지 30℃의 범위이다. 통상적으로, 약 20 내지 25℃의 온도가 커플링에 적용된다. 본 발명의 방법은 본질적으로 반응의 유출물에서 과량의 대부분이 낭비되는 비싸고, 생물학적 위험이 있는 시약을 과량으로 사용하지 않고, 생성물의 고수율 및 GLP-1 생성물의 우수한 순도를 허용하는 고안된 합성 방법을 가지므로 유리하다.
보호기 및 주로 아미노산 측쇄 또는 Nα-말단 아미노기의 보호를 위한 그의 용도가 당업계에 잘 알려져있다 (Bodanzsky, supra 참조). 일반적으로 사용되는 Glu, Asp에 대한 카르복시-보호기는 예를 들어, 통상적으로 사용되지는 않지만, Mpe, 0-1-아다만틸, O-벤질 및 훨씬 간단한 알킬 에스테르가 사용될 수 있다. 편의를 위하여, 통상적이고 바람직하게는 tert-부틸기가 사용된다. 티로신이 상이한 보호기, 예를 들어, tert-부틸 에테르 또는 Z- 또는 더욱 바람직하게는 2-브로모-Z 에스테르에 의해 보호될 수 있다. 트리틸알콜 보호기, 예컨대 2-클로로-트리틸 또는 4-메톡시 또는 4,4' 메톡시-트리틸기가 사용되는 것이 동일하게 가능하다. 바람직하게는, 트리틸 또는 tert-부틸 보호기이다. 더욱 바람직하게는, 티로실 측쇄가 삼차-부틸 에테르로 개질된 것을 의미하는 삼차 부틸 (tBu) 보호기이다. tBu기는 오직 강한 산성 조건하에서만 효율적으로 제거된다. 아르지닌 보호기는 바람직하게는 상기 정의된 것과 같은 오직 강한 산성 조건하에서만 절단되는, 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸라닐-5-설포닐 (Pbf), 아다만틸옥시-카르보닐 및 이소보닐-옥시-카르보닐, 2,2,5,7,8-펜타메틸엔크로만설포닐-6-설포닐 (Pmc), 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐 (Mtr) 및 그의 4-tert-부틸-2,3,5,6-테트라메틸 동종 (Tart) 또는 Boc로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 더욱 바람직하게는, Pbf, Pmc, Mtr이고, 가장 바람직하게는 Pbf이다; 보통 수성 매질에서, 강한 산성 조건하에서 측쇄의 광범위한 탈보호에 따른, 탈보호된 티로신의 구경꾼-알킬화는 Pmc, Mtr 및 Pbf로 관찰되지 않는다. Pbf의 절단률은 가장 높다. HOBt와 임의의 이온쌍 보호 모드에 대한 암시를 명시하였다. Ser, Thr은 통상적으로 바람직하게는 예를 들어, tert-부틸 또는 트리틸, 가장 바람직하게는 tert-부틸에 의해 보호될 수 있다. 결국 동일하게 바람직하지 않은 강한 산성 인큐베이션에서의 확장된 인큐베이션 또는 수소화 제거를 요구하기 때문에, 보호의 다른 모드는 덜 바람직하지만 예를 들어, 벤질로 동일하게 사용될 수 있다. 유사한 생각이 Lys 또는 Nor- 또는 Homo-리신의 보호에 적용된다; 통상적으로 바람직하게는, Lys은 Boc로 보호된다. Trp는 통상적으로 Boc로 보호가 바람직하나, 고체상 합성시 반드시 보호될 필요는 없다. 측쇄 보호기로서, 앞서 언급한 것은 그의 D-동종과 마찬가지로 천연-L-아민드산이 유효하다.
고체상 S는 고체, 불용성 지지체 물질, 상기 조절된 기공 크기 유리, 실리카 또는 예를 들어, 폴리스티렌-디비닐벤젠 수지 (PS 수지)에 펩티드를 부착하기 위해 메리필드 법에 의해 히드록시벤질-페닐 일체 결합 부분과 함께 사용되는 전형적인 폴리스티렌-디비닐벤젠 수지 (PS 수지) 또는 수지에 직접 결합되는 히드록시-벤질-p-벤질옥시 부분과 Wang법에 의해 사용되는 PS 수지와 같은, 더 통상적인 중합성 유기 수지에 대한 양으로 이해되는 것이다. 펩티드의 부착을 위한 상기 작용기 위치는 본 문헌에서 연결자로 언급되고, 본 문헌에서 용어 '고체상'에 의해 필수적인 특징으로 나타나는 것으로 이해된다. 필요하다면, 예를 들어, 더욱 특정화된, 예를 들어, 더욱 산에 불안정한 것과 같은 다른 결합 부분, 연결자가 추가로 미리 제조된 고체상에 상기 일차, 일체형 연결자에 그래프트될 수 있으므로, 때로는 당 업계에서 "핸들"로서 언급된다. 상기의 추가 예는 연결- 또는 핸들-수지 복합체가 수지로부터 펩티드의 최종 절단에 따라 C-말단 산 또는 카르복사미드기의 생성을 모두 허용하는 펩티드 부분에 대한 각각의 O 또는 N-연결에서 (4-메톡시페닐)-아미노메틸- 또는 -히드록시메틸 및 (4-메틸페닐)-아미노메틸- 또는 -히드록시메틸-PS 고체상 (Atkinson 등 의, 2000, J. Org. Chem. 65, 5048)인 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 합성용으로 고체상 수지는 필수적으로 고체상 코어 물질의 일부인 일체형 연결자 또는 핸들의 하나 이상을 포함한다; 상기 연결자 또는 핸들은 고정된 보호기 (Guillier 등 의, Chem.Rev.100,2091-2157,2000)로서 고려될 수 있다. 통상적으로, 비활성 고체 지지체 또는 수지를 포함하는 제시된 고체상은 아미노산 또는 펩티드와 아실화하도록 하는 핸들기의 그의 연결자의 화학적 특성에 비추어 처리된다.
상이한 그래프트 핸들 또는 연결자와 사용할 수 있는 더욱 복잡한 PEG-그래프트 폴리스티렌 수지, 예컨대 텐타겔-기재 Novasyn TG (Novabiochem, Merck Biosciences, Germany)는 표준 PS 수지보다 더욱 양친매성이고, 또한 합성 효율성에 영향을 준다. 본 발명의 문맥에서, PEG 또는 다른 폴리옥시알킬렌 단편이 없는 PS 수지 및 연결자 또는 핸들 부분으로부터 이루어진 고체상의 사용이 바람직하다. 일체형 또는 그래프트 PEG 또는 폴리옥시알킬렌 수지 및 그에 따른 고체상은 덜 바람직하고, 본 명세서에 청구되지 않는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 것과 같은 수지의 표준 메쉬 (mesh) 크기 (US 표준 연구소)는 약 50-500 메쉬, 더욱 바람직하게는 100 내지 400 메쉬이다.
예를 들어, Holmes 등 의, 1995, J. Org. Chem. 60, 2318에 기재된 광절단성 연결자를 생성하는 카복사미드와 같은 광 절단성 연결자를 사용가는 것이 가능하다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 고체상은 강한 산성 조건에서 고체상으로부터 펩티드를 절단하도록 한다. 정의하면, 본 발명에 따르면 약한 산성 조건과 반대되는 강한 산성 조건은 용매에서 50% (v/v) 이상의 트리플루오로 아세트산 (TFA)를 사용하는 것을 의미한다. 더욱이, 반대로 제거를 위해 강한 산성 조건을 요구하는 보호기는 80% 이상의 TFA에서 제거될 수 있는 보호기이다. 따라서, HF와 같은 훨씬 강한 산을 요구하는 보호기는 본 발명의 문맥에서 상기 언급된 정의하에 나타낼 수 없다.
약한 산성 조건은 0.01% (v/v) 내지 50% 미만의 TFA를 갖고, 바람직하게는 0.1% 내지 30%의 TFA를 갖는 것으로 정의된다. 용어 '산에 불안정한'은 주위 온도에서 한 시간 이상 동안 디클로로메탄 중의 2-10%의 TFA에서 본질적인 양적 절단을 언급한다.
본 발명의 구체적인 범주에서, 고체상으로부터 절단되고, 대부분 또는 완전히 탈보호된 상기 명시된 GLP-1 펩티드는 대부분 통상적으로 사용되는 용매 또는 용매 혼합물과 거품이 있는 겔 용액을 제공한다. 상기 겔 용액의 취급은 특히 고체상으로부터 분리하기 위한 여과 작업시 물질의 상당한 손실을 쉽게 야기한다. 바람직한 구현예에서, 고체상은 상기 정의된 약한 산성 조건 하에서 산에 불안정한 고체상을 사용하여 아직 여전히 보호된 펩티드로부터 절단될 수 있는 고체상이다. 상기 모드에서, 처음에는 고체상으로부터 펩티드가 절단되고, 그 다음 두 번째 단계에서, 상기 정의된 것과 같은 강한 산성 조건하에서 측쇄가 탈보호된다.
하나의 더욱더 바람직한 구현예에서, GLP-1 펩티드는 C-말단 카르복사미드과 같은 수지로부터 유리된다. 상기 카르복사미드를 생성하는 수지의 예는 예를 들어, PAL 수지 (5-(4-아미노-메틸-3,5-디히드록시페녹시) 발레산 에스테르), 시버 (Sieber) 수지 (Sieber, P. 1987, Tetrahedron Lett. 28, 2107) 또는 관련된 크산테닐아미드형 수지 (예를 들어, US5306562), 링크 아미드 수지 (Rink, H. 1987, Tetradron Lett. 28:3787), BAL 수지 (4-(4-포르밀-3,5-디메톡시페녹시)-부틸산 에스테르, Tetrahedron Lett. 43:3543)이고, 바람직하게는 산에 불안정한 카르복시아미드 생성 수지가 또한 가장 바람직한 구현예인 예를 들어, 시버 수지 또는 다른 크산테닐아미드형 수지 또는 BAL수지와 같이 사용된다.
다른 바람직한 구현예에서, 고체상은 고체상으로부터 보호된 펩티드의 절단시 C-말단 카르복실산을 유리시키는 산에 불안정한 고체상이다. 상기 예와 더욱 바람직한 구현예 모두는 2'-클로로-트리틸, 4-메톡시 또는 4,4'-디메톡시-트리틸, 4-메틸트리틸 수지 또는 관련된 것들이나, 아미노- 또는 히드록시 작용화 수지로부터 Bayer의 4-카르복시트리틸 연결자와 아실화에 의해 유도될 수 있는 2-(4-히드록시-페닐)-2,2-디페닐-아세틸 수지와는 다르고, 예를 들어, 노바신 TG 수지의 상품명으로 시판된다. 다른 예는 예를 들어, 산에 불안정한 링크산 수지 (4-(2',4'-디메톡시페닐-히드록시메틸)페녹시, Rink 등 의, 1987, Tetrahedron Lett 28,3787) 및 HMPB-수지 (Sieber 등 의, 1987, Tetrahedron Lett. 28, 6147; HMPB: 4-히드록시메틸-3-메톡시페녹시부티릴)이고, 통상적으로 그의 링크 아미드 수지 또는 유도체에 이차 핸들로서 커플링된다.
가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 펩티드는 수지 또는 수지 핸들에 카르복시말단으로 커플링된다 (S = 고체상 또는 수지, 임의로 핸들을 갖는 수지)
더욱 바람직하게는 단독 또는 상기의 더욱더 바람직한 구현예와 조합으로, 하기에 열거된 특정 펩티드 서열 및 각각의 펩티드-고체상 컨쥬게이트이다:
1. A-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-S 또는 A-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2
2. A-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-S 또는 A-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH 또는 -NH2
3. A-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-S 또는 A-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu- Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-OH 또는 -NH2
4. A-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-S 또는 A-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe- Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-NH2
5. A-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-NorVal-Arg-S 또는 A-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-NorVal-Arg-NH2, 여기서 NorVal은 α-아미노이소부틸산 또는 α-메틸아닐린인 Nor-L-발린이고, 통상적으로 간단하게는 아크로님-Aib로 언급함.
본 발명에 따라서, 하기의 화학식의 고체상 컨쥬게이트 GLP-1 또는 GLP-1 아고니스트 펩티드가 제공된다:
화학식
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-R5-(R6)w-(R7)z-S
또는 화학식
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-S
또는 화학식
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-S
또는 화학식
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-S
또는 화학식
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-S
또는 화학식
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-Gly-S
(식 중,
S = 티오에스테르, 에스테르 또는 아미도기를 거쳐 펩티딜 부분에 공유결합되거나 C-말단 아미노산이 리신인 경우, 상기 리신의 ε-아미노 작용기를 거쳐 임의로 공유결합되는 C-말단 결합된 고체상,
A = H-, Ac-, Boc-, Fmoc-,
R1 = His, D-His, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 또는 α-메틸-히스티딘,
R2 = -Ala, D-Ala, -Val, D-Val, Gly, Aib (α-아미노이소부틸산),
R3 = Glu, Asp, Met, Leu, 바람직하게는 Glu 또는 Asp, 가장 바람직하게는 Asp,
R4 = -Lys 또는 Arg,
R5 = -Gly, Aib, Ala, D-Ala
R6 = Arg, Lys 또는 Gly
R7 = Arg, Lys 또는 Gly, 바람직하게는 Lys 또는 Gly,
R8 = Gly 또는 Aib,
여기서, 독립적으로 x, y, w, z는 0 또는 1이고, 단, x=1인 경우 y=1이고, 단, z=1인 경우 w=1이고, 여기서 각각의 Lys, Thr, Ser, Glu, Asp의 하나 이상의 개별적 측쇄는 비염기 불안정하고, 바람직하게는 보호기가 Thr 또는 Ser의 경우에서 유사프롤린 보호기일 수 있는 산-절단성 보호기이고, 여기서 특정 서열 단편 -Val-Ser-Ser에서 하나의 Ser은 세린의 유사프롤린-옥사졸리딘 유도체이고, 바람직하게는 -Ser(ψMe,Mepro)- 또는 -Ser(ψH,Hpro)-으로 이루어진 군으로부터 선택됨).
바람직한 구현예에서, 상기 Ser(ψ-pro)-유사프롤린이 펩티드에서 오직 유사프롤린-보호된 잔기인 것을 특징으로 하는 고체상 컨쥬게이트 펩티드가 제공된다.
다른 바람직한 구현예에서, 펩티드가 -Thr(ψMe,Mepro)- 또는 Thr(ψH,Hpro)-이고, 특정 서열 단편 -Gly-Thr-에 위치하는 하나 이상의 이차 유사프롤린 보호된 잔기를 포함하고, 바람직하게는 펩티드가 상기 일차 및 이차 유사프롤린 잔기인 오직 두 개의 유사프롤린-보호된 잔기를 함유하는 것을 특징으로 하는 고체상 컨쥬게이트 펩티드가 제공된다.
실험
실시예 1: Fmoc - Val - Ser (ψ Me , Me pro )- OH 를 사용하는 H-His-Ala-Glu-Gly-Thr- Phe - Thr - Ser - Asp - Val - Ser - Ser - Tyr - Leu - Glu - Gly - Gln - Ala - Ala - Lvs - Glu - Phe - Ile - Ala - Trp - Leu -Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH의 합성
상기 펩티드는 선형 Fmoc 합성에 의해 수득되었다. 합성 과정에서 유사프롤린 디펩티드 Fmoc-Val-Ser(ψMe , Mepro)-OH (Merck Biosciences GmbH, Schwalbach/Germany로부터 수득됨. Novabiochem 상표 제품)가 N-말단 서열 Ser-Tyr-Leu-Glu-에 커플링되는 경우인 하나의 커플링 단계를 제외하고, 커플링된 모든 아미노산은 통상적으로 Fmoc-단일아미노산으로 시판될 수 있었다. 더욱이 마지막 His 잔기가 Boc-His 잔기와 같이 커플링되는 것을 제외하고, His-측쇄는 보호되지 않았다. 측쇄 보호기가 사용되었다; 쉽게 열거하기 위해, N-말단 Fmoc 보호의 사용을 추가로 언급하지 않았다; Arg(Pbf), Asp(tbu), Gln(Trt), Glu(tbu), Lys(Boc), Ser(tbu), Thr(tbu), Tψ(Boc), Tyr(tbu).
3mmol 규모의 합성은 Fmoc-Gly-2-클로로트리틸 폴리스티렌 수지 (즉, Fmoc-글리신으로 미리 로드된 2-CTC 수지, 주문 번호 RAA-1039, 로딩: > 0.5 mmol/mL, 100-200 메쉬, CBL-Patras, Greece로부터 수득됨)에서 개시하였다. 초기, 수지는 디클로로메탄으로 팽창되였다. 커플링을 위해 Fmoc 아미노산의 2 내지 2.5 eq를 사용하는 표준 Fmoc 합성은 디클로로메탄-N-메틸모르폴린 (DCM:NMP=1:3) 용매계 내 이소프로필아민/HOBt의 존재에서 25℃에서 30분 동안 아미노산의 HBTU 활성을 사용하였다. 예비 활성화가 수행되지 않았으나, 모든 시약은 단일 단계에서 간단하게 혼합될 수 있다. Fmoc 탈보호는 NMP에서 20% (w/w)의 피페리딘에 의 해 달성될 수 있고, 이어서 NMP를 세정하여 염기성 시약을 완전히 제거하였다. 세정 효율성은 클로라닐 (chloranil) 시험에 의해 측정되고; 커플링에 앞서 더 이상 청색이 관찰되지 않을때까지 세정을 반복하였다. 조-용매로서 소량의 DMSO를 첨가하여 종료될 수 있는 아마도 DCM 내 용해도 문제로 인한 말단 Boc-His를 제외하고, 모든 커플링은 잘 진행되었고 재 커플링이 필요하지 않았다. 커플링 효율성은 Gln-17 위치에 대해 Fmoc-Gln(Trt) 대신에 비-측쇄 보호된 Fmoc-Gln를 사용하여 추가로 알맞게 개선될 수 있었다.
첫 번째 단계에서, 여전히 Boc 보호된 펩티드는 0℃에서 DCM 내 2%의 TFA에서 10-30 분 이상 동안 수지로부터 절단되었다: 3 번 반복되는 15 분의 TFA 주기가 가장 잘 수행될 수 있음을 나타내고, 각각은 이어서 피리딘 처리하고 씻어냈다. 1%의 트리에틸실란 (TES)는 스캐빈져 (scavenger)로서 사용되었다. 반응을 질소 거품화에 의해 교반시켰다. 절단 후, TFA를 피리딘을 사용하여, 반응 배양액을 희석된 피리딘 (피리딘/에탄올 1:9 (v/v))에 부어 중화하였다. 수지를 DCM으로 헹구고, 용매를 여과로 없앴다. DCM으로부터 에탄올로 여과물의 용매 교환을 진공하에 DCM을 증류 제거하여 수행하고, 마지막으로 보호된 펩티드를 물을 첨가하여 침전하고, 여과하였다. 케이크를 물로 세 번 세정하고, 펩티드를 실온에서 진공하에 건조하였다. 상기 단계에서, 77%의 수율로 정량되는 약 77.3% 영역 (HPLC에 의해 측정)의 순도를 갖는 물질을 수득하였다. HPLC-MS로 관찰된 분자 질량은 이론적으로 예측된 질량에 해당하였다. DCM과 같은 표준 용액에서 상기 생성물의 용해도는 완벽하였다.
두 번째 단계에서, 광범위한 탈보호가 절단 칵테일 ('CC')로 희석된 DCM에서 수행되었다, DCM:'CC' = 1:10 (v/v). GLP-1 펩티드에 대해, 순수한 DCM보다는 순수한 DCM 부 당 0.1 내지 1 부의 트리플루오로에탄올을 첨가한 것이 탈보호 동안 펩티드의 용해도를 최적화하는데 최적인 것을 발견하였다. 'CC'는 TFA/티오아니솔/페놀/물/TES의 혼합비 (% w/w)가 89:2.5:2.5:5.0:1.0인 것으로 제조되었다. 절단 단계에 앞서 건조 생성물을 상기와 같이 'CC'로 희석된 10 ml의 DCM에 용해하고, 실온에서 5 시간 동안 교반하였다. 그 다음 생성물을 50 ml의 메틸-tert-부틸-에테르 (MTBE, Fluka Chemie, Buchs/Switzerland)를 첨가하여 회수하고, 교반하에 수조에서 30 분 동안 반응물을 0℃로 냉각하고, 그동안 형성된 염 침전물을 여과해냈다. 여과 케이크를 MTBE로 여러번 행구고, 실온에서 건조하여 HPLC에 의해 측정된 것으로 순도 약 95%의 미정제 생성물 0.8g을 산출하였다. 단계 2 및 3을 공동으로 거친 총 수율은 약 75%였다.
실시예 2: 비교예 - 유사프롤린의 부재에서 N-말단 단편 H- His - Ala - Glu - Gly -Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-OH (단편 1 내지 16)의 합성
먼저, 상기 작은 단편의 고체상 합성을, 더 짧은 단편이 합성을 위해 제시되는 것을 제외하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 본질적으로 수행되었다. 각 커플링 반응을 위해 2.5 내지 3 당량의 아미노산을 사용하여, 아미노산 15 내지 9가 모두 쉽게 커플링되었다. 그러나, 하기의 Fmoc 아미노산 8 내지 1은 심각한 문제에 당면하였다: 오직 두 개의 위치에서만 커플링이 유사하고 쉽게 진행되었다. 커플링의 두 개 이상의 반복 주기는 모든 다른 위치에서 요구되나, 여전히 순도 30% 이상의 만족할 만한 수율을 얻지 못했다. 문제의 심각성을 해결하기 위해 부적당한 라세미화의 일반적으로 공지된 양상을 무시하고, 전단력 커플링 접근법은 4 당량의 아미노산을 사용하고 통상적으로 덜 라세미화되는 경향이 있는 아미노산의 커플링 이상이 되기 위해 온도를 30 내지 40 ℃로 증가시키고, 대신 더 활성인 6-Cl-HOBt를 사용하였다. 그러나, 여전히 그 다음 안정된 재-커플링이 요구되었고, 커플링 효율성 그 자체의 현저한 개선은 관찰할 수 없었다. 매우 특이한 용해도 거동을 갖는 것으로 입증된 단편을 제외하고, 수지로부터의 분해는 2%의 TFA에서 실시예 1에 기재된 것과 같이 첫 번째 단계에서 진행되었다. 보호되고, 절단되지 않은 단편은 피리딘의 첨가 후 겔트 (gelt)를 형성하였다. 결과적으로 피리딘은 단지 여과를 위한 여과 단계에 첨가되는 것이 필요했다; DCM 증류는 겔이 거품으로 되고 고체는 도처에 남아 있고, 수율이 현저히 감소하여 매우 어려운 것으로 발견되었다. 물의 첨가시, 형성된 고체는 단리될 수 있었다. 그러나, 그 후 상기 고체 생성물을 용해하는 것이 어렵다는 것은 다시 증명되었다: 보호된 단편은 DCM, THF, 아세토니트릴 및 그의 혼합물에 주로 불용성이다. THF 내 LiCl의 첨가는 용해도를 개선시키지 못했다. 펩티드는 NMP, DMF 또는 DMSO에 약간 용해되는 것으로 증명되었고, 더 적당한 농도로 젤과 같은 외관으로 제공되므로, 수율을 위해 차선으로 발견되는 매우 희석된 용액에서 수행되는 것이 요구된다.

Claims (7)

  1. 펩티드가 하기의 화학식의 것인, 하기 a 및 b 단계를 포함하는, GLP-1 또는 GLP-1 아고니스트 펩티드의 제조 방법:
    화학식
    A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-R5-(R6)w-(R7)z-B
    또는 화학식
    A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-B
    또는 화학식
    A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-B
    또는 화학식
    A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-B
    또는 화학식
    A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-B
    또는 화학식
    A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-Gly-B
    (식 중,
    B = -OH 또는 -NH2
    A = H-, Ac-, Boc-, Fmoc-
    R1 = His, D-His, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 또는 α-메틸-히스티딘
    R2 = -Ala, D-Ala, -Val, D-Val, Gly, Aib (α-아미노이소부틸산)
    R3 = Glu, Asp, Met, Leu
    R4 = -Lys 또는 Arg
    R5 = -Gly, Aib, Ala, D-Ala
    R6 = Arg, Lys 또는 Gly
    R7 = Arg, Lys 또는 Gly
    R8 = Gly 또는 Aib
    여기서, 독립적으로 x, y, w, z는 0 또는 1이고, 단, x=1인 경우 y=1이고, 단, z=1인 경우 w=1이고, 더욱이 여기서 각각의 아미노산은 임의로 보호기를 가질 수 있다),
    a. Fmoc-보호된, 임의로 추가로 적절하게 측쇄 보호된, 선형방식으로 아미노산 또는 유사프롤린 디펩티드를 포함하는 디펩티드의 단계적인 커플링에 의해 고체상에 펩티드를 합성하는 단계, 단, 하나의 적절한 서열 위치에서 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 일차 유사프롤린 디펩티드는 성장하는 펩티드쇄에 커플링됨:
    Fmoc-Val-Ser(ψMe,Mepro)-OH, Fmoc-Val-Ser(ψH,Hpro)-OH, Fmoc-Ser(P)- Ser(ψMe,Mepro)-OH 및 Fmoc-Ser(P)-Ser(ψH,Hpro)-OH (여기서, P는 TFA 80% 이상의 강한 산성 조건하에 절단되는 산-절단가능 보호기임),
    b. 고체상으로부터 펩티드를 절단하고, 임의로 펩티드 사슬을 탈보호하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, Fmoc 글리시딜 잔기 또는 Fmoc-아미노글리시딜 잔기로서 커플링될 수 있는 하나 이상의 글리시딜 잔기는 추가로 그의 골격 Nα에 N-(o,p-디알콕시-벤질) 또는 N-(o-히드록시-p-알콕시-벤질) 또는 N-(o-아실옥시-p-알콕시-벤질)로 N-보호되고, 여기서, 알콕시 및 아실옥시는 각각 독립적으로 C1-C4-알콕시 및 C1-C4-아실옥시이고, 단, 상기 글리시딜 잔기가 서열 -Gly-Thr(ψMe,Mepro)- 또는 -Gly-Thr(ψH,Hpro)-에 포함되지 않고, 또 다른 유사프롤린 또는 Nα-보호된 글리시딜 잔기로부터 두 개의 삽입되는 아미노산 잔기에 의해 공간이 생기는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 두 개의 유사프롤린 디펩티드가 사용되고, 여기서 이차는 상기 일차의 것으로부터 네 개 이상의 삽입되는 아미노산 잔기에 의해 간격이 생기는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 오직 하나의 유사프롤린 디펩티드 단위가 합성에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 펩티드가 하기의 화학식의 것이고, 고체상 S 와 컨쥬게이트된 제 1 항의 단계 a 의 생성물인 GLP-1 또는 GLP-1 아고니스트 펩티드:
    화학식
    A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-R5-(R6)w-(R7)z-S
    또는 화학식
    A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-S
    또는 화학식
    A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-S
    또는 화학식
    A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-S
    또는 화학식
    A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-S
    또는 화학식
    A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-Gly-S
    (식 중,
    S = 티오에스테르, 에스테르 또는 아미도기를 거쳐 펩티딜 부분에 공유결합되거나 C-말단 아미노산이 리신인 경우, 상기 리신의 ε-아미노 작용기를 거쳐 임의로 공유결합되는 C-말단 결합된 고체상,
    A = H-, Ac-, Boc-, Fmoc-,
    R1 = His, D-His, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 또는 α-메틸-히스티딘,
    R2 = -Ala, D-Ala, -Val, D-Val, Gly, Aib (α-아미노이소부틸산),
    R3 = Glu, Asp, Met, Leu,
    R4 = -Lys 또는 Arg,
    R5 = -Gly, Aib, Ala, D-Ala
    R6 = Arg, Lys 또는 Gly
    R7 = Arg, Lys 또는 Gly,
    R8 = Gly 또는 Aib,
    여기서, 독립적으로 x, y, w, z는 0 또는 1이고, 단, x=1인 경우 y=1이고, 단, z=1인 경우 w=1이고, 여기서 각각의 Lys, Thr, Ser, Glu, Asp의 하나 이상의 개별적 측쇄는 비염기 불안정하고, 보호기가 Thr 또는 Ser의 경우에서 유사프롤린 보호기일 수 있는 산-절단성 보호기이고, 여기서 특정 서열 단편 -Val-Ser-Ser에서 하나의 Ser은 세린의 유사프롤린-옥사졸리딘 유도체임).
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 Ser(ψ-pro)-유사프롤린이 펩티드에서 오직 유사프롤린-보호된 잔기인 것을 특징으로 하는 고체상 컨쥬게이트 펩티드.
  7. 제 5 항에 있어서, 펩티드가 -Thr(ψMe,Mepro)- 또는 Thr(ψH,Hpro)-이고, 특정 서열 단편 -Gly-Thr-에 위치하는 하나 이상의 이차 유사프롤린 보호된 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 고체상 컨쥬게이트 펩티드.
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