CN101379075A - 类胰高血糖素肽的合成 - Google Patents

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Abstract

发明一种合成GLP－1肽的新颖方法。

Description

类胰高血糖素肽的合成
技术领域
本发明涉及肽药物合成的领域，即一种合成GLP-1肽激动剂的新方法。
背景技术
新颖种类的糖尿病药物，GLP-1或类胰高血糖素肽1激动剂，是一种有前途的新颖种类的治疗性化合物。然而，其通过标准固相肽合成技术的制备不是那么容易的。基本上，人GLP-1为一种序列上与胰高血糖素有关的天然发生的肽。文献中已描述天然GLP-1的各种些微地修正的设计的序列变体，目的为增加效力。
该种GLP-1肽的制备已描述于WO 05/027978和WO 02/90388中；然而，没有任何已利用于肽合成的方法比非常基本的标准Fmoc固相方法好。
本发明的发明人发现先前技艺的方法不允许良好产率而为工业制备上不可接受。显然地，发现到序列依赖性、个别的偶合步骤是高度无效率的。
发明内容
本发明的目的为发明合成GLP-1肽激动剂的另一或改良的方法。此目的通过本发明的方法解决，其包含在固相合成期间在独特的内序列位置使用Fmoc-假脯氨酸(pseudoproline)双肽单元代替只使用单一Fmoc-氨基酸。
根据本发明，发明一种制备GLP-1或GLP-1激动剂肽的方法，其中该肽具有下式
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-R5-(R6)w-(R7)z-B
或具有下式
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-B
或具有下式
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-B
或具有下式
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-B
或具有下式
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-B
或具有下式
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-Gly-B
，其中
B＝-OH或-NH2，
A＝H-、Ac-、Boc-、Fmoc-，
R1＝His、D-His、去氨基(desamino)-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸(homohistidine)、α-氟甲基-组氨酸或α-甲基-组氨酸，
R2＝-Ala、D-Ala、-Val、D-Val、Gly、Aib(α-氨基异丁酸)，
R3＝Glu、Asp、Met、Leu，优选Glu或Asp，最优选Asp，
R4＝-Lys或Arg，
R5＝-Gly、Aib、Ala、D-Ala，
R6＝Arg、Lys或Gly，
R7＝Arg、Lys或Gly，优选Lys或Gly，
R8＝Gly或Aib，
且其中，独立地，x、y、w、z为0或1，其限制条件为当x＝1时y＝1，及其限制条件为当z＝1时w＝1，
其中个别氨基酸可视需要具有保护基团，
其包含下列步骤:
a.通过包含假脯氨酸双肽的Fmoc-保护(视需要进一步合适地侧链经保护)的氨基酸或双肽的逐步偶合以线性方式在固相上合成肽，其限制条件为在独特的一个分别为-Val-Ser-及/或Val-Ser-Ser并在上述序列式中以粗体字强调的适当序列位置，第一个假脯氨酸双肽系偶合至生长中的肽链，该假脯氨酸双肽系选自由Fmoc-Val-Ser(ΨMe，Mepro)-OH、Fmoc-Val-Ser(ΨH，Hpro)-OH、Fmoc-Ser(P)-Ser(ΨMe，Mepro)-OH及Fmoc-Ser(P)-Ser(ΨH，Hpro)-OH所组成的群，且其中P为一种在至少80％TFA水溶液的强酸条件下裂解的酸可裂解的侧链保护基团，优选P在以下所定义的弱酸条件下不裂解，最优选P为三级-丁基或为三苯甲基，
b.从固相裂解肽，且视需要将肽链去保护。
具体实施方式
GLP-1肽的活性对序列的改变很敏感，大部份周边序列元素允许残基的一些保守取代。显然地，较小的改变对生物稳定性或受体结合且因此对药理活性仍可具有无法预料的效果。对此的良好回顾参见Sarrauste de Menthière等人，European J.Medicinal Chemistry39，2004:473-480。GLP-1肽家族的核心序列部分确实不容许任何的改变。
包含此核心部分的全长或部分肽的线性固相合成遇到个别偶合步骤达到接近不可能的点的完全无效率的重大问题，即使重复偶合亦如此。延长偶合时间、增高偶合温度等等使反应承担增加消旋作用或不要的副产物的风险。
许多作者(Sarrauste，上述，和Adelhorst等人，J.Biol.Chem.269(1994)，6275-6278)已通过二色性光谱分析天然GLP-1-肽在水溶液中的二级结构(例如Chen等人，(1974)通过二色性光谱测定蛋白质在水溶液中的螺旋及贝它形式。生物化学13，3350-3359，Greenfield，N.和Fasman，G.D.(1969)用于蛋白质构形的评估的计算二色光谱。生物化学8，4108-4116)且发现，然而，除了无规卷曲(unorder)及螺线结构的远较大的区域的外，仅相当低含量(10％)的β-折叠构型引起肽骨架的聚集。所使用的光谱法不允许将对应GLP-1序列部份配置至该等结构元素。在技术领域中通常相信固相合成中的聚集且因此产生的问题与β-折叠构型的延长区域的发生有关。低β-折叠构型含量对于大部分至少10aa长度的肽是常见的且与任何合成方法中的稀有问题无关。
Fmoc-假脯氨酸双肽单元可从现有商业途径获得；它们的合成已被披露(例如Ruckle等人，Tetrahedron1999，55(37):11281-11288；Keller等人，1998，J.Am.Chem.Soc.120:2714-2720)。该种假脯氨酸肽最少用于在特殊的中心序列片段或序列位置或部分序列-Val-Ser-Ser-中引入至少一个中心丝氨酸残基，以允许于此序列位置在部分序列-Val-Ser-或-Ser-Ser-使用假脯氨酸双肽，此为本发明的要点，且除了最后进一步地在部分序列-Gly-Thr-或-Phe-Thr-中，优选在部分序列-Gly-Thr-中，引入第二个假脯氨酸残基者的外。本发明的该种假脯氨酸为衍生自Ser或Thr的N-Fmoc-肽基-(4S)-1，3-唑啶羧酸酯类且就本发明而言具有式I的共同结构
Figure A200780004655D00111
其中K为选自由Ser、Val、Phe、Gly所组成的群的氨基酸残基且其中Ser进一步地具有如下定义的在强酸条件下可裂解的侧链-保护基团P；R11、R12独立地为H、甲基或乙基及R10为H或甲基。取代基R11和R12的性质影响肽酰胺键的顺式/反式异构化作用唑啶为其部分且因此在合成期间正面地影响生长中的肽链的结构的假脯氨酸冲击。
就本发明而言，使用焦谷氨酸作为假脯氨酸部分，其需要特殊偶合及去保护化学，亦为可行但为并非优选(Tomasini，C.等人，Tetrahedron letters 2001，42:5211-5214)。
更优选地，只有在如上指明的GLP-1序列内的二个中心Ser残基位置之一的该第一个假脯氨酸残基被使用于本合成方法中。这意谓在合成期间没有使用第二个假脯氨酸双肽单元。最优选地，该第一假脯氨酸双肽为根据本发明用于固相合成的Fmoc-Val-Ser(ΨMe，Me)-OH。
无益地寻求在本发明的独特假脯氨酸双肽不存在下合成GLP-1肽的比较性实例可见实验部分中陈述，说明给与本发明动机的目的技术问题。
用于肽合成的偶合剂在技术领域中为众所周知的(参见Bodansky，M.，肽合成的原则(Principles of Peptide Synthesis)，第2版，Springer Verlag Berlin/Heidelberg，1993；也参见其中偶合添加剂或辅助剂的角色的讨论)。偶合剂可与酸酐类(例如T3P:丙烷膦酸酐)或其它酰化剂例如活化酯类或酸卤化物(例如ICBF，异丁基-氯甲酸酯)混合，或它们可为碳二亚胺(例如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺、二异丙基-碳二亚胺)、活化苯并三嗪-衍生物类(DEPBT:3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮)或苯并三唑的脲(uronium)或鏻盐衍生物。
考虑到最佳产量，短反应时间和保护作用在链加长期间预防消旋作用，更优选为偶合剂系选自由能够活化游离羧酸官能的苯并三唑的脲盐类和鏻盐类组成的群并且反应系在碱存在下进行。该种脲或鏻偶合盐类的适当且和同样地优选的例子为例如HBTU(O-1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐)、BOP(苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲基氨基)-鏻六氟磷酸盐)、PyBOP(苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯啶基鏻六氟磷酸盐)、PyAOP、HCTU(O-(1H-6-氯-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)、TCTU(O-1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐)、HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)、TATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐)、TOTU(O-[氰基(乙氧羰基)亚甲基氨基]-N，N，N’，N”-四甲基脲四氟硼酸盐)、HAPyU(O-(苯并三唑-1-基)氧基双-(吡咯啶基)-脲六氟磷酸盐。
优选地，碱试剂为一种其共轭酸具有从7.5至15的pKa，更优选从7.5至10的pKa的pKa值，且排除肽或氨基酸或氨基酸衍生物的α-氨基官能的弱碱，且该碱优选三级位阻胺。该种及进一步地优选的例子为Hünig-碱(N，N-二异丙基乙基胺)、具有烷基为直链或支链C1-C4烷基的N，N’-二烷基苯胺、2，4，6-三烷基吡啶、2，6-三烷基吡啶或N-烷基-吗福林，更优选其为N-甲基吗福林(NMM)或柯林碱(2，4，6-三甲基吡啶)，最优选其为柯林碱。
偶合添加剂(特别是苯并三唑类型的偶合添加剂)的使用，也是已知的(参见Bodansky，上述)。当使用高活化的前述该种脲或鏻盐偶合剂时，他们的使用为特别优选。因此进一步优选偶合剂添加剂为一种能够形成活化酯的亲核性羟基化合物，更优选具有酸亲核性N-羟基官能，其中N为酰亚胺或为N-酰基或N-芳基取代的三氮烯基，最优选偶合添加剂为N-羟基-苯并三唑衍生物(或1-羟基-苯并三唑衍生物)或为N-羟基-苯并三嗪衍生物。该种偶合添加剂N-羟基化合物已大量且广泛地描述于WO 94/07910和EP-410 182中且其个别披露以引用的方式纳入本文。例子为例如N-羟基-琥珀酰亚胺、N-羟基-3，4-二氢-4-侧氧基-1，2，3-苯并三嗪(HOOBt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)和N-羟基-苯并三唑(HOBt)。N-羟基-苯并三嗪衍生物为特佳，在一最优选具体实例中，偶合剂添加剂为羟基-3，4-二氢-4-侧氧基-1，2，3-苯并三嗪。偶合添加剂的铵盐化合物为已知且它们于偶合化学的用途已被披露于例如US4806641中。
伴随其作为偶合辅助剂的角色，例如HOBt，也可能使用其作为在合成期间保护Arg侧链的离子对试剂，作为对Arg的共价侧链保护的选项。在该情况中，充份地高浓度的HOBt必须在整个固相合成的所有循环处理步骤中维持。
在进一步特别优选的具体实例中，脲或鏻盐偶合试剂为脲盐试剂且优选HCTU、TCTU或HBTU及甚至更优选与N-羟基-3，4-二氢-4-侧氧基-1，2，3-苯并三嗪或其盐组合使用于反应中。对于在除去碱不稳定Nα-保护基团的后用于链肽合成的伸长步骤，此具体实例为主要优选的，但在侧链环化作用期间也可使用于内酰胺化(lactamization)反应。
就本发明而言，应注意HCTU和TCTU定义为被术语“脲盐试剂”包含，如普遍在技术领域中所了解的，尽管这些化合物和可能的类似物经由晶体结构分析已显示包含异亚硝基部分而非脲部分(O.Marder，Y.Shvo，和F.Albericio“HCTU和TCTU:新颖偶合剂:发展和工业应用”，Chimica Oggi 2002，20:37-41)，替代地，在杂环核心上的N-酰氨基取代基引起胍(guanidium)结构。在本上下文中，该类的化合物称为根据本发明的脲盐试剂的‘胍型次类’。
碱不稳定Nα的去保护作用可如技术领域中例行地进行般进行，例如用在N-甲基吗福林(NMP)、二氯甲烷(DCM)或二甲基甲酰胺(DMF)中的20％哌啶。有机非极性非质子溶剂溶剂皆例行地用于技术领域中的所有固相合成的步骤。NMP为优选溶剂。
Fmoc氨基酸或双肽优选每当量的结合反应性固相的氨基官能与正常1-3当量，更优选只与1-2当量的该Fmoc氨基酸试剂偶合，例如通过Kaiser试验测定。偶合温度通常在从15至30℃的范围，尤其是在使用鏻或脲型偶合剂的情形。典型地，约20至25℃的温度被用于偶合。-本发明方法的优点为已发明一种允许产物的高产率或GLP-1产物的优异纯度净而没有强迫使用过量珍贵的生物危险试剂(基本上在反应流出物中大部分的过量物被浪费掉)的合成方法。
保护基团及其用途，主要地用于氨基酸侧链或Nα-端氨基基团的保护，为本领域熟知(cp.Bodanzsky，上述)。Glu、Asp的常用羧基-保护基团为例如Mpe、O-1-金刚烷基、O-苯甲基及甚至可使用简单烷基酯，虽然较不常使用。为了容易的缘故，典型且优选地系使用三级-丁基基团。酪氨酸可被不同保护基团，例如三级-丁基醚或Z-或更优选2-溴-Z酯保护。同样地可能使用三苯甲基醇(alkohol)保护基团例如2-氯-三苯甲基或4-甲氧基或4，4’甲氧基-三苯甲基基团。优选地，其为三苯甲基或三级-丁基保护基团。更佳地，其为三级丁基(tBu)保护基团，表示酪胺酰基侧链被修改至三级-丁基醚。tBu基团只有在强酸条件下有效率地除去。精氨酸保护基团优选可选自由2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃基-5-磺酰基(Pbf)、金刚烷氧基-羰基及异冰片基(isobornyl)-氧基-羰基、2，2，5，7，8-五亚甲基口克唍磺酰基-6-磺酰基(Pmc)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基(Mtr)及其4-三级-丁基-2，3，5，6-四甲基同系物(Tart)或Boc组成的群，其等只在如上述所定义的强酸条件下裂解。更优选地，其为Pbf、Pmc、Mtr，最优选地，其为Pbf；在侧链在强酸条件下(通常水性介质中)的总体去保护后，用Pmc、Mtr且特别是Pbf没有观察到去保护的酪氨酸的旁观者(bystander)烷基化作用。Pbf裂解率为至今最高的。特别对使用HOBt的可选择的离子对保护模式的谙示。Ser、Thr典型可系典型地且优选地经例如三级-丁基或三苯甲基，最优选三级-丁基保护。其它保护的模式同样地能实行的，例如用苯甲基，虽然较不佳，因为最后需要氢解除去或延长在强酸培养下的培养期，两者同样都不符合要求。相似的考虑适用于Lys或正-或高-赖氨酸的保护作用；典型且优选地，Lys系用Boc保护。Trp必须在固相合成期间不需要被保护，虽然典型地用Boc保护为优选。关于侧链保护基团，对于天然L-氨基酸(amind acids)以及其D-同系物前述皆为有效。
固相S应被理解为总计固体、非可溶性撑体材料，该控制孔径玻璃、硅石或更常见的聚合有机树脂如例如Merrifield所使用的标准聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂(PS树脂)与连接肽至其的羟苯甲基-苯基整体连结子部份一起或Wang所使用的PS树脂与直接键联树脂的羟基-苯甲基-对-苯甲氧基部分。该种用于肽的连接的能官位置在此上下文中被称连结子，且应理解在本上下文中以术语‘固相’被心照不宣地推论为强制性的特征。如果需要，其它连结子部分如例如更特化的(例如更酸不稳定)的连结子可被进一步地接枝至在预制固相上的该第一个整体连结子且在技术领域中时常称为“柄(handle)”。该等为连结子-或柄-树脂复合物的进一步例子为分别地以O或N-键联至肽部分的(4-甲氧基苯基)-氨基甲基-或-羟基甲基及(4-甲基苯基)-氨基甲基-或-羟基甲基-PS固相(Atkinson等人，2000，J.Org.Chem.65，5048)，允许在从树脂最终裂解肽时产生C-端酸或甲酰氨基团。为了本发明，固相树脂，使用在合成中，强制性地包含至少一个整体连结子或柄，其为固相核心材料的部分；该连结子或柄可被认为是一种固定的保护基团(Guillier等人，Chem.Rev.100，2091-2157，2000)。典型地，给定包含惰性固体撑体或树脂的固相系凭借其允许用氨基酸或肽的酰化作用的柄基团的连结子的化学性质而处理。更复杂的PEG-接枝聚苯乙烯树脂例如基于特他凝胶(tentagel)的Novasyn TG(Novabiochem，MerckBiosciences，德国)，其可以结合不同接枝柄或连结子的形式获得，比标准PS树脂更具两亲性(amphilic)，且也冲击合成效率。就本发明而言，使用由连结子或柄部分和全无PEG或其它聚氧化烯区段的PS树脂所制备的固相为优选。整体或接枝PEG或聚氧化烯树脂且因此固相为较不佳及优选本发明所排除。
本发明中所使用的树脂具有标准筛孔大小(美国标准局)，其为约50-500网目，更优选100至400网目。
使用光可裂解连结子，如例如披露于Holmes等人，1995，J.Org.Chem.60，2318中的产生甲酰胺的光可裂解连结子系可能的。在另一优选具体实例中，本发明的固相允许在强酸条件下从固相裂解肽。定义上，根据本发明，与弱酸条件相反的强酸条件表示在溶剂中施用至少50％(v/v)三氟乙酸(TFA)。进一步，相反地，一种除去时需要强酸条件的保护基团为一种，至少，可被80％TFA除去的保护基团。因此，就本发明而言，甚至需要更强酸例如HF的保护基团不在前述定义下。弱酸条件定义为具有0.01％(v/v)至<50％TFA，优选具有0.1％至30％TFA。术语“酸不稳定”指在二氯甲烷中的2-10％TFA中于室温下经至少一小时以基本上定量裂解。
在本发明的特定上下文中，上述从固相裂解且大部份或完全地去保护的GLP-1肽以最常用的溶剂或溶剂混合物产生泡沫凝胶溶液。处理该凝胶溶液容易地导致可观的材料损失，特别是在为了从固相分离的过滤操作中。在一优选具体实例中，固相为一种可在如上述所定义的弱酸条件下裂解出仍被保护的肽的固相，使用酸不稳定固相。在该模式中，首先从固相裂解肽且接着，在第二个步骤中，在如上述所定义的强酸条件下侧链去保护。
在一进一步地优选具体实例中，GLP-1肽被从树脂释放为C-端甲酰胺。该种产生甲酰胺的树脂的例子为例如PAL树脂(5-(4-氨基-甲基-3，5-二羟基苯氧基)戊酸酯)、Sieber树脂(Sieber，P.1987，Tetrahedron Lett，28，2107)或相关的口山基酰胺类型树脂(例如US5306562)、Rink酰胺树脂(Rink，H.1987，Tetrahedron Lett.28:3787)、BAL树脂(4-(4-甲酰基-3，5-二甲氧基苯氧基)-丁酸酯，Tetrahedron Lett.43:3543)，优选地可使用产生酸不稳定甲酰胺的树脂，如例如Sieber树脂或其它口山基酰胺类型树脂或BAL树脂，其也为最优选具体实例。
在另一优选具体实例中，固相为酸不稳定固相，其从固相裂解经保护的肽时释放C-端羧酸。该等的实例及进一步地优选具体实例皆为2’-氯-三苯甲基、4-甲氧基或4，4′-二甲氧基-三苯甲基、4-甲基三苯甲基树脂或相关但不同的通过用Bayer的4-羧基三苯甲基连结子酰化而从氨基-或羟基官能化树脂衍生，且例如以Novasyn TG树脂品牌销售的2-(4-羟基-苯基)-2，2-二苯基-乙酰基树脂。进一步地例子为例如酸不稳定Rink酸树脂(4-(2’，4’-二甲氧基苯基-羟甲基)苯氧基，Rink等人，1987，Tetrahedron Lett.28，3787)和HMPB-树脂(Sieber等人，1987，Tetrahedron Lett.28，6147；HMPB:4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酰基，通常偶合至rink酰胺树脂或其衍生物作为第二个柄。
最优选地，根据本发明的肽为羧基端偶合至树脂或树脂柄(S＝固相或树脂，视需为要具有柄的树脂)。
进一步地优选如下所述的特定肽序列及各个肽-固相结合物，其系单独或与上述进一步地优选具体实例组合:
1.
A-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-S                                                             或A-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2
2.
A-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-S                                                       或A-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH或-NH2
3.
A-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-S                                                         或A-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Gly-OH或-NH2
4.
A-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-S                                                        或A-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-NH2
5.
Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-NorVal-Arg-S或A-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-NorVal-Arg-NH2且NorVal为正-1-缬氨酸，其为α-氨基异丁酸或α-甲基丙氨酸，为简称为缩写字-Aib。
实验
实施例1:使用Fmoc-Val-Ser(ΨMe，Mepro)-OH的H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH的合成
上述肽系通过线型Fmoc合成获得。所有偶合的氨基酸皆为商业上可获得的Fmoc-单氨基酸，除了其中在合成期间一个假脯氨酸双肽Fmoc-Val-Ser(ΨMe，Mepro)-OH(得自Merck Biosciences GmbH，Schwalbach/德国，Novabiochem名牌产品)被偶合至N-端序列Ser-Tyr-Leu-Glu-的偶合步骤的外。另一例外，最后的His残基偶合成Boc-His残基；没有赋予His-侧链保护作用。使用侧链保护基团；为了容易列举，没有进一步地提及N-端Fmoc保护的使用:Arg(Pbf)、Asp(tbu)、Gln(Trt)、Glu(tbu)、Lys(Boc)、Ser(tbu)、Thr(tbu)、Trp(Boc)、Tyr(tbu)。
在Fmoc-Gly-2-氯三苯甲基聚苯乙烯树脂(也就是预先加载Fmoc-甘氨酸的2-CTC树脂，订单编号RAA-1039，载入:>0.5毫摩尔/毫升，100-200网目，得自CBL-Patras，希腊)上开始3毫摩尔等级的合成。最初，用二氯甲烷润胀树脂。为了偶合使用2至2.5当量的Fmoc氨基酸的标准Fmoc合成，使用于二氯甲烷-N-甲基吗福啉(DCM:NMP＝1:3)溶剂系统中在二异丙胺/HOBt存在下于25℃经30分钟的氨基酸的HBTU活化作用。没有进行预活化但所有试剂以单一步骤简单混合。Fmoc去保护作用系通过在NMP中的20％(w/w)哌啶接着NMP洗涤至完全除去碱性试剂而达成。洗涤效率系通过四氯苯醌试验评估；在偶合的前重复洗涤直到不再观察到呈蓝色。所有偶合皆良好地进行且不需要再偶合，除了端基Boc-His的外，可能是由于在DCM中的溶解度的问题，其可通过加入少量DMSO作为共溶剂而减少。偶合效率可适当地进一步地通过于位置Gln-17使用非侧链保护的Fmoc-Gln替代Fmoc-Gln(Trt)而改良。
在第一个步骤中，在DCM中的2％TFA于0℃经至少10-30分钟从树脂裂解仍经Boc保护的肽；15分钟的三次重复TFA循环被显示效果最好，每一个接着吡啶处理及润洗。使用1％(w/w)三乙基硅烷(TES)作为捕捉剂(scavenger)。通过氮起泡搅拌反应。裂解的后，通过将反应浓汁(broth)倒进稀吡啶(吡啶/乙醇1:9(v/v))中而使用吡啶中和TFA。树脂用DCM润洗且通过过滤脱掉溶剂。通过在真空下蒸馏掉DCM进行滤液从DCM至乙醇的溶剂交换，且通过加水沉淀最后经保护的肽及过滤。用水洗涤滤饼三次且在真空下于RT干燥肽。在此阶段，获得总计77％产率的具有约77.3％面积(以HPLC评估)的纯度的物质。以HPLC-MS观察到的分子质量对应于理论上预期的质量。此产物在标准溶剂例如DCM中的溶解度是完美的。
在第二个步骤中，在用裂解混合物(‘CC’)稀释的DCM中进行总体去保护作用，DCM:‘CC’＝1:10(v/v)。对于GLP-1肽，发现为了在去保护作用期间将肽的溶解度最佳化，每份纯DCM加入0，1最多至1份的三氟乙醇而非纯DCM是最优选的。‘CC’系以混合比(％w/w):89:2.5:2.5:5.0:1.0的TFA/大茴香硫醚/酚/水/TES所制成。在室温下将得自前述裂解步骤的干燥产物溶解在10毫升如上所述用‘CC’稀释的DCM中且搅拌5小时。接着通过加入50毫升甲基-三级-丁基-醚(MTBE，Fluka Chemie，Buchs/瑞士)，于水浴中在搅拌下将反应经30分钟冷却至0℃，且过滤掉已同时形成的盐沉淀物来回收产物。用MTBE润洗滤饼数次，其然后在室温下干燥，产生0.8克的以HPLC测定的约95％纯度的粗产物。经过步骤2和3的总产率为约75％。
实施例2:比较实例-N-端片段H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-OH(片段1至16)在假脯氨酸不存在下的合成
最初，基本上如实施例1所述进行该小片段的固相合成，除了只着手合成较短片断的外。各偶合反应使用2.5至3当量的氨基酸，氨基酸15至9全部轻易地偶合。然而，下列Fmoc氨基酸8至1有严重问题:仅在二个位置，偶合类似容易地进行。所有的其它位置需要至少二个偶合的重复循环但仍不允许大于30％纯度的满意的产率。为了评估问题的严重性，且忽视一般已知的不适当消旋的方面，剪力偶合方法使用4当量的氨基酸，增加至少一般较少消旋倾向的氨基酸的偶合的温度至30至40℃及使用更具活性的6-Cl-HOBt替代。然而，仍然需要稳定再偶合且无法观察到偶合效率本身的显著改良。如实施例1中所述在2％TFA中在第一个步骤中进行从树脂裂解，除了片段被证明具有非常独特的溶解度性质的外。加入吡啶的后，经保护的未裂解片断形成凝肠(gelt)。结果在过滤步骤的后需要将吡啶仅加至滤液；发现因为凝胶起泡而使DCM蒸馏非常困难，到处留下固体且大幅减少产率。在加入水后，形成可被单离的固体。然而，溶解该固体产物其后再次证明是困难的:经保护的片段为极不溶于DCM、THF、乙腈及其混合物中。加入在THF中的LiCl没有改善溶解度。证明该肽微溶于NMP、DMF或DMSO中，于更合理的浓度产生凝胶状外观，且因此要求在很稀的溶液中操作，发现其对于产率为次佳的。

Claims (8)

1.一种制备GLP-1或GLP-1激动剂肽的方法，其中该肽具有下式
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-R5-(R6)w-(R7)z-B
或具有下式
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-B
或具有下式
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-B
或具有下式
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-B
或具有下式
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-B
或具有下式
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-G1y-B
，其中
B＝-OH或-NH2，
A＝H-、Ac-、Boc-、Fmoc-，
R1＝His、D-His、去氨基(desamino)-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸(homohistidine)、α-氟甲基-组氨酸或α-甲基-组氨酸，
R2＝-Ala、D-Ala、-Val、D-Val、Gly、Aib(α-氨基异丁酸)，
R3＝Glu、Asp、Met、Leu，优选Glu或Asp，最优选Asp，
R4＝-Lys或Arg，
R5＝-Gly、Aib、Ala、D-Ala，
R6＝Arg、Lys或Gly，
R7＝Arg、Lys或Gly，优选Lys或Gly，
R8＝Gly或Aib，
且其中，独立地，x、y、w、z为0或1，其限制条件为当x＝1时y＝1，及其限制条件为当z＝1时w＝1，及进一步地其中个别氨基酸可视需要具有保护基团，其包含下列步骤:
a.通过包含假脯氨酸(pseudoproline)双肽的Fmoc-保护(视需要进一步合适地侧链经保护)的氨基酸或双肽的逐步偶合以线性方式在固相上合成肽，其限制条件为在一个适当序列位置，一选自由Fmoc-Val-Ser(ΨMe，Mepro)-OH、Fmoc-Val-Ser(ΨH，Hpro)-OH、Fmoc-Ser(P)-Ser(ΨMe，Mepro)-OH及Fmoc-Ser(P)-Ser(ΨH，Hpro)-OH所组成的群的第一个假脯氨酸双肽被偶合至生长肽链，其中P为一种在至少80％ TFA的强酸条件下裂解的酸可裂解的保护基团，优选P为三级-丁基或为三苯甲基，
b.从固相裂解肽，且视需要将肽链去保护。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于至少一个环氧丙基残基，其进一步地可以Fmoc环氧丙基残基或以Fmoc-胺酰基环氧丙基残基的形式偶合，系在其骨架Nα上另以N-(o，p-二烷氧基-苯甲基)或以N-(o-羟基-p-烷氧基-苯甲基)或以N-(o-酰氧基-p-烷氧基-苯甲基)而进一步N-保护，且酰氧基和烷氧基独立地分别为C1-C4-烷氧基和C1-C4-酰氧基，其限制条件为该环氧丙基残基不包含在序列-Gly-Thr(ΨMe，Mepro)-或-Gly-Thr(ΨH，Hpro)-中且与另一假脯氨酸或Nα-保护的环氧丙基残基以至少2个介于其中的氨基酸残基分隔。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于使用二个假脯氨酸双肽，其中该第二个与所述第一个以至少四个介于其中的氨基酸残基分隔且优选Fmoc-Gly-Thr(ΨMe，Mepro)-OH。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于合成中只有使用一个假脯氨酸双肽单元，优选Fmoc-Val-Ser(ΨMe，Mepro)-OH被用于偶合至生长中的肽链。
5.一种结合固相的GLP-1或GLP-1激动剂肽，其中该肽具有下式
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-R5-(R6)w-(R7)z-S
或具有下式
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-S
或具有下式
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-S
或具有下式
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-S
或具有下式
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-S
或具有下式
A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-G1y-S
，其中
S＝经由硫酯、酯或酰氨基基团C-端共价或，在C-端氨基酸为赖氨酸的情形，选择性地由该赖氨酸的ε-氨基官能共价键结至肽基部分的固相，
A＝H-、Ac-、Boc-、Fmoc-，
R1＝His、D-His、去氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸或α-甲基-组氨酸，
R2＝-Ala、D-Ala、-Val、D-Val、Gly、Aib(α-氨基异丁酸)，
R3＝Glu、Asp、Met、Leu，优选Glu或Asp，最优选Asp，
R4＝-Lys或Arg，
R5＝-Gly、Aib、Ala、D-Ala，
R6＝Arg、Lys或Gly，
R7＝Arg、Lys或Gly，优选Lys或Gly，
R8＝Gly或Aib，
且其中，独立地，x、y、w、z为0或1，其限制条件为当x＝1时y＝1，及其限制条件为当z＝1时w＝1，其中至少Lys、Thr、Ser、Glu、Asp的个别侧链具有非碱不稳定，优选酸可裂解的保护基团，其在Thr或Ser的情形中保护基团可为假脯氨酸保护基团及其中一个在独特序列片段-Val-Ser-Ser中的Ser为丝氨酸的假脯氨酸-唑啶衍生物，优选自由-Ser(ΨMe，Mepro)-或-Ser(ΨH，Hpro)-所组成的群。
6.如权利要求5所述的结合固相的肽，其特征在于该Ser(Ψ-pro)-假脯氨酸为肽中仅有的假脯氨酸-保护的残基。
7.如权利要求5所述的结合固相的肽，其特征在于该肽包含至少一个第二个假脯氨酸保护的残基，其为-Thr(ΨMe，Mepro)-或为Thr(ΨH，Hpro)-且位于独特序列片段-Gly-Thr-，优选该肽只包含二个假脯氨酸-保护的残基，即所述第一个和第二个假脯氨酸残基。
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