CN1350548A - 长效促胰岛肽 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了经修饰的促胰岛肽。经修饰的促胰岛肽能够形成肽酶稳定的促胰岛肽。经修饰的促胰岛肽能够与一种或多种血液组分形成共价键以生成偶联物。该偶联物可以在体内或离体形成。施用修饰的肽可以治疗患有糖尿病和其它相关疾病的人。

Description

长效促胰岛肽
发明领域
本发明涉及修饰的促胰岛肽。特别是，本发明涉及对糖尿病和其他促胰岛肽有关疾病的治疗、胃肠功能以及与胰高血糖素水平有关的活动具有长效作用的修饰胰高血糖素样肽和exendin肽。
发明背景
促胰岛肽激素胰高血糖素样肽(GLP-1)被推断为一种控制II型非胰岛素依赖型糖尿病以及相关代谢疾病(如肥胖)的可能性治疗剂。其他有效促胰岛肽包括exendin 3和exendin 4。虽然有效，GLP-1、exendin3和exendin 4的缺陷在于与体内血浆半衰期短并且作用持续时间有限，这主要归因于血清清除率快且蛋白水解降解。已经鉴定出负责降解GLP-1的酶是二肽基肽酶IV。许多工作尝试以一定方式抑制肽酶或修饰GLP-1使其降解减缓同时仍然保持生物活性。虽然作了这些多方面的努力，迄今为止没有制备出长效的活性GLP-1。因此，糖尿病群体对改进的GLP-1、exendin 3和exendin 4肽类化合物具有巨大的需求。
所以需要修饰GLP-1、exendin 3、exendin 4和其他促胰岛肽在体内提供长效作用，同时保持其低毒性和治疗功效。
发明概述
为了满足上述需求，本发明涉及修饰的促胰岛肽类(ITPs)。本发明涉及新的化学反应性促胰岛肽的衍生物，其可以与含流动血液蛋白的细胞载体上的有效官能团反应形成共价键。具体来说，本发明涉及新的化学反应性促胰岛肽如胰高血糖素样肽(GLP)和exendin 3及exendin 4的衍生物，其与流动血液蛋白上的有效官能团反应形成共价键。本发明还涉及新的化学反应性促胰岛肽的衍生物和类似物，其可以与流动血液蛋白上的有效官能团反应形成共价键。
本发明涉及修饰的促胰岛肽，其含有与血液化合物上氨基、羟基或巯基反应形成稳定共价键的反应性基团。
本发明涉及含有GLP-1及其衍生物的修饰片段、尤其是GLP-1(7-36)酰胺的促胰岛素。本发明又涉及所述化合物的治疗用途，尤其是修饰GLP-1(7-36)酰胺在治疗成年型糖尿病(II型糖尿病)中的应用。
本发明进一步涉及修饰的Exendin 3和Exendin 4片段和此类化合物的治疗用途。
特别是，本发明涉及GLP-1(1-36)Lys37(ε-MPA)-NH2；GLP-1(1-36)-Lys37(ε-AAEA-AEEA-MPA)-NH2；GLP1(7-36)-Lys37(ε-MPA)-NH2；GLP-1(7-36)-Lys37-(ε-AEEA-AEEA-MPA)-NH2；D-Ala2GLP-1(7-36)-Lys37(ε-MPA)-NH2；Exendin-4(1-39)-Lys40(ε-MPA)-NH2；Exendin-4(1-39)-Lys40(ε-AEEA-AEEA-MPA)-NH2；Exendin-3(1-39)-Lys40(ε-MPA)-NH2；Exendin-3(1-39)-Lys40(-AEEA-AEEA-MPA)-NH2；Lys26(ε-MPA)GLP-1(7-36)-NH2；GLP-1(7-36)-EDA-MPA和Exendin-4(1-39)-EDA-MPA。
本发明进一步涉及含有所述促胰岛肽的衍生物的组合物和该组合物在治疗人体糖尿病中的应用。
本发明进一步涉及提高胰岛素的表达的方法，其包括给哺乳动物胰腺β型胰岛细胞提供有效量的上述公开的经修饰的促胰岛肽。
本发明进一步涉及一种治疗成熟期起始的糖尿病的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用有效量的上述促胰岛肽。
本发明进一步涉及利用本发明的经修饰的促胰岛肽对其他促胰岛肽相关性疾病和病症的治疗。发明详述
定义：
为了保证完全理解本发明，提供下列定义：
促胰岛肽：促胰岛肽(ITPs)是具有促胰岛活性的肽类化合物。显然，促胰岛肽刺激激素胰岛素的合成或表达或引发这种刺激。此类肽包括肽如胰高血糖素样肽、exendin 3和exendin 4以及其他具有促胰岛活性的肽的前体、类似物、片段。
胰高血糖素样肽：胰高血糖素样肽(GLP)和GLP衍生物是肠激素，其一般在高血糖症中刺激胰岛素的分泌，抑制胰高血糖素分泌，促进胰岛素(原)的生物合成并且减慢胃排空和胃酸分泌。一些GLP和GLP衍生物促进细胞摄取葡萄糖，但不促进胰岛素表达，如美国专利No.5,574,008所述，其在此引入作为参考。
Exendin 3和Exendin 4肽：Exendin 3和exendin 4肽和肽衍生物是39个氨基酸的肽，其约53％与GLP-1同源并具有促胰岛活性。
反应性基团：反应性基团是能够形成共价键的化学基团。此类反应试剂与所述促胰岛肽偶联或键合形成修饰的促胰岛肽。反应性基团一般在含水环境中稳定，而且通常为羧基、磷酰基或适当酰基，或者是酯或混合酸酐，或亚胺酸酯(盐)，由此能够与位于流动血液组分的靶位点上的官能团如氨基、羟基或巯基形成共价键。在多数部分，酯包括酚类化合物，或是硫醇酯、烷基酯、磷酸酯等。反应性基团包括琥珀酰亚胺基和马来酰亚胺基。
官能团：官能团是血液组分上的基团，其与经修饰的促胰岛肽上的反应性基团反应形成共价键。官能团包括：键合酯反应体的羟基；与马来酰胺和马来酰亚胺基反应的巯基、亚胺酸酯和硫代酸酯基；与反应体上的羧基、磷酰基或酰基键合的氨基；和与氨基键合的羧基。所述血液组分包括血液蛋白质。
连接基团：连接基团是将反应性基团键合或相连于ITP的化学基团。连接基团可以包括一个或多个烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基等；烷氧基，链烯基，炔基或被烷基取代的氨基，环烷基，多环基团，芳基，多芳基，取代芳基，杂环基和取代杂环基。连接基团也可以含有聚乙氧基氨基酸，例如AEA((2-氨基)乙氧基乙酸)或优选的连接基团AEEA([2-(2-氨基)乙氧基)]乙氧基乙酸)。
血液组分：血液组分可以是固定或者流动的。固定血液组分是非流动血液组分并包括组织、膜受体、间质蛋白、纤维蛋白、胶原、血小板、内皮细胞、上皮细胞及其相关膜和膜受体、躯体体细胞、骨骼肌和平滑肌细胞、神经元组成、骨细胞和破骨细胞以及所有机体组织，尤其是与循环和淋巴系统有关的组织。流动血液组分是在任意长的时间内不具有固定位点的血液组分，一般不超过5分钟，更常常是1分钟。这些血液组分与膜无关并且长时间存在于血液内，并且以至少0.1μg/ml的最低浓度存在。流动血液组分包括血清白蛋白、转铁蛋白、铁蛋白和免疫球蛋白，如IgM和IgG。流动血液组分的半衰期至少约12小时。
保护基：保护基是用于保护肽衍生物不发生自身反应的化学基团。多种保护基公开在本文和U.S.5,493,007(在此引入作为参考)中。此类保护基包括乙酰基、芴基甲氧基羰基(FMOC)、叔丁氧基羰基(BOC)、苄氧基羰基(CBZ)等。具体的保护氨基酸列在表1中。
                            表1
                       天然氨基酸及其缩写
  名称   3个字母的缩写   1个字母的缩写     保护的氨基酸
  丙氨酸   Ala   A     Fmoc-Ala-OH
  精氨酸   Arg   R     Fmoc-Arg(Pbf)-OH
  天门冬酰胺   Asn   N     Fmoc-Asn(Trt)-OH
  天门冬氨酸   Asp   D     Asp(tBu)-OH
  半胱氨酸   Cys   C     Fmoc-Cys(Trt)
  谷氨酸   Glu   E     Fmoc-Glu(tBu)-OH
  谷酰胺   Gln   Q     Fmoc-Gln(Trt)-OH
  甘氨酸   Gly   G     Fmoc-Gly-OH
  组氨酸   His   H     Fmoc-His(Trt)-OH
  异亮氨酸   IIe   I     Fmoc-Ile-OH
  亮氨酸   Leu   L     Fmoc-Leu-OH
  赖氨酸   Lys   K     Fmoc-Lys(Mtt)-OH
  蛋氨酸   Met   M     Fmoc-Met-OH
  苯丙氨酸   Phe   F     Fmoc-Phe-OH
  脯氨酸   Pro   P     Fmoc-Pro-OH
  丝氨酸   Ser   S     Fmoc-Ser(tBu)-OH
  苏氨酸   Thr   T     Fmoc-Thr(tBu)-OH
  色氨酸   Trp   W     Fmoc-Trp(Boc)-OH
  酪氨酸   Tyr   Y     Boc-Tyr(tBu)-OH
  缬氨酸   Val   V     Fmoc-Val-OH
敏感官能团-敏感官能团是指代表ITP肽上潜在反应位点的原子的基团。如果存在，敏感官能团可以选择为用于连接反应性基团修饰的附着点。敏感官能团包括但不限于羧基、氨基、巯基和羟基。
经修饰的肽-经修饰ITP是通过附着反应性基团被修饰且能够通过与血液组分结合形成肽酶稳定化肽的肽。反应性基团可以通过连接基团附着于治疗性肽，或选择性地不采用连接基团附着于治疗性肽。也可以考虑把一种或多种附加氨基酸引入治疗性肽来促进反应性基团的附着。经修饰的肽可以体内给药使其在体内发生与血液组分的结合，或者首先使它们与体外血液组分结合，所得肽酶稳定化肽(如下定义)体内给药。术语“经修饰的治疗性肽”和“经修饰的肽”在本申请中可以互换使用。
肽酶稳定化ITP-肽酶稳定化ITP是经过经修饰的肽的反应性基团和血液组分的官能团之间的共价键、在有或没有连接基团下与血液组分结合的经修饰的肽。肽酶稳定化肽在体内肽酶的存在下比非稳定化肽更加稳定。肽酶稳定化治疗性肽一般比相同序列的非稳定化肽具有提高至少10-50％的半衰期。通过对比血清或血液中未修饰ITP的半衰期和血清或血液中经修饰相应治疗性肽的半衰期可以测定肽酶稳定性。通过在经修饰和未经修饰的肽的给药后采集血清或血液样本并测定肽的活性可以测出半衰期。除了测定活性以外，也可以利用HPLC和质谱测量ITP的长度。发明详述
鉴于上述定义，本发明的焦点在于通过选择性结合在蛋白载体上来修饰促胰岛肽从而提高生物利用度，延长半衰期和分布，但不改变其显著治疗特性。本发明选择的载体(但不限于)是与用马来酰亚胺基团衍生化的促胰岛肽提供的自由巯基结合的白蛋白。
1.促胰岛肽
A.GLP-1和其衍生物
已知合成的激素胰高血糖素是一种大分子量前体分子，其随后在蛋白水解下裂解为三种肽：胰高血糖素、胰高血糖素样肽1(GLP-1)和胰高血糖素样肽2(GLP-2)。GLP-1在其未加工形式中具有37个氨基酸，如SEQ ID NO：1.所示。未加工GLP-1尤其无法介导胰岛素生物合成的诱导。然而，未加工GLP-1肽自然地转化为具有GLP-1的氨基酸7-37(″GLP-1(7-37)″)的31个氨基酸的长肽(7-37肽)SEQ ID NO：2。GLP-1(7-37)也可以经过附加的加工，通过蛋白水解除去C末端的甘氨酸以生成GLP-1(7-36)，其主要存在形式为其C末端残基精氨酸为酰胺化形式的精氨酰胺，即GLP-1(7-36)酰胺。这种加工发生在肠内和胰脏中的较小范围内，得到具有GLP-1(7-37)的促胰岛活性的多肽。
如果化合物能够刺激激素胰岛素的合成或表达或引起这种刺激，则该化合物被视作具有“促胰岛活性”。GLP-1(7-37)和GLP-1(736)的激素活性表现出对胰腺β细胞具有特异性，在此处，它表现为能够诱导胰岛素的生物合成。本发明的胰高血糖素样肽激素可以有助于对成年型糖尿病的发病机理的研究，该疾病是一种以高血糖以特征的病症，其中胰岛素分泌的动力学异常。此外，胰高血糖素样肽适用于该疾病的治疗和处理，以及高血糖症的治疗和处理。
选自已测序的人GLP-1的氨基酸序列的肽组成部分(片段)构成了包含本发明在内的研究的起点。可互换术语“肽片段”和“肽组成部分”是指包括由天然氨基酸序列衍生的合成和天然氨基酸序列。
若干研究人员报导了GLP-1的氨基酸序列(Lopez，L.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 80：5485-5489(1983)；Bell，G.I.等，Nature 302：716-718(1983)；Heinrich，G.等，Endocrinol.115：2176-2181(1984))。前胰高血糖素原(preproglucagon)mRNA结构及其相应氨基酸序列是已知的。前体基因产物，胰高血糖素原成为胰高血糖素和两种的蛋白水解加工业已定性。在此所用的表示GLP-1(1-37)是指具有从第1(N-末端)至第37(C-末端)全部氨基酸的GLP-1多肽。同样地，GLP-1(7-37)是指具有从第7(N-末端)至第37(C-末端)全部氨基酸的GLP-1多肽。同样地，GLP-1(7-36)是指具有从第7(N-末端)至第36(C-末端)全部氨基酸的GLP-1多肽。
在一个实施方案中，GLP-1(7-36)及其肽片段是通过如下所述的常规方式合成，例如通过Merrifield，J.M.(Chem.Soc.85：2149(1962))和Stewart & Young(Solid Phase Peptide Synthesis(Freeman，SanFrancisco，1969)，pages 27-66)所述的公知固相肽合成，这些文献在此引入作为参考。然而，也可以利用如蛋白水解酶通过将天然氨基酸序列片段化获得胰高血糖素多肽的片段或GLP-1的片段。此外，可以利用重组DNA技术获得所需的胰高血糖素原肽或GLP-1的片段，如Maniatis，T.等，Molecular Biology：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，New York(1982)所述，其在此引入作为参考。
本发明包括由诸如GLP-1(1-37)和GLP-1(7-36)的GLP-1衍生的肽。如果可以通过片段化天然序列获得，或者如果可以基于对编码该序列的天然氨基酸的序列或遗传物质(DNA或RNA)的认识合成得到，这种肽被称作“由天然氨基酸序列衍生”。
属于本发明范围内的是那些被称作GLP-1衍生物的分子，例如GLP-1(137)和尤其是GLP-1(7-36)。所述“衍生物”具有以下特征：(1)其分享GLP-1的实质同源性或相似大小的GLP-1片段；(2)能够起促胰岛素作用和(3)利用至少一种此处所提供的试验，该衍生物具有或者(i)比GLP-1的促胰岛活性高的促胰岛素活性，或更优选，(ii)即使当衍生物以10-10M的浓度存在时也可以检测到促胰岛活性，或最优选，(iii)即使当衍生物以10-11M的浓度存在时促胰岛活性也可以检测到。
如果GLP-1衍生物的氨基酸序列至少80％、更优选至少90％和最优选至少95％与GLP-1(1-37)的氨基酸序列相同，该GLP-1的衍生物被称作分享GLP-1的“实质同源性”。
本发明的衍生物包括GLP-1片段，其除了含有基本与天然GLP-1肽同源的序列之外，可以在其氨基和/或其羧基末端含有一个或多个附加氨基酸。所以，本发明涉及可以含有一个或多个在天然GLP-1序列中可能不存在的氨基酸的GLP-1的多肽片段。条件是该多肽具有比GLP-1高的促胰岛活性。附加的氨基酸可以是D-氨基酸或L-氨基酸或它们的结合。
本发明也包括GLP-1片段，其虽然含有与天然GLP-1肽基本上同源的序列，但可以在其氨基和/或其羧基末端缺少一个或多个天然GLP-1发现的附加氨基酸。所以，本发明涉及可以缺少一个或多个正常存在于天然GLP-1序列中的氨基酸的GLP-1的多肽片段，条件是该多肽具有超过GLP-1的促胰岛活性。
本发明还包括上述片段的显著或细微的变体，其具有不重要的氨基酸替代(并因此具有不同于天然序列的氨基酸序列)，条件是该变体具有与上述GLP-1衍生物基本相同的促胰岛活性。显著或细微的替代的例子包括一个碱性残基替代另一个(即Arg替代Lys)、一个疏水性残基替代另一个(即Leu替代Ile)或一个芳族残基替代另一个(即Phe替代Tyr)等。
除了那些具有促胰岛活性的GLP-1衍生物以外，那些促进细胞摄取葡萄糖但不刺激胰岛素表达或分泌的GLP-1衍生物也属于本发明的范围内。此类GLP-1衍生物描述于美国专利No.5,574,008。
可以用于本发明的促进细胞摄取葡萄糖但不刺激胰岛素表达或分泌的GLP-1衍生物包括：
R1-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Xaa-Gly-Arg-R2(SEQ ID NO：3)其中R1选自a)H2N；b)H2N-Ser；c)H2N-Val-Ser；d)H2N-Asp-Val-Ser；e)H2N-Ser-Asp-Val-Ser(SEQ ID NO：4)；f)H2N-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(SEQ ID NO：5)；g)H2N-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(SEQ ID NO：6)；h)H2N-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(SEQID NO：7)；i)H2N-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(SEQ ID NO：8)；j)H2N-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(SEQ ID NO：9)；或k)H2N-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(SEQ ID NO：10)。在所述肽中，X选自Lys或Arg，R2选自NH2、OH、Gly-NH2或Gly-OH。这些肽是不具有促胰岛活性但可有效治疗糖尿病和高血GLP-1糖症的C-末端片段，如US专利No.5,574,008所述。
B.Exendin 3和Exendin 4肽
Exendin 3和Exendin 4是与GLP-1约有53％同源性且发现用作促胰岛剂的39个氨基酸肽(在第2和3残基处不同)。
Exendin-3[SEQ ID No：11]序列是
HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGG PSSGAPPPS，和
Exendin-4[SEQ ID No：12]序列是
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGG PSSGAPPPS。
本发明还包括exendin-4的促胰岛片段，其含有氨基酸序列：Exendin-4(1-31)[SEQ ID No：13]HGEGTFTSDLSKQMEEAVR LFIEWLKNGGPY和Exendin4(1-31)[SEQ ID No：14]HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGY。
本发明也包括exendin-4的抑制片段，其包含氨基酸序列：
Exendin-4(9-39)[SEQ ID No：15]
DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
实施例中提出的其它促胰岛肽如SEQ ID NO：16-22所示。
本发明包括可由天然exendin 3和exendin 4肽衍生的肽。若可以通过片段化天然序列获得，或者若可以基于对编码该序列的天然氨基酸序列或遗传物质(DNA或RNA)的认识合成得到，这种肽被称作“可由天然氨基酸序列衍生”。
属于本发明范围内的是那些被称作exendin 3和exendin 4的“衍生物”的分子。此类“衍生物”具有下列特征：(1)其分享exendin 3和exendin 4的实质同源性或相似大小的GLP-1片段；(2)能够起促胰岛素作用和(3)利用至少一种此处所提供的试验，该衍生物具有或者(i)比exendin3或exendin4的促胰岛活性高的促胰岛素活性，或更优选，(ii)即使当衍生物以10-10M的浓度存在时也可以检测到促胰岛活性，或最优选，(iii)即使当衍生物以10-11M的浓度存在时促胰岛活性也可以检测到。
如果衍生物的氨基酸序列为至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％，与exendin 3或4或具有和衍生物同样数目的氨基酸残基的exendin 3或4的片段的氨基酸序列相同，该exendin 3和exendin 4的衍生物被称作分享exendin 3和exendin 4的“实质同源性”。
本发明的衍生物包括exendin 3或exendin 4片段，其除了含有基本与天然exendin 3或exendin 4肽同源的序列之外，可以在其氨基和/或其羧基末端含有一个或多个附加氨基酸。所以，本发明涉及可以含有一个或多个在天然exendin 3或exendin 4序列中可能不存在的氨基酸的exendin 3和exendin 4的多肽片段，条件是该多肽具有比exendin 3或exendin 4高的促胰岛活性。
同样地，本发明包括exendin 3或exendin 4片段，其虽然含有与天然exendin 3或exendin 4肽基本上同源的序列，但可以在其氨基和/或其羧基末端缺少一个或多个在天然exendin 3或exendin 4肽上发现的附加氨基酸。所以，本发明涉及可以缺少一个或多个正常存在于天然exendin 3或exendin 4序列中的氨基酸的exendin 3或exendin 4的多肽片段，条件是该多肽具有超过exendin 3或exendin 4的促胰岛活性。
本发明还包括上述片段的显著或细微的变体，其具有不重要的氨基酸替代(并因此具有不同于天然序列的氨基酸序列)，条件是该变体具有与上述exendin 3或exendin 4衍生物基本相同的促胰岛活性。显著或细微的替代的例子包括一个碱性残基替代另一个(即Arg替代Lys)、一个疏水性残基替代另一个(即Leu替代Ile)或一个芳族族残基替代另一个(即Phe代替Tyr)等。
2.修饰的促胰岛肽
本发明涉及修饰的促胰岛肽及其衍生物。本发明的经修饰的促胰岛肽包括反应性基团，其可以与血液组分上的有效反应性官能团反应形成共价键。本发明也涉及上述修饰、上述与血液组分的结合及其应用方法。这些方法包括延长经修饰的促胰岛肽的体内有效治疗半衰期。
为了与蛋白上的官能团形成共价键，多种活性羧基，特别是酯可以用作化学反应性基团(反应本体)，其中羟基在修饰促胰岛肽所需的水平上是生理上可接受的。这些连接试剂中可以采用多种不同的羟基，最常见的是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基-磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)、马来酰亚胺-苯甲酰基-琥珀酰亚胺(MBS)、γ-马来酰亚胺基-丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)和马来酰亚胺基丙酸(MPA)。
伯胺是NHS酯的主要靶向，如下图所示。蛋白质N末端上的敏感α-氨基与NHS酯反应。然而，蛋白质上的α-氨基也可以不是NHS偶合所需要的或可利用的。当5个氨基酸在其侧链中含氮时，只有赖氨酸的ε-胺有效地与NHS酯反应。当NHS酯与伯胺的偶联反应释放N-羟基琥珀酰亚胺时形成酰胺键，如下图所示。这些含有反应性基团的琥珀酰亚胺在此称作琥珀酰亚胺基(succinimidyl)。
在本发明的优选实施方案中，蛋白上的官能团应为巯基且化学反应性基团应为含马来酰亚胺基的基团，如(GMBA或MPA)。GMBA代表γ-马来酰亚胺-丁酰胺。此类含马来酰亚胺的基团在此被称作马来酰亚胺基(maleido)。
当反应混合物的pH维持在6.5至7.4之间时，马来酰亚胺基首选肽上的巯基。在pH7.0下，马来酰亚胺基(maleimido)与巯基的反应的速率比其与胺的反应速率快1000倍。马来酰亚胺基和巯基之间形成稳定硫醚键，其在生理条件下不能断裂。
Figure A0080654800172
本发明的促胰岛肽和肽衍生物可以针对特异性标记或非特异性标记的血液组分进行修饰。
A.特异性标记
优选地，本发明的经修饰的促胰岛肽(ITP)被设计为特异性地与流动血液蛋白质上的巯基反应。此类反应优选通过用马来酰亚胺键修饰的治疗性肽(例如，由GMBS、MPA或前体马来酰亚胺制备)与流动血液蛋白(如血清白蛋白或IgG)上的巯基之间的共价键来建成。
在某些环境下，具有马来酰亚胺的特异性标记提供了若干比用基团如NHS和磺基-NHS非特异性标记的流动蛋白更好的优越性。巯基在体内不如氨基般含量丰富。所以，本发明的马来酰亚胺衍生物应不与蛋白共价键合。譬如，在白蛋白(最丰富的血液蛋白)中只存在一个巯基。所以，ITP-马来酰亚胺-白蛋白偶联物应该包括约1∶1的IP和白蛋白摩尔比。除了白蛋白以外，IgG分子(II型)也具有自由巯基。由于IgG分子和血清白蛋白组成了血液中绝大多数的可溶性蛋白，它们也构成血液中多数能够与马来酰亚胺修饰ITP共价键合的自由巯基。
此外，甚至在含自由巯基的血液蛋白中，具有马来酰亚胺的特异性标记导致ITP马来酰亚胺-白蛋白偶联物的优先形成，这归因于白蛋白自身的独特特性。在多种物质中非常守恒的白蛋白的唯一自由巯基位于第34个氨基酸残基(Cys34)上。目前业已证实，白蛋白的Cys34比位于其他含自由巯基的蛋白质上的自由巯基更高的反应性。这部分归因于白蛋白Cys34具有非常低的pK值5.5。该值远远小于普通半胱氨酸残基的典型pK值，其典型为约8。由于这种低pK，在正常的生理条件下，白蛋白的Cys34主要呈电离形式，据报导由此急剧提高了其反应性。除了Cys34的pK值低以外，另一个提高Cys34的反应性的因素是其位置，它位于接近于白蛋白V区的一个环状结构的表面的裂缝内。这样的位置使Cys34非常容易为所有种类的配体利用，在Cys34作为自由基捕获物和自由巯基清除剂的生物作用中是非常重要的因素。这些特性令Cys34非常容易和ITP-马来酰亚胺反应，该反应速率的加快可以是TP-马来酰亚胺与其他含自由巯基蛋白的反应的速率的1000倍。
ITP-马来酰亚胺-白蛋白偶联物的另一个优越性是与肽和Cys34特异性白蛋白的1∶1负荷有关的重现性。其他技术如戊二醛、DCC、EDC和其他如自由胺的化学活化缺乏这样的选择性。譬如，白蛋白含有52个赖氨酸残基，其中的25-30个位于白蛋白的表面并且易于偶联。活化这些赖氨酸残基，或者选择性地修饰肽以通过这些赖氨酸残基偶联，可以得到异种种群的偶联物。即使采用1∶1摩尔比的肽和白蛋白，产物应由多种偶联产物组成，一些产物每个白蛋白含有0、1、2或多个肽，并且各产物具有随机偶联在任一25-30个可利用赖氨酸位点上的肽。考虑到可能存在多种组合形式，难以描述各批次的精确组成和特性，并且批次和批次之间的重现性几乎是不可能的，使此类偶联物无法成为所期望的治疗剂。而且，虽然似乎通过白蛋白的赖氨酸残基的偶联作用至少具有每个白蛋白分子可传递多个治疗剂的优点，研究显示优选1∶1的治疗剂和白蛋白比例。在Stehle等的″The Loading RateDetermines Tumor Targeting Properties of Methotrexate AlbuminConjugates in Rats，″Anti-Cancer Drugs，Vol.8，pp.677-685(1997)(该文献在此引入作为参考)中，作者报导了经戊二醛偶联的1∶1比例的抗癌氨甲蝶呤和白蛋白产生最有希望的结果。这些偶联物被肿瘤细胞吸收，而带有5∶1至20∶1氨甲蝶呤分子的偶联物具有改变的HPLC性能，并且在体内迅速被肝脏摄取。由此假定，在这些较高的比例下，白蛋白的构象改变削弱了其作为治疗载体的有效性。
通过马来酰亚胺-ITP的体内控制给药，人们也可以控制体内白蛋白和IgG的特异性标记。在常规的给药中，80-90％施用的马来酰亚胺-ITP将标记白蛋白，5％以下标记IgG。也可以出现自由巯基如谷胱甘肽的痕量标记。此类特异性标记优选体内应用，因为它能够精确计算所给药物的半衰期。
除了提供可控体内特异性标记以外，马来酰亚胺-TP可以提供离体血清白蛋白和IgG的特异性标记。这种离体标记包括将马来酰亚胺-ITP加入含有血清白蛋白和/或IgG的血液、血清或盐水溶液中。一旦马来酰亚胺-TP离体修饰后，血液、血清或盐水溶液可以重新施用到血液中进行体内治疗。
与NHS-肽相反，马来酰亚胺-ITP在水溶液和自由胺的存在下一般相当稳定。由于马来酰亚胺-ITP只与自由巯基反应，通常不需要用保护基来防止马来酰亚胺-ITP自身发生反应。此外，提高了的肽的稳定性允许应用进一步的纯化步骤如HPLC来制备高度纯化的适合体内使用的产物。最后，提高了的化学稳定性为产物提供了较长的半衰期。
B.非特异性标记
为了血液组分的非特异性标记也可以修饰本发明的ITP。对于非特异性标记，一般采用与氨基键合，尤其是形成酰胺键。为了形成这种键，可以采用多种活性羧基、特别是酯作为化学反应性基团与ITP偶联，其中羟基部分在所需水平下为生理可接受的。虽然这些连接剂中可以采用许多不同的羟基，但最常用的是N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-羟基-磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)。
其他可利用的连接剂公开在美国专利5,612,034，其在此引入作为参考。
具有非特异ITP的化学反应性基团的多种位点可以在体内反应，包括细胞，特别是血红细胞(红细胞)和血小板，以及蛋白质，例如免疫球蛋白，包括IgG和IgM、血清白蛋白、铁蛋白、甾类结合蛋白、转铁蛋白、甲状腺素结合蛋白、α-2-巨球蛋白等。那些与衍生化ITP反应且无法长时间存活的受体一般在约3天内自人体宿主中消除。基于在血液中的浓度，上述蛋白质(包括细胞的蛋白)将在血流中保存至少3天，并且可以保存5天或更长时间(一般不超过60天，更常见不超过30天)特别是对于半衰期。
首先，反应是与血液中的流动组分，特别是血液蛋白和细胞，更具体为血液蛋白和红细胞。所谓“流动”是指在任意长的时间内，一般不超过5分钟，更常为1分钟，没有固定位点，虽然一些血液组分可能在长时间内相对静止。最初，应存在相对异质群体的标记蛋白和细胞。然而，在多数情况中，上述群体在给药后数天内将从起始群体发生实质性变化，这取决于标记蛋白在血流中的半衰期。所以，通常是在约3天或更长时间内，IgG变为血流中的优势标记蛋白。
通常，在给药后5天后，IgG、血清白蛋白和红细胞将是至少约60％摩尔、通常至少约75％摩尔的血液偶联组分，并且IgG、IgM(非常低的范围)和血清白蛋白是至少约50％摩尔、通常至少约75％摩尔、更常至少约80％摩尔的非细胞偶联组分。
预期的非特异性ITP和血液组分的偶联物可以通过给患者直接施用ITP体内制备，该患者可以是人体或其他哺乳动物。给药可以采取快速浓注或利用计量流量等通过输液在长时间内缓慢输注的给药形式。
如果希望，目标偶联物也可以通过结合血液和本发明的衍生化ITP来离体制备，使修饰的ITP和血液组分上的反应性官能团共价键合，随后把偶联血液返回或施用给宿主。此外，上述制备也可通过首先纯化各血液组分或有限数量的组分如血红细胞、免疫球蛋白、血清白蛋白等来实现，并且把这些组分或离体组分与化学反应性ITP结合。随后把标记血液或血液组分返回给宿主以在体内提供目标治疗有效偶联物。在离体操作中也可以对血液进行处理以防止其凝结。
3.修饰ITP的合成
A.ITP合成
ITP片段可以利用所属领域普通技术人员熟知的标准固相肽化学方法合成。譬如，ITP片段可以通过固相化学技术按照下面由Steward和Young(Steward，J.M.和Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd Ed.，Pierce Chemical Company，Rockford，III.，(1984)所述方法利用Applied Biosystems合成仪制备。同样地，可以合成多个片段，随后连接在一起形成更大的片段。这些合成肽片段也可在特定位置用氨基酸替代制备。
对于固相肽合成，有关多种技术的概述可以参见J.M.Stewart和J.D.Young，Solid Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.(SanFrancisco)，1963和J.Meienhofer，Hormonal Proteins and Peptides，vol.2，p.46，Academic Press(New York)，1973。经典的溶液合成法可参见G.Schroder和K.Lupke，The Peptides，Vol.1，Acacemic Press(NewYork)。一般地，这些方法包括顺序加入一种或多种氨基酸或适当保护的氨基酸使肽链延长。正常情况下，第一个氨基酸的氨基或羧基被适宜的保护基保护。随后，该保护或衍生化氨基酸附着在惰性固相载体上或通过加入的下一个在序列中具有互补(氨基或羧基)基团的适当保护的氨基酸且在适合形成酰胺键的条件下以溶液形式被利用。随后从新加入的氨基酸残基除去保护基并且加入下一个氨基酸(适当保护除的)，并且如此继续。
当所有预期的氨基酸已经以适当序列连接后，依次或同时脱除任何残留的保护基(和任何固体载体)以得到最终的多肽。通过对这种通用方法的简化改进，可以一次添加一个以上的氨基酸使链延长，譬如，通过偶联(在不外消旋化手性中心的条件下)保护的三肽和适当保护的二肽，在脱保护后形成五肽。
特别优选的制备本发明化合物的方法包括固相肽合成法，其中用酸或碱敏感基团保护氨基酸α-N-末端。该保护基应具有对肽键形成的条件稳定的特性，同时易于脱除而不破坏生长的肽链或不外消旋化含于其中的任何手性中心。适用的保护基是：9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、苄氧基羰基(Cbz)、联苯基异丙氧基羰基、叔戊氧基羰基、异冰片基氧基羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苄氧基羰基、邻硝基苯基次磺酰基、2-氰基-叔丁氧基羰基等。9-芴基-甲氧基羰基(Fmoc)保护基特别适用于ITP片段的合成。其他优选的侧链保护基是：对于侧链氨基如赖氨酸和精氨酸是2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(pmc)、硝基、对甲苯磺酰基、4-甲氧基苯磺酰基、Cbz、Boc和金刚烷氧基羰基；对于酪氨酸是，苄基、邻溴苄氧基羰基、2，6-二氯苄基、异丙基、叔丁基(t-Bu)、环己基、环戊基和乙酰基(Ac)；对于丝氨酸，是叔丁基、苄基和四氢吡喃基；对于组氨酸，是三苯甲基、苄基、Cbz、对甲苯磺酰基和2，4-二硝基苯基；和对于色氨酸，是甲酰基；对于天门冬氨酸和谷氨酸，是苄基和叔丁基；和对于半胱氨酸，是三苯基甲基(三苯甲基)。
在固相肽合成方法中，α-C-末端氨基酸附着在适当的固体载体或树脂上。适于上述合成的固体载体是那些对逐级缩合-脱保护反应的试剂和条件呈惰性且在所用介质内不溶解的物质。α-C-末端羧基肽的合成所优选的固体载体是4-羟基甲基苯氧基甲基-共聚(苯乙烯-1％二乙烯基苯)。α-C-末端酰胺肽的优选固体载体是Applied Biosystems(FosterCity，Calif.)出售的4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基乙酰氨基乙基树脂。α-C-末端氨基酸与树脂通过N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)或O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N′-四甲基脲-六氟磷酸盐(HBTU)的方式偶联，有或没有4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)或双(2-氧-3-噁唑烷基)氯化膦(BOPCI)介导下偶联在10至50℃内于溶剂如二氯甲烷或DMF中进行约1至约24小时。
当固体载体是4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基-乙酰氨基乙基树脂时，在与上述α-C-末端氨基酸偶联之前，Fmoc基用仲胺、优选哌啶裂解。和脱保护的4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基-乙酰氨基乙基树脂偶联的优选方法是在DMF中利用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N′-四甲基脲六氟-磷酸(HBTU，1当量)和1-羟基苯并三唑(HOBT，1当量)。连续保护的氨基酸的偶联可以在所属领域熟知的自动多肽合成仪中进行。在一个优选实施方案中，生长肽链的α-N-末端氨基酸用Fmoc保护。通过用仲胺，优选用哌啶处理可以从生长肽链的α-N-末端侧脱去Fmoc保护基。随后将各保护的氨基酸以约3倍摩尔过量引入，优选在DMF中进行偶联反应。偶联剂一般是O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N′-四甲基脲六氟磷酸(HBTU，1当量)和1-羟基苯并三唑e(HOBT，1当量)。
在固相合成结束时，连续或在同一操作中从树脂上脱下多肽并且脱保护。多肽的脱除和脱保护可以在同一操作中通过用裂解剂处理树脂结合多肽完成，裂解剂包括硫苯甲醚(thianisole)、水、乙烷二硫醇和三氟乙酸。在多肽的α-C-末端为烷基酰胺的情形下，树脂用烷基胺通过氨解裂解。另外，肽可以通过酯交换脱去，例如用甲醇，随后通过氨解或直接酰胺基转移。保护肽可以在此时纯化，或者直接进行下一步。侧链保护基的脱除是利用上述混合裂解剂进行。完全脱保护肽通过一系列的采用下列任何或全部类型的色谱步骤进行纯化：弱碱性树脂(乙酸型)上的离子交换；在未衍生聚苯乙烯-二乙烯基苯(例如Amberlite XAD)上的疏水吸附色谱；硅胶吸附色谱；在羧甲基纤维素上的离子交换色谱；分配色谱，例如在SephadexG-25、LH-20上或逆流分配；高效液体色谱(HPLC)，尤其是在辛基-或十八烷基甲硅烷基-硅胶键合相柱填充上的反相HPLC。
这些ITP的分子量利用快速原子轰击(FAB)质谱法测定。
本发明的ITP可以利用N-和C-末端保护基合成作为前药使用。
1.N-末端保护基
如上所述，术语“N-保护基”是指那些用于保护氨基酸或肽的α-N-末端或保护氨基酸或肽的氨基在合成过程中不发生预期外反应的基团。常用的N-保护基公开在“Protective Groups In OrganicSynthesis”(John Wiley & Sons，New York(1981))，其在此引入作为参考。另外，保护基可以作为前药使用，其易于在体内裂解，例如通过酶促水解，释放出生物活性母体。α-N-保护基含有低级烷基，例如甲酰基、乙酰基(″Ac″)、丙酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基等；其他酰基包括2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻苯二酰基、邻硝基苯氧基乙酰基、-氯丁酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基等；磺酰基，例如苯磺酰基、p-甲苯磺酰基等；氨基甲酸酯形成基团，例如苄氧基羰基、对氯苄氧基羰基、对甲氧基苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、2-硝基苄氧基羰基、对溴苄氧基羰基、3，4-二甲氧基苄氧基羰基、3，5-二甲氧基苄氧基羰基、2，4-二甲氧基苄氧基羰基、4-乙氧基苄氧基羰基、2-硝基-4，5-二甲氧基苄氧基羰基、3，4，5-三甲氧基苄氧基羰基、1-(p-联苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苄氧基羰基、二苯甲基氧基羰基、叔丁氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基、异丙氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2，2，2-三氯乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧基羰基、环戊基氧基羰基、金刚烷氧基羰基、环己基氧基羰基、苯基硫代羰基等；芳烷基，例如苄基、三苯甲基、苄氧基甲基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)等；和甲硅烷基，例如三甲基硅烷基等。
2.羧基保护基
如上所述，术语″羧基保护基″是指当反应涉及化合物的其他官能位点时用于阻断或保护羧酸官能度的羧酸保护酯或酰胺基。羧基保护基公开在Greene，″Protective Groups in Organic Synthesis″pp.152-186(1981)，其在此引入作为参考。此外，羧基保护基可以用作前药，由此羧基保护基可以易于在体内裂解，例如通过酶促水解，释放生物活性母体。此类羧基保护基为所属领域技术人员熟知，业已广泛用在青霉素和头孢菌素领域中的羧基保护，如美国专利Nos.3,840,556和3,719,667，其公开内容在此引入作为参考。典型羧基保护基是C1-C8低级烷基(例如甲基、乙基或叔丁基等)；芳烷基，例如苯乙基或苄基以及它们的取代衍生物，例如烷氧基苄基或硝基苄基等；芳基链烯基，例如苯基乙烯基等；芳基及其取代衍生物，例如5-二氢茚基等；二烷基氨基烷基，例如二甲基氨基乙基等)；烷酰氧基烷基，例如乙酰氧基甲基、丁酰氧基甲基、戊酰氧基甲基、异丁酰氧基甲基、异戊酰氧基甲基、1-(丙酰氧基)-1-乙基、1-(新戊酰氧基)-1-乙基、1-甲基-1-(丙酰氧基)-1-乙基、新戊酰乙基甲基、丙酰氧基甲基等；环烷酰氧基烷基，例如环丙基羰氧基甲基、环丁基羰氧基甲基、环戊基羰氧基甲基、环己基羰氧基甲基等；芳酰氧基烷基，例如苯甲酰氧基甲基、苯甲酰氧基乙基等；芳烷基羰氧基烷基，例如苄基羰氧基甲基、2-苄基羰氧基乙基等；烷氧基羰基烷基或环烷氧基羰基烷基，例如甲氧基羰基甲基、环己氧基羰基甲基、1-甲氧基羰基-1-乙基等；烷氧基羰氧基烷基或环烷氧基羰氧基烷基，例如甲氧基羰氧基甲基、叔丁氧基羰氧基甲基、1-乙氧基羰氧基-1-乙基、1-环己氧基羰氧基-1-乙基等；芳氧基羰氧基烷基，例如2-(苯氧基羰氧基)乙基、2-(5-二氢茚基氧基羰氧基)乙基等；烷氧基烷基羰氧基烷基，例如2-(1-甲氧基-2-甲基丙烷-2-酰氧基)乙基等；芳烷氧基羰氧基烷基，例如2-(苄氧基羰基氧基)乙基等；芳基链烯基氧基羰氧基烷基，例如2-(3-苯基丙烯-2-基氧基羰氧基)乙基等；烷氧基羰基氨基烷基，例如叔丁氧基羰基氨基甲基等；烷基氨基羰基氨基烷基，例如甲基氨基羰基氨基甲基等；烷酰基氨基烷基，例如乙酰基氨基甲基等；杂环羰氧基烷基，例如4-甲基哌嗪基羰氧基甲基等；二烷基氨基羰基烷基，例如二甲基氨基羰基甲基、二乙基氨基羰基甲基等；(5-(低级烷基)-2-氧-1，3-二氧杂环戊烯-4-基)烷基，例如(5-叔丁基-2-氧-1，3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基等；和(5-苯基-2-氧-1，3-二氧杂环戊烯-4-基)烷基，例如(5-苯基-2-氧-1，3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基等。
代表性的酰胺羧基保护基是氨基羰基和低级烷基氨基羰基。
优选的本发明羧基保护化合物是这样的化合物，其中保护羧基是低级烷基、环烷基或芳烷基酯，譬如甲酯、乙酯、丙酯、异丙酯、丁酯、仲丁酯、异丁酯、戊酯、异戊酯、辛酯、环己酯、苯乙酯等；或烷酰氧基烷基、环烷酰氧基烷基、芳酰氧基烷基或芳烷基羰氧基烷基酯。优选的酰胺羧基保护基是低级烷基氨基羰基。譬如，天门冬氨酸在α-C-末端被酸活泼基团(例如叔丁基)保护和在β-C-末端被氢化活泼基团(例如苄基)保护，随后在合成过程中选择性地脱保护。
B.ITP的修饰
本发明制备修饰TIP的方式根据含有ITP的不同要素的本质变化多端。合成方法的选择应简便、提供高产率并且能够得到高纯度产物。通常，化学反应性基团应在合成的最后阶段产生，譬如，羧基酯化生成活性酯。本发明制备修饰ITP的具体方法如下所述。
为经受用连接基和反应试剂修饰选择的各个ITP按照下列标准修饰：如果一个位于起始ITP上的对保持其药理学活性没有决定作用的羧基可利用，并且ITP上不存在其他反应性官能度时，则选择该羧基作为连接基-反应本体修饰的附着点。如果没有羧酸可利用，则选择其他对保持药理学活性没有决定性影响的官能团作为连接基-反应体修饰的附着点。如果位于ITP上有若干官能团可以利用，保护基的联合形式应以一定方式应用以使连接基/反应本体的加入和全部保护官能团脱保护后仍然保持药理学活性。如果ITP上没有反应性官能团可利用，合成实践应以能够保持生物活性且保证受体或靶向特异性的方式修饰起始ITP。
活性反应本体位于一个在ITP与血液组分键合时ITP保持大部分未修饰ITP活性的位点。
更具体地说，选择经受连接基和反应本体衍生化的各个ITP按照下列标准修饰：如果治疗性肽上的末端羧基可以利用并且对药理学活性的保持没有决定性作用，并且ITP上不存在其他敏感官能团，则选择该羧基作为连接基-反应本体修饰的附着点。如果末端羧基涉及药理学活性，或如果没有可利用的羧基，则可以选择任何其他对保持药理学活性没有实质影响的敏感官能团作为连接基-反应本体修饰的附着点。如果在ITP上存在若干个可利用的敏感官能团，保护基的联合形式应以一定方式应用以使加入连接基/反应本体和全部保护官能团脱保护后，仍然保持药理学活性。如果治疗性肽上没有敏感官能团可利用，合成实践应以能够保持生物活性且保证受体或靶向特异性的方式修饰起始ITP。在这种情形下，修饰发生在肽的相反末端。
NHS衍生物可以由羧酸在治疗性肽中不存在其他敏感官能团的条件下合成。具体而言，这种治疗性肽与N-羟基琥珀酰亚胺在无水CH2Cl2和EDC中反应，利用层析或重结晶从适当溶剂体系纯化产物，得到NHS衍生物。
另外，NHS衍生物可以从含有氨基和/或巯基和羧酸的ITP合成。当分子中存在自由氨基或巯基时，优选在加入NHS衍生物之前将这些敏感官能团保护起来。譬如，如果分子含有自由氨基，有必要在进行上述化学反应之前使胺转化为Fmoc或优选转化为tBoc保护的胺。胺官能团应在NHS衍生物的制成后脱保护。所以，这种方法只适用于那些不必释放其氨基以产生预期药理学效应的化合物。此外，NHS衍生物可以从含有氨基或巯基且无羧酸的治疗性肽合成。当选择的分子不含有羧酸时，可以利用一组双官能连接基使分子转化为反应性NHS衍生物。譬如，将乙二醇-双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)和三乙胺溶于DMF中，向其中加入含自由氨基的分子(与EGS的比例是10∶1)，将会产生一元NHS衍生物。为了从巯基衍生分子制备NHS衍生物，可以利用存在于DMF中的N-[-马来酰亚胺基丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS)和三乙胺。马来酰亚胺基与自由巯基反应，利用在硅胶上层析或通过HPLC可以从反应混合物纯化NHS衍生物。
NHS衍生物也可以从含有多个敏感官能团的ITP合成。各种情况业已得到分析并以不同的方式解决。然而，借助于大量市售的保护基和双官能连接基，本发明可以应用于任何治疗性肽，优选通过一步只衍生化ITP的化学步骤，或首先保护敏感基团的两个步骤或三个步骤(保护、活化和脱保护)。只有在例外的情形中，需要利用多步(超过三步)合成使治疗性肽转化为活性NHS或马来酰亚胺衍生物。
马来酰亚胺衍生物也可以由含有自由氨基和游离羧酸的ITP合成。为了从氨基衍生化分子制备马来酰亚胺衍生物，可以利用存在于DMF中的N-[-马来酰亚胺基丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS)和三乙胺。琥珀酰亚胺酯基与自由氨基反应，并且通过结晶或在硅胶上层析或HPLC可从反应混合物中纯化马来酰亚胺衍生物。
最后，马来酰亚胺衍生物可以从含有多个其他敏感官能团且不含游离羧酸的治疗性肽合成。当选择不含有羧酸的分子时，可以利用一组双官能交联剂把该分子转化为反应性NHS衍生物。譬如，马来酰亚胺基丙酸(MPA)可以和游离胺偶联，通过游离胺和MPA的羧基在HBTU/HOBt/DIEA活化下于DMF中的反应生成马来酰亚胺衍生物。
许多市售的其他杂双官能交联剂可以在必要时作为替代。大量双官能化合物可以用来连接本体。试剂的实例包括：叠氮基苯甲酰肼、N-[4-(p-叠氮基水杨基氨基)丁基]-3′-[2′-吡啶基二硫代)丙酰胺)、双磺基琥珀酰亚胺基辛二酸盐、二甲基己二酰亚胺酯、二琥珀酰亚胺基酒石酸盐、N-y-马来酰亚胺基丁酰氧基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸盐、N-琥珀酰亚胺基[4-叠氮基苯基]-1，3′-二硫代丙酸酯、N-琥珀酰亚胺基[4-碘代乙酰基]氨基苯甲酸盐、戊二醛和琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸盐。
4.修饰ITP的应用
发现本发明的经修饰ITP具有多种用途，包括：用作糖尿病的治疗、镇静剂、神经系统失调的治疗；用于对CNS产生抗焦虑作用；用于激活CNS；用于术后治疗和用作胰岛素耐受性的治疗。
A.糖尿病治疗
本发明的经修饰ITP一般通过葡萄糖依赖性、胰岛素依赖性和胰岛素非依赖性机理使高血糖正常化。因此，修饰ITP可以有效地作为治疗II型糖尿病的基本药物和I型糖尿病的辅助药物。
在糖尿病治疗中使用有效量的经修饰ITP具有比未修饰ITP更有效的优点。由于修饰ITP在体内稳定转移，施用较少量的分子可以产生有效治疗。本发明尤其适合治疗患有I型和II型糖尿病的患者，其中肽的作用依赖于血液葡萄糖的浓度，由此比现有治疗方法大大降低了低血糖副作用的危险性。
本发明还提供一种治疗个体中糖尿病的方法，其中该方法包括提供足以治疗糖尿病的量的经修饰ITP；其中组合物含有修饰ITP。
B.神经系统失调的治疗
还发现本发明的经修饰ITP可以用作镇静剂。在本发明的一个方面中，提供一种利用本发明的经修饰ITP对患有因中枢或外周神经系统增强活化导致的异常的哺乳动物对象实施镇静的方法。该方法包括给该对象施用足够产生镇静或抗焦虑作用量的经修饰ITP。修饰ITP可以经脑心室内、口服、皮下、肌肉内或静脉内给药。该方法可以有效治疗或缓解神经系统的疾病，例如焦虑、运动失调、攻击、精神病、癫痫发作、恐慌发作、癔病和睡眠紊乱。
在一个相关方面，本发明涉及一种提高哺乳动物对象的活动度的方法，包括给该对象施用足以对该对象产生激活作用量的经修饰ITP。优选地，该对象患有因中枢或外周神经系统的活化减弱所致的疾病。发现修饰ITP特别适用于治疗或缓解抑郁、分裂情感性障碍症、睡眠呼吸窒息、注意力缺乏综合征伴精神集中低下、失忆、健忘症和发作性睡眠，这仅仅列举了少数其中中枢神经系统的激发可以有利的病症。
可以用本发明的经修饰ITP诱导激活，用来治疗或缓解抑郁、分裂情感性障碍症、睡眠呼吸窒息、注意力缺乏综合征伴精神集中低下、失忆、健忘症和发作性睡眠。修饰ITP疗法的治疗功效可以通过探询患者了解其状态、利用心理学/神经学试验或通过与窒息疾病有关的症状的好转进行监测。譬如发作性睡眠的治疗可以通过监测睡眠发作的发生次数来获得。另外譬如，可以利用任何所属领域技术人员熟知的许多诊断试验来测试修饰ITP对该对象注意力或记忆能力的效果。
C.术后治疗
可以利用本发明的经修饰ITP进行术后治疗。需要本发明修饰ITP的患者可以在手术之前约1-16小时、在患者手术过程中和患者术后不超过约5天内实施。
本发明的经修饰ITP在手术开始之前约16小时至约1小时时给药。当本发明所用的化合物将为减少分解代谢作用和胰岛素耐受性给药时，术前时间的长短取决于多种因素。这些因素是普通技术的医师所公知的，并且首要包括患者是否在术前的准备期间禁食或补充葡萄糖输注液或饮料，或一些其它形式的营养物。其它的重要因素包括：患者的性别、体重和年龄，失去调节血糖能力的严重程度，不能调节血糖的基本原因，预测的手术引起创伤的严重性，给药途径和生物利用度，机体的持久性，配方和所给化合物的效价。本发明所用的经修饰ITP开始给药后的优选时间间隔是从手术开始前约1小时至约10小时。开始给药的最优选时间间隔是在手术开始之前2小时至8小时。
特定类型的手术，选择性腹部手术后的胰岛素耐受在术后第一天最严重，至少持续5天，并且需要3周恢复正常。所以，术后患者可能需要在手术创伤后施用一段时间的本发明的经修饰ITP，这取决于多种由普通技术的医师应理解和判断的因素。这些因素是患者是否在术后禁食或补充葡萄糖输注液或饮料，或一些其它形式的营养物；并且不限于患者的性别、体重和年龄，失去调节血糖能力的严重程度，不能调节血糖的基本原因，预测的手术引起创伤的严重性，给药途径和生物利用度，机体的持久性，配方和所给化合物的效价。本发明化合物的优选给药持续时间是术后5天以上。
D.胰岛素耐受性的治疗
可以利用本发明的经修饰ITP治疗胰岛素耐受性，这与其在术后治疗中的应用无关。胰岛素耐受性可以归因于胰岛素对细胞表面受体结合力的降低，或细胞内代谢的变化。在特征为胰岛素敏感性降低的第一种类型中，一般通过提高胰岛素浓度来克服。特征为胰岛素响应能力降低的第二种类型无法利用最大胰岛素的量来克服。创伤后的胰岛素耐受性可以利用与胰岛素耐受性成正比的胰岛素剂量加以克服，但由此显然会导致胰岛素敏感性的降低。
修饰ITP正常化患者血糖水平的有效剂量将取决于多种因素，其中包括但不限于：患者的性别、体重和年龄，失去调节血糖的能力的严重程度，不能调节血糖的基本原因，是否同时给予葡萄糖或另一种碳水化合物源，给药途径和生物利用度，机体的持久性，配方和效价。
5.修饰ITP的给药
修饰的ITP在给药时应存在于生理可接受介质中，例如去离子水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、盐水、含水乙醇或其它醇、血浆、蛋白性溶液、甘露糖醇、葡萄糖水、醇、植物油等。其它可以含有的添加剂包括：缓冲剂，其中介质一般被缓冲在约5至10的pH范围内，而缓冲剂浓度一般约为50至250mM；盐，其中盐的浓度通常约为5至500mM；生理可接受稳定剂等。组合物可以被冷冻干燥以常规储存和运输。
修饰ITP多数经口服给药，非肠道给药，例如血管内(IV)、动脉内(IA)、肌肉内(IM)、皮下(SC)等。在适合的情况中可以通过输液给药。在某些场合中，当官能团的反应相对缓慢时，可以通过口服、经鼻、直肠、透皮或气溶胶给药，其中偶联物的特性能够传递到血管系统。通常应采用单剂量注射，虽然如果需要时可采用多次注射，可通过任何常规工具给药修饰ITP，包括注射器、套管针、导管等。具体给药方式应根据给药量、是否单剂量快速浓注或是连续给药等改变。优选地，应血管内给药，引入的位点对于本发明而言并不重要，优选的位点是血流快速的地方，例如静脉内，外周或中枢静脉。发现可以利用其它途径，使给药与缓释技术或保护基质结合。这样做的意图在于，使ITP有效分布在血液中，由此能够与血液组分反应。偶联物的浓度将变化多端，通常约为1pg/ml至50mg/ml。血管内给药的总量一般应在约0.1mg/ml至约10mg/ml、更常为约1mg/ml至约5mg/ml的范围内。
通过与长寿命血液组分结合，例如免疫球蛋白、血清白蛋白、血红细胞和血小板，由此产生了很多优越性。修饰ITP化合物的活性延长到数天至数周。在这段时间内只需要给药一次。可以获得较高的特异性，因为活性化合物主要与大分子键合，由此似乎很少被吸收到细胞内干扰其它生理过程。
血液组分之间共价键的形成可以发生在体内或体外。为了形成离体共价键，把修饰ITP加入血液、血清和含有人血清白蛋白或IgG的盐水溶液中使修饰ITP和血液组分之间形成共价键。在一个优选形式中，ITP用马来酰亚胺修饰并且与人血清白蛋白在盐水溶液中反应。一旦修饰的ITP已经和血液组分反应，形成ITP-蛋白偶联物，则该偶联物可以施用给患者。
另外，可直接将修饰的ITP给予患者，从而使修饰ITP与体内的血液组分之间形成共价键。
6.监测修饰ITP的存在
为了监测ITP的活性和/或修饰ITP的存在，可以监测哺乳动物宿主的血液。在不同的时间采集宿主血液的部分或样品，可以测定出ITP是否已经有足够的量与长寿命血液组分键合变为具有治疗作用，并且此后可以测定血液中ITP化合物的水平。如果希望，还可以测定ITP分子究竟与何种血液组分键合。这在采用非特异性ITP时特别重要。对于特异性马来酰亚胺-ITP，计算血清白和IgG的半衰期更加简单。
利用促胰岛活性的测定、HPLC-MS或ITP的抗体可以监测修饰的GLP。
A.促胰岛活性的测定
本发明涉及促胰岛活性超过或等于未修饰ITP的促胰岛活性的经修饰ITP衍生物。通过给动物细胞提供该化合物或把该化合物注射到动物中并且分别监测释放到培养基或动物循环系统中的免疫反应性胰岛素(IRI)，可以测定化合物的促胰岛活性。利用对胰岛素特异性的放射免疫分析可以检测出存在的IRI。
尽管可以采用任何放射免疫分析检测存在的IRI，优选利用Albano，J.D.M.等(Acta Endocrinol.70：487509(1972))的测定方法的改进法。在这种改进方法中，采用pH7.4的磷酸盐/白蛋白缓冲液。利用500μl的磷酸盐缓冲液、50μl的灌注液样本或存在于灌注液中的大鼠胰岛素标准、100μl的抗胰岛素抗血清(Wellcome Laboratories；1∶40,000稀释)和100μl的[125I]胰岛素的连续条件制备培养液，在10×75mm可任意处理玻璃管中得到750μl的总体积。4℃下培育2-3天后，利用炭分离法将抗体键合的胰岛素与游离胰岛素分开。该测定灵敏度一般为1-2μl U/ml。为了测定释放到在组织培养物中生长的细胞的细胞培养基中的IRI，优选将放射标记掺杂在胰岛素原中。尽管可以利用任何能够标记多肽的放射性标记，但优选采用3H亮氨酸从而获得胰岛素原的标记化。标记化可以进行任何足以形成可检测胰岛素原分子库的时间；然而，细胞优选在放射性标记的存在下培育60分钟。尽管任何能够表达胰岛素的细胞系都可以用来测定化合物是否具有促胰岛效应，但优选采用大鼠胰岛瘤细胞，尤其是RIN-38大鼠胰岛瘤细胞。此类细胞可以在任何适当介质中生长；然而，优选采用含有0.1％BSA和25mM葡萄糖的DME培养基。
还可以通过胰腺输注测定修饰ITP的促胰岛特性。就地分离灌注大鼠胰腺制备法是Penhos，J.C.等(Diabetes 18：733-738(1969))的方法的改进。按照该方法，体重350-600g的禁食大鼠(优选雄性Charles River系白化大鼠)用腹膜内注射的异戊巴比妥钠麻醉(Eli Lilly和Co.，160ng/kg)。结扎肾、肾上腺、胃和下部结肠血管。切除整个肠道，但除约4cm的十二指肠和下降结肠和直肠以外。所以，只灌注小部分的肠道，由此减小具有促胰岛免疫反应性的肠物质可能造成的干扰。灌注液优选是含有4％葡聚糖T70和0.2％牛血清白蛋白的改进Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液(馏分V)，并且优选以气泡形式通入95％O2和5％CO2。优选使用一种非脉动流、4通道滚柱轴承泵(Buchler polystatic，Buchler Instruments Division，Nuclear-Chicago Corp.)，并且从一种灌注液到另一种灌注液的切换优选使用一个三向旋阀来转换。进行、调试和分析灌注的方式优选按照Weir，G.C.等(J.Clin.Investigat.54：1403-1412(1974))所述的方法，其在此引入作为参考。
B.HPLC-MS
HPLC与质谱(MS)偶连可以用来测定肽和经修饰的肽的存在，这是所属领域技术人员熟知的。通常采用两种流动相：0.1％TFA/水和0.1％TFA/乙腈。柱温度和梯度条件可以改变。具体详情如下面的实施例部分所述。
C.抗体
本发明的另一方面涉及利用对ITP特异性的抗体测定ITP或其偶联物在生物样本(例如血液)中的浓度的方法以及此类抗体在治疗与ITP或偶联物潜在相关的中毒中的应用。这是有益的，因为ITP在患者体内提高了的稳定性和寿命可能在治疗过程中导致新的问题，包括中毒可能性的增加。使用单克隆或多克隆的对特定ITP具有特异性的抗ITP抗体可以协助解决此类问题。抗体可以产生或衍生自用特定修饰ITP免疫、用试剂的致免疫片段或与试剂的免疫决定簇相应的合成免疫原免疫的宿主。优选的抗体应对天然、衍生化和偶联形式的经修饰ITP具有高特异性和亲和力。此类抗体也可以用酶、荧光染料或放射性标记物进行标记。
利用纯化ITP可以制备对修饰ITP具有特异性的抗体，来诱导衍生化ITP特异性抗体。通过抗体的诱导，不但可以通过给动物注射来刺激免疫反应，而且在合成抗体或其它特异性结合分子的制备中也可以进行类似步骤，例如筛选重组免疫球蛋白文库。单克隆和多克隆抗体都可以通过所属领域熟知的方法制备。
可以利用抗体来监测血流中存在的ITP肽。血液和/或血清样本可以利用SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析。这些技术能够分析血液或血清测定出修饰ITP和血液组分的结合。
还可以利用抗治疗剂抗体来治疗因修饰ITP给予引起的中毒，并且可以离体或体内应用。离体方法包括利用固定在固体载体上的抗治疗剂抗体免疫透析治疗中毒。体内方法包括施用足够有效引发抗体-治疗剂复合物的清除量的治疗剂抗体。
可利用抗体通过在无灭菌条件下令血液与抗体接触来除去离体患者血液中的经修饰ITP及其偶联物。譬如，抗体可以固定或固定化在柱基质上，患者血液可自患者流出并且经过该基质。修饰ITP将结合该抗体，血液含有低浓度的ITP，随后可以返回到患者循环系统中。通过调节压力和流量可以控制除去的经修饰ITP的量。可将修饰ITP从患者血液的血浆组分中优先除去，譬如利用半渗透膜，或首先利用所属领域的已知方法从细胞组分分离出血浆组分以使血浆组分流经含有抗治疗剂抗体的基质。另外，ITP偶联血液细胞(包括红细胞)的优先除去可以通过收集和浓缩患者血液中的血细胞并且使这些细胞与固定的抗ITP抗体接触排出患者血液的血清组分来完成。
抗ITP抗体可以经非肠道体内施用给接受修饰ITP或偶联物治疗的患者。抗体将与ITP化合物和偶联物结合。一旦键合，如果不是完全阻断，ITP的活性也将受到阻碍，由此降低ITP化合物在患者血流中的生物有效浓度并且减小有害的副作用。此外，结合的抗体-ITP复合物将有助于患者血流中ITP化合物和偶联物的清除。
现将通过下列非限定实施例举例说明来全面描述本发明。
实施例
通用方法
100μM规模上的促胰岛肽的固相肽合成采用手动固相合成和顺序肽合成仪(Symphony Peptide Synthesizer)利用Fmoc保护Rink AmideMBHA树脂、Fmoc保护氨基酸、O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N′-四甲基-脲六氟磷酸盐(HBTU)在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中进行，并且利用N-甲基吗啉(NMM)的活化，Fmoc基团的哌啶脱保护(步骤1)。当需要时，手动进行Lys(Aloc)基团的选择性脱保护，用3当量的溶于5mlCHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液处理2小时该树脂来完成(步骤2)。随后用CHCl3(6×5mL)、20％HOAc的DCM溶液(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗涤树脂。在某些情况中，合成随后重新自动化用于一个AEEA(氨基乙氧基乙氧基乙酸)基的添加、乙酸的加入或3-马来酰亚胺基丙酸(MPA)的加入(步骤3)。树脂裂解和产物分离采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚进行，随后用干冰冷却的Et2O沉淀(步骤4)。产物通过反相制备性HPLC、利用Varian(Rainin)的制备性二元HPLC系统纯化：30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在约180分钟内以9.5mL/min的梯度洗脱，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV检测仪(Varian Dynamax UVD II)。通过RP-HPLC质谱、利用Hewlett Packard LCMS-1100系列分光计且利用电子喷射电离测定纯度为95％，该分光计装配二极管组检测器。实施例1
Tyr32-Exendin 4(1-32)-NH2
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Glu-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Tyr-酰胺的制备
Figure A0080654800381
100μM规模上的类似物的固相肽合成采用手动固相合成和顺序肽合成仪(Symphony Peptide Synthesizer)利用Fmoc保护Rink AmideMBHA树脂、Fmoc保护的氨基酸、O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N＇-四甲基-脲六氟磷酸盐(HBTU)在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中进行，并且利用N-甲基吗啉(NMM)的活化，Fmoc基团的哌啶脱保护(步骤1)。树脂裂解和产物分离采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚实现，随后用干冰冷却的Et2O沉淀(步骤2)。产物通过反相制备性HPLC、利用Varian(Rainin)的制备性二元HPLC系统纯化：30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在约180分钟内以9.5mL/min的梯度洗脱，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和在λ214和254nm下的UV检测仪(Varian DynamaxUVD II)，通过RP-HPLC测定出所需肽的纯度＞95％。
实施例2
Tyr31-Exendin 4(1-31)
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Glu-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Tyr-酰胺的制备
Figure A0080654800391
100μM规模上的类似物的固相肽合成采用手动固相合成和顺序肽合成仪、利用Fmoe保护Rink Amide MBHA树脂、Fmoc保护的氨基酸、O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N′-四甲基-脲六氟磷酸盐(HBTU)在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中进行，并且利用N-甲基吗啉(NMM)的活化，Fmoc基团的哌啶脱保护(步骤1)。树脂裂解和产物分离采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚进行，随后用干冰冷却的Et2O沉淀(步骤2)。产物通过反相制备性HPLC、利用Varian(Rainin)的制备性二元HPLC系统纯化：30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在约180分钟内以9.5mL/min的梯度洗脱，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和在λ214和254nm下的UV检测仪(Varian Dynamax UVD II)，通过RP-HPLC测定出所需肽的纯度＞95％。
实施例3
Exendin-4(9-39)-NH2
Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asu-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Aly-Pro-Pro-Pro-Ser-酰胺的制备
Figure A0080654800401
100μM规模上的类似物的固相肽合成采用手动固相合成和顺序肽合成仪、利用Fmoc保护Rink Amide MBHA树脂、Fmoc保护的氨基酸、O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N′-四甲基-脲六氟磷酸盐(HBTU)在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中进行，并且利用N-甲基吗啉(NMM)的活化，Fmoc基团的哌啶脱保护(步骤1)。树脂裂解和产物分离采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚实现，随后用干冰冷却的Et2O沉淀(步骤2)。产物通过反相制备性HPLC、利用Varian(Rainin)的制备性二元HPLC系统纯化：30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在约180分钟内以9.5mL/min的梯度洗脱，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和在λ214和254nm下的UV检测仪(Varian Dynamax UVD II)，通过RP-HPLC测定出所需肽的纯度＞95％。
实施例4
GLP-1(1-36)-Lys37(ε-MPA)-NH2.5TFA的制备
His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys(ε-MPA)-NH2.5TFA
通过从加入的赖氨酸残基的氨基开始连接来合成修饰的GLP-1肽，如以下示意图所示。
利用自动肽合成法，将下列保护氨基酸顺序加到Rink AmideMBHA树脂上：Fmoc-Lys(Aloc)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Lys(tBoc)-OH，
Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ile-
OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(tBoc)-OH，Fmoc-
Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-
Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Tyr(Pbf)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，
Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-
Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，
Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Boc-His(N-Trt)-OH，
Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-
Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Boc-His(N-Trt)-OH(步骤1)
Lys(Aloc)基团的选择性脱保护采用手动进行且用3当量的溶于5ml的CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液处理2小时该树脂来完成(步骤2)。随后树脂用CHCl3(6×5mL)、20％HOAc的DCM溶液(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗涤。合成随后重新自动化以用于增加3-马来酰亚胺基丙酸(步骤3)。树脂裂解和产物分离采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚实现，随后用干冰冷却的Et2O沉淀(步骤4)。产物通过反相制备性HPLC、利用Varian(Rainin)的制备性二元HPLC系统纯化：30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在约180分钟内以9.5mL/min的梯度洗脱，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV检测仪(Varian Dynamax UVD II)。通过RP-HPLC质谱、利用Hewlett Packard LCMS-1100系列分光计且利用电子喷射电离测定产物纯度＞95％，该分光计装配二极管组检测器。
实施例5
GLP-1(1-36)-Lys37(ε-AEEA-AEEA-MPA)-NH2.5TFA的制备；
His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys(ε-AEEA-AEEA-MPA)-NH2.5TFA
通过从加入的赖氨酸残基的氨基开始连接来合成修饰的GLP-1肽，如以下示意图所示。
Figure A0080654800431
利用自动肽合成法，将下列保护氨基酸顺序加到Rink AmideMBHA树脂上：Fmoc-Lys(Aloc)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Lys(tBoc)-OH，
Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ile-
OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(tBoc)-OH，Fmoc-
Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-
Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Tyr(Pbf)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，
Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-
Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，
Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Boc-His(N-Trt)-OH，
Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-
Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Boc-His(N-Trt)-OH(步骤1)
Lys(Aloc)基团的选择性脱保护采用手动进行且用3当量的溶于5ml CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液处理2小时该树脂来完成(步骤2)。随后树脂用CHCl3(6×5mL)、20％HOAc的DCM溶液(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗涤。合成随后重新自动化用于增加2个AEEA(氨基乙氧基乙氧基乙酸)和3-马来酰亚胺基丙酸(步骤3)。树脂裂解和产物分离采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚实现，随后用干冰冷却的Et2O沉淀(步骤4)。产物通过反相制备性HPLC、利用Varian(Rainin)的制备性二元HPLC系统纯化：30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在约180分钟内以9.5mL/min的梯度洗脱，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV检测仪(VarianDynamax UVD II)。通过RP-HPLC质谱、利用Hewlett Packard LCMS-1100系列分光计且利用电子喷射电离测定产物纯度＞95％，该分光计装配二极管组检测器。对于C174H265N44O56(MH+)，ESI-MS m/z计算值3868，实测值[M+H2]2+1934，[M+H3]3+1290，[M+H4]4+967。
实施例6
GLP-1(7-36)-Lys37(E-MPA)-NH2.4TFA的制备；
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys(ε-MPA)-NH2.4TFA
如下所述，通过从加入的赖氨酸残基的ε-N末端开始连接来合成修饰的GLP-1肽。
利用自动肽合成法，将下列保护氨基酸顺序加到Rink AmideMBHA树脂上：Fmoc-Lys(Aloc)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Lys(tBoc)-OH，
Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ile-
OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(tBoc)-OH，Fmoc-
Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-
Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Tyr(Pbf)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，
Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-
Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，
Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Boc-His(N-Trt)-OH
(步骤1)
Lys(Aloc)基团的选择性脱保护采用手动进行且用3当量的溶于5ml CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液处理2小时该树脂来完成(步骤2)。随后树脂用CHCl3(6×5mL)、20％HOAc的DCM溶液(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗涤。合成随后重新自动化用于增加3-马来酰亚胺基丙酸(步骤3)。树脂裂解和产物分离采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚实现，随后用干冰冷却的Et2O沉淀(步骤4)。产物通过反相制备性HPLC、利用Varian(Rainin)的制备性二元HPLC系统纯化：30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在约180分钟内以9.5mL/min的梯度洗脱，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV检测仪(Varian Dynamax UVD II)。通过RP-HPLC质谱、利用Hewlett Packard LCMS-1100系列分光计且利用电子喷射电离测定产物纯度＞95％，该分光计装配二极管组检测器。
实施例7
GLP-1(7-36)-Lys37(ε-AEEA-AEEA-MPA)-NH2.4TFA的制备
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys(ε-AEEA-AEEA-MPA)-NH2.4TFA
以下所述，通过从加入的赖氨酸残基的ε-N末端开始连接来合成修饰的GLP-1肽。
利用自动肽合成法，将下列保护氨基酸顺序加到Rink AmideMBHA树脂上：Fmoc-Lys(Aloc)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Lys(tBoc)-OH，
Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ile-
OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(tBoc)-OH，Fmoc-
Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-
Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Tyr(Pbf)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，
Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Frnoc-
Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，
Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Boc-His(N-Trt)-OH
(步骤1)
Lys(Aloc)基团的选择性脱保护采用手动进行且用3当量的溶于5ml CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液处理2小时该树脂来完成(步骤2)。随后树脂用CHCl3(6×5mL)、20％HOAc的DCM溶液(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗涤。合成随后重新自动化用于增加2个AEEA(氨基乙氧基乙氧基乙酸)和3-马来酰亚胺基丙酸(步骤3)。树脂裂解和产物分离采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚实现，随后用干冰冷却的Et2O沉淀(步骤4)。产物通过反相制备性HPLC、利用Varian(Rainin)的制备性二元HPLC系统纯化：30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在约180分钟内以9.5mL/min的梯度洗脱，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV检测仪(VarianDynamax UVD II)。通过RP-HPLC质谱、利用Hewlett Packard LCMS-1100系列分光计且利用电子喷射电离测定产物纯度＞95％，该分光计装配二极管组检测器。
实施例8
D-Ala2GLP-1(7-36)-Lys37(ε-MPA)-NH2.4TFA的制备
His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys(ε-MPA)-NHH2.4TFA
按照下面的示意图合成D-Ala2GLP-1(7-36)酰胺。
A.D-Ala2-GLP-1(7-36)酰胺的制备
100μM规模上的GLP-1类似物的固相肽合成采用手动固相合成和顺序肽合成仪、利用Fmoc保护的Rink Amide MBHA树脂、Fmoc保护的氨基酸、O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N′-四甲基-脲六氟磷酸盐(HBTU)在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中进行，并且利用N-甲基吗啉(NMM)的活化，Fmoc基团的哌啶脱保护(步骤1)。树脂裂解和产物分离采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚实现，随后用干冰冷却的Et2O沉淀(步骤2)。产物通过反相制备性HPLC、利用Varian(Rainin)的制备性二元HPLC系统纯化：30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在约180分钟内以9.5mL/min的梯度洗脱，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和在λ214和254nm下的UV检测仪(Varian Dynamax UVD II)，通过RP-HPLC测定出所需肽的纯度＞95％。
按照下面的示意图通过从加入的赖氨酸残基的ε-N末端开始连接来合成修饰的GLP-1肽。
B.D-Ala2GLP-1(7-36)-Lys37(E-MPA)酰胺的制备
Figure A0080654800471
利用自动肽合成法，将下列保护氨基酸顺序加到Rink AmideMBHA树脂上：Fmoc-Lys(Aloc)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Lys(tBoc)-OH，
Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ile-
OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(tBoc)-OH，Fmoc-
Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-
Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Tyr(Pbf)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，
Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-
Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，
Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-d-Ala-OH，Boc-His(N-Trt)-
OH(步骤1)
Lys(Aloc)基团的选择性脱保护采用手动进行且用3当量的溶于5ml CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液处理2小时该树脂来完成(步骤2)。随后树脂用CHCl3(6×5mL)、20％HOAc的DCM溶液(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗涤。合成随后重新自动化用于增加3-马来酰亚胺基丙酸(步骤3)。树脂裂解和产物分离采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚实现，随后用干冰冷却的Et2O沉淀(步骤4)。产物通过反相制备性HPLC、利用Varian(Rainin)的制备性二元HPLC系统纯化：30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在约180分钟内以9.5mL/min的梯度洗脱，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV检测仪(Varian Dynamax UVD II)。通过RP-HPLC质谱、利用Hewlett Packard LCMS-1100系列分光计且利用电子喷射电离测定产物纯度＞95％，该分光计装配二极管组检测器。
实施例9
D-Ala2GLP-1(7-36)-Lys37(ε-AEEA-AEEA-MPA)-NH2.4TFA的制备
His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys(ε-AEEA-AEEA-MPA)-NH2.4TFA
按照下面的示意图通过从加入的赖氨酸残基的ε-N末端开始连接来合成修饰的GLP-1肽。
利用自动肽合成法，将下列保护氨基酸顺序增加到Rink AmideMBHA树脂上：Fmoc-Lys(Aloc)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Lys(tBoc)-OH，
Fmoc-Val-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ile-
OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(tBoc)-OH，Fmoc-
Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-
Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Tyr(Pbf)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，
Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-
Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，
Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-d-Ala-OH，Boc-His(N-Trt)-
OH(步骤1)
Lys(Aloc)基团的选择性脱保护采用手动进行且用3当量的溶于5ml CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液处理2小时该树脂来完成(步骤2)。随后树脂用CHCl3(6×5mL)、20％HOAc的DCM溶液(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗涤。合成随后重新自动化用于增加2个AEEA(氨基乙氧基乙氧基乙酸)和3-马来酰亚胺基丙酸(步骤3)。树脂裂解和产物分离采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚实现，随后用干冰冷却的Et2O沉淀(步骤4)。产物通过反相制备性HPLC、利用Varian(Rainin)的制备性二元HPLC系统纯化：30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在约180分钟内以9.5mL/min的梯度洗脱，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV检测仪(VarianDynamax UVD II)。通过RP-HPLC质谱、利用Hewlett Packard LCMS-1100系列分光计且利用电子喷射电离测定产物纯度＞95％，该分光计装配二极管组检测器。
实施例10
Exendin-4(1-39)-Lys40(ε-MPA)-NH2的制备；
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys(ε-MPA)-NH2.5TFA
Exendin-4按照下面的示意图合成。
A.Exendin 4的制备
Figure A0080654800501
Exendin-4在100μM规模上的固相肽合成利用手动固相合成和顺序肽合成仪、采用Fmoc保护的Rink Amide MBHA树脂进行。下列保护氨基酸顺序加到该树脂上：
Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-
Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-
Pro-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-
Lys(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，
Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-
Val-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，
Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-
Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，
Fmoc--Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr(tBu)-
OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Boc-His(Trt)-
OH
它们溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，按照序列，用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸盐(HBTU)和二异丙基乙胺(DIEA)活化。用20％(V/V)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液处理20分钟脱除Fmoc保护基(步骤1)。树脂裂解和产物分离采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚实现，随后用干冰冷却的Et2O沉淀(步骤2)。产物通过反相制备性HPLC、利用Varian(Rainin)的制备性二元HPLC系统纯化：30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在约180分钟内以9.5mL/min的梯度洗脱，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV检测仪(Varian Dynamax UVD II)。通过RP-HPLC测定所需肽纯度＞95％。
B.修饰Exendin 4(SEQ ID NO：18)的制备
按照下面的示意图通过从加入的赖氨酸残基的ε-N末端开始连接来合成修饰的Exendin-4肽。
Figure A0080654800521
利用自动肽合成法，将下列保护氨基酸顺序加到Rink AmideMBHA树脂上：Fmoc-Lys(Aloc)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-
Pro-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser-OH，Fmoc-Ser(tBu)-
OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，
Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-
OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Arg(Bpf)-OH，
Fmoc-Val-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-
OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-
Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，
Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr(tBu)-
OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Boc-His(Trt)-OH
(步骤1)
Lys(Aloc)基团的选择性脱保护采用手动进行且用3当量的溶于5ml CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液处理2小时该树脂来完成(步骤2)。随后树脂用CHCl3(6×5mL)、20％HOAc的DCM溶液(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗涤。合成随后重新自动化用于增加3-马来酰亚胺基丙酸(步骤3)。树脂裂解和产物分离采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚实现，随后用干冰冷却的Et2O沉淀(步骤4)。产物通过反相制备性HPLC、利用Varian(Rainin)的制备性二元HPLC系统纯化：30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在约180分钟内以9.5mL/min的梯度洗脱，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV检测仪(Varian Dynamax UVD II)。通过RP-HPLC质谱、利用Hewlett Packard LCMS-1100系列分光计且利用电子喷射电离测定产物纯度＞95％，该分光计装配二极管组检测器。
实施例11
修饰Exendin-4(1-39)-Lys40(ε-AEEA-AEEA-MPA)NH2.5TFA的制备；
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys(ε-AEEA-AEEA-MPA)-NH2.5TFA
按照下面的示意图通过从加入的赖氨酸残基的ε-N末端开始连接来合成修饰的Exendin-4肽。
利用自动肽合成法，将下列保护氨基酸顺序加到Rink AmideMBHA树脂上：Fmoc-Lys(Aloc)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-
Pro-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser-OH，Fmoc-Ser(tBu)-
OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，
Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-
OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Arg(Bpf)-OH，
Fmoc-Val-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-
OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-
Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，
Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr(tBu)-
OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Boc-His(Trt)-
OH(步骤1)
Lys(Aloc)基团的选择性脱保护采用手动进行且用3当量的溶于5ml CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液处理2小时该树脂来完成(步骤2)。随后树脂用CHC13(6×5mL)、20％HOAc的DCM溶液(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗涤。合成随后重新自动化用于增加2个AEEA(氨基乙氧基乙氧基乙酸基团和3-马来酰亚胺基丙酸(步骤3)。树脂裂解和产物分离采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚实现，随后用干冰冷却的Et2O沉淀(步骤4)。产物通过反相制备性HPLC、利用Varian(Rainin)的制备性二元HPLC系统纯化：30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在约180分钟内以9.5mL/min的梯度洗脱，使用Phenomenex Luna10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV检测仪(VarianDynamax UVD II)。通过RP-HPLC质谱、利用Hewlett Packard LCMS-1100系列分光计且利用电子喷射电离测定产物纯度＞95％，该分光计装配二极管组检测器。
实施例12
Exendin-3(1-39)-Lys40(ε-MPA)-NH2.5TFA的制备
His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys(s-MPA)-NH2.5TFA
A.Exendin 3的制备
如下面的示意图所示合成Exendin-3肽。
Figure A0080654800551
Exendin 3在100μM规模上的固相肽合成利用手动固相合成和顺序肽合成仪、采用Fmoc保护的Rink Amide MBHA树脂进行。下列保护氨基酸顺序加到该树脂上：
Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-
Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-
Pro-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-
Lys(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，
Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-
Val-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，
Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-
Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，
Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr(tBu)-
OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Boc-
His(Trt)-OH
它们溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，按照序列，用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸盐(HBTU)和二异丙基乙胺(DIEA)活化。用20％(V/V)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液处理20分钟脱除Fmoc保护基(步骤1)。树脂裂解和产物分离采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚进行，随后用干冰冷却的Et2O沉淀(步骤2)。产物通过反相制备性HPLC、利用Varian(Rainin)的制备性二元HPLC系统纯化：30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在约180分钟内以9.5mL/min的梯度洗脱，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV检测仪(Varian Dynamax UVD II)。通过RP-HPLC测定所需肽纯度＞95％。
B.修饰Exendin 3的制备
利用自动肽合成法，将下列保护氨基酸顺序加到Rink AmideMBHA树脂上：Fmoc-Lys(Aloc)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-
Pro-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser-OH，Fmoc-Ser(tBu)-
OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，
Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-
OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Arg(Bpf)-OH，
Fmoc-Val-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-
OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-
Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，
Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr(tBu)-
OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(OtBu)-OH，Boc-
His(Trt)-OH(步骤1)
通过从加入的赖氨酸残基的ε-N末端开始连接合成修饰的Exendin-3肽。
Lys(Aloc)基团的选择性脱保护采用手动进行且用3当量的溶于5ml CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液处理2小时该树脂来完成(步骤2)。随后树脂用CHCl3(6×5mL)、20％HOAc的DCM溶液(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗涤。合成随后重新自动化用于增加3-马来酰亚胺基丙酸(步骤3)。树脂裂解和产物分离采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚实现，随后用干冰冷却的Et2O沉淀(步骤4)。产物通过反相制备性HPLC、利用Varian(Rainin)的制备性二元HPLC系统纯化：30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在约180分钟内以9.5mL/min的梯度洗脱，使用Phenomenex Luna 10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV检测仪(Varian Dynamax UVD II)。通过RP-HPLC质谱、利用Hewlett Packard LCMS-1100系列分光计且利用电子喷射电离测定产物纯度＞95％，该分光计装配二极管组检测器。
实施例13
Exendin-3(1-39)-Lys40(ε-AEEA-AEEA-MPA)-NH2.5TFA的制备；
His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys(ε-AEEA-AEEA-MPA)-NH2.5TFA
如下所述，通过从加入的赖氨酸残基的ε-N末端开始连接来合成修饰的Exendin-3肽。
利用自动肽合成法，将下列保护氨基酸顺序加到Rink AmideMBHA树脂上：Fmoc-Lys(Aloc)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-
Pro-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser-OH，Fmoc-Ser(tBu)-
OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，
Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-
OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Arg(Bpf)-OH，
Fmoc-Val-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-
OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-
Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，
Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr(tBu)-
OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Ser(OtBu)-OH，Boc-
His(Trt)-OH(步骤1)
Lys(Aloc)基团的选择性脱保护采用手动进行且用3当量的溶于5ml CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液处理2小时该树脂来完成(步骤2)。随后树脂用CHCl3(6×5mL)、20％HOAc的DCM溶液(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗涤。合成随后重新自动化用于增加两个AEEA(氨基乙氧基乙氧基乙酸)基团和3-马来酰亚胺基丙酸(步骤3)。树脂裂解和产物分离采用85％TFA/5％TIS/5％硫苯甲醚和5％苯酚实现，随后用干冰冷却的Et2O沉淀(步骤4)。产物通过反相制备性HPLC、利用Varian(Rainin)的制备性二元HPLC系统纯化：30-55％B(含0.045％TFA的H2O(A)和含0.045％TFA的CH3CN(B))在约180分钟内以9.5mL/min的梯度洗脱，使用Phenomenex Luna10μ苯基-己基，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV检测仪(VarianDynamax UVD II)。通过RP-HPLC质谱、利用Hewlett Packard LCMS-1100系列分光计且利用电子喷射电离测定产物纯度＞95％，该分光计装配二极管组检测器。
实施例14
Lys26(ε-MPA)GLP-1(7-36)-NH2的制备
Figure A0080654800581
DAC：GLP-1类似物在100μM规模上的固相肽合成利用手动固相合成和顺序肽合成仪、采用Fmoc保护的Rink Amide MBHA树脂进行。下列保护氨基酸顺序增加到该树脂上：
Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Val-OH，
Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-
Phe-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Aloc)-OH，Fmoc-Ala-OH，
Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，
Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-
OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asp(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-
Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-
Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Boc-His(Trt)-OH
它们溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，按照序列，用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸盐(HBTU)和二异丙基乙胺(DIEA)活化。用20％(V/V)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液处理20分钟脱除Fmoc保护基(步骤1)。Lys(Aloc)基团的选择性脱保护采用手动进行且用3当量的溶于5ml CHCl3∶NMM∶HOAc(18∶1∶0.5)中的Pd(PPh3)4溶液处理2小时该树脂来完成(步骤2)。随后树脂用CHCl3(6×5mL)、20％HOAc的DCM溶液(6×5mL)、DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗涤。合成随后重新自动化用于增加3-马来酰亚胺基丙酸(步骤3)。树脂裂解和产物分离采用86％TFA/5％TIS/5％H2O/2％硫苯甲醚和2％苯酚进行，随后用干冰冷却的Et2O沉淀(步骤4)。产物通过反相制备性HPLC、利用Varian(Rainin)的制备性二元HPLC系统纯化，纯化时采Dynamax C18，60，8μm，21mm×25cm柱，该柱带有用DynamaxC18，60，8μm防护模块，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV检测仪(Varian Dynamax UVD II)。通过RP-HPLC测定所需DAC纯度＞95％。
Figure A0080654800601
实施例15
GLP-1(7-36)-EDA-MPA的制备
修饰GLP-1类似物在100μM规模上的固相合成手动并且在顺序肽合成仪SASRIN(超级酸敏感树脂)上进行。下列保护氨基酸顺序加到树脂上：Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-
Leu-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-
OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-
Ala-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmco-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-
Leu-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，
Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asp(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-
OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-
Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Boc-His(Trt)-OH
它们溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，按照序列，用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸盐(HBTU)和二异丙基乙胺(DIEA)活化。用20％(V/V)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液处理20分钟脱除Fmoc保护基(步骤1)。用1％TEA/DCM处理树脂脱下完全保护的肽(步骤2)。随后向游离C-末端依次添加乙二胺和3-马来酰亚胺基丙酸(步骤3)。随后裂解保护基，用86％TFA/5％TIS/5％H2O/2％硫苯甲醚和2％苯酚分离产物，随后用干冰冷却的Et2O沉淀(步骤4)。产物通过反相制备性HPLC、利用Varian(Rainin)的制备性二元HPLC系统纯化，纯化时采Dynamax C18，60，8μm，21mm×25cm柱，该柱带有用Dynamax C18，60，8μm防护模块，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV检测仪(Varian Dynamax UVD II)。通过RP-HPLC测定所需DAC纯度＞95％。
实施例16
Exendin-4(1-39)-EDA-MPA的制备
下列示意图说明了Exendin-4(1-39)EDA-MPA的合成。
Figure A0080654800611
修饰Exendin-4类似物在100μM规模上的固相合成手动并且在顺序肽合成仪SASRIN(超级酸敏感树脂)上进行。下列保护氨基酸顺序加到树脂上：Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ala-
OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Pro-
OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-
OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ile-
OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Val-OH，
Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-
Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，
Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-
Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，
Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Boc-His(Trt)-OH.
它们溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，按照序列，用O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基-脲六氟磷酸盐(HBTU)和二异丙基乙胺(DIEA)活化。用20％(V/V)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液处理20分钟脱除Fmoc保护基(步骤1)。用1％TEA/DCM处理树脂脱下完全保护的肽(步骤2)。随后向游离C-末端依次添加乙二胺和3-马来酰亚胺基丙酸(步骤3)。随后裂解保护基，用86％TFA/5％TIS/5％H2O/2％硫苯甲醚和2％苯酚分离产物，随后用干冰冷却的Et2O沉淀(步骤4)。产物通过反相制备性HPLC、利用Varian(Rainin)的制备性二元HPLC系统纯化，纯化时采Dynamax C18，60A，8μm，21mm×25cm柱，该柱带有用Dynamax C18，60，8μm防护模块，21mm×25cm柱和λ214和254nm下的UV检测仪(Varian Dynamax UVD II)。通过RP-HPLC测定所需DAC纯度＞95％。
                   序列表<110>康久化学公司
多米尼克·P·布里顿
伯努瓦·拉尔谢维克
阿朗·M·埃斯林
达伦·L·霍姆斯
阿努克·勒布朗
瑟奇·圣皮埃尔<120>长效促胰岛肽<130>1610<140>PCT/US00/13653<141>2000-05-17<150>60/159,783<151>1999-10-15<150>60/134,406<151>1999-05-17<160>22<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>37<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>1His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val1               5              10                      15Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu
        20              25                      30Val Lys Gly Arg Gly
    35<210>2<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>2His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1               5                  10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
        20                  25                  30<210>3<211>22<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>3Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val1              5                   10                  15Xaa Gly Arg Xaa Gly Arg
        20<210>4<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>4Ser Asp Val Ser1<210>5<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>5Thr Ser Asp Val Ser1               5<210>6<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>6Phe Thr Ser Asp Val Ser1               5<210>7<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>7Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser1               5<210>8<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>8Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser1               5<210>9<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>9Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser1               5<210>10<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>10Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser1               5                  10<210>11<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>11His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1               5                  10                  15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
        20                  25                  30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
    35<210>12<211>39<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>12His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1               5                  10                  15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
        20                  25                  30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
    35<210>13<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>13His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1               5                  10                  15Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Tyr
        20                  25                  30<210>14<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>14His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1               5                  10                  15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Tyr
        20                  25                  30<210>15<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>15Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Met Ile Glu1               5                  10                  15Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
        20                  25                  30<210>16<211>37<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>16His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val1               5                  10                  15Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu
        20                  25                  30Val Lys Gly Arg Lys
    35<210>17<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>17His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1               5                  10                  15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Lys
        20                  25                  30<210>18<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>18His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1               5                  10                  15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
        20                  25                  30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys
    35                  40<210>19<211>40<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>19His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1               5                  10                  15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ash Gly Gly Pro Ser
        20                  25                  30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys
    35                  40<210>20<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>20His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Glu Met Glu Glu1               5                  10                  15Glu Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Tyr
        20                  25                  30<210>21<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>21His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Glu Met Glu Glu1               5                  10                  15Glu Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Tyr
        20                  25                  30<210>22<211>29<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>22Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu1               5                  10                  15Trp Leu Lys Gly Gly Pro Ser Ser Gly Pro Pro Pro Ser
        20                  25

Claims (19)

1.一种经修饰的促胰岛肽或其衍生物，含有与血液组分上的氨基、羟基或巯基反应形成稳定共价键的反应性基团。
2.权利要求1的肽，其中所述的反应性基团选自琥珀酰亚胺基和马来酰亚胺基。
3.按照权利要求2的肽，其中衍生物与血液蛋白上的巯基反应。
4.按照权利要求1的肽，其中所述肽选自SEQID NO：2、SEQIDNO：3、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ IDNO：15。
5.按照权利要求1的肽，其中所述肽选自SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22。
6.一种用于人体糖尿病治疗方法中的含有促胰岛肽或其类似物的衍生物的组合物，所述衍生物含有与血液组分上的氨基、羟基、巯基反应形成稳定共价键的反应性基团，其中该反应性基团选自琥珀酰亚胺基和马来酰亚胺基。
7.权利要求6的组合物，其中所述衍生物与血液组分反应。
8.权利要求6的组合物，其中所述肽选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ IDNO：15。
9.权利要求6的组合物，其中所述肽选自SEQ ID：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22。
10.一种促胰岛肽的衍生物，该衍生物含有与人血清白蛋白上的巯基反应形成共价键的马来酰亚胺基。
11.权利要求9的衍生物，其中所述肽选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ IDNO：15。
12.权利要求9的衍生物，其中所述肽选自SEQ ID：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22。
13.一种用于人体糖尿病治疗方法中的含有促胰岛肽的衍生物的组合物，所述衍生物含有与人血清白蛋白上的巯基反应形成共价键的马来酰亚胺基。
14.权利要求13的组合物，其中所述肽选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ IDNO：15。
15.权利要求13的组合物，其中所述肽选自SEQ ID：16、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22。
16.一种组合物在制备用于延长促胰岛肽在糖尿病患者的体内半衰期的药物中的应用，该组合物含有促胰岛肽或其类似物的衍生物，所述衍生物含有与血液组分上的氨基、羟基或巯基反应形成稳定共价键的反应性基团，其中该反应性基团选自琥珀酰亚胺基和马来酰亚胺基。
17.按照权利要求16的组合物的应用，其中所述生物与血液蛋白反应。
18.按照权利要求16的组合物的应用，其中所述肽选自SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15。
19.一种促胰岛肽，其选自
GLP-1(1-36)-Lys37(ε-MPA)-NH2、GLP-1(1-36)-Lys37(ε-AEEA-AEEA-MPA)-NH2、GLP-1(7-36)-Lys37(ε-MPA)-NH2、GLP-1(7-36)-Lys37(ε-AEEA-AEEA-MPA)-NH2、D-Ala2GLP-1(7-36)-Lys37-(ε-MPA)-NH2、D-Ala2GLP-1(7-36)-Lys37(ε-AEEA-AEEA-MPA)-NH2、exendin-4(1-39)-Lys40(ε-MPA)-NH2、exendin-4(1-39)-Lys40(ε-AEEA-AEEA-MPA)-NH2、exendin-3(1-39)-Lys40(ε-MPA)-NH2和exendin-3(1-39)-Lys40(ε-AEEA-AEEA-MPA)。
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