CN103189389A

CN103189389A - 新的glp-ⅰ类似物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN103189389A
Application number: CN2011800380912A
Authority: CN
Inventors: 姚志勇; 李新宇; 支钦
Original assignee: SHENZHEN JYMED TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: SHENZHEN JYMED TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2011-09-03
Filing date: 2011-09-03
Publication date: 2013-07-03
Anticipated expiration: 2031-09-03
Also published as: CN103189389B; WO2013029279A1

Abstract

本发明提供了胰高血糖素样肽-Ⅰ(GLP-Ⅰ)类似物，其包括具有GLP-Ⅰ(7-37)氨基酸序列的母体肽以及在母体肽的两个赖氨酸残基上的氨基通过酰胺键偶联的两个修饰基团，其中一个基团包含马来酰亚胺基团(MPA)。该GLP-Ⅰ类似物具有促胰岛素活性，且具有半衰期长、稳定性好、副作用小的优点，可用于治疗糖尿病等疾病。本发明还提供了该GLP-Ⅰ类似物的合成方法、组合物及制药用途。

Description

新的GLP-Ⅰ类似物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及药物化学和有机化学领域，尤其涉及多肽类似物，还涉及多肽类似物的制备方法、组合物及其在制药中的用途。

背景技术

胰高血糖素样肽 -1 （ glucagon-like peptide-1,GLP- Ⅰ）是一种由小肠 -L 细胞分泌的多肽激素。 GLP- Ⅰ是从含有 160 个氨基酸的胰高血糖素原（ PG ）肽链上断裂的 30 个氨基肽段。 GLP- Ⅰ能够在高血糖水平下促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素释放、促进机体胰岛素原基因的表达及延迟胃排空和胃酸分泌，同时发现 GLP- Ⅰ能够增加饱腹感（抑制食欲）和降低能量摄取。长期注射 GLP- Ⅰ或者 exendin-4( 人类 GLP- Ⅰ的长效类似物 ) 能够增加大鼠 β - 细胞团的数量。 GLP- 通过各种独立的作用机制调节血糖水平，在预防和治疗糖尿病中引起广泛关注。

胃肠道 L- 细胞受血糖的调节，分泌 GLP- Ⅰ肽，半衰期 5min ，代谢清除率 12-13min 。 GLP- Ⅰ在 DDP IV （ dipeptidyl peptidase IV ）作用下降解，即去掉 N- 端两个氨基酸残基，转化为无活性的 GLP- Ⅰ肽。由于 GLP- Ⅰ 的半减期极短，限制了其临床应用，人们研究得到了一些具有 GLP- Ⅰ样生物活性的类似物。如从毒蛇唾液中分离出的 exendin-4, 与 GLP- Ⅰ序列高度同源，生理作用类似，半衰期更长。 E xendin-4 的 N- 端剪切产物 exendin 能够与β细胞表面的 GLP- Ⅰ受体（ GLP- Ⅰ -R ）拮抗，特异性抑制 GLP- Ⅰ介导的十二指肠内葡萄糖和口服营养素引起的胰岛素分泌。

为了满足临床应用的需要，对 GLP- Ⅰ 进行分子改造以抵抗酶的降解和提高活性 , 包括 N - 末端 His 自由氨基的甲基化、脱氨基化、羟基化等 , 以及对第二位 Ala 的 D2 型氨基酸置换 , 已取得了预期的效果，可能为 2 型糖尿病的治疗开辟新途径。目前进入临床应用的有礼来公司的艾塞那肽（ exenatide ），该药为首个新型的 GLP- Ⅰ 激动剂注射剂 , 用于二甲双胍和磺脲类药物控制血糖不理想的 2 型糖尿病患者的血糖控制 , 已在美国上市。丹麦的 NovoNordisk 公司研发的 GLP- Ⅰ 类似物利拉鲁肽（ Liraglutide ） , 能抵抗 DDP IV 的降解 , 半衰期可达 12 h , 同时与白蛋白连接 , 具有缓慢释放的特性 , 一次注射可维持 24 h 的药效。 Conjuchem 公司的 CJC1131 ，是位置 8 带非天然的 D- 丙氨酸的立体异构体 GLP- Ⅰ和一个带化学活性基团的连接体，注射后与白蛋白共价结合，半衰期约 10-12h 。有研究表明，对 GLP- Ⅰ的 N 末端进行修饰后所得产物如 N- 谷氨酸 -GLP- Ⅰ和 N- 乙酰 -GLP- Ⅰ，和 GLP- Ⅰ相比，其半衰期长且促胰岛素分泌作用强。但这些药物副作用较强，会导致恶心、呕吐等副作用，且化学合成的步骤繁琐而价格又非常高昂。

因此，人们迫切希望开发一种活性高，稳定性好，可方便的利用化学方法合成，且副作用少的可用于治疗糖尿病的 GLP- Ⅰ类似物。

发明内容

本发明的目的在于开发一种活性高的用于糖尿病治疗的 GLP- Ⅰ类似物，并作为新一代治疗糖尿病的药物。

发明人经过大量的实验研究，对 GLP- Ⅰ分子进行了改造，结果表明该类 GLP- Ⅰ类似物具有更长的半衰期，具有促胰岛素活性，没有临床不良发应发生，可用于糖尿病等疾病的治疗，从而完成了本发明。

本发明的第一个方面是提供一种 GLP- Ⅰ 类似物，该 GLP- Ⅰ类似物含以下序列的母体肽 :

H ₂N-Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Xaa34-Gly-Arg-Xaa37-COR ₁ ；

其中， R ₁ =-OH 或 -NH ₂ ；

Xaa7= 组氨酸 ,D- 组氨酸 , 脱氨基 - 组氨酸， 2- 氨基 - 组氨酸，β - 羟基 - 组氨酸，高组氨酸， N α - 乙酰基 - 组氨酸，α - 氟甲基 - 组氨酸，α - 甲基 - 组氨酸， 3- 吡啶基丙氨酸， 2- 吡啶基丙氨酸或 4- 吡啶基丙氨酸；

Xaa8=Ala,D-Ala,Gly,Val,Leu,Ile,Lys,Aib,(1- 氨基环丙基 ) 羧酸，（ 1- 氨基环丁基）羧酸，（ 1- 氨基环戊基）羧酸，（ 1- 氨基环己基）羧酸，（ 1- 氨基环庚基）羧酸或（ 1- 氨基环辛基）羧酸；

Xaa26=Lys ；

Xaa34=Lys, Glu, Asn 或 Arg ，

Xaa37=Gly, Ala, Glu, Pro 或 Lys ，且 Xaa34 或 Xaa37 中至少一个为 Lys ；

所述 GLP- Ⅰ类似物还含有 Q1 和 Q2 基团， Q1 及 Q2 基团同时出现在母体肽中，当 Xaa26,Xaa34,Xaa37 任意两个或全部为 Lys 时，以酰胺键的形式连接在 Xaa26,Xaa34,Xaa37 中的任意二个 Lys 残基上；

Q1 基团为亲脂性的取代基连接一个桥接基团 W ，亲脂性的取代基以其羧基与一个桥接基团的氨基形成一个酰胺键，桥接基团的氨基酸残基的羧基与母体肽的一个 Lys 的 N- 末端残基上形成一个酰胺键从而连接到母体肽上；桥接基团 W 是有 1-7 个亚甲基不分支链烷烃α , ω - 二羧基；所述亲脂性取代基是选自含 CH ₃ (CH ₂ ) _n CO- 之组的一个酰基，其中 n 是 4-38 的整数；

Q2 基团为ε(AEEA)_n-MPA，n=0-3，其结构式如下：

。

其中各符号的定义如下， His ：组氨酸， Ala: 丙氨酸， Glu ：谷氨酸， Gln ：谷氨酰胺， Gly ：甘氨酸， Thr ：苏氨酸， Phe ：苯丙氨酸， Ser ：丝氨酸， Asp ：天冬氨酸， Val ：缬氨酸， Tyr ：酪氨酸， Leu: 亮氨酸， Ile ：异亮氨酸， Lys ：赖氨酸， Trp ：色氨酸， Arg ：精氨酸， Asn ：天冬酰胺， Pro ：脯氨酸， Aib ： 2- 氨基异丁酸， AEEA ： 2-(2-(2- 氨基乙氧基 ) 乙氧基 ) 乙酸， MPA ： 3- 马来酰亚胺丙酸。

在本发明的一个实施方案中， Xaa7 优选为组氨酸。

在本发明的一个实施方案中， Xaa8 优选为 D-Ala 。

在本发明的一个实施方案中，桥接基团 W 优选为有 2 个亚甲基的不分支链烷烃α , ω - 二羧基；进一步优选为谷氨酸。

在本发明的一个实施方案中，亲脂性取代基优选为 CH ₃ (CH ₂ ) _n CO ，其中 n 是 4-24 的整数；进一步优选为 CH ₃ (CH ₂ ) ₁₄ CO- 。

本发明的 GLP- Ⅰ类似物具有促胰岛素活性，稳定性好，半衰期长，没有临床不良发应发生。可用于治疗高血糖症、 2 型糖尿病、葡萄糖耐量降低、 1 型糖尿病、肥胖症、高血压、 X 综合症、血脂障碍、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和其他心血管疾病、中风、炎性肠综合症、消化不良或胃溃疡；或用于减少食物摄取、减少 β - 细胞凋亡、增强 β - 细胞功能和 β - 细胞量和 / 或恢复 β - 细胞的葡萄糖敏感性；优选治疗高血糖症、 2 型糖尿病、葡萄糖耐量降低、 1 型糖尿病；更优选治疗 2 型糖尿病。

本发明的另一个方面是提供一种制备本发明的第一个方面的 GLP- Ⅰ类似物的方法，包括：合成 GLP- Ⅰ类似物的母体肽，所述母体肽上的自由氨基和自由羧基被保护基团保护；脱去 Q1 基团在母体肽上的偶联位置处的氨基酸残基上的保护基团，将 Q1 基团偶联到所述母体肽上；脱去 Q2 基团在母体肽上的偶联位置处的氨基酸残基上的保护基团，将 Q2 基团偶联到所述母体肽上；脱去母体肽上其它氨基酸残基上的保护基团，制备得到所述的 GLP- Ⅰ类似物。

对氨基酸残基的自由氨基和自由羧基的保护和脱保护可以使用本领域公知的技术。羧基一般以盐或酯的形式加以保护，常用的盐有钾盐、钠盐、三乙胺盐、三丁胺盐；常用的酯有甲酯（ OMe ）、乙酯（ OEt ）、苄酯 (oBzl) 、叔丁酯 (OtBu) 。氨基保护基常用的有苄氧甲酰基（ CBZ ）、叔丁氧甲酰基（ Boc ）、对甲苯磺酰基（ Tosyl ）等。

在本发明的一个实施方案中，还包括步骤：将制备得到的 GLP- Ⅰ类似物使用反相液相色谱纯化。

对制备得到的 GLP- Ⅰ类似物纯化可以使用如分子筛、吸附层析、亲和层析、疏水层析、电泳、浓缩结晶等本领域公知的技术进一步纯化。

在本发明的一个实施方案中，所述将 Q1 基团偶联到所述母体肽上，包括：桥接基团的氨基酸残基的羧基与母体肽的一个 Lys 的 N- 末端残基上形成一个酰胺键从而连接到母体肽上，亲脂性的取代基以其羧基与一个桥接基团的氨基形成一个酰胺键从而偶联到母体肽上。

在本发明的一个实施方案中，所述将 Q2 基团偶联到所述母体肽上，包括：（ AEEA ） _n 的羧基与母体肽的一个 Lys 的 N- 末端残基上形成一个酰胺键从而连接到母体肽上， MPA 以其羧基与（ AEEA ） _n 的氨基形成一个酰胺键 ; 所述（ AEEA ） _n 中的 n=1-3 。

在本发明的一个实施方案中，所述将 Q2 基团偶联到所述母体肽上，包括： MPA 以其羧基与母体肽的一个 Lys 的 N- 末端残基上形成一个酰胺键。

本发明的 GLP- Ⅰ类似物的制备方法简便，产物收率高，制备成本较大降低。

本发明的另一个方面提供一种药物组合物，包括本发明的第一个方面的 GLP- Ⅰ类似物或其药学上可接受的盐。

在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物包括： 0.9mg/ml 本发明的第一个方面的 GLP- Ⅰ类似物或其药学上可接受的盐， 5.0% （ w/v ）的苯甲酚， 5.2% （ w/v ）的甘露醇， 12.5mg/ml 的丙二醇， 8.0mM 的磷酸盐缓冲液。其中 pH 通常约为 5-8 ，优选 pH 为 6-8 ，更优选 pH 为 7-7.5 。

当 GLP- Ⅰ类似物用于制备药物时，优选为其药学上可接受的盐。本发明的 GLP- Ⅰ类似物可以与任一无机碱，无机及有机酸反应形成盐。通常采用的形成酸加成盐的酸为无机酸，如盐酸，氢溴酸，氢碘酸，硫酸，磷酸等，有机酸如对 - 甲苯磺酸，甲磺酸，草酸，对溴苯基磺酸，碳酸，琥珀酸，柠檬酸，苯甲酸，乙酸等。优选的酸加成盐是与无机酸如盐酸、氢溴酸，更优选与盐酸形成的盐。碱加成盐包括由无机碱衍生物的盐，如铵或碱金属或稀土金属的氢氧化物，碳酸盐，碳酸氢盐等。这类碱包括氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铵，碳酸钾等。

本发明的药物组合物还可包括其药学上可接受的载体。如本文所用，术语'药学上可接受的载体'指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在 Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co. ， N.J. 1991) 中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如崩解剂、润湿剂、乳化剂、 pH 缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中 pH 通常约为 5-8 ，较佳地， pH 约为 6-8 。

本发明的组合物时，可以使用本领域公知的技术制成各种剂型，如丸剂、片剂、胶囊剂、注射剂等，优选为注射剂。注射剂可以为溶液型、无菌粉末，优选为无菌粉末。制备注射剂时，按照本领域公知的技术将本发明的 GLP- Ⅰ类似物或其药学上可接受的盐配制成溶液，所使用的溶剂选自注射用水、注射用大豆油、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、苯甲酸苄酯、二甲基乙醇胺。溶液中还可以添加其它物质，如吐温 80 、甲基纤维素、甘露醇、葡萄糖、氯化钠、苯甲酚、苯酚、三氯叔丁醇等。溶液可以选择醋酸 - 醋酸钠、枸橼酸 - 枸橼酸纳、乳酸、磷酸缓冲体系，优选磷酸缓冲体系。配制的溶液在过滤去除固体颗粒、去除热源、灭菌或除菌后制备为注射剂，如注射剂为无菌粉末，则进一步还包括冷冻干燥，这些技术都是本领域公知的。

根据医疗上的需要，本发明的注射剂的给药途径可以为静脉注射、脊椎抢注射、肌肉注射、皮下注射和皮内注射，优选为静脉注射、肌肉注射、皮下注射，更优选为静脉注射。

应理解，所用 GLP- Ⅰ类似物的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况 ( 例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果 ) 来决定，这在熟练医师可以判断的范围内。

本发明的组合物稳定性好，血管刺激性、肌肉刺激性、过敏性及溶血实验证明没有不良临床反应。

本发明的另一个方面是本发明的 GLP- Ⅰ类似物在制备治疗或预防疾病的药物中的用途。

这些疾病包括高血糖症、 2 型糖尿病、葡萄糖耐量降低、 1 型糖尿病、肥胖症、高血压、 X 综合症、血脂障碍、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和其他心血管疾病、中风、炎性肠综合症、消化不良或胃溃疡。

在本发明的一个实施方案中，所述的 GLP- Ⅰ类似物用于制备延缓或预防 2 型糖尿病发展的药物。

本发明的再一个方面是本发明的 GLP- Ⅰ类似物在制备减少食物摄取、减少 β - 细胞凋亡、增强 β - 细胞功能和 β - 细胞量和 / 或恢复 β - 细胞的葡萄糖敏感性的药物中的用途。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

对于本发明实施例中用到的英文缩写，列表给出其中英文名的对照，见表 1.0 。

表 1.0 英文缩写的中英文名

缩写	英文名	中文名
Fmoc	9-fluorenylmethoxycarbonyl	9- 芴甲氧羰基
tBu	tert-butyl	叔丁基
Boc	tert-butoxycarbonyl	叔丁基甲酰基
Otbu	tert-butoxy	叔丁氧基
Trt	triphenylmethyl(trityl)	三苯甲基
Aloc	allyloxycarbonyl	烯丙氧基羰基
ivDDe	1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-3-methylbutyl	1- （ 4 ， 4- 二甲基 -2 ， 6- 二氧代环己亚基） -3- 甲基丁基
Pd(PPh <sub>3</sub> ) <sub>4</sub>	Tetrakis(triphenylphosphine)palladium	四 ( 三苯基膦 ) 钯
NMM	N-methylmorpholin	N- 甲基吗啉
DIC	N,N-diisopropylcarbodiimide	N,N-二异丙基碳二亚胺
HOBt	1-hydroxy-1H-benzotriazole	N- 羟基苯并三氮唑
NMP	N-methyl-2-pyrrolidinone	N- 甲基吡咯烷酮
DMF	N,N-dimethylformamide	N,N- 二甲基甲酰胺
Pbf	2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-yl-sulfonyl	2,2,4,6,7- 五甲基二氢苯并呋喃 -5-yl- 磺酰基
Fmoc-AEEA-OH	N-Fmoc-2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]acetic acid	N-Fmoc-2-[2-(2- 氨基乙氧基 ) 乙氧基 ) 乙酸
MPA	3-maleimidopropionic acid	3- 马来酰亚胺丙酸
TFA	trifluoroacetic acid	三氟乙酸
EDT	ethanedithiol	乙二硫醇
DCM	Dichloromethane	二氯甲烷
HBTU	2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate	苯并三氮唑 -N,N,N',N'- 四甲基脲六氟磷酸盐
DIEA	2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate	N- 二异丙基乙胺

实施例1：

化合物 1 （ Compound 1 ）的合成

1a ) 主肽链组装：

按照 Fmoc/tbu 策略在 CS336X 多肽合成仪（美国 C S Bio 公司）上合成 0.25mmol 规模的 Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)

-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala- Lys(Aloc) -Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys (Boc) -Gly-Arg(pbf)-Lys (ivDDe) -wang resin 。

1b) Aloc 的脱除与 Q1 的引入：

将 1a ）中所得的肽树脂加入氯仿中，氩气保护下加入 Pd(PPh ₃ ) ₄ ,NMM ，搅拌反应 2 小时，树脂用 DMF, DCM 洗涤后，加入 Fmoc-Glu-Otbu,DIC,HOBt 的 NMP 混合溶液，偶联 2 小时，哌啶（ piperidine ） /DMF 脱除 Fmoc 基团，加入软脂酸（ palmitic acid ） ,DIC,HOBt 的 NMP 偶联液，偶联 3 小时，得到： Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr

(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala- Lys(Palmitoyl-gama-Glu-Otbu) -Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys (Boc) -Gly-Arg(pbf)-Lys (ivDDe) -wang resin 。

1c ) ivDDe 的脱除与 Q2 的引入：

在 NMP:DCM 为 1:1 （体积比）的溶液中将由 1b ）产生的保护的肽基树脂洗涤两次，加入新鲜制备的 2% 的肼水合物 NMP 溶液，将该反应混合物在室温下振摇 12 分钟，然后过滤。将肼处理步骤重复两次。此后用 NMP 、 DCM 和 NMP 充分洗涤树脂。向其中加入 Fmoc-AEEA-OH,HBTU,DIEA 的 NMP 混合偶联液，振摇 3 小时后，过滤，洗涤，哌啶 /DMF 脱除 Fmoc 基团，用 3- 马来酰亚胺丙酸 ,DIC,HOBt 的 DMF 偶联液，偶联反应 3 小时，得到： Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala- Lys(Palmitoyl-gama-Glu-Otbu) -Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys (Boc)-Gly-Arg(pbf)-Lys(AEEA-MPA )-wang resin.

1d) 全保护的脱除

Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Palmitoyl-gama-Glu-Otbu)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(Boc)-Gly-Arg(pbf)-Lys(AEEA-MPA)-wang resin 树脂加入至圆底烧瓶中 , 冰浴下加入切割液 TFA/EDT/Phenol/

Water(88/2/5/5 ，体积比 ), 升温，控制裂解液温度 25 ℃ , 反应 90 min 。过滤，滤饼用少量 TFA 洗涤 3 次，合并滤液。滤液在搅拌下缓慢倒入冰乙醚中。静置 1 h 以上 , 待沉淀完全。倾去上清液，沉淀离心，用冰乙醚洗涤 6 次，得到粗品： H-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp

-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Palmitoyl-gama-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys(AEEA-MPA)-OH 。

1e) 精制纯化

将 1d ）中所得粗品溶于 5% 乙酸 /H ₂ O 中，通过 10 μ m 反相 C18 的填充的 50mmx250mm 柱上进行 2 次半制备型 HPLC 纯化。用 32-50% CH ₃ CN-0.1%TFA/H ₂ O 梯度以 50ml/min 将该柱洗脱 45 分钟，收集含有肽的馏分，浓缩除去 CH ₃ CN 后冻干。得到 HPLC 纯度大于 98% 的纯品： H-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Palmitoyl-gama-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys(AEEA-MPA)-OH 。

用 PDMS 法分析分离出的产物，发现质子化分子离子峰的 m/z 值为 4106.31 ± 3 。因此，得出实施例 1 制备的化合物 1 的分子量为 4105.31 ± 3Da （理论值为 4105.31 ）。由金黄色葡萄球菌 V8 蛋白酶对目标化合物进行酶解切割，随后通过 PDMS 进行肽片段的质量测定，从而确定酰基化位置（ Lys26 、 Lys37 ）。

从药物代谢动力学、体外活性测定、药效学分析三个实验考察了实施例 1 制备的化合物 1 的动物实验，结果分别如下：

化合物 1 和 GLP- Ⅰ 药物代谢动力学分析

对于雄性 SD 大鼠以 0.1mg/kg 的剂量通过静脉注射（ IV ）或皮下注射（ SC ）途径分别施用实施例 1 制备的化合物 1 与 GLP - Ⅰ。在给药后的 0-360 小时内不同时间将动物进行放血处理，收集每个样本的血浆并用 N- 端特异的放射免疫测定法分析。使用模型依赖（对于 IV 所得的数据）和模型非依赖（对于 SC 所得的数据）的方法计算药物代谢动力学参数，数据如表 1-1 和表 1-2 所示。通过 IV 进行施用的化合物 1 的消除半衰期大约为 19 小时， GLP- Ⅰ 的消除半衰期大约为 12 小时。而通过 SC 进行施用的化合物 1 的消除半衰期大约为 15 小时， GLP- Ⅰ 消除半衰期大约为 8 小时。通过 IV 或 SC 途径分别施用化合物 1 与 GLP- Ⅰ ，均没有临床不良发应发生。通过表 1-1 和表 1-2 可以观察到化合物 1 延长消除半衰期、降低的清除率等。

表 1-1 化合物 1 的平均值（± SD ）药物代谢动力学实验数据

给药途径	Cmax (ng/mL)	Tmax (h)	AUC0-last (ng*h/mL)	T1/2 (h)	CL/F (mL/h/kg)	Vss/F (mL/kg)
1	IV(SD)	2251(186)	0.10(0.00)	53425(1803)	18.4(3.3)	2.1(0.4)	56(1.2)
1	SC(SD)	205(33)	27.0(0.0)	15847(2935)	14.2(1.1)	6.8(1.5)	265(65)

表 1-2 GLP- Ⅰ 的平均值（± SD ）药物代谢动力学实验数据

给药途径	C<sub>max</sub> (ng/mL)	T<sub>max</sub> (h)	AUC<sub>0-last</sub> (ng*h/mL)	T<sub>1/2</sub> (h)	CL/F (mL/h/kg)	Vss/F (mL/kg)
IV(SD)	1752(223)	0.008(0.00)	33124(2644)	11(4.3)	1.8(0.8)	101(1.7)
SC(SD)	164(38)	8.0(0.0)	7942(1985)	7(2.1)	2.8(1.7)	158(45)

其中， C _max 表示所观察的血浆浓度最大值； T _max 表示所观察的达血浆浓度最大值的时间； AUC _0-last 表示所测定的从 0 到无穷大的血浆浓度 - 时间曲线下的面积； T _1/2 表示以小时计的消除半衰期； CL/F 表示作为生物利用率函数的总的身体清除率； Vss/F 表示作为生物利用率函数的稳态时的分布容积。

化合物 1 和 GLP- Ⅰ 体外活性测定

将用于 CRE- 荧光素酶系统的，稳定表达人 GLP- Ⅰ 受体的 HEK-293 细胞，按照每孔 120 μ l 低血清 DMEM FBS 培养基、 30000 个细胞接种到 96 孔板中。接种后第二天，将 20 μ l 等分试样的待测样品溶于 0.5%BSA 中，与该细胞混合并孵育 5 小时。在加入细胞以获得剂量应答曲线（从该曲线测定 EC50 值）之前，一般为待测化合物 1 制备包含从 0.001nM 到 10nM 的 15 种稀释液，为待测 GLP- Ⅰ 制备包含从 0.001nM 到 10nM 的 15 种稀释液，以及为 Val8- GLP- Ⅰ (7-37)OH 标准品准备 0.3nM 和 3nM 的 10 种标准溶液。在孵育之后，将 100 μ l 荧光素酶试剂直接加入每块平板中并轻轻混合 2 分钟。将平板放入 Tri-lux 发光计中并计算荧光素酶表达导致的光输出。化合物 1 和 GLP- Ⅰ 的平均 EC50 值分别如下：化合物 1 的平均 EC50 值分别为 0.42 ± 0.05nM ； GLP- Ⅰ 的平均 EC50 值为 0.28 ± 0.04nM 。

化合物 1 和 GLP- Ⅰ 药效学分析

化合物 1 和 GLP- Ⅰ ，分别通过皮下注射（ SC ）途径按照 0.01mg/kg 的剂量给雄性短尾猴用药。并且通过皮下注射（ SC ）途径按照 0.01mg/kg 的剂量注射对照液磷酸盐缓冲液。皮下注射 0.01mg/kg 的剂量化合物 1 和 GLP- Ⅰ 后， 1 、 2 、 3 、 5 、 7 、 10 天分步输注葡萄糖液。皮下注射（ SC ） 0.01mg/kg 的剂量注射对照液后立即分步输注葡萄糖液。分步输注葡萄糖液是在禁食 15 小时后在给予镇静剂的猴子上进行的。在开始输注葡萄糖液 10 分钟之前，抽取血液样本定义基线。然后，以 15mg/kg/min 的速率再输注 30 分钟。在输注期间，以 15 分钟为间隔抽取血液样本，用免疫测定法确定胰岛素水平，数据显示如表 1-3 、 1-4 。

表 1-3 化合物 1 的平均值（± SD ）药效学参数值胰岛素曲线下面积

注射液	AUC<sub>0-last</sub> (pM*min)
	第1天	第2天	第3天	第5天	第7天	第10天
	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD
对照液	15432	3529	14251	2234	14012	2014	13984	1819	12759	1587	11845	1096
化合物1	35453	3102	33123	1852	31721	1542	30456	1432	29652	1254	28121	1022

表 1-4 GLP- Ⅰ的平均值（± SD ）药效学参数值胰岛素曲线下面积

注射液	AUC<sub>0-last</sub> (pM*min)
	第1天	第2天	第3天	第5天	第7天	第10天
	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD
对照液	15432	3529	14251	2234	14012	2014	13984	1819	12759	1587	11845	1096
GLP- Ⅰ	31254	3542	30045	2432	21123	1563	15542	1348	11764	1141	10548	1248

从表 1-3 、 1-4 可以看出，在单次皮下注射 0.01mg/kg 化合物 1 后，至少 10 天证明其具有促胰岛素活性，而注射 GLP- Ⅰ后只有 3 天具有促胰岛素活性。

实施例2：

化合物 2 （ Compound 2 ）合成

1a ) 主肽链组装：

按照 Fmoc/tbu 策略在 CS336X 多肽合成仪上合成 0.25mmol 规模的 Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys( Boc )-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys (ivDDe) -Gly-Arg(pbf)-Lys (Aloc) -wang resin 。

1b) Aloc 的脱除与 Q1 的引入：

将 1a ）中所得的肽树脂加入氯仿中，氩气保护下加入 Pd(PPh ₃ ) ₄ ,NMM ，搅拌反应 2 小时，树脂用 DMF, DCM 洗涤后，加入 Fmoc-Glu-OtBu,DIC, HOBt 的 NMP 偶联液 , 偶联 3 小时，哌啶（ piperidine ） /DMF 脱除 Fmoc 基团，加入软脂酸（ palmitic acid ） ,DIC,HOBt, 的 NMP 偶联液，偶联 3 小时，得到： Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)

-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys (Boc)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(ivDDe)-Gly-Ar g(pbf)-Lys( Palmitoyl-gama-Glu-Otbu )- wang resin 。

1c ) ivDDe 的脱除与 Q2 的引入：

在 NMP:DCM 为 1:1 （体积比）的溶液中将有 1b ）产生的保护的肽基树脂洗涤两次，加入新鲜制备的 2% 的肼水合物 NMP 溶液，将该反应混合物在室温下振摇 12 分钟，然后过滤。将肼处理步骤重复两次。此后用 NMP 、 DCM 和 NMP 充分洗涤树脂。向其中加入 3- 马来酰亚胺丙酸（ 3-maleimidopropionic acid ） ,DIC,HOBt 的 DMF 偶联液，偶联反应 3 小时，得到： Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe

-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys( Boc )-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys (MPA) -Gly-Arg(pbf)-Lys( Palmitoyl-gama-Glu-Otbu) - wang resin 。

1d) 全保护的脱除

Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys( Boc) -Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys( MPA) -Gly-Arg(pbf)-Lys( Palmitoyl-gama-Glu-Otbu )- wang resin 树脂加入至圆底烧瓶中 , 冰浴下加入切割液 TFA/EDT/Phenol/Water

(88/2/5/5 ，体积比 ), 升温，控制裂解液温度 25 ℃ , 反应 90 min 。过滤，滤饼用少量 TFA 洗涤 3 次，合并滤液。滤液在搅拌下缓慢倒入冰乙醚中。

静置 1 h 以上 , 待沉淀完全。倾去上清液，沉淀离心，用冰乙醚洗涤 6 次，得到粗品： H-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser

-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys( MPA )-Gly-Arg-Lys( Palmitoyl-gama-Glu) -OH 。

1e) 精制纯化

将 1d ）中所得粗品溶于 5% 乙酸 /H ₂ O 中，通过 10 μ m 反相 C18 的填充的 50mmx250mm 柱上进行 2 次半制备型 HPLC 而纯化。用 34-46% CH3CN-0.1%TFA/H ₂ O 梯度以 50ml/min 将该柱洗脱 45 分钟，收集含有肽的馏分，浓缩除去 CH ₃ CN 后冻干。得到 HPLC 纯度大于 98% 的纯品： H-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (MPA) -Gly-Arg-Lys (Palmitoyl-gama-Glu) -OH 。

用 PDMS 法分析分离出的产物，发现质子化分子离子峰的 m/z 值为 3949.31 ± 3 。因此，得出实施例 2 制备的化合物 2 的分子量为 3948.31 ± 3Da （理论值为 3948.31 ）。

从药物代谢动力学、体外活性测定、药效学分析三个实验考察了实施例 2 制备的化合物 2 的动物实验，结果分别如下：

化合物 2 和 GLP- Ⅰ 药物代谢动力学分析

对于雄性 SD 大鼠以 0.1mg/kg 的剂量通过静脉注射（ IV ）或皮下注射（ SC ）途径分别施用实施例 2 制备的化合物 2 与 GLP- Ⅰ 。在给药后的 0-360 小时内不同时间将动物进行放血处理，收集每个样本的血浆并用 N- 端特异的放射免疫测定法分析。使用模型依赖（对于 IV 所得的数据）和模型非依赖（对于 SC 所得的数据）的方法计算药物代谢动力学参数，数据如表 2-1 和表 2-2 所示。通过 IV 进行施用的化合物 2 的消除半衰期大约为 23 小时， GLP- Ⅰ 的消除半衰期大约为 12 小时。而通过 SC 进行施用的化合物 2 的消除半衰期大约为 18 ， GLP- Ⅰ 消除半衰期大约为 8 小时。通过 IV 或 SC 途径分别施用化合物 2 与 GLP- Ⅰ ，均没有临床不良发应发生。通过表 2-1 和表 2-2 可以观察到化合物 2 延长消除半衰期、降低的清除率等。

表 2-1 化合物 2 的平均值（±）药物代谢动力学实验数据

给药途径	Cmax (ng/mL)	Tmax (h)	AUC0-last (ng*h/mL)	T1/2 (h)	CL/F (mL/h/kg)	Vss/F (mL/kg)
2	IV(SD)	2239(201)	0.11(0.00)	53439(1631)	21.9(3.0)	2.3(0.5)	48(1.4)
2	SC(SD)	211(32)	23.8(0.0)	15812(1914)	16.9(1.2)	5.7(1.6)	259(22)

表 2-2 GLP- Ⅰ的平均值（±）药物代谢动力学实验数据

给药途径	Cmax (ng/mL)	Tmax (h)	AUC0-last (ng*h/mL)	T1/2 (h)	CL/F (mL/h/kg)	Vss/F (mL/kg)
IV(SD)	1752(223)	0.008(0.00)	33124(2644)	11(4.3)	1.8(0.8)	101(1.7)
SC(SD)	164(38)	8.0(0.0)	7942(1985)	7(2.1)	2.8(1.7)	158(45)

化合物 2 和 GLP- Ⅰ 体外活性测定

将用于 CRE- 荧光素酶系统的，稳定表达人 GLP- Ⅰ 受体的 HEK-293 细胞，按照每孔 120 μ l 低血清 DMEM FBS 培养基、 30000 个细胞接种到 96 孔板中。接种后第二天，将 20 μ l 等分试样的待测样品溶于 0.5%BSA 中，与该细胞混合并孵育 5 小时。在加入细胞以获得剂量应答曲线（从该曲线测定 EC50 值）之前，一般为待测化合物 1 制备包含从 0.001nM 到 10nM 的 15 种稀释液，为待测 GLP- Ⅰ 制备包含从 0.001nM 到 10nM 的 15 种稀释液，以及为 Val8- GLP- Ⅰ (7-37)OH 标准品准备 0.3nM 和 3nM 的 10 种标准溶液。在孵育之后，将 100 μ l 荧光素酶试剂直接加入每块平板中并轻轻混合 2 分钟。将平板放入 Tri-lux 发光计中并计算荧光素酶表达导致的光输出。化合物 2 和 GLP- Ⅰ 的平均 EC50 值分别如下：化合物 2 的平均 EC50 值分别为 0.44 ± 0.06nM ； GLP- Ⅰ 的平均 EC50 值为 0.28 ± 0.04nM 。

化合物 2 和 GLP- Ⅰ 药效学分析

化合物 2 和 GLP- Ⅰ ，分别通过皮下注射（ SC ）途径按照 0.01mg/kg 的剂量给雄性短尾猴用药。并且通过皮下注射（ SC ）途径按照 0.01mg/kg 的剂量注射对照液磷酸盐缓冲液。皮下注射 0.01mg/kg 的剂量化合物 2 和 GLP- Ⅰ 后， 1 、 2 、 3 、 5 、 7 、 10 天分步输注葡萄糖液。皮下注射（ SC ） 0.01mg/kg 的剂量注射对照液后立即分步输注葡萄糖液。分步输注葡萄糖液是在禁食 15 小时后在给予镇静剂的猴子上进行的。在开始输注葡萄糖液 10 分钟之前，抽取血液样本定义基线。然后，以 15mg/kg/min 的速率再输注 30 分钟。在输注期间，以 15 分钟为间隔抽取血液样本，用免疫测定法确定胰岛素水平，数据显示如表 2-3 、 2-4 。

表 2-3 化合物 2 的平均值（± SD ）药效学参数值胰岛素曲线下面积

注射液	AUC<sub>0-last</sub> (pM*min)
	第1天	第2天	第3天	第5天	第7天	第10天
	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD
对照液	15432	3529	14251	2234	14012	2014	13984	1819	12759	1587	11845	1096
化合物2	33251	2545	31545	1531	30123	1266	29142	1148	27964	1041	26418	1048

表 2-4 GLP- Ⅰ的平均值（± SD ）药效学参数值胰岛素曲线下面积

从表 2-3 、 2-4 可以看出，在单次皮下注射 0.01mg/kg 化合物 2 后，至少 10 天证明其具有促胰岛素活性，而注射 GLP- Ⅰ 后只有 3 天具有促胰岛素活性。

实施例3：

化合物 3 （ Compound 3 ）合成

1a ) 主肽链组装：

按照 Fmoc /tbu 策略在 CS336X 多肽合成仪上合成 0.25mmol 规模的 Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys( Aloc )-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys( ivDDe )-Gly-Arg(pbf)- Pro -wang resin 。

1b) Aloc 的脱除与 Q1 的引入：

将 1a 中所得的肽树脂加入氯仿中，氩气保护下加入 Pd(PPh3)4,NMM ，搅拌反应 2 小时，树脂用 DMF, DCM 洗涤后，加入 Fmoc-Asp-Otbu,DIC,HOBt 的 NMP 混合溶液，偶联 2 小时，哌啶（ piperidine ） /DMF 脱除 Fmoc 基团，硬脂酸（ stearic acid ） ,DIC,HOBt, 偶联 3 小时，得到： Boc-His(Boc)

-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Stearyl -beta-Asp-Otbu )-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys( ivDDe )-Gly-Arg(pbf)-Pro-wang resin 。

1c ) ivDDe 的脱除与 Q2 的引入：

在 NMP:DCM 为 1:1 （体积比）的溶液中将由 1b ）产生的保护的肽基树脂洗涤两次，加入新鲜制备的 2% 的肼水合物 NMP 溶液，将该反应混合物在室温下振摇 12 分钟，然后过滤。将肼处理步骤重复两次。此后用 NMP 、 DCM 和 NMP 充分洗涤树脂。向其中加入 Fmoc-AEEA-AEEA-OH,HBTU,DIEA 的 NMP 混合偶联液，振摇 3 小时后，过滤，洗涤，哌啶 /DMF 脱除 Fmoc 基团，用 3- 马来酰亚胺丙酸 ,DIC,HOBt 的 DMF 偶联液，偶联反应 3 小时，得到： Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Stearyl -beta-Asp-Otbu )-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys( AEEA-AEEA-MPA )-Gly-Arg(pbf)- Pro -wang resin 。

1d) 全保护的脱除

Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(Stearyl -beta-Asp-Otbu )-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys( AEEA-AEEA-MPA )-Gly-Arg(pbf)- Pro -wang resin 树脂加入至圆底烧瓶中 , 冰浴下加入切割液 TFA/EDT/Phenol/

Water(88/2/5/5 ，体积比 ), 升温，控制裂解液温度 25 ℃ , 反应 90 min 。过滤，滤饼用少量 TFA 洗涤 3 次，合并滤液。滤液在搅拌下缓慢倒入冰乙醚中。静置 1 h 以上 , 待沉淀完全。倾去上清液，沉淀离心，用冰乙醚洗涤 6 次，得到粗品： H -His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp

-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Stearyl -beta-Asp )-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (AEEA-AEEA-MPA) -Gly-Arg- Pro - OH 。

1e) 精制纯化

将 1d ）中所得粗品溶于 5% 乙酸 /H ₂ O 中，通过 10 μ m 反相 C8 的填充的 50mmx250mm 柱上进行 2 次半制备型 HPLC 而纯化。用 35-54% CH3CN-0.1%TFA/H ₂ O 梯度以 50ml/min 将该柱洗脱 45 分钟，收集含有肽的馏分，浓缩除去 CH3CN 后冻干。得到 HPLC 纯度大于 98% 的纯品： H -His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Stearyl -beta-Asp )-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (AEEA-AEEA-MPA) -Gly-Arg- Pro - OH 。

用 PDMS 法分析分离出的产物，发现质子化分子离子峰的 m/z 值为 4205.78 ± 3 。因此，得出实施例 3 制备的化合物 3 的分子量为 4204.78 ± 3Da （理论值为 4204.78 ）。由金黄色葡萄球菌 V8 蛋白酶对目标化合物进行酶解切割，随后通过 PDMS 进行肽片段的质量测定，从而确定酰基化位置（ Lys26 、 Lys34 ）。

从药物代谢动力学、体外活性测定、药效学分析三个实验考察了实施例 3 制备的化合物 3 的动物实验，结果分别如下：

化合物 3 和 GLP- Ⅰ药物代谢动力学分析

对于雄性 SD 大鼠以 0.1mg/kg 的剂量通过静脉注射（ IV ）或皮下注射（ SC ）途径分别施用实施例 3 制备的化合物 3 与 GLP- Ⅰ。在给药后的 0-360 小时内不同时间将动物进行放血处理，收集每个样本的血浆并用 N- 端特异的放射免疫测定法分析。使用模型依赖（对于 IV 所得的数据）和模型非依赖（对于 SC 所得的数据）的方法计算药物代谢动力学参数，数据如表 3-1 和表 3-2 所示。通过 IV 进行施用的化合物 3 的消除半衰期大约为 16 小时， GLP- Ⅰ的消除半衰期大约为 12 小时。而通过 SC 进行施用的化合物 3 的消除半衰期大约为 13 ， GLP- Ⅰ消除半衰期大约为 8 小时。通过 IV 或 SC 途径分别施用化合物 3 与 GLP- Ⅰ，均没有临床不良发应发生。通过表 3-1 和表 3-2 可以观察到化合物 3 延长消除半衰期、降低的清除率等。

表 3-1 化合物 3 的平均值（± SD ）药物代谢动力学实验数据

给药途径	Cmax (ng/mL)	Tmax (h)	AUC0-last (ng*h/mL)	T1/2 (h)	CL/F (mL/h/kg)	Vss/F (mL/kg)
3	IV(SD)	2191(209)	0.09(0.00)	53335(1565)	14.5(3.5)	2.2(0.5)	51(1.3)
3	SC(SD)	217(30)	22.7(0.0)	15742(1454)	11.3(1.3)	4.9(1.4)	245(28)

表 3-2 GLP- Ⅰ的平均值（± SD ）药物代谢动力学实验数据

其中， Cmax 表示所观察的血浆浓度最大值； Tmax 表示所观察的达血浆浓度最大值的时间； AUC0-last 表示所测定的从 0 到无穷大的血浆浓度 - 时间曲线下的面积； T 1/2 表示以小时计的消除半衰期； CL/F 表示作为生物利用率函数的总的身体清除率； Vss/F 表示作为生物利用率函数的稳态时的分布容积。

化合物 3 和 GLP- Ⅰ体外活性测定

将用于 CRE- 荧光素酶系统的，稳定表达人 GLP- Ⅰ受体的 HEK-293 细胞，按照每孔 120 μ l 低血清 DMEM FBS 培养基、 30000 个细胞接种到 96 孔板中。接种后第二天，将 20 μ l 等分试样的待测样品溶于 0.5%BSA 中，与该细胞混合并孵育 5 小时。在加入细胞以获得剂量应答曲线（从该曲线测定 EC50 值）之前，一般为待测化合物 3 制备包含从 0.001nM 到 10nM 的 15 种稀释液，为待测 GLP- Ⅰ制备包含从 0.001nM 到 10nM 的 15 种稀释液，以及为 Val8- GLP- Ⅰ (7-37)OH 标准品准备 0.3nM 和 3nM 的 10 种标准溶液。在孵育之后，将 100 μ l 荧光素酶试剂直接加入每块平板中并轻轻混合 2 分钟。将平板放入 Tri-lux 发光计中并计算荧光素酶表达导致的光输出。化合物 3 和 GLP- Ⅰ的平均 EC50 值分别如下：化合物 3 的平均 EC50 值分别为 0.33 ± 0.06nM ； GLP- Ⅰ的平均 EC50 值为 0.28 ± 0.04nM 。

化合物 3 和 GLP- Ⅰ药效学分析

化合物 3 和 GLP- Ⅰ，分别通过皮下注射（ SC ）途径按照 0.01mg/kg 的剂量给雄性短尾猴用药。并且通过皮下注射（ SC ）途径按照 0.01mg/kg 的剂量注射对照液磷酸盐缓冲液。皮下注射 0.01mg/kg 的剂量化合物 3 和 GLP- Ⅰ后， 1 、 2 、 3 、 5 、 7 、 10 天分步输注葡萄糖液。皮下注射（ SC ） 0.01mg/kg 的剂量注射对照液后立即分步输注葡萄糖液。分步输注葡萄糖液是在禁食 15 小时后在给予镇静剂的猴子上进行的。在开始输注葡萄糖液 10 分钟之前，抽取血液样本定义基线。然后，以 15mg/kg/min 的速率再输注 30 分钟。在输注期间，以 15 分钟为间隔抽取血液样本，用免疫测定法确定胰岛素水平，数据显示如表 3-3 、 3-4 。

表 3-3 化合物 3 的平均值（± SD ）药效学参数值胰岛素曲线下面积

注射液	AUC<sub>0-last</sub> (pM*min)
	第1天	第2天	第3天	第5天	第7天	第10天
	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD
对照液	15432	3529	14251	2234	14012	2014	13984	1819	12759	1587	11845	1096
化合物3	32996	2981	30121	1854	26731	1843	20454	1312	15342	1534	11131	832

表 3-4 GLP- Ⅰ的平均值（± SD ）药效学参数值胰岛素曲线下面积

从表 3-3 、 3-4 可以看出，在单次皮下注射 0.01mg/kg 化合物 3 后，至少 5 天证明其具有促胰岛素活性，而注射 GLP- Ⅰ 后只有 3 天具有促胰岛素活性。

实施例4：

化合物 4 （ Compound 4 ）合成

1a ) 主肽链组装：

按照 Fmoc/tbu 策略在 CS336X 多肽合成仪上合成 0.25mmol 规模的 Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-A la-Lys(ivDDe)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(ivDDe)-Gly-Arg(pbf)-Lys(Aloc) -wang resin 。

1b) Aloc 的脱除与 Q1 的引入：

将 1a ）中所得的肽树脂加入氯仿中，氩气保护下加入 Pd(PPh ₃ ) ₄ ,NMM ，搅拌反应 2 小时，树脂用 DMF, DCM 洗涤后，加入 Fmoc-Glu-OtBu,DIC, HOBt 的 NMP 偶联液 , 偶联 3 小时，哌啶（ piperidine ） /DMF 脱除 Fmoc 基团，加入软脂酸（ palmitic acid ） ,DIC,HOBt, 的 NMP 偶联液，偶联 3 小时，得到： Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-

Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala -Ala-Lys(ivDDe)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(ivDDe)-Gly-A rg(pbf)-Lys (Palmitoyl-gama-Glu-Otbu )- wang resin 。

1c ) ivDDe 的脱除与 Q2 的引入：

在 NMP:DCM 为 1:1 （体积比）的溶液中将由 1b ）产生的保护的肽基树脂洗涤两次，加入新鲜制备的 2% 的肼水合物 NMP 溶液，将该反应混合物在室温下振摇 12 分钟，然后过滤。将肼处理步骤重复两次。此后用 NMP 、 DCM 和 NMP 充分洗涤树脂。向其中加入 3- 马来酰亚胺丙酸 ,DIC,HOBt 的 DMF 偶联液，偶联反应 3 小时，得到： Boc-His(Boc)-D-Ala

-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys( MPA)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(MPA)-Gly-Ar g(pbf)-Lys( Palmitoyl-gama-Glu-Otbu) -wang resin 。

1d) 全保护的脱除

Boc-His(Boc)-D-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(Otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-A la-Lys(MPA)-Glu(Otbu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Lys(MPA)-Gly-Arg(pbf)-Lys(Palmitoyl-gama-Glu-Otbu)- wang resin 树脂加入至圆底烧瓶中 , 冰浴下加入切割液 TFA/EDT/Phenol/Water

-Ser-Tyr-Leu-Glu -Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(MPA)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(MPA)-Gly-Arg-Lys(Palmitoyl-gama-Glu) -OH 。

1e) 精制纯化

将 1d 中所得粗品溶于 5% 乙酸 /H ₂ O 中，通过 10 μ m 反相 C ₁₈ 的填充的 50mmx250mm 柱上进行 2 次半制备型 HPLC 而纯化。用 34-46% CH3CN-0.1%TFA/H ₂ O 梯度以 50ml/min 将该柱洗脱 45 分钟，收集含有肽的馏分，浓缩除去 CH3CN 后冻干。得到 HPLC 纯度大于 98% 的纯品： H-His-

D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Al a-Lys(MPA)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(MPA)-Gly-Arg-Lys(Palmitoyl-gama-Glu)-OH 。

用 PDMS 法分析分离出的产物，发现质子化分子离子峰的 m/z 值为 4097.65 ± 3 。因此，得出实施例 4 制备的化合物 4 的分子量为 4096.65 ± 3Da （理论值为 4096.65 ）。由金黄色葡萄球菌 V8 蛋白酶对目标化合物进行酶解切割，随后通过 PDMS 进行肽片段的质量测定，从而确定酰基化位置（ Lys26 、 Lys34 、 Lys37 ）。

从药物代谢动力学、体外活性测定、药效学分析三个实验考察了实施例 4 制备的化合物 4 的动物实验，结果分别如下：

化合物 4 和 GLP- Ⅰ 药物代谢动力学分析

对于雄性 SD 大鼠以 0.1mg/kg 的剂量通过静脉注射（ IV ）或皮下注射（ SC ）途径分别施用实施例 4 制备的化合物 4 与 GLP- Ⅰ 。在给药后的 0-360 小时内不同时间将动物进行放血处理，收集每个样本的血浆并用 N- 端特异的放射免疫测定法分析。使用模型依赖（对于 IV 所得的数据）和模型非依赖（对于 SC 所得的数据）的方法计算药物代谢动力学参数，数据如表 4-1 和表 4-2 所示。通过 IV 进行施用的化合物 4 的消除半衰期大约为 18 小时， GLP- Ⅰ 的消除半衰期大约为 12 小时。而通过 SC 进行施用的化合物 4 的消除半衰期大约为 14 ， GLP- Ⅰ 消除半衰期大约为 8 小时。通过 IV 或 SC 途径分别施用化合物 4 与 GLP- Ⅰ ，均没有临床不良发应发生。通过表 4-1 和表 4-2 可以观察到化合物 4 延长消除半衰期、降低的清除率等。

表 4-1 化合物 4 的平均值（± SD ）药物代谢动力学实验数据

给药途径	Cmax (ng/mL)	Tmax (h)	AUC0-last (ng*h/mL)	T1/2 (h)	CL/F (mL/h/kg)	Vss/F (mL/kg)
4	IV(SD)	2211(211)	0.15(0.00)	53245(1613)	16.8(2.8)	2.7(0.3)	46(1.1)
4	SC(SD)	228(34)	23.8(0.0)	15458(1918)	13.2(0.9)	4.2(1.2)	252(21)

表 4-2 GLP- Ⅰ的平均值（± SD ）药物代谢动力学实验数据

化合物 4 和 GLP- Ⅰ 体外活性测定

将用于 CRE- 荧光素酶系统的，稳定表达人 GLP- Ⅰ 受体的 HEK-293 细胞，按照每孔 120 μ l 低血清 DMEM FBS 培养基、 30000 个细胞接种到 96 孔板中。接种后第二天，将 20 μ l 等分试样的待测样品溶于 0.5%BSA 中，与该细胞混合并孵育 5 小时。在加入细胞以获得剂量应答曲线（从该曲线测定 EC ₅₀ 值）之前，一般为待测化合物 4 制备包含从 0.001nM 到 10nM 的 15 种稀释液，为待测 GLP- Ⅰ 制备包含从 0.001nM 到 10nM 的 15 种稀释液，以及为 Val ₈ - GLP- Ⅰ (7-37)OH 标准品准备 0.3nM 和 3nM 的 10 种标准溶液。在孵育之后，将 100 μ l 荧光素酶试剂直接加入每块平板中并轻轻混合 2 分钟。将平板放入 Tri-lux 发光计中并计算荧光素酶表达导致的光输出。化合物 4 和 GLP- Ⅰ 的平均 EC ₅₀ 值分别如下：化合物 4 的平均 EC ₅₀ 值分别为 0.44 ± 0.06nM ； GLP- Ⅰ 的平均 EC ₅₀ 值为 0.28 ± 0.04nM 。

化合物 4 和 GLP- Ⅰ 药效学分析

化合物 4 和 GLP- Ⅰ ，分别通过皮下注射（ SC ）途径按照 0.01mg/kg 的剂量给雄性短尾猴用药。并且通过皮下注射（ SC ）途径按照 0.01mg/kg 的剂量注射对照液磷酸盐缓冲液。皮下注射 0.01mg/kg 的剂量化合物 4 和 GLP- Ⅰ 后， 1 、 2 、 3 、 5 、 7 、 10 天分步输注葡萄糖液。皮下注射（ SC ） 0.01mg/kg 的剂量注射对照液后立即分步输注葡萄糖液。分步输注葡萄糖液是在禁食 15 小时后在给予镇静剂的猴子上进行的。在开始输注葡萄糖液 10 分钟之前，抽取血液样本定义基线。然后，以 15mg/kg/min 的速率再输注 30 分钟。在输注期间，以 15 分钟为间隔抽取血液样本，用免疫测定法确定胰岛素水平，数据显示如表 4-3 、 4-4 。

表 4-3 化合物 4 的平均值（± SD ）药效学参数值胰岛素曲线下面积

注射液	AUC<sub>0-last</sub> (pM*min)
	第1天	第2天	第3天	第5天	第7天	第10天
	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD	平均值	SD
对照液	15432	3529	14251	2234	14012	2014	13984	1819	12759	1587	11845	1096
化合物4	31953	2982	30123	1862	25728	1382	23449	1162	20632	1034	15121	990

表 4-4 GLP- Ⅰ的平均值（± SD ）药效学参数值胰岛素曲线下面积

从表 4-3 、 4-4 可以看出，在单次皮下注射 0.01mg/kg 化合物 4 后，至少 7 天证明其具有促胰岛素活性，而注射 GLP- Ⅰ 后只有 3 天具有促胰岛素活性。

实施例 5

组合物配方：由浓度为 0.9mg/ml 实施例 1 制备的化合物 1 ，浓度为 8.0mM 的磷酸盐缓冲液，浓度为 5.0% （ w/v ）的苯甲酚，浓度为 5.2% （ w/v ）的甘露醇，浓度为 12.5mg/ml 的丙二醇， pH 为约 7.5 。

其制备过程如下：向 10 00ml 烧杯中加入 0.9g 实施例 1 制备的化合物 1 ， 52 g 甘露醇， 50g 苯甲酚， 12.5g 丙二醇， 750ml 水，加入磷酸盐至其浓度为 8 mM ，并且用 1NNaOH 将 pH 调节至 7.5 ，加注射用水定容。在过滤前，注射液中加入 12.5g 活性碳，在搅拌下吸附热原 30 分钟，脱碳过滤。滤液经 0.22 µ m 钛棒过滤器过滤，再经 0.22 µ m 微孔滤膜除菌过滤。每瓶以 1.25ml 的量填充入 10ml 玻璃小瓶，冷冻干燥，压塞，扎盖，获得实施例 1 制备的化合物 1 制剂。

由实施例 5 制得制剂 5 00 支，通加速试验对其稳定性进行了考察。通过动物血管刺激性、肌肉刺激性、溶血及过敏性实验，对局部刺激性进行了考察。

加速试验：

将实施例 5 制备的一批样品放入温度为 40 ± 2 ℃ 、相对湿度为 75% ± 5% 的恒温恒湿箱中进行考察，分别在 0 、 1 、 2 、 3 和 6 个月时取样测定，结果见表 5-1 。

表 5-1 实施例 5 样品加速试验结果

批号	时间（月）	外观色泽	pH	溶液澄清度	有关物质（％）	含量(%)
批号	时间（月）	外观色泽	pH	溶液澄清度	单个杂质	含量(%)	总杂质
100401	0	无色溶液	7.5	澄清	0.14	0.85	100.2
	1	无色溶液	7.3	澄清	0.18	0.79	101.1
	2	无色溶液	7.4	澄清	0.26	0.76	100.8
	3	无色溶液	7.7	澄清	0.30	0.97	99.5
	6	无色溶液	7.3	澄清	0.33	1.13	98.9

通过表 5-1 可以看出，经加速试验考察 6 个月，实施例 5 制备的制剂，外观色泽、 pH 、溶液澄清度指标无明显变化，杂质无明显增加，含量无明显下降，表明本发明制备的制剂可于室温下保存，稳定性强。

血管刺激性、肌肉刺激性、过敏性及溶血实验：

血管刺激性：

选取双耳无损伤的健康家兔 6 只，左侧耳缘静脉注射实施例 5 注射液 1ml ，右耳注射等容量 5% 葡萄糖注射液，每天 1 次，连续注射 7 天。

注射期间，每天定时观察耳缘静脉的刺激性反应。第 8 天处死家兔，取双侧耳缘静脉及周围组织，用甲醛固定，在注射部位近心端作常规组织切片，光镜下观察有无病理变化。观察指标及判断标准见表 5-2 。

表 5-2 血管刺激性评分及判断标准

观察方法	血管刺激性评分标准	血管刺激性判断标准
	观察指标得分评分标准	累计得分判断标准
肉 <dl id="dlis298"><dt /><dd /></dl> 眼	周围组织0 无水肿1 轻微水肿2 明显水肿 3 重度水肿	< 0.5 无刺激性< 2.5 轻度刺激性< 4.5 中度刺激性> 4.5 重度刺激性
	血管0正常1 血管轻度充血发红，纹路清晰2 血管充血发红，纹路不清3 血管重度充血,呈紫红色
光镜	周围组织0正常1 水肿2 出血3 炎症细胞浸润	< 0.5 无刺激性< 2.5 轻度刺激性< 4.5 中度刺激性> 4.5 重度刺激性
	血管0内皮及血管壁完整1 内皮损伤2 血管栓塞 3 血管破裂

结果显示，家兔耳缘静脉注射实施例 5 注射液的刺激性，与 5% 葡萄糖注射液比较无明显差异。肉眼观察，未见血管充血、周围组织水肿等炎症反应。组织切片检查，未见血管结构异常、内皮损伤、血栓形成及其它病理变化。其肉眼和光镜观察的血管、周围组织的累计得分均小于 0.5 ，表明无刺激性。

肌肉刺激性：

取健康家兔 6 只，每只家兔左侧股四头肌内注射实施例 5 注射液 1ml ，右侧注射同体积生理盐水。注射后观察注射部位肌肉有无充血、水肿等反应，半数动物 48h 后 ( 第 3 天 ) 放血处死，纵向切开皮肤，肉眼观察两侧注射部位有无充血、水肿等反应，并取其组织做病理检查。然后按表 1-3 中的标准评价该药的刺激反应。余下动物继续观察 14d ，于第 18 天放血处死后重复上述操作，评价标准见表 5-3 。

表 5-3 肌肉刺激反应评价标准

级别	刺激反应现象
0 级	给药部位无明显反应
1 级	给药部位轻度充血，直径小于0.15cm
2 级	给药部位中度充血，直径0.15～1.0cm
3 级	给药部位重度充血、红肿、肌肉有变性
4 级	出现肌肉褐色变性、坏死
5 级	肌肉严重变性，出现大面积坏死

结果表明，家兔左侧股四头肌内注射实施例 5 注射液后，肉眼观察注射部位肌肉无充血、水肿等反应，病理组织检查亦未见组织变性或坏死等明显性刺激反应，与生理盐水侧相比无显著差异。

对豚鼠的致敏作用：

选取健康豚鼠 6 只，每只腹腔注射实施例 5 注射液 0.5ml ，隔日注射 1 次，共注射 3 次。然后随机分为 2 组，分别在第 1 次给药后 14 或 21 天，静脉注射实施例 5 注射液 1ml 。观察豚鼠有无兴奋不安、呼吸困难等过敏症状。

结果两组豚鼠均活动正常，未见呼吸异常等。

体外溶血性试验：

制备 2% 家兔红细胞悬液。取试管 7 支，按表 5-4 加入各种液体。将各试管轻轻摇匀，置 37 ℃恒温水浴中孵育，观察 0.5 、 1 、 2 、 3 、 6 小时的结果。红细胞体外凝集与溶血的判断标准见表 5-5 。

表 5-4 样品体外溶血试验加样表

管号	1	2	3	4	5	6	7
实施例5 (ml)	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5	0	0
0.9% 氯化钠注射液(ml）	2.4	2.3	2.2	2.1	2.0	2.5	0
蒸馏水（ml）	0	0	0	0	0	0	2.5
2% 红细胞悬液（ml）	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
实施例5终浓度（mg/ml）	0.18	0.36	0.54	0.72	0.90	0	0

表 5-5 红细胞体外溶血与凝集试验判断标准

观察指标	分级	判断标准
溶血	完全溶血	溶液澄明红色，管底无细胞残留。
	部分溶血	溶液澄明红色或棕红色，管底有少量细胞残留。
	不溶血	上清液无色澄明，红细胞全部下沉。
红细胞凝集	假凝集	红细胞聚集成块,振摇后能分散，制剂可供临床使用。
红细胞凝集	真凝集	振摇后凝集物不能分散，制剂不宜用于临床。

结果，蒸馏水对照管在 0.5 小时完全溶血。生理盐水和实施例 5 样品各浓度在 6 小时内均无溶血现象。轻轻振摇，生理盐水和各浓度实施例 5 样品管底沉积的红细胞均能完全分散，表明本实施例制备的注射液无红细胞凝集反应。

血管刺激性、肌肉刺激性、体外溶血性及过敏性实验表明，实施例5注射液无明显的刺激性、过敏性，也不会引起溶血反应。

Claims

1. 一种 GLP- Ⅰ 类似物，所述 GLP- Ⅰ 类似物含有以下序列的母体肽 :

H ₂ N-Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys26-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Xaa34-Gly-Arg-Xaa37-COR1 ；

其中， R1=-OH 或 -NH ₂ ；

Xaa26=Lys ；

Xaa34=Lys, Glu, Asn 或 Arg ；

Xaa37=Gly, Ala, Glu, Pro 或 Lys ；且 Xaa34 或 Xaa37 当中的至少一个为 Lys ；

所述 GLP- Ⅰ类似物还含有 Q1 和 Q2 基团， Q1 及 Q2 基团同时出现在母体肽中，当 Xaa26,Xaa34,Xaa37 任意两个或全部为 Lys 时，以酰胺键的形式连接在 Xaa26 ,Xaa34,Xaa37 中的任意二个 Lys 残基上；

所述 Q1 基团为亲脂性的取代基连接一个桥接基团 W ，亲脂性的取代基以其羧基与一个桥接基团的氨基形成一个酰胺键，桥接基团的氨基酸残基的羧基与母体肽的一个 Lys 的 N- 末端残基上形成一个酰胺键从而连接到母体肽上；桥接基团 W 是有 1-7 个亚甲基不分支链烷烃α , ω - 二羧基；所述亲脂性取代基是选自含 CH ₃ (CH ₂ ) _n CO- 之组的一个酰基，其中 n 是 4-38 的整数；

所述Q2基团为ε(AEEA)_n-MPA，n=0-3，其结构式如下：

。

2 、如权利要求 1 所述的 GLP- Ⅰ类似物，其特征在于，所述的 Xaa7 为组氨酸。

3 、如权利要求 2 所述的 GLP- Ⅰ类似物，其特征在于，所述的 Xaa8 为 D-Ala 。

4 、如权利要求 2 所述的 GLP- Ⅰ类似物，其特征在于，所述的桥接基团 W 为有 2 个亚甲基的不分支链烷烃α , ω - 二羧基。

5 、如权利要求 4 所述的 GLP- Ⅰ类似物，其特征在于，所述的桥接基团 W 为谷氨酸。

6 、如权利要求 2 所述的 GLP- Ⅰ 类似物，其特征在于，所述的 CH 3 (CH 2 ) n CO ，其中 n 是 4-24 的整数。

7 、如权利要求 6 所述的 GLP- Ⅰ 类似物，其特征在于，所述的亲脂性取代基是 CH 3 (CH 2 ) 14 CO- 。

8 、一种制备权利要求 1-7 任一项所述的 GLP- Ⅰ类似物的方法，其特征在于，包括：合成 GLP- Ⅰ类似物的母体肽，所述母体肽上的自由氨基和自由羧基被保护基团保护；脱去 Q1 基团在母体肽上的偶联位置处的氨基酸残基上的保护基团，将 Q1 基团偶联到所述母体肽上；脱去 Q2 基团在母体肽上的偶联位置处的氨基酸残基上的保护基团，将 Q2 基团偶联到所述母体肽上；脱去母体肽上其它氨基酸残基上的保护基团，制备得到所述的 GLP- Ⅰ类似物。

9 、如权利要求 8 所述的方法，其特征在于，还包括：将制备得到的 GLP- Ⅰ类似物使用反相液相色谱纯化。

10 、如权利要求 8 所述的方法，所述将 Q1 基团偶联到所述母体肽上，其特征在于，包括：桥接基团的氨基酸残基的羧基与母体肽的一个 Lys 的 N- 末端残基上形成一个酰胺键从而连接到母体肽上，亲脂性的取代基以其羧基与一个桥接基团的氨基形成一个酰胺键从而偶联到母体肽上。

11 、如权利要求 8 所述的方法，所述将 Q2 基团偶联到所述母体肽上，其特征在于，包括：（ AEEA ） n 的羧基与母体肽的一个 Lys 的 N- 末端残基上形成一个酰胺键从而连接到母体肽上， MPA 以其羧基与（ AEEA ） n 的氨基形成一个酰胺键 ; 所述（ AEEA ） n 中的 n=1-3 。

12 、如权利要求 8 所述的方法，其特征在于，所述将 Q2 基团偶联到所述母体肽上，包括： MPA 以其羧基与母体肽的一个 Lys 的 N- 末端残基上形成一个酰胺键。

13 、一种药物组合物，所述的药物组合物含有权利要求 1-7 任一项所述的 GLP- Ⅰ类似物或其药学上可接受的盐。

14 、如权利要求 13 所述的药物组合物，包括： 0.9mg/ml 权利要求 1-7 任一项所述的 GLP- Ⅰ类似物或其药学上可接受的盐， 5.0% （ w/v ）的苯甲酚， 5.2% （ w/v ）的甘露醇， 12.5mg/ml 的丙二醇， 8.0mM 的磷酸盐缓冲液。

15 、如权利要求 1-7 任一项所述的 GLP- Ⅰ类似物在制备治疗或预防疾病的药物中的用途。

16 、如权利要求 15 所述的用途，其特征在于，所述的疾病为高血糖症、 2 型糖尿病、葡萄糖耐量降低、 1 型糖尿病、肥胖症、高血压、 X 综合症、血脂障碍、认知障碍、动脉粥样硬化、心肌梗塞、冠心病和其他心血管疾病、中风、炎性肠综合症、消化不良或胃溃疡。

17 、如权利要求 15 所述的用途，其特征在于，所述的 GLP- Ⅰ类似物用于制备延缓或预防 2 型糖尿病发展的药物。

18 、如权利要求1-7任一项所述的GLP- Ⅰ类似物在制备减少食物摄取、减少β- 细胞凋亡、增强β-细胞功能和β-细胞量和/或恢复β-细胞的葡萄糖敏感性的药物中的用途。