CN115232200B - 长效化Exendin-4类似物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及长效化Exendin‑4类似物、其制备方法及其作为药物的应用。本发明通过半胱氨酸的巯基与马来酰亚胺发生迈克尔加成反应来方便高效地引入小分子基团，可避免在早期GLP‑1受体长效化激动剂的研发过程中，采用赖氨酸作为小分子基团连接臂所引起的选择性差、反应不方便等问题。此外，小分子基团具有较强的血清白蛋白结合率，可增加缀合物与血清白蛋白的结合，延长肽链的作用时间，可避免GLP‑1的肾脏快速滤过和代谢失活，因而该类化合物的半衰期及体内降糖作用时间显著延长。而且意外地发现，本发明修饰后的Exendin‑4类似物可以与小分子吸收增强剂混合后，口服给药可以产生较好的治疗效果。

Description

长效化Exendin-4类似物及其应用
技术领域
本发明涉及药物化学、糖尿病治疗和减肥领域，具体涉及长效化Exendin-4类似物、其制备方法及其作为药物的应用。
背景技术
糖尿病是继肿瘤、心血管疾病之后第三大严重威胁人类健康的慢性非传染性疾病。临床上采用胰岛素强化治疗的方法来延缓糖尿病进程，胰岛素治疗在降低血糖的同时可以一定程度上逆转胰岛β-细胞功能损害。但是使用胰岛素后可能会出现低血糖的危险。受到剂量大小、注射部位、注射途径、个体差异或注射后未进食等因素的影响，如果使用胰岛素稍有不慎，就会出现严重的低血糖副作用。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)主要由肠道L细胞葡萄糖依赖性分泌的肠降血糖多肽激素，作用于胰岛β-细胞膜上的受体GLP-1受体(GLP-1R)，促进胰岛素的分泌。其葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌的特性，不易出现低血糖副作用。
其它生物学效应还包括：
1、促进β-细胞胰岛素基因的转录和翻译，刺激β-细胞的增值和分化；
2、增加胰岛素的敏感性；
3、增加生长抑素分泌，抑制胰高血糖素的产生(此作用也是血糖依赖性)；
4、抑制胃酸分泌，延迟胃排空；
5、通过作用于丘脑下部的中枢抑制食欲，降低食物摄取量等作用。
虽然天然GLP-1在治疗糖尿病上有以上诸多优点，但它在体内易被二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)快速降解。DPP-Ⅳ可特异性识别天然GLP-1的N末端第二位丙氨酸(Ala)残基，从肽链N末端第8位丙氨酸(Ala)处切除二肽，使其转变为无活性的形式，其体内半衰期仅几分钟。GLP-1分子N端是与GLP-1受体的结合部位，其组氨酸残基丧失，导致GLP-1完全失去生物活性。目前普遍使用的延长GLP-1体内半衰期的修饰策略包括对8位修饰使得GLP-1能抵抗DPP-IV酶的降解，将GLP-1肽链N端8位和9位的氨基酸互换可以达到此目的。然而，由于多肽还会在肾脏中快速滤过消除，抗DPP-IV酶的降解只能一定程度的延长GLP-1的半衰期。
诺和诺德公司将索马鲁肽与名为SNAC(sodium N-(8-[2-hydroxybenzoyl]amino)caprylate)的小分子吸收增强剂混合构成了口服索马鲁肽(semaglutide，
Figure BDA0003597311090000021
)，于2019年9月被FDA批准上市。SNAC与索马鲁肽的结合能够让索马鲁肽在胃部被部分吸收。SNAC在胃部的溶解能够提高局部环境的pH值，不仅能改善索马鲁肽的溶解度，还可以缓冲胃酸环境，抵抗胃部酶解，当SNAC与索马鲁肽之间的非共价键暴露于血液后很容易断裂，从而释放索马鲁肽进入循环。但是到目前为止，口服GLP-1受体激动肽中仅仅只有索马鲁肽被验证与SNAC共给药能发挥降糖作用。未见其它的GLP-1受体激动肽如利拉鲁肽等具有与SNAC组合给药发挥降糖作用的报道。本发明设计人意外地发现，本发明所设计合成的多肽具有与包括SNAC在内的口服吸收促进剂组合给药发挥降糖效果的能力。克服了多肽药物不被口服吸收这一重大缺陷。能够减少病人多次皮下给药的痛苦，具有实用性，给糖尿病治疗领域带来新的突破。
发明内容
本发明在研究中发现，将改构后的rExendin-4与SNAC混合后口服给药，无法获得确切的治疗效果。
为了制备含Exendin-4的口服制剂，并解决现有技术存在的问题，本发明在短效GLP-1受体激动剂Exendin-4的基础上，设计合成了一类新型的Exendin-4类似物。该类类似物对多肽非活性位点进行半胱氨酸替换，采用半胱氨酸-马来酰亚胺缀合策略，设计合成了一类Exendin-4衍生物。本发明通过半胱氨酸的巯基与马来酰亚胺发生迈克尔加成反应来方便高效地引入小分子基团，可避免在早期GLP-1受体长效化激动剂的研发过程中，采用赖氨酸作为小分子基团连接臂所引起的选择性差、反应不方便等问题。此外，小分子基团具有较强的血清白蛋白结合率，可增加缀合物与血清白蛋白的结合，延长肽链的作用时间，可避免GLP-1的肾脏快速滤过和代谢失活，因而该类化合物的半衰期及体内降糖作用时间显著延长。而且意外地发现，本发明修饰后的Exendin-4类似物可以与小分子吸收增强剂混合后，口服给药可以产生较好的治疗效果。
因此，本发明通过如下技术方案实现：
本发明涉及一类Exendin-4类似物，其为如下式(I)所示序列：
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro–Xaa-OH
式(I)
其中：
Xaa为Cys或化学修饰的Cys；
化学修饰的Cys选自：
Figure BDA0003597311090000031
其中，n选自自然数6-14，m选自自然数6-14。
根据本发明的优选技术方案，所述n选自6-12，例如8-10，m选自6-12，例如8-10。
根据本发明的优选技术方案，优选的化学修饰的Cys选自：
Figure BDA0003597311090000041
在一个实施方案中，本发明涉及具有如下序列的Exendin-4类似物：
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys-OH
(SEQ.ID NO.1)
Figure BDA0003597311090000042
Figure BDA0003597311090000051
本发明还提供了一种药物组合物，包括治疗有效量的至少一种上述式(I)化合物、其药学上可接受的盐，或药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明进一步提供了上述式(I)化合物和其药学上可接受的盐，或药学上可接受的载体或稀释剂在制备用于治疗糖尿病的药物中的应用。
本发明还提供了上述式(I)化合物的制备方法，其包括如下步骤：
将式I-1化合物与
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys-OH
式(I-1)
Cys的修饰基团或带有保护基的Cys的修饰基团进行反应，制备得到式(I)化合物。
根据本发明，所述反应通过在树脂上的固定化反应进行。
根据本发明，在反应完成后，还包括裂解树脂的步骤。
根据本发明，所述Cys的修饰基团或带有保护基的Cys的修饰基团选自如下所示结构：
Figure BDA0003597311090000061
其中NH上的另一个键为H，或者为NH保护基团；
其中，n选自自然数6-14，m选自自然数6-14。
根据本发明的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)树脂的溶胀
(2)Fmoc-Cys(Trt)-Wang Resin的合成
将Fmoc-Cys(Trt)-OH(23.2mg,0.04mmol)，HBTU(15.1mg,0.04mmol)，HOBt(5.4mg,0.04mmol)和DIPEA(13.9μL,0.08mmol)溶于NMP10 mL中，再将此溶液加入上一步得到的树脂中反应，用DCM和NMP洗涤树脂。
(3)Fmoc脱保护
用哌啶脱除氨基酸的Fmoc保护基，脱去Fmoc后的树脂或者氨基酸会裸露氨基用于和下一个氨基酸的羧基连接形成酰胺键。树脂清洗干净后加入脱保护剂，通入氮气，吹动溶液，反应15min后，将反应液抽出。再加入新的脱保护剂，通入氮气，吹动30min，滤出反应液。向反应管中交替加入DMF或DCM进行清洗4次。
检测：取少量树脂放入0.5mL EP管中，加入3滴检测试剂充分晃动后观察。若树脂呈蓝色，则脱保护成功；若树脂无色，则还需要加入脱保护剂进行脱除。
(4)氨基酸耦合
将Fmoc-Pro-OH(4.6mg,0.04mmol)和HOBt(6.5mg，0.048mmol)用DMF充分溶解，加入DIC(6.05mg，0.048mmol)，充分搅拌。将上述配置的缩合溶液倒入多肽反应管。通入氮气，吹动溶液3h。反应结束后，DMF和DCM交替清洗4次。
检测：取少量树脂放入0.5mL EP管中，加入3滴检测试剂充分晃动后观察。若树脂呈白色，则氨基酸耦合成功。若树脂仍为蓝色，则重新配制缩合溶液进行耦合。
(5)肽链的延长
按照肽链的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸，依次连接上相应的氨基酸直至肽链合成完毕，得到连有SEQ.ID NO:1的树脂。
(6)树脂上多肽的裂解
将上述得到的连有SEQ.ID NO:1的树脂放入反应瓶中，各加入裂解剂Reagent K(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT,82.5:5:5:5:2.5,V/V)10mL，进行反应。
本发明还可以采用生物制备的方法制备上述式(I)的化合物，即通过生物表达得到目标肽序，后续通过半胱氨酸的巯基与马来酰亚胺发生迈克尔加成反应得到上述目标化合物。
本发明还提供一种口服递送组合物，其包含治疗有效量的至少一种上述式(I)化合物、其药学上可接受的盐，或药学上可接受的载体或稀释剂。
根据本发明的口服递送组合物，其还包括口服促吸收剂。
本发明还提供了上述式(I)化合物的口服递送组合物，其特征在于：上述式(I)化合物和口服促吸收剂的组合物，其中化合物与口服促吸收剂质量比为1:10-300。
根据本发明优选的技术方案，其特征在于，所述口服促吸收剂为8-(2-羟基苯甲酰胺基)辛酸钠、N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸(5-CNAC)、胆碱和香叶酸组成的离子液体(Cage)、N-[10-(2-羟基苯甲酰基)氨基]癸酸钠(SNAD)。根据本发明更优选的技术方案，其特征在于：所述口服促吸收剂为8-(2-羟基苯甲酰胺基)辛酸钠。
本发明的优点在于：
1、本发明的长效化Exendin-4类似物可以在保留降糖活性的基础上，具有抗肾脏滤过消除和抗DPP-Ⅳ酶解作用。
2、本发明的肽链为固相合成或生物表达得到，缀和长效化小分子后半衰期及体内降糖作用时间显著延长制备得到的Exendin-4类似物，结构全新，比天然Exendin-4更加稳定，降血糖作用时间长，适合作为治疗糖尿病药物的活性成分。
3、本发明意外地发现设计合成得到化合物具有与口服吸收促进剂(如N-[8-(2-羟基苯甲酰基)-氨基]辛酸钠)混合后，口服给药能发挥降糖效果的能力。克服了多肽药物不被口服吸收这一重要瓶颈。能够减少病人多次皮下给药的痛苦，具有实用性，给糖尿病治疗领域带来新的突破。
附图说明
图1是实验4中组合物对正常ICR小鼠口服糖耐量的影响；(a)代表血浆葡萄糖水平随时间的变化；(b)显示血糖水平的AUC0-2h，±SEM(n＝6).**为p≤0.01and***为p≤0.001。
实验组1：Exendin-4(口服)；
实验组2：实施例2+口服吸收促进剂制备得到口服递送组合物；
实验组3：实施例3+口服吸收促进剂制备得到口服递送组合物；
实验组4：实施例4+口服吸收促进剂制备得到口服递送组合物；
实验组5：实施例5+口服吸收促进剂制备得到口服递送组合物；
实验组6：实施例6+口服吸收促进剂制备得到口服递送组合物；
实验组7：实施例7+口服吸收促进剂制备得到口服递送组合物；
实验组8：实施例8+口服吸收促进剂制备得到口服递送组合物。
图2是实验2中Exendin-4及Exendin-4类似物的隔日降血糖效应。
具体实施方式
在本说明书全文中采用以下缩写：
Ala：丙氨酸；Arg：精氨酸；Asn：天冬酰胺；Asp：天门冬氨酸；DCM：二氯甲烷；DIC：N，N’-二异丙基碳二亚胺；DIEA：N，N'-二异丙基乙胺；DMF：二甲基甲酰胺；DMSO：二甲亚砜；ESI-MS：电喷雾质谱；Fmoc：N-9-芴甲氧羰基；Gln：谷氨酰胺；Glu：谷氨酸；Gly：甘氨酸；HBTU：苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯；His：组氨酸；HOBt：1-羟基-苯并三氮唑；Ile：异亮氨酸；Leu：亮氨酸；Lys：赖氨酸；Met：甲硫氨酸；NMP：N-甲基吡咯烷酮；Phe：苯丙氨酸；Pro：脯氨酸；Ser：丝氨酸；Thr：苏氨酸；Trp：色氨酸；Tyr：酪氨酸；Val：缬氨酸。
本发明是通过下列实施例来进行说明的，但这些实施例不是本发明保护范围的限制。
实施例1
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Cys-OH
(SEQ.ID NO.1)的固相合成
(1)树脂的溶胀
称取Wang Resin 50mg(取代度1.16mmol/g)，经DCM 7mL溶胀30min，抽滤去DCM，再用NMP 10mL溶胀30min，分别用NMP，DCM 7mL冲洗干净。
(2)Fmoc-Cys(Trt)-Wang Resin的合成
将Fmoc-Cys(Trt)-OH(24.8mg，0.04mmol)，HBTU(15.1mg，0.04mmol)，HOBt(5.4mg，0.04mmol)和DIPEA(13.9μL，0.08mmol)溶于NMP 10mL中，再将此溶液加入上一步得到的树脂中反应2小时，结束后滤去反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。
(3)Fmoc脱保护
用哌啶脱除氨基酸的Fmoc保护基，脱去Fmoc后的树脂或者氨基酸会裸露氨基用于和下一个氨基酸的羧基连接形成酰胺键。树脂清洗干净后加入脱保护剂，通入氮气，吹动溶液，反应15min后，将反应液抽出。再加入新的脱保护剂，通入氮气，吹动30min，滤出反应液。向反应管中交替加入DMF或DCM进行清洗4次。
检测：取少量树脂放入0.5mL EP管中，加入3滴检测试剂充分晃动后观察。若树脂呈蓝色，则脱保护成功；若树脂无色，则还需要加入脱保护剂进行脱除。
(4)氨基酸耦合
将Fmoc-Pro-OH(4.6mg，0.04mmol)和HOBt(6.5mg，0.048mmol)用DMF充分溶解，加入DIC(6.05mg，0.048mmol)，充分搅拌。将上述配置的缩合溶液倒入多肽反应管。通入氮气，吹动溶液3h。反应结束后，DMF和DCM交替清洗4次。
检测：取少量树脂放入0.5mL EP管中，加入3滴检测试剂充分晃动后观察。若树脂呈白色，则氨基酸耦合成功。若树脂仍为蓝色，则重新配制缩合溶液进行耦合。
(5)肽链的延长
按照肽链的序列，重复上述脱保护和偶合的步骤依次连接上相应的氨基酸，依次连接上相应的氨基酸直至肽链合成完毕，得到连有SEQ.ID NO：1的树脂。
(6)树脂上多肽的裂解
将上述得到的连有SEQ.ID NO：1的树脂放入反应瓶中，各加入裂解剂Reagent K(TFA/苯甲硫醚/水/苯酚/EDT,82.5:5:5:5:2.5,V/V)10mL，先在0℃下振摇30min，再在常温下反应3h。反应结束后抽滤，加少量TFA和DCM洗涤三次，合并滤液。将滤液加入大量的冰乙醚中析出白色絮状沉淀，冷冻离心得到目标多肽的粗品。最终得到粗品72.7mg，收率为91.2％。使用HPLC监测反应，色谱条件为：C18柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 35％～85％，20min；流速1mL/min；柱温40℃；检测波长214nm。反应结束后，采用制备液相色谱进行纯化，色谱条件为：C18柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 40％～90％，20min；流速为6mL/min检测波长为214nm。收集的溶液冻干得纯品30.5mg。理论相对分子质量为4202.5。ESI-MS m/z:Found[M+3H]3+1401.1,[M+4H]4+1052.0。
此外，还可以采用生物制备的方法制备序列1所示的长效化Exendin-4类似物。例如生物表达的rExendin-4由北京博康健基因科技有限公司自行制备：以含有rExendin-4目的基因的质粒pET-32a(+)为基础，通过点突变PCR将重组质粒pET32a中目的基因39aa位点Ser突变为Cys；突变后的质粒转化得到重组质粒阳性菌株，测序鉴定；提取阳性菌株的质粒，质粒转化至BL21(DE3)plysS菌种，得到工程菌株。工程菌株经培养和诱导表达后离心收集含目的蛋白的菌体，菌体经破碎、纯化后，获得高纯度的rExendin-4蛋白多肽。rExendin-4的氨基酸序列为HGEGTFTSDLSKQMEE EAVRLFIEWLKNGG PSSGAPPPC。
实施例2
Figure BDA0003597311090000101
(1)马来酰亚胺化的脂肪链的合成
将8-氨基辛烷(1.0equiv)与马来酸酐(1.2equiv)溶于冰醋酸中，超声溶解后，120℃回流反应，薄层板检测反应完毕后，反应液冷却至室温，加入大量水，乙酸乙酯萃取三次(3×20mL)，合并上层萃取液，萃取液使用饱和食盐水洗3次，无水Na2SO4干燥过夜。萃取液真空旋干得到粗品，粗品柱层析(乙酸乙酯/石油醚)分离得得纯品。
(2)马来酰亚胺化的脂肪链与实施例1中多肽的缀合
称取1-辛基-1H-吡咯-2,5-二酮(0.1mmol)溶于2mL甲醇中，多肽溶于2mL水中，并相互混合，5uL DIEA作为催化剂，5uL NMP助溶，室温下搅拌反应1天。
(3)多肽的纯化
将粗品多肽溶于50％的乙腈/水中，使用制备液相色谱纯化，色谱条件为：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 40％～90％，20min；流速为7mL/min检测波长为214nm。收集的溶液冻干得纯品22mg。理论相对分子质量为4370.7。ESI-MS m/z:found[M+3H]3+1457.9，[M+4H]4+1093.7。
实施例3
Figure BDA0003597311090000111
(1)马来酰亚胺化的脂肪链的合成
将12-氨基十二烷(1.0equiv)与马来酸酐(1.2equiv)溶于冰醋酸中，超声溶解后，120℃回流反应，薄层板检测反应完毕后，反应液冷却至室温，加入大量水，乙酸乙酯萃取三次(3×20mL)，合并上层萃取液，萃取液使用饱和食盐水洗3次，无水Na2SO4干燥过夜。萃取液真空旋干得到粗品，粗品柱层析(乙酸乙酯/石油醚)分离得得纯品。
(2)马来酰亚胺化的脂肪链与实施例1中多肽的缀合
称取1-十二烷基-1H-马来酰亚胺-2,5-酮(0.1mmol)溶于2mL甲醇中，多肽溶于2mL水中，并相互混合，5uL DIEA作为催化剂，5uL NMP助溶，室温下搅拌反应1天。
(3)多肽的纯化
将粗品多肽溶于50％的乙腈/水中，使用制备液相色谱纯化，色谱条件为：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 40％～90％，20min；流速为7mL/min检测波长为214nm。收集的溶液冻干得纯品39mg。理论相对分子质量为4410.5。ESI-MS m/z:found[M+3H]3+1472.6，[M+4H]4+1103.8。
实施例4
Figure BDA0003597311090000121
(1)马来酰亚胺化的脂肪链的合成
将16-氨基十六烷(1.0equiv)与马来酸酐(1.2equiv)溶于冰醋酸中，超声溶解后，120℃回流反应，薄层板检测反应完毕后，反应液冷却至室温，加入大量水，乙酸乙酯萃取三次(3×20mL)，合并上层萃取液，萃取液使用饱和食盐水洗3次，无水Na2SO4干燥过夜。萃取液真空旋干得到粗品，粗品柱层析(乙酸乙酯/石油醚)分离得得纯品。
(2)马来酰亚胺化的脂肪链与实施例1中多肽的缀合
称取1-十六烷基-1H-马来酰亚胺-2,5-酮(0.1mmol)溶于2mL甲醇中，多肽溶于2mL水中，并相互混合，5uL DIEA作为催化剂，5uL NMP助溶，室温下搅拌反应1天。
(3)多肽的纯化
将粗品多肽溶于50％的乙腈/水中，使用制备液相色谱纯化，色谱条件为：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 40％～90％，20min；流速为7mL/min检测波长为214nm。收集的溶液冻干得纯品31mg。理论相对分子质量为4466.6。ESI-MS m/z:found[M+3H]3+1490.5，[M+4H]4+1118.9。
实施例5
Figure BDA0003597311090000122
(1)马来酰亚胺化的脂肪酸的合成
将8-氨基辛酸(1.0equiv)与马来酸酐(1.2equiv)溶于冰醋酸中，超声溶解后，120℃回流反应，薄层板检测反应完毕后，反应液冷却至室温，加入大量水，乙酸乙酯萃取三次(3×20mL)，合并上层萃取液，萃取液使用饱和食盐水洗3次，无水Na2SO4干燥过夜。萃取液真空旋干得到粗品，粗品柱层析(乙酸乙酯/石油醚)分离得得纯品。
(2)马来酰亚胺化的脂肪酸与实施例1中多肽的缀合
称取1-辛酸-1H-马来酰亚胺-2,5-酮(0.1mmol)溶于2mL甲醇中，多肽溶于2mL水中，并相互混合，5uL DIEA作为催化剂，5uL NMP助溶，室温下搅拌反应1天。
(3)多肽的纯化
将粗品多肽溶于50％的乙腈/水中，使用制备液相色谱纯化，色谱条件为：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 40％～90％，20min；流速为7mL/min检测波长为214nm。收集的溶液冻干得纯品25mg。理论相对分子质量为4522.7。ESI-MS m/z:found[M+3H]3+1509.6，[M+4H]4+1131.9。
实施例6
Figure BDA0003597311090000131
1)马来酰亚胺化的脂肪酸的合成
将12-氨基十二烷酸(1.0equiv)与马来酸酐(1.2equiv)溶于冰醋酸中，超声溶解后，120℃回流反应，薄层板检测反应完毕后，反应液冷却至室温，加入大量水，乙酸乙酯萃取三次(3×20mL)，合并上层萃取液，萃取液使用饱和食盐水洗3次，无水Na2SO4干燥过夜。萃取液真空旋干得到粗品，粗品柱层析(乙酸乙酯/石油醚)分离得得纯品。
(2)马来酰亚胺化的脂肪酸与实施例1中多肽的缀合
称取1-十二烷酸-1H-马来酰亚胺-2,5-酮(0.1mmol)溶于2mL甲醇中，多肽溶于2mL水中，并相互混合，5uL DIEA作为催化剂，5uL NMP助溶，室温下搅拌反应1天。
(3)多肽的纯化
将粗品多肽溶于50％的乙腈/水中，使用制备液相色谱纯化，色谱条件为：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 40％～90％，20min；流速为7mL/min检测波长为214nm。收集的溶液冻干得纯品22mg。理论相对分子质量为4496.9。ESI-MS m/z:found[M+3H]3+1500.6，[M+4H]4+1093.1。
实施例7
Figure BDA0003597311090000141
(1)马来酰亚胺化的脂肪酸的合成
将16-氨基十六烷酸(1.0equiv)与马来酸酐(1.2equiv)溶于冰醋酸中，超声溶解后，120℃回流反应，薄层板检测反应完毕后，反应液冷却至室温，加入大量水，乙酸乙酯萃取三次(3×20mL)，合并上层萃取液，萃取液使用饱和食盐水洗3次，无水Na2SO4干燥过夜。萃取液真空旋干得到粗品，粗品柱层析(乙酸乙酯/石油醚)分离得得纯品。
(2)马来酰亚胺化的脂肪酸与实施例1中多肽的缀合
称取1-十六烷酸-1H-马来酰亚胺-2,5-酮(0.1mmol)溶于2mL甲醇中，多肽溶于2mL水中，并相互混合，5uL DIEA作为催化剂，5uL NMP助溶，室温下搅拌反应1天。
(3)多肽的纯化
将粗品多肽溶于50％的乙腈/水中，使用制备液相色谱纯化，色谱条件为：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 40％～90％，20min；流速为7mL/min检测波长为214nm。收集的溶液冻干得纯品29mg。理论相对分子质量为4552.8。ESI-MS m/z:found[M+3H]3+1519.5，[M+4H]4+1140.1。
实施例8
Figure BDA0003597311090000142
(1)式I的合成
称取Wang树脂100mg(取代度0.8mmol/g)，经DCM溶胀30min，再用NMP 10mL溶胀30min，分别用NMP，DCM 7mL冲洗干净。将Fmoc-Lys(Dde)(85.22mg,0.16mmol)，HBTU(60.6mg,0.16mmol)，DIEA(55.6uL,0.32mmol)，HOBt(21.6mg,0.16mmol)溶于NMP 10mL中，将此溶液加入树脂中反应2小时，结束后滤去反应液，将DCM：甲醇：DIEA为5：4：1的10mL溶液加入树脂封闭反应1小时，滤去反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次，将Fmoc-AEEA(61.6mg,0.16mmol)，HBTU(60.6mg,0.16mmol)，DIEA(55.6uL,0.32mmol)，HOBt(21.6mg,0.16mmol)溶于NMP 10mL中，将此溶液加入树脂中反应2小时，结束后滤去反应液。
向树脂中加入含0.1M HOBt的25％哌啶/NMP(V/V)溶液脱除Fmoc，反应结束后用NMP洗涤干净。同样方法再次偶联Fmoc-AEEA，反应结束后，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。向树脂中加入含0.1M HOBt的25％哌啶/NMP(V/V)溶液脱除Fmoc，反应结束后用NMP洗涤干净。将Fmoc-Glu-OtBu(68.0mg,0.16mmol)，HBTU(60.6mg,0.16mmol)，DIEA(55.6μL,0.32mmol)，HOBt(21.6mg,0.16mmol)溶于NMP 10mL中，将此溶液加入树脂中反应2小时，结束后滤去反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。向树脂中加入含0.1M HOBt的25％哌啶/NMP(V/V)溶液脱除Fmoc，反应结束后用NMP洗涤干净。将十八烷二酸单叔丁酯(59.2mg,0.16mmol)，HBTU(60.6mg,0.16mmol)，DIEA(55.6uL,0.32mmol)，HOBt(21.6mg,0.16mmol)溶于NMP 10mL中，将此溶液加入树脂中反应2小时，结束后滤去反应液，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。用含2％水合肼的DMF(2％Hydrazine in DMF/DCM)浸泡多肽树脂3分钟，抽干树脂,滤掉脱保护液,重复上步操作2遍，结束后用NMP洗涤干净，此步骤以脱去赖氨酸上的Dde保护。将(27.04mg,0.16mmol)N-正辛基马来酰亚胺，HBTU(60.6mg,0.16mmol)，DIEA(55.6uL,0.32mmol)，HOBt(21.6mg,0.16mmol)溶于NMP 10mL中，将此溶液加入树脂中反应2小时，反应结束后，用DCM和NMP各7mL洗涤树脂3次。
将上述得到的树脂放入反应瓶中，加入裂解剂20％三氟乙醇/DCM 10mL，常温振摇30分钟，反应结束后抽滤，蒸干溶剂得到式I粗品42.4mg。理论相对分子质量为1012.2，ESI-MS m/z:1013.5[M-H+]。
Figure BDA0003597311090000161
(2)式I与实施例1中多肽的缀合
称取式I(0.1mmol)溶于2mL甲醇中，多肽溶于2mL水中，并相互混合，5uL DIEA作为催化剂，5uL NMP助溶，室温下搅拌反应1天。
(3)多肽的纯化
将粗品多肽溶于50％的乙腈/水中，使用制备液相色谱纯化，色谱条件为：C18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：0.1％TFA/乙腈(V/V)；流动相梯度：流动相B 40％～90％，20min；流速为7mL/min检测波长为214nm。收集的溶液冻干得纯品29mg。理论相对分子质量为5216.9。ESI-MS m/z:found[M+3H]3+1740.2，[M+4H]4+1306.2。
以下是本发明中涉及的Exendin-4类似物的体外和体内降糖药理实验方法以及结果实验例1、Exendin-4类似物的受体激动活性实验
HEK293细胞共转染编码GLP-1R的cDNA，细胞系表达并利用Western Blot检测已构建的HEK293细胞中GLP-1R的蛋白水平，确证稳定高表达的GLP-R-HEK293细胞株。受体激动活性实验中，首先，将细胞种于96孔板中，2h后，化合物用DMSO溶解，使用含有0.1％牛血清蛋白的培养基稀释至不同倍数，加入共转染的GLP-1R-HEK293细胞中。孵育20min后，使用Cisbo公司的ELISA试剂盒检测相应的cAMP值，非线性回归后计算化合物的EC50数值。此处的EC50代表了化合物的半最大效应浓度，即完全激动GLP-1R所需化合物浓度的一半。EC50越小说明化合物与GLP-1R的结合能力越强，在同样剂量下产生的降血糖效果就越显著。
表1本发明化合物的EC50
Figure BDA0003597311090000162
Figure BDA0003597311090000171
如表1所示，本发明的化合物对GLP-1R的激动活性均较好，其中SEQ.ID NO:1的EC50优于Exendin-4，说明对Exendin-4改造后，其受体激动活性增强。在此基础上缀和了边链的SEQ.ID NO:2-SEQ.ID NO:8仍旧保持了明显优于上市药物索马鲁肽的受体激动活性，这一结果提示本发明的化合物具备比索马鲁肽更好的降血糖效果。
实验例2、Exendin-4及Exendin-4类似物的隔日降血糖实验
正常昆明小鼠，分为9组，每组6只，小鼠饲养在标准化动物房中。实验开始时，提前24h给予Exendin-4及Exendin-4类似物，对照组注射生理盐水。正常饮食饮水12h，接着禁食12h，在化合物注射24h后，进行小鼠单次腹腔葡萄糖耐量实验。各组按照小鼠体重每kg腹腔注射20％葡萄糖溶液，注射葡萄糖时定为0min，在0，15，30，45，60，120min，尾尖采血测定血糖水平。
表2 Exendin-4及Exendin-4类似物隔日降血糖的效应
Figure BDA0003597311090000172
Figure BDA0003597311090000181
n＝6，
Figure BDA0003597311090000183
以Exendin-4作为对照，*为P<0.05，**为P<0.01，***为P<0.001
如表2所示，Exendin-4和本发明化合物经过注射24h后，未经改造的天然Exendin-4已失去活性，当再给予葡萄糖刺激后，其已经不能较快将血糖控制在较低的水平，其糖耐量表现与生理盐水组相当。而本发明的经过边链缀和的肽链，即SEQ.ID NO:2-SEQ.ID NO:8仍具备较好的控制血糖的效果，尤其是SEQ.ID NO:8，表现出最为强劲的控制血糖的能力，故经本发明改造后的Exendin-4类似物体内降糖作用时间显著的延长。
实验例3、Exendin-4及Exendin-4类似物的长期给药体内控制体重活性
雄性DIO小鼠40-45g，随机分组，8只为一组，共8组。适应性喂养1周。给药前一天为第0天，第0天晚上小鼠禁食不禁水，次日腹腔给药，Liraglutide给药剂量为100nmol/kg，SEQ.ID NO:2-SEQ.ID NO:8给药剂量为15nmol/kg，给药后，正常给食给水。每天给药(重复第1天实验方案)，测量30天各组小鼠的体重，考察各组小鼠的平均体重变化。
由表3可以看出，所有给药组小鼠体重均增加。绝大部分化合物体重增加值缓慢，表现出明显的控制体重增长，尤其以SEQ.ID NO:1、SEQ.ID NO:4、SEQ.ID NO:6、SEQ.ID NO:7、SEQ.ID NO:8控制体重最显著，其控制体重的效果优于阳性对照Liraglutide组。
表3 Exendin-4及Exendin-4类似物长期给药给药前后体重变化情况
Figure BDA0003597311090000182
Figure BDA0003597311090000191
以生理盐水组为对照，*为p<0.05,**为p<0.01以及***为p<0.001以Liraglutiede为对照,#为p<0.05,##为p<0.01and###为p<0.001
实验例4、Exendin-4及Exendin-4类似物与口服吸收促进剂混合用药正常小鼠口服葡萄糖耐量实验
将Exendin-4及Exendin-4类似物与N-[8-(2-羟基苯甲酰基)-氨基]辛酸钠以质量比1:60混合制备复合体。
18-22g的清洁级雄性ICR小鼠适应性喂养一周后，随机分组，分为正常对照组，Exendin-4腹腔给药组，Exendin-4口服给药组，待测化合物给药组(实施例2-8与N-[8-(2-羟基苯甲酰基)-氨基]辛酸钠联合制备得到的口服递送组合物)，每组6只；实验前小鼠禁食不禁水12小时后称重，尾尖采血测定空腹血糖水平，正常对照组灌胃给予生理盐水，腹腔、口服给药组均按照体重给予相应浓度的待测药物，给药30min后测定各组血糖水平，并分别立即腹腔注射3g/kg葡萄糖水溶液，测定给予葡萄糖后15，30，45，60及120min的血糖水平；收集实验结果，采用GraphPad 7.0以时间为横坐标，血糖值为纵坐标绘制折线图，并计算各组血糖曲线下面积AUC0-2h。
如图1所示，灌胃给予葡萄糖后，各组小鼠的血糖水平均明显升高，并于给糖后15min或30min达到血糖水平峰值，Exendin-4腹腔给药组和实施例2-8与N-[8-(2-羟基苯甲酰基)-氨基]辛酸钠联合制备得到的口服递送组合物组的小鼠血糖水平相比于生理盐水组和Exendin-4口服组具有显著性差异。

Claims (9)

1.一种长效化Exendin-4类似物，其序列为：
Figure FDA0004245605620000011
2.一种口服递送组合物，其特征在于：包括权利要求1所述的长效化Exendin-4类似物和口服促吸收剂，其中Exendin-4类似物与口服促吸收剂质量比为1:10-300。
3.根据权利要求2所述的口服递送组合物，其特征在于：所述口服递送组合物为权利要求1所述的长效化Exendin-4类似物与口服促吸收剂组成的组合物，其中所述口服促吸收剂选自辛酸钠、癸酸钠、N-[8-(2-羟基苯甲酰基)-氨基]辛酸钠、N-[8-(2-羟基苯甲酰基)-氨基]癸酸钠、8-[N-(2-羟基-4-甲氧基苯甲酰基)氨基]辛酸钠、8-[N-(2-羟基-5-氯苯甲酰基)氨基]辛酸钠、4-[(4-氯-2-羟基苯甲酰基)氨基]丁酸钠、壳聚糖、海藻酸盐、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、葡聚糖、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、透明质酸酶、乙二胺四乙酸或N-乙酰基-L-半胱氨酸乙二胺四乙酸。
4.一种药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1所述的长效化Exendin-4类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述盐为长效化Exendin-4类似物与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、焦硫酸、磷酸、硝酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一烷酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡糖酸、3-羟基-2-萘甲酸、烟酸、扑酸、果胶酯酸、过硫酸、3-苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、氨基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、肥酸、藻酸、马来酸、富马酸、D-葡糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚酸、甘油磷酸、天冬氨酸、磺基水杨酸、半硫酸或硫氰酸反应所成的盐。
5.权利要求1所述的长效化Exendin-4类似物所制备的药剂，所述的药剂是药剂学上的片剂、胶囊、酏剂、糖浆、锭剂、吸入剂、喷雾剂、注射剂、膜剂、贴剂、散剂、颗粒剂、块剂、乳剂或栓剂。
6.权利要求2或3中任意一种口服递送组合物所制备的药剂，所述的药剂是药剂学上的片剂、胶囊、酏剂、糖浆、锭剂、吸入剂、喷雾剂、注射剂、膜剂、贴剂、散剂、颗粒剂、块剂、乳剂或栓剂。
7.权利要求1所述的长效化Exendin-4类似物或者权利要求2或3中任意一种口服递送组合物在制备治疗糖尿病、肥胖症、高血脂症或非酒精性脂肪肝的药物中的应用。
8.权利要求1所述的长效化Exendin-4类似物所制备的药学上可接受的盐在制备治疗糖尿病、肥胖症、高血脂症或非酒精性脂肪肝的药物中的应用。
9.权利要求1所述的长效化Exendin-4类似物的制备方法，包括生物表达、液相合成或固相合成制备方法。
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