WO2023132609A1 - 지속형 지방산-펩타이드 유도체 및 이의 용도 - Google Patents

지속형 지방산-펩타이드 유도체 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023132609A1
WO2023132609A1 PCT/KR2023/000110 KR2023000110W WO2023132609A1 WO 2023132609 A1 WO2023132609 A1 WO 2023132609A1 KR 2023000110 W KR2023000110 W KR 2023000110W WO 2023132609 A1 WO2023132609 A1 WO 2023132609A1
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WO
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fatty acid
peptide derivative
glp
intestinal
group
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PCT/KR2023/000110
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English (en)
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Inventor
김완섭
권오찬
유태형
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주식회사 휴온스랩
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a long-acting fatty acid-peptide derivative and its use, and specifically, to a long-acting GLP-1/GLP-2 dual agonist and its use for treating intestinal disorders, intestinal damage, or gastric disorders.
  • Glucagon-like peptide-1 has various biological activities such as stimulating insulin secretion, inhibiting glucagon secretion, inhibiting gastric emptying, inhibiting gastric or intestinal motility, enhancing glucose utilization and inducing weight loss. induce effect.
  • GLP-1 is effective in preventing pancreatic ⁇ -cell degeneration caused by the progression of type 2 diabetes, non-insulin dependence diabetes mellitus (NIDDM) and promoting the generation of new ⁇ -cells. It is known that it can act as a recovery of insulin secretion ability by NIDDM.
  • Glucagon-like peptide-2 (GLP-2) is a peptide hormone composed of 33 amino acids produced by L-cells of the small intestine in response to ingested nutrients. GLP-2 induces mucosal growth in the small and large intestine, promotes the growth of enterocytes and crypt cells, and inhibits apoptosis. GLP-2 also increases the absorption of nutrients in the small intestine and reduces intestinal permeability. GLP-2 also inhibits gastric emptying and secretion of gastric acid, increases intestinal blood flow rate, and relaxes intestinal smooth muscle. GLP-2 has shown promising potential as a therapeutic agent in various intestinal diseases and experimental models of intestinal damage due to its characteristics such as energy absorption and protection and activation of intestinal cell functions.
  • Gattex teduglutide
  • SBS short bowel syndrome
  • GLP-2 GLP-2
  • an analogue thereof As a drug, there are problems that must first be solved.
  • peptides such as GLP-2 are easily denatured due to their low stability, are degraded by proteolytic enzymes in the body and lose their activity, and are also relatively small in size and easily eliminated through the kidneys.
  • most of the peptide drugs are administered to patients in the form of injections, and therefore, frequent injections are required to maintain blood levels of physiologically active peptides, which causes great suffering to patients.
  • Various attempts have been made to overcome these problems.
  • GLP-2 has a very short physiological activity half-life of less than 7 minutes. This is due to the loss of potency of GLP-2 by cleavage between amino acids 2 (Ala) and 3 (Asp) of GLP-2 by dipeptidyl peptidase IV or lower, DPPIV.
  • the present inventors have developed a peptide agent that has the activity of GLP-1 as well as GLP-2, which is the target of existing drugs, and exhibits superior efficacy than existing drugs through the synergistic effect between GLP-1 and GLP-2. During development, an attempt was made to increase the physiological activity half-life of the drug.
  • the present inventors have prepared GLP-1/GLP-2-like peptides that bind to GLP-1 and GLP-2 receptors, which are intestinal cells, and show the effect of treating intestinal and gastric diseases, and to the peptides
  • GLP-1 and GLP-2 receptors which are intestinal cells, and show the effect of treating intestinal and gastric diseases
  • the fatty acid-peptide derivative of the present invention which exhibits dual action activity on GLP-1 and GLP-2 receptors, has a therapeutic effect on short bowel syndrome and increases half-life in the body.
  • an object of the present invention is a fatty acid-peptide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof in which a fatty acid is linked to a polypeptide represented by the general formula below, wherein the polypeptide represented by the general formula is N-terminal, C-terminal, or It is to provide a fatty acid-peptide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof, characterized in that a fatty acid is linked to the middle chain.
  • Amino acid sequence-Kn represented by SEQ ID NO: 1
  • K is lysine, and n is an integer from 1 to 10.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating one or more diseases selected from the group consisting of intestinal disorders, intestinal damage and gastric diseases, comprising the fatty acid-peptide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. is to do
  • the present invention is a fatty acid-peptide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof in which a fatty acid is bound to a polypeptide represented by the following general formula, wherein the polypeptide represented by the general formula is N
  • a fatty acid-peptide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof characterized in that a fatty acid is bonded to the terminal, C-terminus, or intermediate chain thereof.
  • Amino acid sequence-Kn represented by SEQ ID NO: 1
  • K is lysine, and n is an integer from 1 to 10.
  • the fatty acid may be a C12 to C22 saturated fatty acid or unsaturated fatty acid, but is not limited thereto.
  • n may be an integer of 2 to 9, but is not limited thereto.
  • the fatty acid may be linked to the C-terminus, but is not limited thereto.
  • polypeptide represented by the general formula may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5, but is not limited thereto.
  • the fatty acid-peptide derivative may have an in vivo half-life (t 1/2 ) of 2 hours or more, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating one or more diseases selected from the group consisting of intestinal disorders, intestinal damage, and gastric diseases, comprising the fatty acid-peptide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. do.
  • the intestinal disease may be one or more selected from the group consisting of short bowel syndrome, irritable bowel disease, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, colitis, colitis, pancreatitis, ileitis, mucositis, and intestinal atrophy. It is not limited.
  • the intestinal disease may be short bowel syndrome, but is not limited thereto.
  • the gastric disease may be at least one selected from the group consisting of gastric spasm, gastritis, gastric ulcer, duodenitis, and duodenal ulcer, but is not limited thereto.
  • the fatty acid-peptide derivative may be administered at 0.1 to 200 mg/kg per week, but is not limited thereto.
  • the fatty acid-peptide derivative may increase the weight or length of the small intestine, but is not limited thereto.
  • the fatty acid-peptide derivative may increase villus height, but is not limited thereto.
  • the fatty acid-peptide derivative may increase the protein or DNA content of the small intestine, but is not limited thereto.
  • the present invention comprises the step of administering a composition containing the fatty acid-peptide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient to a subject in need thereof, consisting of intestinal disease, intestinal damage, and gastric disease Provides a method for preventing, treating, or improving one or more diseases selected from the group.
  • the present invention provides a use of the fatty acid-peptide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof for preventing, treating, or improving one or more diseases selected from the group consisting of intestinal disorders, intestinal damage, and gastric diseases.
  • the present invention provides a use of the fatty acid-peptide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof for preparing a drug for treating one or more diseases selected from the group consisting of intestinal disorders, intestinal damage, and gastric diseases.
  • the fatty acid-peptide derivative of the present invention is an agonist for both GLP-1 and GLP-2 receptors, effectively stimulating GLP-1 and GLP-2 receptors known as targets of short bowel syndrome, and has excellent sustained efficacy in vivo compared to existing drugs With, it shows a significantly superior therapeutic effect compared to negative and positive controls in short bowel syndrome animal models, and is expected to be useful for the prevention, improvement, and treatment of intestinal diseases, intestinal damage, and gastric diseases.
  • Figure 1 shows the Scheme of the cell proliferation efficacy evaluation method in the intestine using the CCD-18co cell line and the Caco-2 cell line.
  • Figure 2 shows a daily administration test method scheme for confirming the effect on intestinal proliferation of normal mice.
  • Figure 3 shows the administration test (secondary test) method Scheme for each period to confirm the effect on the intestinal proliferation of normal mice.
  • Figure 4 shows a test (third test) method scheme for final candidate selection to confirm the effect on intestinal proliferation of normal mice.
  • Figure 5 shows a test method scheme for confirming the effect on the intestinal growth of the short bowel syndrome rat model.
  • Figure 7 shows the results of cell proliferation evaluation of colon-derived serosal cell line CCD-18co cells and colon cancer-derived Caco-2 cells.
  • Figure 9 shows the daily weight change according to the daily administration test. Data are presented as mean ⁇ SD.
  • Figure 10 shows the body weight on the 8th day according to the daily administration test. Data are presented as mean ⁇ SD. *p ⁇ 0.05 vs. G1, **p ⁇ 0.01 vs. G1, #p ⁇ 0.05 vs. G2, ##p ⁇ 0.01 vs. G2, &&p ⁇ 0.01 vs. G3.
  • Figure 11 shows the weight of the small intestine according to the daily administration test. Data are presented as mean ⁇ SD. *p ⁇ 0.05 vs. G1, **p ⁇ 0.01 vs. G1.
  • Figure 12 shows the weight ratio of the small intestine to body weight according to the daily administration test. Data are presented as mean ⁇ SD. **p ⁇ 0.01 vs. G1.
  • Figure 13 shows the daily weight change according to the periodic administration test (second test). Data are presented as mean ⁇ SD.
  • Figure 14 shows the body weight on the 8th day according to the periodic administration test (second test). Data are presented as mean ⁇ SD. *p ⁇ 0.05 vs. G1, **p ⁇ 0.01 vs. G1, #p ⁇ 0.05 vs. G2, ##p ⁇ 0.01 vs. G2, &p ⁇ 0.05 vs. G3, &&p ⁇ 0.01 vs. G3, € €p ⁇ 0.01 vs. G4.
  • Figure 15 shows the weight of the small intestine according to the periodic administration test (second test). Data are presented as mean ⁇ SD. **p ⁇ 0.01 vs. G1, #p ⁇ 0.05 vs. G2.
  • Figure 16 shows the weight-to-body ratio of the small intestine according to the periodic administration test (second test). Data are presented as mean ⁇ SD. **p ⁇ 0.01 vs. G1, ##p ⁇ 0.01 vs. G2, € €p ⁇ 0.01 vs. G4.
  • Figure 17 shows the daily weight change according to the final candidate selection test (third test). Data are presented as mean ⁇ SD.
  • Figure 18 shows the body weight on the 8th day according to the test for final candidate selection (third test). Data are presented as mean ⁇ SD. **p ⁇ 0.01 vs. G1, ##p ⁇ 0.01 vs. G2.
  • 25 shows changes in intestinal length for each administration group according to the short bowel syndrome model test. Data are presented as mean ⁇ SD. **p ⁇ 0.01 vs. G1, #p ⁇ 0.05 vs. G2.
  • 26 shows the protein content of each administration group according to the short bowel syndrome model test. Data are presented as mean ⁇ SD. *p ⁇ 0.05 vs. G1, **p ⁇ 0.01 vs. G1, #p ⁇ 0.05 vs. G2, ##p ⁇ 0.01 vs. G2, &p ⁇ 0.05 vs. G3, €p ⁇ 0.05 vs. G4, € €p ⁇ 0.01 vs. G4.
  • 29 shows villus height, crypt depth, and mucosal thickness in the duodenum for each administration group according to the short bowel syndrome model test. Data are presented as mean ⁇ SD. *p ⁇ 0.05 vs. G1, **p ⁇ 0.01 vs. G1, #p ⁇ 0.05 vs. G2, ##p ⁇ 0.01 vs. G2, &p ⁇ 0.05 vs. G3, &&p ⁇ 0.01 vs. G3, €p ⁇ 0.05 vs. G4, € €p ⁇ 0.01 vs. G4.
  • FIG. 30 shows villus height, crypt depth, and mucosal thickness in the jejunum for each administration group according to the short bowel syndrome model test. Data are presented as mean ⁇ SD. **p ⁇ 0.01 vs. G1, #p ⁇ 0.05 vs. G2, ##p ⁇ 0.01 vs. G2, &p ⁇ 0.05 vs. G3, € €p ⁇ 0.01 vs. G4.
  • the present invention relates to a fatty acid-peptide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof in which a fatty acid is bonded to a polypeptide represented by the following general formula, wherein the polypeptide represented by the general formula is at the N-terminus, C-terminus, or intermediate chain thereof. It relates to a fatty acid-peptide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof, characterized in that a fatty acid is bound, and a composition for preventing, improving or treating intestinal diseases, intestinal damage, or gastric diseases comprising the same as an active ingredient.
  • Amino acid sequence-Kn represented by SEQ ID NO: 1
  • K is lysine, and n is an integer from 1 to 10.
  • peptide means a linear molecule formed by binding amino acid residues to each other by a peptide bond.
  • a "peptide” can be easily prepared by chemical synthesis known in the art (Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983). Representative methods include, but are not limited to, liquid or solid phase synthesis, fragment condensation, F-MOC or T-BOC chemistry (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press). , Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).
  • the peptides of the present invention can be prepared by genetic engineering methods.
  • DNA sequence encoding the peptide is constructed according to a conventional method.
  • DNA sequences can be constructed by PCR amplification using appropriate primers.
  • DNA sequences may be synthesized by standard methods known in the art, such as using an automated DNA synthesizer (available from Biosearch or Applied Biosystems).
  • the constructed DNA sequence is a vector comprising one or more expression control sequences (eg, promoters, enhancers, etc.) operably linked to the DNA sequence to control the expression of the DNA sequence. and the host cell is transformed with the recombinant expression vector formed therefrom. The resulting transformants are cultured under appropriate media and conditions to allow expression of the DNA sequence, and the substantially pure peptide encoded by the DNA sequence is recovered from the culture.
  • the recovery may be performed using a method known in the art (eg, chromatography).
  • a method known in the art eg, chromatography
  • 'substantially pure peptide' means that the peptide according to the present invention does not substantially contain any other host-derived proteins.
  • a method known in the art eg, chromatography
  • 'substantially pure peptide' means that the peptide according to the present invention does not substantially contain any other host-derived proteins.
  • glucose like peptide-1 (GLP-1) is a kind of incretin, a hormone secreted from the digestive tract, and is secreted from L cells in the intestinal tract in an ingestion-dependent manner to increase pancreatic insulin secretion. It is a protein known to play a role in suppressing postprandial blood sugar rise by suppressing the secretion of Glucagon and Glucagon. As such, GLP-1 has been widely known for its use in the treatment of diabetes, and its weight loss effect has also been reported by being involved in the physiological control of appetite. In addition, research reports that GLP-1 induces the division of enterocytes and crypt cells to induce an increase in the number of enterocytes are already known.
  • glucagon like peptide-2 (GLP-2) refers to 33 short peptides produced in the form of proglucagon precursors in enteroendocrine L cells of the intestine and specific regions of the brain and produced through enzymatic cleavage by intestinal enzymes.
  • GLP-1 glucagon-like peptide-1
  • GLP-2 is widely known to be effective not only in inflammatory bowel disease but also in short bowel syndrome (SBS).
  • SBS short bowel syndrome
  • Gattex teduglutide
  • Gattex teduglutide
  • polypeptide represented by the following general formula of the present invention is SEQ ID NO: 1 (His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Tyr-Leu-Asp-Ala-Leu- Ala-Thr-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp) may contain 1 to 10 lysines, but is not limited thereto. .
  • Amino acid sequence-Kn represented by SEQ ID NO: 1
  • K is lysine, and n is an integer from 1 to 10.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention may be obtained by changing N (Asn), which is the 16th amino acid of native GLP-2, to A (Ala), but is not limited thereto. This may be for reducing the overall peptide size, but is not limited thereto.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention may be obtained by changing A (Ala), the second amino acid of native GLP-2, to G (Gly) of Exendin-4 and gattex, but is not limited thereto. This may be for increasing the activity of GLP-1 and GLP-2, but is not limited thereto.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention is one in which the amino acid at position 13 is substituted with Tyr (Y) and/or the amino acid at position 19 is replaced with Thr (T) based on the native GLP-2 amino acid. It may be, but is not limited thereto. The substitution may be for increasing the biological activity of GLP-1 and GLP-2, but is not limited thereto.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 may be a variant having 80%, 90%, 95%, 97%, 98% or 99% homology thereto, and some of the sequences in the sequence of SEQ ID NO: 1 Deletions, substitutions or additions may also be included within the scope of the present invention.
  • the fatty acid-peptide derivative may have dual agonist activity for GLP-1 receptor and GLP-2 receptor, but is not limited thereto.
  • the fatty acid-peptide derivative may have greater agonist activity on the GLP-2 receptor than agonist activity on the GLP-1 receptor, but is not limited thereto.
  • the fatty acid-peptide derivative has a relative agonist activity for the GLP-1 receptor of 5% to 30%, 8% to 30%, 10% to 30%, 10% to 25%, 10% to 23%, 13% to 25%, 13% to 23%, 14% to 23%, 14% to 21%, 15% to 25%, 17% to 23%, or 18% to 22%. It is not.
  • the fatty acid-peptide derivative has a relative agonist activity for the GLP-2 receptor of 30% to 300%, 30% to 250%, 30% to 200%, 30% to 180%, 30% to 150%, 30% to 120%, 40% to 300%, 40% to 250%, 40% to 200%, 40% to 180%, 40% to 150%, 40% to 120%, 50% to 300%, 50% to 250%, 50% to 200%, 50% to 180%, 50% to 150%, 50% to 130%, 70% to 300%, 70% to 250%, 70% to 200%, 70% to 180 %, it may be 70% to 150%, 70% to 130%, or 80% to 100%, but is not limited thereto.
  • the fatty acid-peptide derivative of the present invention may include one or more amino acid changes within the range of showing effects of preventing, treating, or improving intestinal disorders, intestinal damage, or gastric disorders.
  • modification of the amino terminal or carboxy terminal may be induced to select a part of the amino acid sequence and increase its activity.
  • the peptides of the present invention can have an increased half-life upon in vivo administration.
  • the fatty acid may be a C12 to C22 saturated fatty acid or unsaturated fatty acid.
  • the fatty acid may be bonded to a polypeptide represented by the general formula in the form of a fatty acid group, but is not limited thereto.
  • the saturated fatty acid group mentioned in the present invention includes a lauryl group (C12:0, lauryl), a tridecyl group (C13:0, tridecyl), a myristyl group (C14:0, myristil), and a pentadecyl group (C15:0, pentadecyl).
  • palmitoyl group (C16:0, palmitoyl), margaryl group (C17:0, margaryl), stearyl group (C18:0, stearyl), nonadecyl group (C19:0, nonadecyl), arachidyl group (C20 :0, arachidyl), heneicosyl group (C21:0, heneicosyl), or behenyl group (C22:0, behenyl).
  • the C12 to C22 unsaturated fatty acid groups referred to in the present invention are palmitoleyl (C16: 1, palmitoleyl), oleyl (C18: 1, oleyl), myristoleyl (C14: 1 myristoleyl), linoleyl (C18) :2 linoleyl) or arachidonyl group (C20:3, arachidonyl).
  • n may be an integer of 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 2 to 9, 2 to 8, 2 to 7, 3 to 7, 4 to 7, 5 to 7, or 6 to 8 However, it is not limited thereto.
  • the fatty acid may be bonded to the C-terminus of the polypeptide represented by the general formula, but is not limited thereto.
  • polypeptide represented by the general formula may consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5, but is not limited thereto.
  • the fatty acid-peptide derivative has an in vivo half-life (t 1/2 ) of 2 hours or more, 3 hours or more, 4 hours or more, 5 hours or more, 6 hours or more, 7 hours or more, 8 hours or more, 9 hours or more. or more, 10 hours or more, 11 hours or more, 12 hours or more, 13 hours or more, 14 hours or more, 15 hours or more, 16 hours or more, 17 hours or more, 18 hours or more, or 19 hours or more, but is not limited thereto. .
  • the fatty acid-peptide derivative of the present invention showed a half-life in blood of about 19 hours, compared to the blood half-life of 1.8 hours of the positive control teduglutide.
  • the fatty acid-peptide derivative has a mean retention time (MRT) in blood of 3 to 100 hours, 3 to 90 hours, 3 to 80 hours, 3 to 70 hours, 3 to 60 hours, 3 to 50 hours, and 3 to 50 hours.
  • MRT mean retention time
  • 40 hours 5 to 100 hours, 5 to 90 hours, 5 to 80 hours, 5 to 70 hours, 5 to 60 hours, 5 to 50 hours, 5 to 40 hours, 10 to 100 hours, 10 to 90 hours, 10 to 80 hours, 10 to 70 hours, 10 to 60 hours, 10 to 50 hours, 10 to 40 hours, 20 to 100 hours, 20 to 90 hours, 20 to 80 hours, 20 to 70 hours, 20 to 60 hours, 20 to 60 hours It may be 50 hours, 20 to 40 hours, 25 to 35 hours, or about 30 hours, but is not limited thereto.
  • the fatty acid-peptide derivative of the present invention showed an average retention time in blood of about 31.8 hours, compared to the average retention time in blood of 2.1 hours of the positive control teduglutide.
  • the fatty acid-peptide derivative may be administered at 0.1 to 200 mg/kg per week, but is not limited thereto.
  • the fatty acid-peptide derivative may increase the weight or length of the small intestine, but is not limited thereto.
  • the fatty acid-peptide derivative may increase villus height, but is not limited thereto.
  • a protecting group such as acetyl group, fluorenyl methoxy carbonyl group, formyl group, myristyl group, stearyl group or polyethylene glycol (PEG) may be bound to the N-terminus or C-terminus of the fatty acid-peptide derivative of the present invention.
  • the carboxy terminal of may be modified with a hydroxyl group (-OH), an amino group (-NH 2 ), an azide (-NHNH 2 ), and the like.
  • oligosaccharides chains, all nanoparticles (gold particles, liposomes, heparin, hydrogel, etc.), amino acids, carrier proteins, etc. can be combined. Modification of the amino acids described above serves to improve the potency and stability of the peptides of the present invention.
  • bowel disease may be short bowel syndrome, irritable bowel disease, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, colitis, colitis, pancreatitis, ileitis, mucositis or intestinal atrophy, but is not limited thereto.
  • gastric disease may be gastric spasm, gastritis, gastric ulcer, duodenitis, or duodenal ulcer, but is not limited thereto.
  • short bowel syndrome refers to various metabolic abnormalities caused by a decrease in digestion and absorption of nutrients due to a short small intestine, and is classified into congenital and acquired according to the type of onset. Congenital means that the fetus is born with a short small intestine, and acquired means that the length of the small intestine remaining after cutting out due to other diseases or trauma is too short, causing disability.
  • Acquired short bowel syndrome refers to a situation in which the intestine is extensively resected for various reasons, resulting in a decrease in intestinal absorption capacity, resulting in diarrhea, dehydration, and malnutrition. Although many cases are cured with medical treatment, including TPN, in some cases, an intestinal lengthening procedure or an intestinal transplantation may be required. It is a disease that requires complex treatment.
  • the present invention may also include a pharmaceutically acceptable salt of the fatty acid-peptide derivative as an active ingredient.
  • pharmaceutically acceptable salt includes salts derived from pharmaceutically acceptable inorganic acids, organic acids, or bases.
  • acids examples include hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene-p-sulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, citric acid, methanesulfonic acid, formic acid , benzoic acid, malonic acid, gluconic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, benzenesulfonic acid and the like.
  • Acid addition salts can be prepared by conventional methods, for example, by dissolving a compound in an aqueous solution of excess acid and precipitating the salt using a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. It can also be prepared by heating equimolar amounts of the compound and an acid or alcohol in water and then evaporating the mixture to dryness, or suction filtering the precipitated salt.
  • a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile.
  • Salts derived from suitable bases may include, but are not limited to, alkali metals such as sodium and potassium, alkaline earth metals such as magnesium, and ammonium.
  • the alkali metal or alkaline earth metal salt can be obtained, for example, by dissolving the compound in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the undissolved compound salt, and then evaporating and drying the filtrate.
  • the metal salt it is particularly suitable for pharmaceutical purposes to prepare a sodium, potassium or calcium salt, and the corresponding silver salt can be obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (eg, silver nitrate).
  • a suitable silver salt eg, silver nitrate
  • the content of the fatty acid-peptide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof in the composition of the present invention can be appropriately adjusted according to the symptoms of the disease, the progress of the symptoms, the condition of the patient, etc., for example, 0.0001 to 99.9 based on the weight of the total composition. % by weight, or 0.001 to 50% by weight, but is not limited thereto.
  • the content ratio is a value based on the dry amount after removing the solvent.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • the excipient may be, for example, one or more selected from the group consisting of a diluent, a binder, a disintegrant, a lubricant, an adsorbent, a moisturizer, a film-coating material, and a controlled release additive.
  • compositions according to the present invention are powders, granules, sustained-release granules, enteric granules, solutions, eye drops, elsilic agents, emulsions, suspensions, spirits, troches, perfumes, and limonadese, respectively, according to conventional methods.
  • tablets, sustained-release tablets, enteric tablets, sublingual tablets, hard capsules, soft capsules, sustained-release capsules, enteric capsules, pills, tinctures, soft extracts, dry extracts, fluid extracts, injections, capsules, perfusate It can be formulated and used in the form of external preparations such as warning agents, lotions, pasta agents, sprays, inhalants, patches, sterile injection solutions, or aerosols, and the external agents are creams, gels, patches, sprays, ointments, and warning agents.
  • lotion, liniment, pasta, or cataplasma may have formulations such as the like.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharide, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Additives for the liquid formulation according to the present invention include water, dilute hydrochloric acid, dilute sulfuric acid, sodium citrate, sucrose monostearate, polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters (tween esters), polyoxyethylene monoalkyl ethers, lanolin ethers, Lanolin esters, acetic acid, hydrochloric acid, aqueous ammonia, ammonium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, prolamine, polyvinylpyrrolidone, ethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, and the like may be used.
  • a solution of white sugar, other sugars, or a sweetener may be used, and aromatics, coloring agents, preservatives, stabilizers, suspending agents, emulsifiers, thickeners, etc. may be used as necessary.
  • Purified water may be used in the emulsion according to the present invention, and emulsifiers, preservatives, stabilizers, fragrances, etc. may be used as needed.
  • tragacantha methylcellulose, carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose sodium, microcrystalline cellulose, sodium alginate, hydroxypropylmethylcellulose, HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910, etc. and, if necessary, surfactants, preservatives, stabilizers, colorants, and fragrances may be used.
  • Injections according to the present invention include distilled water for injection, 0.9% sodium chloride injection, IV injection, dextrose injection, dextrose + sodium chloride injection, polyethylene glycol (PEG), lactated IV injection, ethanol, propylene glycol, non-volatile oil-sesame oil , solvents such as cottonseed oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, ethyl oleate, isopropyl myristate, and benzene benzoate; solubilizing agents such as sodium benzoate, sodium salicylate, sodium acetate, urea, urethane, monoethylacetamide, butazolidine, propylene glycol, twins, nijuntinamide, hexamine, and dimethylacetamide; buffers such as weak acids and their salts (acetic acid and sodium acetate), weak bases and their salts (ammonia and ammonium acetate), organic compounds, proteins, albumin, peptone, and gums; tonicity
  • the suppository according to the present invention includes cacao butter, lanolin, witapsol, polyethylene glycol, glycerogelatin, methylcellulose, carboxymethylcellulose, a mixture of stearic acid and oleic acid, subanal, cottonseed oil, peanut oil, palm oil, cacao butter + Cholesterol, Lecithin, Lannet Wax, Glycerol Monostearate, Tween or Span, Imhausen, Monolen (Propylene Glycol Monostearate), Glycerin, Adeps Solidus, Buytyrum Tego-G -G), Cebes Pharma 16, Hexalide Base 95, Cotomar, Hydroxycote SP, S-70-XXA, S-70-XX75 (S-70-XX95), Hyde Hydrokote 25, Hydrokote 711, Idropostal, Massa estrarium (A, AS, B, C, D, E, I, T), Massa-MF, Masupol, Masupol-15, Neos
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations contain at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, etc. ) or by mixing lactose and gelatin.
  • excipients for example, starch, calcium carbonate, sucrose, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions for oral administration, emulsions, syrups, etc.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, aromatics, and preservatives may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations, and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type of patient's disease, severity, activity of the drug, It may be determined according to factors including sensitivity to the drug, administration time, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field. Since the pharmaceutical composition of the present invention has excellent in vivo persistence, the number and frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention can be significantly reduced.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by a person skilled in the art to which the present invention belongs.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration can be envisaged, eg oral administration, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, intravenous injection, intramuscular injection, paraspinal space (intrathecal) injection, sublingual administration, buccal administration, intrarectal insertion, vaginal It can be administered by intraoral insertion, ocular administration, otic administration, nasal administration, inhalation, spraying through the mouth or nose, dermal administration, transdermal administration, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of drug as an active ingredient together with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex, weight and severity of the disease of the patient.
  • the present invention is the fatty acid-peptide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof; Or it provides a method for preventing, treating, or improving one or more diseases selected from the group consisting of intestinal disease, intestinal damage, and gastric disease, comprising administering a composition containing the same as an active ingredient to a subject in need thereof.
  • the present invention is the fatty acid-peptide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof; Or it provides a composition containing the same as an active ingredient for preventing, treating, or improving one or more diseases selected from the group consisting of intestinal disease, intestinal damage, and gastric disease.
  • the present invention is the fatty acid-peptide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof; Or it provides a use for preparing a pharmaceutical for the treatment of one or more diseases selected from the group consisting of intestinal disease, intestinal damage, and gastric disease of a composition comprising the same as an active ingredient.
  • “individual” means a subject in need of treatment of a disease, and more specifically, a human or non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse, cow, etc. It may be a mammal of, but is not limited thereto.
  • administration means providing a given composition of the present invention to a subject by any suitable method.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays the onset of a desired disease
  • treatment means that a desired disease and its associated metabolic abnormalities are improved or treated by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • Any action that is beneficially altered, and “improvement” means any action that reduces a parameter related to a desired disease, for example, the severity of a symptom, by administration of the composition according to the present invention.
  • a peptidyl resin for 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) SPPS (stationary phase peptide synthesis) was prepared.
  • Rink Amide MBHA resin was resin swelled in a DMF solvent for 60 minutes.
  • Fmoc-amino acid was sequentially coupled to the resin by solid phase synthesis together with a coupling reagent.
  • the resin was then washed three times with DMF.
  • Fmoc-Gln(Trt)-Thr(Psi,Me,Me,Pro)-OH was used at amino acids 5 and 6.
  • Deprotection of Fmoc was performed on the resin using 20% Piperidine/DMF, and then washed 5 times using DMF.
  • the crude peptide was purified to 70% by reverse phase HPLC (Reverse Phase Preparative HPLC) using a luna C18 5 ⁇ m column and a fraction collector with Hanbon equipment, and A buffer (4 Purification was performed using g/L ammonium acetate, aq.) and buffer B (4 g/L ammonium acetate, 70% ACN, aq.). Afterwards, the obtained samples were analyzed using HPLC and MS and lyophilized. The obtained material (13.7 mg) was prepared in Buffer A (0.1% TFA, aq.) and Buffer B (0.1% TFA, 80% ACN, aq.) under gradient conditions using HPLC and MS to obtain a purity of 95%. The second purification was performed using , and finally, 10.8 mg of HU003 peptide sample was obtained.
  • HU003 (SEQ ID NO: 1): His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Tyr-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe -Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp
  • Palmitic acid was conjugated to lysine through a peptide bond, and Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH was purchased from Polypeptide in the form of synthesized chemicals and synthesized (Cas no. 1491158-62-3, PPL item no: 500495).
  • the binding of lysine-palmitic acid to the HU003 peptide was performed in the same manner as in Experimental Example 1-1.
  • a fatty acid when attached to each of the following peptide sequences, it is indicated as HU003K2FA, HU003K3FA, HU003K5FA, HU003K7FA, and HU003K9FA.
  • HU003K2 (SEQ ID NO: 2): His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Tyr-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe -Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys
  • HU003K3 (SEQ ID NO: 3): His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Tyr-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe -Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys
  • HU003K5 (SEQ ID NO: 4): His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Tyr-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe -Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys
  • HU003K7 (SEQ ID NO: 5): His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Tyr-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe -Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys
  • HU003K9 (SEQ ID NO: 6): His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Tyr-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe -Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys
  • the cell lines used were GLP-1R/CHO and GLP-2/CHO cells, and information on the cells is shown in Table 2 below.
  • the synthetic peptides were treated with GLP-1R/CHO and GLP-2R/CHO cells, respectively, to confirm intracellular cAMP concentration.
  • cAMP concentration was measured using a cAMP assay kit (Discover X, 90-0075-LM10).
  • EC50 values were compared using exendin-4 (DiscoverX, 92-1115) for GLP-1 and GLP-2 (DiscoverX, 92-1079) for GLP-2 as standards. Information on standard products is shown in Table 3 below.
  • GLP-1 activity measurement GLP-2 activity measurement substance name Exendin-4 GLP-2 (synthetic) manufacturing company Discover X Discover X water >95% >95%
  • CCD-18co cells are colon-derived serosal cells (fibroblasts) that have GLP-2 receptors and express cell growth factors such as IGF-1, VEGF, and FGF when combined with GLP-2 agonists. Increased cell growth factor induces proliferation of colon cancer-derived cell line Caco-2 cells.
  • the evaluation scheme using CCD-18co and Caco-2 cells is shown in FIG. 1 .
  • CCD-18co cells cultured in a 75T flask were subcultured in a 6-well plate at a concentration of 2x10 5 cells/well.
  • serum starvation conditions were created by reducing the concentration of FBS to 0.1% FBS in 10% FBS/DMEM medium, and further cultured at 4 °C for 24 hours.
  • CCD-18co cells were treated with 100 nM, 250 nM, or 1000 nM of GLP-1 and GLP-2 agonists (Liraglutide, Teduglutide), or synthetic peptides (HU003K5FA, HU003K7FA) diluted in 0.1% FBS/DMEM medium.
  • Treated cells were incubated at 37 °C for 24 hours. After obtaining the supernatant of the synthetic peptide-treated CCD-18co cell medium (conditioned medium, CM), centrifugation was performed at 700 xg for 3 minutes, and suspended matter was removed with a 0.22 ⁇ m filter.
  • conditioned medium conditioned medium
  • Caco-2 cells cultured in a 5T flask were subcultured in a 96-well plate at a concentration of 0.5x10 4 cells/well.
  • Caco-2 cells were replaced with 100 ⁇ l of fresh 10% FBS/MEM medium, and CCD-18co CM was treated with FBS/MEM medium in a ratio of 1:1. After treatment with CCD-18co CM, incubation was performed at 37 °C for 3 days.
  • Caco-2 cells were replaced with 100 ⁇ l of fresh 10% FBS/MEM medium, and then 10 ⁇ l of EZ-cytox assay solution was added so that the medium became 10%. After the EZ-cytox assay solution was added, cell proliferation was confirmed by measuring absorbance at a wavelength of 450 nM using a spectrophotometer every hour for a total of 4 hours.
  • SD rats (Male, 7 weeks old at the time of administration, Coretech Co., Ltd.) were used as test animals, and the designed test groups are shown in Table 4 below.
  • the pharmacokinetic test of the drug in the blood used a model-independent method (Non-compartmental analysis), and the pharmacokinetic parameters, the maximum concentration in blood (C max ), the time to reach the maximum concentration in blood (T max ), and the drug concentration-time curve in blood Analysis of lower area (AUClast) and elimination half-life (T 1/2 ) was performed using Phoenix Winnonlin.
  • test animals (Male, 7 weeks old at the time of administration, Orient Bio Co., Ltd.) were used as test animals.
  • Test substances and positive control substances were each converted to individual doses based on body weight, and were administered subcutaneously (s.c.) at a dose of 5 ml per kg body weight.
  • the designed test groups are shown in Table 5 below.
  • the body weight of each individual was measured once a day. Measurements were made using the same scale in order to minimize errors in each measurement.
  • the animals were anesthetized, laparotomy, and blood were exsanguinated, and intestinal tissues (from the stomach to the large intestine) were extracted for each individual.
  • the extracted intestinal tissue was photographed, and the intestinal tissue after the photograph was incised only in the small intestine (from the duodenum to the cecum), and the contents were removed with a cotton swab and then weighed.
  • SD rats (Male, 7 weeks old at the time of administration, Orient Bio Co., Ltd.) were used as test animals. Rats were fasted for 16 hours before surgery, anesthetized by intraperitoneal injection of ketamine and xylene (3:2), and an incision was made along the central abdomen. The small intestine, cecum, and large intestine were removed with tweezers and sterile swabs. After resection from the jejunum part at a distance of 40 cm from the Ligament of Treitz to the proximal colon at a distance of 1 cm from the cecum (including 60% small intestine and cecum), End-to-end anastomosis was performed.
  • the small intestine was placed in place, and 5 ml of sterile saline was put into the abdominal cavity for body fluid resuscitation and sutured with 2-0 silk suture. In addition, 200 mg/kg ampicillin was subcutaneously injected to prevent infection after surgery.
  • Test substances and positive controls were each converted to individual doses based on body weight, and administered subcutaneously (s.c.) at a dose of 1 ml per kg body weight.
  • the designed test groups are shown in Table 8 below.
  • Villus height, crypt depth, and mucosal thickness were measured through histopathology and H&E staining (Hematoxylin & Eosin staining).
  • H&E staining was performed on the tissue sections to observe the histopathological findings of each tissue, and the height, depth, and mucosal thickness of the villi of the jejunum and duodenum, and the depth of the colon were measured.
  • villi height ( ⁇ m) mucosal thickness - villi depth
  • Intestinal mucosal DNA was extracted from frozen tissue using QIAZEN's Dneasy Blood & Tissue Kit and measured. Intestinal mucosal proteins were extracted and measured using Thermo Scientific's Pierce BCA protein assay kit. Each method was performed according to the manufacturer's kit instructions.
  • Example 1 Activity analysis of long-acting GLP-1/GLP-2 peptides according to palmitic acid binding sites
  • the long-acting peptide synthesized by the method of Experimental Example 1-2 was reacted with GLP-1R/CHO cells and GLP-2R/CHO cells respectively to confirm whether cAMP increase was induced.
  • Cells in which an increase in cAMP was induced were disrupted, and the increased amount of intracellular cAMP was quantified by an ELISA method.
  • the test for each test group and the control group was performed together to confirm the contrast activity. In order to ensure the accuracy of the activity results, repeated tests were performed three or more times for each peptide. Meanwhile, since the number of lysines capable of binding to palmitic acid was up to 9, the activity of the long-acting GLP-1/GLP-2 peptide bound to palmitic acid was measured by adding and synthesizing up to 9 lysines.
  • HU003K7FA showed the highest activity with about 20.4% of GLP-1 activity and 90.3% of GLP-2 activity in GLP-1, and HU003K5FA showed the next highest activity. Accordingly, the comparison results of HU003K7FA and HU003K5FA with the positive control group are shown in FIG. 6 .
  • GLP-1/GLP-2 peptide candidates (HU003K5FA, HU003K7FA) and GLP-2 agent Teduglutide, GLP-1 agent Liraglutide, and Teduglutide + Liraglutide as positive controls were tested in CCD-18co cells and Caco- 2 cells were used to confirm the effect of inducing intestinal epithelial cell proliferation.
  • Caco-2 cells the cell growth of the drug-treated group was calculated as an increase in the number of cells compared to the control group, with the cell growth of the untreated CM-treated control group as 100%.
  • the long-acting peptides HU003K5FA and HU003K7FA of the present invention showed a similar effect to that of the positive control at 100 nm and a significantly increased effect than the positive control at a concentration of 250 nM or more.
  • HU003K7FA It was confirmed that the effect of inducing proliferation of intestinal epithelial cells was excellent.
  • Gattex teduglutide
  • candidate substances HU003K2FA and HU003K7FA were used to measure their ability to persist in the blood.
  • the half-life (T 1/2 ) in blood was increased by 10.6 times in the HU003K2FA-administered group and 2.7-fold in the HU003K7FA-administered group, and the mean retention time (MRT) in blood was also It increased by 12.6 times in the HU003K2FA-administered group and 2.8-fold in the HU003K7FA-administered group.
  • the body weight decreased the most in the G4 and G5 Liraglutide-administered groups, and showed a similar decrease in the HU003K5FA and HU003K7FA-administered groups. This was predicted to be due to the GLP-1 receptor activating effect of the GLP-1/GLP-2 dual agonist.
  • the intestinal weight-to-body weight increase was significantly increased compared to teduglutide 10 mg/kg, which is considered to be due to the high persistence in blood.
  • the rate of increase in intestinal weight due to weight loss was similar to that of teduglutide.
  • Example 4 the second test of Example 5 was conducted by designing a test group corresponding to a formulation suitable for administration once or twice a week.
  • Example 4 it was confirmed whether the function of the small intestine could be improved only by administering the long-acting peptide of the present invention once to three times a week instead of daily administration.
  • the Teduglutide + Liraglutide and HU003K7FA-administered group lost weight at the first administration, but then recovered and lost weight only in the Teduglutide + Liraglutide group and the high-concentration administration group of HU003K7FA compared to the vehicle on the 8th day before sacrifice. confirmed that It was predicted that weight loss was due to the GLP-1 receptor activating effect of the GLP-1/GLP-2 dual agonist.
  • Example 5 it was confirmed whether small intestine function could be improved by administering the long-acting peptide of the present invention with only 1/3 the dose of Teduglutide once or twice a week.
  • the Teduglutide + Liraglutide and HU003K7FA-administered groups lost weight at the first administration, but then recovered, and on the 8th day before sacrifice, it was confirmed that only the Teduglutide + Liraglutide-administered group compared to the Vehicle group lost weight.
  • HU003K7FA which had the most excellent effect, was finally selected as a candidate substance for the treatment of short bowel syndrome, and an efficacy test was conducted in a short bowel syndrome model.
  • the length and weight of the small intestine hardly increased in the Teduglutide-administered group (G3), but in the HU003K7FA-administered group (G5 to G7), the length of the small intestine increased significantly by about 10% compared to the vehicle.
  • the Teduglutide + Liraglutide administration group (G4) increased the length of the small intestine, but rather decreased the weight of the small intestine, confirming that it was not suitable for the treatment of short bowel syndrome.
  • FIG. 28 tissues including duodenum, jejunum, and large intestine were stained by H&E staining. Based on the results of FIG. 28, the histopathological analysis of FIGS. 29 and 30 was performed.
  • the villus height increased by 18.3% in Teduglutide compared to Vehicle, and when the total dose of HU003K7FA was administered at 14 mg/week, the twice-weekly formulation (G7) increased by 31.4% , the one-time formulation (G6) increased significantly by 42.6%.
  • the fatty acid-peptide derivative of the present invention has excellent sustained efficacy in vivo compared to conventional drugs and exhibits excellent therapeutic effects in animal models of short bowel syndrome, so it is useful for preventing, improving, and treating intestinal diseases, intestinal damage, and gastric diseases expected to be available.

Abstract

본 발명은 지속형 지방산-펩타이드 유도체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 지속형 GLP-1/GLP-2 이중 작용제 및 이의 장질환, 장손상, 또는 위질환 치료 용도 등에 관한 것이다. 본 발명의 지방산-펩타이드 유도체는 GLP-1과 GLP-2 수용체 모두에 대한 작용제로서, 단장증후군의 타겟으로 알려진 GLP-1 및 GLP-2 수용체를 효과적으로 자극하며, 기존 약물 대비 생체 내 우수한 효력 지속 효과를 가지고, 단장증후군 동물 모델에서 음성 대조군 및 양성 대조군과 비교하여 현저히 우수한 치료 효과를 나타내는 바, 장질환 및 위질환의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

지속형 지방산-펩타이드 유도체 및 이의 용도
본 발명은 지속형 지방산-펩타이드 유도체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 지속형 GLP-1/GLP-2 이중 작용제 및 이의 장질환, 장손상, 또는 위질환 치료 용도 등에 관한 것이다.
본 출원은 2022년 01월 05일에 출원된 한국특허출원 제10-2022-0001657호 및 2022년 04월 22일에 출원된 한국특허출원 제10-2022-0050232호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
글루카곤-유사 펩타이드-1(glucagon-like peptide-1, 이하 GLP-1)은 인슐린 분비 자극, 글루카곤 분비 억제, 위 공복 억제, 위 운동 또는 장 운동 억제, 글루코오스 사용 증진 및 체중 감량 유도와 같은 다양한 생물학적 효과를 유도한다. 또한, GLP-1은 제2형 당뇨병인 인슐린 비-의존성 진성 당뇨병(Type Ⅱdiabetes, Non-insulin dependence diabetes mellitus, NIDDM)이 진행됨에 따라 유발되는 췌장 β세포 퇴화의 예방 및 신생 β세포의 생성 촉진에 의한 인슐린 분비능의 회복 등의 작용을 할 수 있는 것으로 알려져 있다.
글루카곤 유사 펩타이드-2(glucagon-like peptide-2, 이하 GLP-2)는 섭취된 영양분에 반응하여 소장의 L-세포에서 생성되는 33개의 아미노산으로 구성된 펩타이드 호르몬이다. GLP-2는 소장, 대장에서 점막 성장을 유도하고, 장세포와 선와(crypt) 세포의 성장 촉진 및 세포사멸(apoptosis)을 억제한다. 또한 GLP-2는 소장에서 영양분의 흡수를 증가시키고 장 투과성을 감소시킨다. 또한 GLP-2는 위 배출(Gastric emptying) 및 위산 분비를 억제하고, 장 혈류 속도를 증가시키고, 장 평활근을 이완시킨다. GLP-2는 에너지 흡수 및 보호, 장 세포 기능의 활성화 등의 특징으로 다양한 장 질환과 장 손상의 실험모델에서 치료제로서 유망한 가능성을 보여왔다.
실제로, GLP-2 유사체인 Gattex(teduglutide)가 2012년 말에 미국의 NPS pharmaceuticals, Inc.에서 개발되어 단장증후군(short bowel syndrome, SBS) 치료제로 희귀의약품 지정을 받았으며, 적응증을 확대하여 염증성 장질환 환자들에서 임상 2상을 진행 중에 있다.
그런데 GLP-2 또는 이의 유사체를 약물로 상용화하기 위하여서는 먼저 해결해야 할 문제점들이 있다. GLP-2와 같은 펩타이드는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 체내 단백질 가수 분해 효소에 의해 분해되어 그 활성을 잃으며, 또한 상대적으로 크기가 작아 신장을 통해 쉽게 제거되기 때문에 약리 성분으로 펩타이드를 포함하는 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 펩타이드 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나 펩타이드 약물은 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되며, 따라서 생리활성 펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사하게 되는데, 이는 환자의 엄청난 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 다양한 시도가 있어 왔다. 그 중 하나로 펩타이드 약물의 생체막 투과도를 증가시켜 구강 또는 비강을 통한 흡입으로 펩타이드 약물을 체내로 전달하려는 시도가 있었다. 그러나 이러한 방법은 주사제에 비해 펩타이드의 체내 전달 효율이 낮으며, 따라서 아직까지는 펩타이드 약물의 체내 활성이 요구되는 조건으로 유지하는데 어려움이 많다. 특히, GLP-2는 생리 활성 반감기가 7분 이하로 매우 짧다. 이는 디펩티딜 펩티다아제 Ⅳ이하, DPPⅣ에 의한 GLP-2의 아미노산 2번(Ala)과 3번(Asp) 사이의 절단에 의한 GLP-2의 역가 상실에 기인한다.
이에, 본 발명자들은 기존 약물의 타겟인 GLP-2 뿐만 아니라 GLP-1의 활성을 동시에 가지고, GLP-1/GLP-2 간 시너지효과(Synergistic effect)로 기존의 약물보다 우수한 효능을 나타내는 펩타이드 제제를 개발하면서, 약물의 생리 활성 반감기를 증가시키고자 하였다.
이에 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하기 위해 장내 세포인 GLP-1 및 GLP-2 수용체에 결합하여 장질환 및 위질환 치료 효과를 나타내는 GLP-1/GLP-2 유사 펩타이드를 제작하고, 상기 펩타이드에 라이신 및 팔미트산을 결합시킴으로써, GLP-1 및 GLP-2 수용체에 이중으로 작용 활성을 나타냄에 따라 단장증후군 치료 효과 및 체내 반감기가 증대되는 본 발명의 지방산-펩타이드 유도체를 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 하기 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드에 지방산이 결합된 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서, 상기 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드는 N 말단, C 말단, 또는 그 중간 사슬에 지방산이 결합된 것을 특징으로 하는, 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.
[일반식]
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열-Kn
(상기 일반식에서, K는 라이신(Lysine)이며, n은 1 내지 10의 정수이다.)
본 발명의 다른 목적은 상기 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 장질환, 장손상 및 위질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드에 지방산이 결합된 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서, 상기 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드는 N 말단, C 말단, 또는 그 중간 사슬에 지방산이 결합된 것을 특징으로 하는, 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[일반식]
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열-Kn
(상기 일반식에서, K는 라이신(Lysine)이며, n은 1 내지 10의 정수이다.)
본 발명의 일 구현예에서, 상기 지방산은 C12 내지 C22의 포화 지방산 또는 불포화 지방산일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 n은 2 내지 9의 정수일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 지방산은 C 말단에 결합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드는 서열번호 2 또는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 지방산-펩타이드 유도체는 생체 내 반감기(t1/2)가 2시간 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 장질환, 장손상, 및 위질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 장질환은 단장증후군, 과민성 장질환, 염증성 장질환, 크론씨병, 결장염, 대장염, 췌장염, 회장염, 점막염, 및 장 위축으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 장질환은 단장증후군일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 위질환은 위경련, 위염, 위궤양, 십이지장염, 및 십이지장궤양으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 지방산-펩타이드 유도체는 주(week) 당 0.1 내지 200 mg/kg 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 지방산-펩타이드 유도체는 소장 무게 또는 길이를 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 지방산-펩타이드 유도체는 융모 높이를 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 지방산-펩타이드 유도체는 소장의 단백질 또는 DNA 함량을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 장질환, 장손상, 및 위질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환 예방, 치료, 또는 개선 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 장질환, 장손상, 및 위질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 예방, 치료, 또는 개선 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 장질환, 장손상, 및 위질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 치료용 약제를 제조하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 지방산-펩타이드 유도체는 GLP-1과 GLP-2 수용체 모두에 대한 작용제로서, 단장증후군의 타겟으로 알려진 GLP-1 및 GLP-2 수용체를 효과적으로 자극하며, 기존 약물 대비 생체 내 우수한 효력 지속 효과를 가지고, 단장증후군 동물 모델에서 음성 대조군 및 양성 대조군과 비교하여 현저히 우수한 치료 효과를 나타내는바, 장질환, 장손상, 및 위질환의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 CCD-18co 세포주 및 Caco-2 세포주를 이용한 장 내 세포증식효능 평가방법 Scheme을 나타낸 것이다.
도 2는 정상 마우스의 장 증식에 미치는 영향을 확인하기 위한 매일 투여 시험 방법 Scheme을 나타낸 것이다.
도 3은 정상 마우스의 장 증식에 미치는 영향을 확인하기 위한 기간별 투여 시험(2차 시험) 방법 Scheme을 나타낸 것이다.
도 4는 정상 마우스의 장 증식에 미치는 영향을 확인하기 위한 최종 후보 선정을 위한 시험(3차 시험) 방법 Scheme을 나타낸 것이다.
도 5는 단장증후군 랫드 모델의 장 증식에 미치는 영향을 확인하기 위한 시험 방법 Scheme을 나타낸 것이다.
도 6은 HU003K5FA 및 HU003K7FA의 GLP-1 수용체 및 GLP-2 수용체 활성 시험 결과를 양성대조군(Exendin-4, GLP-2)과 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 대장 유래 장막 세포주 CCD-18co 세포 및 대장암 유래 Caco-2 세포의 세포 증식 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 HU003K2FA 및 HU003K7FA를 랫드에 단회 피하 투여한 후 시간에 따른 혈중 농도를 나타낸 것이다.
도 9는 매일 투여 시험에 따른 일별 체중 변화를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다.
도 10은 매일 투여 시험에 따른 8일차 체중을 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. *p<0.05 vs. G1, **p<0.01 vs. G1, #p<0.05 vs. G2, ##p<0.01 vs. G2, &&p<0.01 vs. G3.
도 11은 매일 투여 시험에 따른 소장 무게를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. *p<0.05 vs. G1, **p<0.01 vs. G1.
도 12는 매일 투여 시험에 따른 체중 대비 소장 무게 비율을 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. **p<0.01 vs. G1.
도 13은 기간별 투여 시험(2차 시험)에 따른 일별 체중 변화를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다.
도 14는 기간별 투여 시험(2차 시험)에 따른 8일차 체중을 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. *p<0.05 vs. G1, **p<0.01 vs. G1, #p<0.05 vs. G2, ##p<0.01 vs. G2, &p<0.05 vs. G3, &&p<0.01 vs. G3, €€p<0.01 vs. G4.
도 15는 기간별 투여 시험(2차 시험)에 따른 소장 무게를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. **p<0.01 vs. G1, #p<0.05 vs. G2.
도 16은 기간별 투여 시험(2차 시험)에 따른 체중 대비 소장 무게 비율을 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. **p<0.01 vs. G1, ##p<0.01 vs. G2, €€p<0.01 vs. G4.
도 17은 최종 후보 선정을 위한 시험(3차 시험)에 따른 일별 체중 변화를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다.
도 18은 최종 후보 선정을 위한 시험(3차 시험)에 따른 8일차 체중을 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. **p<0.01 vs. G1, ##p<0.01 vs. G2.
도 19는 최종 후보 선정을 위한 시험(3차 시험)에 따른 소장 무게를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. **p<0.01 vs. G1, #p<0.05 vs. G2, ##p<0.01 vs. G2, &&p<0.01 vs. G3.
도 20은 최종 후보 선정을 위한 시험(3차 시험)에 따른 체중 대비 소장 무게 비율을 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. **p<0.01 vs. G1, #p<0.05 vs. G2, ##p<0.01 vs. G2, &p<0.05 vs. G3.
도 21은 단장증후군 모델 시험에 따른 일별 체중 변화를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다.
도 22는 단장증후군 모델 시험에 따른 16일차 체중을 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. **p<0.01 vs. G1, #p<0.05 vs. G2, &p<0.05 vs. G3, &&p<0.01 vs. G3, €p<0.05 vs. G4, €€p<0.01 vs. G4.
도 23은 단장증후군 모델 시험에 따른 소장 무게를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. ##p<0.01 vs. G2, &&p<0.01 vs. G3, €€p<0.01 vs. G4.
도 24는 단장증후군 모델 시험에 따른 체중 대비 소장 무게 비율을 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. **p<0.01 vs. G1, #p<0.05 vs. G2, ##p<0.01 vs. G2, &p<0.05 vs. G3, &&p<0.01 vs. G3, €p<0.05 vs. G4, €€p<0.01 vs. G4.
도 25는 단장증후군 모델 시험에 따른 투여군 별 장 길이의 변화를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. **p<0.01 vs. G1, #p<0.05 vs. G2.
도 26은 단장증후군 모델 시험에 따른 투여군 별 단백질 함량을 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. *p<0.05 vs. G1, **p<0.01 vs. G1, #p<0.05 vs. G2, ##p<0.01 vs. G2, &p<0.05 vs. G3, €p<0.05 vs. G4, €€p<0.01 vs. G4.
도 27은 단장증후군 모델 시험에 따른 투여군 별 총 DNA 함량을 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. **p<0.01 vs. G1, #p<0.05 vs. G2, ##p<0.01 vs. G2, &p<0.05 vs. G3, &&p<0.01 vs. G3, €€p<0.01 vs. G4.
도 28은 단장증후군 모델 시험에 따른 투여군 별 H&E 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 29는 단장증후군 모델 시험에 따른 투여군 별 십이지장(Duodenum)에서의 융모 높이, 움 깊이, 점막 두께를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. *p<0.05 vs. G1, **p<0.01 vs. G1, #p<0.05 vs. G2, ##p<0.01 vs. G2, &p<0.05 vs. G3, &&p<0.01 vs. G3, €p<0.05 vs. G4, €€p<0.01 vs. G4.
도 30은 단장증후군 모델 시험에 따른 투여군 별 공장(Jejunum)에서의 융모 높이, 움 깊이, 점막 두께를 나타낸 것이다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. **p<0.01 vs. G1, #p<0.05 vs. G2, ##p<0.01 vs. G2, &p<0.05 vs. G3, €€p<0.01 vs. G4.
본 발명은 하기 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드에 지방산이 결합된 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서, 상기 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드는 N 말단, C 말단, 또는 그 중간 사슬에 지방산이 결합된 것을 특징으로 하는, 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 이를 유효성분으로 포함하는 장질환, 장손상, 또는 위질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
[일반식]
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열-Kn
(상기 일반식에서, K는 라이신(Lysine)이며, n은 1 내지 10의 정수이다.)
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서, 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다:
알라닌 Ala, A;
아르지닌 Arg, R;
아스파라긴 Asn, N;
아스파르트산 Asp, D;
시스테인 Cys, C;
글루탐산 Glu, E;
글루타민 Gln, Q;
글리신 Gly, G;
히스티딘 His, H;
이소류신 Ile, I;
류신 Leu, L;
라이신 Lys, K;
메티오닌 Met, M;
페닐알라닌 Phe, F;
프롤린 Pro, P;
세린 Ser, S;
트레오닌 Thr, T;
트립토판 Trp, W;
티로신 Tyr, Y;
발린 Val, V.
본 발명에서, "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.
본 발명에서, "펩타이드"는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989). 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩티드'라 함은 본 발명에 따른 펩티드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.
본 발명의 용어 "GLP-1(glucagon like peptide-1)"은, 소화기관에서 분비되는 호르몬인 인크레틴의 일종으로, 섭취에 의존적으로 장관 내의 L 세포에서 분비되어 췌장의 인슐린 분비를 증가시키는 역할과 글루카곤의 분비를 억제하여 이로 인해 식후 혈당의 상승을 억제하는 역할을 하는 것으로 알려진 단백질이다. 이렇듯, GLP-1은 기존에 당뇨병 치료 용도가 널리 알려져 있었으며, 식욕의 생리적 조절에도 관여하여 체중 감소 효과도 보고되어 있다. 또한 GLP-1은 장세포와 선와(crypt) 세포의 분열을 유도하여 장세포 수의 증가를 유도하는 연구보고가 이미 알려져 있다. 이는 기존의 GLP-2 활성에 소장의 융모세포의 세포분열을 유도하는 GLP-1의 활성이 융합됨으로써, 두 가지 활성 기작으로 소장 융모세포의 증식과 성장을 촉진시켜 단장증후군 치료에 보다 효과적일 것으로 예상된다.
본 발명의 용어 "GLP-2(glucagon like peptide-2)"는, 장의 장내분비 L 세포 및 뇌의 특정 영역에서 프로글루카곤 전구체 형태로 생성되어, 장내 효소에 의한 효소 절단을 통해 생성되는 33개의 짧은 아미노산을 갖는 펩타이드 호르몬으로서, 음식의 섭취와 함께 영양분 소화에 반응하여, 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 옥신토모듈린 및 글리센틴과 함께 동시 분비된다. 상기 GLP-2는 염증성 장질환 뿐만 아니라, 단장 증후군(Short bowel syndrome, SBS) 등에 효과적인 것이 널리 알려져 있었다. 실제로 GLP-2 유사체인 Gattex(teduglutide)가 2012년 말에 미국의 NPS pharmaceuticals, Inc.에서 개발되어 단장증후군 치료제로 희귀의약품 지정을 받았으며, 현재 적응증을 확대하여 염증성 장질환 환자들에서 임상 2상을 진행 중에 있다.
본 발명의 하기 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드는 서열번호 1(His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Tyr-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp)에 라이신이 1 내지 10개 결합된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[일반식]
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열-Kn
(상기 일반식에서, K는 라이신(Lysine)이며, n은 1 내지 10의 정수이다.)
본 발명의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열은 천연형 GLP-2의 16번째 아미노산인 N(Asn)을 A(Ala)로 변경한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이는 전체적인 펩타이드 사이즈를 줄이기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열은 천연형 GLP-2의 2번째 아미노산인 A(Ala)를 Exendin-4와 gattex의 G(Gly)로 변경한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이는 GLP-1 및 GLP-2의 활성 증가를 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열은 천연형 GLP-2 아미노산을 기준으로 13번째 위치의 아미노산이 Tyr(Y) 및/또는 19번째 위치의 아미노산이 Thr(T)로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 치환은 GLP-1 및 GLP-2의 생물학적 활성을 증가시키기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열은 이와 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 상동성을 가지는 변이체일 수도 있으며, 서열번호 1의 서열 내 일부 서열의 결실, 치환 또는 부가도 본 발명의 범주 내에 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기 지방산-펩타이드 유도체는 GLP-1 수용체 및 GLP-2 수용체에 대한 이중 작용제 활성을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 지방산-펩타이드 유도체는 GLP-1 수용체에 대한 작용제 활성보다 GLP-2 수용체에 대한 작용제 활성이 큰 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 지방산-펩타이드 유도체는 GLP-1 수용체에 대한 상대 작용제 활성이 5 % 내지 30 %, 8 % 내지 30 %, 10 % 내지 30 %, 10 % 내지 25 %, 10 % 내지 23 %, 13 % 내지 25 %, 13 % 내지 23 %, 14 % 내지 23 %, 14 % 내지 21 %, 15 % 내지 25 %, 17 % 내지 23 %, 또는 18 % 내지 22 %인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 지방산-펩타이드 유도체는 GLP-2 수용체에 대한 상대 작용제 활성이 30 % 내지 300 %, 30 % 내지 250 %, 30 % 내지 200 %, 30 % 내지 180 %, 30 % 내지 150 %, 30 % 내지 120 %, 40 % 내지 300 %, 40 % 내지 250 %, 40 % 내지 200 %, 40 % 내지 180 %, 40 % 내지 150 %, 40 % 내지 120 %, 50 % 내지 300 %, 50 % 내지 250 %, 50 % 내지 200 %, 50 % 내지 180 %, 50 % 내지 150 %, 50 % 내지 130 %, 70 % 내지 300 %, 70 % 내지 250 %, 70 % 내지 200 %, 70 % 내지 180 %, 70 % 내지 150 %, 70 % 내지 130 %, 또는 80 % 내지 100 %인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 지방산-펩타이드 유도체는 장질환, 장손상, 또는 위질환의 예방, 치료, 및 개선 효과를 나타내는 범위 내에서 하나 이상의 아미노산 변경을 포함할 수 있다.
본 발명의 지방산-펩타이드 유도체는 아미노산 서열의 일부 부위를 선정하고 그 활성을 증가시키기 위해 아미노 말단 또는 카르복시 말단의 변형을 유도할 수 있다. 이러한 변형을 통해 본 발명의 펩타이드는 생체 내 투여 시에 증가된 반감기를 가질 수 있다.
본 발명에서, 상기 지방산은 C12 내지 C22의 포화 지방산 또는 불포화 지방산일 수 있다. 상기 지방산은 지방산기의 형태로 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드에 결합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 언급하는 포화 지방산기는 라우릴기(C12:0, lauryl), 트라이데실기(C13:0, tridecyl), 미리스틸기(C14:0, myristil), 펜타데실기(C15:0, pentadecyl), 팔미토일기(C16:0, palmitoyl), 마르가릴기(C17:0, margaryl), 스테아릴기(C18:0, stearyl), 노나데실기(C19:0, nonadecyl), 아라키딜기(C20:0, arachidyl), 헤네이코실기(C21:0, heneicosyl), 또는 베헤닐기(C22:0, behenyl)이다.
본 발명에서 언급하는 C12 내지 C22의 불포화 지방산기는 팔미트올레일기(C16:1, palmitoleyl), 올레일기(C18:1, oleyl), 미리스트올레일기(C14:1 myristoleyl), 리놀레일기(C18:2 linoleyl) 또는 아라키도닐기(C20:3, arachidonyl)이다.
본 발명에서, 상기 n은 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 3 내지 7, 4 내지 7, 5 내지 7, 또는 6 내지 8의 정수일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 지방산은 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드의 C 말단에 결합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드는 서열번호 2 또는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 지방산-펩타이드 유도체는 생체 내 반감기(t1/2)가 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상, 6시간 이상, 7시간 이상, 8시간 이상, 9시간 이상, 10시간 이상, 11시간 이상, 12시간 이상, 13시간 이상, 14시간 이상, 15시간 이상, 16시간 이상, 17시간 이상, 18시간 이상, 또는 19시간 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 지방산-펩타이드 유도체는 양성대조군 테두글루티드의 혈중반감기가 1.8시간인 것과 비교하여, 약 19시간의 혈중반감기를 나타내었다.
본 발명에서, 상기 지방산-펩타이드 유도체는 혈중 평균 체류시간(MRT)이 3 내지 100시간, 3 내지 90시간, 3 내지 80시간, 3 내지 70시간, 3 내지 60시간, 3 내지 50시간, 3 내지 40시간, 5 내지 100시간, 5 내지 90시간, 5 내지 80시간, 5 내지 70시간, 5 내지 60시간, 5 내지 50시간, 5 내지 40시간, 10 내지 100시간, 10 내지 90시간, 10 내지 80시간, 10 내지 70시간, 10 내지 60시간, 10 내지 50시간, 10 내지 40시간, 20 내지 100시간, 20 내지 90시간, 20 내지 80시간, 20 내지 70시간, 20 내지 60시간, 20 내지 50시간, 20 내지 40시간, 25 내지 35시간, 또는 약 30시간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 지방산-펩타이드 유도체는 양성대조군 테두글루티드의 혈중 평균 체류시간이 2.1시간인 것과 비교하여, 약 31.8시간의 혈중 평균 체류시간을 나타내었다.
본 발명에서, 상기 지방산-펩타이드 유도체는 주 당 0.1 내지 200 mg/kg 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 지방산-펩타이드 유도체는 소장 무게 또는 길이를 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 지방산-펩타이드 유도체는 융모 높이를 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 지방산-펩타이드 유도체의 N 말단 또는 C 말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 보호기가 결합될 수 있으며, 펩타이드의 카르복시 말단은 히드록시기(-OH), 아미노기(-NH2), 아자이드(-NHNH2)등으로 변형될 수 있다. 또한 본 발명의 펩타이드의 말단 또는 아미노산의 R-잔기(R-group)에 당쇄(oligosaccharides chains), 모든 나노입자(골드입자, 리포솜, 헤파린, 하이드로젤 등), 아미노산, 담체 단백질(carrier proteins) 등을 결합할 수 있다. 상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 역가(potency)와 안정성을 개선하는 작용을 한다.
본 발명에서, "장질환"은 단장증후군, 과민성 장질환, 염증성 장질환, 크론씨병, 결장염, 대장염, 췌장염, 회장염, 점막염 또는 장 위축일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "위질환"은 위경련, 위염, 위궤양, 십이지장염, 또는 십이지장궤양일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "단장증후군"이란 소장이 짧아 영양소의 소화 흡수 기능이 저하됨으로써 발생하는 여러 가지 대사 이상을 의미하며, 발병 유형에 따라 선천성과 후천성으로 구분된다. 선천성은 태아가 짧은 소장을 갖고 태어나는 것을 의미하고, 후천성은 다른 질병이나 외상으로 인해 잘라내고 남은 소장의 길이가 너무 짧아 장애를 일으키는 것을 의미한다.
후천성 단장증후군은 여러 가지 원인으로 인하여 장을 광범위하게 절제하여, 그 결과 장 흡수능력이 떨어져, 설사, 탈수 및 영양불량 등을 초래하는 상황을 의미한다. TPN 등을 포함한 내과적 치료로 치유되는 경우가 많으나, 어떤 경우에는 장길이를 길게 하는 수술(intestinal lengthening procedure) 혹은 장이식(intestinal transplantation)을 필요로 하기도 하는, 환자와 의료진 모두에게 장기간의 주의 깊은 복합적인 치료를 요하게 하는 질환이다.
본 발명은 또한, 상기 지방산-펩타이드 유도체의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 염"이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다.
적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 글루콘산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
본 발명의 조성물 내의 지방산-펩타이드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9% 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16(Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈(Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입(AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈(N, Es), 웨코비(W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제(TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 생체 내 지속성이 우수하므로, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
또한, 본 발명은 상기 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 장질환, 장손상, 및 위질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환 예방, 치료, 또는 개선 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 장질환, 장손상, 및 위질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 예방, 치료, 또는 개선 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 장질환, 장손상, 및 위질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 치료용 약제를 제조하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "투여"란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 "예방"이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, "개선"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. 지속형 GLP-1/GLP-2 이중 작용제의 합성 및 정제
1-1. HU003 펩타이드의 합성
9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) SPPS(고정상 펩타이드 합성)를 위한 펩티딜 레진을 준비하였다. 먼저, Rink Amide MBHA 레진을 DMF용매에 60분간 레진스웰링(Resin swell)하였다. 그리고, Fmoc-아미노산을 커플링 시약(Coupling regent)과 함께 고체상 합성에 의해 레진에 순서대로 결합하였다. 이후 레진은 DMF로 3번 세척하였다. Fmoc-Gln(Trt)-Thr(Psi,Me,Me,Pro)-OH는 아미노산 5번과 6번에 사용되었다. Fmoc의 탈보호는 20 % Piperidine/DMF을 사용하여 레진에 진행하였고, 이후 DMF를 이용하여 5번 세척하였다. 이후, 완전히 보호된 상태로 모든 아미노산을 펩티딜 레진에 결합하였다. 이후 완전히 보호된 펩티딜 레진을 E solution(TFA:Thioanisole:EDT:Phenol:H2O=87.5:5:2.5:2.5:2.5)을 이용하여 3시간동안 분리시킨 후 여과시켰다. 이후 여과액을 차가운 에터를 이용해 침전시키고, 진공 하에 건조시켜 조(crude) 펩타이드를 얻었다. 조 펩타이드는 Hanbon 장비로 luna C18 5 μm 컬럼, 시료 분취기(fraction collector)를 이용해 분취량 역상 HPLC(Reverse Phase Preparative HPLC)를 진행해 70 %까지 정제한 후, 그래디언트(gradient) 조건 하에 A 버퍼(4 g/L 암모늄 아세테이트, aq.)와 B 버퍼(4 g/L 암모늄 아세테이트, 70 % ACN, aq.)를 이용하여 정제를 진행했다. 이후 얻은 시료는 HPLC와 MS를 이용하여 분석 및 동결건조 시켰다. 얻은 물질(13.7 mg)은 95 %의 순도를 얻기 위해 HPLC, MS를 이용해 그래디언트(gradient) 조건 하에 A 버퍼(0.1 % TFA, aq.), B 버퍼(0.1 % TFA, 80 % ACN, aq.)를 이용해 2번째 정제를 하였고, 최종적으로 10.8 mg의 HU003 펩타이드 시료를 수득하였다.
HU003(서열번호 1): His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Tyr-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp
[화학식 1]
서열번호 1의 펩타이드
Figure PCTKR2023000110-appb-img-000001
1-2. HU003 펩타이드와 팔미트산(Palmitic acid)의 접합(Conjugation)
팔미트산을 접합하기 위하여, Boc 및/또는 Fmoc에 의해 보호된 아미노산(Fmoc-Lys(Palm-Glu-OtBu)-OH , Fmoc-Lys(Trt)-OH)을 추가로 사용하여 합성하였다. 팔미트산은 펩타이드 결합을 통해 라이신에 접합됐으며, Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH는 합성된 화학물질 상태로 Polypeptide사에서 구매해 합성을 진행하였다(Cas no. 1491158-62-3, PPL item no: 500495). HU003 펩타이드에 대한 라이신-팔미트산의 결합은 상기 실험예 1-1의 방법과 동일하게 진행되었다.
제작된 라이신(K) 및 펩타이드의 서열은 하기 표 1에 나타내었다. 붉은색으로 표시된 K는 지방산이 접합된 부위를 나타낸다.
본 명세서에서는, 하기 각각의 펩타이드 서열에 지방산을 붙인 경우, 이를 HU003K2FA, HU003K3FA, HU003K5FA, HU003K7FA, 및 HU003K9FA로 표시하였다.
Figure PCTKR2023000110-appb-img-000002
HU003K2(서열번호 2): His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Tyr-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys
HU003K3(서열번호 3): His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Tyr-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys
HU003K5(서열번호 4): His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Tyr-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys
HU003K7(서열번호 5): His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Tyr-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys
HU003K9(서열번호 6): His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Thr-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Tyr-Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys
실험예 2. cAMP assay(GLP-1 및 GLP-2 수용체 효능 분석)
2-1. 인간 GLP-1, GLP-2 수용체를 발현하는 세포주
신규 GLP-1/GLP-2 펩타이드 활성 검증을 위하여 cell based assay 시험을 수행하였다. 사용된 세포주는 GLP-1R/CHO, GLP-2/CHO 세포이며, 세포에 대한 정보는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.
세포 제조 번호 (Code) 제조사
GLP-1R/CHO 95-0062C2 DiscoverX
GLP-2R/CHO 95-0112C2 DiscoverX
2-2. 인간 GLP-1/GLP-2 생물학적 활성 검정
합성 펩타이드를 GLP-1R/CHO, GLP-2R/CHO 세포에 각각 처리하여 세포 내 cAMP 농도를 확인하였다. cAMP 농도는 cAMP assay kit(Discover X, 90-0075- LM10)를 사용하여 측정하였다. GLP-1은 exendin-4(DiscoverX, 92-1115)를, GLP-2는 GLP-2(DiscoverX, 92-1079)를 표준품으로 사용하여 EC50을 비교하였다. 표준품에 대한 정보는 하기 표 3에 나타난 바와 같다.
GLP-1 활성측정 GLP-2 활성측정
물질 명 Exendin-4 GLP-2 (합성)
제조사 Discover X Discover X
순도 > 95% > 95%
실험예 3. 세포 증식 평가(Cell proliferation assay)
CCD-18co 세포는 대장 유래 장막 세포(Fibroblast)로 GLP-2 수용체가 존재하며, GLP-2 아고니스트와 결합할 때 세포성장인자인 IGF-1, VEGF, FGF 등을 발현한다. 증가된 세포성장인자는 대장암 유래 세포주 Caco-2 세포의 증식을 유도한다. 본 시험은 자사에서 개발한 지속형 GLP-1/GLP-2 펩타이드와 양성 대조군인 GLP-2 제제 테드글루티드(teduglutide)와 GLP-1 제제인 리라글루티드(liraglutide) 두 제제를 혼합하여 증가된 세포성장인자에 의해 Caco-2 세포의 증식 효과를 확인하였다. CCD-18co 및 Caco-2 세포를 이용한 평가 스킴은 도 1에 나타내었다.
먼저, 75T 플라스크에 배양한 CCD-18co 세포를 6 웰 플레이트에 2x105 cells/well 농도로 계대배양 하였다. CCD-18co 세포가 최대밀도로 성장하면 10 % FBS/DMEM 배지에서 FBS를 0.1 % FBS로 농도를 감소시켜 serum starvation 조건을 만들어 4 ℃에서 24시간 동안 추가배양 하였다. 이어서, 100 nM, 250 nM, 또는 1000 nM의 GLP-1 및 GLP-2 작용제(Liraglutide, Teduglutide), 또는 합성 펩타이드(HU003K5FA, HU003K7FA)를 0.1 % FBS/DMEM 배지에 희석하여 CCD-18co 세포에 처리하였다. 처리된 세포는 24시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 합성 펩타이드를 처리한 CCD-18co 세포 배지(conditioned medium, CM)의 상등액을 얻은 후 원심분리를 700 x g 조건으로 3분 실시한 후 0.22 μm 필터로 부유물질을 제거하였다.
한편, 5T 플라스크에서 배양한 Caco-2 세포는 96 웰 플레이트에 0.5x104 cells/well 농도로 계대배양 하였다. Caco-2 세포를 신선한 10 % FBS/MEM 배지로 100 μl씩 갈아준 뒤 CCD-18co CM을 FBS/MEM 배지와 1:1이 되도록 처리하였다. CCD-18co CM의 처리 후 3일간 37 ℃에서 인큐베이션하였다. Caco-2 세포는 신선한 10 % FBS/MEM 배지로 100 μl씩 갈아준 뒤 EZ-cytox assay 용액을 배지의 10 %가 되도록 10 μl씩 첨가하였다. EZ-cytox assay 용액을 첨가한 후 한 시간 마다 총 4시간 동안 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 450 nM 파장에서 흡광도를 측정하여 세포증식을 확인하였다.
실험예 4. 약물동태시험
시험 동물은 SD 랫드(rat)(Male, 투여 시 7주령, ㈜코아텍)를 사용하였으며, 디자인된 시험군은 하기 표 4에 나타내었다.
Group 투여물질 투여량 투여경로/ 채혈 시간 (hr)
1 Teduglutide 1 mg/kg - 투여 경로: I.V 투여(꼬리정맥투여)
- 채혈 시간: 10m, 20m, 30m, 45m, 1h, 2h, 4h, 6h 8h
채혈 방법: 경정맥 또는 꼬리정맥채혈
2 HU003K2FA
3 HU003K7FA
각 시험군의 모든 개체에 대하여 투여 후 일정시간 간격으로 일회용 주사기(1 mL, 26G, 한국백신) 및 헤파린 튜브를 이용하여 경정맥 또는 꼬리정맥에서 약 300 μL의 혈액을 취득하였다. 채혈한 혈액은 즉시 항응고제가 담긴 혈장 튜브에 담아 채혈 후 30 분 이내에 13,000 rpm 에서 5분간 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 분리된 각 혈장은 최대 200 μL를 1개의 튜브에 분주하여 초저온 냉동고에 넣어 보관하였으며, 모든 채혈이 종료된 후에 전달되었다. 채혈로부터 얻은 혈장을 이용해 항체를 이용한 ELISA 분석을 수행함으로써 혈중 내 펩타이드 농도를 측정하였다. 혈중 약물의 약물동태시험은 모델비의존형 방법(Non-compartmental analysis)을 사용하였으며, 약물동태학적 파라미터인 혈중최고농도(Cmax), 최고혈중농도 도달시간(Tmax), 혈중약물농도-시간곡선하 면적(AUClast) 및 소실 반감기(T1/2)등 분석은 Phoenix Winnonlin을 사용하였다.
실험예 5. 정상 마우스의 장 증식에 미치는 약효 평가
시험 동물은 SD 랫드(Male, 투여 시 7주령, ㈜ 오리엔트바이오)를 사용하였다. 시험물질 및 양성대조물질(Liraglutide, Teduglutide)은 체중을 근거로 개체별 투여량을 각각 환산하였으며, 체중 kg당 5 ㎖의 투여량으로 피하(Subcutaneous, s.c.) 투여하였다. 디자인된 시험군은 하기 표 5에 나타내었다.
Figure PCTKR2023000110-appb-img-000003
Figure PCTKR2023000110-appb-img-000004
Figure PCTKR2023000110-appb-img-000005
입수 시, 군 분리 시, 시험물질 투여 기간 1 일 1 회로 개체 별 체중을 측정하였다. 매 측정 시 오차를 최소화하기 위하여 동일한 저울을 사용하여 측정하였다.
또한, 시험 종료 후, 동물은 마취하고 개복하여 방혈한 다음 개체 별로 장 조직(위부터 대장까지)을 적출하였다. 적출한 장 조직은 사진 촬영을 실시하였으며, 사진 촬영을 마친 장 조직은 소장(십이지장부터 맹장 전까지) 부분만 절개하여 면봉으로 내용물을 깨끗이 제거한 뒤 무게를 측정하였다.
실험결과는 NCEED(인하대학교 소화기질환유효성평가지원센터)에서 보유하고 있는 상용통계처리 프로그램(IBM SPSS statistics version 25.0)을 사용하였다. Mann-Whitney 분석을 통해 데이터를 통계 분석하였다.
실험예 6. 단장증후군(Short bowel syndrome, SBS) 랫드 모델에서 약효 평가
6-1. 단장증후군 모델의 제작
시험 동물은 SD 랫드(Male, 투여 시 7주령, ㈜ 오리엔트바이오)를 사용하였다. 랫드는 수술 전 16 시간 동안 절식시키고, 케타민과 자일렌(3:2)을 복강 내로 주입하여 마취한 후 중앙 복부를 따라 절개하였다. 핀셋과 소독 면봉으로 소장, 맹장, 및 대장을 들어내었다. 트레이츠 인대(Ligament of Treitz)로부터 40 cm 거리 위치의 공장(Jejunum) 부분에서부터 맹장(Cecum)으로부터 1 cm 거리 위치의 Proximal colon까지(60 % 소장, 맹장 포함) 절제한 후, 공장과 결장에 대해 End-to-end 문합을 시행하였다. 소장을 제자리에 위치시키고 체액 소생을 위해 복강 내에 멸균 식염수 5 ㎖을 넣고 2-0 Silk 봉합사로 봉합하였다. 또한, 수술 후 감염 예방을 위해 200 mg/kg 앰피실린을 피하에 주사하였다.
6-2. 투여 방법
시험물질 및 양성대조물질(Liraglutide, Teduglutide)은 체중을 근거로 개체별 투여량을 각각 환산하였으며, 체중 kg당 1 ㎖의 투여량으로 피하(Subcutaneous, s.c.) 투여하였다. 디자인된 시험군은 하기 표 8에 나타내었다.
Figure PCTKR2023000110-appb-img-000006
6-3. 조직병리학적 분석
조직병리 및 H&E 염색(Hematoxylin & Eosin 염색)을 통해 융모 높이(Villus height), 움 깊이(Crypt depth), 및 점막 두께(Mucosal thickness)를 측정하였다. 먼저, 십이지장, 공장, 대장 조직을 10 % 중성완충포르말린용액(10 % buffered neutral formalin)에 고정하였다. 고정된 조직을 일정한 두께로 삭정한 다음, 일반적인 조직처리과정을 거쳐 파라핀 포매하여 4~5 ㎛의 조직절편을 제작하였다. 조직 절편에 대해서 H&E 염색을 실시하여 각 조직의 조직병리학적 소견을 관찰하고, 공장, 십이지장의 융모 높이, 움 깊이, 및 점막 두께, 및 대장의 움 깊이를 측정하였다.
융모 높이에 대한 계산 식은 다음과 같다: 융모 높이(μm) = 점막 두께 - 움 깊이
6-4. DNA 및 단백질 함량 측정
십이지장과 공장 점막의 DNA 및 단백질 함량을 측정하였다. 장 점막 DNA는 냉동 조직으로부터 QIAZEN사의 Dneasy Blood & Tissue Kit를 이용하여 추출하고 측정하였다. 장 점막 단백질은 Thermo Scientific사의 Pierce BCA protein assay kit를 이용하여 추출하여 측정하였다. 각 방법은 제조사의 키트 사용법에 따라 수행되었다.
실시예 1. 팔미트산 결합 위치에 따른 지속형 GLP-1/GLP-2 펩타이드의 활성 분석
상기 실험예 1-2의 방법에 의해 합성된 지속성 펩타이드를 GLP-1R/CHO 세포와 GLP-2R/CHO 세포에 각각 반응시켜 cAMP 증가를 유도하는지 확인하였다. cAMP의 증가가 유도된 세포를 파쇄하여 세포 내 cAMP 증가량을 ELISA 방법으로 정량하였다. 각 시험군 및 대조군에 대한 시험을 함께 수행하여 대비 활성을 확인하였다. 활성 결과의 정확성을 확보하기 위하여 각 펩타이드에 대하여 3회 이상 반복 시험을 수행하였다. 한편, 팔미트산이 결합 가능한 라이신은 최대 9개였는 바, 라이신을 9개까지 추가 및 합성함으로써 팔미트산이 결합된 지속형 GLP-1/GLP-2 펩타이드의 활성을 측정하였다.
표 9에 라이신 개수에 따른 활성 평가 결과, HU003 펩타이드에 라이신 7개를 추가하였을 때가 가장 높은 활성을 가지는 것으로 확인되었다.
결과적으로, HU003K7FA가 GLP-1에서 GLP-1 활성이 약 20.4 %, GLP-2 활성이 90.3 %로 가장 높은 활성을 보였으며, HU003K5FA가 다음으로 높은 활성을 보였다. 이에, HU003K7FA 및 HU003K5FA의 양성 대조군과의 비교 결과를 도 6에 나타내었다.
Figure PCTKR2023000110-appb-img-000007
실시예 2. 세포 증식 평가(Cell proliferation assay) 결과 확인
지속형 GLP-1/GLP-2 펩타이드 후보물질 2종(HU003K5FA, HU003K7FA)과 양성 대조물질로서 GLP-2 제제인 Teduglutide, GLP-1 제제인 Liraglutide, 그리고 Teduglutide + Liraglutide를 CCD-18co 세포와 Caco-2 세포를 이용하여, 장 상피세포 증식 유도효과를 확인하였다. Caco-2 세포의 성장은 약물처리를 하지 않은 CM 처리 대조군의 세포성장을 100 %로 하여 약물처리군의 세포성장을 대조군 대비 세포가 증가한 정도로 계산하였다.
표 10 및 도 7에 나타난 바와 같이, 시험결과 약물 농도를 100 nM로 처리 했을 때, Liraglutide는 대조군 대비 99.9 ±7.6 %, Teduglutide는 대조군 대비 106.0 ±3.7 %, Teduglutide + Liraglutide를 병용 처리한 군은 대조군 대비 107.6 ±1.8 %였다. 본 발명의 지속형 펩타이드 HU003K5FA를 처리한 군은 103.6 ±5.4 %, HU003K7FA를 처리한 군은 113.0 ±1.0 %으로 확인되었다.
또한, 약물농도를 250 nM로 처리 했을 때, Liraglutide는 109.18 ±5.6 %, Teduglutide는 115.7 ±6.2 %, Teduglutide + Liraglutide를 병용 처리한 군은 112.4 ±3.6 %, HU003K5FA를 처리한 군은 122.2 ±9.9 %, HU003K7FA를 처리한 군은 125.1 ±11.7 %만큼 대조군 대비 세포 증식이 증가한 것을 확인하였다.
약물농도를 1000 nM로 처리 했을 때, Liraglutide는 109.5 ±6.4 %, Teduglutide는 120.9 ±3.8 %, Teduglutide + Liraglutide를 병용 처리한 군은 117.8 ±3.3 %, HU003K5FA를 처리한 군은 125.5 ±9.9 %, HU003K7FA를 처리한 군은 133.0 ±8.0 %만큼 대조군 대비 세포 증식이 증가한 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 지속형 펩타이드 HU003K5FA 및 HU003K7FA의 장 상피세포 증식 유도효과가 100 nm에서는 양성 대조군과 비슷한 정도였으며, 250 nM 이상의 농도에서는 양성 대조군보다도 유의하게 증가된 효과를 나타낸 것을 확인하였으며, 특히 HU003K7FA의 장 상피 세포 증식 유도효과가 우수함을 확인하였다.
Figure PCTKR2023000110-appb-img-000008
실시예 3. HU003K2FA, HU003K7FA의 약물동태시험 결과 확인
Gattex(teduglutide) 또는 후보물질 HU003K2FA, HU003K7FA를 정상 랫드에 단회 정맥투여하여 혈중 지속 능력을 측정하였다.
그 결과, 도 8 및 표 11에 나타난 바와 같이, 양성대조군 teduglutide와 비교하여 혈중반감기(T1/2)가 HU003K2FA 투여군에서 10.6배, HU003K7FA 투여군에서 2.7배 증가하였으며, 혈중 평균 체류시간(MRT) 또한 HU003K2FA 투여군에서 12.6배, HU003K7FA 투여군에서 2.8배 증가하였다.
PK Parameter T1/2 Tmax Cmax C0 AUClast MRT(min) CL (mL/min/kg)
min min ng/mL ng/mL ng/mL*min min mL/min/kg
Teduglutide 13.8 5 7797 12014 175037 16.2 5.7
HU003K2FA 145.9 10 9190 10875 1563897 203.6 0.5
HU003K7FA 37.7 10 10642 11994 677550 46.0 1.5
실시예 4. 정상 마우스에 미치는 효과 확인 : 1차 시험
4-1. 체중 확인
도 9 및 도 10에 나타난 바와 같이, 체중은 G4, 및 G5인 Liraglutide 투여군에서 가장 크게 감소했으며, HU003K5FA, HU003K7FA 투여군에서도 비슷하게 감소하는 경향을 보였다. 이는 GLP-1/GLP-2 이중작용제의 GLP-1수용체 활성화 효과에 기인한 것으로 예측하였다.
4-2. 소장 무게 확인
본 발명의 지속형 펩타이드가 정상 마우스의 소장 무게를 증가시킴으로써, 소장 기능을 개선할 수 있는지 확인하였다.
도 11에 나타난 바와 같이, HU003K5FA, 또는 HU003K7FA 투여군 모두 vehicle 대비 소장의 무게가 증가함을 확인하였다.
도 12에 나타난 바와 같이, HU003K5FA, 또는 HU003K7FA 1 mg/kg 투여군은 teduglutide 10 mg/kg 대비 체중대비 장 무게 증가가 유의적으로 증가했으며, 이는 혈중 지속능력이 높기 때문으로 판단된다. liraglutide 투여군은 체중감소로 인해 장 무게의 증가 비율이 teduglutide와 유사하게 측정되었다.
실시예 4의 결과에 따라, 주 1~2회 투여에 적합한 제형에 부합하는 시험군을 디자인하여 실시예 5의 2차 시험을 진행하였다.
실시예 5. 정상 마우스에 미치는 효과 확인 : 2차 시험
상기 실시예 4의 결과에 따라, 본 발명의 지속형 펩타이드를 매일 투여하지 않고 주 1회 내지 3회 투여하는 것만으로도 소장 기능을 개선할 수 있는지 확인하였다.
5-1. 체중 확인
도 13 및 도 14에 나타난 바와 같이, Teduglutide + Liraglutide 및 HU003K7FA 투여군은 최초 투여 시에 체중이 감소 했지만, 이후 회복하여 희생 전 8일차에서는 Vehicle 대비 Teduglutide + Liraglutide 군과 HU003K7FA의 고농도 투여군에서만 체중이 감소하는 것을 확인하였다. 이는 GLP-1/GLP-2 이중작용제의 GLP-1 수용체 활성화 효과에 의해 체중이 감소하는 것으로 예측되었다.
5-2. 소장 무게 확인
도 15 및 도 16에 나타난 바와 같이, 소장 무게는 Vehicle 대비 모든 투여군에서 유의적으로 증가하는 것을 확인 했으며, 특히 HU003K7FA는 용량 의존적인 차이를 나타내었다. Liraglutide의 경우 몸무게가 감소함에 따라 체중 대비 소장 무게가 더 증가한 것으로 측정되었다.
HU003K7FA를 투여기간 동안 총 21 mg/kg 투여한, G6, G8, G10의 결과에서는 Tedulgutide 10 mg/kg(daily, 총 70 mg/kg 투여) 대비 소장 무게 증가 효과가 유의하게 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 6. 정상 마우스에 미치는 효과 확인 : 3차 시험
상기 실시예 5의 결과에 따라, 본 발명의 지속형 펩타이드를 Teduglutide의 1/3 용량만으로 주 1회 또는 2회 투여하는 것만으로도 소장 기능을 개선할 수 있는지 확인하였다.
6-1. 체중 확인
도 17 및 도 18에 나타난 바와 같이, Teduglutide + Liraglutide 및 HU003K7FA 투여군은 최초 투여 시에 체중이 감소했지만, 이후 회복하여 희생 전 8일차에서는 Vehicle 대비 Teduglutide + Liraglutide 투여군에서만 체중이 감소하는 것을 확인하였다.
6-2. 소장 무게 확인
도 19에 나타난 바와 같이, 소장 무게는 Vehicle 대비 모든 투여군에서 유의적으로 증가하는 것을 확인했으며, 특히 HU003K5FA, 또는 HU003K7FA의 투여 시 용량에 의존적인 효과 차이를 확인할 수 있었다.
도 20에 나타난 바와 같이, 체중 대비 소장 무게의 경우 주 2회 HU003K5FA를 투여하는 G7과 HU003K7FA를 주 1회 투여하는 G8의 결과에서 높은 효과가 나타나는 것으로 확인되었다. 소장 무게 변화의 경우, 동일 용량 대비 HU003K5FA보다 HU003K7FA가 12 % 정도 높은 효능을 보임을 확인하였다.
상기 결과를 토대로, 효과가 가장 우수한 HU003K7FA를 단장증후군 치료 후보물질로 최종 선정하였으며, 단장증후군 모델에서의 효력 시험을 진행하였다.
실시예 7. 단장증후군 모델에 대한 치료 효과 확인
7-1. 체중 확인
본 발명의 지속형 펩타이드 투여에 따른 단장증후군 모델의 체중 변화를 평가하였다.
도 21 및 도 22에 나타난 바와 같이, 단장증후군 모델(G2)은 소장의 십이지장을 50-60 % 제거하고, 그리고 회장과 맹장 전체를 제거하기 때문에 전체적으로 체중이 감소하였다. 이에 반해, 본 발명명의 지속형 펩타이드 HU003K7FA를 2주간 투여한 G5 내지 G7은 기존 약물인 Teduglutide 또는 Teduglutide + Liraglutide 투여군 대비 몸무게가 월등히 증가하는 것을 확인하였다.
7-2. 소장 무게 확인
상기 지속형 펩타이드 투여에 따른 몸무게의 증가가 소장 무게의 증가에 의한 것임을 확인하였다.
도 23 및 도 24에 나타난 바와 같이, Teduglutide를 투여한 군에서는 소장 무게에 큰 변화가 없었다. 이에 반해, 본 발명의 지속형 펩타이드인 HU003K7FA를 주 1회 투여한 경우, Vehicle 대비 소장 무게가 14.6 %, 또는 28.0 % 증가했으며, 주 2회 투여 시, 33.9 % 증가하였다.
7-3. 소장 길이 변화 확인
본 발명의 지속형 펩타이드 투여에 따른 소장의 길이 변화를 측정하였다.
표 12 및 도 25에 나타난 바와 같이, Teduglutide 투여군(G3)에서는 소장의 길이 및 무게가 거의 증가하지 않았지만, HU003K7FA 투여군(G5 내지 G7)에서는 Vehicle 대비 소장 길이가 약 10 % 정도 유의미하게 증가하는 경향을 보였다. 한편, Teduglutide + Liraglutide 투여군(G4)은 소장 길이는 증가시키지만, 소장 무게는 오히려 감소시켜 단장 증후군의 치료에 적합하지 않음을 확인하였다.
Figure PCTKR2023000110-appb-img-000009
7-4. 소장에서의 단백질 및 DNA 함량 비교 결과 확인
본 발명의 지속형 펩타이드 투여에 따른 소장의 DNA 및 단백질 함량 증가를 평가하였다.
도 26 및 도 27에 나타난 바와 같이, Duodenum(십이지장)의 경우 Vehicle 대비 HU003K7FA를 3.5 mg/kg 주 2회 투여한 군에서 DNA 및 Protein량이 증가하는 것을 확인하였다.
한편, Jejunum(공장)의 경우 Vehicle 대비 Teduglutide를 투여한 군에서는 단백질 및 DNA가 오히려 감소했지만, HU003K7FA를 투여한 군에서 Vehicle 투여군 대비 DNA 및 Protein량이 월등히 증가하는 것을 확인하였다.
7-5. 소장의 조직병리학적 분석 결과 확인
본 발명의 지속형 펩타이드 투여에 따른 장 조직 형성 효과를 확인하기 위하여, 소장의 조직병리학적 변화를 평가하였다.
먼저, 도 28에 나타난 바와 같이, H&E 염색을 통해 십이지장, 공장 및 대장을 포함하는 조직을 염색하였다. 도 28의 결과를 바탕으로 도 29 및 도 30의 조직병리학적 분석을 수행하였다.
도 29에 나타난 바와 같이, Duodenum(십이지장)의 경우 융모 높이(villus height)가 Vehicle 대비 Teduglutide는 6.2 % 가량 증가했으며, HU003K7FA의 총 용량을 14 mg/week로 투여했을 때, 주 2회 제형(G7)은 16.1 %, 1회 제형(G6)은 14.5 % 증가하였다.
도 30에 나타난 바와 같이, Jejunum(공장)의 경우 융모 높이가 Vehicle 대비 Teduglutide는 18.3 % 가량 증가했으며, HU003K7FA의 총 용량을 14 mg/week로 투여했을 때, 주 2회 제형(G7)은 31.4 %, 1회 제형(G6)은 42.6 %만큼 크게 증가하였다.
이는 본 발명의 HU003K7FA가 양성 대조군 대비 강력한 장 조직 형성 촉진 효과를 가짐을 나타내는 결과이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 지방산-펩타이드 유도체는 기존 약물 대비 생체 내 우수한 효력 지속 효과를 가지고, 단장증후군 동물 모델에서 우수한 치료 효과를 나타내는바, 장질환, 장손상, 및 위질환의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (16)

  1. 하기 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드에 지방산이 결합된 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로서,
    상기 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드는 N 말단, C 말단, 또는 그 중간 사슬에 지방산이 결합된 것을 특징으로 하는, 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
    [일반식]
    서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열-Kn
    (상기 일반식에서, K는 라이신(Lysine)이며, n은 1 내지 10의 정수이다.)
  2. 제1항에 있어서,
    상기 지방산은 C12 내지 C22의 포화 지방산 또는 불포화 지방산인 것을 특징으로 하는, 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 n은 2 내지 9의 정수인 것을 특징으로 하는, 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 지방산은 C 말단에 결합되는 것을 특징으로 하는, 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 일반식으로 표시되는 폴리펩타이드는 서열번호 2 또는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 지방산-펩타이드 유도체는 생체 내 반감기(t1/2)가 2시간 이상인 것을 특징으로 하는, 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  7. 제1항의 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 장질환, 장손상, 및 위질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 장질환은 단장증후군, 과민성 장질환, 염증성 장질환, 크론씨병, 결장염, 대장염, 췌장염, 회장염, 점막염 및 장 위축으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 장질환은 단장증후군인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 위질환은 위경련, 위염, 위궤양, 십이지장염, 및 십이지장궤양으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 지방산-펩타이드 유도체는 주 당 0.1 내지 200 mg/kg 투여되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 지방산-펩타이드 유도체는 소장 무게 또는 길이를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  13. 제7항에 있어서,
    상기 지방산-펩타이드 유도체는 융모 높이를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  14. 제1항의 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 장질환, 장손상, 및 위질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환 예방, 치료, 또는 개선 방법.
  15. 제1항의 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 장질환, 장손상, 및 위질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 예방, 치료, 또는 개선 용도.
  16. 제1항의 지방산-펩타이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 장질환, 장손상, 및 위질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 치료용 약제를 제조하기 위한 용도.
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