KR20170078668A

KR20170078668A - 이중 glp-1r 및 glp-2r 작용제 활성을 갖는 조성물 및 펩티드

Info

Publication number: KR20170078668A
Application number: KR1020177011935A
Authority: KR
Inventors: 미스터 쇠렌 융베리 페데르센; 미스터 쇠렌 블로크 반 비텔로스투인; 페르닐레 콩스바크-비스만; 미스터 야코브 옐싱; 닐스 브랑
Original assignee: 구브라 에이피에스
Priority date: 2014-10-31
Filing date: 2015-10-30
Publication date: 2017-07-07
Also published as: CA2965560A1; US20180280480A1; JP2017537894A; EP3212217A1; WO2016066818A1

Abstract

본 발명은 사람의 GLP-1 수용체 및 사람의 GLP-2 수용체에 대한 작용제 활성을 갖는 조성물 및 펩티드, 뿐만 아니라 그 제조 방법 및 용도에 관한 것으로서, 사람의 GLP-1 수용체에 대한 상기 이중 펩티드의 상대 작용제 활성 (GLP-1R_상대)은 적어도 0.01이고, 사람의 GLP-2 수용체에 대한 상기 이중 펩티드의 상대 작용제 활성 (GLP-2R_상대)은 적어도 0.01이며, 또한 (GLP-1R_상대)(GLP-2R_상대)는 적어도 0.01이다. 또한, 본 발명은 상기 펩티드의 지질화 유사체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 사람의 질환, 특히 장 및 뇌 관련 질환 또는 대사 질환, 예컨대 위장관 염증, 짧은 창자 증후군 및 크론병의 치료 또는 예방적 치료에 관한 것이다.

Description

이중 GLP-1R 및 GLP-2R 작용제 활성을 갖는 조성물 및 펩티드{COMPOSITIONS AND PEPTIDES HAVING DUAL GLP-1R AND GLP-2R AGONIST ACTIVITY}

본 발명은 이중 GLP-1R 및 GLP-2R 작용제 활성을 갖는 조성물 및 펩티드, 및 사람 또는 동물 질환, 예컨대 흡수장애 (malabsorption) 및 장 염증 (gut inflammation)을 일으키는 장 질환 (bowel diseases), 예컨대 짧은 창자 증후군 (short bowel syndrome) 및 짧은 창자 질환 (short bowel disease)의 예방 또는 치료에서 그 용도에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명에 따른 조성물 및 이중 GLP1R-GLP2R 작용제 펩티드는 또한 대사증후군 (metabolic syndrome), 비만 (obesity) 및 당뇨병 (diabetes)을 예방 또는 치료하는데 유용하다. 또한, 본 발명은 상기 이중 펩티드를 포함하는 약학적 및 수의학적 조성물, 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

짧은 창자 증후군 (short bowel syndrome: SBS, 또한 Short Gut Syndrome 또는 간단하게 Short Gut라고 함)은 흡수장애 질환이고, 이는 소장의 일부를 수술에 의해 제거하거나 또는 상기 창자의 분절(segment)의 기능이상 (dysfunction)에 의해서 유발될 수 있다. 예를 들면, 크론병 (Crohn's disease), 소화관의 염증 장애, 창자 꼬임 (volvulus), 혈액공급이 차단되어 조직사 (tissue death)를 초래하는 소장의 자연 꼬임 (spontaneous twisting), 소장의 종양, 소장의 상처 또는 외상, 괴사 작은창자큰창자염 (necrotizing enterocolitis) (미숙 신생아 (premature newborn)), 비만을 치료하기 위한 우회술 (bypass surgery), 소장의 질병 및 손상된 부위를 제거하기 위한 수술과 관련된 수술에 의해서 대부분의 장애가 유발된다. 또한, 일부 유아는 선천성 짧은 장차를 가지고 태어난다.

짧은 창자 증후군의 증상들로는 복통, 설사, 체액 상실 (fluid depletion), 체중 손실 및 영양실조를 포함할 수 있다. 짧은 창자 증후군이 있는 환자는 비타민 및 미네랄의 흡수장애에 의해 유발되는 합병증, 예컨대, 비타민 A, D, E, K, B9 (엽산), 및 B12, 칼슘, 마그네슘, 철 및 아연의 결핍증을 가질 수 있다. 이는 빈혈, 과다각화증 (hyperkeratosis)(피부의 각화 (scaling)), 이상 (easy bruising), 근육 연축 (muscle spasms), 불량한 혈액 응고 (poor blood clotting), 및 뼈 통증 (bone pain)으로 나타날 수 있다.

짧은 창자 증후군은 이식을 제외하면 치료 방법에 없다. 그러나, 몇가지 GLP-2 유사체가 SBS의 치료를 위해서 제시되었다.

글루카곤-유사 펩티드-2 (Glucagon-like peptide-2: GLP-2 또는 GLP2)는 창자 장내분비 세포 (intestinal enteroendocrine cells)에 의해서 생성되는 33-아미노산 프로글루카곤-유래 펩티드 (33-amino acid proglucagon-derived peptide)이다. 네이티브 GLP-2는 서열 H-HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD-OH 를 갖는다. 글루카곤-유사 펩티드-1 (glucagon-like peptide-1: GLP-1 또는 GLP1) 및 글루카곤 자체와 같이, GCG 유전자에 의해서 인코딩되는 상기 프로글루카곤 펩티드로부터 유래된다. GLP-2는 창자 성장을 자극하고, 장세포의 아포프토시스 (enterocyte apoptosis)를 감소시킨다. 더욱이, GLP-2는 전체 비경구 영양 (parenteral nutrition)으로부터 기인하는 창자 형성저하증 (intestinal hypoplasia)을 방지한다. GLP-2R인, G 단백질-결합된 수용체 상과 구성원 (G protein-coupled receptor superfamily member)이 상기 장에서 발현되고, 상기 글루카곤 수용체 (glucagon receptor: GCGR)및 GLP-1에 대한 수용체 (GLP-1R)와 밀접한 관련이 있다. GLP-2는 상기 GLP-2R에 대한 자연 작용제이다. 순환 (circulation)에서, DPP-IV에 의한 빠른 분해에 의해서 GLP-2는 수 분의 반감기를 갖는다. NPS Pharmaceuticals 및 Nycomed (Takeda)에 의해서 개발된 제제인 테두글루티드 (teduglutide)인, 글루카곤-유사 펩티드-2 유사체가 미국 및 유럽에서 짧은 창자 질환의 치료에서 사용이 승인되었고, 상표명 Gattex/Revestive로 시판되었다. 테두글루티드는 DPP-IV 내성 GLP-2 유사체이고, 향상된 약물력학 특성을 나타내었다.

또한, GLP-1이 창자 성장에 긍정적인 영향을 미친다는 것이 제안되었다. 상기 제시된 작용 기작이 이해되지 않았음에도 불구하고, GLP-1은 위 운동성 및 분비를 억제하는 것이 제안되었고, 이는 긍정적인 효과를 미칠 수 있다.

펩티드 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1 또는 GLP1)의 주요 형태는 GLP-1(7-37)-OH 및 GLP-1(7-36)-NH₂ 이다. 상기는 프로글루카곤으로부터 선택적 절단 (selective cleavage)으로부터 기인한다. 활성 GLP-1이 식사 후에 창자내 L-세포로부터 분비된다. GLP-1은 인슐린 분비의 글루코스-의존성 자극을 유도하면서 글루카곤 분비를 억제하는 강력한 항고혈당성 호르몬 (antihyperglycemic hormone)이다. 네이티브 GLP-1은 서열 H-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKG-OH 를 갖는다. 순환에서, DPP-IV에 의한 빠른 분해에 의해서 GLP-1이 수 분의 반감기를 갖는다. GLP1 수용체 (GLP-1R)는 다른 장소들 중, 식욕 조절에 관여하는 뇌에서 발현된다. 약학에서 GLP-1의 사용은 포유류에서 음식 섭취를 감소시켜서, 결과적으로 체중을 감소시킬 수 있다는 것이 잘 알려져 있다. 리라글루티드 (Liraglutide)는 2형 당뇨병을 치료하기 위해서 Novo Nordisk에 의해서 개발된 지속성 (long-acting) 글루카곤-유사 펩티드-1 작용제 (GLP-1 작용제)이다. 리라글루티드가 Victoza라는 브랜드명 (brand name)으로 시판된다.

그러므로, GLP-1 및 GLP-2 둘 다는 몇 가지 장 및 뇌 관련 질환에 관여하는 것으로 사료된다.

본 발명의 목적은 GLP-1 및 GLP-2 수용체 활성을 제공하는 펩티드 유사체의 동시 투여를 사용하여 조합 치료 제공의 효과를 조사하는 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 사람 또는 동물 질환의 치료, 특히 장 및/또는 뇌 관련 질환의 치료에 사용하기 위한 이중 GLP-1 및 GLP-2 수용체 활성을 제공하는 조성물의 적합성을 조사하는데 있다. 특히, 본 발명의 목적은 장 및 뇌 관련 질환의 향상된 치료, 특히 짧은 창자 질환에 관련된 상태의 치료를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 조합된 (이중) GLP-1 및 GLP-2 수용체 활성을 갖는 단일 펩티드를 제공하는데 있다.

WO2013/164484에서는 상기 GLP-1 및 GLP-2 수용체 모두에서 활성을 갖는 특정 GLP-2 유사체를 개시하였다. 그러나, 상기 GLP-1 및 GLP-2 수용체에 대한 상기 수용체 활성은 본 발명에 따른 이중 작용제 펩티드라고 생각하기에는 충분하지 않았다. WO2013/164484의 표 2에서 명백한 바와 같이, 본 발명에서 정의된 바와 같이 최대 이중 활성을 갖는 펩티드는, 0.03 미만의 상대 GLP-1R 활성 및 1/3의 상대 GLP-2R 활성을 갖는 "화합물 11"이다. 그러므로, 화합물 11의 (GLP-1R_상대)(GLP-2R_상대)는 0.01 미만이다.

본 발명의 부가의 목적은 사람 또는 동물 질환의 치료, 특히 장 및/또는 뇌 관련 질환의 치료, 특히 짧은 창자 질환과 관련된 상태의 치료에 사용하기 위한, 상기 GLP-1 및 GLP-2 수용체에 대한 이중 활성을 갖는 펩티드의 적합성을 조사하는데 있다.

본 발명은 이중 GLP-1 및 GLP-2 수용체 활성을 제공하는 조성물이 사람 또는 동물 질환의 치료, 특히 장 및/또는 뇌 관련 질환의 치료에 사용하기에 적당하다는 놀라운 발견에 기반한다.

본 출원의 실험 부분에서 볼 수 있는 바와 같이, GLP-1 및 GLP-2 유사체에 의한 조합된 치료는 놀랍게도 다른 치료 그룹과 비교하여, 마우스 (mice) 및 래트 (rats)에서 사료 섭취에 있어서 감소 효과를 제공함과 동시에 장 중량 또는 부피에서 현저하고 상승작용하는 증가를 나타내었다.

또한, 본 발명은 상기 GLP-1 및 GLP-2 수용체 둘 다에 대한 이중 작용제 기능을 갖는 펩티드 유사체의 놀라운 동정 및 개발에 기반한다.

또한, 본 발명은 특정 장 및 뇌 관련 질환의 치료에서 상기 이중 작용제의 증가된 효능의 놀라운 발견에 기반한다.

따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 사람의 GLP-1 수용체에 대한 작용제 활성을 제공하는 제1 펩티드 또는 그 지질화 유사체 (lipidated analog) 및 사람의 GLP-2 수용체에 대한 작용제 활성을 제공하는 제2 펩티드 또는 그 지질화 유사체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 상기 사람의 GLP-1 수용체에 대한 상기 펩티드의 상대 작용제 활성 (GLP-1R_상대)은 적어도 0.01이고, 상기 사람의 GLP-2 수용체에 대한 상기 펩티드의 상대 작용제 활성 (GLP-2R_상대)은 적어도 0.01이며, 또한 (GLP-1R_상대)(GLP-2R_상대)는 적어도 0.01이고, 장 증식 (gut proliferation)의 유도에 사용하기 위한 것이다.

부가의 양태에서, 본 발명은 사람의 GLP-1 수용체에 대한 작용제 활성을 제공하는 제1 펩티드 또는 그 지질화 유사체 및 사람의 GLP-2 수용체에 대한 작용제 활성을 제공하는 제2 펩티드 또는 그 지질화 유사체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 상기 사람의 GLP-1 수용체에 대한 상기 펩티드의 상대 작용제 활성 (GLP-1R_상대)은 적어도 0.01이고, 상기 사람의 GLP-2 수용체에 대한 상기 펩티드의 상대 작용제 활성 (GLP-2R_상대)은 적어도 0.01이며, 또한 상기 펩티드는 (GLP-2R_상대)>(GLP-1R_상대)를 제공한다.

본 발명의 매우 바람직한 양태에서, 상기 "제1" 펩티드 및 상기 "제2" 펩티드로 상기에 나타낸 펩티드들은 동일한 펩티드이다.

따라서, 매우 바람직한 양태에서, 본 발명은 사람의 GLP-1 수용체 및 사람의 GLP-2 수용체에 대한 작용제 활성을 갖는 이중 펩티드, 그 약학적 허용가능한 염, 용매화물 또는 지질화 유사체에 관한 것으로서, 상기 사람의 GLP-1 수용체에 대한 상기 이중 펩티드의 상대 작용제 활성 (GLP-1R_상대)은 적어도 0.01이고, 상기 사람의 GLP-2 수용체에 대한 상기 이중 펩티드의 상대 작용제 활성 (GLP-2R_상 _대)은 적어도 0.01이며, 또한 (GLP-1R_상대)(GLP-2R_상대)는 적어도 0.01이다.

부가의 양태에서, 본 발명은 사람 또는 동물 피험체의 치료를 위한 상기 조성물 및 이중 펩티드의 용도에 관한 것이다. 그 부가의 양태에서, 본 발명은 사람 또는 동물 피험체에서 짧은 창자 질환의 치료를 위한 상기 조성물 및 이중 펩티드의 용도에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 서열번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 서열번호: 1의 아미노산 서열로부터 2 이하의 변이 (deviations)를 갖는 지질화 펩티드 유사체에 관한 것이다;

상기에서, X₂는 Gly, Ala, Aib (2-아미노이소부티르산) 또는 Sar (N-메틸 글리신)이고; X₅는 Thr 또는 Ser이며; X₇은 Thr 또는 Ser이고; X₈은 Thr, Asp, Ser 또는 Glu이며; X₉는 Asp 또는 Glu이고; X₁₀은 Leu, Nle (노르루신), Met, Val 또는 Tyr이며; X₁₂는 Thr, Ser 또는 Ala이고; X₁₄는 Leu, Nle (노르루신), Met 또는 Val이며; X₁₅는 Asp 또는 Glu이고; X₁₆은 Ala, Asn, Gln, Gly, Ser, Glu, Asp, Arg 또는 Lys이며; X₁₉는 Ala, Val 또는 Leu이고; X₂₀은 Arg, Lys 또는 His이며; X₂₁은 Asp 또는 Glu이고; X₂₄는 Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Lys 또는 Arg이며; X₂₇은 Ile, Leu, Val, Lys, Arg 또는 Nle (노르루신)이고; X₂₈은 Gln, Asn, Lys 또는 Arg이며; X₂₉는 Thr, Ser, Lys 또는 Arg이고; X₃₀은 Lys 또는 Arg이며; X₃₁은 Ile이거나 또는 부재하고; X₃₂는 Thr이거나 또는 부재하며; X₃₃은 Asp이거나 또는 부재한다.

부가의 양태에서, 본 발명은 사람 또는 동물 피험체의 치료를 위한 상기 펩티드의 용도에 관한 것이다. 부가의 양태에서, 본 발명은 사람 또는 동물 피험체에서 장 및 뇌 관련 질환의 치료를 위한 상기 펩티드의 용도에 관한 것이다. 부가의 양태에서, 본 발명은 사람 또는 동물 피험체에서 짧은 창자 질환의 치료를 위한 상기 펩티드의 용도에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 이중 작용제 펩티드 및 적어도 하나의 약학적 또는 수의학적 부형제를 포함하는 약학적 또는 수의학적 조성물에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 뿐만 아니라 본 발명에 따른 펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

정의

본 발명의 문맥에서, "펩티드 (peptide)"는 펩티드 (아미드) 결합에 의해서 연결된 아미노산 모노머의 사슬 ("잔기 (residues)"라고 명함)을 의미한다. 본 발명에 따른 펩티드는 상기 펩티드의 각 말단에 N-말단 및 C-말단 아미노산 잔기를 갖는다. 상기 N-말단 아미노산 잔기는 바람직하게 수소, 메틸, 아세틸, 포르밀, 벤조일, 트리플루오로아세틸 중에서 선택된 R₁-기를 포함하고, 상기 C-말단 아미노산 잔기는 바람직하게 NH₂ 또는 OH인 R₂ 기를 포함한다. 본 발명에 따르면, 용어 "펩티드 (peptide)"는 아미노산 모노머의 사슬(들)의 약학적 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함한다.

본 발명의 문맥에서, "사람의 GLP-1 수용체에 대한 작용제 활성 (agonist activity towards the human GLP-1 receptor)"은 상기 GLP-1 수용체를 활성화하는 능력을 의미하고, 이는 예를 들어 하기 실험 부분에서 서술되어진 바와 같이, 적당한 인 비트로 (in vitro) 분석에 의해서 결정된다.

본 발명의 문맥에서, "사람의 GLP-1 수용체에 대한 상기 이중 펩티드의 상대 작용제 활성 (relative agonist activity of the dual peptide towards the human GLP-1 receptor" (GLP-1R_상대)은, 동일한 조건하에 측정되는 네이티브 GLP-1의 EC₅₀-농도로 측정되는 해당하는 활성과 비교하여, 관련 화합물 또는 이중 펩티드의 EC₅₀-농도로 측정되는 상기 GLP-1 수용체에 대한 상대 활성의 측정이다. 상기 EC₅₀ 값은 특정 분석에서 최대 활성의 반을 달성하기 위해서 필요로 하는 농도의 측정이다. 펩티드가 특정 수용체 (예컨대, GLP-1R)에서 참조 펩티드의 EC₅₀ 보다 더 낮은 EC₅₀을 갖는다면 (동일한 분석에서), 상기 펩티드는 상기 수용체에서 상기 참조 펩티드보다 더 높은 효능을 갖는다. 예로서, 상기 네이티브 GLP-1 (참조)이 적당한 분석에서 0.01 nM의 EC₅₀을 제공하고, 또한 상기 이중 펩티드가 동일한 조건하에서 0.02 nM의 EC₅₀을 제공한다면, 상기 이중 펩티드의 상대 활성 (GLP-1R_상대)은 0.01nM/0.02nM = 0.5 또는 50%이다.

본 발명의 문맥에서, "사람의 GLP-2 수용체에 대한 작용제 활성 (agonist activity towards the human GLP-2 receptor)"은 상기 GLP-2 수용체를 활성화하는 능력을 의미하고, 이는 예를 들어 하기 실험 부분에서 서술되어진 바와 같이, 적당한 인 비트로 GLP-1 분석에 의해서 결정된다.

본 발명의 문맥에서, "사람의 GLP-2 수용체에 대한 상기 이중 펩티드의 상대 작용제 활성 (relative agonist activity of the dual peptide towards the human GLP-2 receptor" (GLP-2R_상대)은, 동일한 조건하에 측정되는 네이티브 GLP-2의 EC₅₀-농도로 측정되는 해당하는 활성과 비교하여, 관련 화합물 또는 이중 펩티드의 EC₅₀-농도로 측정되는 GLP-2 수용체에 대한 상대 활성의 측정이다. 예로서, 상기 네이티브 GLP-2가 적당한 분석에서 0.01 nM의 EC₅₀을 제공하고, 또한 상기 이중 펩티드가 동일한 조건하에서 0.10 nM의 EC₅₀을 제공한다면, 상기 이중 펩티드의 상대 활성 (GLP-1R_상대)은 0.01nM/0.10nM = 0.1 또는 10%이다.

본 발명의 문맥에서, "치료 (treatment)"는 피험체에서 발생하거나 또는 발생할 가능성이 있는 하나 이상의 원하지 않는 상태(들)의 의학적 치료 및 예방적 치료를 포함하는 것으로 의도된다. 상기에서와 같이, 상기 원하지 않는 상태는 치료를 임상적으로 필요로 하는 질병 또는 상태로서 임상적으로 분류되거나 또는 분류가능할 필요는 없다. 원하지 않는 상태로 고통받는 피험체는 바람직하게 포유류이다. 더 바람직하게, 원하지 않는 상태로 고통받는 피험체는 인간이다.

본 발명의 문맥에서, "혈청 알부민 결합 아미노산 (Serum albumin binding amino acid)"은 상기 아미노산 주사슬에 혈청 알부민 결합 곁사슬을 부착시킴으로써 변형되어진 천연 또는 비천연 아미노산과 같은 아미노산을 의미한다. 상기 아미노산 주사슬에 혈청 알부민 결합 곁사슬의 부착을 또한 "지질화 (lipidation)"라고 부를 수 있다.

본 발명의 문맥에서, "혈청 알부민 결합 곁사슬 (Serum albumin binding side chain)"은 아미노산에 부착된 곁사슬 (잔기)을 의미하고, 상기 곁사슬은 혈청 알부민에 결합할 수 있는 관능기로 이루어지거나 또는 이를 포함한다. 상기 곁사슬이 알부민 결합 바이오코어 분석 (albumin binding biocore assay)에서 비지질화 펩티드와 비교하여 증가된 결합 친화도를 나타낸다면 본 발명에 따른 혈청 알부민에 관능기가 결합될 수 있다. 알부민 결합의 결정을 위한 방법의 다른 예로는 US 20110275559 A1에 개시된 바와 같이 고정된 알부민을 갖는 미세적정 플레이트 (microtiter plate)를 사용하여 효소-결합 면역흡착 분석 (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)을 사용하여 상기 펩티드의 결합을 측정하는 것이다. 높은 알부민 친화도를 갖는 유도체를 동정하기 위한 대안이지만 간접적인 방법은, 저농도의 알부민에서 결합과 비교하여, 고농도의 알부민이 상기 분석에 존재할 때, 상기 결합 용량-반응 곡선 (binding dose-response curve)이 오른쪽으로 이동한 상기 유사체를 선택하는 것이다 (Lau et al. 2015, Journal of Medicinal Chemistry 58 (18): 7370- 7380). 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 혈청 알부민 결합 곁사슬은 지질 (lipid) 분자 (지질화 아미노산 (lipidated amino acid)이라 함), 콜레스테롤 분자 또는 시알산 (sialic acid) 분자를 포함한다.

본 발명의 문맥에서, "지질화 유사체 (lipidated analog)"는 하기 청구범위에서 정의된 바와 같은 서열을 갖는 펩티드의 유사체를 의미한다. 본 발명에 따른 유사체는, 상기 서열 (청구범위에서 정의된 바와 같음)이 하나 또는 그 이상, 바람직하게 단 하나의, 혈청 알부민 결합 아미노산 잔기(들) 및 하나 또는 그 이상의 혈청 알부민 결합 곁사슬(들)의 도입 (예컨대, 치환)에 의해 변경되어지는 (또한 그러므로, 일탈될 수 있는) 유사체이다.

본 발명을 이루는 실험 중에, 상기 GLP-1 및 GLP-2 수용체에 대한 이중 활성을 제공하는 조성물들이, 다른 치료 그룹과 비교하여, 마우스에서 사료 섭취를 감소시키면서, 동시에 장 중량에서 현저하고 상승작용하는 증가를 제공하는 것이 놀랍게도 발견되었다.

그러므로, 상기 조성물들은 특정 사람 또는 동물 질환의 치료, 특히 장 및/또는 뇌 관련 질환의 치료에 사용하기에 적당하다고 결론지었다.

또한, 상기 GLP-1 수용체 및 상기 GLP-2 수용체 둘 다에 대한 활성을 갖는 이중 펩티드 작용제를 개발할 수 있다는 것이 놀랍게도 발견되었다.

따라서, 본 발명은, 장 증식의 유도에 사용하기 위한, 이중 GLP-1 및 GLP-2 수용체 활성 또는 그 지질화 유사체를 갖는 조성물 및 펩티드에 관한 것으로서, 사람의 GLP-1 수용체에 대한 상대 작용제 활성 (GLP-1R_상대)은 적어도 0.01이고, 사람의 GLP-2 수용체에 대한 상기 화합물의 상대 작용제 활성 (GLP-2R_상대)은 적어도 0.01이며, 또한 (GLP-1R_상대)(GLP-2R_상대)는 적어도 0.01이다.

또한, 본 발명은 사람의 GLP-1 수용체에 대한 작용제 활성을 제공하는 제1 펩티드 또는 그 지질화 유사체 및 사람의 GLP-2 수용체에 대한 작용제 활성을 제공하는 제2 펩티드 또는 그 지질화 유사체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 상기 사람의 GLP-1 수용체에 대한 상기 펩티드의 상대 작용제 활성 (GLP-1R_상대)은 적어도 0.01이고, 상기 사람의 GLP-2 수용체에 대한 상기 펩티드의 상대 작용제 활성 (GLP-2R_상대)은 적어도 0.01이며, 또한 상기 펩티드는 (GLP-2R_상대)>(GLP-1R_상대)를 제공한다. 그 바람직한 양태에서, 상기 제1 펩티드 및 제2 펩티드는 GLP-1 작용 화합물 및 GLP-2 작용 화합물 둘 다인 동일한 (이중) 펩티드이다.

그 바람직한 양태에서, 상기 조성물에서 상기 GLP-2 작용 화합물은 적어도 0.1, 바람직하게 적어도 0.2, 더 바람직하게 적어도 0.3, 더욱 바람직하게 적어도 1인 GLP-2R_상대를 갖는다.

더 바람직한 양태에서, 상기 조성물 중 상기 화합물들은, (GLP-1R_상대)(GLP-2R_상대)가 적어도 0.02, 바람직하게 적어도 0.03, 더 바람직하게 적어도 0.2, 더욱 바람직하게 적어도 0.5인, 상대 활성을 갖는다.

그 더욱 바람직한 양태에서, 상기 조성물 중 상기 화합물들은, (GLP-2R_상대)>(GLP-1R_상대), 바람직하게 (GLP-2R_상대)>2(GLP-1R_상대), 더욱 바람직하게 (GLP-2R_상대)>10(GLP-1R_상대)인, 상대 활성을 갖는다.

상기 GLP-1 유사체인 리라글루티드는 0.1의 상대 GLP-1 활성을 갖는다. 상기 GLP-2 유사체인 테두글루티드는 ≥ 1.0의 상대 GLP-2 활성을 갖는다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 사람의 GLP-1 수용체 및 사람의 GLP-2 수용체에 대한 이중 작용제 활성을 갖는 펩티드에 관한 것으로서, 상기 사람의 GLP-1 수용체에 대한 상기 이중 펩티드의 상대 작용제 활성 (GLP-1R_상대)은 적어도 0.01이고, 상기 사람의 GLP-2 수용체에 대한 상기 이중 펩티드의 상대 작용제 활성 (GLP-2R_상대)은 적어도 0.01이며, 또한 (GLP-1R_상대)(GLP-2R_상대)는 적어도 0.01이다. 또한, 본 발명은 상기 펩티드의 지질화 유사체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 그 약학적 허용가능한 염 및 용매화물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 상기 펩티드, 또는 그 약학적 허용가능한 염 또는 용매화물의 이중 활성은 사람의 GLP-1 수용체 및 사람의 GLP-2 수용체에 대한 활성이고, 상기 사람의 GLP-1 수용체에 대한 상기 이중 펩티드의 상대 작용제 활성 (GLP-1R_상대)는 적어도 0.01이고, 상기 사람의 GLP-2 수용체에 대한 상기 이중 펩티드의 상대 작용제 활성 (GLP-2R_상대)은 적어도 0.01이며, 또한 (GLP-1R_상대)(GLP-2R_상대)는 적어도 0.01이다.

상기 GLP-1R에 대한 네이티브 GLP-1의 EC₅₀은 (대부분의 분석에서) 상기 GLP-2R에 대한 네이티브 GLP-2의 EC₅₀보다 더 적다. 그러므로, 본 발명의 특정 양태에서, 상대적으로 높은 GLP-2 활성을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 양태에서, GLP-2R_상대는 적어도 0.1이다. 본 발명의 더 바람직한 양태에서, GLP-2R_상대는 적어도 0.2이다. 본 발명의 더욱 바람직한 양태에서, GLP-2R_상대는 적어도 0.3이다. 본 발명의 더욱 더 바람직한 양태에서, GLP-2R_상대는 적어도 1.0이다.

또한, 본 발명에 따른 상기 펩티드는 실제 이중 활성을 갖는, 즉 상기 조합된 활성은 가능한 높은 것이 바람직하다. 그러므로, 본 발명의 바람직한 양태에서, (GLP-1R_상대)(GLP-2R_상대)는 적어도 0.02이다. 본 발명의 더 바람직한 양태에서, (GLP-1R_상대)(GLP-2R_상 _대)는 적어도 0.03이다. 본 발명의 더욱 바람직한 양태에서, (GLP-1R_상대)(GLP-2R_상 _대)는 적어도 0.2이다. 본 발명의 더욱 더 바람직한 양태에서, (GLP-1R_상대)(GLP-2R_상 _대)는 적어도 0.5이다.

본 발명의 상응하는 바람직한 양태에서, (GLP-2R_상대) > (GLP-1R_상대)이다. 본 발명의 더 바람직한 양태에서, (GLP-2R_상대) > 2(GLP-1R_상대)이다. 본 발명의 더욱 바람직한 양태에서, (GLP-2R_상대) > 10(GLP-1R_상대)이다.

또한, 본 발명은 서열번호: 1에 따른 펩티드 서열을 포함하는 펩티드 또는 서열번호: 1의 아미노산 서열로부터 2 이하의 변이를 갖는 그 지질화 펩티드 유사체, 또는 그 약학적 허용가능한 염 또는 용매화물에 관한 것이다;

상기에서,

X₂는 Gly, Ala, Aib (2-아미노이소부티르산), Sar (N-메틸 글리신)이고;

X₅는 Thr, Ser이며;

X₇은 Thr, Ser이고;

X₈은 Thr, Asp, Ser, Glu이며;

X₉는 Asp, Glu이고;

X₁₀은 Leu, Nle (노르루신), Met, Val, Tyr이며;

X₁₂는 Thr, Ser, Ala이고;

X₁₄는 Leu, Nle (노르루신), Met, Val이며;

X₁₅는 Asp, Glu이고;

X₁₆은 Ala, Asn, Gln, Gly, Ser, Glu, Asp, Arg, Lys이며;

X₁₉는 Ala, Val, Leu이고;

X₂₀은 Arg, Lys, His이며;

X₂₁은 Asp, Glu이고;

X₂₄는 Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Lys, Arg이며;

X₂₇은 Ile, Leu, Val, Lys, Arg, Nle (노르루신)이고;

X₂₈은 Gln, Asn, Lys, Arg이며;

X₂₉는 Thr, Ser, Lys, Arg이고;

X₃₀은 Lys, Arg이며;

X₃₁은 Ile이거나 또는 부재하고;

X₃₂는 Thr이거나 또는 부재하며;

X₃₃은 Asp이거나 또는 부재한다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 상기 펩티드는 상기 N-말단 잔기에 R¹ 기 및 상기 C-말단 잔기에 R² 기를 포함하고, 상기 R¹ 기는 수소, 메틸, 아세틸, 포르밀, 벤조일 또는 트리플루오로아세틸이고, 상기 R² 기는 NH₂ 또는 OH이다.

본 발명의 바람직한 양태에서, X₇은 Thr이고, X₉는 Glu이며, X₁₉는 Ala이다.

그러므로, 본 발명의 바람직한 양태에서, 상기 펩티드는 서열번호: 2에 따른 펩티드 서열 또는 그 지질화 펩티드 유사체를 포함하거나 또는 이로 이루어진다;

상기에서

X₈은 Thr, Asp, Ser, Glu이고;

X₁₀은 Leu, Nle (노르루신), Met, Val, Tyr이며;

X₁₆은 Ala, Asn, Gln, Gly, Ser, Glu, Asp, Arg, Lys이고;

X₂₄는 Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Lys, Arg이며;

X₃₁은 Ile이거나 또는 부재하고;

X₃₂는 Thr이거나 또는 부재하며;

X₃₃은 Asp이거나 또는 부재하고;

상기에서, R¹은 수소, 메틸, 아세틸, 포르밀, 벤조일, 트리플루오로아세틸이고, R²는 NH₂ 또는 OH이다.

본 발명의 바람직한 양태에서, X₈은 Asp 또는 Ser이다. 더욱 바람직한 양태에서, X₈은 Ser이다.

본 발명의 바람직한 양태에서, X₁₀은 Leu 또는 Nle (노르루신)이다.

본 발명의 바람직한 양태에서, X₁₆은 Ala 또는 Asn이다.

본 발명의 바람직한 양태에서, X₂₄는 Ala 또는 Asn이다.

본 발명의 바람직한 양태에서, X₃₁, X₃₂, 및 X₃₃은 Ile, Thr, 및 Asp이다.

본 발명의 다른 바람직한 양태에서, X₃₁, X₃₂, 및 X₃₃은 부재한다.

본 발명의 가장 바람직한 양태들 중 하나에서, 상기 펩티드가 하기 중에서 선택된다

본 발명의 더 바람직한 양태에서, 상기 펩티드가 서열번호: 3-7의 펩티드들 중 선택된다.

본 발명의 더 바람직한 양태에서, 상기 펩티드는 서열번호: 3의 펩티드 또는 그 펩티드의 지질화 유사체이다.

본 발명의 더 바람직한 양태에서, 상기 펩티드는 서열번호: 6의 펩티드 또는 그 펩티드의 지질화 유사체이다.

본 발명의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 펩티드는 하나 또는 그 이상, 바람직하게 단 하나의, 혈청 알부민 결합 곁사슬(들)을 포함한다. 바람직하게, 상기 혈청 알부민 결합 곁사슬이 아미노산 잔기의 상기 곁사슬, 예컨대 리신의 곁사슬 (즉, ε-N-알킬화 리신), 2,3-디아미노프로피온산, 2,4-디아미노부티르산, 오르니틴 (ornithine), O-아미노프로필세린 또는 1차 아미노기를 포함하는 더 긴 O-알킬화 세린의 곁사슬에 부착된다.

바람직하게, 상기 혈청 알부민 결합 아미노산 잔기가 치환으로서 서열번호: 1의 서열로 삽입되어서, 서열번호: 1의 서열의 상기 아미노산 서열이 (가능하게) 변경된다 (서열번호: 1의 서열로부터 "변이"로 본 발명에 따라 이해됨). 상기 도입된 변이는 GLP-1 및 GLP-2 수용체 활성에 있어서 상기 펩티드의 특성에 영향을 줄 수 있지만, 그러나 본 발명의 범위로부터 상기 수득된 혈청 알부민 결합 펩티드를 벗어나지 않는다. 당분야의 통상의 지식을 가진 자라면, 하나 이상의 혈청 알부민 결합 곁사슬의 도입으로 GLP-1 및/또는 GLP-2 수용체 활성에서 (가능한) 감소에 대해서 인 비보 (in vivo)에서 연장된 반감기의 가능성을 제공하는 것을 이해한다.

상기 혈청 알부민 결합 아미노산 잔기는 혈청 알부민 결합 곁사슬을 포함한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 혈청 알부민 결합 곁사슬은 지질 분자를 포함하는 곁사슬이다. 광의의 용어로, 본 발명에 따른 혈청 알부민 결합 곁사슬을 포함하는 상기 아미노산 잔기는 지질화 아미노산 잔기이다.

하나의 구현예에서, 상기 혈청 알부민 결합 곁사슬은 적어도 14개의 탄소 원자를 갖는 알킬 사슬을 포함하고, 상기 알킬 사슬은 말단 (distal) 카르복실산 또는 말단 테트라졸기를 포함하며, 상기 알킬 사슬은 근접한 (proximal) 카르보닐기를 포함한다.

하나의 구현예에서, 상기 혈청 알부민 결합 곁사슬은 구조 A를 포함하고, 상기에서 A는 하기 중 선택된다

상기에서, a는 적어도 10이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 혈청 알부민 결합 곁사슬이 A-B-C-, A-B- 및 A-C-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기에서 A는

이고,

상기에서, a는 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17 및 18로 이루어진 군으로부터 선택되고, 또한

B가 하기로부터 선택된다

상기에서, b가 0, 1, 및 2로 이루어진 군으로부터 선택되고, c가 0, 1 및 2로 이루어진 군으로부터 선택되며, 또한 d가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된다.

C는 스페이서 분자 (spacer molecule), 예컨대 적어도 하나의 D, E, S, T, K, R, G, A, 오르니틴, 시트룰린 (Citrulline), 8-아미노-3,6-디옥사옥타노산 또는 12-아미노-4,7,10-트리옥사옥타데카노산 분자이다.

본 발명에 따른 혈청 알부민 결합 곁사슬이 예컨대 WO2011058165에 개시되었다.

A-B-C-의 예는 하기와 같다:

A-B-의 예는 하기와 같다:

A-C-의 예는 하기와 같다:

하나의 구현예에서, 상기 혈청 알부민 결합 곁사슬은 적어도 하나의 디카르복실산, 예컨대, 헥사데칸디오산, 옥타데칸디오산 또는 도데칸디오산을 포함한다.

매우 바람직한 구현예에서, 상기 혈청 알부민 결합 곁사슬은 리신 잔기에 부착된 구조 A-B로 이루어진다.

상기 구현예의 매우 바람직한 예가 하기에 개시되고, 여기에서 A는

이고, 또한

B는 리신 잔기에 부착된

이다.

매우 바람직한 아미노산 곁사슬 (K(C16-γE-)라고 함)이 하기에 개시된다:

상기 디카르복실산의 말단에서 음전하는 혈청 알부민에 대한 상기 펩티드의 친화도를 증가시키는 것으로 사료된다. 하나의 구현예에서, 상기 지방 이산 (fatty di-acid) 또는 테트라졸이 스페이서 (spacer), 예컨대 음전하를 띤 아미노산, 예컨대, L-감마-글루타메이트에 부착될 수 있다. 하나의 구현예에서, 임의로 디카르복실산 또는 테트라졸기를 포함하는 알킬 사슬이 스페이서에 부착될 수 있다. 하나의 구현예에서, 임의로 디카르복실산 또는 테트라졸기를 포함하는 조합된 알킬 사슬 및 상기 음전하를 띤 아미노산이 스페이서에 의해서 분리될 수 있다.

바람직한 양태에서, 본 발명은 상기 열거된 서열번호: 1-18의 지질화 펩티드 유사체를 포함하고, 상기 지질화 펩티드는 적어도 하나의 지질화 아미노산 잔기를 포함한다. 바람직하게, 상기 지질화 펩티드는 상기 펩티드의 상기 수용체 활성에서 상기 지질화의 영향을 최소화하기 위해서 단 하나의 지질화 아미노산 잔기를 포함한다.

서열번호: 6을 갖는 펩티드에 기반하는, 실시예에서 볼 수 있는 바와 같이, 위치들 X₇, X₈, X₁₁, X₁₂, X₁₄, X₁₆, X₁₇, X₂₀ 에서 혈청 알부민 결합 곁사슬의 도입으로 관능성 펩티드 (functional peptides)를 제공하는 것이 개시되었다.

따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 펩티드는, 위치들 X₇, X₈, X₁₁, X₁₂, X₁₄, X₁₆, X₁₇ 및 X₂₀ 중 선택된 위치에서 아미노산 잔기에 도입된 지질화를 포함하는, 서열번호: 1의 펩티드의 지질화 유사체이다.

본 발명의 더 바람직한 구현예에서, 상기 펩티드는, 위치들 X₁₁, X₁₂, X₁₄, X₁₆, X₁₇ 및 X₂₀ 중 선택된 위치에서 아미노산 잔기를 지질화 혈청 알부민 결합 아미노산 잔기로 치환시킴으로써 도입된 지질화를 포함하는, 서열번호: 1의 펩티드의 지질화 유사체이다.

본 발명의 더 바람직한 구현예에서, 상기 펩티드는, 위치들 X₁₂, X₁₄, X₁₆ 및 X₁₇ 중 선택된 위치에서 아미노산 잔기에 도입된 지질화를 포함하는, 서열번호: 1의 펩티드의 지질화 유사체이다.

본 발명의 더 바람직한 구현예에서, 상기 펩티드는 서열번호: 1의 펩티드의 지질화 유사체이고, 상기 지질화가 위치 X₁₄ 또는 X₁₇에서 상기 아미노산 잔기에 도입된다.

본 발명의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 펩티드는, 위치들 X₇, X₈, X₁₁, X₁₂, X₁₄, X₁₆, X₁₇ 및 X₂₀ 중 선택된 위치에서 아미노산 잔기에 도입된 지질화를 포함하는, 서열번호: 6의 펩티드의 지질화 유사체이다.

본 발명의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 펩티드는, 위치들 X₁₁, X₁₂, X₁₄, X₁₆, X₁₇ 및 X₂₀ 중 선택된 위치에서 아미노산 잔기에 도입된 지질화를 포함하는, 서열번호: 6의 펩티드의 지질화 유사체이다.

본 발명의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 펩티드는, 위치들 X₁₂, X₁₄, X₁₆ 및 X₁₇ 중 선택된 위치에서 아미노산 잔기에 도입된 지질화를 포함하는, 서열번호: 6의 펩티드의 지질화 유사체이다.

본 발명의 매우 바람직한 구현예에서, 상기 펩티드는 서열번호: 6의 펩티드의 지질화 유사체이고, 상기 지질화가 위치 X₁₄ 또는 X₁₇에서 상기 아미노산 잔기에 도입된다.

특히, 서열번호: 6의 상기 펩티드의 매우 바람직한 지질화 유사체가 하기 서열번호들 중 선택된다:

서열번호: 6의 상기 펩티드의 하나의 특히 매우 바람직한 지질화 유사체는 서열번호: 23을 갖는 펩티드이다.

서열번호: 6의 상기 펩티드의 다른 특히 매우 바람직한 지질화 유사체는 서열번호: 25를 갖는 펩티드이다.

하기의 실험 부분에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 이중 조성물 또는 펩티드가 유익한 약리학적 효과를 제공하는 것이 놀랍게도 관찰되었다. 그러므로, 본 발명은 또한 사람 또는 동물 피험체의 치료 또는 예방적 치료를 위한 본 발명에 따른 상기 이중 펩티드의 용도에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 사람 또는 동물 피험체의 장 및 뇌 관련 질환의 치료 또는 예방적 치료를 위한 본 발명에 따른 상기 이중 조성물 또는 펩티드의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 사람 또는 동물 피험체에서 GLP-1 및 GLP-2 둘 다와 관련된 질환의 치료 또는 예방적 치료를 위한 본 발명에 따른 상기 이중 펩티드의 용도에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 사람 또는 동물 피험체에서 위장관 장애 (gastrointestinal disorders) 뿐만 아니라 위 및 장-관련 장애의 치료 또는 예방적 치료를 위한 본 발명에 따른 상기 이중 GLP1R-GLP2R 작용제 조성물 또는 펩티드의 용도에 관한 것이다. 위장관 장애는 식도의 상부 위장관 (upper gastrointestinal tract)의 장애를 포함한다. 위 및 장-관련 장애는 임의의 병인론 (aetiology)의 궤양 (예컨대, 소화 궤양 (peptic ulcers), 졸링거-엘리슨 증후군 (Zollinger-Ellison syndrome), 약물-유발 궤양, 감염 또는 다른 병원체에 관련된 궤양), 소화 장애 (digestion disorders), 흡수 장애, 짧은 창자 증후군, 컬-드-삭 증후군 (cul-de-sac syndrome), 염증성 창자 질환 (inflammatory bowel diseases) (크론병 및 궤양 대장염 (ulcerative colitis)), 복강 스프루 (celiac sprue), 저감마글로불린혈증 스프루 (hypogammaglobulinemic sprue), 및 화학요법 및/또는 방사선 요법-유발 점막염 (mucositis) 및 설사를 포함한다.

더욱이, 본 발명에 따른 상기 이중 조성물 또는 GLP1R-GLP2R 작용제 펩티드가 또한 대사 증후군, 비만, 당뇨병, 비알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis: NASH)을 예방 또는 치료, 및 간, 지방, 췌장, 신장, 장을 포함하는 대사 중요 조직 (metabolically important tissues)에서 염증을 예방 또는 치료하는데 유용하다. 특히, 본 발명에 따른 상기 펩티드는 비알콜성 지방간염 (NASH)의 치료에 효과적인 것으로 사료된다.

또한, 조직 회복의 1차 연료인 글루코스의 가속 합성 (accelerated synthesis)은 수술 후에 중요한 대사 변화이고, 체단백질 (body protein) 및 에너지 저장을 소비하여 발생한다 (Gump et al. 1974, J. Trauma 14: 378-88; Black et al. 1982, Ann. Surg . 196 : 420-35). 이러한 변화는 이전에, 외상에 대한 반응으로 분비되는, 글루코-조절 스트레스 호르몬 (gluco-regulatory stress hormones) 및 다른 이화작용 인자 (catabolic factors), 예컨대 시토킨 (cytokines)에 기인된다. 이화작용 (catabolism)에 대한 변화가 더 클수록, 이환율 (morbidity)이 더 커지고, 환자의 회복은 더 느려진다 (Thorell et al. 1993, Eur . J. Surg . 159: 593-99; Chernow et al. 1987, Arch. Intern. Med . 147: 1273-8). 그러므로, 본 발명에 따른 상기 이중 조성물 및 GLP1R-GLP2R 작용제 펩티드가 또한 수술 외상에 의해서 유발된 이화작용 반응 및 인슐린 내성을 방지함으로써 수술 후에 회복을 향상시킴으로써 수술 외상을 예방 또는 치료하는데 유용하다.

특히, 본 발명에 따른 조성물 및 펩티드는 사람 또는 동물 피험체의 치료 또는 예방적 치료에 사용하기에 적당하고, 상기 치료 또는 예방적 치료는 짧은 창자 증후군에 관련된 상태의 치료 또는 예방적 치료이다.

따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드 및 적어도 하나의 약학적 또는 수의학적 부형제를 포함하는 약학적 또는 수의학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 이중 유사체, 또는 그 염 또는 유도체가 보관 또는 투여를 위해 제조된 약학적 조성물로서 조제될 수 있고, 약학적 허용가능한 담체내에 본 발명의 펩티드, 또는 그 염 또는 유도체의 치료 유효량을 포함한다.

당분야의 통상의 지식을 가진 자라면 펩티드 약제 (peptide pharmaceuticals)를 포함하는 적당한 약학적 제제 또는 조성물을 제공하는데 익숙하다.

또한, 본 발명은 사람 또는 동물 피험체의 의학적 또는 수의학적 치료를 위한 본 발명에 따른 펩티드 또는 조성물의 용도에 관한 것이다.

바람직하게, 본 발명에 따른 약학적 또는 수의학적 조성물은 단위 투여 형태 (unit dosage form)이다.

또한, 본 발명은 사람 또는 동물 피험체의 치료 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 본 발명에 따른 펩티드 또는 조성물을 사람 또는 동물 피험체에 투여하는 단계를 포함한다.

제조 방법:

고상 (solid-phase) 또는 액상 (liquid-phase) 펩티드 합성에 의해서 본 발명의 유사체를 합성하는 것이 바람직하다. 상기 합성은 당분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다.

그러나, 상기 이중 유사체가 다수의 방법으로 합성될 수 있고, 예를 들면 상기 방법은:

(a) 고상 또는 액상 펩티드 합성에 의해서 상기 펩티드를 합성하고, 또한 이와 같이 수득된 상기 합성 펩티드를 회수하는 단계; 또는

(b) 상기 펩티드가 자연 발생되는 아미노산으로 이루어진 경우, 숙주 세포에서 상기 펩티드를 인코딩하는 핵산 구조체 (nucleic acid construct)를 발현시키고, 또한 상기 숙주 세포 배양으로부터 상기 발현 산물을 회수하는 단계; 또는

(c) 상기 펩티드가 자연 발생되는 아미노산으로 이루어진 경우, 상기 펩티드를 인코딩하는 핵산 구조체의 무세포 인 비트로 발현 (cell-free in vitro expression)을 실시하고, 또한 상기 발현 산물을 회수하는 단계; 또는 상기 펩티드의 단편을 수득하기 위해 (a), (b), 및 (c)의 방법들의 조합, 이어서 상기 펩티드를 수득하기 위해서 상기 단편들을 결합 (예컨대, 결찰)하고, 또한 상기 펩티드를 회수하는 단계.

그러므로, 본 발명은 또한 본 발명의 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 핵산 분자의 발현을 제공하고, 또한 이와 같이 생성된 산물을 정제하는 단계를 포함한다.

실시예

실시예 1

펩티드 합성 및 정제

모든 펩티드들이 N-α-아미노 보호기 (protecting group) 및 곁사슬 관능기 (side-chain functionalities)를 위한 적당한 공통 보호기로서 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc)을 사용하는 고상 펩티드 합성에 의해서 합성되었다. 상기 합성이 TentaGel S Ram 수지 (0.1 mmol 스케일; 로딩 (loading) 0.24 mmol/g)를 사용하는 MultiSynTech SyroII (Biotage)에서 수행되었다. 상기 결합 (couplings)이 N,N-디메틸포름아미드 (N,N-dimethylformaide: DMF)에서 결합 시약 (coupling reagent)으로서 N,N '-디이소프로필카르보디이미드 (DIC) 및 첨가제로서 Oxyma Pure를 사용하여 수행되었다. 상기 결합이 실온에서 2 × 2 시간 동안 수행되었다. 각 결합 후에, 상기 수지가 N-메틸피롤리돈(NMP) (2 × 2.5 ml), 디클로로메탄 (2.5 ml) 및 NMP (2 × 2.5 ml)에 의해서 세척되었다. N-α-탈보호 (deprotection)를 위해서, NMP 중 피페리딘 (40%)이 개시 탈보호 (initial deprotection)를 위해서 상기 수지에 첨가되었고 (3분), 그 후에 17분 동안 NMP 중 피페리딘 (20%)을 사용하여 2차 탈보호시켰다. 상기 수지가 NMP (2 × 2.5 ml) 디클로로메탄 (2.5 ml) 및 NMP (2 × 2.5 ml)에 의해 세척되었다. 상기 지질화가 Lys의 ε 아민 상에 부위-선택적으로 부착되었다. 상기 Lys는 Alloc로 보호된 곁사슬이었다. 상기 최종 N-말단 위치한 아미노산 (His)은 Boc로 보호된 N 이었다. 상기 Alloc 기가 실온에서 2시간 동안 탈기된 디클로로메탄 중 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 및 디메틸아민 보란 복합체를 사용하여 제거되었다. DCM, NMP 중 20% 피페리딘 및 NMP에 의해서 광범위하게 세척한 후에, 상기 지질화가 수동 합성 (manual synthesis)을 사용하여 수행되었다. 상기 결합들이 결합 시약으로서 HATU (N-[(디메틸아미노)-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리딘-1-일메틸렌]-N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥시드) 및 염기로서 DIEA를 사용하여 수행되었고, Fmoc 제거가 NMP 중 20% 피페리딘을 사용하여 수행되었다.

고체-지지체 (solid-support)로부터 상기 펩티드 절단 및 아미노산 곁사슬 탈보호를 위해서, 상기 수지가 디클로로메탄을 사용하여 세척되었고, 실온에서 30분 동안 건조되었다. 상기 수지가 트리플루오로아세트산 (TFA)/ 트리에틸실란 (TES) / 물 (95/ 2.5/ 2.5; 2 시간; 실온)에 의해서 처리되었다. 상기 TFA-펩티드 혼합물이 수집되었고, 디에틸에테르가 첨가되어서, 상기 조 펩티드 (crude peptides)의 침전을 유도하였다. 에테르가 원심분리 및 기울여 따르기 (decantation)에 의해서 제거되었다. 30 ml/분으로 35분에 걸쳐서 완충액 A (수 중 0.1% TFA) 중 완충액 B (아세토니트릴 중 0.1% TFA)의 5-60 %의 구배 (gradient)를 사용하여 Gemini-NX, AXIA packed, 5㎛ C-18, 110Å, 30-100 mm 컬럼 및 프랙션 수집기 (fraction collector)를 구비한 Waters 150 LC 시스템을 사용하여, 제조 (preparative) RP-HPLC에 의해서 상기 펩티드가 정제되었다. 정제된 펩티드가, 6분에 걸쳐서 완충액 A (5% 아세토니트릴, 수 중 0.1% 포름산) 중 완충액 B (5% 물, 아세토니트릴 중 0.1% 포름산)의 0-100% 구배를 사용하여, Acquity UPLC BEH C-18 1.7㎛, 2.1-100mm를 구비한 UPLC-ESI-MS (Waters)에 의해서 특성화되었다. 모든 펩티드가 UV로 측정되어서 95% 이상의 순도를 가졌다.

하기 화합물들이 상기 기술을 사용하여 합성되었다.

실시예 2

GLP1 및 GLP2 수용체 효능 분석

인 비트로 관능성 스크린 (functional screens)이 Euroscreen (벨기에) 또는 DiscoveRx (USA)에서 수행되었다. 용량 반응 곡선 (dose response curves)이 참조 화합물로서 네이티브 사람의 GLP-1 및 GLP-2와 병행하여 수행되었다. 예시된 결과가 표 1 및 표 2에 열거되었다.

수용체 효능
화합물	GLP-1R, EC ₅₀ (nM)	GLP-2R, EC ₅₀ (nM)
GLP-1	0.026	>1000
GLP-2	ND	0.45
서열번호: 3	0.28	0.19
서열번호: 4	0.04	1.38
서열번호: 5	2.02	0.29
서열번호: 6	0.16	0.07
서열번호: 7	0.18	2.28
서열번호: 10	0.16	6.53
서열번호: 11	3.99	0.33
서열번호: 13	4.16	0.14
서열번호: 15	0.40	7.93
서열번호: 16	1.79	1.52
서열번호: 17	0.08	7.17
서열번호: 18	0.09	7.06

수용체 효능
화합물	GLP-1R, EC ₅₀ (nM)	GLP-2R, EC ₅₀ (nM)
GLP-1	0.004	>100
GLP-2	nd	0.0227
서열번호: 19	>10	>100
서열번호: 20	>10	9.445
서열번호: 21	>10	4.248
서열번호: 22	0.543	6.610
서열번호: 23	0.169	1.057
서열번호: 24	0.338	5.597
서열번호: 25	0.319	1.928
서열번호: 26	0.658	>100

실시예 3

C57BL /6J 마우스에서 장 증식에 있어서의 효과

PoC 연구 1 - 네이티브 GLP-1 및 GLP-2의 사용

40마리의 암컷 C57BL/6J 마우스가 Janvier (프랑스)로부터 구입되었다. -1일에 기록된 체중에 기반하여, 마우스를 하기 4개의 연구 그룹 (그룹 당 n = 10)으로 무작위로 나눴다: 그룹 1: 부형제, BID, SC. 그룹 2: 네이티브 GLP-1 (GLP-1(7-36)-아미드) 3.0 mg/kg, BID, SC. 그룹 3: 네이티브 GLP-2 3.0 mg/kg, BID, SC. 그룹 4: 네이티브 GLP-1 3.0 mg/kg + 네이티브 GLP-2 3.0 mg/kg, BID, SC. 투여량 부피 (dosing volume)는 5 ml/kg, SC 이었다. 3%의 만니톨 및 0.6%의 L-His (pH 9.0)를 포함하는 PBS 완충액에 화합물들이 용해되었다. 상기 피하 주사 (subcutaneous injections)를 아래 등 (lower back)에 놓았다. 연구 8일째에, 상기 마우스를 끝내고, GI 관이 중량 결정을 위해서 제거되었다. 장 습윤 중량 (gut wet weight)에서 결과가 하기 표 3에 열거되었다.

전체 장 중량 - PoC 1 8일째 (mg ± S.E.M .)
투여량	0 mg /kg	3 mg /kg	3 + 3 mg /kg
부형제	1009 ± 33.5
GLP-1		1090 ± 34.6
GLP-2		1256 ± 30.1***
GLP-1 + GLP-2			1354 ± 21.5 ***, ^#
평균 ± SEM (n=9-10); 부형제와 비교하여 ***P<0.001; (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정) GLP-2와 비교하여 #P<0.05; (Student's t-검정)

결과:

상기 데이터는 네이티브 GLP-2의 7일간의 투여로, 부형제 치료와 비교하여, 장 중량이 대략 25%까지 현저하게 증가될 수 있다는 것을 보여주었다. 놀랍게도, 네이티브 GLP-1과 네이티브 GLP-2의 동시-투여로 장 중량이 대략 34%로 더 증가되었다 (표 3). 동시-치료 이후에 장 중량에서의 부가의 증가가 네이티브 GLP-2 치료 단독인 경우와 비교하여 통계적으로 유의했다 (P=0.015, student's t-검정).

실시예 4

C57BL /6J 마우스에서 급성 사료 섭취에서의 효과

상기 C57BL/6J 마우스가 상기 연구 시작 7일 전에 도착되었다. 상기 기간 동안, 상기 동물들이 실험 패러다임 (experimental paradigm)에 익숙해지도록 상기 동물들을 매일 다루었다. -1일에, 상기 마우스를 하기 약물 치료 그룹 중 하나에 참여시키기 위해서 체중에 따라서 무작위로 나누었다 (각 그룹에서 n = 6-8): 그룹 1: 부형제. 그룹 2: 리라글루티드 0.2 mg/kg. 그룹 3-5: 서열번호: 3; 3.0; 1.0; 0.3 mg/kg. 그룹 6-8: 서열번호: 4; 3.0; 1.0; 0.3 mg/kg. 그룹 9-11: 서열번호: 5; 3.0; 1.0; 0.3 mg/kg. 그룹 12-14: 서열번호: 6; 3.0; 1.0; 0.3 mg/kg. 그룹 15-17: 서열번호: 7; 3.0; 1.0; 0.3 mg/kg. 투여 시작 3일 전에, 모든 동물들을 매일 다루고, 또한 피하 가상 주사 (subcutaneous mock injections)에 의해서 상기 실험 조건에 익숙해지도록 하였다 (즉, 상기 등의 피부를 꼬집음 (nipping)). 기준 사료 섭취 (baseline food intake)가 상기 연구 4일 전에 모니터되었다. -1일의 체중에 따라 마우스를 무작위로 나눴다. 동물들에게 2번 개별로 주사하였다. 제1 급성 투여량이 0일에 라이트 아웃 (lights out) 전에 투여되고, 사료 섭취가 투여후 24 시간 모니터되었다. 3일째에, 마우스를 새로운 치료 그룹으로 다시 무작위로 나누고, 라이트 아웃 전에 투여했다. 사료 섭취가 투여 후 24시간 모니터되었다. -5일로부터 연구 전체에 걸쳐서 체중이 매일 측정되었다. 상기 연구가 5일째에 종료되었다. 상기 유사체들이 3.0; 1.0; 및 0.3 mg/kg 투여량 SC로 투여되고, 리라글루티드가 0.2 mg/kg으로 투여되었다. 투여는 오후에 라이트 아웃 전에 (13:30 내지 14:00 사이) 실시되었다. 투여량이 피하로 투여되었다 (투여량 부피 5 ml/kg). 사료 섭취 데이터가 HM-2 시스템, 디지털 칭량 셀(digital weighing cells)을 사용하는 온라인 컴퓨터화 공급 시스템 (online computerized feeding system)을 사용하여 수집되었다. 사료 섭취 및 체중이 -7일부터 연구 전체를 통해서 측정되었다. 포스페이트 완충액 식염수에 3%의 만니톨 및 0.6%의 L-His를 용해시키고, 상기 pH를 9.0으로 조정함으로써 상기 부형제가 제조되었다. 상기 결과가 하기 표 4에 열거되었다.

전체 사료 섭취 (g/동물) 0일: 0-4.5 시간 (라이트 오프 )
투여량	0 mg /kg	0.2 mg/kg	3 mg /kg	1 mg /kg	0.3 mg/kg
부형제	1.45 ± 0.50
리라글루티드		0.08 ± 0.03 ***
서열번호: 3			0.30 ± 0.08 **	0.66 ± 0.15	0.76 ± 0.37
서열번호: 4			0.25 ± 0.08 **	0.79 ± 0.15	0.93 ± 0.06
서열번호: 5			0.26 ± 0.08 **	0.83 ± 0.18	0.69 ± 0.19
서열번호: 6			0.06 ± 0.03 ***	0.13 ± 0.08 ***	0.33 ± 0.17 **
서열번호: 7			0.28 ± 0.12 **	0.47 ± 0.08 *	1.05 ± 0.41
평균 ± SEM (n=8-10); 부형제와 비교하여, * P<0.05, P<0.01,* P<0.001; (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

결과:

상기 시험된 서열번호: 3-7은, 부형제 치료 대조군과 비교하여, 모든 시험된 투여량에서 4.5 시간 후에 사료 섭취가 감소된 것이 관찰되었다. 또한, 서열번호: 6의 단일 투여량 (0.3-3 mg/kg), 서열번호: 7의 단일 투여량 (1-3 mg/kg), 및 서열번호: 3-5의 단일 투여량 (3 mg/kg)으로, 부형제 치료된 대조군과 비교하여, 4.5 시간 후에 사료 섭취가 현저하게 감소되었다.

그러므로, 상기 결과에서, 4.5 시간 후에 사료 섭취의 가장 효과적인 억제제는 서열번호: 6이고 (표 4), 이는 또한 가장 강력한 이중 작용제 및 가장 강력한 GLP-2 수용체 작용제 (표 1)임을 보여주었다. 또한, 상기 결과는 이중 GLP-1 및 GLP-2 수용체 활성들이 사료 섭취를 감소시키는 것을 나타내었다.

실시예 5

C57BL /6J 마우스에서 장 증식에 있어서 GLP-1 및 GLP-2 펩티드 조합의 효과

일반적인 프로토콜 절차

덴마크의 Taconic으로부터 입수된 40마리 (40, n = 10, 4개의 그룹)의 수컷 C57BL/6J 마우스가 사용되었다. 상기 실험 시에, 상기 마우스는 9-10 주령에 도달되었다. 상기 마우스를 그들의 새로운 환경에서 1주일 동안 적응시켰고, 규칙적 식사 (regular chow diet) (Altromin 1324, Brogaarden A/S, 덴마크) 및 국내 품질 수돗물 (domestic quality tap water)이 제공되었다. 상기 연구하는 동안, 광-, 온도-, 및 습도-조절된 방에서 (12시간 명; 12-시간 암 사이클, 4AM/4PM에 라이트 온/오프; 22±1 ℃; 50±10% 상대 습도) 케이지 (cage) 당 2마리씩 동물들이 수용되었다. 마우스들을 -1일에 기록된 체중에 기반하여 4개의 연구 그룹으로 무작위로 나눴다. 모든 마우스는 도착하자마자 이식용 마이크로칩 (implantable microchips) (Pet ID Microchip, E-vet)에 의해서 독특하게 확인되었다. HM02Lab 소프트웨어 (Ellegaard Systems, Faaborg, 덴마크)를 구동하는 노트북에 연결된 WS-2 웨이트 스테이션 (weight station) (MBrose ApS, Faaborg, 덴마크)을 사용하여 동물들이 확인되었다. 상기 HM02Lab 소프트웨어는 상기 체중을 ID와 매칭시키고, 상기 체중에 기반하여 직접 투여량이 산출되었다. 상기 동물들을 취급 및 주사에 길들이기 위해서 상기 실험 전 3일 동안 모든 마우스를 다루었다.

PoC 연구 2 - 공지된 GLP-1 유사체 리라글루티드 및 GLP-2 유사체 테두글루 티드의 사용

상기 마우스를 -1일에 기록된 체중에 기반하여 3개의 연구 그룹들 (그룹 당 n = 10)로 무작위로 나눴다. 상기 그룹은 하기와 같다: 그룹 1: 부형제, BID, SC. 그룹 2: 리라글루티드 0.2 mg/kg, BID, SC. 그룹 3: 테두글루티드 1.0 mg/kg, BID, SC. 그룹 4: 리라글루티드 0.2 mg/kg 및 테두글루티드 1.0 mg/kg, BID, SC. 투여량 부피는 5 ml/kg, SC. 3%의 만니톨 및 0.6%의 L-His를 포함하는 PBS 완충액 (pH 7.4)에 화합물들을 용해시켜서, 0.6 mg/ml의 최종 농도로 수득되었다. 1 ml의 시린지 (luer-lock™, Becton)에 연결된 27 g x 5/8" 바늘 (Monoject™, Kendall)로 동물들에게 투여되었다. 상기 피하 주사를 상기 아래 등에 놓았다. 연구 8일 째에, 상기 마우스를 끝내고, GI 관이 중량 결정을 위해서 제거되었다. 장 습윤 중량에서 결과가 하기 표 5에 열거되었다. 소장 중량 (표 6) 및 대장 중량 (표 7)에서 결과가 하기에 열거되었다. 소장 길이 (표 8) 및 대장 길이 (표 9)에서 결과가 하기에 열거되었다.

장 습윤 중량 - PoC 연구 2 8일째 (g ± S.E.M.)
그룹 1: 부형제	2.2 ± 0.2 ^###
그룹 2: 리라글루티드, 0.2 mg/kg (BID)	3.2 ± 0.3 *** ^###
그룹 3: 테두글루티드, 1.0 mg/kg (BID)	2.6 ± 0.2 * ^###
그룹 4: 테두글루티드, 1.0 mg/kg + 리라글루티드, 0.2 mg/kg (BID)	4.0 ± 0.4 ***
평균 ± SEM (n=9-10); 부형제와 비교하여, P<0.05,* P<0.01,*** P<0.001; 그룹 4와 비교하여, ^#P<0.05,^## P<0.01,^### P<0.001; (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

소장 중량 - PoC 연구 2 8일째 (g ± S.E.M.)
그룹 1: 부형제	1.1 ± 0.2 ^###
그룹 2: 리라글루티드, 0.2 mg/kg (BID)	1.5 ± 0.3 ** ^###
그룹 3: 테두글루티드, 1.0 mg/kg (BID)	1.3 ± 0.2 ^###
그룹 4: 테두글루티드, 1.0 mg/kg + 리라글루티드, 0.2 mg/kg (BID)	2.0 ± 0.2 ***
평균 ± SEM (n=9-10); 부형제와 비교하여, * P<0.05, P<0.01,* P<0.001; 그룹 4와 비교하여, ^# P<0.05,^## P<0.01,^### P<0.001; (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

대장 중량 - PoC 연구 2 8일째 (g ± S.E.M.)
그룹 1: 부형제	0.30 ± 0.04 ^##
그룹 2: 리라글루티드, 0.2 mg/kg (BID)	0.30 ± 0.01 ^##
그룹 3: 테두글루티드, 1.0 mg/kg (BID)	0.26 ± 0.03 ^###
그룹 4: 테두글루티드, 1.0 mg/kg + 리라글루티드, 0.2 mg/kg (BID)	0.46 ± 0.12 **
평균 ± SEM (n=9-10); 부형제와 비교하여, * P<0.05, P<0.01,* P<0.001; 그룹 4와 비교하여, ^# P<0.05,^## P<0.01,^### P<0.001; (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

소장 길이 - PoC 연구 2 8일째 (cm ± S.E.M.)
그룹 1: 부형제	20.5 ± 1.6 ^###
그룹 2: 리라글루티드, 0.2 mg/kg (BID)	24.2 ± 1.5 ***
그룹 3: 테두글루티드, 1.0 mg/kg (BID)	22.9 ± 1.6 ** ^#
그룹 4: 테두글루티드, 1.0 mg/kg + 리라글루티드, 0.2 mg/kg (BID)	24.8 ± 1.4 ***
평균 ± SEM (n=9-10); 부형제와 비교하여, * P<0.05, P<0.01,* P<0.001; 그룹 4와 비교하여, ^# P<0.05,^## P<0.01,^### P<0.001; (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

대장 길이 - PoC 연구 2 8일째 (cm ± S.E.M.)
그룹 1: 부형제	5.2 ± 0.6 ^##
그룹 2: 리라글루티드, 0.2 mg/kg (BID)	5.9 ± 0.4
그룹 3: 테두글루티드, 1.0 mg/kg (BID)	5.1 ± 0.6 ^##
그룹 4: 테두글루티드, 1.0 mg/kg + 리라글루티드, 0.2 mg/kg (BID)	6.1 ± 0.7 **
평균 ± SEM (n=9-10); 부형제와 비교하여, * P<0.05, P<0.01,* P<0.001; 그룹 4와 비교하여, ^# P<0.05,^## P<0.01,^### P<0.001; (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

결과:

상기 데이터는 GLP-1 유사체 리라글루티드에 의한 치료에 의해서 장 습윤 중량 (표 5), 소장 중량 (표 6), 소장 길이 (표 8) 및 대장 길이 (표 9)가 증가되었음을 보여주었다. 또한, 상기 GLP-2 유사체 테두글루티드에 의한 치료에 의해서 장 습윤 중량 (표 5), 소장 중량 (표 6) 및 소장 길이 (표 8)가 증가되었음을 보여주었다.

그러나, 놀랍게도 상기 GLP-1 유사체 리라글루티드 및 상기 GLP-2 유사체 테두글루티드에 의한 조합 치료에 의해서 장 습윤 중량 (표 5), 소장 중량 (표 6) 및 대장 중량 (표 7) 뿐만 아니라 대장 길이 (표 9)에 있어서 상승작용 효과가 초래되었다는 것을 보여주었다.

실시예 6

GLP1R - GLP2R 이중 작용제 화합물 연구

상기 마우스를 -1일에 기록된 체중에 기반하여 3개의 연구 그룹 (그룹 당 n = 10)으로 무작위로 나눴다. 상기 그룹은 하기와 같다: 그룹 1: 부형제, BID, SC. 그룹 2: 테두글루티드 3.0 mg/kg, BID, SC. 그룹 3: 서열번호: 3, 3.0 mg/kg, BID, SC. 그룹 4: 서열번호: 6, 3.0 mg/kg, BID, SC. 투여량 부피는 5 ml/kg, SC 이었다. 3%의 만니톨 및 0.6%의 L-His를 포함하는 PBS 완충액에 화합물들을 용해시켜서, 0.6 mg/ml의 최종 농도로 수득되고, pH는 9.0으로 조정되었다. 1 ml의 시린지 (luer-lock™, Becton)에 연결된 27 g x 5/8" 바늘 (Monoject™, Kendall)로 동물들에게 투여되었다. 상기 피하 주사를 아래 등에 놓았다. 누적 사료 섭취량에 대한 결과가 하기 표 10에 열거되었다.

누적 사료 섭취량 - GLP1R - GLP2R 이중 작용제 화합물 연구 0-7일 (g ± S.E.M.)
그룹 1: 부형제	30.04 ± 1.23
그룹 2: 테두글루티드, 3.0 mg/kg (BID)	31.82 ± 6.52
그룹 3: 서열번호: 3, 3.0 mg/kg (BID)	26.03 ± 2.49 *
그룹 4: 서열번호: 6, 3.0 mg/kg (BID)	21.96 ± 1.46 ***
평균 ± SEM (n=10); 부형제와 비교하여, * P<0.05, P<0.01,* P<0.001; (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

결과:

7일 동안 매일 2회 투여된 서열번호: 3 및 서열번호: 6은, 부형제 및 테두글루티드 치료된 대조군과 비교하여, 누적 사료 섭취량이 상당히 감소되었다.

실시예 7

7일째에, 경구 글루코스 내성 시험 (oral glucose tolerance test: OGTT)이 수행되었다. 상기 경구 글루코스 로드 4시간 전에 모든 사료를 제거하여서 동물들을 약간 공복 상태에 있도록 하였다. 상기 OGTT 2시간 전에 피하로 (SC) 부형제 (SC) 및 화합물들이 투여되었다. t=0에서, 마우스는 경구 글루코스 로드 (2 g/kg; 4 ml/kg; 500 mg/ml, Fresenius Kabi, 스웨덴)를 받았다. 정확한 투여를 위해서, 시린지에 연결된 위장-삽입 튜브 (gastrically-placed tube)를 통해서 급식으로 글루코스가 제공되었다. 혈중 글루코스가 글루코스 투여 전 및 글루코스 투여 후 t = 15, 30, 60 및 120분에서 꼬리 혈관 혈액으로부터 측정되었다. 혈액 시료 (꼬리 혈관)가 10 ㎕의 헤파린 첨가 유리 모세관 튜브 (heparinized glass capillary tubes)로 수집되고, 완충액 (0.5 ml의 글루코스/락테이트 시스템 용액 (EKF-diagnostics, 독일)) 중에 즉시 현탁시키고, 제조자의 지시에 따라서 BIOSEN c-라인(Line) 글루코스 메터 (glucose meter) (EKF-diagnostics, 독일)를 사용하여 시험일에 글루코스에 대해서 분석되었다. 상기 OGTT로부터의 결과가 하기 표 11에 열거되었다.

경구 글루코스 내성 시험 - GLP1R - GLP2R 이중 작용제 화합물 연구 7일째 AUC, 0-120 분 (mmol/L* min ± S.E.M.)
그룹 1: 부형제	882 ± 109
그룹 2: 테두글루티드, 3.0 mg/kg (BID)	890 ± 182
그룹 3: 서열번호: 3, 3.0 mg/kg (BID)	503 ± 97 *** ^###
그룹 4: 서열번호: 6, 3.0 mg/kg (BID)	523 ± 112 *** ^###
평균 ± SEM (n=10); 부형제와 비교하여, * P<0.05, P<0.01,* P<0.001; 그룹 2와 비교하여, ^# P<0.05,^## P<0.01,^### P<0.001; (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

결과:

7일 동안 매일 2회 투여된 서열번호: 3 및 서열번호: 6은, 부형제 및 테두글루티드 치료된 대조군과 비교하여, 공복시 혈중 글루코스가 상당히 감소되었다.

실시예 8

연구 8일째에, 상기 마우스를 끝내고, 장 습윤 중량을 결정하기 위해서 상기 GI 관이 제거되었다. 상기 장 습윤 중량 결과가 하기 표 12에 열거되었다.

장 습윤 중량 - GLP1R - GLP2R 이중 작용제 화합물 연구 8일째 (g ± S.E.M.)
그룹 1: 부형제	2.2 ± 0.2
그룹 2: 테두글루티드, 3.0 mg/kg (BID)	3.0 ± 0.3 ***
그룹 3: 서열번호: 3, 3.0 mg/kg (BID)	3.3 ± 0.2 *** ^#
그룹 4: 서열번호: 6, 3.0 mg/kg (BID)	3.8 ± 0.3 *** ^###
평균 ± SEM (n=10); 부형제와 비교하여, * P<0.05, P<0.01,* P<0.001; 그룹 2와 비교하여, ^# P<0.05,^## P<0.01,^### P<0.001; (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

결과:

8일 동안 매일 2회 투여된 서열번호: 3 및 서열번호: 6은, 부형제 및 테두글루티드 치료된 대조군과 비교할 때, 장 습윤 중량이 상당히 증가되었다.

실시예 9

식이 유도 비만 (diet induced obese: DIO ) 스프라그 -돌리 래트 (Sprague-Dawley rats)에서 체중 및 장 증식에 있어서 효과

30마리의 수컷 스프라그-돌리 (Sprague-Dawley) 래트 (7주령)가 Taconic (덴마크)으로부터 구입되었고, 상기 Gubra 애니멀 유닛 (animal unit)으로 옮겼다. 순응 기간 동안, 상기 래트가 조절된 온도 조건하에 (22±1 ℃; 50±10% 상대 습도), 12:12 명암 주기 하에 (04:00-16:00 h에 라이트 온) 케이지당 2마리씩 수용되었다. 연구 내내, 상기 래트가 정규-식이 (diet-regular) Altromin 1324 설치류 사료 (rodent chow) (Brogaarden, 덴마크), 및 초콜레이트 스프레드 (Chocolate spread) (Nutella, Ferrero Italy), 피넛 버터 및 파우더 정규식 (powdered regular) Altromin 1324 설치류 사료 (Brogaarden, 덴마크)로 만들어진 페이스트의 2가지 선택 식단으로 자유롭게 접근할 수 있다. 상기 동물들에게 실험 전 65주 동안 상기 식단이 유지되었다. 동물들이 상기 전체 연구 기간 (-6일 내지 25일) 동안 단일 수용되었다.

상기 동물들이 -1일에 기록된 체중에 기반하여 3개의 연구 그룹으로 무작위로 나눠서 하기 그룹들 중 하나에 참여시켰다: 그룹 1: 부형제, SC, BID. 그룹 2: 서열번호: 6, 82 nmol/kg (2-7일), 164 nmol/kg (8-14일) 및 328 nmol/kg (15-25일), SC, BID. 그룹 3: 리라글루티드, 82 nmol/kg, SC, BID. 포스페이트 완충액 식염수 중 3%의 만니톨 및 0.6%의 L-His를 용해시키고, 상기 pH를 9.0으로 조정함으로써 상기 부형제가 제조되었다. 투여는 아침 (06:00에서 08:00 h 사이) 및 오후에 라이트 아웃 전 (13:30에서 14:00 h 사이)에 실시되었다. 투여량 부피 1 ml/kg으로 피하로 투여되었다. 상기 동물들이 취급 및 절차에 순응하도록 실험 전에 모든 래트가 다루어 졌다. 체중이 -3일부터 25일 종료시까지 측정되었다. 총 체지방량 (total body fat mass)이 연구 시작 전 (-1일) 및 종료 전 (연구 25일)에 비침습적 (non-invasive) EchoMRI-900 (EchoMRI, USA)에 의해서 분석되었다. 연구 23일에, 래트들에게 경구 글루코스 내성 시험 (OGTT)이 실시되었다. 상기 경구 글루코스 로드 4시간 전에 모든 사료를 제거하여 상기 동물들을 약간 공복 상태로 만들었다. 부형제 및 화합물들이 상기 OGTT 2시간 전에 피하로 (SC) 투여되었다. t=0에서, 래트들은 경구 글루코스 로드 (2 g/kg; 4 ml/kg; 500 mg/ml, Fresenius Kabi, 스웨덴)를 받았다. 정확한 투여를 위해서 시린지에 연결된 위장-삽입 튜브를 통해서 급식으로 글루코스가 제공되었다. 혈중 글루코스가 글루코스 투여 전 및 글루코스 투여 후에 (t = 15, 30, 60 및 120분) 꼬리 혈관 혈액으로부터 측정되었다. 혈액 시료가 10 ㎕의 헤파린 첨가 유리 모세관 튜브로 수집되고, 완충액 (0.5 ml의 글루코스/락테이트 시스템 용액 (EKF-diagnostics, 독일))에 즉시 현탁시키고, 제조자의 지시에 따라서 BIOSEN c-라인 글루코스 메터 (EKF-diagnostics, 독일)를 사용하여 시험일에 글루코스에 대해 분석되었다. 연구 25일째에, 상기 래트들을 끝내고, 상기 GI 관이 제거되었다. 창자를 식염수로 플러시하고 (flushed), 칭량한 후에, Hansen et al. 2013, Am J Transl Res 5(3) : 347-58에 의해서 개시된 바와 같은 입체학적 방법 (stereological methods)에 의해서 소장 및 대장 부피의 결정을 위해서 4% PFA로 고정시켰다.

체중에서 결과가 하기 표 13에 열거되었다. 전체 체지방량에서의 결과가 표 14에 열거되었고, 상기 OGTT의 결과가 표 15에 열거되었다. 마지막으로, 소장 및 대장 부피에서 결과가 표 16 및 표 17에 제공되었다.

연구 시작에서 체중 (g ± S.E.M .) 0일 및 25일
투여량	0 nmol /kg		82 nmol /kg		328 nmol /kg
	0일	25일	0일	25일	0일	25일
부형제	978.3± 31.3	926.6± 30.3
리라글루티드			984.4± 29.4	801.5± 25.4 **
서열번호: 6					962.7± 27.8	803.9± 35.5 *
평균 ± SEM (n=7-10); 부형제와 비교하여, * P<0.05,** P<0.01 (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

연구 시작에서 전체 체지방량 (g ± S.E.M .) 0일 및 25일
투여량	0 nmol /kg		82 nmol /kg		328 nmol /kg
	-1일	25일	-1일	25일	-1일	25일
부형제	399.5 ± 22.8	369.2 ± 20.9
리라글루티드			392.1 ± 21.6	272.7 ± 18.9 **
서열번호: 6					400.3± 18.3	292.2± 25.4 *
평균 ± SEM (n=7-10); 부형제와 비교하여, * P<0.05,** P<0.01; (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

경구 글루코스 내성 시험 중에 혈중 글루코스. -45분 내지 240분에서 곡선하 면적 ( AUC ) (mmol/Lmin ±* S.E.M .) 23일
투여량	0 nmol /kg	82 nmol /kg	328 nmol /kg
부형제	2845 ± 215.2
리라글루티드		2299 ±161.4
서열번호: 6			1731 ± 77.0 ***
평균 ± SEM (n=7-10); 부형제와 비교하여, *** P<0.001; (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

소장 부피 ( cm ³ ± S.E.M .) 25일
투여량	0 nmol /kg	82 nmol /kg	328 nmol /kg
부형제	4.67 ± 0.48
리라글루티드		5.36 ± 0.48
서열번호: 6			8.50 ± 0.62 ***
평균 ± SEM (n=5); 부형제와 비교하여, *** P<0.001; (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

대장 부피 ( cm ³ ± S.E.M .) 25일
투여량	0 nmol /kg	82 nmol /kg	328 nmol /kg
부형제	2.17 ± 0.15
리라글루티드		2.22 ± 0.21
서열번호: 6			2.64 ± 0.17
평균 ± SEM (n=5); (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

결과:

상기 데이터는, DIO 래트에서 상기 지질화 GLP-1 유사체 리라글루티드에 의한 치료 25일에 체중 및 전체 체지방량에서 현저하게 감소된 것을 보여주었다 (표 13 및 표 14). 상기 이외에, 서열번호: 6에 의한 치료에 의해서도 체중 및 전체 체지방량에서 유사하게 감소된 것을 보여주었고 (표 13 및 표 14), 또한 글루코스 내성이 향상되었다 (표 15). 상기 효과들 이외에, 서열번호: 6에 의한 25일 동안의 치료에 의해서 입체학에 의해서 추정되는 바와 같이 소장 부피에서 현저하게 증가되었다 (표 16). 어떠한 치료도 대장 부피에서 현저한 효과를 갖지 않았다 (표 17).

실시예 10

당뇨병 db/db 마우스에서 혈중 글루코스 , HbA1c 및 장 증식에서의 효과

도착 시에 5주령인, 전체 46마리의 당뇨병 db/db (BKS.Cg-m +/+ Leprdb/J) 수컷 마우스가 Janvier (프랑스)로부터 입수되었다. 상기 마우스가 정상 사료 (Altromin 1324, Brogaarden A/S, Gentofte, 덴마크) 및 국내 품질 수돗물에 자유롭게 접근가능하게 하면서 그들의 새로운 환경에서 2주 동안 순응시켰다. 이들이 광-, 온도-, 및 습도-조절된 방 (12-시간 명: 12-시간 암 사이클, 04:00/16:00 h에서 라이트 온/오프; 22±1 ℃; 50±10% 상대습도)에서 n=2의 그룹으로 수용되었다. 상기 습관화 기간 (habituation period) 중에, 동물들이 실험 패러다임에 익숙해졌다.

상기 당뇨병 상태를 스크린하기 위해서, 연구 시작 전에 2주마다. 기준, 자유 급식 혈중 글루코스 시료가 수득되었다 (혈액이 꼬리 혈관으로부터 수집되었음). -3일에 평균 BG/BW 값에 가장 가까운 40마리의 동물들을 무작위로 4개의 그룹으로 나눴다 (n = 10/그룹; 남은 6마리는 상기 주요 연구로부터 제외되었음): 그룹 1: 부형제, BID, SC. 그룹 2: 서열번호: 6, 50 nmol/kg, BID, SC. 그룹 3: 서열번호: 6, 250 nmol/kg, BID, SC. 그룹 4: 리라글루티드, 50 nmol/kg, BID, SC. 부형제 및 서열번호: 6이 PBS 중 0.6% L-His 및 3% 만니톨 (pH 9.0)에 용해되었고, 리라글루티드가 PBS 중 0.1% BSA (pH 7.4)에 용해되었다. 상기 실험의 0-58일 동안, 06:00-08:00 시간 및 다시 02:00-04:00 시간 사이에 1일 2회 피하로 상기 동물들에게 투여되었다. 투여량 부피는 5 ml/kg이었다.

실험 56일째에, 경구 글루코스 내성 시험이 수행되었다. 글루코스 볼루스 (glucose bolus)의 투여 4시간 전에 사료를 제거하여서 동물들을 약간 공복 상태에 있게 하였다. 상기 OGTT 실시 45분 전에 화합물들이 투여되었다. t=0에서, 마우스들은 2 g/kg 글루코스의 경구 글루코스 로드 (글루코스 200 mg/ml, Fresenius Kabi, 스웨덴)를 받았다. 정확한 투여를 위해서 시린지에 연결된 위장-삽입 튜브를 통해서 급식으로 글루코스가 제공되었다. 혈액 시료가 상기 꼬리 혈관으로부터 수집되었고, 혈중 글루코스가 글루코스 투여 후 -60, 0, 15, 30, 60, 120 및 240분 시점에서 측정되었다. HbA1c를 측정하기 위한 시료가 t= -60분에서 혈중 글루코스와 병행하여 채취되었다. 마우스에게는 마지막 혈액 시료채취 후에 다시 사료가 제공되었다.

연구 기간의 종료 시에, 이소플루란 마취하에 마우스를 참수 (decapitation)에 의해서 끝냈다. 상기 전체 창자가 절개되었고, 소장과 대장으로 나누고, 그 후에 길이가 측정되었다. 창자를 식염수로 플러쉬시키고, 칭량한 후에, (Hansen et al. 2013, Am J Transl Res 5(3):347-58)에 의해서 개시된 바와 같은 입체학적 방법에 의해서 소장 및 대장 부피의 결정을 위해서 4% PFA로 고정시켰다. 또한, 최종 혈액 시료가 채취되고, (Jaisson et al. 2012, Analytical and Bioanalytical Chemistry 402:1635-41)에 의해서 개시된 바와 같이 혈장 시트룰린 (plasma citrulline)에 대해서 측정되었다.

혈중 글루코스 및 HbA1c에 있어서 결과가 하기 표 18 및 표 19에 열거되었다. 상기 OGTT의 결과가 표 20에 제공되었다. 상기 소장 및 대장에서 입체적 부피 및 표면적 추정값이 표 21, 표 22, 표 23 및 표 24에 열거되었다.

혈중 글루코스 , 포만 상태 ( mmol /L ± S.E.M .) 56일
투여량	0 nmol /kg	50 nmol /kg	250 nmol /kg
부형제	15.9 ± 1.8
서열번호: 6		7.2 ± 1.0 ***
서열번호: 6			5.9 ± 0.4 ***
리라글루티드		5.6 ± 0.7 ***
평균 ± SEM (n=8-10); 부형제와 비교하여, *** P<0.001; (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

HbA1c ( % ± S.E.M .) 56일
투여량	0 nmol /kg	50 nmol /kg	250 nmol /kg
부형제	6.2 ± 0.4
서열번호: 6		5.0 ± 0.2 **
서열번호: 6			4.4 ± 0.1 ***
리라글루티드		4.5 ± 0.2 ***
평균 ± SEM (n=8-10); 부형제와 비교하여, P<0.01 및 * P<0.001; (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

경구 글루코스 내성 시험 중에 혈중 글루코스 . -240분에서 240분에 곡선하 면적 ( AUC ). (mmol/Lmin* ± S.E.M.) 56일
투여량	0 nmol /kg	50 nmol /kg	250 nmol /kg
부형제	9172 ± 924
서열번호: 6		3543 ± 469 ***
서열번호: 6			2472 ± 119 ***, ^#
리라글루티드		3123 ± 278 ***
평균 ± SEM (n=8-10); 부형제와 비교하여,*** P<0.001; (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정) 리라글루티드와 비교하여, # P<0.05; (Student's t-검정)

소장 부피 ( mm ³ ± S.E.M .) 58일
투여량	0 nmol /kg	50 nmol /kg	250 nmol /kg
부형제	1177 ± 45.1
서열번호: 6		2097 ± 72.7 ***
서열번호: 6			2043 ± 62.3 ***
리라글루티드		1072 ± 38.1
평균 ± SEM (n=8-10); 부형제와 비교하여, *** P<0.001; (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

대장 부피 ( mm ³ ± S.E.M .) 58일
투여량	0 nmol /kg	50 nmol /kg	250 nmol /kg
부형제	247.5 ± 14.8
서열번호: 6		274.2 ± 7.0
서열번호: 6			288.2 ± 23.7
리라글루티드		232.6 ± 7.0
평균 ± SEM (n=8-10); 부형제와 비교하여, *** P<0.001; (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

소장 표면적 ( cm ² ± S.E.M .) 58일
투여량	0 nmol /kg	50 nmol /kg	250 nmol /kg
부형제	180.7 ± 12.3
서열번호: 6		348.9 ± 10.8 ***
서열번호: 6			344.0 ± 20.8 ***
리라글루티드		144.3 ± 8.4
평균 ± SEM (n=8-10); 부형제와 비교하여, *** P<0.001; (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

대장 표면적 ( cm ² ± S.E.M .) 58일
투여량	0 nmol /kg	50 nmol /kg	250 nmol /kg
부형제	13.4 ± 1.9
서열번호: 6		13.6 ± 1.2
서열번호: 6			18.6 ± 1.9
리라글루티드		14.1 ± 0.7
평균 ± SEM (n=8-10); (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

결과:

상기 데이터는, 리라글루티드에 의한 8주의 치료에 의해서 포만-상태 혈중 글루코스 수준, HbA1c 수준에서 감소 뿐만 아니라 글루코스 내성이 향상되는 것을 보여주었다 (표 18, 19 및 20). 서열번호: 6에 의한 치료에 의해서 또한 포만-상태 혈중 글루코스, HbA1c 수준의 감소 뿐만 아니라 투여량-의존성 방식 (dose dependent manner)에서 글루코스 내성의 향상이 유도되었다. 250 nmol/kg의 서열번호: 6으로 치료된 동물들은, 리라글루티드에 의해서 치료된 동물들과 비교하여, 글루코스 내성이 더욱 향상되었다 (P=0.03, Student's t-검정, 표 20).

또한, 서열번호: 6에 의한 8주 치료에 의해서 소장 부피 뿐만 아니라 표면적에서 현저한 증가가 유도되었고, 또한 여기서 50 nmol/kg의 저용량으로 250 nmol/kg의 고용량과 동일한 효과를 보였다 (표 21 및 23). 대장 부피 또는 표면적에 있어서는 상기 화합물들 중 어느 것으로부터도 현저한 효과를 갖지 않았다 (표 22 및 24).

실시예 11

마른 NMRI 마우스에서 사료 섭취에 있어서 급성 효과

전체 35 마리의 수컷 NMRI 마우스 (도착시, 4 주령, 평균 BW 28.11 g)가 Janvier (프랑스)로부터 입수되었고, HM2 시스템으로 배치되었다. 모든 동물들이 4개의 그룹으로 수용되었다. 상기 동물실 환경이 조절되었다 (표적 범위: 온도 22 ± 2 ℃; 상대 습도 50 ± 10%; 명/암 사이클: 12 시간 명, 12 시간 암, 14:00에서 02:00 시간 라이트 오프). 상기 마우스는 Altromin (Brogaarden, 덴마크) 및 수돗물에 자유롭게 접근가능했다. 마우스가 연구 시작 5일 전에 도착되어서, HM-2 시스템으로 옮겼다. 도착 일로부터, 케이지에 사료가 제공되지 않았고, 그럼으로써 상기 동물들을 사료 채널 (food channels)로부터 먹는 것을 학습시켜서, 상기 동물들을 HM-2 시스템에 더 빠르게 습관화시켰다. 사료 섭취 및 체중이 -3일부터 연구 전체 기간 동안 측정되었다. 사료 섭취 데이터가 HM-2 실시간 사료 섭취 모니터링 시스템 (real-time food intake monitoring system)인, 디지탈 칭량 셀 (digital weighing cells)을 사용하는 온라인 컴퓨터화 공급 시스템 (online computerized feeding system)을 사용하여 수집되었다. 상기 동물들이 마이크로칩으로 독특하게 확인될 때, 각 개별 마우스가 상기 사료 채널로 들어가고 나갈 때 그 해당하는 마이크로칩에 의해서 확인되었다. 상기 HM-2 시스템이 연속적으로 및 실시간 모드로 2개의 독립적 채널로 사료 섭취 활동을 모니터하였고, 사람이 개입하지 않고 선택된 시간 간격내에서 각 동물에 의해서 소비된 사료의 양 및 각 식사의 시작 시간과 종료 시간이 기록되었다. 유효 사료 섭취가 HM-2 조절 유닛 소프트웨어 (HMLab, MBRose, Faaborg, 덴마크)에 의해서 산출되었다. 동물들이 체중 (및 마지막 24 시간까지 평균 누적 사료 섭취)에 따라서 하기 실험 그룹으로 0일에 무작위로 나눴다 (n=8-9): 그룹 1: 부형제 0 nmol/kg s.c. 그룹 2: 리라글루티드 50 nmol/kg s.c. 그룹 3: 서열번호: 23 50 nmol/kg s.c.

제1 및 단독 투여량이 13:30 내지 14:00 사이에서 (라이트 오프 직전) 실험 0일에 투여되었다. 투여량이 아래 등 부위에서 피하로 투여되었다 (투여량 부피 5 ml/kg). 사료 섭취가 동물의 투여 후 최대 68 시간까지 측정되었다. 12, 24 및 60 시간 후에 누적 사료 섭취량을 표 25에서 찾을 수 있다.

단일 투여량의 투여 후에 누적 사료 섭취량 (grams pr mice ± S.E.M .) 투여 후 12, 24 및 60 시간
투여량	0 nmol /kg			50 nmol /kg
	12 h	24 h	60 h	12 h	24 h	60 h
부형제	3.84 ± 0.44	4.61 ± 0.39	12.69 ± 3.08
리라글루티드				1.72 ± 0.20 ***	2.62 ± 0.27 ***	12.83 ± 1.78
서열번호: 23				1.82 ± 0.24 ***	2.83 ± 0.22 ***	11.43 ± 1.97
평균 ± SEM (n=8-9); 부형제와 비교하여, *** P<0.001; (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

결과:

상기 데이터는, 리라글루티드에 의한 치료에 의해서, 마우스에서 50 nmol/kg 의 단일 투여량의 투여 후 최대 24 시간까지 급성 사료 섭취량이 현저하게 감소된 것을 보여주었다 (표 25). 또한, 서열번호: 23의 단일, 동등하게 낮은 용량으로 또한 12시간 및 24시간 후 둘 다에서 마른 NMRI 마우스에서 리라글루티드와 유사한 정도로 급성 사료 섭취량이 현저하게 감소될 수 있음을 보여주었다. 60 시간에서, 리라글루티드는 상기 부형제와 비교하여 사료 섭취에서 차이를 보이지 않았고, 반면에 서열번호: 23은 여전히 효과를 갖는 경향이 있었다.

실시예 12

마른 C57BL /6J 마우스에서 체중에 있어서 하위-급성 효과 (Sub-acute effect)

프랑스 Janvier로부터 입수된 18마리의 수컷 C57/BL6J 마우스가 사용되었다. 실험 시에, 상기 마우스가 9주령에 도달되었다. 상기 마우스를 그들의 새로운 환경에서 1주 동안 순응시켰고, 정규 사료 식사 (Altromin 1324, Brogaarden A/S, 덴마크) 및 국내 품질 수돗물이 제공되었다. 광-, 온도-, 및 습도-조절된 방 (12-시간 명: 12-시간 암 사이클, 4AM/4PM 시간에 라이트 온/오프; 22±1 ℃; 50±10% 상대 습도)에서 연구 중에 케이지당 6마리씩 동물들이 수용되었다.

마우스들이 -3일에 기록된 체중에 기반하여 하기 7개의 연구 그룹으로 무작위로 나눴다: 그룹 1: 부형제, BID, SC, 그룹 2: 서열번호: 23, 50 nmol/kg BID, SC. 투여량 부피는 5 ml/kg, SC 이었다.

상기 화합물들이 pH 7.4의 0.1%의 BSA를 포함하는 PBS 완충액에 용해되었다. 상기 아래 등에 피하로 주사를 놓았다. 취급 및 주사에 상기 동물들을 순응시키기 위해서 실험 3일 전부터 모든 마우스가 다루어 졌다. 체중이 -3일부터 7일까지 측정되었고, 기준 체중에 대한 변화율 (percent change)이 표 26에 개시되었다.

	기준 체중에 대한 체중 변화 ( % ) ( % ± S.E.M .) 0, 2, 5 및 7일
투여량	0 nmol /kg				50 nmol /kg
일수	0	2	5	7	0	2	5	7
부형제	100.0 ± 0.0	97.8 ± 1.2	95.5 ± 1.4	100.0 ± 1.4
서열번호: 23					100.0 ± 0.0	90.7 ± 0.8 ***	89.5 ± 1.8 #	90.8 ± 1.4 ***
평균 ± SEM (n=6); 2일, 부형제와 비교하여, *** P<0.001; 5일 부형제와 비교하여, # P<0.05; (일원 ANOVA w/ Dunnett's post hoc 검정)

상기 데이터는 50 nmol/kg의 서열번호: 23에 의한 치료에 의해서 투여 2일 후에 마른 C57BL/6J 마우스에서 체중이 현저하게 감소된 것을 보여주었다. 상기 체중 손실이 투여하고 최대 7일 동안 지속되었다 (표 26).

SEQUENCE LISTING <110> Gubra Aps <120> COMPOSITIONS AND PEPTIDES HAVING DUAL GLP-1R AND GLP-2R AGONIST ACTIVITY <130> P1025PC00 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(2) <223> Gly, Ala, Aib, Sar <220> <221> PEPTIDE <222> (5)..(5) <223> Thr, Ser <220> <221> PEPTIDE <222> (7)..(7) <223> Thr, Ser <220> <221> PEPTIDE <222> (8)..(8) <223> Thr, Asp, Ser, Glu <220> <221> PEPTIDE <222> (9)..(9) <223> Asp, Glu <220> <221> PEPTIDE <222> (10)..(10) <223> Leu, Nle, Met, Val, Tyr <220> <221> PEPTIDE <222> (12)..(12) <223> Thr, Ser, Ala <220> <221> PEPTIDE <222> (14)..(14) <223> Leu, Nle, Met, Val <220> <221> PEPTIDE <222> (15)..(15) <223> Asp, Glu <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(16) <223> Ala, Asn, Gln, Gly, Ser, Glu, Asp, Arg, Lys <220> <221> PEPTIDE <222> (19)..(19) <223> Ala, Val, Leu <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(20) <223> Arg, Lys, His <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(21) <223> Asp, Glu <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(24) <223> Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Lys, Arg <220> <221> PEPTIDE <222> (27)..(27) <223> Ile, Leu, Val, Lys, Arg, Nle <220> <221> PEPTIDE <222> (28)..(28) <223> Gln, Asn, Lys, Arg <220> <221> PEPTIDE <222> (29)..(29) <223> Thr, Ser, Lys, Arg <220> <221> PEPTIDE <222> (30)..(30) <223> Lys, Arg <220> <221> PEPTIDE <222> (31)..(31) <223> Ile or absent <220> <221> PEPTIDE <222> (32)..(32) <223> Thr or absent <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(33) <223> Asp or absent <400> 1 His Xaa Asp Gly Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Leu Ala Xaa Xaa Xaa Phe Ile Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa <210> 2 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (8)..(8) <223> Thr, Asp, Ser, Glu <220> <221> PEPTIDE <222> (10)..(10) <223> Leu, Nle, Met, Val, Tyr <220> <221> PEPTIDE <222> (16)..(16) <223> Ala, Asn, Gln, Gly, Ser, Glu, Asp, Arg, Lys <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(24) <223> Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Lys, Arg <220> <221> PEPTIDE <222> (31)..(31) <223> Ile or absent <220> <221> PEPTIDE <222> (32)..(32) <223> Thr or absent <220> <221> PEPTIDE <222> (33)..(33) <223> Asp or absent <400> 2 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Xaa Glu Xaa Ser Thr Tyr Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Xaa Trp Leu Ile Gln Thr Lys Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Arg <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 3 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Asp Glu Leu Ser Thr Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Arg 20 25 30 <210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 4 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ser Thr Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Arg 20 25 30 <210> 5 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 5 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Asp Glu Leu Ser Thr Tyr Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Arg <210> 6 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 6 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ser Thr Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Arg <210> 7 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 7 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ser Thr Tyr Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Arg <210> 8 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 8 Arg His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ser Thr Tyr Leu Asp 1 5 10 15 Asn Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Arg 20 25 30 <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 9 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ser Thr Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Arg 20 25 30 <210> 10 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 10 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ser Thr Tyr Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Arg <210> 11 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 11 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Asp Glu Leu Ser Thr Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Arg <210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 12 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Asp Glu Leu Ser Thr Tyr Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Arg 20 25 30 <210> 13 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 13 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Asp Glu Leu Ser Thr Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Arg <210> 14 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 14 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ser Thr Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Arg <210> 15 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (10)..(10) <223> Nle <400> 15 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Asp Glu Xaa Ser Thr Tyr Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Arg 20 25 30 <210> 16 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (10)..(10) <223> Nle <400> 16 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Asp Glu Xaa Ser Thr Tyr Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Arg <210> 17 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (10)..(10) <223> Nle <400> 17 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Ser Glu Xaa Ser Thr Tyr Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Arg <210> 18 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (10)..(10) <223> Nle <400> 18 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Ser Glu Xaa Ser Thr Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp Arg <210> 19 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 19 His Gly Asp Gly Ser Phe Lys Ser Glu Leu Ser Thr Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 20 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 20 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Lys Glu Glu Leu Ser Thr Tyr Leu Asp 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile 20 25 30 Thr Asp <210> 21 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 21 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Lys Thr Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 22 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 22 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ser Lys Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 23 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 23 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ser Thr Tyr Lys Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 24 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 24 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ser Thr Tyr Leu Asp Lys 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 25 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 25 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ser Thr Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Lys Ala Ala Arg Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 26 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 26 His Gly Asp Gly Ser Phe Thr Ser Glu Leu Ser Thr Tyr Leu Asp Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Lys Asp Phe Ile Ala Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp

Claims

사람의 GLP-1 수용체에 대한 작용제 활성 (agonist activity)을 제공하는 제1 펩티드 또는 그 지질화 유사체 (lipidated analog) 및 사람의 GLP-2 수용체에 대한 작용제 활성을 제공하는 제2 펩티드 또는 그 지질화 유사체를 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 사람의 GLP-1 수용체에 대한 상기 펩티드의 상대 작용제 활성 (GLP-1R_상대)은 적어도 0.01이고, 상기 사람의 GLP-2 수용체에 대한 상기 펩티드의 상대 작용제 활성 (GLP-2R_상대)은 적어도 0.01이며, 또한 (GLP-1R_상대)(GLP-2R_상대)는 적어도 0.01이고, 장 증식 (gut proliferation)의 유도에 사용하기 위한 약학적 조성물.
사람의 GLP-1 수용체에 대한 작용제 활성을 제공하는 제1 펩티드 또는 그 지질화 유사체 및 사람의 GLP-2 수용체에 대한 작용제 활성을 제공하는 제2 펩티드 또는 그 지질화 유사체를 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 사람의 GLP-1 수용체에 대한 상기 펩티드의 상대 작용제 활성 (GLP-1R_상대)은 적어도 0.01이고, 상기 사람의 GLP-2 수용체에 대한 상기 펩티드의 상대 작용제 활성 (GLP-2R_상대)은 적어도 0.01이며, 또한 상기 펩티드는 (GLP-2R_상대)>(GLP-1R_상대)를 제공하는 약학적 조성물.
사람의 GLP-1 수용체 및 사람의 GLP-2 수용체에 대한 이중 작용제 활성을 갖는 펩티드, 그 약학적 허용가능한 염, 용매화물 또는 지질화 유사체로서, 상기 사람의 GLP-1 수용체에 대한 상기 이중 펩티드의 상대 작용제 활성 (GLP-1R_상 _대)은 적어도 0.01이고, 상기 사람의 GLP-2 수용체에 대한 상기 이중 펩티드의 상대 작용제 활성 (GLP-2R_상대)은 적어도 0.01이며, 또한 (GLP-1R_상대)(GLP-2R_상대)는 적어도 0.01인 펩티드, 그 약학적 허용가능한 염, 용매화물 또는 지질화 유사체.
청구항 1 또는 2에 따른 조성물, 또는 청구항 3에 따른 펩티드에 있어서, GLP-2R_상대는 적어도 0.1, 바람직하게 적어도 0.2, 더 바람직하게 적어도 0.3, 더 더욱 바람직하게 적어도 1인 것인 조성물 또는 펩티드.
청구항 1 내지 4 중 어느 항에 있어서, (GLP-1R_상대)(GLP-2R_상대)는 적어도 0.02, 바람직하게 적어도 0.03, 더 바람직하게 적어도 0.2, 더 더욱 바람직하게 적어도 0.5인 것인 조성물 또는 펩티드.
청구항 1 내지 5 중 어느 항에 있어서, (GLP-2R_상대)>(GLP-1R_상대)이고, 바람직하게 (GLP-2R_상대)>2(GLP-1R_상대)이며, 더욱 바람직하게 (GLP-2R_상대)>10(GLP-1R_상대)인 것인 조성물 또는 펩티드.
서열번호: 1에 따른 서열을 포함하는 펩티드 또는 서열번호: 1의 아미노산 서열에서 2 이하의 변이 (deviations)를 갖는 지질화 펩티드 유사체, 또는 그 약학적 허용가능한 염 또는 용매화물:

상기에서,
X₂는 Gly, Ala, Aib, Sar이고;
X₅는 Thr, Ser이며;
X₇은 Thr, Ser이고;
X₈은 Thr, Asp, Ser, Glu이며;
X₉는 Asp, Glu이고;
X₁₀은 Leu, Nle, Met, Val, Tyr이며;
X₁₂는 Thr, Ser, Ala이고;
X₁₄는 Leu, Nle, Met, Val이며;
X₁₅는 Asp, Glu이고;
X₁₆은 Ala, Asn, Gln, Gly, Ser, Glu, Asp, Arg, Lys이며;
X₁₉는 Ala, Val, Leu이고;
X₂₀은 Arg, Lys, His이며;
X₂₁은 Asp, Glu이고;
X₂₄는 Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Lys, Arg이며;
X₂₇은 Ile, Leu, Val, Lys, Arg, Nle이고;
X₂₈은 Gln, Asn, Lys, Arg이며;
X₂₉는 Thr, Ser, Lys, Arg이고;
X₃₀은 Lys, Arg이며;
X₃₁은 Ile이거나 또는 부재하고;
X₃₂는 Thr이거나 또는 부재하며;
X₃₃은 Asp이거나 또는 부재한다.
청구항 7에 있어서, X₇은 Thr이고, X₉는 Glu이며, X₁₉는 Ala인 것인 펩티드 또는 지질화 펩티드 유사체.
청구항 8에 있어서, 서열번호: 2에 따른 펩티드 서열을 포함하는 것인 펩티드 또는 지질화 펩티드 유사체:

상기에서,
X₈은 Thr, Asp, Ser, Glu이고;
X₁₀은 Leu, Nle, Met, Val, Tyr이며;
X₁₆은 Ala, Asn, Gln, Gly, Ser, Glu, Asp, Arg, Lys이고;
X₂₄는 Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Lys, Arg이며;
X₃₁은 Ile이거나 또는 부재하고;
X₃₂는 Thr이거나 또는 부재하며;
X₃₃은 Asp이거나 또는 부재하고;
또한, R¹은 수소, 메틸, 아세틸, 포르밀, 벤조일, 트리플루오로아세틸이고, R²는 NH₂ 또는 OH이다.
청구항 7 내지 9 중 어느 항에 있어서, X₈은 Asp 또는 Ser, 바람직하게 Ser이고; X₁₀은 Leu 또는 Nle이며; X₁₆은 Ala 또는 Asn이고; X₂₄는 Ala 또는 Asn이며; 또한, X₃₁, X₃₂, 및 X₃₃은 Ile, Thr 및 Asp이거나, 또는 X₃₁, X₃₂, 및 X₃₃은 부재하는 것인 펩티드 또는 지질화 펩티드 유사체.
청구항 7 내지 10 중 어느 항에 있어서, 상기 펩티드는 하기 중에서 선택되는 것인 펩티드 또는 지질화 펩티드 유사체:
청구항 7 내지 11 중 어느 항에 있어서, 하나의 지질화 아미노산 잔기를 포함하는 것인 지질화 펩티드 유사체.
청구항 12에 있어서, 상기 지질화 아미노산 잔기가 위치 X₇-X₁₉ 중 어느 하나에 존재하는 것인 펩티드.
청구항 13에 있어서, 상기 지질화 아미노산 잔기가 위치 X₁₂, X₁₄, X₁₆ 및 X₁₇ 중 어느 하나에 존재하는 것인 펩티드.
청구항 14에 있어서, 상기 지질화 아미노산 잔기가 위치 X₁₄ 또는 X₁₇ 중 어느 하나에 존재하는 것인 펩티드.
청구항 12 내지 15 중 어느 항에 있어서, 하기 중 선택되는 것인 펩티드:
청구항 16에 있어서, 하기 중 선택되는 것인 펩티드:
청구항 2 내지 17 중 어느 항에 있어서, 사람 또는 동물 피험체의 치료 또는 예방적 치료에 사용하기 위한 것인 조성물 또는 펩티드.
청구항 18에 있어서, 상기 치료 또는 예방적 치료는 장 및 뇌 관련 질환 또는 대사 질환에 관련된 상태, 예컨대 위장관 염증 (gastrointestinal inflammation), 짧은 창자 증후군 (short bowel syndrome) 및 크론병 (Crohn's disease)의 치료 또는 예방적 치료인 것인 조성물 또는 펩티드.
청구항 18 또는 19에 있어서, 상기 치료 또는 예방적 치료는 비-알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis: NASH)의 치료 또는 예방적 치료인 것인 조성물 또는 펩티드.
청구항 18 또는 19에 있어서, 상기 치료 또는 예방적 치료는 수술 외상 (surgical trauma)의 치료 또는 예방적 치료인 것인 조성물 또는 펩티드.
청구항 3 내지 17 중 어느 항에 따른 펩티드 및 적어도 하나의 약학적 또는 수의학적 부형제를 포함하는 약학적 또는 수의학적 조성물.
청구항 3 내지 17 중 어느 항의 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
청구항 3 내지 17 중 어느 항의 펩티드를 제조하는 방법으로서, 청구항 23의 상기 핵산 분자의 발현을 제공하고, 또한 이와 같이 생성된 산물을 정제하는 단계를 포함하는 방법.