WO2022245065A1 - 세포 투과성 펩타이드 및 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체 작용제를 포함하는 복합체 - Google Patents

세포 투과성 펩타이드 및 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체 작용제를 포함하는 복합체 Download PDF

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peptide
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강서희
한송이
서유선
나혜림
하지희
이연주
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    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment

Definitions

  • the present invention relates to a complex comprising a cell-permeable peptide and a glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor agonist, and more particularly, to a cell-permeable peptide and a glucagon-like peptide exhibiting improved cell permeability compared to commercial TAT peptide- 1 It relates to a complex comprising an agent.
  • GLP-1 glucagon-like peptide-1
  • Cell-penetrating peptides also called PTD (protein-transduction domains) and MTS (membrane-translocating sequences)
  • PTD protein-transduction domains
  • MTS membrane-translocating sequences
  • Conventional cell-penetrating peptides are sequences derived from viral proteins such as HIV-1, or derived from proteins expressed by other species such as Drosophila, or characteristic amino acid sequences are selected through amino acid sequence analysis constituting conventional cell-penetrating peptides
  • it since it is an artificially synthesized amino acid sequence, it may cause side effects such as an immune response when applied to the human body.
  • it since it can affect the structure and function of the protein to be delivered, there is a problem in that the efficiency is lowered when connected to the biologically active substance to be delivered into the cell.
  • liraglutide known as an antidiabetic drug
  • liraglutide is a GLP-1 receptor agonist with 97% sequence homology to human GLP-1.
  • Liraglutide is approved and marketed as a once-daily, subcutaneous injection therapy for improving blood sugar control in patients with type 2 diabetes and for weight control in obese patients.
  • TCTP translationally controlled tumor protein
  • an object of the present invention is to provide a complex comprising a cell penetrating peptide consisting of the following amino acid sequence and a GLP-1 receptor agonist:
  • R1 is any one amino acid selected from the group consisting of A, V, I, L, S, F, K and R,
  • R2 is any one amino acid selected from the group consisting of S, L, F, T and Y;
  • R3 is any one amino acid selected from the group consisting of E, L, A and R,
  • R4 is any one amino acid selected from the group consisting of Q, H, T, L, D and R,
  • R5 is any one amino acid selected from the group consisting of L, S, V, A, K and H;
  • R6 is any one dipeptide selected from the group consisting of DK, EK, QK, NK, KK and FK.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing the complex, comprising mixing a cell penetrating peptide having the following amino acid sequence and a Glucagon like peptide-1 receptor agonist:
  • R1 is any one amino acid selected from the group consisting of A, V, I, L, S, F, K and R,
  • R2 is any one amino acid selected from the group consisting of S, L, F, T and Y;
  • R3 is any one amino acid selected from the group consisting of E, L, A and R,
  • R4 is any one amino acid selected from the group consisting of Q, H, T, L, D and R,
  • R5 is any one amino acid selected from the group consisting of L, S, V, A, K and H;
  • R6 is any one dipeptide selected from the group consisting of DK, EK, QK, NK, KK and FK.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes or obesity comprising the complex as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes or obesity consisting of the complex.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes or obesity consisting essentially of the complex.
  • Another object of the present invention is to provide the use of the complex for preparing a formulation for the treatment of diabetes or obesity.
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating diabetes or obesity comprising administering an effective amount of a composition containing the complex as an active ingredient to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a complex comprising a cell penetrating peptide consisting of the following amino acid sequence and a GLP-1 receptor agonist:
  • R1 is any one amino acid selected from the group consisting of A, V, I, L, S, F, K and R,
  • R2 is any one amino acid selected from the group consisting of S, L, F, T and Y;
  • R3 is any one amino acid selected from the group consisting of E, L, A and R,
  • R4 is any one amino acid selected from the group consisting of Q, H, T, L, D and R,
  • R5 is any one amino acid selected from the group consisting of L, S, V, A, K and H;
  • R6 is any one dipeptide selected from the group consisting of DK, EK, QK, NK, KK and FK.
  • the present invention provides a method for preparing the complex, comprising mixing a cell penetrating peptide having the following amino acid sequence and a GLP-1 receptor agonist to provide:
  • R1 is any one amino acid selected from the group consisting of A, V, I, L, S, F, K and R,
  • R2 is any one amino acid selected from the group consisting of S, L, F, T and Y;
  • R3 is any one amino acid selected from the group consisting of E, L, A and R,
  • R4 is any one amino acid selected from the group consisting of Q, H, T, L, D and R,
  • R5 is any one amino acid selected from the group consisting of L, S, V, A, K and H;
  • R6 is any one dipeptide selected from the group consisting of DK, EK, QK, NK, KK and FK.
  • the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes or obesity comprising the complex as an active ingredient.
  • the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes or obesity comprising the complex.
  • the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes or obesity consisting essentially of the complex.
  • the present invention provides the use of the complex for preparing a formulation for the treatment of diabetes or obesity.
  • the present invention provides a method for treating diabetes or obesity comprising administering an effective amount of a composition containing the complex as an active ingredient to a subject in need thereof.
  • range format various aspects or conditions relating to the present invention may be suggested in a range format.
  • the description of a range value is meant to include a corresponding boundary value, that is, to include all values from the lower limit value to the upper limit value unless otherwise specified. It is to be understood that the description of range formats is merely for convenience and brevity and is not to be construed as an inflexible limitation on the scope of the invention. Accordingly, statements of ranges should be considered to have specifically disclosed all possible subranges as well as individual numerical values within the range.
  • a range such as 7 to 170
  • peptide and protein are used according to their usual (conventional) meaning, that is, they refer to an amino acid sequence.
  • a peptide is not limited to a particular length, but in the context of the present invention generally refers to a fragment of a full-length protein and is subject to post-translational modifications such as glycosylation, acetylation, phosphorylation, etc., and others known in the art. It may contain modifications (both naturally occurring and non-naturally occurring modifications) and may be expressed as a 'polypeptide'.
  • the peptides and proteins of the present invention can be prepared using any of a variety of known recombinant and/or synthetic techniques, illustrative examples of which are further described below.
  • the present invention provides a complex comprising a cell-penetrating peptide having the following amino acid sequence and a GLP-1 receptor agonist:
  • R1 is any one amino acid selected from the group consisting of A, V, I, L, S, F, K and R,
  • R2 is any one amino acid selected from the group consisting of S, L, F, T and Y;
  • R3 is any one amino acid selected from the group consisting of E, L, A and R,
  • R4 is any one amino acid selected from the group consisting of Q, H, T, L, D and R,
  • R5 is any one amino acid selected from the group consisting of L, S, V, A, K and H;
  • R6 is any one dipeptide selected from the group consisting of DK, EK, QK, NK, KK and FK.
  • the peptide of the present invention is a novel peptide having cell membrane permeability, which itself has excellent cell membrane permeability and has an excellent effect of delivering a GLP-1 receptor agonist into living tissue.
  • the "cell membrane” means a membrane that builds a boundary between a cell and the outside of the cell.
  • the cell membrane may be a cell membrane of any organism, for example, a unicellular or multicellular organism belonging to bacteria (Bacteria), archaea (Archaea) and eukaryote (Eukarya).
  • the eukaryote may be any organism belonging to Protista, Fungus, Plantae, and Animalia.
  • the animal may be any animal including humans.
  • the "cell membrane” may be a membrane of any type of cell.
  • the "cell” may be selected from the group consisting of epithelial cells, muscle cells, immune cells and endothelial cells, but is not limited thereto.
  • the cells form the lining of an organ in direct contact with the outside of the body, such as endothelium, epithelium, or mucous membrane, or are cells of a cell layer covering the surface of an organ or blood vessel in the body. It can be.
  • the cells include skin epithelial cells, hair follicle epithelial cells, mucosal epithelial cells, corneal epithelial cells, scalp epithelial cells, corneal endothelial cells, and vascular endothelial cells.
  • the mucosal epithelial cells may be at least one mucosal epithelial cell selected from the group consisting of nasal cavity, lung, vagina, rectum, anus, urethra, sublingual, ocular, conjunctival and oral mucosa.
  • the vascular endothelial cells may be endothelial cells of various arteries, veins, and capillaries, including cerebrovascular vessels constituting the blood-brain barrier (BBB), endothelial cells of lymphatic vessels, and endothelial cells of the lining of the heart.
  • the cells may be various cancer cells including cervical cancer, breast cancer, liver cancer, lung cancer, and the like.
  • the cells may be cells having receptors for various substances such as hormones, chemical transmitters in the nervous system, and drugs.
  • insulin receptors, glucagon-like-protein 1 (Glucagon-like- It may be a cell having a protein 1, GLP1) receptor, but the cell is not limited to the above examples.
  • proteases include, for example, achromopeptidase, aminopeptidase, ancrod, angiotensin converting enzyme, bromelain , calpain, calpain I, calpain II, carboxypeptidase A, carboxypeptidase B, carboxypeptidase G G), carboxypeptidase P, carboxypeptidase W, carboxypeptidase Y, caspase 1, caspase 2, caspase caspase 3, caspase 4, caspase 5, caspase 6, caspase 7, caspase 8, caspase 9 (caspase 9), caspase 10 (caspase 10), caspase 11 (caspase 11), caspase 12 (caspase 12), caspase 13 (caspase 13), cathepsin B (cathepsin B),
  • licheniformis protease protease (protease B. licheniformis, alkaline or alcalase), protease from Bacillus polymyxa, Bacillus sp. Protease from Bacillus sp, Rhizopus sp.
  • Protease from Rhizopus sp. protease S, proteasomes, proteinase from Aspergillus oryzae, proteinase 3, Proteinase A, proteinase K, protein C, pyroglutamate aminopeptidase, rennin, streptokinase, sub Examples include subtilisin, thermolysin, thrombin, tissue plasminogen activator, trypsin, tryptase, and urokinase. have. A person skilled in the art can easily determine which proteolytic enzyme is appropriate, taking into account the chemical specificity of the fragment to be produced.
  • the peptides of the present invention can be prepared by any suitable procedure known to those skilled in the art, such as recombinant techniques.
  • the polypeptides of the present invention can be prepared by direct peptide synthesis using solid phase techniques.
  • synthesis can be initiated by attaching functional units, called linkers, to small porous beads to guide the peptide chain.
  • linkers functional units
  • the peptide is covalently bound to the beads and prevents them from being separated by filtration until they are cleaved by a specific reactant, such as trifluoroacetic acid (TFA).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • a protection process in which the N-terminal amine of a peptide attached to a solid phase is combined with an N-protected amino acid unit, a deprotection process, a re-exposed amine group and a new Synthesis is performed by repeating a cycle (deprotection-wash-coupling-wash) of a coupling process in which amino acids are combined.
  • the SPPS method can be performed using microwave technology together, and microwave technology can shorten the time required for coupling and deprotection of each cycle by applying heat in the peptide synthesis process.
  • the thermal energy may prevent folding or aggregation of the extended peptide chain and promote chemical bonding.
  • the peptide of the present invention can be prepared by a liquid phase peptide synthesis method, and the specific method thereof is referred to the following documents: US Patent No. 5,516,891.
  • the peptide of the present invention can be synthesized by various methods such as a method of mixing the solid phase synthesis method and the liquid phase synthesis method, and the preparation method is not limited to the means described herein.
  • Protein synthesis can be performed using manual techniques or by automation. Automated synthesis can be accomplished using, for example, an Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer). Alternatively, various fragments can be chemically synthesized separately and combined using chemical methods to produce the target molecule.
  • the peptide is a D-form or L-form, a peptide composed of only a part of the D-form or L-form sequence, or all of them in the form of a racemate through a conventional peptide synthesis method or preparation method known to those skilled in the art. can be produced and used.
  • other conventional modifications known in the art are possible to increase the stability of the peptide.
  • the peptide may include conventional variants.
  • the variant is one in which an arbitrary change has occurred in the amino acid sequence of the 'peptide', and may include one or more substitutions, deletions, additions and/or insertions.
  • Such variants may be naturally occurring, or may be any of a number of techniques well known in the art, for example, by modifying or altering one or more of the above peptide sequences of the present invention and producing those described herein. It can be produced synthetically by evaluating biological activity.
  • the variant comprises conservative substitutions.
  • a 'conservative substitution' is a substitution in which an amino acid is substituted with another amino acid having similar characteristics, and a person skilled in the art can predict that the secondary structure and hydropathic nature (hydropathic nature, hydrophobic or hydrophilic nature) of the peptide are substantially unchanged. .
  • amino acids exhibit conservative changes: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; and (5) phe, tyr, trp, his.
  • Modifications may be performed within the structure of the peptides of the present invention, yielding functional molecules that encode peptide variants or derivatives having desired (desirable) characteristics. If it is desired to change the amino acid sequence of the peptide in order to prepare an equivalent or improved variant of the peptide of the present invention, one or more codons can be changed based on protein codon information known in the art by those skilled in the art. have.
  • variant peptides may differ from the native sequence by substitutions, deletions or additions of 5 or fewer amino acids.
  • Variants can also be altered, for example by deletion or addition of amino acids that have minimal impact on the secondary structure and hydropathic properties of the peptide.
  • the peptide may include a signal (or leader) sequence at the N-terminus of the protein, and this sequence directs the transfer of the protein simultaneously or after translation.
  • the peptide may also be linked (conjugated) to a linker sequence or other sequence to facilitate synthesis, purification or identification of the peptide (eg polyHis), or to enhance binding of the peptide to a solid support.
  • a chemoselective ligation technique may be used to modify the peptide of the present invention, for example by attaching a polymer in a site-specific and controlled manner. can do.
  • These techniques typically rely on the incorporation of a chemoselective anchor into a protein backbone, either by chemical or recombinant means, and subsequent alteration with a polymer carrying a complementary linker.
  • the assembly process and the covalent structure of the resulting protein-polymer conjugate are controlled, thereby enabling rational optimization of drug properties such as efficacy and pharmacokinetic properties. They improve their pharmacokinetic properties, for example by allowing the optional attachment of PEG.
  • the peptide of the present invention may include a pharmaceutically acceptable salt form.
  • the pharmaceutically acceptable salts include, for example, hydrochloride, sulfate, phosphate, acetate, citrate, tartrate, succinate, lactate, maleate, fumarate, oxalate, methanesulfonate, or p-toluenesulfonate. Examples include, but are not limited to.
  • the peptide may be selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 10, preferably selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 to 5, most preferably the peptide of SEQ ID NO: 3 can
  • peptides consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 10 show excellent cell membrane permeability compared to the permeability of conventional TAT proteins, and the higher the treatment concentration and the longer the treatment time, the greater the intracellular permeability It was found to show a rapid increase.
  • the GLP-1 receptor agonist refers to a peptide or compound that is a variant of GLP-1 (7-37).
  • GLP-1 (7-37) has the sequence HAEGTFTSDV SSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (SEQ ID NO: 12).
  • the "variant” refers to a peptide or compound comprising one or more amino acid substitutions, deletions, additions and/or insertions.
  • the GLP-1 receptor agonist is at least 60%, 65%, 70%, 80% or 90% of GLP-1(7-37) over the entire length of GLP-1(7-37). It may be a peptide or compound exhibiting sequence identity.
  • the GLP-1 receptor agonist may preferably be liraglutide, semaglutide, exenatide, or a combination thereof, most preferably liraglutide. glutide or a salt thereof.
  • the liraglutide is Victoza Or, it is a drug for blood sugar control or adult weight control in adults with type 2 diabetes sold under the brand name Saxenda, and is a GLP-1 receptor agonist used as an adjunct to diet and exercise.
  • Liraglutide is a long-acting analog of naturally occurring human GLP-1 (7-37) in which the lysine at position 34 is replaced by an arginine and a palmitoyl group is attached to the lysine at position 26 via a glutamoyl spacer .
  • the complex provided by the present invention functions as a transmembrane carrier that moves GLP-1 receptor agonists such as liraglutide through the cell membrane.
  • the cell-penetrating peptide is a very small peptide, it is possible to minimize possible biological interference with the GLP-1 receptor agonist.
  • the peptide and GLP-1 receptor agonist conjugate provided by the present invention can be used intravenously, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intradermal, nasal, point It can be delivered in vivo by injection through routes such as mucosal, inhalation, and oral.
  • a complex means that one or more peptides contain one or more GLP-1 receptor agonists.
  • the peptide and the GLP-1 receptor agonist in the "complex" are included in a ratio of 1: 1, 1: multi, multi: 1, multi: multi may have been
  • the peptide and the GLP-1 receptor agonist may be included in a molar ratio of 1:1 to 1:100, or 100:1 to 1:1.
  • the molar ratio is exemplary and is not limited thereto.
  • the complex is formed by simply mixing the peptide and the GLP-1 receptor agonist, by mixing the peptide and the GLP-1 receptor agonist, or by linking or conjugating them by chemical bonds. All inclusive.
  • the complexes may be connected by physical bonds, chemical bonds, covalent bonds, or non-covalent bonds, or may be connected in an integrated or fused form using a mediator.
  • the GLP-1 receptor agonist is a protein
  • the coding sequence of the cell-penetrating peptide is added to the corresponding protein sequence and linked with several linkers, and then penetrates cells in the form of a fusion protein or is used in tissue or blood.
  • the method for forming the complex is not limited.
  • the GLP-1 receptor agonist may be linked to the N-terminus or C-terminus of the peptide.
  • the 'complex' may be a simple mixture of the peptide and the GLP-1 receptor agonist.
  • the "complex" may be a complex formed by mixing the peptide and the GLP-1 receptor agonist.
  • the peptide and the GLP-1 receptor agonist may be dissolved in a buffer solution and mixed at a constant molar ratio, and after mixing, for stabilization, at a constant temperature, for example, at room temperature, or at a refrigerated temperature for a certain period of time, for example, It can be left for 1 second to 1 hour.
  • the temperature and time are exemplary and are not limited thereto.
  • the “complex” may be one in which the peptide and the GLP-1 receptor agonist are linked to each other by a chemical bond.
  • the chemical bond may be a covalent bond or a non-covalent bond.
  • the peptide and the GLP-1 receptor agonist may be bonded through a non-covalent bond, which may be formed by mixing the cell penetrating peptide of the present invention and the GLP-1 receptor agonist in the same solvent.
  • the non-covalent bond may be each of a hydrogen bond, an ionic bond, a van der Waals interaction, or a hydrophobic interaction, or a combination thereof.
  • the chemical bond is formed by a covalent bond
  • a specific functional group or linker may be bonded to the peptide and the GLP-1 receptor agonist, and then chemical bonding may be caused by this.
  • the chemical bond is an amine reaction, a thiol reaction, a carboxylate reaction, a hydroxyl reaction, an aldehyde reaction, a ketone reaction, an acrylate It may be a chemical bond by any one of an Acrylate reaction, an Azide reaction, an Alkyne reaction, a catechol reaction, and a pyrogallol reaction. Not limited.
  • an amine group is connected to one of the cell-permeable peptide and the GLP-1 receptor agonist, and to the other, isothiocyanates, isocyanates, acryl azide ( Acryl azide), NHS (N-hydroxysuccinimide) ester, acyl chloride, sulfonyl chloride, aldehyde, epoxide, fluorobenzene, or succinic anhydride Anhydride) may be connected.
  • the reaction between an amine group and isothiocyanate forms an isothiourea bond
  • the reaction between an amine group and an isocyanate forms an isourea bond.
  • An arylamine bond may be formed by the reaction of low benzene, but is not limited to the above example.
  • a thiol group is connected to one of the cell-permeable peptide and the GLP-1 receptor agonist, and to the other, Iodoacetyl, Maleimide, or aziridine ), acryloyl, fluorobenzene, or vinylsulfone may be connected.
  • the reaction of a thiol group with iodoacetyl, maleimide, aziridine, acryloyl, or vinylsulfone forms a thioether bond
  • the reaction of a thiol group with fluorobenzene forms an aryl thioether bond. It may be, but is not limited to the above example.
  • one of the cell-penetrating peptide and the GLP-1 receptor agonist may have a carboxylate group connected to the other, and diazoacetate may be connected to the other one.
  • the bond in this case is an ester bond, but is not limited to the above example.
  • a hydroxyl group may be connected to one of the cell-permeable peptide and the GLP-1 receptor agonist, and isocyanates may be connected to the other.
  • the bond in this case is a carbamate bond, but is not limited to the above example.
  • an aldehyde group When the chemical bonding is by an aldehyde reaction, an aldehyde group may be connected to one of the cell-permeable peptide and the GLP-1 receptor agonist, and a hydrazide or amine may be connected to the other.
  • a hydrazone bond may be formed through a reaction between an aldehyde group and a hydrazide, and a Schiff base may be formed through a reaction between an aldehyde group and an amine, but the examples are not limited thereto.
  • a ketone group may be connected to one of the cell-permeable peptide and the GLP-1 receptor agonist, and a hydrazide or amine may be connected to the other, but is not limited to the above examples. .
  • an acrylate may be connected to one of the cell-permeable peptide and the GLP-1 receptor agonist, and diazoacetic acid or an alkene may be connected to the other, but is limited to the above example. It doesn't work.
  • an azide group may be connected to one of the cell-permeable peptide and the GLP-1 receptor agonist, and an alkene may be connected to the other.
  • triazoline may be formed, but is not limited to the above example.
  • an alkyne When the chemical bond is by an alkyn reaction, an alkyne may be connected to one of the cell-permeable peptide and the GLP-1 receptor agonist, and an azide group may be connected to the other.
  • triazole may be formed, but is not limited to the above example.
  • a catechol group may be connected to one of the cell-permeable peptide and the GLP-1 receptor agonist, and an amine or thiol group may be connected to the other. Not limited.
  • the bond between the cell-permeable peptide and the GLP-1 receptor agonist when the bond between the cell-permeable peptide and the GLP-1 receptor agonist is a covalent bond, the bond is a peptide bond, a maleimide linker bond, or a disulfide bond ), or a sulfanyl (bi-functional) bond.
  • the bond when the binding between the cell-permeable peptide and the GLP-1 receptor agonist is a non-covalent bond, the bond may be a charge-dependent bond.
  • the type of coupling is not limited thereto.
  • the peptide and the GLP-1 receptor agonist may be connected by a linker.
  • the linker may be any linker known in the art.
  • the "complex" may be a complex formed by expressing the peptide and the GLP-1 receptor agonist in a fused state.
  • a gene expressing the peptide and a GLP-1 receptor agonist is inserted into one vector, and then an organism is transformed with the vector to express the gene inserted into the vector, the peptide and the GLP-1 receptor
  • An agent may be expressed as a fusion protein.
  • an optional linker between the peptide and the GLP-1 receptor agonist may be included.
  • the linker may be a peptide linker composed of one or more amino acids.
  • the peptide linker may be, for example, a polypeptide consisting of 1 to 100 or 2 to 50 amino acids.
  • the peptide linker may include, for example, Gly, Asn, and Ser residues, and may also include neutral amino acids such as Thr and Ala.
  • Amino acid sequences suitable for peptide linkers are known in the art.
  • the length of the linker may be variously determined within the limit of not affecting the function of the complex. That is, the linker may include 1 to 100 or 2 to 50 of at least one selected from the group consisting of Gly, Asn, Ser, Thr, and Ala, but is not limited thereto.
  • the complex of the present invention includes a site that can target a specific cell or organelle within a specific cell, a site that activates a site of the peptide in a specific environment such as pH change, level of a specific enzyme, temperature, and a specific Various specific sites such as a site that separates the peptide and the GLP-1 receptor agonist under environmental conditions and a linker site or chemical moiety between the peptide and the GLP-1 receptor agonist when forming a complex may be added.
  • the function of PTD is hidden until the local disease environment (infarction, cancer, inflammation, etc.), microwave, ultrasound, radiofrequency, etc.
  • GLP-1 receptor agonists are applied to the local area, and then PTD functions under specific environmental changes to transport GLP-1 receptor agonists. It may be possible to transport GLP-1 receptor agonists with cell- or environment-selective multifunctionality, such as promoting Various sites may be added to increase stability in vivo, improve pharmacokinetic properties, maximize efficacy, or reduce side effects. In addition, a factor promoting the release of the GLP-1 receptor agonist into the cytosol may be added to increase the transport efficiency of the GLP-1 receptor agonist of the PTD into the cytosol.
  • the position in the complex of the peptide and the GLP-1 receptor agonist is not limited, and an additional site capable of exhibiting a specific function or a site capable of regulating or cleaving the action of the complex in a special environment may be included, which site is described above. Not limited to examples.
  • Complexes can be formed in the form of various nanocarriers, and ligand or molecule imaging that can target specific cells or molecules to membrane lipid-based nanocarriers such as liposomes or micelles as nanocarriers It can be applied to the diagnosis and treatment of diseases through the modification of functional groups for In the present invention, by using the peptide as a ligand, liposomes or micelles are modified to increase the delivery of drugs or nanoparticles wrapped in liposomes or micelles into cells.
  • the complex may be used to deliver a GLP-1 receptor agonist into living tissue or blood or promote cell permeation.
  • the complex may be delivered through cells constituting biological tissue or cell-to-cell junctions, but the delivery method is not limited.
  • the biological tissue refers to one or more epithelial tissue, muscle tissue, nerve tissue, and connective tissue, and each organ may consist of one or more tissues, such as mucous membrane, skin, brain, lung, liver, kidney, spleen, lung, heart, and stomach. , large intestine, digestive tract, bladder, ureter, urethra, ovary, testis, genital organ, muscle, blood, blood vessel, lymphatic vessel, lymph node, thymus, pancreas, adrenal gland, thyroid, parathyroid gland, larynx, tonsils, bronchi, and alveoli.
  • tissues such as mucous membrane, skin, brain, lung, liver, kidney, spleen, lung, heart, and stomach.
  • large intestine, digestive tract, bladder, ureter, urethra, ovary testis, genital organ, muscle, blood, blood vessel, lymphatic vessel, lymph node, thymus, pancreas, adrenal gland, thyroid, parathyroid gland, lary
  • Cells constituting the biological tissue include epithelial cells, muscle cells, nerve cells, glandular cells, glial cells, germ cells, stem cells, mesenchymal cells, mesenchymal stem cells, osteoblasts, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, blood cells Cells, hematopoietic cells, lung cells, hepatocytes, fibroblasts, immune cells, endothelial cells, adipocytes, chondrocytes, etc. may be included, but are not limited to the above examples.
  • Epithelial cells include mucosal epithelial cells, hair follicle epithelial cells, digestive tract epithelial cells, respiratory epithelial cells, genital epithelial cells, urinary epithelial cells, and the like.
  • Endothelial cells include vascular endothelial cells or lymphatic endothelial cells, but are not limited to the above examples.
  • the complex may be for delivering a GLP-1 receptor agonist through the mucous membrane or skin, but is not limited to the above examples.
  • the complex is an oral formulation, an injection, a mucosal formulation, an oral mucosal formulation, a nasal formulation, an ophthalmic formulation, a vaginal formulation, an inhalant, an external formulation, and a transdermal absorbent, a sublingual formulation, and an implantation formulation.
  • a mucosal formulation an oral mucosal formulation
  • a nasal formulation an ophthalmic formulation
  • a vaginal formulation an inhalant
  • an external formulation an external formulation
  • transdermal absorbent a sublingual formulation
  • implantation formulation implantation formulation
  • the term 'transdermal absorbent' or 'transdermal administration' refers to direct contact, layering, or spreading onto dermal tissue, particularly outer skin (epidermis) or membrane. it means.
  • the composition of the present invention may further include a skin penetration enhancer.
  • Skin penetration enhancers refer to agents that enhance the rate of transport across the skin surface. Skin penetration enhancers may be present in any amount, such as between about 0.1% and about 50% by weight of the composition. In some embodiments, the skin penetration enhancer may be present in an amount of between about 0.1% and about 25%, between about 0.5% and about 10%, or between about 1% and about 5% by weight of the composition.
  • Non-limiting examples of skin penetration enhancers include sulfoxides such as dimethylsulfoxide (DMSO), ethers such as diethylene glycol monoethyl ether (eg Transcutol P, manufactured by Gattefosse Cedex, France), and surfactants such as sodium laurate.
  • sulfoxides such as dimethylsulfoxide (DMSO)
  • ethers such as diethylene glycol monoethyl ether (eg Transcutol P, manufactured by Gattefosse Cedex, France)
  • surfactants such as sodium laurate.
  • Sodium Lauryl Sulfate, Tween 20, 40, 60, 80 (manufactured by Croda Inc, Edison, NJ, U.S.A.); alcohols such as ethanol, propanol, benzyl alcohol; fatty acids such as lauric acid, oleic acid, valeric acid and isostearic acid; fatty acid esters such as isopropyl myristate, isopropyl palmitate, methyl propionate, and ethyl oleate; polyols and their esters such as propylene glycol, ethylene glycol, glycerol, butanediol, polyethylene glycol, and polyethylene glycol monolaurate; amides and other nitrogen compounds such as urea, dimethylacetamide (DMA), dimethylformamide (DMF), 2-pyrrolidone, 1-methyl-2-pyrrolidone, ethanolamine, diethanolamine and triethanolamine; terpenes; contains alkanons.
  • DMA
  • the complex may further include a signal peptide that allows the GLP-1 receptor agonist to be delivered to a specific organ or a specific intracellular organelle.
  • a signal sequence is a short peptide, usually 5 to 30 amino acids in length, that is stored in a specific intracellular organelle (ER, Golgi, or endosome), secreted from a cell, or inserted into a cell membrane.
  • the complex of the present invention may include any known signal sequence, and the GLP-1 receptor agonist may be moved to a specific site in a cell by the signal sequence, but is not limited to the above examples.
  • the complex may further include a substance or site that allows the GLP-1 receptor agonist to be specifically delivered into a specific organ or cell by targeting the specific organ or cell.
  • the complex may further include an antibody that specifically binds to a receptor present in a specific cell.
  • an antibody that specifically binds to the HER-2 receptor of breast cancer cells
  • the peptide-GLP-1 receptor agonist complex can specifically bind to breast cancer cells through the antibody and be delivered into the cells.
  • a pH-sensitive system As one aspect of the present invention, a pH-sensitive system, an enzyme-sensitive system, a light-sensitive system, an oxygen-sensitive system, etc. It may further include a site or material that enables specific delivery by expressing the cell permeation efficiency of PTD according to a specific pH, enzyme activity, light, and oxygen environment, but is not limited to the above example.
  • the complex or a composition including the same may further include a substance that allows the peptide and the GLP-1 receptor agonist to be more easily released from endosomes in the cell (endosomal release, endosomal escape).
  • a substance that allows the peptide and the GLP-1 receptor agonist to be more easily released from endosomes in the cell endosomal release, endosomal escape.
  • membrane-disruptive peptides, membrane-disruptive polymers, lysosomotropic agents, etc. are possible, and the tetramerization domain (p53tet) of the p53 protein is linked to the peptide, or PMAPs (pH-Dependent Membrane Active Peptides) may be taken, such as linking the peptide to the peptide, but is not limited to the above example.
  • the complex or a composition containing the same may further include a substance or site capable of increasing the half-life of the peptide or GLP-1 receptor agonist.
  • the complex may be formulated so that the peptide and the GLP-1 receptor agonist are not degraded in the body until they are delivered to a desired cell.
  • the GLP-1 receptor agonist may be absorbed by the gastrointestinal or small intestine epithelium
  • the peptide and GLP-1 receptor agonist are degraded or absorbed by any other cell until they reach the gastrointestinal or small intestine epithelium of the digestive tract. It can be formulated so that it does not.
  • the present invention provides a composition for oral administration comprising the complex according to the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for nasal administration comprising the complex according to the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for transdermal administration comprising the complex according to the present invention as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for preparing the complex, comprising mixing a cell penetrating peptide having the following amino acid sequence and a GLP-1 receptor agonist:
  • R1 is any one amino acid selected from the group consisting of A, V, I, L, S, F, K and R,
  • R2 is any one amino acid selected from the group consisting of S, L, F, T and Y;
  • R3 is any one amino acid selected from the group consisting of E, L, A and R,
  • R4 is any one amino acid selected from the group consisting of Q, H, T, L, D and R,
  • R5 is any one amino acid selected from the group consisting of L, S, V, A, K and H;
  • R6 is any one dipeptide selected from the group consisting of DK, EK, QK, NK, KK and FK.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes or obesity comprising the complex as an active ingredient.
  • the diabetes may be characterized as type 2 diabetes.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may contain the complex alone or formulated in a suitable form together with a pharmaceutically acceptable carrier, and may further contain an excipient or diluent.
  • a pharmaceutically acceptable carrier include all kinds of solvents, dispersion media, oil-in-water or water-in-oil emulsions, aqueous compositions, liposomes, microbeads and microsomes.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may further include, for example, a carrier for parenteral administration.
  • the carrier for parenteral administration may include water, suitable oil, saline, aqueous glucose and glycol, and the like, and may further include a stabilizer and a preservative.
  • Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium bisulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, and the like in addition to the above components. Reference may be made to other pharmaceutically acceptable carriers and agents known in the art.
  • composition of the present invention can be administered to mammals including humans by any method.
  • parenteral administration methods include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or rectal administration can be
  • composition of the present invention can be formulated as a preparation for parenteral administration according to the administration route as described above.
  • preparations for parenteral administration they may be formulated in the form of injections, creams, lotions, external ointments, oils, moisturizers, gels, aerosols, and nasal inhalants by methods known in the art. These formulations are described in prescriptions generally known to all pharmaceutical chemists.
  • the total effective amount of the composition of the present invention can be administered to the patient in a single dose or by a fractionated treatment protocol in which multiple doses are administered over a long period of time.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may vary the content of the active ingredient according to the severity of the disease.
  • the preferred total dose of the pharmaceutical composition of the present invention may be about 0.01 ⁇ g to 10,000 mg, most preferably 0.1 ⁇ g to 500 mg per kg of patient body weight per day.
  • the dose of the pharmaceutical composition is determined by considering various factors such as the formulation method, administration route, and number of treatments as well as the patient's age, weight, health condition, sex, severity of disease, diet, and excretion rate. Therefore, considering this point, those skilled in the art will be able to determine an appropriate effective dosage of the composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited in its formulation, administration route and administration method as long as it exhibits the effects of the present invention.
  • the content of the composition is not significantly limited depending on the purpose or aspect of use, for example, 0.01 to 99% by weight, preferably 0.5 to 50% by weight, more preferably 1 to 30% by weight based on the total weight of the composition. weight percent.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include additives such as pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents in addition to active ingredients.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include 0.1 to 99.9% by weight of the cell-penetrating peptide and the GLP-1 receptor agonist prepared by the method of the present invention, and 99.9% to 0.1% by weight of a carrier.
  • the cell penetrating peptide and the GLP-1 receptor agonist of the composition may include 0.01 to 99.99% by weight of the cell penetrating peptide and 99.99% to 0.01% by weight of the GLP-1 receptor agonist.
  • the present invention provides a composition for preparing a preparation for oral administration of a GLP-1 receptor agonist comprising, as an active ingredient, a cell penetrating peptide consisting of the following amino acid sequence:
  • R1 to R6 are as described above.
  • the present invention provides a composition for preparing a preparation for intranasal administration of a GLP-1 receptor agonist comprising, as an active ingredient, a cell penetrating peptide consisting of the following amino acid sequence:
  • R1 to R6 are as described above.
  • the present invention provides a composition for preparing a preparation for transdermal administration of a GLP-1 receptor agonist comprising as an active ingredient a cell penetrating peptide consisting of the following amino acid sequence:
  • R1 to R6 are as described above.
  • the present invention provides the use of the complex for preparing an agent for the treatment of diabetes or obesity.
  • the present invention provides a method for treating diabetes or obesity comprising administering an effective amount of a composition containing the complex as an active ingredient to a subject in need thereof.
  • the 'effective amount' of the present invention refers to an amount that exhibits an effect of improving, treating, detecting, diagnosing, or suppressing or reducing diabetes or obesity when administered to a subject
  • the 'subject' refers to an animal, preferably It may be mammals, especially animals including humans, and may also be cells, tissues, organs, etc. derived from animals.
  • the subject may be a patient in need of the effect.
  • the 'treatment' of the present invention refers comprehensively to improving diabetes or obesity or symptoms caused by diabetes or obesity, which may include curing, substantially preventing, or improving the condition, Alleviating, curing or preventing one or most of the symptoms resulting from the disease, but is not limited thereto.
  • the term “comprising” is used in the same meaning as “including” or “characterized by”, and in the composition or method according to the present invention, specifically mentioned It does not exclude additional components or method steps not specified. Also, the term “consisting of” means excluding additional elements, steps or components not separately described. The term “essentially consisting of” means that in the scope of a composition or method, in addition to the described materials or steps, materials or steps that do not substantially affect the basic characteristics thereof may be included.
  • the complex of the present invention comprising a cell-penetrating peptide and a GLP-1 receptor agonist improves the cell membrane penetrating ability of the GLP-1 receptor agonist, making it possible to administer a drug in a non-invasive way, or to administer a drug to cells, tissues, It can be effectively delivered to living organisms such as blood.
  • 1a to 1f show BEAS-2B cells or HeLa cells treated with the peptides of the present invention at various concentrations, and after 15 minutes (1a, 1b), 30 minutes (1c, 1d) and 2 hours (1e, 1f) This is the result of analyzing the degree of intracellular permeability.
  • SPR surface plasmon resonance
  • Caco-2 cell line which is a human-derived colorectal cancer cell line.
  • 5 is a graph showing the quantification and observation of the degree of intracellular penetration with a fluorescence microscope after 1 hour and 30 minutes after treating HeLa cells with a complex of cell-penetrating peptide and liraglutide.
  • each of the peptides of SEQ ID NOs: 1 to 10 shown in Table 1 was prepared to have a purity of 95% or more. This peptide synthesis was carried out by requesting I-Cure Pepgen Co., Ltd.
  • Intracellular penetration patterns of the peptides of the present invention were confirmed by fluorescence microscopy.
  • rhodamine fluorescent dye was labeled at the amino terminus of each peptide of SEQ ID NOs: 1 to 10 prepared in Example 1.
  • BEAS-2B cells or HeLa cells were treated with various concentrations of the peptides of BCP1 to BCP10, and then the concentration of the intracellular peptides was evaluated 15 minutes, 30 minutes, and 2 hours later.
  • TAT peptide GRKKRRQRRR
  • BEAS-2B cells or HeLa cells were treated with the peptides BCP3, BCP4, and BCP5 at concentrations of 10 ⁇ M and 50 ⁇ M, and control TAT was also treated at the same concentration.
  • the cell culture slide was inoculated, because plastic causes fluorescence interference when observed under a fluorescence microscope. After washing, the glass cover glass was adhered to the slide glass using mounting medium with DAPI, and the sample was observed under a fluorescence microscope 400 times.
  • Example 3 Evaluation of the binding ratio of cell penetrating peptide and liraglutide
  • SPR Surface plasmon resonance
  • Example 5 Intracellular penetration pattern of cell penetrating peptide and liraglutide complex
  • HeLa cell line which is a cervical cancer cell line, was prepared, and the N-terminus of liraglutide was labeled with FITC (fluorescein isothiocyanate), a fluorescent substance, in order to detect liraglutide accumulated in the cell through the cell membrane.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • HeLa cells were washed three times with PBS to remove the mixture remaining on the cell membrane. After confirming the intracellular penetration pattern with a fluorescence microscope, measure the emission at 518 nm and excitation at 493 nm using a microplate fluorescence reader (SYNERGY H1 microplate reader, BIO-TEK), which is an indicator of liraglutide entering the cell. Phosphorus FITC fluorescence was measured.
  • each cell-permeable peptide and liraglutide were mixed according to the molar ratio, and the mixture was treated on HeLa cell line for 24 hours, and then cytotoxicity was confirmed using CCK-8 (cell counting kit-8) did
  • each complex did not exhibit cytotoxicity, as shown in FIG. 6 .
  • the complex of the present invention comprising a cell-penetrating peptide and a GLP-1 receptor agonist improves the cell membrane penetrating ability of the GLP-1 receptor agonist, making it possible to administer a drug in a non-invasive way, or to administer a drug to cells, tissues, It can be effectively delivered to living organisms such as blood, so industrial applicability is very high.

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Abstract

본 발명은 세포 투과성 펩타이드 및 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1) 수용체 작용제를 포함하는 복합체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상용 TAT 펩타이드와 비교하여 향상된 세포 투과성을 나타내는 세포 투과성 펩타이드 및 글루카곤 유사 펩타이드-1 작용제를 포함하는 복합체에 관한 것이다. 세포 투과성 펩타이드 및 GLP-1 수용체 작용제를 포함하는 본 발명의 복합체는 GLP-1 수용체 작용제의 세포막 투과능을 개선하여 비침습적인 방법에 따라 약물을 투여하는 것을 가능하게 하거나, 약물을 세포, 조직, 혈액 등 생체 내로 효과적으로 전달할 수 있다.

Description

세포 투과성 펩타이드 및 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체 작용제를 포함하는 복합체
본 출원은 2021년 5월 21일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2021-0065734호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 세포 투과성 펩타이드 및 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1) 수용체 작용제를 포함하는 복합체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상용 TAT 펩타이드와 비교하여 향상된 세포 투과성을 나타내는 세포 투과성 펩타이드 및 글루카곤 유사 펩타이드-1 작용제를 포함하는 복합체에 관한 것이다.
세포 투과성 펩타이드는 PTD(protein-transduction domains), MTS(membrane-translocating sequences)라고도 불리는 데, 수송대상체에 결합된 형태 또는 혼합된 형태로 세포막을 통과해 단백질, DNA, RNA 등의 운반 대상을 세포 내뿐만 아니라 세포질, 세포내 소기관, 핵 안에까지 운반할 수 있다.
종래 세포 투과성 펩타이드들은 HIV-1과 같은 바이러스 단백질로부터 유래한 서열이거나, 초파리와 같은 다른 종이 발현하는 단백질로부터 유래한 것들이거나, 종래 세포 투과성 펩타이드를 구성하는 아미노산 서열 분석을 통해 특징적인 아미노산 서열을 선정, 인공적으로 합성해 낸 아미노산 서열이라는 점에서, 인체에 적용해서 사용할 때에 면역 반응 등의 부작용을 일으킬 소지가 있었다. 또한, 전달하고자 하는 단백질의 구조 및 기능에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 세포 내로 전달하고자 하는 생물학적 활성 물질과 연결할 때에 효율이 저하되는 문제가 있었다.
예를 들어, 당뇨병 치료제로 알려진 리라글루타이드는 인간 GLP-1과 97% 서열 상동성을 갖는 GLP-1 수용체 작용제이다. 리라글루타이드는 1일 1회, 피하 주사 요법으로서 제2형 당뇨병을 갖고 있는 환자의 혈당 조절 개선, 그리고 비만 환자의 체중 조절용 약물로서 승인되어 판매되고 있다.
이와 같은 주사제의 투여는 환자의 큰 불편을 유발하므로, 약물의 복약 순응도가 감소한다. 따라서, 당뇨 환자를 위한 치료제로서 리라글루타이드를 비침습적인 경로(경구, 비강 등)로 투여하기 위한 새로운 시도가 필요하다.
이에, 본 발명자는 리라글루타이드와 같은 GLP-1 수용체 작용제를 비침습적인 경로로 투여할 수 있는 제제를 개발하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 일련의 서열을 나타내는 TCTP 단백질 (translationally controlled tumor protein) 유래의 PTC (protein transduction domain) 변이체들이 GLP-1 수용체 작용제를 효과적으로 세포 내로 침투시킬 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드 및 GLP-1 수용체 작용제(Glucagon like peptide-1 receptor agonist)를 포함하는 복합체를 제공하는 것이다:
MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6
상기 식에서,
R1은 A, V, I, L, S, F, K 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R2는 S, L, F, T 및 Y로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
R3는 E, L, A 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R4는 Q, H, T, L, D 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
R5는 L, S, V, A, K 및 H로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R6는 DK, EK, QK, NK, KK 및 FK로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 디펩타이드이다.
본 발명의 다른 목적은 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드 및 GLP-1 수용체 작용제(Glucagon like peptide-1 receptor agonist)를 혼합하는 단계를 포함하는, 상기 복합체 제조방법을 제공하는 것이다:
MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6
상기 식에서,
R1은 A, V, I, L, S, F, K 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R2는 S, L, F, T 및 Y로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
R3는 E, L, A 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R4는 Q, H, T, L, D 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
R5는 L, S, V, A, K 및 H로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R6는 DK, EK, QK, NK, KK 및 FK로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 디펩타이드이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 복합체로 이루어진 당뇨병 또는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 복합체로 필수적으로 이루어진 당뇨병 또는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 당뇨병 또는 비만 치료용 제제를 제조하기 위한 상기복합체의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 당뇨병 또는 비만을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드 및 GLP-1 수용체 작용제(Glucagon like peptide-1 receptor agonist)를 포함하는 복합체를 제공한다:
MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6
상기 식에서,
R1은 A, V, I, L, S, F, K 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R2는 S, L, F, T 및 Y로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
R3는 E, L, A 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R4는 Q, H, T, L, D 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
R5는 L, S, V, A, K 및 H로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R6는 DK, EK, QK, NK, KK 및 FK로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 디펩타이드이다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드 및 GLP-1 수용체 작용제(Glucagon like peptide-1 receptor agonist)를 혼합하는 단계를 포함하는, 상기 복합체 제조방법을 제공한다:
MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6
상기 식에서,
R1은 A, V, I, L, S, F, K 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R2는 S, L, F, T 및 Y로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
R3는 E, L, A 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R4는 Q, H, T, L, D 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
R5는 L, S, V, A, K 및 H로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R6는 DK, EK, QK, NK, KK 및 FK로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 디펩타이드이다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 상기 복합체로 이루어지는 당뇨병 또는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 상기 복합체로 필수적으로 이루어지는 당뇨병 또는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 당뇨병 또는 비만 치료용 제제를 제조하기 위한 상기 복합체의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 당뇨병 또는 비만을 치료하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 실시는, 특별히 반대로 나타내지 않는 이상, 본 발명이 속하는 기술 분야 내의 분자생물학 및 재조합 DNA 기술의 종래 방법을 사용하고, 설명을 위한 목적으로서 대부분이 아래(문헌)에 기재되어 있다. 이러한 기술은 문헌 중에 상세하게 설명된다: Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, ed., 1984).
본 명세서에 인용되는 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그 전체가 참고로서 본 명세서에 원용된다.
본 명세서에 개시된 내용 전반에 걸쳐서, 본 발명과 관련된 다양한 양상 또는 조건들이 범위 형식으로 제안될 수 있다. 본 명세서에서 범위값의 기재는, 별다른 언급이 없는 한 해당 경계값을 포함하는 것으로서 즉, 하한값 이상 내지 상한값 이하의 값들을 모두 포함하는 의미이다. 범위 형식의 서술은 단순히 편의성 및 간략성을 위한 것이며, 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한(inflexible limitation)으로서 해석되지 않아야 하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 서술은 상기 범위 내의 개별적인 수치값들뿐만 아니라 모든 가능한 하부범위(subrange)를 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 7 내지 170과 같은 범위의 서술은 상기 범위 내의 개별적 수치들, 예를 들어, 9, 27, 35, 101, 및 155 뿐만 아니라, 10 내지 127, 23 내지 35, 80 내지 100, 50 내지 169 등과 같은 하부범위들을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭과 무관하게 적용된다.
본 발명의 용어 '~을 포함하는(comprising)'이란 '함유하는' 또는 '특징으로 하는'과 동일하게 사용되며, 조성물 또는 방법에 있어서, 언급되지 않은 추가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다.
본 명세서 사용된 용어 「펩타이드」 및 「단백질」은 통상(종래)의 의미에 따라 사용되는 것으로, 즉 아미노산의 배열을 의미한다. 펩타이드는 특정의 길이로 한정되지 않지만, 본 발명의 문맥에서는 일반적으로 전장(full length) 단백질의 단편을 나타내며, 번역후의 수식, 예를 들면 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등 및 해당 분야에 공지된 다른 수식(자연적으로 발생하는 수식 및 비자연적 발생의 수식)을 포함할 수 있고 '폴리펩타이드'로 표현될 수도 있다. 본 발명의 펩타이드 및 단백질은 임의의 다양한 공지의 재조합 및/또는 합성의 기술을 이용하여 제조될 수 있으며, 그 예시적인 실시예는 이하에서 추가로 설명한다.
본 발명은 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드 및 GLP-1 수용체 작용제(Glucagon like peptide-1 receptor agonist)를 포함하는 복합체를 제공한다:
MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6
상기 식에서,
R1은 A, V, I, L, S, F, K 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R2는 S, L, F, T 및 Y로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
R3는 E, L, A 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R4는 Q, H, T, L, D 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
R5는 L, S, V, A, K 및 H로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R6는 DK, EK, QK, NK, KK 및 FK로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 디펩타이드이다.
본 발명의 상기 펩타이드는 세포막 투과성이 있는 신규한 펩타이드로서 그 자체로 세포막 투과성이 우수하며, GLP-1 수용체 작용제를 생체 조직 내로 전달시키는 효과가 우수하다.
본 발명에서 상기 "세포막"은 세포와 세포 외부의 경계를 짓는 막을 의미한다. 본 발명의 일 양태로서, 상기 세포막은 임의의 생명체, 예를 들어 세균 (Bacteria), 고세균 (Archaea) 및 진핵생물 (Eukarya)에 속하는 단세포 또는 다세포 생물의 세포의 막일 수 있다. 상기 진핵생물은 원생생물계 (Protista), 균계 (Fungus), 식물계 (Plantae), 및 동물계 (Animalia)에 속하는 임의의 생물일 수 있다. 상기 동물은 사람을 포함하는 임의의 동물이 될 수 있다.
본 발명에서, 상기 "세포막"은 임의의 종류의 세포의 막이 될 수 있다. 예를 들어, 상기 "세포"는 상피세포, 근육세포, 면역세포 및 내피세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 세포는 내피 (endothelium), 상피 (epithelium), 점막 (mucous membrane) 등 체외와 직접 맞닿아 있는 기관의 벽 (lining)을 이루거나, 또는 체내에서 어떤 장기 또는 혈관의 표면을 덮는 세포층의 세포가 될 수 있다. 본 발명의 일 양태로서, 상기 세포는 피부 상피세포, 모낭 상피세포, 점막 상피세포, 각막 상피세포, 두피 상피세포, 각막 내피세포, 혈관 내피세포를 포함한다. 예를 들어, 상기 점막 상피세포는 비강, 폐, 질, 직장, 항문, 요도, 설하, 안구, 결막 및 구강 점막으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 점막의 상피세포일 수 있다. 예컨대 상기 혈관 내피세포는 혈액뇌장벽 (BBB)을 이루고 있는 뇌혈관을 비롯한 각종 동맥, 정맥, 모세혈관의 내피세포, 림프관 내피세포, 심장 안벽의 내피세포 등이 될 수 있다. 또한 상기 세포는 자궁경부암, 유방암, 간암, 폐암 등을 포함하는 다양한 암세포가 될 수 있다. 또한 상기 세포는 호르몬, 신경계의 화학전달 물질, 약물 등 다양한 물질의 수용체 (receptor)를 가진 세포가 될 수 있으며, 예를 들어 인슐린 수용체 (insulin receptor), 글루카곤-유사-단백질 1 (Glucagon-like-protein 1, GLP1) 수용체를 갖는 세포가 될 수 있으나, 상기 세포는 상기 예시에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 펩타이드는 당업계에 공지된 이용가능한 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 일례로 임의의 다양한 단백질 분해효소를 이용하여 제조될 수 있다. 예시적인 프로테아제(단백질분해효소)로서는, 예를 들면, 아크로모펩티다아제(achromopeptidase), 아미노펩티다제(aminopeptidase), 안크로드(ancrod), 안지오텐신 변환 효소(angiotensin converting enzyme), 브로멜라인(bromelain), 칼파인(calpain), 칼파인 I(calpain I), 칼파인 II(calpain II), 카르복시펩티다제 A(carboxypeptidase A), 카르복시펩티다제 B(carboxypeptidase B), 카르복시펩티다제 G(carboxypeptidase G), 카르복시펩티다제 P(carboxypeptidase P), 카르복시펩티다제 W(carboxypeptidase W), 카르복시펩티다제 Y(carboxypeptidase Y), 카스파아제 1(caspase 1), 카스파아제 2(caspase 2), 카스파아제 3(caspase 3), 카스파아제 4(caspase 4), 카스파아제 5(caspase 5), 카스파아제 6(caspase 6), 카스파아제 7(caspase 7), 카스파아제 8(caspase 8), 카스파아제 9(caspase 9), 카스파아제 10 (caspase 10), 카스파아제 11(caspase 11), 카스파아제 12 (caspase 12), 카스파아제 13 (caspase 13), 카텝신 B(cathepsin B), 카텝신 C(cathepsin C), 카텝신 D(cathepsin D), 카텝신 E(cathepsin E), 카텝신 G(cathepsin G), 카텝신 H(cathepsin H), 카텝신 L(cathepsin L), 키모파파인(chymopapain), 키마아제(chymase), 키모트립신(chymotrypsin), 크로스 트리파인(clostripain), 콜라게나제(collagenase), 보체 C1r(complement C1r), 보체 C1s (complement C1s), 보체 D인자(complement Factor D), 보체 I인자(complement factor I), 쿠쿠미신(cucumisin), 디펩티딜펩티다제 IV(dipeptidyl peptidase IV), 백혈구 엘라스타제(elastase, leukocyte), 췌장 엘라스타제(elastase, pancreatic), 엔도프로테이나제 Arg-C( endoproteinase Arg-C), 엔도프로테이나제 Asp-N(endoproteinase Asp-N), 엔도프로테이나제 Glu-C(endoproteinase Glu-C), 엔도프로테이나제 Lys-C(endoproteinase Lys-C), 엔테로키나제(enterokinase), Xa 인자(factor Xa), 피신(ficin), 퓨린(furin), 그란자임 A(granzyme A), 그란자임 B(granzyme B), HIV 프로테아제(HIV Protease), IGase, 칼리크레인 조직(kallikrein tissue), 일반 류신 아미노펩티다제(leucine aminopeptidase, general), 세포기질 류신 아미노펩티다제(leucine aminopeptidase, cytosol), 마이크로솜 류신 아미노펩티다제(leucine aminopeptidase, microsomal), 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease), 메티오닌 아미노펩티다제(methionine aminopeptidase), 뉴트라제(neutrase), 파파인(papain), 펩신(pepsin), 플라스민(plasmin), 프롤리다제(prolidase), 프로나제 E(pronase E), 전립선 특이적 항원(prostate specific antigen), Streptomyces griseus 유래의 호알카리성 프로테아제(protease alkalophilic from Streptomyces griseus), Aspergillus 유래의 프로테아제(protease from Aspergillus), Aspergillus saitoi 유래의 프로테아제(protease from Aspergillus saitoi), Aspergillus sojae 유래의 프로테아제(protease from Aspergillus sojae), B. licheniformis 프로테아제(protease B. licheniformis, alkaline or alcalase), Bacillus polymyxa 유래의 프로테아제(protease from Bacillus polymyxa), Bacillus sp. 유래의 프로테아제(protease from Bacillus sp), Rhizopus sp. 유래의 프로테아제(protease from Rhizopus sp.), 프로테아제 S(protease S), 프로테아좀류(proteasomes), Aspergillus oryzae 유래의 프로테이나제(proteinase from Aspergillus oryzae), 프로테이나제 3(proteinase 3), 프로테이나제 A(proteinase A), 프로테이나제 K(proteinase K), 프로테인 C(protein C), 피로글루타메이트 아미노펩티다제(pyroglutamate aminopeptidase), 레닌(rennin), 스트렙토키나제(streptokinase), 서브틸리신(subtilisin), 서몰리신(thermolysin), 트롬빈(thrombin), 조직 플라스미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator), 트립신(trypsin), 트립타제(tryptase) 및 우로키나제(urokinase) 등을 들 수 있다. 당업자라면 제작하고자하는 단편의 화학적 특이성을 고려하여, 어떤 단백질분해효소가 적절할지 용이하게 결정 가능하다.
본 발명에서 상기 펩타이드는 당분야의 숙련자에게 공지된 임의의 적합한 절차, 예컨대 재조합 기법에 의해 제조될 수 있다. 재조합 제조 방법에 부가하여, 본 발명의 폴리펩티드는 고상 기법을 이용한 직접적 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다.
고체상 펩타이드 합성(SPPS) 방법은 작은 다공성의 비드(beads)에 링커(linkers)라 불리는 기능성 유닛(functional units)을 부착하여 펩타이드 사슬을 이어 나갈 수 있도록 유도함으로써 합성을 개시할 수 있다. 액체상 방법과 달리 펩타이드는 비드와 공유 결합하여 TFA(trifluoroacetic acid)와 같은 특정 반응물에 의해 절단되기 전까지 여과(filtration) 과정에 의해 떨어져 나가는 것을 방지한다. 고체상에 부착된 펩타이드의 N-말단 아민과 N-보호 아미노산 유닛(N-protected amino acid unit)이 결합하는 보호(protection) 과정, 탈보호(deprotection) 과정, 다시 드러난 아민 그룹(amine group)과 새로운 아미노산이 결합하는 커플링(coupling) 과정의 사이클(cycle, deprotection-wash-coupling-wash)이 반복되면서 합성이 이루어지게 된다. 상기 SPPS 방법은 마이크로파(microwave) 기술을 함께 이용하여 수행할 수 있으며, 마이크로파 기술은 펩타이드 합성 과정에서 열을 가해줌으로써 각 사이클의 커플링과 탈보호에 요구되는 시간을 단축시킬 수 있다. 상기 열 에너지는 확장되는 펩타이드 사슬이 접히거나(folding) 집합체를 형성하는 것(aggregation)을 방지하고 화학적 결합을 촉진시킬 수 있다.
또한 액체상 펩타이드 합성법에 의해 본 발명의 펩타이드를 제작할 수 있으며, 이의 구체적 방법은 하기의 문헌들을 참조로 한다: US 등록특허 제 5,516,891. 또한 본 발명의 펩타이드는 상기 고체상 합성법과 액체상 합성법을 혼합하는 방법 등의 다양한 방법으로 합성 가능하며, 본 명세서에 기술된 수단에 그 제조 방법이 제한되지 않는다.
단백질 합성은 수동 기법을 이용해서 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화된 합성은, 예를 들어 Applied Biosystems 431A 펩티드 합성기(Perkin Elmer)를 이용해서 달성될 수 있다. 대안적으로, 다양한 단편이 별도로 화학적으로 합성되고 화학적 방법을 이용하여 조합되어 목적 분자를 제조할 수 있다.
본 발명에서 상기 펩타이드는 당업자에게 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법 혹은 제조 방법을 통하여 D-form이나 L-form, 서열 중 일부만 D-form이나 L-form으로 구성된 펩타이드, 또는 이들의 라세미체 형태로 모두 제작하여 사용될 수 있다. 또한 펩타이드의 안정성을 높이기 위해 그 외의 당업계에 공지된 통상적인 변형이 가능하다.
본 발명에서 상기 펩타이드는 통상적인 변이체를 포함할 수 있다. 상기 변이체는, 상기 '펩타이드'의 아미노산 서열에 임의의 변경이 발생한 것으로서, 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 이러한 변이체는 자연적으로 발생되는 것일 수 있고, 또는 본 기술분야에 잘 알려진 임의의 다수의 기술을 이용하여, 예를 들어 본 발명의 상기 펩타이드 서열 중의 하나 이상을 수정 또는 변형하고 본 명세서에 기재된 이들의 생물학적 활성을 평가하는 것에 의해 합성적으로 생성될 수 있다.
본 발명의 일양태로서, 상기 변이체(variant)는 보존적 치환을 포함한다. '보존적 치환'이란, 어느 아미노산이 유사한 특성을 가지는 다른 아미노산으로 치환되어 당업자라면 그 펩타이드의 2차 구조 및 감수성질(hydropathic nature, 소수성 또는 친수성 성질)이 실질적으로 비변화되었다고 예측할 수 있는 치환이다. 일반적으로 하기 아미노산 군이 보존성 변화를 나타낸다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his.
변형(modification)은 본 발명의 펩타이드의 구조 내에 수행되는 것일 수 있고, 원하는(바람직한) 특징을 가지고 있는 펩타이드 변이체 또는 파생물(derivatives)을 암호화하는 기능적 분자를 수득할 수 있다. 본 발명의 상기 펩타이드와 등가(equivalent)의 또는 향상된(improved) 변이체를 제작하기 위해 펩타이드의 아미노산 서열을 변경하고자 하는 경우, 당업자는 당업계에 알려진 단백질 코돈 정보에 기초하여 하나 이상의 코돈을 변화시킬 수 있다.
또한 상기 변이체는 비보존적 변경을 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 변이체 펩타이드는 5개 아미노산 또는 그것보다 적은 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 천연 서열과는 다를 수 있다. 변이체는 또한, 예를 들어 상기 펩타이드의 2차 구조 및 감수(hydropathic) 특성에 대해서 가지는 영향이 최소인 아미노산의 결실 또는 부가에 의해 변경될 수 있다.
본 발명에서 상기 펩타이드는 단백질의 N-말단에 시그널(또는 리더) 서열을 포함할 수 있고, 이 서열은 번역과 동시에 또는 번역 후에 그 단백질의 이송을 지시한다. 상기 펩타이드는, 또한 펩타이드의 합성, 정제 또는 동정을 용이하게 하기 위해(예를 들면 폴리His), 또는 펩타이드의 고체 지지체에 대한 결합을 증강하기 위해, 링커 서열 또는 다른 서열과 결합(컨쥬게이트)될 수 있다.
본 발명의 일양태에서 본 발명의 상기 펩타이드를 변경하기 위하여 화학선택적 결찰(chemoselective ligation)기술이 이용될 수 있으며, 예를 들어 부위 특이적인 방식 및 제어된 방식으로 중합체(polymer)를 부착하는 것에 의할 수 있다. 이러한 기술은 대표적으로 화학적 수단 또는 재조합 수단 중 하나에 의해 단백질 골격 내로 화학 선택적인 앵커(chemoselective anchor)가 결합하는 것과, 상보적인 링커를 운반하는 중합체로 후속적 변경하는 것에 의존한다. 결과적으로, 조립 공정 및 얻어진 단백질-중합체 결합체(protein-polymer conjugate)의 공유결합 구조는 제어되며, 그것에 따라 유효성 및 약물 동태학적 특성 등과 같은 약물 특성의 합리적 최적화가 가능하게 된다. 예컨대 PEG의 선택적인 부착을 허용함으로써 이들의 약동학적 특성을 개선한다.
본 발명의 상기 펩타이드에는 약학적으로 허용가능한 염의 형태가 포함이 될 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은 예를 들어, 염산염, 황산염, 인산염, 초산염, 구연산염, 주석산염, 숙신산염, 젖산염, 말레산염, 푸마르산염, 옥살산염, 메탄술폰산염, 또는 파라톨루엔술폰산염 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일양태에서 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3 내지 5로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 3의 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 1 내지 10의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 종래의 TAT 단백질의 투과율과 비교하여 탁월한 세포막 투과도를 나타내며, 처리농도가 높을수록, 처리시간이 길수록 세포 내 투과율은 급격히 증가하는 양상을 나타내는 것으로 확인되었다.
본 발명에서 상기 GLP-1 수용체 작용제는 GLP-1(7-37)의 변이체인 펩티드 또는 화합물을 의미한다. GLP-1(7-37)은 서열 HAEGTFTSDV SSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (서열번호 12)를 가진다. 상기 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 치환, 삭제, 부가 및/또는 삽입을 포함하는 펩티드 또는 화합물을 의미한다.
한 구체예에서 상기 GLP-1 수용체 작용제는 GLP-1(7-37)의 전체 길이에 걸쳐 GLP-1(7-37)에 대한 적어도 60%, 65%, 70%, 80% 또는 90%의 서열 동일성을 나타내는 펩티드 또는 화합물일 수 있다.
그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 상기 GLP-1 수용체 작용제는 바람직하게는 리라글루타이드(liraglutide), 세마글루타이드(semaglutide), 엑세나타이드(exenatide) 또는 이의 조합일 수 있으며, 가장 바람직하게는 리라글루타이드 또는 이의 염일 수 있다.
본 발명에서 상기 리라글루타이드(liraglutide)은 빅토자 또는 삭센다라는 상표명으로 판매되고 있는 제2형 당뇨병을 가진 성인의 혈당 조절용 또는 성인 체중 조절용 약물로서, 식이요법 및 운동의 보조제로 이용되는 GLP-1 수용체 작용제이다. 리라글루타이드는 34번 위치의 라이신이 아르기닌으로 치환되고 글루타모일 스페이서를 통해 26번 위치의 라이신에 팔미토일 그룹이 결합된, 자연적으로 발생한 인간 GLP-1(7-37)의 지속작용 유사체이다.
본 발명이 제공하는 상기 복합체는 리라글루타이드 등 GLP-1 수용체 작용제를 세포막을 통해 이동시키는 세포막투과 전달체(transmembrane carrier)로서의 기능을 나타낸다.
본 발명에서 상기 세포 투과성 펩타이드는 매우 작은 펩타이드이므로 혹시 발생할 수 있는 GLP-1 수용체 작용제 대한 생물학적 간섭을 최소화할 수 있다. 본 발명이 제공하는 상기 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제 복합체는 정맥내(intravein), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 생체 내 전달될 수 있다.
본 발명에 있어서 복합체는 하나 이상의 펩타이드에 하나 이상의 GLP-1 수용체 작용제가 포함된 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 "복합체"에서 상기 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제는 1 : 1, 1 : 다 (多), 다 (多) : 1, 다 (多) : 다 (多)의 비율로 포함된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 펩타이드와 상기 GLP-1 수용체 작용제는 1 : 1 내지 1 : 100, 또는 100 : 1 내지 1 : 1의 몰비로 포함된 것일 수 있다. 그러나 상기 몰비는 예시적인 것이며 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 상기 복합체는 상기 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제가 단순히 혼합 (mixing)된 것, 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제가 혼합되어 형성된 것, 또는 이들이 화학결합에 의해 연결되거나 컨쥬게이션 되어 생성된 것을 모두 포함한다. 또한 복합체는 물리적 결합, 화학적 결합, 공유 결합, 비공유 결합으로 연결되거나, 매개체를 이용하여 통합된 또는 융합된 형태로 연결될 수 있다. 예를 들어, GLP-1 수용체 작용제가 단백질인 경우, 해당 단백질 서열에 상기 세포 투과성 펩타이드의 코딩 서열을 추가하여 여러 링커와 연결한 후 융합 단백질 (fusion protein)의 형태로 세포를 투과하거나 조직, 혈액으로 운반될 수 있으나 복합체를 형성하는 방법에는 제한이 없다. 또한, 상기 GLP-1 수용체 작용제는 상기 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 결합될 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 '복합체'는 상기 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제가 단순히 혼합 (mixture)된 상태일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 "복합체"는 상기 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제가 혼합 (mixture)에 의해 복합체를 이룬 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제는 완충액에 용해되어 일정 몰비로 혼합될 수 있으며, 혼합 후 안정화를 위해 일정한 온도, 예를 들어 상온에서, 또는 4 냉장 온도에서 일정 시간, 예를 들어 1 초 내지 1 시간 동안 방치될 수 있다. 상기 온도 및 시간은 예시적인 것이며 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 "복합체"는 상기 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제가 화학결합 (chemical bond)에 의해 서로 연결된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 화학결합은 공유 결합 또는 비공유 결합이 될 수 있다. 바람직하게는 상기 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제는 비공유결합에 의해 결합된 것일 수 있으며, 이는 본 발명의 세포 투과성 펩타이드 및 상기 GLP-1 수용체 작용제가 동일 용매에서 혼합되어 형성되는 것일 수 있다. 비공유결합의 바람직한 예는 수소결합, 이온결합, 반데르발스 상호작용 또는 소수성 상호작용의 각각 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 화합결합이 공유결합에 의하는 경우 예컨대, 상기 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제에 각각 특정 작용기 또는 링커를 결합시킨 후, 이에 의하여 화학 결합이 일어나도록 할 수 있다. 상기 화학 결합은 아민 반응 (amine reaction), 티올 반응 (thiol reaction), 카복실레이트 반응 (carboxylate reaction), 하이드록실 반응 (hydroxyl reaction), 알데하이드 반응 (aldehyde reaction), 케톤 반응 (ketone reaction), 아크릴레이트 반응 (Acrylate reaction), 아자이드 반응 (Azide reaction), 알키인 반응 (Alkyne reaction), 카테콜 반응 (catechol reaction) 및 피로갈롤 반응 (pyrogallol reaction) 중 어느 하나의 반응에 의한 화학 결합일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 화학 결합이 아민 반응에 의한 것일 경우, 상기 세포투과성 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제 중 어느 하나에는 아민기가 연결되고, 다른 하나에는 이소티오시안산염 (Isothiocyanates), 이소시아네이트 (Isocyanates), 아크릴 아자이드 (Acryl azide), NHS (N-hydroxysuccinimide) 에스터, 아실클로라이드 (acyl chloride), 술포닐 클로라이드 (Sulfonyl chloride), 알데하이드 (Aldehyde), 에폭시드 (Epoxide), 플루오로벤젠 (Fluorobenzene), 또는 무수숙신산 (Succinic Anhydride)이 연결된 것일 수 있다. 아민기와 이소티오시안산염의 반응으로 이소티오우레아 (isothiourea) 결합이 형성되고, 아민기와 이소시아네이트의 반응으로 이소우레아 (isourea) 결합이 형성되고, 아민기와 아크릴 아자이드, NHS 에스터, 아실클로라이드 (acyl chloride), 또는 무수숙신산의 반응으로 아마이드 (amide) 결합이 형성되고, 아민기와 술포닐 클로라이드의 반응으로 술폰아마이드 결합이 형성되고, 아민기와 알데하이드 또는 에폭시드의 반응으로 아민 결합이 형성되고, 아민기와 플루오로벤젠의 반응으로 아릴아민 (arylamine) 결합이 형성될 수 있으나, 상기 예시에 한정되지 않는다.
상기 화학 결합이 티올 반응에 의한 것일 경우, 상기 세포투과성 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제 중 어느 하나에는 티올기가 연결되고, 다른 하나에는 이오도아세틸 (Iodoacetyl), 말레이미드 (Maleimide), 아지리딘 (Aziridine), 아크릴로일 (Acryloyl), 플루오로벤젠 (Fluorobenzene), 또는 비닐설폰 (Vinylsulfone)이 연결된 것일 수 있다. 티올기와 이오도아세틸, 말레이미드, 아지리딘, 아크릴로일, 또는 비닐설폰의 반응으로 티오에테르 (thioether) 결합이 형성되고, 티올기와 플루오로벤젠의 반응으로 아릴 티오에테르(aryl thioether) 결합이 형성될 수 있으나, 상기 예시에 한정되지 않는다.
상기 화학 결합이 카복실레이트 반응에 의한 것일 경우, 상기 세포투과성 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제 중 어느 하나에는 카복실레이트기가 연결되고, 다른 하나에는 다이아조아세트산 (Diazoacetate)이 연결된 것일 수 있다. 이 경우의 결합은 에스터 (ester) 결합이나, 상기 예시에 한정되지 않는다.
상기 화학 결합이 하이드록실 반응에 의한 것일 경우, 상기 세포투과성 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제 중 어느 하나에는 하이드록실기가 연결되고, 다른 하나에는 이소시아네이트 (Isocyanates)가 연결된 것일 수 있다. 이 경우의 결합은 카바메이트 (carbamate) 결합이나, 상기 예시에 한정되지 않는다.
상기 화학 결합이 알데하이드 반응에 의한 것일 경우, 상기 세포투과성 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제 중 어느 하나에는 알데하이드기가 연결되고, 다른 하나에는 하이드라자이드 (Hydrazide) 또는 아민 (Amine)이 연결된 것일 수 있다. 알데하이드기와 하이드라자이드의 반응으로 하이드라존 (hydrazone) 결합이 형성되고, 알데하이드기와 아민의 반응으로 쉬프 염기 (schiff base)가 형성될 수 있으나, 상기 예시에 한정되지 않는다.
상기 화학 결합이 케톤 반응에 의한 것일 경우, 상기 세포투과성 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제 중 어느 하나에는 케톤기가 연결되고, 다른 하나에는 하이드라자이드 또는 아민이 연결된 것일 수 있으나, 상기 예시에 한정되지 않는다.
상기 화학 결합이 아크릴레이트 반응에 의한 것일 경우, 상기 세포투과성 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제 중 어느 하나에는 아크릴레이트가 연결되고, 다른 하나에는 다이아조아세트산 또는 알켄이 연결된 것일 수 있으나, 상기 예시에 한정되지 않는다.
상기 화학 결합이 아자이드 반응에 의한 것일 경우, 상기 세포투과성 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제 중 어느 하나에는 아자이드기가 연결되고, 다른 하나에는 알켄 (alkene)이 연결된 것일 수 있다. 이 경우 트리아졸린 (triazoline)이 형성될 수 있으나, 상기 예시에 한정되지 않는다.
상기 화학 결합이 알키인 반응에 의한 것일 경우, 상기 세포투과성 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제 중 어느 하나에는 알키인 (alkyne)이 연결되고, 다른 하나에는 아자이드기가 연결된 것일 수 있다. 이 경우 트리아졸 (triazole)이 형성될 수 있으나, 상기 예시에 한정되지 않는다.
또한 상기 화학 결합이 카테콜 반응 또는 피로갈롤 반응인 경우, 상기 세포투과성 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제 중 어느 하나에는 카테콜기가 연결되고, 다른 하나에는 아민 또는 티올기가 연결된 것일 수 있으나, 상기 예시에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 세포투과성 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제의 결합이 공유 결합일 경우, 상기 결합은 펩타이드 결합 (peptide bond), 말레이미드 링커 결합 (Maleimide linker bond), 이황화 결합 (Disulfide bond), 설파닐 (바이-펑셔널) 결합 (sulfanyl (bi-functional) bond)이 될 수 있다. 본 발명의 다른 구현예로서, 상기 세포투과성 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제의 결합이 비공유 결합일 경우, 상기 결합은 전하 의존성 결합 (Charge-dependent bond)이 될 수 있다. 그러나 결합의 종류는 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 "복합체"에서 상기 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제는 링커 (linker)로 연결된 것일 수 있다. 상기 링커는 당업계에 공지된 임의의 링커가 될 수 있다.
그러나 화학 결합의 종류 및 사용되는 링커 또는 작용기의 종류는 상술한 것에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 "복합체"는 상기 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제가 서로 융합 (fusion)된 상태로 발현되어 이룬 복합체가 될 수 있다. 예를 들어, 하나의 벡터 내에 상기 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제를 발현하는 유전자를 삽입한 후, 상기 벡터로 생물을 형질전환시켜 벡터에 삽입된 유전자를 발현하도록 하면, 상기 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제가 융합 단백질 (fusion protein)로서 발현될 수 있다. 융합 단백질로 발현될 때, 상기 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제 간에 임의의 링커가 포함되도록 할 수 있다. 예를 들어 상기 링커는 1 개 이상의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커가 될 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 예를 들어, 1 내지 100 개 또는 2 내지 50 개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 펩타이드 링커는, 예컨대, Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 한편, 상기 링커는 상기 복합체의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 즉, 상기 링커는 Gly, Asn, Ser, Thr 및 Ala로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 총 1 내지 100 개 또는 2 내지 50 개 포함하여 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 복합체에는 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제 이외에 특정 세포나 특정 세포 내 소기관에 타겟팅할 수 있는 부위, pH 변화, 특정 효소의 수준, 온도 등 특정 환경에서 펩타이드의 부위가 활성화되도록 하는 부위, 특정 환경 조건에서 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제가 분리되도록 하는 부위, 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제가 복합체를 생성할 때에 둘 사이에 링커 (linker) 부위나 chemical moiety 등 다양한 특정 부위가 부가될 수 있다. 예를 들어 국소 질병 환경 (경색, 암, 염증 등), 국소 부위의 microwave, ultrasound, radiofrequency 등이 적용되기 전까지 PTD의 기능이 감춰져 있다가 특정 환경 변화에서 PTD가 기능하여 GLP-1 수용체 작용제의 운반을 촉진하는 등 세포 혹은 환경 선택적인 다기능을 가진 GLP-1 수용체 작용제의 운반이 가능할 수 있다. 생체 내에서의 안정성을 증가시키고, 약동학적 특성을 개선하여 효능을 극대화시키거나 부작용을 줄이기 위한 다양한 부위가 추가될 수 있다. 또한, PTD의 GLP-1 수용체 작용제의 세포질로의 운반 효율을 높이기 위하여 세포질로 GLP-1 수용체 작용제의 유리를 촉진하는 인자가 추가될 수 있다. 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제의 복합체 내에서의 위치는 제한이 없으며, 특수한 기능을 나타낼 수 있는 추가 부위나 특수한 환경에서 복합체의 작용을 조절하거나 절단할 수 있는 부위가 포함될 수 있으며, 이 부위는 상기 예시에 한정되지 아니한다.
다양한 나노운반체 (nanocarrier)의 형태로 복합체가 형성될 수 있으며, 나노운반체로서 리포좀 (liposome)이나 마이셀 (micelle) 등 막지질 기반의 나노운반체들에 특정 세포나 분자를 표적할 수 있는 리간드나 분자 이미징을 위한 기능성기의 수식을 통해 질병의 진단과 치료에 적용할 수 있다. 본 발명에서 상기 펩타이드를 리간드로 이용해 리포좀이나 마이셀을 수식하여 리포좀이나 마이셀에 싸여져 있는 약물 혹은 나노파티클의 세포 내로의 전달을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 복합체는 GLP-1 수용체 작용제를 생체 조직 또는 혈중으로 전달시키거나 세포 투과를 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 복합체는 생체 조직을 구성하는 세포 또는 세포 간 연접을 통하여 전달될 수 있으나 전달 방식에는 제한이 없다.
상기 생체 조직은 하나 이상의 상피조직, 근육조직, 신경조직, 결합조직을 의미하며 각 장기는 하나 이상의 조직으로 이루어질 수 있으므로, 점막, 피부, 뇌, 폐, 간, 신장, 비장, 폐장, 심장, 위장, 대장, 소화관, 방광, 요관, 요도, 난소, 정소, 생식기, 근육, 혈액, 혈관, 림프관, 림프절, 흉선, 췌장, 부신, 갑상선, 부갑상선, 후두, 편도, 기관지, 폐포의 다양한 생체 장기가 포함될 수 있으나, 상기 예시에 제한되지 않는다.
상기 생체 조직을 구성하는 세포는 상피세포, 근육세포, 신경세포, 선세포, 신경교세포, 생식세포, 줄기세포, 중간엽세포, 중간엽줄기세포, 골아세포, 골세포, 조골세포, 파골세포, 혈구세포, 조혈세포, 폐세포, 간세포, 섬유아세포, 면역세포, 내피세포, 지방세포, 연골세포 등 다양한 세포가 포함될 수 있으나, 상기 예시에 제한되지 않는다.
상피세포에는 점막상피세포, 모낭상피세포, 소화관상피세포, 호흡기상피세포, 생식기상피세포, 비뇨기상피세포 등이 포함된다. 내피세포는 혈관내피세포 또는 림프관내피세포 등이 있으나, 상기 예시에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 복합체는 점막 또는 피부를 통하여 GLP-1 수용체 작용제를 전달시키기 위한 것일 수 있으나, 상기 예시에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 복합체는 경구제제, 주사제, 점막투여제제, 구강 점막 투여 제제, 비강 투여 제제, 안과 제제, 질 투여 제제, 흡입제, 외용제제, 및 경피 흡수제, 설하 투여 제제, 이식 제제, 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 형태로 이용될 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
상기 '경피 흡수제' 또는 "경피 투여"라는 용어들은 진피 조직, 특히 바깥쪽 피부 (상피(epidermis)) 또는 막(membrane) 위에 직접적인 접촉, 층을 이루는 것(layering) 또는 도포하는 것(spreading)을 의미한다. 본 발명의 조성물이 경피 투여용인 경우 상기 조성물은 피부 투과 증진제 (penetration enhancer)를 추가로 포함할 수 있다. 피부 투과 증진제는 피부 표면을 통한 수송 속도를 증진시키는 시약을 지시한다. 피부 투과 증진제는 이를테면 조성물 중량의 약 0.1% 내지 약 50% 사이의 여하한 용량으로 존재할 수 있다. 일부 실시예들에서, 피부 투과 증진제는 조성물 중량의 약 0.1% 내지 약 25% 사이의, 약 0.5% 내지 약 10% 사이의, 또는 약 1% 내지 약 5% 사이의 용량으로 존재할 수 있다. 피부 투과 증진제들의 비-제한적 예시들은 설폭사이드들 이를테면 디메틸설폭사이드 (DMSO), 에테르들 이를테면 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 (예컨대 트랜스쿠톨 P, 제조원 Gattefosse Cedex, France), 그리고 계면활성제들 이를테면 소듐 라우레이트, 소듐 라우릴 설페이트, 트윈 20, 40, 60, 80 (제조원 Croda Inc, Edison, NJ, U.S.A.); 알코올들 이를테면 에탄올, 프로판올, 벤질 알코올; 지방산들 이를테면 라우릭 애시드, 올레익 애시드, 발레릭 애시드 및 이소스테아릭 애시드; 지방산 에스테르들 이를테면 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 메틸프로피오네이트, 그리고 에틸 올레이트; 폴리올들 및 이들의 에스테르들 이를테면 프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜, 글리세롤, 부탄디올, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 글리콜 모노라우레이트; 아마이드들 그리고 여타 질소 화합물들 이를테면 유레아, 디메틸아세트아마이드 (DMA), 디메틸포름아마이드 (DMF), 2-피롤리돈, 1-메틸-2-피롤리돈, 에탄올아민, 디에탄올아민 및 트리에탄올아민; 테르펜들; 알카논들을 포함한다. "경피 투과 증진제들(Percutaneous Penetration Enhancers), eds." Smith 등 (CRC Press, 1995) 은 해당 분야에 대한 개관 및 증진제들에 대한 추가적 배경 지식을 제공한다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 복합체는 상기 GLP-1 수용체 작용제가 특정 기관 또는 특정 세포내 소기관으로 전달되도록 하는 신호 서열 (signal peptide)을 더 포함할 수 있다. 신호 서열이란 일반적으로 5 - 30 아미노산 길이의 짧은 펩타이드로서, 특정 세포내 소기관 (ER, 골지, 엔도솜) 내에 머물거나, 세포로부터 분비되거나, 세포막 내에 삽입된다. 본 발명의 복합체는 임의의 공지의 신호 서열을 포함할 수 있으며, 상기 신호 서열에 의해 GLP-1 수용체 작용제가 세포 내 특정 부위로 이동하도록 할 수 있으나, 상기 예시에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 복합체는 상기 GLP-1 수용체 작용제가 특정 기관 또는 특정 세포를 타겟팅하여 그 특정 기관 또는 특정 세포 내로 특이적으로 전달되도록 하는 물질 혹은 부위를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 복합체는 특정 세포에 존재하는 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 더 포함할 수 있다. 예컨대 본 발명의 복합체에서 상기 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제의 복합체에 유방암세포의 HER-2 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 (허셉틴)가 추가적으로 결합되어 있는 경우, 펩타이드-GLP-1 수용체 작용제의 복합체는 상기 항체를 통해 유방암 세포에 특이적으로 결합하고 그 세포 내로 전달될 수 있다. 이와 같이 본 발명에서 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제의 복합체가 특정 기관 또는 특정 세포 내로 전달될 수 있도록 하는 물질의 종류에는 제한이 없으며, 당업계에 알려진 임의의 타겟팅 분자가 본 발명에 적용될 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 세포 밖이나 내부에서만 세포 투과능이 활성화되는 세포 투과성 펩타이드 (Activable cell penetrating peptide)의 일환으로 pH-sensitive system, enzyme-sensitive system, light-sensitive system, oxygen-sensitive system 등을 활용하여 특정 pH, 효소활성, 빛, 산소 환경에 따라 PTD의 세포투과 효능이 발현되어 특이적인 전달을 가능하게 하는 부위 혹은 물질을 더 포함할 수 있으나, 상기 예시에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 복합체 또는 이를 포함하는 조성물은 상기 펩타이드 및 GLP-1 수용체 작용제가 세포 내의 엔도솜에서 더 쉽게 방출 (endosomal release, endosomal escape)되도록 하는 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, membrane-disruptive peptides, membrane-disruptive polymers, lysosomotropic agent 등이 가능하며, p53 단백질의 사합체화 도메인 (p53tet)을 상기 펩타이드에 연결시키거나, HA2 융합 펩타이드와 같은 PMAPs (pH-Dependent Membrane Active Peptides)를 상기 펩타이드에 연결시키는 등의 전략을 취할 수 있으나, 상기 예시에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 복합체 또는 이를 포함하는 조성물은 상기 펩타이드 혹은 GLP-1 수용체 작용제의 반감기를 증가시킬 수 있는 물질 혹은 부위를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 복합체는 상기 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제가 목적하는 세포로 전달되기 전까지 체내에서 분해되지 않도록 하는 제형화될 수 있다. 예를 들어, 상기 GLP-1 수용체 작용제가 위장 또는 소장 상피에서 흡수되도록 하는 것이 목적인 경우, 상기 펩타이드와 GLP-1 수용체 작용제가 소화관의 위장 또는 소장 상피에 도착하기까지 분해되거나 다른 임의의 세포로 흡수되지 않도록 제형화될 수 있다.
한편, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 조성물을 제공한다. 아울러, 본 발명은 본 발명에 따른 복합체를 유효성분으로 포함하는 비강 투여용 조성물을 제공한다. 아울러, 본 발명은 본 발명에 따른 복합체를 유효성분으로 포함하는 경피 투여용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드 및 GLP-1 수용체 작용제(Glucagon like peptide-1 receptor agonist)를 혼합하는 단계를 포함하는, 상기 복합체 제조방법을 제공한다:
MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6
상기 식에서,
R1은 A, V, I, L, S, F, K 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R2는 S, L, F, T 및 Y로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
R3는 E, L, A 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R4는 Q, H, T, L, D 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
R5는 L, S, V, A, K 및 H로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R6는 DK, EK, QK, NK, KK 및 FK로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 디펩타이드이다.
본 발명은 또한 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 복합체를 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 당업계에 공지되어 있는 것을 참고로 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명에서 상기 조성물은 사용목적 내지 양상에 따라 함량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들면 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~99 중량%, 바람직하게는 0.5~50 중량%, 더 바람직하게는 1~30 중량%일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 방법으로 제조된 세포 투과성 펩타이드 및 GLP-1 수용체 작용제를 0.1 내지 99.9 중량%로 포함하고, 담체를 99.9% 내지 0.1 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물의 세포 투과성 펩타이드 및 GLP-1 수용체 작용제는 세포 투과성 펩타이드를 0.01 내지 99.99 중량%로 포함하고, GLP-1 수용체 작용제를 99.99% 내지 0.01 중량%로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 GLP-1 수용체 작용제의 경구 투여용 제제 제조용 조성물을 제공한다:
MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6
상기 식에서, R1 내지 R6는 상기한 바와 같다.
또한, 본 발명은 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 GLP-1 수용체 작용제의 비강 투여용 제제 제조용 조성물을 제공한다:
MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6
상기 식에서, R1 내지 R6는 상기한 바와 같다.
또한, 본 발명은 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 GLP-1 수용체 작용제의 경피 투여용 제제 제조용 조성물을 제공한다:
MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6
상기 식에서, R1 내지 R6는 상기한 바와 같다.
또한 본 발명은 당뇨병 또는 비만 치료용 제제를 제조하기 위한 상기 복합체의 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 당뇨병 또는 비만을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 '유효량'이란 개체에게 투여하였을 때, 당뇨병 또는 비만의 개선, 치료, 검출, 진단 또는 당뇨병 또는 비만의 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 '개체'란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자(patient) 일 수 있다.
본 발명의 상기 '치료'는 당뇨병 또는 비만 또는 당뇨병 또는 비만으로 인한 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 상기 질환을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 상기 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "을 포함하는(comprising)"이란 "함유하는(including)" 또는 "특징으로 하는(characterized by)"과 동일한 의미로 사용되며, 본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 있어서, 구체적으로 언급되지 않은 추가적인 구성 성분 또는 방법의 단계 등을 배제하지 않는다. 또한 용어 "로 이루어지는(consisting of)"이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 "필수적으로 이루어지는(essentially consisting of)"이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 물질 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계 등을 포함할 수 있는 것을 의미한다.
세포 투과성 펩타이드 및 GLP-1 수용체 작용제를 포함하는 본 발명의 복합체는 GLP-1 수용체 작용제의 세포막 투과능을 개선하여 비침습적인 방법에 따라 약물을 투여하는 것을 가능하게 하거나, 약물을 세포, 조직, 혈액 등 생체 내로 효과적으로 전달할 수 있다.
도 1a 내지 1f는 본 발명의 펩타이드들을 다양한 농도로 BEAS-2B 세포 또는 HeLa 세포에 처리하고, 15 분 후(1a, 1b), 30분 후 (1c, 1d) 및 2시간 후(1e, 1f) 세포 내 투과정도를 분석한 결과이다.
도 2a 및 2b는 본 발명의 펩타이드를 다양한 농도로 BEAS-2B 세포 또는 HeLa 세포에 처리하고, BEAS-2B 세포에서 30 분 후 형광 현미경으로 분석하였고(2a), HeLa 세포에서 2 시간 후 형광 현미경으로 분석한 결과(2b)이다.
도 3은 본 발명의 CPP 후보군과 리라글루타이드의 결합 비율을 확인하기 위해 표면 플라드몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 분석한 결과이다.
도 4는 인간 유래 대장암 세포인 Caco-2 세포주에서 세포 투과성 펩타이드와 리라글루타이드의 복합체를 처리한 후, 세포 투과능을 평가한 결과이다.
도 5는 세포 투과성 펩타이드와 리라글루타이드의 복합체를 HeLa 세포에 처리하고, 1 시간 30 분 후 세포 내 투과 정도를 형광 현미경으로 관찰하고 이를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 세포 투과성 펩타이드와 리라글루타이드의 복합체를 HeLa 세포에 처리하고, 24 시간 후 세포 독성 정도를 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 세포 투과성 펩타이드의 제작
세포 투과성을 나타내는 펩타이드를 제작하기 위해 하기 표 1에 나타낸 서열번호 1 내지 10의 각 펩타이드를 순도 95% 이상이 되도록 제작하였다. 이 펩타이드 합성은 아이큐어펩젠㈜에 의뢰하여 진행하였다.
서열번호 명칭 서열
서열번호 1 BCP 1 MIIFRASEQLDK
서열번호 2 BCP 2 MIIFRVLEQSEK
서열번호 3 BCP 3 MIIFRIFLHLQK
서열번호 4 BCP 4 MIIFRLFLHLNK
서열번호 5 BCP 5 MIIFRLSATVKK
서열번호 6 BCP 6 MIIFRSTALVKK
서열번호 7 BCP 7 MIIFRLSATAKK
서열번호 8 BCP 8 MIIFRFYEDAFK
서열번호 9 BCP 9 MIIFRKKEDKDK
서열번호 10 BCP 10 MIIFRRLRRHKK
서열번호 11 TAT(대조군) GRKKRRQRRR
실시예 2: 세포 투과성 펩타이드의 세포 내 투과 양상 확인
본 발명의 펩타이드의 세포 내 투과 양상을 형광 현미경으로 확인하였다.
이를 위하여 상기 실시예 1에서 제작한 서열번호 1 내지 10의 각 펩타이드의 아미노 말단에 로다민(Rhodamine) 형광 염료를 표지(labelling) 하였다. BEAS-2B 세포 또는 HeLa 세포에 다양한 농도의 BCP1 내지 BCP10의 펩타이드를 처리한 후 15분, 30분 및 2시간 경과 후 세포 내 펩타이드의 농도를 평가하였다. 대조군으로는 TAT 펩타이드(GRKKRRQRRR)(서열번호 11)를 사용하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 BCP1 내지 BCP10의 펩타이드는 모두 대조군으로 사용된 TAT보다 월등히 향상된 세포 투과도를 나타낸 것으로 확인되었다
그 다음으로, 10μM 과 50μM의 농도로 펩타이드 BCP3, BCP4, BCP5를 BEAS-2B 세포 또는 HeLa 세포에 처리하였고, 대조군 TAT도 같은 농도로 처리하였다. 단, 세포 접종시 세포 배양 슬라이드에 접종하였는데, 이는 형광 현미경 관찰시 플라스틱은 형광간섭현상을 유발하기 때문이다. 세척 후 mounting medium with DAPI를 사용하여 유리 커버 글라스를 슬라이드 글라스에 밀착시켜 형광 현미경 400배로 시료를 관찰하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, BCP3, BCP4 및 BCP5는 모두 대조군으로 사용된 TAT보다 월등히 향상된 세포 투과도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 세포 투과성 펩타이드 및 리라글루타이드의 결합 비율 평가
세포 투과성 펩타이드(CPP) BCP3, BCP4 및 BCP5와 리라글루타이드의 상호결합 및 흡착 또는 해리 정도를 통하여 결합 비율을 확인하기 위해 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 분석을 진행하였다.
분석은 Dextran chip에 각 CPP를 고정하고 리라글루타이드를 통과시킬 때 분자상호결합에 의한 흡착 정도를 측정하였다.
그 결과, 하기 표 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, BCP3, BCP4 및 BCP5 모두 리라글루타이드와 높은 결합력을 나타내었으며, 이 중에서 특히 BCP3과 리라글루타이드와의 결합력이 가장 높은 것으로 확인되었다.
Figure PCTKR2022006923-appb-img-000001
실시예 4: 세포 투과성 펩타이드 및 리라글루타이드 복합체의 세포막 투과능 평가
인간 유래 대장암세포인 Caco-2 세포주를 준비하고, 12-웰 플레이트에 인서트를 장착하여 각 웰 당 1 X 105개씩 분주한 다음, 세포배양액 (DMEM)으로 하여, 37℃의 가습조건이 유지되는 5% CO2 인큐베이터에서 21일간 배양하였다.
2일 마다 새로운 세포 배양액으로 교체해주고, 21~28일 후 세포를 분주한 웰에 투과능 실험을 진행하였다. HBSS에 리라글루타이드와 세포 투과성 펩타이드 BCP3, BCP4 또는 BCP5를 몰 비율에 맞게 각각 혼합하여 각 웰에 리라글루타이드의 농도가 100μM이 되게 제조하였다.
각 세포 투과성 펩타이드와 리라글루타이드의 혼합물은 인서트 위쪽 donor에 500uL 처리하였으며, 약물 처리 후 5시간 동안 1시간마다 인서트 아래쪽 acceptor에 200uL씩 얻어 HPLC로 분석했다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 리라글루타이드 단독군(LRG)보다 세포 투과성 펩타이드 및 리라글루타이드 혼합물의 투과도가 향상된 것으로 나타났고, 이 중에서 BCP3과 리라글루타이드를 1:1의 몰비로 혼합한 복합체의 투과능이 가장 높은것으로 나타났다.
실시예 5: 세포 투과성 펩타이드 및 리라글루타이드 복합체의 세포 내 투과 양상
자궁경부암 세포주인 HeLa 세포주를 준비하고, 세포막을 투과하여 세포 내 축척된 리라글루타이드를 검출하기 위해, 리라글루타이드의 N-말단에 형광물질인 FITC(fluorescein isothicyanate)로 라벨시켰다.
그 다음 상기 실시예 4에서 투과능이 제일 높았던 서열번호 BCP3과 리라글루타이드 복합체를 1:0.5 및 1:1의 몰비로 각각 혼합하여 혼합물을 제조하였고, 각각 HeLa 세포주에 1 시간 30 분 동안 처리하였다.
배양이 종결된 후, HeLa 세포의 세포막에 남아있는 혼합물을 제거하기 위해 PBS로 3 회 세척하였다. 세포 내 투과 양상을 형광현미경으로 확인한 후, 마이크로 플레이트 형광 판독기(SYNERGY H1 microplate reader, BIO-TEK)를 사용하여 방출(emission) 518nm, 여기(excitation) 493nm에서 측정하여 세포 내로 들어간 리라글루타이드의 지표인 FITC의 형광도를 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 리라글루타이드 단독군(LRG)보다 BCP3와 리라글루타이드 복합체 처리군에서 높은 수준의 형광이 관찰되어 BCP3와 리라글루타이드 혼합체가 자궁경부암세포의 세포막을 잘 투과함을 알 수 있었다.
실시예 6: 독성평가
상기 제조한 각 복합체가 세포독성을 나타내지 않아 치료제로 이용할 수 있는지 여부를 확인하였다.
실시예 4와 같이 각 세포 투과성 펩타이드와 리라글루타이드를 몰 비율에 맞게 각각 혼합하여 혼합물을 HeLa 세포주에 24시간 동안 처리한 후, CCK-8 (cell counting kit-8)를 사용하여 세포 독성을 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 각 복합체가 세포독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
세포 투과성 펩타이드 및 GLP-1 수용체 작용제를 포함하는 본 발명의 복합체는 GLP-1 수용체 작용제의 세포막 투과능을 개선하여 비침습적인 방법에 따라 약물을 투여하는 것을 가능하게 하거나, 약물을 세포, 조직, 혈액 등 생체 내로 효과적으로 전달할 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.

Claims (17)

  1. 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드 및 GLP-1 수용체 작용제(Glucagon like peptide-1 receptor agonist)를 포함하는 복합체:
    MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6
    상기 식에서,
    R1은 A, V, I, L, S, F, K 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
    R2는 S, L, F, T 및 Y로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
    R3는 E, L, A 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
    R4는 Q, H, T, L, D 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
    R5는 L, S, V, A, K 및 H로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
    R6는 DK, EK, QK, NK, KK 및 FK로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 디펩타이드이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 복합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 GLP-1 수용체 작용제는 리라글루타이드(liraglutide), 세마글루타이드(semaglutide), 엑세나타이드(exenatide) 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 복합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 GLP-1 수용체 작용제는 상기 세포 투과성 펩타이드에 공유결합 또는 비공유결합에 의해 결합된 것을 특징으로 하는 복합체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 비공유결합은 수소결합, 이온결합, 반데르발스 상호작용 및 소수성 상호작용 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 복합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 복합체는 상기 세포 투과성 펩타이드 및 상기 GLP-1 수용체 작용제가 혼합되어 형성되는 것을 특징으로 하는 복합체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 복합체는 GLP-1 수용체 작용제를 생체 조직 또는 혈중으로 전달시키거나, 또는 세포 투과를 촉진시키기 위한 것을 특징으로 하는 복합체.
  8. 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드 및 GLP-1 수용체 작용제(Glucagon like peptide-1 receptor agonist)를 혼합하는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 복합체 제조방법:
    MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6
    상기 식에서,
    R1은 A, V, I, L, S, F, K 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
    R2는 S, L, F, T 및 Y로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
    R3는 E, L, A 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
    R4는 Q, H, T, L, D 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
    R5는 L, S, V, A, K 및 H로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
    R6는 DK, EK, QK, NK, KK 및 FK로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 디펩타이드이다.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 복합체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 복합체를 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 조성물.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 복합체를 유효성분으로 포함하는 비강 투여용 조성물.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 복합체를 유효성분으로 포함하는 경피 투여용 조성물.
  13. 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 GLP-1 수용체 작용제의 경구 투여용 제제 제조용 조성물:
    MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6
    상기 식에서,
    R1은 A, V, I, L, S, F, K 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
    R2는 S, L, F, T 및 Y로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
    R3는 E, L, A 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
    R4는 Q, H, T, L, D 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
    R5는 L, S, V, A, K 및 H로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
    R6는 DK, EK, QK, NK, KK 및 FK로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 디펩타이드이다.
  14. 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 GLP-1 수용체 작용제의 비강 투여용 제제 제조용 조성물:
    MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6
    상기 식에서,
    R1은 A, V, I, L, S, F, K 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
    R2는 S, L, F, T 및 Y로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
    R3는 E, L, A 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
    R4는 Q, H, T, L, D 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
    R5는 L, S, V, A, K 및 H로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
    R6는 DK, EK, QK, NK, KK 및 FK로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 디펩타이드이다.
  15. 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 GLP-1 수용체 작용제의 경피 투여용 제제 제조용 조성물:
    MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6
    상기 식에서,
    R1은 A, V, I, L, S, F, K 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
    R2는 S, L, F, T 및 Y로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
    R3는 E, L, A 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
    R4는 Q, H, T, L, D 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
    R5는 L, S, V, A, K 및 H로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
    R6는 DK, EK, QK, NK, KK 및 FK로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 디펩타이드이다.
  16. 당뇨병 또는 비만 치료용 제제를 제조하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 복합체의 용도.
  17. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 복합체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 당뇨병 또는 비만을 치료하는 방법.
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