WO2023158286A1 - 칼시퀘스트린 기반의 금속이온 반응성 입자 및 이의 용도 - Google Patents

칼시퀘스트린 기반의 금속이온 반응성 입자 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023158286A1
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physiologically active
active substance
particles
particle
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박세호
김성현
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주식회사 툴바이오
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Definitions

  • the present invention relates to calciquestrin-based metal ion-reactive particles and uses thereof. More specifically, the present invention relates to calciquestrin-based metal ion-reactive particles prepared by combining a physiologically active substance widely used in pharmaceuticals and cosmetics with calsequestrin (CSQ) and then reacting with metal ions, and drugs thereof It relates to use in delivery vehicles, pharmaceutical compositions or vaccines.
  • CSQ calsequestrin
  • Korean Patent Publication No. 10-2020-0044977 discloses microparticles containing biodegradable polymers and drugs.
  • calciquestrin is a calcium-binding protein of the myoendoplasmic reticulum, and even though the concentration of calcium is higher in the myoendoplasmic reticulum than in the cytoplasm, it binds to calcium after muscle contraction and functions to store calcium ions in the cisterna of the myoendoplasmic reticulum. .
  • the calciquestrin may exist as a monomer when the amount of calcium is low, and change to a multimer when the amount of calcium increases, thereby increasing in size.
  • the inventors of the present invention have found that when a physiologically active substance (protein, peptide or low molecular weight drug) is combined with calciquestrin and then formed into particles using metal ions, physiological activity After confirming that the in vitro and in vivo stability of the substance is improved, the half-life in the body is increased, the antigen delivery efficiency is increased, and the in vivo effect can be continuously maintained, the present invention has been completed.
  • a physiologically active substance protein, peptide or low molecular weight drug
  • An object of the present invention is to provide particles containing calciquestrin combined with a physiologically active substance, uses thereof, and methods for preparing the same.
  • An object of the present invention is to provide particles containing calciquestrin combined with a physiologically active substance for increasing the in vitro and in vitro stability of the physiologically active substance administered into the body and a method for preparing the same.
  • An object of the present invention is to provide particles containing calciquestrin combined with a physiologically active substance for increasing the in vivo half-life of the physiologically active substance administered into the body and a method for preparing the same.
  • An object of the present invention is to provide particles containing calciquestrin combined with a physiologically active substance for increasing the durability of the effect of the physiologically active substance administered into the body and a method for preparing the same.
  • An object of the present invention is to provide particles containing calciquestrin combined with an antigenic material for increasing the delivery efficiency of an antigen administered into the body and a method for preparing the same.
  • a particle comprising a metal ionically bonded to the calciquestrin is disclosed.
  • the metal is Cu, Ra, Ba, Sr, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Be, Fe(II), Zn, Mg, Mn, Co, Ni, Al, Fe(III), It may be at least one selected from the group consisting of Au, He, Cr, Si, V, Ga, In, La, and Ce.
  • the metal may exclude calcium.
  • the metal may include calcium.
  • the metal may include zinc.
  • the metal may include magnesium.
  • the particles are calciquestrin-based metal ion-reactive particles containing a physiologically active substance fused with calciquestrin, and the particles can be self-assembled by calcium.
  • the physiologically active substance may be covalently bound to calciquestrin.
  • the physiologically active substance may not be covalently bonded to calciquestrin.
  • the physiologically active substance linked to calciquestrin may include a cleavage site between the physiologically active substance and calciquestrin.
  • the physiologically active substance linked to calciquestrin includes a cleavage site between the physiologically active substance and calciquestrin, and the cleavage site is a protease, nuclease, lipase, glycosidase, pH, hypoxia, It can be cleaved by photo-, heat, enzymes, ultrasound and x-rays or hydrolysis.
  • the physiologically active substance bound to calciquestrin may not be cleaved between the physiologically active substance and calciquestrin.
  • a plurality of the calciquestrin may be bound to a single metal.
  • the calciquestrin may contain amino acids having 85% or more sequence homology with one or more amino acid sequences selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 11.
  • a portion of the C-terminal amino acid sequence of wild-type calciquestrin may be modified.
  • a portion of the C-terminal amino acid sequence of wild-type calciquestrin may be deleted.
  • the calciquestrin may include a sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 11.
  • the calciquestrin may consist of a sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 11.
  • the particles may exclude elastin-like polypeptides or elastomers.
  • the particle may exclude a sequence having a repeating unit of VPGXG (X is an amino acid).
  • the physiologically active substance may be at least one selected from the group consisting of macromolecular proteins, peptides, glycoproteins, cytokines, growth factors, blood products, vaccines, hormones, enzymes, antibodies, and synthetic products.
  • the physiologically active substance is interleukin-2, blood factor VII, blood factor VIII, blood factor IX, immunoglobulin, horseradish peroxidase (HRP), cytokine, ⁇ -interferon, ⁇ -interferon, ⁇ -interferon, colony stimulating factor (GM-CSF), human fibronectin extra domain B (EBD), fibroblast growth factor (FGF), Nerve growth factor (NGF), insulinlike growth factor (IGF), transforming growth factor- ⁇ and - ⁇ (TGF- ⁇ , - ⁇ ), brain-derived neurotrophic factor (brain-derived neutrophic factor, BDNF), platelet-derived growth factor (PDGF), placental growth factor (PlGF), hepatocyte growth factor (HGF), exendin, somatostatin ( somatostatin), luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH), adrenocorticotropic hormone, growth hormone-releasing hormone, oxytocin, thymosin alpha-1 ), cortic
  • HRP
  • the physiologically active substance may be a polypeptide of interest.
  • the physiologically active material may have a length of 2 to 1000 amino acids.
  • the physiologically active substance may be a chemical substance of interest.
  • the physiologically active substance may be at least one selected from the group consisting of an immunomodulatory compound, an anticancer agent, an antiviral agent, an antibacterial agent, an antifungal agent, and an anthelmintic agent.
  • the average diameter of the particles may be 10nm to 1cm.
  • the particles may not be assembled by temperature change.
  • the particles may exclude polymers.
  • the particle can be used to deliver a physiologically active substance to a subject in need thereof.
  • the particles can be used for tissue regeneration.
  • the half-life of the bioactive material may be increased compared to before the bioactive material is granulated.
  • the half-life of the bioactive material may be increased by at least 10% compared to before the bioactive material is granulated.
  • the stability of the physiologically active substance in the body may be increased compared to before the physiologically active substance is granulated.
  • the stability of the physiologically active substance in the body may be increased by at least 10% compared to before the physiologically active substance is granulated.
  • the durability of the effect of the physiologically active substance may increase as the stability of the physiologically active substance in the body increases, compared to before the physiologically active substance is granulated.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating one or more diseases selected from the group consisting of skin wounds, diabetes, inflammatory diseases, ophthalmic diseases, tissue regeneration, infectious diseases, and cancer diseases, including the particles according to the first embodiment, is disclosed.
  • the composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • a vaccine for preventing or treating one or more diseases selected from the group consisting of inflammatory diseases, infectious diseases, and cancer diseases, comprising the particles according to the first embodiment or the pharmaceutical composition according to the second embodiment, is disclosed.
  • the vaccine may include an adjuvant.
  • the vaccine may be lyophilized.
  • kits for preparing particles comprising calciquestrin and a physiologically active substance configured to be linked to the calciquestrin.
  • a metal configured to ionic bond with the calciquestrin may be further included.
  • the kit may be a kit for preparing metal ion-reactive particles based on calciquestrin including the calciquestrin and a physiologically active substance configured to be linked to the calciquestrin.
  • the kit is Cu, Ra, Ba, Sr, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Be, Fe (II), Zn, Mg, Mn, Co, Ni, Al, Fe (III), It may include one or more selected from the group consisting of Au, He, Cr, Si, V, Ga, In, La, and Ce.
  • the physiologically active substance fused with calciquestrin may be included in the form of a nucleotide molecule that coats it.
  • the physiologically active substance fused with calciquestrin may be included in the form of an expression vector containing a nucleic acid coating it.
  • the physiologically active substance fused with calciquestrin may be included in the form of a cell transformed with an expression vector containing a nucleic acid encoding the same.
  • a method for producing particles according to the first embodiment is disclosed.
  • the method may include mixing a metal with a physiologically active substance connected to the calciquestrin.
  • the method may further include linking calciquestrin to the physiologically active substance.
  • the method may further include the step of recombinantly expressing a sequence containing the calciquestrin and a physiologically active substance.
  • the method may further include a step of purifying the physiologically active substance linked to the calciquestrin.
  • the host cell is Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Salmonella typhimurium, Serratia marcessons, Pseudomonas species, yeast, insect cells, CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN, MDCK cell line, and plant cells.
  • the method may further include preparing the physiologically active substance to form a chemical bond with calciquestrin.
  • the present invention discloses a method for delivering a bioactive substance to a subject in need thereof.
  • the method comprises:
  • the method may include administering calciquestrin, a physiologically active substance, and a metal to form the particles according to the first embodiment to the subject.
  • the calciquestrin may be linked to a physiologically active substance.
  • the administration may include expressing calciquestrin and a nucleotide molecule encoding a physiologically active substance in a subject.
  • the administration may include expressing a first nucleotide molecule encoding calciquestrin and a second nucleotide molecule encoding a physiologically active substance in a subject.
  • the administration may include parenteral, oral, subcutaneous, topical, intramuscular, transdermal, buccal, sublingual, intranasal, transvascular, subcutaneous, orbital or respiratory administration.
  • the physiologically active substance may be directly administered to the target site of the subject's disease.
  • the physiologically active substance may not be directly administered to the target site of the subject's disease.
  • the step of releasing the bioactive material from the particles may be further included.
  • a step of releasing the physiologically active substance from the particles in a free form may be further included.
  • a step of releasing the physiologically active substance from the particles in a state linked to calciquestrin may be further included.
  • the stability of the calciquestrin-based metal ion-reactive particles of the present invention is suppressed by hydrolytic enzymes in the body, compared to before particleization by metal ions, thereby improving stability.
  • the half-life of the metal ion-reactive particles based on calciquestrin of the present invention is increased in the body compared to before particleization by metal ions, so that the durability of the effect of the physiologically active substance can be improved.
  • the calciquestrin-based metal ion-reactive particles of the present invention can maintain activity due to improved in vitro stability of the physiologically active substance compared to before particleization by metal ions.
  • the calciquestrin-based metal ion-reactive particles of the present invention can increase the antigen delivery efficiency compared to the particles before particleization by metal ions.
  • Figure 2 shows a schematic diagram of the CSQ-KGF expression vector.
  • 3 is an SDS-PAGE result of purified CSQ-KGF.
  • Figure 4 shows the results of fluorescence microscopic observation and particle distribution machine (DLS) of CSQ-KGF granulated with metal ions (Ca 2+ ).
  • Figure 9 shows the in vivo wound recovery evaluation results of the control group (Saline), native KGF, and CSQ-KGF granulated with metal ions (Ca 2+ ).
  • FIG. 10 shows the results of wound closure analysis of CSQ-KGF granulated with metal ions (Ca 2+ ) and non-particle CSQ-KGF (no particle).
  • FIG. 11 shows a schematic diagram (A) of Exenatide-CSQ expression vector and SDS-PAGE results (B) of purified CSQ-KGF.
  • FIG. 16 shows the results of particleization (A) and immunogenic vaccine efficacy (B) evaluation results according to metal ion (Ca 2+ ) concentration of CSQ-SARS Cov2 RBD.
  • 17 is a schematic diagram showing a method for preparing CSQ-Doxorubicin granulated with metal ions.
  • FIG. 21 shows the results of a particle distribution system (DLS) of CSQ-Anti-VEGF scFv granulated with metal ions (Ca 2+ ).
  • DLS particle distribution system
  • FIG. 30 shows the results of a particle distribution system (DLS) of CSQ-hGH granulated with metal ions (Ca 2+ ).
  • DLS particle distribution system
  • DLS particle distribution machine
  • amino acid refers to both natural and non-natural amino acids, as well as amino acid analogs and mimetics.
  • Natural amino acids include the 20(L)-amino acids used during protein biosynthesis, as well as others such as, for example, 4-hydroxyproline, hydroxylysine, desmosine, isodesmosine, homocysteine, citrulline and ornithine.
  • Unnatural amino acids include, for example, (D)-amino acids, norleucine, norvaline, p-fluorophenylalanine, ethionine, and the like, and are known to those skilled in the art.
  • Amino acid analogs include modified forms of natural and non-natural amino acids.
  • Such modifications may include, for example, substitution or replacement of chemical groups and moieties on amino acids or derivatization of amino acids.
  • Amino acid mimetics include organic structures that exhibit functionally similar properties, such as, for example, the charge and charge spacing properties of a reference amino acid. For example, an organic structure mimicking arginine (Arg or R) will have a positively charged moiety located in similar molecular space and with the same degree of mobility as the e-amino group of the side chain of the natural Arg amino acid.
  • Mimetics also include constrained structures to maintain optimal spacing and charge interactions of amino acids or amino acid functional groups.
  • One skilled in the art knows or can determine the structures that constitute functionally equivalent amino acid analogs and amino acid mimetics.
  • the term "elastin-like polypeptide” refers to a type of amino acid polymer that changes conformation with temperature.
  • the elastin-like polypeptide may be a polymer having "inverse phase transitioning behavior".
  • the reverse phase transition behavior indicates that it is soluble in an aqueous solution at a temperature below the "inverse phase transition temperature (Tt)" and becomes insoluble when the temperature rises above the reverse phase transition temperature.
  • Tt inverse phase transition temperature
  • the elastin-like polypeptide can transition from highly soluble elongated chains to tightly folded aggregates with greatly reduced solubility. This reverse phase transition may be induced by having more ⁇ -turns and distorted ⁇ -structures in the structure of the elastin-like polypeptide as the temperature rises.
  • the elastin-like polypeptide may have, for example, a phase transition temperature of about 10°C to about 70°C or about 39°C to about 70°C.
  • half-life refers to half the pharmacological, physiological or other activity of a bioactive substance according to the present invention, when administered to the serum or tissue of an organism, relative to this activity or at any other defined time point.
  • the term “half-life” also refers to the amount or concentration of a bioactive substance according to the present invention compared to such amount or concentration when administered to the serum or tissue of an organism or any other defined time point.
  • half of the starting amount administered to the serum or tissue of an organism compared to half-life may be measured in serum and/or any one or more selected tissues.
  • the terms “modulating” and “altering” refer to “increasing”, “enhancing” or “stimulating” as well as “increasing”, “enhancing” or “stimulating”, typically a statistically significant or physiologically significant amount or degree relative to a control. Includes “decreasing” or “decreasing”.
  • An “increased”, “stimulated” or “enhanced” amount is typically a “statistically significant” amount, equal to or greater than 1.1 of the amount produced by a control composition in the absence of calciquestrin and a metal ionically bonded thereto according to the present invention. , 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 times or more (eg: 500 , 1000 times).
  • polypeptide As used herein, the terms “polypeptide”, “protein” and “peptide” are used interchangeably and refer to a polymer of amino acids that is not limited to any particular length.
  • polypeptide or protein refers to a chain of one or more amino acids, each chain comprising amino acids covalently linked by peptide bonds, said polypeptide or protein being a native protein, i.e.
  • the native and specifically non-recombinant cell or a molecule having the amino acid sequence of a native protein, which may comprise a plurality of chains linked together non-covalently and/or covalently by peptide bonds having the sequence of a protein genetically engineered or produced by a recombinant cell, or a native sequence It includes molecules having deletions from, additions to, and/or substitutions of one or more amino acids of.
  • the polypeptide is a "recombinant" polypeptide produced by a recombinant cell comprising one or more recombinant DNA molecules, which typically consists of a heterologous polynucleotide sequence or combination of polynucleotide sequences that would not otherwise be found in the cell.
  • polynucleotide and “nucleic acid” include mRNA, RNA, cRNA, cDNA and DNA.
  • the term refers to a polymeric form of nucleotides of at least 10 bases in length, typically ribonucleotides or deoxynucleotides or modified forms of either type of nucleotide.
  • the term includes DNA in single and double stranded forms.
  • isolated DNA and isolated polynucleotide and “isolated nucleic acid” refer to molecules that have been isolated without total genomic DNA of a particular species.
  • an isolated DNA segment encoding a polypeptide refers to a DNA segment that contains one or more coding sequences but is substantially isolated or free purified from total genomic DNA of the species from which the DNA segment is obtained. Also included are non-coding polynucleotides that do not encode a polypeptide (eg, primers, probes, oligonucleotides). Also included are recombinant vectors including, for example, expression vectors, viral vectors, plasmids, cosmids, phagemids, phages, viruses, and the like.
  • drug delivery system is a system for delivering a drug having therapeutic efficacy to a necessary part of the body, and efficiently delivers a drug to a tissue in need and a required amount of the drug. It can be understood as drug prescription, compounding method or drug formulation.
  • active ingredient means a component that can exhibit the desired activity alone or together with a carrier inactive itself.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays the onset of a disease by administration of the composition of the present invention
  • treatment means that symptoms caused by a disease are improved by administering the composition of the present invention. means any action that becomes or is advantageously altered.
  • fusion refers to a form in which two or more proteins are artificially linked, and in the present invention, it refers to a form in which calciquestrin and a physiologically active substance are linked.
  • fusion proteins can be chemically conjugated or obtained by expression and purification by genetic recombination methods.
  • the fusion protein there is no particular restriction on the connection order of calciquestrin and physiologically active substances, and "N-terminus - calciquestrin - physiologically active substance - C terminus" or "N-terminal – Physiologically active substances - Calciquestrin - C-terminal” forms can all be included.
  • the metal is Cu, Ra, Ba, Sr, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Be, Fe (II), Zn, Mg, Mn, Co, Ni, Al, Fe ( III), may be one or more selected from the group consisting of Au, He, Cr, Si, V, Ga, In, La, and Ce, but is not limited thereto.
  • Ca, Mg, Fe, Zn, Cu and Mn are used as the metal.
  • the metal may exclude calcium.
  • the metal may include calcium.
  • the metal may include zinc.
  • the metal may include magnesium.
  • the particles are metal ion-reactive particles based on calciquestrin containing a physiologically active substance fused with calciquestrin, and can be self-assembled by calcium.
  • the physiologically active substance may be covalently bonded to calciquestrin.
  • the physiologically active substance may not be covalently bonded to calciquestrin.
  • the physiologically active substance connected to calciquestrin may include a cleavage site between the physiologically active substance and calciquestrin.
  • the physiologically active substance linked to calciquestrin includes a cleavage site between the physiologically active substance and calciquestrin, and the cleavage site can be cleaved by an enzyme, pH or hydrolysis.
  • the physiologically active substance linked to calciquestrin includes a cleavable linker between the physiologically active substance and calciquestrin, and the cleavable linker is a protease-cleavable peptide linker, a nuclease- Nucleic acid sensitive linker, lipase-sensitive lipid linker, glycosidase-sensitive carbohydrate linker, pH-sensitive linker, hypoxia-sensitive linker, photo-cleavable linker, heat-labile linker, enzyme-cleavable linker, ultrasound - At least one may be selected from the group consisting of a sensitive linker and an x-ray cleavable linker, but is not limited thereto.
  • the protease may include metalloprotease, serine protease, cysteine protease, aspartic acid protease, etc., but is not limited thereto.
  • the protease-cleavable peptide linker is MMP1, MMP2, MMP3, MMP4, MMP5, MMP6, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13, MMP14, TEV protease, matriptase, uPA, FAP, It can be cleaved by one or more proteases selected from the group consisting of legumain, PSA, kallikrein, cathepsin A and cathepsin B.
  • PLGVRG cleavable by MMP2 was used as the protease-cleavable peptide linker.
  • the physiologically active substance bound to calciquestrin may not be cleaved between the physiologically active substance and calciquestrin.
  • the physiologically active substance linked to calciquestrin may include a non-cleavable linker between the physiologically active substance and calciquestrin.
  • a plurality of the calciquestrin may be bound to a single metal.
  • the amino acid sequence of calciquestrin is 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more sequence homology containing amino acids can do.
  • the amino acid sequence of calciquestrin may include one or more sequences selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 11.
  • the amino acid sequence of calciquestrin may consist of one or more sequences selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 11.
  • the calciquestrin may be wild-type calciquestrin or a form in which a part of the C-terminus of the wild-type calciquestrin amino acid sequence is modified.
  • the modified form may be a form in which a portion of the C-terminal amino acid sequence of wild-type calciquestrin is deleted.
  • the modified form may be a form in which the C-terminus of the amino acid sequence, ie, an acidic tail, is deleted.
  • the modified form may be a form in which 6 to 20 amino acids at the C-terminus of the amino acid sequence of wild-type calciquestrin are deleted. According to one exemplary embodiment, it was confirmed that when the acidic tail of the C-terminus of the amino acid sequence of calciquestrin is deleted, particles can be formed even at a low concentration of metal ions.
  • the particles may exclude elastin-like polypeptides or elastomers.
  • the elastin-like polypeptide comprises one or more repeating units selected from the group consisting of VPGXG, PGXGV, GXGVP, XGVPG, GVPGX, and combinations thereof in part or in whole, wherein V is valine, P is proline, G Is glycine, X may be a natural amino acid or a non-natural amino acid.
  • X of each repeating unit may be the same or different amino acids.
  • the selected repeating unit may be repeated 2 or more times, for example, 2 to 200 times.
  • the particle may exclude a sequence having a repeating unit of VPGXG (X is an amino acid).
  • the physiologically active substance may be at least one selected from the group consisting of high molecular proteins, peptides, glycoproteins, cytokines, growth factors, blood products, vaccines, hormones, enzymes, antibodies, and synthetic agents there is.
  • the physiologically active substance is interleukin-2, blood factor VII, blood factor VIII, blood factor IX, immunoglobulin, horseradish peroxidase (HRP), cytokine, ⁇ -Interferon, ⁇ -interferon, ⁇ -interferon, colony stimulating factor (GM-CSF), human fibronectin extra domain B (EBD), fibroblast growth factor (FGF), nerve Growth factor (NGF), insulinlike growth factor (IGF), transforming growth factor- ⁇ and - ⁇ (TGF- ⁇ , - ⁇ ), brain-derived neurotrophic factor (brain-derived neutrophic factor, BDNF), plateletderived growth factor (PDGF), placental growth factor (PlGF), hepatocyte growth factor (HGF), exendin, somatostatin ), luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH), adrenocorticotropic hormone, growth hormone-releasing hormone, oxytocin, thymosin alpha-1 , corticotropin-releasing factor, calc
  • the bioactive substance may be a polypeptide of interest.
  • the bioactive material may have a length of 2 to 1000 amino acids.
  • the bioactive substance may be a chemical substance of interest.
  • the physiologically active substance may be at least one selected from the group consisting of an inverse regulatory compound, an anticancer agent, an antiviral agent, an antibacterial agent, an antifungal agent, and an anthelmintic agent.
  • the anticancer agent is, for example, maytansinoid, auristatin (including MMAE, MMAF), aminopterin, actinomycin, bleomycin, thalisomycin, camptothecin, N8-acetyl spermidine, 1-(2 Chloroethyl)-1,2-dimethylsulfonyl hydrazide, esperamycin, etoposide, 6-mercaptopurine, dolastatin, trichothecenes, calicheamicin, taxol, taxanes, paclitaxel , docetaxel, methotrexate, vincristine, vinblastine, doxorubicin, melphalan, mitomycin A, mitomycin C, chlorambucil, duocamycin, L-asparaginase, mercaptopurine (mercaptopurine), thioguanine, hydroxyurea, cytarabine, cyclophosphamide,
  • the anti-inflammatory agent is a steroid agent that reduces inflammation or swelling by binding to glucocorticoid receptors, non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) that relieve pain in response to cyclic oxygenase (COX) that synthesizes prostaglandins that cause inflammation, or activation of inflammatory cells. and immune-specific anti-inflammatory drugs (ImSAIDs) that change transport may be included, but are not limited thereto.
  • the immunological disease treatment agent may include azathioprine, chlorambucil, cyclophosphamide, cyclosporine, mycophenolate, azathioprine, or methotrexate, but is not limited thereto.
  • the size of the particle may be 10 nm to 1 cm.
  • the particle size may be 100 nm to 5,000 nm.
  • the calciquestrin-based metal ion-reactive particles may have a size of 1,000 to 5,000 nm.
  • the particles may not be assembled by temperature change.
  • the particles may exclude polymers.
  • the physiologically active substance bound to calciquestrin is expressed in a host cell by an expression vector containing baeksan encoding the calciquestrin and the physiologically active substance, or calciquestrin and the physiologically active substance It may be formed by chemical conjugation of
  • the particle may be used for delivering a physiologically active substance to a subject in need thereof.
  • the subject may include a human, dog, chicken, pig, cow, sheep, guinea pig or monkey, but is not limited thereto.
  • the particle can be used for tissue regeneration.
  • the physiologically active material may have increased in vivo and extracorporeal stability compared to before particleization.
  • the stability of the bioactive material may be increased by 1.1 times, 1.5 times, 1.7 times, 2 times or more compared to before being granulated.
  • the half-life of the physiologically active substance in the body may be increased compared to before particleization.
  • the half-life of the physiologically active substance in the body may be increased by 1.1 times, 1.5 times, 1.7 times, 2 times or more compared to before granulation.
  • the physiologically active substance may increase the duration of effects in the body.
  • the durability of the physiologically active substance in the body may be increased by 1.1 times, 1.5 times, 1.7 times, 2 times or more compared to before being granulated.
  • the particle may further include an amino acid sequence that binds to a substance present in a specific tissue or cell in the body so that the particle can be selectively transported to a specific region or cell in the body.
  • the present invention is intended to provide a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease comprising particles containing calciquestrin, a physiologically active substance combined with calciquestrin, and a metal ionically bonded to calciquestrin.
  • the physiologically active substance combined with calciquestrin is I. All of the contents described in the particle are included.
  • the disease may be one or more diseases selected from the group consisting of skin wounds, diabetes, inflammatory diseases, ophthalmic diseases, tissue regeneration, infectious diseases and cancer diseases, but is not limited thereto.
  • the inflammatory disease is endocarditis, pericarditis, myocarditis, stomatitis, hepatitis, cholecystitis, cholangitis, esophagitis, colitis, gastritis, enteritis, appendicitis, pancreatitis, bronchitis, thyroiditis, oophoritis, cystitis, urethritis, It includes, but is not limited to, prostatitis, vaginitis, osteomyelitis, arthritis, and the like, and includes all inflammatory diseases known in the art.
  • the cancer disease includes liver cancer, thyroid cancer, ovarian cancer, multiple myeloma, lymphoma, leukemia, kidney cancer, stomach cancer, breast cancer, cervical cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, lung cancer, etc. It is not limited and includes all cancer diseases known in the art.
  • the ophthalmic disease is macular degeneration, choroidal neovascularization, acute macular neuroretinopathy, macular edema, Behcet's disease, retinal disorder, diabetic retinopathy, retinal artery occlusive disease, central retinal vein Obstruction, uveitis retinal disease, retinal detachment, ocular trauma affecting the site or location of the posterior ocular region, posterior segment disease induced or affected by ocular laser therapy, posterior segment disease induced or affected by photodynamic therapy, optical Post-segment diseases such as coagulation, radiation retinopathy, epiretinal membrane disorders, branch retinal vein occlusion, anterior ischemic optic neuropathy, non-retinopathy diabetic retinal dysfunction, retinitis pigmentosa and glaucoma, and aphakic, pseudophakic, Includes astigmatism, blepharospasm, cataract, conjunctival disease, conjunctivitis,
  • the infectious disease includes a disease or disease caused by bacteria, viruses, fungi, or parasites.
  • the infectious disease includes influenza virus, flavivirus, human adenovirus (HAdV), coronavirus severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV or SARS-CoV-1), Severe acute respiratory syndrome type 2 coronavirus (SARS-CoV-2), MERS coronavirus (MERS-CoV), coronavirus disease 2019 (COVID-19), herpes virus, Zika virus, Japanese encephalitis virus (JEV), Epstein-Barr virus (EBV), Ebola virus (EBOV), rhinovirus, Chikungunya virus ( Chikungunya virus (CHIKV), Hepatitis C virus (HCV), Hepatitis B virus (HBV), Hepatitis A virus (HAV), Rotavirus, Astrovirus , Hantavirus, Dengue virus, SFTS virus (severe fever with thrombocytopenia syndrome virus
  • the pharmaceutical composition may further include a carrier, and the carrier is a pharmaceutically acceptable carrier commonly used in formulation, and includes lactose, dextrose, sucrose, and sorbitol. , mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate , talc, magnesium stearate and mineral oil, etc., but are not limited thereto.
  • the carrier is a pharmaceutically acceptable carrier commonly used in formulation, and includes lactose, dextrose, sucrose, and sorbitol. , mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenz
  • An exemplary pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components.
  • a lubricant e.g., a talc, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, niol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, a talct, a talct, a talct, a stea, stea, stea, stea, stea, ste
  • the pharmaceutical composition may be prepared by mixing one or more diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants commonly used in the art.
  • solid preparations for oral administration include tablets, patients, powders, granules, capsules, troches, etc., and these solid preparations contain one or more excipients such as starch and calcium carbonate in the particles of the present invention. It is prepared by mixing sucrose or lactose or gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate and talc are also used.
  • liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions for oral administration, emulsions or syrups, and various excipients such as wetting agents and sweeteners in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents , fragrances, preservatives, and the like may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspension solutions, emulsions, freeze-dried formulations, suppositories, and the like.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
  • As a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerol, gelatin, and the like may be used.
  • the present invention comprises administering to a subject in need thereof a pharmaceutical composition comprising calciquestrin, a physiologically active substance bound to calciquestrin, and particles containing a metal ionically bonded to calciquestrin. It is intended to provide a method for treating a disease.
  • the subject may include a human, dog, chicken, pig, cow, sheep, guinea pig or monkey, but is not limited thereto.
  • the administration may be oral, rectal, transdermal, intradermal, intravascular, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, intramedullary, intrathecal or subcutaneous, and the dosage may be determined according to the condition of the patient. and body weight, disease severity, drug form, route of administration and time, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition may be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the "pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is based on the type, severity, activity of the drug, and drug It may be determined according to factors including sensitivity, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • the composition may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the effective amount of the composition according to the present specification may vary depending on the patient's age, sex, and weight, and is generally 0.1 to 100 mg per 1 kg of body weight, preferably 0.5 to 10 mg daily or every other day, or 1 It can be administered in 1 to 3 divided doses per day. However, since it may increase or decrease depending on the route of administration, severity of obesity, gender, weight, age, etc., the dosage is not limited to the scope of the present invention in any way.
  • the present invention relates to at least one selected from the group consisting of inflammatory diseases, infectious diseases, and cancer diseases, including calciquestrin, physiologically active substances combined with calciquestrin, and particles containing a metal ionically bonded to calciquestrin.
  • a vaccine for preventing or treating a disease is provided.
  • the physiologically active substance combined with calciquestrin is I.
  • inflammatory diseases, infectious diseases and cancer diseases are II. It includes all of the contents described in the pharmaceutical composition and treatment method.
  • the vaccine may further include an adjuvant.
  • the adjuvant is a mineral substance, aluminum hydroxide, aluminum phosphate, bacterial extract (e.g., bacterial lipid sugar, Freund's adjuvant, and/or MDP), oil emulsion, saponin, squalene, potassium aluminum sulfate, calcium hydroxide, TLR agonist, etc. Including, but not limited to.
  • the vaccine may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier is lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose , methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil, but are not limited thereto.
  • the vaccine may be formulated for parenteral administration.
  • the parenteral administration may include subcutaneous injection or intradermal injection.
  • the vaccine may be lyophilized.
  • An object of the present invention is to provide a kit for preparing particles containing calciquestrin and a physiologically active substance configured to be linked to the calciquestrin.
  • the physiologically active substance combined with calciquestrin is I. All of the contents described in the particle are included.
  • the kit may further include a metal configured to ionically bind to the calciquestrin.
  • the metal is Cu, Ra, Ba, Sr, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Be, Fe(II), Zn, Mg, Mn, Co, Ni, Al, Fe(III), Au, It may be one or more selected from the group consisting of He, Cr, Si, V, Ga, In, La, and Ce, but is not limited thereto.
  • the metal ion may be a metal compound or an aqueous solution thereof.
  • the metal ion when the metal ion is a calcium ion, the calcium ion may be included in the form of calcium chloride (CaCl2) or a solution of calcium chloride (CaCl2).
  • the kit may include a diluent, a buffer, an enzyme, instructions for preparing metal ion-reactive particles, etc., but is not limited thereto.
  • the metal ion may be included at a concentration of 0.1 to 10000 mM, preferably 1 mM to 5000 mM, more preferably 2 mM to 10000 mM, and most preferably 10 mM to 1000 mM.
  • the physiologically active substance bound to calciquestrin may be included in the form of a nucleotide molecule encoding it.
  • the physiologically active substance coupled with calciquestrin may be included in the form of an expression vector containing a nucleic acid encoding the same.
  • the physiologically active substance bound to calciquestrin may be included in the form of a cell transformed with an expression vector containing a nucleic acid encoding the same.
  • the physiologically active substance bound to calciquestrin may be included in the form of a protein expressed from a cell transformed with an expression vector containing a nucleic acid encoding the same.
  • the physiologically active substance bound to calciquestrin may be included in a chemically conjugated form of calciquestrin and the physiologically active substance.
  • An object of the present invention is to provide a method for preparing particles comprising calciquestrin, a physiologically active substance combined with calciquestrin, and a metal ionically bonded to calciquestrin.
  • the physiologically active substance combined with calciquestrin is I. All of the contents described in the particle are included.
  • the method may include mixing a metal with a physiologically active substance linked to calciquestrin.
  • the method may further include a step of linking calciquestrin to the physiologically active substance.
  • the method may further include a step of recombinantly expressing a sequence including the calciquestrin and a physiologically active substance.
  • the method may further include a step of purifying the physiologically active substance connected to the calciquestrin.
  • the host cell is Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Salmonella typhimurium, Serratia marcessons, Pseudomonas species, yeast, insect cell, CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN, MDCK cell line, and at least one selected from the group consisting of plant cells, the method.
  • the method may further include preparing the physiologically active substance to form a chemical bond with calciquestrin.
  • the present invention is intended to provide a method for delivering a physiologically active substance to a subject in need thereof.
  • the physiologically active substance combined with calciquestrin is I. All of the contents described in the particle are included.
  • the method is V. Preparing particles according to the method described in the manufacturing method, and
  • It may include; administering the particles to a subject.
  • the method comprises: I. It may include administering calciquestrin, a physiologically active substance, and a metal to form the particles.
  • the calciquestrin may be linked to the physiologically active substance.
  • the administration may include expressing calciquestrin and a nucleotide molecule encoding the physiologically active substance in a subject.
  • the administration may include expressing a first nucleotide molecule encoding calciquestrin and a second nucleotide molecule encoding the physiologically active substance in a subject.
  • the administration may include parenteral, oral, subcutaneous, topical, intramuscular, transdermal, buccal, sublingual, intranasal, transvascular, subcutaneous, orbital or respiratory administration.
  • the physiologically active substance may be directly administered to a target site of a disease of a subject.
  • the physiologically active substance may not be directly administered to a target site of a disease of a subject.
  • the method may further include releasing the physiologically active substance from the particles.
  • the method may further include releasing the physiologically active substance from the particles in a free form.
  • the method may further include releasing the physiologically active substance from the particles in a state linked to calciquestrin.
  • the present invention also seeks to provide use of a product or method featuring one or more of the elements disclosed herein.
  • KGF-1 gene was synthesized (Bioneer, Daejeon, Korea). At this time, the amino acid sequence information of CSQ and KGF-1 is as follows:
  • KGF (SEQ ID NO: 12):
  • the CSQ vector and insert DNA were treated with restriction enzymes. About 1 ⁇ g of insert DNA was reacted with BamHI (New England Biolabs (NEB, Ipswich)) and XhoI (NEB, Ipswich) for one day, and purified DNA was obtained using a PCR purification kit.
  • CSQ vector CIAP Calf Intestinal Alkaline Phosphatase
  • NEB Trioxane
  • Ipswich Trioxane
  • T4 DNA ligase T4 DNA ligase
  • Ligation was carried out at room temperature for 3 hours (Fig. 2)
  • the DNA obtained by ligation reaction between CSQ vector and KGF insert was transformed.
  • PCR was performed on 6 samples, DNA electrophoresis was performed to confirm the insert, and the cloned colony was sequenced by Bioneer and confirmed.
  • BL21 cells were transformed with all of the DNAs whose sequences were confirmed by Bioneer, and then smeared on agar medium containing ampicillin.
  • the colony grown on the agar plate medium was inoculated into 5 ml of LB medium containing ampicillin (50 ⁇ g/ml), incubated for one day at 37 ° C while mixing at a speed of 200 rpm, and then mixed with glycerol at a ratio of 1: 1 to form stock. 1 ml was made and stored in -80 ° C deepfreezer. Inoculate 20 ⁇ l of the stock into 20 ml of LB medium containing ampicillin (50 ⁇ g/ml) and incubate for one day at 37° C.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-chiogalactopyranoside
  • Particles were generated by adding 10 mM each of Ca2+, Mg2+, Fe2+, Zn2+, Cu2+ and Mn2+ to 50 ⁇ l of the purified CSQ-KGF protein and reacting at 4° C. for 30 minutes.
  • the medium in which the CHO cells were cultured was centrifuged at 13000 rpm for 10 minutes to remove the supernatant.
  • 50 ⁇ l of the culture supernatant containing hydrolase was added to the granulated CSQ-KGF, mixed by inverting lightly 10 times, and then stored in a 37° C. incubator for 3 days. After storage, samples were taken out at intervals of 12 hours or 24 hours from 0 hour to 96 hours and stored at -20 ° C.
  • HaCaT cells were dispensed as much as cells/well in a 96 well plate and cultured for one day in a 37°C 5% CO2 incubator with 10% FBS and 1% P/S DMEM. It was starvated for one day with FBS-free DMEM. After washing twice with DPBS, CSQ-KGF, CSQ, and KGF were added at a concentration of 2.5 nM to FBS-free DMEM, and the sample was dispensed so that the total volume was 200 ⁇ l. After culturing in an incubator for 2 days, XTT cell viability kit reagent was dispensed, and then absorbance at 450 nm was measured with a micro plate reader. As a result, even when KGF was fused with calciquest (CSQ-KGF), it was confirmed to have the same efficacy as native (KGF) (FIG. 7).
  • HaCaT cells were dispensed as many cells/well in a 24-well plate and cultured for 1 day in a 37°C, 5% CO2 incubator with 10% FBS and 1% P/S DMEM. It was starvated for one day with FBS-free DMEM. Linear scratches were made on the cells using a 1000 ⁇ l pipet tip. After washing twice with DPBS, CSQ-KGF, CSQ, and KGF were added to FBS-free DMEM at a concentration of 10 nM, and samples were dispensed so that the total volume was 500 ⁇ l. While culturing in a 37°C, 5% CO2 incubator, scratches were observed and photographed under an inverted microscope at 24-hour intervals from 0 to 74 hours.
  • the wound closure degree was compared by analyzing the scratch area of the captured image through imageJ. As a result, even when KGF was fused with calciquestrin (CSQ-KGF), it was confirmed to have the same efficacy as native (KGF) (FIG. 8).
  • C57BL/6N (Orient bio), female, 8-week-old mice were grouped into groups of 5 and prepared in cages. During the 5-day adaptation period, feed and drinking water were provided with a 12-hr light-dark cycle. Hair on the back was removed using hair removal cream and clippers. One day after hair removal, 4 drosal full-thickness wounds were made in one animal using a 6 mm biopsy punch.
  • CSQ-KGF microparticle
  • CSQ-KGF no particle
  • KGF in 20mM Tris-HCl buffer, pH7.0
  • CSQ in 20mM Tris-HCl buffer, pH7.0
  • granulated with 10mM CaCl2 at the wound site was prepared at a concentration of 1 nM, respectively, and dispensed to the wound site by 10 ⁇ l.
  • the control group was replaced with 10 ⁇ l of 20 mM Tris-HCl buffer (pH7.0).
  • a dressing was applied to the wound site with Tegadem. Photographs of the wound were taken every 2 days, and the length of the wound was measured using a digital caliper. The area of the wound was analyzed using imageJ, and the wound healing rate was calculated according to Equation 1 below:
  • Wound recovery rate (initial wound area-open wound area)/(initial wound area)
  • Exenatide-CSQ particles were prepared using the Exenatide gene instead of the KGF-1 gene in the same manner as in Preparation Example 1 (FIG. 11). At this time, the amino acid sequence information of Exenatide is as follows:
  • the size of the generated Exenatide-CSQ particles was measured using a fluorescence microscope and a dynamic light scattering photometer. As a result, it was found that the Exenatide-CSQ protein could react with metal ions and be stably particleized, and in particular, it was confirmed that the protein was formed into micro-sized particles at a concentration of 10 mM (FIG. 12).
  • mice C57BL/6J (Orient bio), male, 6-week-old mice were prepared in cages by forming 4 groups of 4 mice each. During the 5-day adaptation period, feed and drinking water were provided with a 12-hr light-dark cycle. Feed was stopped 20 hours before the experiment. One hour before the drug injection, a blood sample was taken by tail-cut and blood glucose was measured with a blood glucose meter (Green Cross Green Doctor blood glucose meter). Exenatide, Exenatide-CSQ (No particle), and Exenatide-CSQ Depot (particle, 10 mM CaCl2 was added and reacted for 30 minutes) at a concentration of 750 nmol/kg, respectively, by S.C. Injection. Blood glucose was measured after injection to evaluate the hypoglycemic effect.
  • Exenatide-CSQ protein was granulated into micro-sized particles by metal ions, it showed a significantly improved blood glucose reduction effect compared to native (Exenatide) and CSQ-KGF (no particle) not granulated with metal ions. was (FIG. 14).
  • Exenatide-CSQ particles made of 10mM calcium, 0mM calcium Exenatide-CSQ (No particle) and Exenatide were injected into mice by S.C. Serum samples were prepared over time. The half-life of each sample was measured using Exenatide ELISA kits (MyBioSource). As a result, when Exenatide-CSQ protein is granulated into micro-sized particles by metal ions, it can be maintained at a high concentration in vivo for a long period of time compared to native (Exenatide) and Exenatide-CSQ (No particle) not particleized with metal ions. It was confirmed that there is (Fig. 15).
  • CSQ-SARS Cov2 RBD particles were prepared using the same method as in Preparation Example 1, except that the SARS Cov2 RBD gene was used instead of the KGF-1 gene.
  • amino acid sequence information of SARS Cov2 RBD is as follows:
  • SARS Cov2 RBD (SEQ ID NO: 14):
  • the size of the generated CSQ-SARS Cov2 RBD particles was measured using a fluorescence microscope and a dynamic light scattering photometer. As a result, it was confirmed that the CSQ-SARS Cov2 RBD protein was stably formed into particles by reacting with metal ions (FIG. 16A).
  • 365 nm nanoparticles were prepared by treatment with 4 mM CaCl2.
  • Balb/c mice were prepared in cages in groups of 5 each. After one injection of 50 ⁇ g of RBD-CSQ nanoparticles, RBD protein, and Saline, a second injection was given 2 weeks later. On day 14 after the second injection, blood samples were collected and analyzed by ELISA using an anti-RBD antibody. Briefly, 96-well plates (Corning) were coated overnight with 100 ⁇ l of antigen solution (30 ⁇ g/ml RBD).
  • Doxorubicin Conjugation Kit (PerKit) was purchased and Doxorubicin was conjugated to CSQ according to the kit manual. Briefly, after making Doxorubicin-NHS ester by attaching sulfo-NHS ester to Doxorubicin, Doxorubicin was mixed with 1-3mg CSQ and reacted for 2 hours in the dark. Then, Doxorubicin-CSQ and Doxorubicin were separated by desalting column to obtain Doxorubicin-CSQ (FIG. 17).
  • Doxorubicin-CSQ particles Dox-CSQ nanoparticle prepared with 2 mM calcium, Doxorubicin-CSQ particles (Dox-CSQ, No particle) and doxorubicin (Dox) with 0 mM calcium were administered to BALB/c mice by I.V. After injection, serum samples were prepared according to time. The amount of serum was measured using the fluorescence of doxorubicin (Dox).
  • CSQ-EGF particles were prepared using the same method as in Preparation Example 1, except that the EGF gene was used instead of the KGF-1 gene.
  • the amino acid sequence information of EGF is as follows:
  • EGF SEQ ID NO: 15:
  • the size of the generated CSQ-EGF particles was measured using a fluorescence microscope and a dynamic light scattering photometer. As a result, it was confirmed that the CSQ-EGF protein was stably formed into particles by reacting with metal ions (FIG. 20).
  • CSQ-Anti-VEGF scFv-CSQ particles were prepared in the same manner as in Preparation Example 1, except that the Anti-VEGF scFv-CSQ gene was used instead of the KGF-1 gene.
  • the amino acid sequence information of Anti-VEGF scFv-CSQ is as follows:
  • Anti-VEGF scFv (SEQ ID NO: 16):
  • the size of the generated Anti-VEGF scFv-CSQ particles was measured using a fluorescence microscope and a dynamic light scattering photometer. As a result, it was confirmed that the CSQ-Anti-VEGF scFv-CSQ protein was stably formed into particles by reacting with metal ions (FIG. 21).
  • CSQ-FGF2 particles were prepared using the same method as in Preparation Example 1, except that the FGF2 gene was used instead of the KGF-1 gene.
  • the amino acid sequence information of FGF2 is as follows:
  • FGF2 (SEQ ID NO: 17):
  • the size of the generated FGF2 particles was measured using a fluorescence microscope and a dynamic light scattering photometer. As a result, it was confirmed that the CSQ-FGF2 protein was stably formed into particles by reacting with metal ions (FIG. 22).
  • CSQ-BMP2 particles were prepared using the same method as in Preparation Example 1, except that the BMP2 gene was used instead of the KGF-1 gene.
  • the amino acid sequence information of BMP2 is as follows:
  • BMP2 (SEQ ID NO: 18):
  • the size of the generated CSQ-BMP2 particles was measured using a fluorescence microscope and a dynamic light scattering photometer. As a result, it was confirmed that the CSQ-BMP2 protein was stably formed into particles by reacting with metal ions (FIG. 23).
  • CSQ-TGF particles were prepared using the same method as in Preparation Example 1, except that the TGF gene was used instead of the KGF-1 gene.
  • the amino acid sequence information of TGF is as follows:
  • TGF (SEQ ID NO: 19):
  • the size of the generated CSQ-TGF particles was measured using a fluorescence microscope and a dynamic light scattering photometer. As a result, it was confirmed that the CSQ-TGF protein was stably formed into particles by reacting with metal ions (FIG. 24).
  • CSQ-VEGF particles were prepared using the same method as in Preparation Example 1, except that the VEGF gene was used instead of the KGF-1 gene.
  • VEGF (SEQ ID NO: 20):
  • the size of the generated CSQ-VEGF particles was measured using a fluorescence microscope and a dynamic light scattering photometer. As a result, it was confirmed that the CSQ-VEGF protein was stably formed into particles by reacting with metal ions (FIG. 25).
  • CSQ-GLP1 particles were prepared using the same method as in Preparation Example 1, except that the GLP1 gene was used instead of the KGF-1 gene.
  • GLP1 (SEQ ID NO: 21):
  • the size of the generated CSQ-GLP1 particles was measured using a fluorescence microscope and a dynamic light scattering photometer. As a result, it was confirmed that the CSQ-GLP1 protein was stably formed into particles by reacting with metal ions (FIG. 26).
  • CSQ-TEV protease particles were prepared using the same method as in Preparation Example 1, except that the TEV protease gene was used instead of the KGF-1 gene.
  • the amino acid sequence information of the TEV protease is as follows:
  • the size of the generated CSQ-TEV protease particles was measured using a fluorescence microscope and a dynamic light scattering photometer. As a result, it was confirmed that the CSQ-TEV protease protein was stably formed into particles by reacting with metal ions (FIG. 27).
  • CSQ-HRP enzyme particles were prepared using the same method as in Preparation Example 1, except that the HRP enzyme gene was used instead of the KGF-1 gene.
  • the amino acid sequence information of HRP is as follows.
  • the size of the generated CSQ-HRP enzyme particles was measured using a fluorescence microscope and a dynamic light scattering photometer. As a result, it was confirmed that the CSQ-HRP enzyme protein reacted with metal ions and stably formed into particles (FIG. 28).
  • CSQ-hGH particles were prepared in the same manner as in Preparation Example 1, except that the hGH gene was used instead of the KGF-1 gene.
  • the amino acid sequence information of hGH is as follows.
  • the size of the generated CSQ-hGH particles was measured using a fluorescence microscope and a dynamic light scattering photometer. As a result, it was confirmed that the CSQ-hGH protein was stably formed into particles by reacting with metal ions (FIG. 30).
  • CSQ-GCSF particles were prepared in the same manner as in Preparation Example 1, except that the GCSF gene was used instead of the KGF-1 gene.
  • amino acid sequence information of GCSF is as follows.
  • G-CSF SEQ ID NO: 25:
  • the size of the generated CSQ-GCSF particles was measured using a fluorescence microscope and a dynamic light scattering photometer. As a result, it was confirmed that the CSQ-GCSF protein was stably formed into particles by reacting with metal ions (FIG. 32).
  • the amino acid sequence information of CSQ2 (WT), CSQ2 ( ⁇ 8) and CSQ2 ( ⁇ 16) is as follows:
  • CSQ-cleavable linker-KGF was prepared using the same method as in Preparation Example 1, except that the CSQ-MMP2 cleavable vector was used instead of the CSQ-MCS vector and CaCl2 was added at a concentration of 10 mM.
  • the amino acid sequence information of the cleavable linker is as follows:
  • CSQ-cleavable linker-hGH was prepared using the same method as in Preparation Example 14, except that the CSQ-MMP2 cleavable vector was used instead of the CSQ-MCS vector and CaCl2 was added at a concentration of 10 mM.
  • the amino acid sequence information of the cleavable linker is as follows:
  • a peptide in which N-hydroxysuccinimide (NHS) was attached to an exanatide peptide was synthesized through Anygen.
  • Exanatide-NHS was reacted for 6 hours by adding a 10-fold molar ratio compared to CSQ. Then, exanatide was separated by desalting column to finally obtain exanatide-CSQ.
  • CSQ-maleimide was prepared by reacting CSQ protein with SMCC (succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate) at a 10-fold ratio.
  • SMCC succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate
  • CSQ-maleimide and hGH were reacted at a 1:1 molar ratio for 12 hours using the cysteine amino acid of hGH.
  • unreacted CSQ-maleimide and hGH were separated by size exclusion chromatography (SEC) to finally separate the CSQ-hGH conjugate.
  • the calciquestrin-based metal ion-reactive particles of the present invention are inhibited from decomposition by hydrolytic enzymes in the body compared to before particleization by metal ions, thereby improving stability, and increasing the half-life in the body, thereby reducing the effect of physiologically active substances.
  • Sustainability can be improved, the in vitro stability of the physiologically active substance can be improved to maintain the activity, and also the antigen delivery efficiency can be increased.

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Abstract

본 발명은 칼시퀘스트린 기반의 금속이온 반응성 입자 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 의약품 및 화장품에 많이 사용되고 있는 생리활성물질을 칼시퀘스트린(calsequestrin, CSQ)과 결합시킨 후 금속이온과 반응시켜 제조된 칼시퀘스트린 기반의 금속이온 반응성 입자, 및 이의 약물전달체, 약학적 조성물 또는 백신에서의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 금속이온 반응성 입자는 생리활성물질의 체내 및 체외 안정성, 활성 유지시간, 체내 반감기 및 항원 전달 효율을 증가시킬 수 있다.

Description

칼시퀘스트린 기반의 금속이온 반응성 입자 및 이의 용도
본 발명은 칼시퀘스트린 기반의 금속이온 반응성 입자 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 의약품 및 화장품에 많이 사용되고 있는 생리활성물질을 칼시퀘스트린(calsequestrin, CSQ)과 결합시킨 후 금속이온과 반응시켜 제조된 칼시퀘스트린 기반의 금속이온 반응성 입자, 및 이의 약물전달체, 약학적 조성물 또는 백신에서의 용도에 관한 것이다.
단백질 및 펩타이드 약물은 경구 투여되는 경우, 일반적으로 위의 산성 환경 하에서 활성 구조를 잃게 되거나 효소적 분해로 인하여 위 또는 장에서 흡수되는 비율이 낮다. 또한, 비경구 투여되는 경우에도 생체 내에서 짧은 반감기를 갖거나 생체 이용률이 낮기 때문에, 단백질 및 펩타이드 약물이 지속적으로 방출되어 약물의 지속적인 효과를 나타내기 위한 연구가 진행되고 있다. 나아가, 단백질 및 펩타이드 약물 외에 합성 의약품들의 경우에도, 생체 내에 투여되어 약물이 천천히 지속적으로 배출되도록 하는 약물 전달 시스템에 대한 연구가 진행되고 있다. 이와 관련하여, 대한민국 공개특허공보 제10-2020-0044977호는 생분해성 고분자 및 약물을 포함하는 마이크로 입자를 개시하고 있다.
한편, 칼시퀘스트린은 근소포체의 칼슘-결합 단백질로서, 세포질보다 근소포체에서 칼슘의 농도가 더 높을 지라도 근육 수축 후에 칼슘과 결합하여 근소포체의 시스터나에 칼슘 이온을 저장할 수 있도록 하는 기능을 한다. 이때, 상기 칼시퀘스트린은 칼슘이 적을 때에는 단량체로 존재하다가 칼슘의 양이 증가하면 다량체로 변해 크기가 커지는 성질을 가질 수 있다.
[선행기술문헌]
1. 대한민국 공개특허공보 제10-2020-0044977호
본 발명자들은 신규한 소재를 이용한 약물 전달 시스템을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 생리활성물질(단백질, 펩타이드 또는 저분자 약물)을 칼시퀘스트린과 결합시킨 후 금속이온을 이용하여 입자화하는 경우, 생리활성물질의 체외 및 체내 안정성이 향상되고, 체내에서의 반감기가 증가할 뿐만 아니라 항원 전달 효율이 증가하고 또한 체내 효과가 지속적으로 유지될 수 있음을 확인한 후, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 생리활성물질과 결합된 칼시퀘스트린을 포함하는 입자, 이의 용도, 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 체내에 투여되는 생리활성물질의 체내 및 체외 안정성을 증가시키기 위한 생리활성물질과 결합된 칼시퀘스트린을 포함하는 입자 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 체내에 투여되는 생리활성물질의 체내 반감기를 증가시키기 위한 생리활성물질과 결합된 칼시퀘스트린을 포함하는 입자 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 체내에 투여되는 생리활성물질의 체내 효과 지속성을 증가시키기 위한 생리활성물질과 결합된 칼시퀘스트린을 포함하는 입자 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 체내에 투여되는 항원의 전달효율을 증가시키기 위한 항원물질과 결합된 칼시퀘스트린을 포함하는 입자 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
제1구현예에 따르면,
칼시퀘스트린,
상기 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질, 및
상기 칼시퀘스트린과 이온결합된 금속을 포함하는, 입자가 개시된다.
본 발명에 있어서, 상기 금속은 Cu, Ra, Ba, Sr, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Be, Fe(Ⅱ), Zn, Mg, Mn, Co, Ni, Al, Fe(Ⅲ), Au, He, Cr, Si, V, Ga, In, La 및 Ce로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 금속은 칼슘을 배제할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 금속은 칼슘을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 금속은 아연을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 금속은 마그네슘을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 입자는 칼시퀘스트린과 융합된 생리활성물질을 포함하는 칼시퀘스트린 기반의 금속이온 반응성 입자로서, 상기 입자는 칼슘에 의해 자가-조립될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성물질은 칼시퀘스트린에 공유 결합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성물질은 칼시퀘스트린에 공유결합 되지 않을 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 칼시퀘스트린에 연결된 생리활성물질은 생리활성물질과 칼시퀘스트린 사이에 절단 부위를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 칼시퀘스트린에 연결된 생리활성물질은 생리활성물질과 칼시퀘스트린 사이에 절단 부위를 포함하고, 상기 절단 부위는 프로테아제, 뉴클레아제, 리파아제, 글리코시다아제, pH, 저산소, 광(photo-), 열, 효소, 초음파 및 x-선 또는 가수분해에 의해 절단될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 칼시퀘스트린에 결합된 생리활성물질은 상기 생리활성물질과 칼시퀘스트린 사이가 절단되지 않을 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 칼시퀘스트린의 복수개가 단일의 금속에 결합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 칼시퀘스트린은 서열번호 1 내지 11의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 상동성을 갖는 것인 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 칼시퀘스트린은 야생형 칼시퀘스트린의 아미노산 서열 C-말단의 일부가 변형될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 칼시퀘스트린은 야생형 칼시퀘스트린의 아미노산 서열 C-말단의 일부가 결실될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 칼시퀘스트린은 서열번호 1 내지 11의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 칼시퀘스트린은 서열번호 1 내지 11의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 입자는 엘라스틴-유사 폴리펩티드 또는 탄성 중합체를 배제할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 입자는 VPGXG의 반복 단위(상기 X는 아미노산이다)를 갖는 서열을 배제할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성물질은 고분자 단백질, 펩타이드, 당 단백질, 사이토카인, 성장인자, 혈액제제, 백신, 호르몬, 효소, 항체, 및 합성제제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성물질은 인터루킨-2(Interleukin-2), 혈액 인자 VII, 혈액 인자 VIII, 혈액 인자 IX, 면역글로불린, 호세라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP), 사이토카인, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 인간 피브로넥튼엑스트라 도메인 B(human fibronectin extra domain B, EBD), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor,FGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), 인슐린 성장 인자(insulinlike growth factor, IGF), 형질 전환 성장 인자(trans-forming growth factor-α and -β, TGF-α, -β), 뇌 유래 신경 영양 인자(brain-derived neutrophic factor, BDNF), 혈소판 유래 성장 인자(plateletderived growth factor, PDGF), 태반 성장 인자(placental growth factor, PlGF), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 엑센딘, 소마토스타틴(somatostatin), LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone), 아드레노코티코트로픽 호르몬(adrenocorticotropic hormone), 성장호르몬-방출 호르몬(growth hormone-releasing hormone), 옥시토신(oxytocin), 티모신 알파-1(thymosin alpha-1), 코티코트로핀-방출인자(corticotropin-releasing factor), 칼시토닌(calcitonin), 비발리루딘(bivalirudin), 바소프레신(vasopressin), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 소낭-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 항이뇨 호르몬, 색소성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 황체분비호르몬, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGPR), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor;THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, 글루코우로니다제, 케라틴세포 성장 인자(Keratinocyte growth factor, KGF), 엑세나타이드(Exenatide), 독소루비신(Doxorubicin), 항 혈관 내피 성장 인자 항체(vascular endothelial growth factor, Anti-VEGF scFv), SARS Cov2 RBD(receptor binding domain), 표피 성장 인자 (epidermal growth factor, EGF), 섬유아세포 성장 인자 (Fibroblast growth factor-2), 뼈 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP2), 형질 전환 성장 인자(trans-forming growth factor), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 글루카곤-유사 펩티드-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1), TEV 프로테아제, HRP 효소, 인간성장호르몬 (hGH) 및 조혈성장인자(G-CSF)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성물질은 관심 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성물질은 2 내지 1000개의 아미노산 길이를 갖는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성물질은 관심 화학물질일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성물질은 면역조절 화합물, 항암제, 항바이러스제, 항박테리아제, 항진균제 및 구충제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 입자의 평균 직경은 10nm 내지 1cm일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 입자는 온도 변화에 의해 조립되지 않을 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 입자는 중합체를 배제할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 입자는 생리활성물질을 이를 필요로 하는 대상체에 전달하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 입자는 조직 재생에 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성물질의 반감기는 상기 생리활성물질이 입자화되기 전과 비교하여 증가될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성물질의 반감기는 상기 생리활성물질이 입자화되기 전과 비교하여 적어도 10% 증가될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성물질의 체내 안정성은 상기 생리활성물질이 입자화되기 전과 비교하여 증가될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성물질의 체내 안정성은 상기 생리활성물질이 입자화되기 전과 비교하여 적어도 10% 증가될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성물질의 효과 지속성은 생리활성물질의 체내 안정성이 증가함에 따라, 상기 생리활성물질이 입자화되기 전화 비교하여 증가될 수 있다.
제2구현예에 따르면,
제1구현예에 따른 입자를 포함하는 피부 상처, 당뇨병, 염증 질환, 안과 질환, 조직재생, 감염병 및 암질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 개시된다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다.
제3구현예에 따르면,
제1구현예에 따른 입자 또는 제2구현예에 따른 약학적 조성물을 포함하는 염증 질환, 감염병 및 암질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료용 백신이 개시된다.
본 발명에 있어서, 상기 백신은 어쥬번트(adjuvant)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 백신은 동결건조된 것일 수 있다.
제4구현예에 따르면,
칼시퀘스트린 및 상기 칼시퀘스트린에 연결되도록 구성된 생리활성물질을 포함하는 입자 제조용 키트개 개시된다.
본 발명에 있어서, 상기 칼시퀘스트린과 이온 결합하도록 구성된 금속을 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 상기 칼시퀘스트린 및 상기 칼시퀘스트린에 연결되도록 구성된 생리활성물질을 포함하는 칼시퀘스트린 기반의 금속이온 반응성 입자 제조용 키트일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 Cu, Ra, Ba, Sr, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Be, Fe(Ⅱ), Zn, Mg, Mn, Co, Ni, Al, Fe(Ⅲ), Au, He, Cr, Si, V, Ga, In, La 및 Ce로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 칼시퀘스트린과 융합된 생리활성물질은 이를 코팅하는 뉴클레오티드 분자 형태로 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 칼시퀘스트린과 융합된 생리활성물질은 이를 코팅하는 핵산을 포함하는 발현 벡터 형태로 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 칼시퀘스트린과 융합된 생리활성물질은 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 세포의 형태로 포함될 수 있다.
제5구현예에 따르면,
제1구현예에 따른 입자의 제조 방법이 개시된다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 상기 칼시퀘스트린과 연결된 생리활성물질과 금속을 혼합하는 단계를 포함하는 것인 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 상기 생리활성물질에 칼시퀘스트린을 연결하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 상기 칼시퀘스트린과 생리활성물질을 포함하는 서열을 재조합 발현시키는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 상기 칼시퀘스트린과 연결된 생리활성물질을 정제하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은
A) 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
B) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 형질도입하여 형질전환체를 얻는 단계;
C) 상기 형질전환체로부터 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질을 포함하는 단백질을 발현시키는 단계; 및
D) 금속이온을 이용하여 상기 발현된 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질을 포함하는 단백질을 입자화하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 상기 숙주세포는 에스체리치아 콜리, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스, 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스, 슈도모나스 종, 효모, 곤충세포, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN, MDCK 세포주, 및 식물세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은
A) 칼시퀘스트린과 생리활성물질을 반응시켜 화학적 접합(Chemical conjugation)을 형성하는 단계; 및
B) 금속이온을 이용하여 상기 칼시퀘스트린과 접합된 생리활성물질을 입자화하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 상기 생리활성물질을 칼시퀘스트린과 화학적 접합을 형성할 수 있도록 준비하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.
제6구현예에 따르면,
본 발명은 생리활성물질을 이를 필요로 하는 대상체에 전달하는 방법을 개시한다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은:
제5구현예에 따른 방법에 따라 입자를 제조하는 단계, 및
상기 입자를 대상체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 대상체에 제1구현예에 따른 입자를 형성하기 위하여 칼시퀘스트린, 생리활성물질 및 금속을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 칼시퀘스트린은 생리활성물질에 연결된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 투여는 칼시퀘스트린 및 생리활성물질을 코딩하는 뉴클레오티드 분자를 대상체에서 발현시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 투여는 칼시퀘스트린을 코딩하는 제1뉴클레오티드 분자 및 생리활성물질을 코딩하는 제2뉴클레오티드 분자를 대상체에서 발현하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 투여는 비경구, 경구, 피하, 국소, 근육내, 경피, 협측, 설하, 비강내, 경혈관, 피하, 안와 또는 호흡기 투여를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성물질은 대상체의 질병의 표적 부위에 직접 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성물질은 대상체의 질병의 표적 부위에 직접 투여되지 않을 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성물질이 입자로부터 방출되는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성물질이 유리 형태로 입자로부터 방출되는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생리활성물질이 칼시퀘스트린에 연결된 상태로 입자로부터 방출되는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
제7구현예에 따르면,
본 출원에 개시된 하나 또는 그 이상의 요소를 특징으로 하는 제품 또는 방법의 사용을 개시한다.
본 발명의 칼시퀘스트린 기반의 금속이온 반응성 입자는 금속이온에 의해 입자화되기 전과 비교하여 체내의 가수분해 효소에 의한 분해가 억제되어 안정성이 향상될 수 있다.
또한, 본 발명의 칼시퀘스트린 기반의 금속이온 반응성 입자는 금속이온에 의해 입자화되기 전과 비교하여 체내에서 반감기가 증가되어 생리활성물질 효과의 지속성이 향상될 수 있다.
또한, 본 발명의 칼시퀘스트린 기반의 금속이온 반응성 입자는 금속이온에 의해 입자화되기 전과 비교하여 생리활성물질의 체외 안정성이 향상되어 활성을 유지할 수 있다.
또한, 본 발명의 칼시퀘스트린 기반의 금속이온 반응성 입자는 금속이온에 의해 입자화되기 전과 비교하여 항원의 전달효율을 증가시킬 수 있다.
도 1은 일 예시적인 구현예로서 CSQ-KGF가 금속이온으로 입자화된 경우 안정성 증가, 활성 유지시간 증가 및 체내 반감기 증가에 따른 생리활성물질의 체내 효능 지연 방출 및 약물의 효과 지속성을 향상시킬 수 있음을 나타내는 모식도이다.
도 2는 CSQ-KGF 발현 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 3은 정제된 CSQ-KGF의 SDS-PAGE 결과이다.
도 4는 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 CSQ-KGF의 형광현미경 관찰 결과 및 입자분포기(DLS) 결과를 나타낸다.
도 5은 다양한 금속이온(Ca2+, Mg2+, Fe2+, Zn2+, Cu2+ 및 Mn2+)으로 입자화된 CSQ-KGF의 안정성 평가 데이터로서, SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 6은 다양한 금속이온(Ca2+, Mg2+, Fe2+, Zn2+, Cu2+ 및 Mn2+)으로 입자화된 CSQ-KGF의 방출속도 평가 결과를 나타낸다.
도 7은 CSQ-KGF, CSQ 및 native KGF의 In vitro Proliferation test 결과를 나타낸다.
도 8은 CSQ-KGF, CSQ 및 native KGF의 In vitro Migration test 결과를 나타낸다.
도 9는 대조군(Saline), native KGF 및 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 CSQ-KGF의 In vivo 상처회복율 평가 결과를 나타낸다.
도 10은 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 CSQ-KGF 및 입자화되지 않은 CSQ-KGF (No particle)의 상처 봉합 분석 결과를 나타낸다.
도 11은 Exenatide-CSQ 발현 벡터의 모식도(A) 및 정제된 CSQ-KGF의 SDS-PAGE 결과(B)를 나타낸다.
도 12는 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 Exenatide-CSQ의 탁도(Turbidity) 및 입자분포기(DLS) 결과를 나타낸다.
도 13는 다양한 금속이온(Ca2+, Mg2+, Fe2+, Zn2+, Cu2+ 및 Mn2+)으로 입자화된 Exenatide-CSQ의 안정성 평가 데이터로서, SDS-PAGE 결과(A), 금속이온 농도에 따른 안정성 평가(B) 및 금속이온의 종류에 따른 안정성 평가(C) 결과를 나타낸다
도 14는 native Exenatide, 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 Exenatide-CSQ 및 금속으로 입자화되지 않은 Exenatide-CSQ (No particle)의 In vivo 혈당감소율 평가 결과를 나타낸다.
도 15는 native Exenatide, 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 Exenatide-CSQ 및 금속으로 입자화되지 않은 Exenatide-CSQ (No particle)의 In vivo 반감기 평가 결과를 나타낸다.
도 16은 CSQ-SARS Cov2 RBD의 금속이온(Ca2+) 농도에 따른 입자화 결과(A) 및 면역원성 백신 효능(B) 평가 결과를 나타낸다.
도 17은 금속이온 으로 입자화된 CSQ-Doxorubicin의 제조 방법을 나타내는 모식도이다.
도 18은 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 CSQ-Doxorubicin의 입자분포기(DLS) 결과를 나타낸다.
도 19는 native Doxorubicin, 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 CSQ-Doxorubicin 및 금속으로 입자화되지 않은 CSQ-Doxorubicin (No particle)의 In vivo 반감기 평가 결과를 나타낸다.
도 20은 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 CSQ-EGF의 입자분포기(DLS) 결과를 나타낸다.
도 21은 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 CSQ-Anti-VEGF scFv의 입자분포기(DLS) 결과를 나타낸다.
도 22는 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 CSQ-FGF2의 입자분포기(DLS) 결과를 나타낸다.
도 23은 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 CSQ-BMP2의 입자분포기(DLS) 결과를 나타낸다.
도 24는 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 CSQ-TGF의 입자분포기(DLS) 결과를 나타낸다.
도 25는 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 CSQ-VEGF의 입자분포기(DLS) 결과를 나타낸다.
도 26은 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 CSQ-GLP1의 입자분포기(DLS) 결과를 나타낸다.
도 27은 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 CSQ-TEV protease의 입자분포기(DLS) 결과를 나타낸다.
도 28은 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 CSQ-HRP enzyme의 입자분포기(DLS) 결과를 나타낸다.
도 29는 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 CSQ-HRP enzyme 및 금속이온으로 입자화되지 않은 CSQ-HRP enzyme (No particle)의 안정성 평가 결과를 나타낸다.
도 30은 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 CSQ-hGH의 입자분포기(DLS) 결과를 나타낸다.
도 31은 다양한 금속이온(Ca2+, Mg2+, Fe2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+)으로 입자화된 CSQ-hGH의 입자분포기(DLS) 결과를 나타낸다.
도 32는 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 CSQ-GCSF의 입자분포기(DLS) 결과를 나타낸다.
도 33은 CSQ2 WT, CSQ2 △8 및 CSQ2 △16의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 34는 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 CSQ2 (WT), CSQ2(△8) 및 CSQ2(△16)의 흡광도 결과(A) 및 입자분포기(DLS) 결과(B)를 나타낸다.
도 35는 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 KGF-CSQ2 (WT), KGF-CSQ2(△8) 및 KGF-CSQ2(△16)의 입자분포기(DLS) 결과(B)를 나타낸다.
도 36은 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 CSQ-cleavable linker-KGF로부터 분리된 KGF의 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 37은 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 CSQ-cleavable linker-hGH로부터 분리된 hGH의 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 38은 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 Exenatide-CSQ conjugation의 입자분포기(DLS) 결과를 나타낸다.
도 39는 금속이온(Ca2+)으로 입자화된 hGH-CSQ conjugation의 입자분포기(DLS) 결과를 나타낸다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법, 재료, 조성물, 시약, 세포가 본 개시내용의 주제의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 기재되어 있다. 본 명세서에 인용된 특허 및 특허 출원을 포함하지만 이에 제한되지 않는 모든 공보 및 참고 문헌은 각각의 개별 공보 또는 참고 문헌이 구체적이고 개별적으로 완전하게 제시된 것으로 본원에 참고로 포함되는 것으로 표시된 것처럼 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 본 출원이 우선권을 주장하는 임의의 특허 출원은 또한 공보 및 참고 문헌에 대해 상기 기재된 방식으로 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "아미노산"은 천연 및 비-천연 아미노산 둘 다 뿐만 아니라 아미노산 유사체 및 모방체를 의미한다. 천연 아미노산은 단백질 생합성 동안 사용되는 20(L)-아미노산뿐만 아니라, 예를 들면, 4-하이드록시프롤린, 하이드록시리신, 데스모신, 이소데스모신, 호모시스테인, 시트룰린 및 오르니틴과 같은 기타를 포함한다. 비천연 아미노산은, 예를 들면, (D)-아미노산, 노르류신, 노르발린, p-플루오로페닐알라닌, 에티오닌 등을 포함하며, 이는 당업자에게 공지되어 있다. 아미노산 유사체는 천연 및 비-천연 아미노산의 변형된 형태를 포함한다. 이러한 변형은, 예를 들면, 아미노산 상의 화학적 그룹 및 모이어티의 치환 또는 대체 또는 아미노산의 유도체화를 포함할 수 있다. 아미노산 모방체는, 예를 들어, 기준 아미노산의 전하 및 전하 간격 특성과 같은 기능적으로 유사한 특성을 나타내는 유기 구조를 포함한다. 예를 들어, 아르기닌(Arg 또는 R)을 모방하는 유기 구조는 유사한 분자 공간에 위치하고 천연 Arg 아미노산의 측쇄의 e-아미노 그룹과 동일한 정도의 이동성을 갖는 양전하 모이어티를 가질 것이다. 모방체는 또한 아미노산 또는 아미노산 작용성 그룹의 최적 간격 및 전하 상호작용을 유지하기 위해 강요된 구조를 포함한다. 당업자는 기능적으로 동등한 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 구성하는 구조를 알고 있거나 결정할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "엘라스틴-유사 폴리펩티드(elastin-like polypeptide)"는 온도에 따라 구조(conformation) 변화를 하는 아미노산 중합체의 일 종류를 나타낸다. 상기 엘라스틴-유사 폴리펩티드는 "역상전이 거동(inverse phase transitioning behavior)"을 갖는 중합체일 수 있다. 역상전이 거동이란 "역상전이 온도(inverse phase transition temperature: Tt)" 미만의 온도에서는 수성 용액에 용해성이고, 온도가 역상전이 온도보다 높게 상승하는 경우, 불용성으로 되는 것을 나타낸다. 상기 엘라스틴-유사 폴리펩티드는 온도가 상승함에 따라 고도로 용해성인 긴 사슬(elongated chain)로부터 크게 감소된 용해도를 갖는 단단하게 접혀진 응집체(tightly folded aggregate)로 전이할 수 있다. 이러한 역상전이는 온도의 상승에 따라 엘라스틴-유사 폴리펩티드의 구조가 β-턴 및 찌그러진 β-구조(distorted β-structure)를 더 많이 가지게 됨으로써 유도되는 것일 수 있다. 상기 엘라스틴-유사 폴리펩티드는 예를 들면, 약 10℃ 내지 약 70℃ 또는 약 39℃ 내지 약 70℃의 상전이 온도를 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “반감기"는 본 발명에 따른 생리활성물질이 유기체의 혈청 또는 조직으로 투여시 이러한 활성에 비해 또는 임의의 다른 정의된 시점에 비해 이의 약물학적, 생리학적 또는 다른 활성의 절반을 잃는 데 걸리는 시간을 의미할 수 있다. 용어 "반감기"는 또한 본 발명에 따른 생리활성물질의 양 또는 농도가 유기체의 혈청 또는 조직으로 투여시 이러한 양 또는 농도에 비해 또는 임의의 다른 정의된 시점에 비해 유기체의 혈청 또는 조직에 투여된 출발량의 절반으로 감소되는 데 걸리는 시간을 의미할 수 있다. 반감기는 혈청 및/또는 임의의 하나 이상의 선택된 조직에서 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "조절하는" 및 "변경하는"은 대조군에 비해 전형적으로 통계적으로 유의하거나 생리학적으로 유의한 양 또는 정도로 "증가하는", "향상시키는" 또는 "자극하는" 뿐만 아니라 "감소하는" 또는 "저하되는"을 포함한다. "증가된", "자극된" 또는 "향상된" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의한" 양이며, 본 발명에 따른 칼시퀘스트린 및 이와 이온결합된 금속의 부재 또는 대조군 조성물에 의해 생성된 양의 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100배 이상(예를 들면: 500, 1000배)인 증가를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"는 상호교환적으로 사용되며 임의의 특정 길이로 제한되지 않는 아미노산의 중합체를 의미한다. 용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 하나 이상의 아미노산의 쇄를 의미하며, 여기서 각 쇄는 펩티드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산을 포함하고, 상기 폴리펩티드 또는 단백질은 천연 단백질, 즉 천연 및 특이적으로 비재조합 세포, 또는 유전적으로 조작된 또는 재조합 세포에 의해 생성된 단백질의 서열을 갖는 펩티드 결합에 의해 함께 비공유 및/또는 공유 연결된 복수의 쇄를 포함할 수 있고, 천연 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자, 또는 천연 서열의 하나 이상의 아미노산으로부터 결실, 이에의 첨가 및/또는 이의 치환을 갖는 분자를 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 재조합 DNA 분자를 포함하는 재조합 세포에 의해 생성된 "재조합" 폴리펩티드이며, 이는 전형적으로 그렇지 않으면 세포에서 발견되지 않을 이종성 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 조합으로 이루어진다.
본 명세서에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 mRNA, RNA, cRNA, cDNA 및 DNA를 포함한다. 상기 용어는 전형적으로 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 어느 하나의 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태인, 길이가 적어도 10개의 염기인 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 상기 용어는 단일 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다. 용어 "단리된 DNA" 및 "단리된 폴리뉴클레오티드" 및 "단리된 핵산"은 특정 종의 전체 게놈 DNA 없이 단리된 분자를 지칭한다. 따라서, 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 DNA 세그먼트는 하나 이상의 코딩 서열을 함유하지만 DNA 세그먼트가 수득되는 종의 전체 게놈 DNA로부터 실질적으로 단리되거나 유리 정제되는 DNA 세그먼트를 지칭한다. 또한, 폴리펩티드를 인코딩하지 않는 비코딩 폴리뉴클레오티드(예: 프라이머, 프로브, 올리고뉴클레오티드)가 포함된다. 또한, 예를 들어, 발현 벡터, 바이러스 벡터, 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 파지, 바이러스 등을 포함하는 재조합 벡터가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "약물전달체"는 치료 효능이 있는 약물을 생체 내 필요한 부분에 전달하는 시스템으로, 약물이 필요한 조직으로의 전달 효율 및 필요한 양의 약물을 효율적으로 전달하는 것으로, 약물 조성물, 약물 처방, 배합 방법 또는 약물 제제로 이해할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유효 성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "예방"이란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란 본 발명의 조성물을 투여함으로써 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “융합”은 2종 이상의 단백질이 인위적으로 연결된 형태를 말하며, 본 발명에서는 칼시퀘스트린과 생리활성물질이 연결된 형태의 단백질을 의미한다. 이러한 융합 단백질은 화학적으로 접합되거나 (chemically conjugated) 또는 유전자 재조합 방법으로 발현 및 정제하여 수득될 수 있다. 상기 융합 단백질에서 칼시퀘스트린과 생리활성물질의 연결 순서는 특별한 제한이 없으며， “N 말단 - 칼시퀘스트린 - 생리활성물질 - C 말단” 또는 “N 말단 – 생리활성물질 - 칼시퀘스트린 - C 말단“ 형태 모두 포함될 수 있다.
Ⅰ. 입자
본 발명은
칼시퀘스트린,
상기 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질, 및
상기 칼시퀘스트린과 이온결합된 금속을 포함하는 입자를 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 금속은 Cu, Ra, Ba, Sr, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Be, Fe(Ⅱ), Zn, Mg, Mn, Co, Ni, Al, Fe(Ⅲ), Au, He, Cr, Si, V, Ga, In, La 및 Ce로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 예시적인 실시예에서, 상기 금속으로서 Ca, Mg, Fe, Zn, Cu 및 Mn가 사용되었다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 금속은 칼슘을 배제할 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 금속을 칼슘을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 금속은 아연을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 금속은 마그네슘을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 입자는 칼시퀘스트린과 융합된 생리활성물질을 포함하는 칼시퀘스트린 기반의 금속이온 반응성 입자로서, 칼슘에 의해 자가-조립될 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 생리활성물질은 칼시퀘스트린에 공유 결합될 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 생리활성물질은 칼시퀘스트린에 공유결합 되지 않을 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 칼시퀘스트린에 연결된 생리활성물질은 생리활성물질과 칼시퀘스트린 사이에 절단 부위를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 칼시퀘스트린에 연결된 생리활성물질은 생리활성물질과 칼시퀘스트린 사이에 절단 부위를 포함하고, 상기 절단 부위는 효소, pH 또는 가수분해에 의해 절단될 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 칼시퀘스트린에 연결된 생리활성물질은 생리활성물질과 칼시퀘스트린 사이에 절단성 링커를 포함하고, 상기 절단성 링커는 프로테아제-절단성 펩티드 링커, 뉴클레아제-민감성 핵산 링커, 리파아제-민감성 지질 링커, 글리코시다아제-민감성 탄수화물 링커, pH-민감성 링커, 저산소증-민감성 링커, 광 (photo-)-절단성 링커, 열-불안정성 링커, 효소-절단성 링커, 초음파-민감성 링커 및 x-선 절단성 링커로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 프로테아제-절단성 펩트드 링커에 있어서, 상기 프로테아제는 메탈로프로테아제, 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이 경우, 상기 프로테아제-절단성 펩티드 링커는 MMP1, MMP2, MMP3, MMP4, MMP5, MMP6, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13, MMP14, TEV 프로테아제, 매트립타제, uPA, FAP, 레구마인, PSA, 칼리크레인, 카텝신 A 및 카텝신 B로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 일 예시적인 구현예에서, 상기 프로테아제-절단성 펩티드 링커는 MMP2에 의해 절단가능한 PLGVRG이 사용되었다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 칼시퀘스트린에 결합된 생리활성물질은 상기 생리활성물질과 칼시퀘스트린 사이가 절단되지 않을 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 칼시퀘스트린에 연결된 생리활성물질은 상기 생리활성물질과 칼시퀘스트린 사이에 비-절단성 링커를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 칼시퀘스트린의 복수개가 단일의 금속에 결합될 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 칼시퀘스트린의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 11의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 서열과 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열상동성을 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 칼시퀘스트린의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 11의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 칼시퀘스트린의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 11의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 칼시퀘스트린은 야생형의 칼시퀘스트린이거나 야생형 칼시퀘스트린 아미노산 서열의 C-말단 일부가 변형된 형태일 수 있다. 상기 변형된 형태는 야생형 칼시퀘스트린의 아미노산 서열 C-말단 일부가 결실된 형태일 수 있다. 상기 변형된 형태는 아미노산 서열의 C-말단, 즉, 산성 꼬리 (acidic tail)가 결실된 형태일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형된 형태는 야생형 칼시퀘스트린의 아미노산 서열 C-말단의 6 내지 20개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다. 일 예시적인 실시예에 따르면, 칼시퀘스트린 아미노산 서열의 C-말단의 산성 꼬리가 결실되는 경우, 낮은 농도의 금속이온으로도 입자화될 수 있음이 확인되었다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 입자는 엘라스틴-유사 폴리펩티드 또는 탄성 중합체를 배제할 수 있다. 상기 엘레스틴-유사 폴리펩티드는 일부분 또는 전체가 VPGXG, PGXGV, GXGVP, XGVPG, GVPGX 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 반복 단위를 1회 이상 포함하고, 여기서 V는 발린, P는 프롤린, G는 글리신, X는 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산인 것일 수 있다. 여기서, 각 반복 단위의 X는 동일하거나 다른 아미노산일 수 있다. 상기 선택된 반복 단위는 2 이상 반복, 예를 들면 2 내지 200회 반복되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 입자는 VPGXG의 반복 단위(상기 X는 아미노산이다)를 갖는 서열을 배제할 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 생리활성물질은 고분자 단백질, 펩타이드, 당 단백질, 사이토카인, 성장인자, 혈액제제, 백신, 호르몬, 효소, 항체, 및 합성제제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 예를 들면, 상기 생리활성물질은 인터루킨-2(Interleukin-2), 혈액 인자 VII, 혈액 인자 VIII, 혈액 인자 IX, 면역글로불린, 호세라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP), 사이토카인, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 인간 피브로넥튼엑스트라 도메인 B(human fibronectin extra domain B, EBD), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor,FGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), 인슐린 성장 인자(insulinlike growth factor, IGF), 형질 전환 성장 인자(trans-forming growth factor-α and -β, TGF-α, -β), 뇌 유래 신경 영양 인자(brain-derived neutrophic factor, BDNF), 혈소판 유래 성장 인자(plateletderived growth factor, PDGF), 태반 성장 인자(placental growth factor, PlGF), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 엑센딘, 소마토스타틴(somatostatin), LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone), 아드레노코티코트로픽 호르몬(adrenocorticotropic hormone), 성장호르몬-방출 호르몬(growth hormone-releasing hormone), 옥시토신(oxytocin), 티모신 알파-1(thymosin alpha-1), 코티코트로핀-방출인자(corticotropin-releasing factor), 칼시토닌(calcitonin), 비발리루딘(bivalirudin), 바소프레신(vasopressin), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 소낭-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 항이뇨 호르몬, 색소성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 황체분비호르몬, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGPR), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor;THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, 글루코우로니다제, 케라틴세포 성장 인자(Keratinocyte growth factor, KGF), 엑세나타이드(Exenatide), 독소루비신(Doxorubicin), 항 혈관 내피 성장 인자 항체(vascular endothelial growth factor, Anti-VEGF scFv), SARS Cov2 RBD(receptor binding domain), 표피 성장 인자 (epidermal growth factor, EGF), 섬유아세포 성장 인자 (Fibroblast growth factor-2), 뼈 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP2), 형질 전환 성장 인자(trans-forming growth factor), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 글루카곤-유사 펩티드-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1), TEV 프로테아제, HRP 효소, 인간성장호르몬 (hGH) 및 조혈성장인자(G-CSF)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 생리활성물질은 관심 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 생리활성물질은 2 내지 1000개의 아미노산 길이를 가질 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 생리활성물질은 관심 화학물질일 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 생리활성물질은 역조절 화합물, 항암제, 항바이러스제, 항박테리아제, 항진균제 및 구충제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 항암제는 예를 들어, 마이탄시노이드, 오리스타틴 (MMAE, MMAF 포함), 아미노프테린, 악티노마이신, 블레오마이신, 탈리소마이신, 캄프토쎄신, N8-아세틸 스퍼미딘, 1-(2 클로로에틸)-1,2-다이메틸 술포닐 하이드라자이드, 에스퍼라마이신, 에토포사이드, 6-머캅토퓨린, 돌라스타틴, 트리코테센, 칼리케아미신, 탁솔(taxol), 탁산, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 A, 미토마이신 C, 클로람부실, 듀오카마이신, L-아스파라기나제(L-asparaginase), 머캡토퓨린(mercaptopurine), 티오구아닌(thioguanine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 시타라빈(cytarabine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 니트로소우레아(nitrosourea), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 미토마이신(mitomycin), 다카바진(dacarbazine), 프로카바진(procarbazine), 토포테칸(topotecan), 질소 머스터드(nitrogen mustard), 사이톡산(cytoxan), 에토포시드(etoposide),5-플루오로우라실(5-fluorouracil), CNU(bischloroethylnitrosourea), 이리노테칸(irinotecan), 캄포토테신(camptothecin), 블레오마이신(bleomycin), 이다루비신(idarubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 닥티노마이신(dactinomycin), 플리카마이신(plicamycin), 미톡산트론(mitoxantrone), 아스파라기나제(asparaginase), 비노렐빈(vinorelbine), 클로로람부실(chlorambucil), 멜파란(melphalan), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 부설판(busuLfan), 트레오설판(treosulfan), 데카바진(decarbazine), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 토포테칸(topotecan), 9-아미노캠프토테신(9-aminocamptothecin), 크리스나톨(crisnatol), 미토마이신 C(mitomycin C), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 티아조퓨린(tiazofurin), 리바비린(ribavirin), EICAR(5-ethynyl-1-beta-Dribofuranosylimidazole-4-carboxamide), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 데프록사민(deferoxamine), 플룩수리딘(floxuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 랄티트렉세드(raltitrexed), 시타라빈(cytarabine(ara C)), 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside), 플루다라빈(fludarabine), 타목시펜(tamoxifen), 라록시펜(raloxifene), 메게스트롤(megestrol), 고세렐린(goserelin), 류프롤리드 아세 테이트(leuprolide acetate), 플루타미드(flutamide), 바이칼루타마이드(bicalutamide), EB1089, CB1093, KH1060, 베르테포르핀(verteporfin), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 광감작제 Pe4(photosensitizer Pe4), 데메톡시-하이포크레린 A(demethoxy-hypocrellin A), 인터페론-α(Interferon-α), 인터페론-γ(Interferon-γ), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor), 겜사이타빈(Gemcitabine), 벨케이드(velcade), 레발미드(revamid), 탈라미드(thalamid), 로바스타틴(lovastatin), 1-메틸-4-페닐피리디늄 이온(1-methyl-4-phenylpyridiniumion), 스타우로스포린(staurosporine), 악티노마이신 D(actinomycin D), 닥티노마이신(dactinomycin), 블레오마이신 A2(bleomycin A2), 블레오마이신 B2(bleomycinB2), 페플로마이신(peplomycin), 에피루비신(epirubicin), 피라루비신(pirarubicin), 조루비신(zorubicin), 마이토산트론(mitoxantrone), 베라파밀(verapamil) 및 탑시가르긴(thapsigargin), 핵산 분해 효소 및 세균이나 동식물 유래의 독소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 항염증제는 당질코르티코이드 수용체에 결합하여 염증이나 부기를 줄이는 스테로이드제제, 염증을 만드는 프로스타글란딘을 합성하는 고리형산소화효소(COX)에 대응하여 통증을 완화하는 비-스테로이드항염증제(NSAIDs) 또는 염증세포의 활성화와 이송을 바꾸는 면역특이소염제제(ImSAIDs) 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역질환 치료제는 아자티오프린, 클로람부실, 사이클로포스파마이드, 사이클로스포린, 미코페놀레이트, 아자치오프린(azathioprine), 또는 메토트렉세이트(methotrexate)를 포함할 수 있으나, 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 입자의 크기는 10nm 내지 1cm일 수 있다. 예를 들면, 상기 입자의 크기는 100nm 내지 5,000nm일 수 있다. 바람직하기는, 상기 칼시퀘스트린 기반의 금속이온 반응성 입자의 크기는 1,000 내지 5,000nm일 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 입자는 온도 변화에 의해 조립되지 않을 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 입자는 중합체를 배제할 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질은 상기 칼시퀘스트린과 생리활성물질을 코딩하는 백산을 포함하는 발현 벡터에 의하여 숙주세포에서 발현되거나 칼시퀘스트린과 생리활성물질의 화학적 접합(Chemical conjugation)에 의해 형성될 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 입자는 이를 필요로 하는 대상체에 생리활성물질을 전달하기 위한 용도로 사용될 수 있다. 상기 대상체는 인간, 개, 닭, 돼지, 소, 양, 기니아피그 또는 원숭이를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 입자는 조직 재생을 위한 용도로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 생리활성물질은 입자화되기 전과 비교하여 체내 및 체외 안정성이 증가할 수 있다. 예를 들면, 상기 생리활성물질의 안정성은 입자화되기 전에 비해 1.1배 이상, 1.5배 이상, 1.7배 이상, 2배 이상, 또는 그 이상 증가할 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 생리활성물질은 입자화되기 전과 비교하여 체내 반감기가 증가할 수 있다. 예를 들면, 상기 생리활성물질의 체내 반감기는 입자화되기 전에 비해 1.1배 이상, 1.5배 이상, 1.7배 이상, 2배 이상, 또는 그 이상 증가할 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 생리활성물질은 체내 효과 지속성이 증가할 수 있다. 예를 들면, 상기 생리활성물질의 체내 효과 지속성은 입자화되기 전에 비해 1.1배 이상, 1.5배 이상, 1.7배 이상, 2배 이상, 또는 그 이상 증가할 수 있다.
본 발명에 따른 입자에 있어서, 상기 입자는 입자를 체내의 특정부위 또는 특정세포로 선택적 이송이 가능하도록, 체내 특정조직 또는 특정세포에 존재하는 물질과 결합하는 아미노산서열을 더욱 포함할 수 있다.
Ⅱ. 약학적 조성물 및 치료 방법
약학적 조성물
본 발명은 칼시퀘스트린, 상기 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질, 및 상기 칼시퀘스트린과 이온결합된 금속을 포함하는 입자를 포함하는 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 하고자 한다. 이때, 상기 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질은 Ⅰ. 입자에 기재된 내용을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 질환은 피부 상처, 당뇨병, 염증 질환, 안과 질환, 조직재생, 감염병 및 암질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 염증 질환은 심내막염, 심낭염, 심근염, 구내염, 간염, 담낭염, 담도염, 식도염, 대장염, 위염, 장염, 충수염, 췌장염, 기관지염, 갑상선염, 난소염, 방광염, 요도염, 전립선염, 질염, 골수염, 관절염 등을 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 모든 염증 질환을 포함한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 암 질환은 간암, 갑상선암, 난소암, 다발골수종, 림프종, 백혈병, 신장암, 위암, 유방암, 자궁경부암, 전립선암, 췌장암, 폐암 등을 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 모든 암 질환을 포함한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 안과 질환은 황반 변성, 맥락막 혈관 신생, 급성 황반 신경망막병증, 황반 부종, 베체트병, 망막 장애, 당뇨병성 망막병증, 망막 동맥 폐색성 질환, 중심 망막 정맥 폐색, 포도막염성 망막 질환, 망막 박리, 후안 부위 또는 위치에 영향을 주는 안 외상, 안구 레이저 치료에 의해 유발되거나 영향을 받은 후안부 질환, 광역학 치료에 의해 유발되거나 영향을 받은 후안부 질환, 광응고, 방사선 망막병증, 망막 전막 장애, 망막 분지정맥 폐쇄, 전방 허혈성 시신경병증, 비-망막병증성 당뇨병성 망막 기능이상, 망막색소변성증 및 녹내장과 같은 후안부 질환과 무수정체안, 위수정체안, 난시, 안검경련, 백내장, 결막 질환, 결막염, 각막 질환, 각막 궤양, 건성안 증후군, 눈꺼풀 질환, 눈물 기관 질환, 눈물관 폐색, 근시, 노안, 동공 장애, 굴절 장애 및 사시와 같은 전안부 질환 등을 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 모든 안과 질환을 포함한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 감염병은 박테리아, 바이러스, 진균류, 또는 기생충에 의해 유발된 질병 또는 질환을 포함한다. 예를 들면, 상기 감염병은 인플루엔자 바이러스(Influenza virus), 플라비 바이러스(Flavivirus), 아데노 바이러스(Human adenovirus, HAdV), 코로나 바이러스 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV 또는 SARS-CoV-1), 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV-2),메르스 코로나 바이러스(MERS-CoV), 코로나바이러스 감염증-19(Coronavirus disease 2019 (COVID-19)), 헤르페스 바이러스(Herpes virus), 지카 바이러스(Zica virus), 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus, JEV), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV), 에볼라 바이러스(Ebola virus, EBOV), 리노 바이러스(rhinovirus), 치쿤군야 바이러스(Chikungunya virus, CHIKV), C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus, HCV), B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV), A형 간염 바이러스(Hepatitis A virus, HAV), 로타바이러스, 아스트로 바이러스(Astrovirus), 한타바이러스(Hantavirus), 뎅기 바이러스(Dengue virus), SFTS 바이러스(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus), HIV 바이러스, 웨스트나일바이러스(West Nile Virus, WNV), 황열바이러스(Yellow fever virus) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 모든 감염병환을 포함한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 약학 조성물은 담체를 더 포함할 수 있으며, 상기 담체는 약제학적으로 허용되는 담체로서 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 예의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 약학적 조성물은 당해 분야에서 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 하나 이상 혼합하여 제조될 수 있다. 일 실시예로, 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 입자에 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 다른 일 실시예로, 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
치료 방법
본 발명은 칼시퀘스트린, 상기 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질, 및 상기 칼시퀘스트린과 이온결합된 금속을 포함하는 입자를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 질환 치료 방법을 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 질환 치료 방법에 있어서, 상기 개체는 인간, 개, 닭, 돼지, 소, 양, 기니아피그 또는 원숭이를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 질환 치료 방법에 있어서, 상기 투여는 경구, 직장, 경피, 피내, 혈관 내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내, 골수 내, 경막 내 또는 피하될 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 질환 치료 방법에 있어서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 명세서에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏당 0.1 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
Ⅲ. 백신
본 발명은 칼시퀘스트린, 상기 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질, 및 상기 칼시퀘스트린과 이온결합된 금속을 포함하는 입자를 포함하는 염증 질환, 감염병 및 암질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료용 백신을 제공한다. 이때, 상기 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질은 Ⅰ. 입자에 기재된 내용을 모두 포함하고, 염증 질환, 감염병 및 암질환은 Ⅱ. 약학적 조성물 및 치료 방법에 기재된 내용을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 백신에 있어서, 상기 백신은 어쥬번트(adjuvant)를 더 포함할 수 있다. 상기 어쥬번트는 미네랄 물질, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 세균 추출물(예를 들어, 세균성 지질당, 프로인트 보조제, 및/또는 MDP), 유성 에멀젼, 사포닌, 스쿠알렌, 황산알루미늄칼륨, 수산화칼슘, TLR 작용제등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 백신에 있어서, 상기 백신은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 백신에 있어서, 상기 백신은 비경구 투여용으로 제제화될 수 있다, 상기 비경구 투여는 피하 주사 또는 피내 주사를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 백신에 있어서, 상기 백신은 동결건조될 수 있다.
Ⅳ. 키트
본 발명은 칼시퀘스트린 및 상기 칼시퀘스트린에 연결되도록 구성된 생리활성물질을 포함하는 입자 제조용 키트를 제공하고자 한다. 이때, 상기 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질은 Ⅰ. 입자에 기재된 내용을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 상기 칼시퀘스트린과 이온 결합하도록 구성된 금속을 더욱 포함할 수 있다. 상기 금속은 상기 금속은 Cu, Ra, Ba, Sr, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Be, Fe(Ⅱ), Zn, Mg, Mn, Co, Ni, Al, Fe(Ⅲ), Au, He, Cr, Si, V, Ga, In, La 및 Ce로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 금속 이온은 금속 화합물 또는 이의 수용액일 수 있다. 예를 들면, 상기 금속 이온이 칼슘 이온인 경우, 상기 칼슘 이온은 염화칼슘(CaCl2) 형태 또는 염화칼슘(CaCl2)의 용액으로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 희석액, 완충액, 효소, 금속이온 반응성 입자를 제조하기 위한 설명서 등을 함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 금속 이온은 0.1 내지 10000mM의 농도, 바람직하게는 1mM 내지 5000mM의 농도, 더욱 바람직하게는 2mM 내지 10000mM의 농도, 가장 바람직하게는 10mM 내지 1000mM로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질은 이를 코딩하는 뉴클레오티드 분자 형태로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질은 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터의 형태로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질은 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 세포의 형태로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질은 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 세포로부터 발현된 단백질 형태로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질은 칼시퀘스트린과 생리활성물질이 화학적으로 접합(Chemically conjugated)된 형태로 포함될 수 있다.
Ⅴ. 제조방법
본 발명은 칼시퀘스트린, 상기 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질, 및 상기 칼시퀘스트린과 이온결합된 금속을 포함하는 입자의 제조 방법을 제공하고자 한다. 이때, 상기 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질은 Ⅰ. 입자에 기재된 내용을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 칼시퀘스트린과 연결된 생리활성물질과 금속을 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 생리활성물질에 칼시퀘스트린을 연결하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 칼시퀘스트린과 생리활성물질을 포함하는 서열을 재조합 발현시키는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 칼시퀘스트린과 연결된 생리활성물질을 정제하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 방법은
A) 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
B) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 형질도입하여 형질전환체를 얻는 단계;
C) 상기 형질전환체로부터 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질을 포함하는 단백질을 발현시키는 단계; 및
D) 금속이온을 이용하여 상기 발현된 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질을 포함하는 단백질을 입자화하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 숙주세포는 에스체리치아 콜리, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스, 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스, 슈도모나스 종, 효모, 곤충세포, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN, MDCK 세포주, 및 식물세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 방법.
본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 방법은
A) 칼시퀘스트린과 생리활성물질을 반응시켜 화학적 접합(Chemical conjugation)을 형성하는 단계; 및
B) 금속이온을 이용하여 상기 칼시퀘스트린과 접합된 생리활성물질을 입자화하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 생리활성물질을 칼시퀘스트린과 화학적 접합을 형성할 수 있도록 준비하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.
Ⅵ. 전달 방법
본 발명은 생리활성물질을 이를 필요로 하는 대상체에 전달하는 방법을 제공하고자 한다. 이때, 상기 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질은 Ⅰ. 입자에 기재된 내용을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 생리활성물질은 전달하는 방법에 있어서, 상기 방법은 Ⅴ. 제조방법에 기재된 방법에 따라 입자를 제조하는 단계, 및
상기 입자를 대상체에 투여하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 생리활성물질은 전달하는 방법에 있어서, 상기 방법은 대상체에 Ⅰ. 입자를 형성하기 위하여 칼시퀘스트린, 생리활성물질 및 금속을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 생리활성물질은 전달하는 방법에 있어서, 상기 칼시퀘스트린은 생리활성물질에 연결될 수 있다.
본 발명에 따른 생리활성물질은 전달하는 방법에 있어서, 상기 투여는 칼시퀘스트린 및 생리활성물질을 코딩하는 뉴클레오티드 분자를 대상체에서 발현시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 생리활성물질은 전달하는 방법에 있어서, 상기 투여는 칼시퀘스트린을 코딩하는 제1뉴클레오티드 분자 및 생리활성물질을 코딩하는 제2뉴클레오티드 분자를 대상체에서 발현하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 생리활성물질은 전달하는 방법에 있어서, 상기 투여는 비경구, 경구, 피하, 국소, 근육내, 경피, 협측, 설하, 비강내, 경혈관, 피하, 안와 또는 호흡기 투여를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 생리활성물질은 전달하는 방법에 있어서, 상기 생리활성물질은 대상체의 질병의 표적 부위에 직접 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 생리활성물질은 전달하는 방법에 있어서, 상기 생리활성물질은 대상체의 질병의 표적 부위에 직접 투여되지 않을 수 있다.
본 발명에 따른 생리활성물질은 전달하는 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 생리활성물질이 입자로부터 방출되는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 생리활성물질은 전달하는 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 생리활성물질이 유리 형태로 입자로부터 방출되는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 생리활성물질은 전달하는 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 생리활성물질이 칼시퀘스트린에 연결된 상태로 입자로부터 방출되는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 출원에 개시된 하나 또는 그 이상의 요소를 특징으로 하는 제품 또는 방법의 사용을 제공하고자 한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[1. 금속이온 입자화된 CSQ-KGF의 제조 및 특성 평가]
제조예 1. 금속이온 입자화된 CSQ-KGF의 제조
1-1. CSQ-KGF 클로닝
CSQ-MCS vector에 KGF를 클로닝하기 위해서, KGF-1 유전자를 합성하였다 (Bioneer, Daejeon, Korea). 이때 CSQ 및 KGF-1의 아미노산 서열 정보는 하기와 같다:
Human CSQ1 (서열번호 1):
QEGLDFPEYDGVDRVINVNAKNYKNVFKKYEVLALLYHEPPEDDKASQ
RQFEMEELILELAAQVLEDKGVGFGLVDSEKDAAVAKKLGLTEVDSMY
VFKGDEVIEYDGEFSADTIVEFLLDVLEDPVELIEGERELQAFENIED
EIKLIGYFKSKDSEHYKAFEDAAEEFHPYIPFFATFDSKVAKKLTLKL
NEIDFYEAFMEEPVTIPDKPNSEEEIVNFVEEHRRSTLRKLKPESMYE
TWEDDMDGIHIVAFAEEADPDGFEFLETLKAVAQDNTENPDLSIIWID
PDDFPLLVPYWEKTFDIDLSAPQIGVVNVTDADSVWMEMDDEEDLPSA
EELEDWLEDVLEGEINTEDDDDDDDD
KGF (서열번호 12):
MCNDMTPEQMATNVNCSSPERHTRSYDYMEGGDIRVRRLFCRTQWYLR
IDKRGKVKGTQEMKNNYNIMEIRTVAVGIVAIKGVESEFYLAMNKEGK
LYAKKECNEDCNFKELILENHYNTYASAKWTHNGGEMFVALNQKGIPV
RGKKTKKEQKTAHFLPMAIT
상기 제조된 KGF 유전자를 CSQ 벡터에 삽입하기 위해서 CSQ 벡터와 인서트 DNA를 제한효소로 처리하였다. 약 1㎍의 인서트 DNA를 BamHI (New England Biolabs (NEB, Ipswich) 및 XhoI (NEB, Ipswich)으로 하루 동안 반응시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제 DNA를 얻었다. 또한, 약 40㎍의 CSQ 벡터에 CIAP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase) (NEB, Ipswich)를 넣고 3시간 동안 반응시킨 후, PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. T4 DNA 리가아제 (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 인서트 DNA를 CSQ 벡터와 상온에서 3시간 동안 연결하였다 (도 2). 그 다음, CSQ 벡터와 KGF 인서트를 연결 반응시킨 DNA를 transformaion하였다. 컴피턴트 세포인 DH5a를 얼음 위에서 녹이고, 100㎕의 컴피턴트 세포에 연결 반응시킨 용액 2㎕와 혼합한 후, 30분 동안 반응시켰다. 그 다음, 42℃에서 1분간 heat shock을 하고 SOC media를 200㎕ 넣어준 뒤 37℃에서 30분 동안 배양하여 도말하였다. 도말하여 나온 콜로니를 무작위로 6개 찍어 PCR하였고, DNA 전기영동하여 Insert를 확인하였다. cloning이 된 콜로니를 바이오니아에 시퀀싱 의뢰하여 확인하였다.
1-2. CSQ-KGF 정제
바이오니아에서 시퀀스가 확인된 DNA 모두를 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린 (50μg/㎖)이 포함된 5㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1㎖을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린 (50μg/㎖)이 포함된 20㎖의 LB 배지에 stock 20㎕를 접종하여 37℃에서 150rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린 (50μg/㎖)이 포함된 400㎖의 LB 배지에 옮겨 OD=1.2까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 넣어주어 20℃에서 150rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000rpm로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼 (20mM Tris (pH 8.0)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF (Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 DMSO 1㎖에 녹인 후 용해된 E. coli에 1㎖ 넣었다. 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 상층액에 CaCl2 20mM을 넣고 4℃에서 1시간 반응하였다. 그 다음 5000rpm의 속도로 30분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 침전물에 EDTA를 넣고 현탁하여 CSQ-KGF 단백질을 얻었다 (도 3).
1-3. CSQ-KGF 입자화
CSQ-KGF 단백질이 CaCl2와 반응하여 안정적으로 입자화되는지 평가하기 위해서 CSQ-KGF에 1mM에서 10mM 농도의 CaCl2를 첨가하였다. 4℃에서 30분 동안 반응시킨 후 생성된 입자 크기를 형광현미경과 동적 광산란 광도계 (dynamic light scattering)를 통해 측정하였다. 그 결과, CSQ-KGF 단백질은 금속이온과 반응하여 안정적으로 입자화된될 수 있는 것으로 나타났으며, 특히 10 mM의 농도의 금속이온에 의해 마이크로 크기로 입자화되는 것으로 확인되었다 (도 4).
실시예 1. CSQ-KGF 입자의 특성 평가
1-1. 안정성 평가
상기 정제된 CSQ-KGF 단백질 50㎕에 Ca2+, Mg2+, Fe2+, Zn2+, Cu2+ 및 Mn2+을 각각 10mM 첨가하여 4℃에서 30분 반응시켜 입자를 생성하였다. CHO cell을 배양한 배지를 13000rpm 10분 원심분리하여 상등액을 덜어냈다. 가수분해효소가 포함된 배양액 상등액 50㎕를 입자화된 CSQ-KGF에 첨가하고 가볍게 10회 inverting을 하여 섞어준 다음 37℃ 인큐베이터에서 3일 동안 보관하였다. 보관 후 0시간부터 96시간까지 12시간 또는 24시간 간격으로 샘플을 꺼내어 -20℃에서 보관하였다. 3일이 지난 후 샘플을 완전히 해동하여 5X sample buffer 12.5㎕를 첨가하고 vortexing으로 완전히 섞어주었다. 80℃에서 10분 동안 샘플을 가열한 다음 10% acrylamide SDS-PAGE gel의 well에 10㎕씩 분주하여 단백질 밴드를 확인하였다. 그 다음, SDS-PAGE gel을 coomassic brilliant blue로 염색하여 Gel-documentation으로 촬영하였다. 촬영 이미지의 밴드 크기를 바탕으로 각각의 금속이온으로 입자화된 CSQ-KGF의 안정성을 비교하였다. 그 결과, CSQ-KGF 단백질이 금속이온(Ca2+, Mg2+, Fe2+, Zn2+, Cu2+ 및 Mn2+)에 의해 마이크로 크기로 입자화된 경우, 입자화되지않은 CSQ-KGF (0 mM)에 비하여 안정성이 현저히 향상된 것으로 확인되었다 (도 5).
1-2. 방출속도 평가
상기 정제된 CSQ-KGF에 10mM 농도의 Ca2+, Mg2+, Fe2+, Zn2+, Cu2+ 및 Mn2+ 이온을 각각 첨가하고 4℃에서 30분 동안 반응시켜 CSQ-KGF 입자를 형성하였다. 샘플이 담겨있는 튜브의 입구를 파라필름으로 밀봉시킨 후 37℃ 조건에서 반응시키고, 0일부터 6일까지 2일 간격으로 동적 광산란 광도계 (dynamic light scattering)를 통해 입자 크기를 측정하여 방출속도를 평가하였다. 그 결과, CSQ-KGF 단백질이 금속이온(Ca2+, Mg2+, Fe2+, Zn2+, Cu2+ 및 Mn2+)에 의해 마이크로 크기로 입자화된 경우, KGF가 지연방출되는 것으로 확인되었다 (도 6).
실험예 1. CSQ-KGF 입자의 효능 평가
1-1. In vitro Proliferation test
96 well plate에 HaCaT cell을 cell/well 만큼 분주하여 10% FBS, 1% P/S DMEM으로 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 하루 동안 배양하였다. FBS Free DMEM으로 하루 동안 starvation하였다. DPBS로 2회 washing 후 FBS Free DMEM에 2.5nM 농도로 CSQ-KGF, CSQ, KGF를 첨가하여 total volume이 200㎕이 되도록 샘플을 분주하였다. 2일 동안 인큐베이터에서 배양 후 XTT cell viability kit시약을 분주한 다음 micro plate reader로 450nm 흡광도를 측정하였다. 그 결과, KGF가 칼시퀘스트과 융합 (CSQ-KGF)되더라도 native (KGF)와 동일한 효능을 갖는 것으로 확인되었다 (도 7).
1-2. In vitro Migration test
24 well plate에 HaCaT cell을 cell/well 만큼 분주하여 10% FBS, 1% P/S DMEM으로 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 1일 동안 배양하였다. FBS Free DMEM으로 하루 동안 starvation하였다. 1000㎕ pipet tip을 이용하여 세포에 직선형태의 scratch를 냈다. DPBS로 2회 washing 후 FBS Free DMEM에 10nM 농도로 CSQ-KGF, CSQ, KGF를 첨가하여 total volume이 500㎕이 되도록 샘플을 분주하였다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하면서 0시간부터 74시간 동안 24시간 간격으로 역상현미경으로 scratch를 관찰하고 사진을 촬영하였다. 촬영한 이미지를 imageJ를 통해 scratch 면적을 분석하여 상처 봉합(wound closure) 정도를 비교하였다. 그 결과, KGF가 칼시퀘스트린과 융합 (CSQ-KGF)되더라도 native (KGF)와 동일한 효능을 갖는 것으로 확인되었다 (도 8).
1-3. In vivo 상처회복율 평가
C57BL/6N(Orient bio), female, 8주령 mouse를 5마리씩 그룹을 지어 케이지에 준비하였다. 5일의 적응기 동안 12-hr light-dark cycle 가지며 사료와 식수를 제공하였다. 제모크림과 클리퍼를 이용해 등쪽의 털을 제모하였다. 제모 하루 후에 6mm biopsy punch를 사용하여 1마리에 4개의 drosal full thickness wound를 만들었다. 상처부위에 10mM CaCl2으로 입자화한 CSQ-KGF(microparticle), CSQ-KGF (No particle), KGF(in 20mM Tris-HCl buffer, pH7.0), CSQ(in 20mM Tris-HCl buffer, pH7.0)을 각각 1nM 농도로 준비하고 10㎕만큼 상처 부위에 분주하였다. 대조군은 20mM Tris-HCl buffer (pH7.0) 10㎕로 대체하였다. 상처부위에 Tegadem으로 드레싱을 하였다. 2일 간격으로 상처의 사진을 촬영하고 상처의 길이를 digital caliper를 사용하여 측정하였다. 상처의 면적을 imageJ를 통해 분석하고, 상처회복율을 하기의 수학식 1에 따라 계산하였다:
[수학식 1]
상처회복율 = (초기 상처 면적-열린 상처 부분)/(초기 상처 면적)
그 결과, CSQ-KGF 단백질이 금속이온에 의해 마이크로 크기로 입자화된 경우, 대조군(Saline), native (KGF) 및 CSQ-KGF (No particle) 단백질에 비하여 현저히 향상된 상처회복율을 나타내는 것으로 확인되었다 (도 9-10).
[2. 금속이온 입자화된 Exenatide-CSQ의 제조 및 특성 평가]
제조예 2. 금속이온 입자화된 Exenatide-CSQ의 제조
KGF-1 유전자 대신에 Exenatide 유전자를 상기 제조예 1과 동일한 방법을 사용하여 Exenatide-CSQ 입자를 제조하였다 (도 11). 이때 Exenatide의 아미노산 서열 정보는 하기와 같다:
Exenatide(서열번호 13):
AAHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
상기 생성된 Exenatide-CSQ 입자의 크기를 형광현미경과 동적 광산란 광도계 (dynamic light scattering)를 통해 측정하였다. 그 결과, Exenatide-CSQ 단백질은 금속이온과 반응하여 안정적으로 입자화될 수 있는 것으로 나타났으며, 특히 10 mM의 농도에서는 마이크로 크기로 입자화되는 것으로 확인되었다 (도 12).
실시예 2. Exenatide-CSQ 입자의 특성 평가
상기 정제된 Exenatide-CSQ 단백질 50㎕에 Ca2+, Mg2+, Fe2+, Zn2+, Cu2+ 및 Mn2+을 각각 10mM 첨가하여 4℃에서 30분 반응시켜 입자를 생성한 후, 상기 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 각각의 금속이온으로 입자화된 Exenatide-CSQ의 안정성을 비교하였다. 그 결과, Exenatide-CSQ 단백질이 금속이온(Ca2+, Mg2+, Fe2+, Zn2+, Cu2+ 및 Mn2+)에 의해 마이크로 크기로 입자화된 경우, 입자화되지 않은 Exenatide-CSQ (0 mM)에 비하여 안정성이 현저히 향상된 것으로 확인되었다 (도 13).
실험예 2. Exenatide-CSQ의 효능 평가
2-1. In vivo 혈당감소율 평가
C57BL/6J(Orient bio), male, 6주령 마우스를 4마리씩 4그룹을 지어 케이지에 준비하였다. 5일의 적응기 동안 12-hr light-dark cycle 가지며 사료와 식수를 제공하였다. 실험 20시간 전 사료제공을 중단하였다. 약물을 주사하기 1시간 전에 tail-cut으로 혈액샘플을 채취하여 혈당측정기(녹십자 그린닥터 혈당측정기)로 혈당을 측정하였다. 엑세나타이드(Exenatide), 엑세나타이드-CSQ (No particle), 엑세나타이드-CSQ Depot (particle, 10mM CaCl2를 넣고 30분간 반응)를 각각 750nmol/kg의 농도로 S.C Injection으로 주사하였다. 주사 후 혈당을 측정하여 저혈당(hypoglycemic) 효과를 평가하였다. 그 결과, Exenatide-CSQ 단백질이 금속이온에 의해 마이크로 크기로 입자화된 경우, native (Exenatide) 및 금속이온으로 입자화되지 않은 CSQ-KGF (No particle)에 비하여 현저히 향상된 혈당 감소 효과를 나타내는 것으로 확인되었다 (도 14).
2-2. In vivo 반감기 평가
10mM 칼슘으로 제작된 Exenatide-CSQ 입자와 0mM 칼슘인 Exenatide-CSQ　（No particle)과 Exenatide를 마우스에 S.C Injection 한 후 시간에 따라 serum sample을 만들었다. Exenatide ELISA kits (MyBioSource)을 이용하여 각 샘플의 반감기를 측정하였다. 그 결과, Exenatide-CSQ 단백질이 금속이온에 의해 마이크로 크기로 입자화된 경우, native (Exenatide) 및 금속이온으로 입자화되지 않은 Exenatide-CSQ (No particle)에 비하여 생체 내에서 장기간 고농도로 유지될 수 있는 것으로 확인되었다 (도 15).
[3. 금속이온 입자화된 CSQ-SARS Cov2 RBD의 제조 및 특성 평가]
제조예 3. 금속이온 입자화된 CSQ-SARS Cov2 RBD의 제조
KGF-1 유전자 대신에 SARS Cov2 RBD 유전자를 사용한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법을 사용하여 CSQ-SARS Cov2 RBD 입자를 제조하였다. 이때 SARS Cov2 RBD의 아미노산 서열 정보는 하기와 같다:
SARS Cov2 RBD(서열번호 14):
PNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTF
KCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKL
PDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIY
QAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAP
ATVCGPKKS
상기 생성된 CSQ-SARS Cov2 RBD 입자의 크기를 형광현미경과 동적 광산란 광도계 (dynamic light scattering)를 통해 측정하였다. 그 결과, CSQ-SARS Cov2 RBD 단백질이 금속이온과 반응하여 안정적으로 입자화된 것으로 확인되었다 (도 16A).
실험예 3. CSQ-SARS Cov2 RBD의 면역원성 평가
SARS Cov2 RBD-CSQ 나노입자의 면역원성을 확인하기 위해 4 mM CaCl2를 처리하여 365 nm의 나노입자를 제조하였다. Balb/c mouse를 5마리씩 그룹을 지어 케이지에 준비하였다. 50 ㎍의 RBD-CSQ 나노입자, RBD 단백질, Saline을 한번 주사한 후 2주 후에 2차 주사하였다. 2차 주사후 14일째에, 혈액 샘플을 채취하여 anti-RBD antibody를 이용하여 ELISA로 분석하였다. 간략하게, 96-웰 플레이트(Corning)를 100 ㎕의 항원 용액(30 ㎍/ml RBD)으로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 세척하고 차단한 후 혈액 샘플(2% 우유에 1:10000 희석)을 첨가하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양했습니다. 그 후 플레이트를 세척하고, HRP-접합된 항-마우스 IgG를 2차 항체로 사용하고, TMB 기질(BD OptEIA)을 첨가하고 450nm에서 흡광도를 평가하였다. 그 결과, SARS Cov2 RBD-CSQ 단백질이 금속이온에 의해 입자화된 경우, native (SARS Cov2 RBD) 및 금속이온으로 입자화되지 않은 SARS Cov2 RBD-CSQ (No particle)에 비하여 면역원성 현저히 증가하는 것으로 확인되었다 (도 16B).
[4. 금속이온 입자화된 CSQ-Doxorubicin의 제조 및 특성 평가]
제조예 4. 금속이온 입자화된 CSQ-Doxorubicin의 제조
독소루비신 결합 키트(Doxorubicin Conjugation Kit (PerKit))를 구매하여 키트 매뉴얼에 따라 CSQ에 Doxorubicin을 결합하였다. 간단히 설명하면, Doxorubicin에 sulfo-NHS 에스터를 붙여 Doxorubicin-NHS 에스터를 만든 후에 1~3mg CSQ에 Doxorubicin을 혼합하여 어두운 곳에서 2시간 동안 반응하였다. 그 다음 Desalting column으로 Doxorubicin-CSQ와 Doxorubicin을 분리하여 Doxorubicin-CSQ을 얻었다 (도 17). 상기 생성된 CSQ-Doxorubicin 단백질의 CaCl2에 대한 입자화 생성을 평가하기 위해서 CSQ-Doxorubicin에 1mM에서 10mM 농도의 CaCl2를 첨가하였다. 4℃에서 30분 동안 반응시킨 후 생성된 입자 크기를 동적 광산란 광도계 (dynamic light scattering)를 통해 측정하였다. 그 결과, CSQ-Doxorubicin 단백질이 금속이온과 반응하여 안정적으로 입자화되는 것으로 확인되었다 (도 18).
실험예 4: CSQ-Doxorubicin의 In vivo 반감기 평가
2mM 칼슘으로 제작된 Doxorubicin-CSQ 입자(Dox-CSQ nanoparticle)와 0mM 칼슘인 Doxorubicin-CSQ 입자(Dox-CSQ, No particle)과 독소루비신(Dox)를 BALB/c 마우스에 I.V. Injection 한 후 시간에 따라 serum sample을 만들었다. 독소루비신(Dox)의 형광을 이용하여 serum의 양을 측정하였다. 그 결과, CSQ-Doxorubicin 단백질이 금속이온에 의해 입자화된 경우, native (Doxorubicin) 및 금속이온으로 입자화되지 않은 CSQ-Doxorubicin (No particle)에 비하여 생체 내에서 장기간 고농도로 유지될 수 있는 것으로 확인되었다 (도 19).
[5. 금속이온 입자화된 CSQ-EGF의 제조 및 특성 평가]
KGF-1 유전자 대신에 EGF 유전자를 사용한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법을 사용하여 CSQ-EGF 입자를 제조하였다. 이때, EGF의 아미노산 서열 정보는 하기와 같다:
EGF(서열번호 15):
NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDL
KWWELR
상기 생성된 CSQ-EGF 입자의 크기를 형광현미경과 동적 광산란 광도계 (dynamic light scattering)를 통해 측정하였다. 그 결과, CSQ-EGF 단백질이 금속이온과와 반응하여 안정적으로 입자화되는 것으로 확인되었다 (도 20).
[6. 금속이온 입자화된 CSQ-Anti-VEGF scFv-CSQ의 제조 및 특성 평가]
KGF-1 유전자 대신에 Anti-VEGF scFv-CSQ 유전자를 사용한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법을 사용하여 CSQ-Anti-VEGF scFv-CSQ 입자를 제조하였다. 이때, Anti-VEGF scFv-CSQ의 아미노산 서열 정보는 하기와 같다:
Anti-VEGF scFv(서열번호 16):
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEIIHSWLAWYQQKPGKAPKLLI
YLASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNVYLAST
NGANFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQ
PGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVRQAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYA
TWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDI
WGQGTLVTVSS
상기 생성된 Anti-VEGF scFv-CSQ 입자의 크기를 형광현미경과 동적 광산란 광도계 (dynamic light scattering)를 통해 측정하였다. 그 결과, CSQ-Anti-VEGF scFv-CSQ 단백질이 금속이온과 반응하여 안정적으로 입자화되는 것으로 확인되었다 (도 21).
[7. 금속이온 입자화된 CSQ-FGF2의 제조 및 특성 평가]
KGF-1 유전자 대신에 FGF2 유전자를 사용한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법을 사용하여 CSQ-FGF2 입자를 제조하였다. 이때 FGF2의 아미노산 서열 정보는 하기와 같다:
FGF2(서열번호 17):
PALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREK
SDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDEC
FFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKTGPGQKAIL
FLPMSAKS
상기 생성된 FGF2 입자의 크기를 형광현미경과 동적 광산란 광도계 (dynamic light scattering)를 통해 측정하였다. 그 결과, CSQ-FGF2 단백질이 금속이온과 반응하여 안정적으로 입자화되는 것으로 확인되었다 (도 22).
[8. 금속이온 입자화된 CSQ-BMP2의 제조 및 특성 평가]
KGF-1 유전자 대신에 BMP2 유전자를 사용한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법을 사용하여 CSQ-BMP2 입자를 제조하였다. 이때, BMP2의 아미노산 서열 정보는 하기와 같다:
BMP2(서열번호 18):
MQAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCH
GECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISM
LYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR
상기 생성된 CSQ-BMP2 입자의 크기를 형광현미경과 동적 광산란 광도계 (dynamic light scattering)를 통해 측정하였다. 그 결과, CSQ-BMP2 단백질이 금속이온과 반응하여 안정적으로 입자화되는 것으로 확인되었다 (도 23).
[9. 금속이온 입자화된 CSQ-TGF의 제조 및 특성 평가]
KGF-1 유전자 대신에 TGF 유전자를 사용한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법을 사용하여 CSQ-TGF 입자를 제조하였다. 이때, TGF의 아미노산 서열 정보는 하기와 같다:
TGF(서열번호 19):
ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFC
LGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPI
VYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCSR
상기 생성된 CSQ-TGF 입자의 크기를 형광현미경과 동적 광산란 광도계 (dynamic light scattering)를 통해 측정하였다. 그 결과, CSQ-TGF 단백질이 금속이온과 반응하여 안정적으로 입자화되는 것으로 확인되었다 (도 24).
[10. 금속이온 입자화된 CSQ-VEGF의 제조 및 특성 평가]
KGF-1 유전자 대신에 VEGF 유전자를 사용한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법을 사용하여 CSQ-VEGF 입자를 제조하였다.
VEGF(서열번호 20):
MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKF
MDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGC
CNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCE
CRPKKDRARQEKCDKPRR
상기 생성된 CSQ-VEGF 입자의 크기를 형광현미경과 동적 광산란 광도계 (dynamic light scattering)를 통해 측정하였다. 그 결과, CSQ-VEGF 단백질이 금속이온과 반응하여 안정적으로 입자화되는것으로 확인되었다 (도 25).
[11. 금속이온 입자화된 CSQ-GLP1의 제조 및 특성 평가]
KGF-1 유전자 대신에 GLP1 유전자를 사용한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법을 사용하여 CSQ-GLP1 입자를 제조하였다.
GLP1(서열번호 21):
AAHGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGA
상기 생성된 CSQ-GLP1 입자의 크기를 형광현미경과 동적 광산란 광도계 (dynamic light scattering)를 통해 측정하였다. 그 결과, CSQ-GLP1 단백질이 금속이온과 반응하여 안정적으로 입자화되는 것으로 확인되었다 (도 26).
[12. 금속이온 입자화된 CSQ-TEV protease의 제조 및 특성 평가]
KGF-1 유전자 대신에 TEV protease 유전자를 사용한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법을 사용하여 CSQ-TEV protease 입자를 제조하였다. 이때 TEV protease의 아미노산 서열 정보는 하기와 같다:
TEV protease(서열번호 22)
GESLFKGPRDYNPISSTICHLTNESDGHTTSLYGIGFGPFII
TNKHLFRRNNGTLLVQSLHGVFKVKNTTTLQQHLIDGRDMII
IRMPKDFPPFPQKLKFREPQREERICLVTTNFQTKSMSSMVS
DTSCTFPSSDGIFWKHWIQTKDGQCGSPLVSTRDGFIVGIHS
ASNFTNTNNYFTSVPKNFMELLTNQEAQQWVSGWRLNADSVL
WGGHKVFMVKPEEPFQPVKEATQLMN
상기 생성된 CSQ-TEV protease 입자의 크기를 형광현미경과 동적 광산란 광도계 (dynamic light scattering)를 통해 측정하였다. 그 결과, CSQ-TEV protease 단백질이 금속이온과 반응하여 안정적으로 입자화되는 것으로 확인되었다 (도 27).
[13. 금속이온 입자화된 CSQ-HRP enzyme의 제조 및 특성 평가]
제조예 13. 금속이온 입자화된 CSQ-HRP enzyme의 제조
KGF-1 유전자 대신에 HRP enzyme 유전자를 사용한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법을 사용하여 CSQ-HRP enzyme 입자를 제조하였다. 이때 HRP의 아미노산 서열 정보는 하기와 같다.
HRP(서열번호 23):
QLTPTFYDNSCPNVSNIVRDTIVNELRSDPRIAASILRLH
FHDCFVNGCDASILLDNTTSFRTEKDAFGNANSARGFPVI
DRMKAAVESACPRTVSCADLLTIAAQQSVTLAGGPSWRVP
LGRRDSLQAFLDLANANLPAPFFTLPQLKDSFRNVGLNRS
SDLVALSGGHTFGKNQCRFIMDRLYNFSNTGLPDPTLNTT
YLQTLRGLCPLNGNLSALVDFDLRTPTIFDNKYYVNLEEQ
KGLIQSDQELFSSPNATDTIPLVRSFANSTQTFFNAFVEA
MDRMGNITPLTGTQGQIRLNCRVVNSNSLLHDMVEVVDFV
SSM
상기 생성된 CSQ-HRP enzyme 입자의 크기를 형광현미경과 동적 광산란 광도계 (dynamic light scattering)를 통해 측정하였다. 그 결과, CSQ-HRP enzyme 단백질이 금속이온과 반응하여 안정적으로 입자화되는 것으로 확인되었다 (도 28).
실시예 13. HRP-CSQ 입자의 안정성 평가
HRP-CSQ 단백질을 입자화를 위해 칼슘 1mM, 4mM, 6mM을 첨가하였다. 또한 대조군으로 HRP 단백질도 칼슘 1mM, 4mM, 6mM을 첨가하였다. 이 두개의 단백질을 30℃에서 8일간 보관하면서 HRP의 활성을 측정하였다. HRP의 활성은 TMB 용액을 통해 측정하였다. 그 결과, HRP-CSQ 단백질이 금속이온으로 입자화된 경우 입자화되지 않은 HRP-CSQ (0 mM)에 비하여 안정성이 증가하였으며 특히 8일 까지도 활성이 안정적으로 유지되는 것으로 확인되었다 (도 29).
[14. 금속이온 입자화된 CSQ-hGH의 제조 및 특성 평가]
KGF-1 유전자 대신에 hGH 유전자를 사용한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법을 사용하여 CSQ-hGH 입자를 제조하였다. 이때 hGH의 아미노산 서열 정보는 하기와 같다.
hGH(서열번호 24):
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQ
KYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISL
LLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEG
IQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNY
GLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
상기 생성된 CSQ-hGH 입자의 크기를 형광현미경과 동적 광산란 광도계 (dynamic light scattering)를 통해 측정하였다. 그 결과, CSQ-hGH 단백질이 금속이온과 반응하여 안정적으로 입자화되는 것으로 확인되었다 (도 30).
또한, CSQ-hGH 단백질의 Ca2+, Mg2+, Fe2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+ 이온에 대한 입자화 생성을 평가하기 위해서 CSQ-hGH에 1mM에서 10mM 농도의 금속이온을 첨가하였다. 상온에서 30분 동안 반응시킨 후 생성된 입자 크기를 동적 광산란 광도계 (dynamic light scattering)를 통해 측정하였다. 그 결과, CSQ-hGH 단백질이 다양한 금속이온(Ca2+, Mg2+, Fe2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+)과 반응하여 안정적으로 입자화되는 것으로 확인되었다 (도 31).
[15. 금속이온 입자화된 CSQ-GCSF의 제조 및 특성 평가]
KGF-1 유전자 대신에 GCSF 유전자를 사용한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법을 사용하여 CSQ-GCSF 입자를 제조하였다. 이때 GCSF의 아미노산 서열 정보는 하기와 같다.
G-CSF(서열번호 25):
TPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATY
KLCHPEELVLLGHSLGIPWAPLSSCPSQALQLAGCLSQL
HSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTI
WQQMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASH
LQSFLEVSYRVLRHLAQP
상기 생성된 CSQ-GCSF 입자의 크기를 형광현미경과 동적 광산란 광도계 (dynamic light scattering)를 통해 측정하였다. 그 결과, CSQ-GCSF 단백질이 금속이온과 반응하여 안정적으로 입자화되는 것으로 확인되었다 (도 32).
[16. 금속이온 입자화된 KGF-CSQ2(WT), KGF-CSQ2(△8) 및 KGF-CSQ2(△16)의 제조 및 특성 평가]
CSQ(서열번호 1) 대신에 CSQ2(WT), CSQ2(△8) 및 CSQ2(△16)를 사용한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법을 사용하여 KGF-CSQ2(WT), KGF-CSQ2(△8) 및 KGF-CSQ2(△16) 입자를 제조하였다 (도 33). 이때 CSQ2(WT), CSQ2(△8) 및 CSQ2(△16)의 아미노산 서열 정보는 하기와 같다:
Human CSQ2 (hCSQ2, 서열번호 2):
EEGLNFPTYDGKDRVVSLSEKNFKQVLKKYDLLCLYYHEP
VSSDKVTPKQFQLKEIVLELVAQVLEHKAIGFVMVDAKKE
AKLAKKLGFDEEGSLYILKGDRTIEFDGEFAADVLVEFLL
DLIEDPVEIISSKLEVQAFERIEDYIKLIGFFKSEDSEYY
KAFEEAAEHFQPYIKFFATFDKGVAKKLSLKMNEVDFYEP
FMDEPIAIPNKPYTEEELVEFVKEHQRPTLRRLRPEEMFE
TWEDDLNGIHIVAFAEKSDPDGYEFLEILKQVARDNTDNP
DLSILWIDPDDFPLLVAYWEKTFKIDLFRPQIGVVNVTDA
DSVWMEIPDDDDLPTAEELEDWIEDVLSGKINTEDDDEDD
DDDDNSDEEDNDDSDDDDDE
CSQ2 △8(서열번호 3):
EEGLNFPTYDGKDRVVSLSEKNFKQVLKKYDLLCLYYHEPV
SSDKVTPKQFQLKEIVLELVAQVLEHKAIGFVMVDAKKEAK
LAKKLGFDEEGSLYILKGDRTIEFDGEFAADVLVEFLLDLI
EDPVEIISSKLEVQAFERIEDYIKLIGFFKSEDSEYYKAFE
EAAEHFQPYIKFFATFDKGVAKKLSLKMNEVDFYEPFMDEP
IAIPNKPYTEEELVEFVKEHQRPTLRRLRPEEMFETWEDDL
NGIHIVAFAEKSDPDGYEFLEILKQVARDNTDNPDLSILWI
DPDDFPLLVAYWEKTFKIDLFRPQIGVVNVTDADSVWMEIP
DDDDLPTAEELEDWIEDVLSGKINTEDDDEDDDDDDNSDEE
DND
CSQ2 △16(서열번호 4):
EEGLNFPTYDGKDRVVSLSEKNFKQVLKKYDLLCLYYHEPV
SSDKVTPKQFQLKEIVLELVAQVLEHKAIGFVMVDAKKEAK
LAKKLGFDEEGSLYILKGDRTIEFDGEFAADVLVEFLLDLI
EDPVEIISSKLEVQAFERIEDYIKLIGFFKSEDSEYYKAFE
EAAEHFQPYIKFFATFDKGVAKKLSLKMNEVDFYEPFMDEP
IAIPNKPYTEEELVEFVKEHQRPTLRRLRPEEMFETWEDDL
NGIHIVAFAEKSDPDGYEFLEILKQVARDNTDNPDLSILWI
DPDDFPLLVAYWEKTFKIDLFRPQIGVVNVTDADSVWMEIP
DDDDLPTAEELEDWIEDVLSGKINTEDDDEDDDDDD
그 다음, 생성된 KGF-CSQ2(WT), KGF-CSQ2(△8) 및 KGF-CSQ2(△16) 입자 크기를 형광현미경과 동적 광산란 광도계 (dynamic light scattering)를 통해 측정하였다. 그 결과, 칼시퀘스트린의 C-말단 산성 꼬리 (acidic tail)가 없어 질수록 낮은 금속이온 농도에서 입자가 형성될 수 있는 것으로 확인되었다 (도 34-35).
[17. 금속이온 입자화된 CSQ-cleavable linker-KGF의 제조 및 특성 평가]
CSQ-MCS vector 대신에 CSQ-MMP2 cleavable 벡터를 사용하고 CaCl2를 10mM 농도로 첨가한 것을 제외하고는 상기 제조예 1과 동일한 방법을 사용하여 CSQ-cleavable linker-KGF를 제조하였다. 이때 cleavable linker의 아미노산 서열 정보는 하기와 같다:
cleavable linker (서열번호 26):
PLGVRG
그 다음, 10mM 칼슘 이온으로 생성된 CSQ-PLGVRG-KGF 입자가 MMP2에 의해 절단되어 KGF가 방출되는지를 확인하기 위하여 MMP2 (Thermofisher)를 5㎕를 첨가하여 30℃에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 분석하였다. 그 결과, MMP2에 의해 CSQ-PLGVRG-KGF 입자에서 KGF가 용이하게 분리될 수 있음이 확인되었다 (도 36).
[18. 금속이온 입자화된 CSQ-cleavable linker-hGH의 제조 및 특성 평가]
CSQ-MCS vector 대신에 CSQ-MMP2 cleavable 벡터를 사용하고 CaCl2를 10mM 농도로 첨가한 것을 제외하고는 상기 제조예 14와 동일한 방법을 사용하여 CSQ-cleavable linker-hGH를 제조하였다. 이때 cleavable linker의 아미노산 서열 정보는 하기와 같다:
cleavable linker (서열번호 26):
PLGVRG
그 다음, 10mM 칼슘 이온으로 생성된 CSQ-PLGVRG-hGH 입자가 MMP2에 의해 절단되어 hGH가 방출되는지를 확인하기 위하여 MMP2 (Thermofisher)를 5㎕를 첨가하여 30℃에서 하루 동안 반응시킨 후 SDS-PAGE로 분석하였다. 그 결과, MMP2에 의해 CSQ-PLGVRG-hGH 입자에서 hGH가 용이하게 분리될 수 있음이 확인되었다 (도 37).
[19. 금속이온 입자화된 Exenatide-CSQ의 conjugation 제조 및 특성 평가]
엑사나타이드 펩타이드에 N-hydroxysuccinimide(NHS)가 붙은 펩타이드를 애니젠(Anygen)을 통해 합성하였다. 엑사나타이드-NHS를 CSQ 대비 10배 molar ratio를 넣어줘서 6시간 동안 반응하였다. 그 다음 Desalting column으로 엑사나타이드를 분리하여 최종적으로 엑사나타이드-CSQ을 얻었다.
상기 생성된 Exenatide-CSQ conjugate을 0~10 mM 금속이온(칼슘)을 첨가하였다. 상온에서 30분 동안 반응시킨 후 생성된 입자 크기를 동적 광산란 광도계 (dynamic light scattering)를 통해 측정하였다. 그 결과, Exenatide-CSQ conjugate이 금속이온과 반응하여 안정적으로 입자화되는 것으로 확인되었다 (도 38).
[20. 금속이온 입자화된 hGH-CSQ의 conjugation 제조 및 특성 평가
CSQ 단백질에 SMCC( succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)를 10배 ratio로 반응을 하여 CSQ-maleimide를 만들었다. 여기에 hGH의 시스테인 아미노산을 이용하여 CSQ-maleimide와 hGH를 1:1 molar ratio로 12시간 반응을 하였다. 그 다음 반응이 안된 CSQ-maleimide와 hGH를 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)로 분리하여 최종적으로 CSQ-hGH conjugate를 분리하였다.
상기 생성된 hGH-CSQ conjugate을 0~10 mM 금속이온(칼슘)을 첨가하였다. 상온에서 30분 동안 반응시킨 후 생성된 입자 크기를 동적 광산란 광도계 (dynamic light scattering)를 통해 측정하였다. 그 결과, hGH-CSQ conjugate이 금속이온과 반응하여 안정적으로 입자화되는 것으로 확인되었다 (도 39).
본 발명의 칼시퀘스트린 기반의 금속이온 반응성 입자는 금속이온에 의해 입자화되기 전과 비교하여 체내의 가수분해 효소에 의한 분해가 억제되어 안정성이 향상되며, 체내에서 반감기가 증가되어 생리활성물질 효과의 지속성이 향상될 수 있으며, 생리활성물질의 체외 안정성이 향상되어 활성을 유지할 수 있으며, 또한 항원의 전달효율을 증가시킬 수 있다.

Claims (69)

  1. 칼시퀘스트린,
    상기 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질, 및
    상기 칼시퀘스트린과 이온결합된 금속을 포함하는, 입자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 금속은 아연, 칼슘, 마그네슘, 철, 구리 및 망간으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 입자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 금속은 칼슘을 배제하는 것인, 입자.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 금속은 칼슘을 포함하는 것인, 입자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속은 아연을 포함하는 것인, 입자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속은 마그네슘을 포함하는 것인, 입자.
  7. 칼시퀘스트린과 융합된 생리활성물질을 포함하는 칼시퀘스트린 기반의 금속이온 반응성 입자로서,
    상기 입자는 칼슘에 의해 자가-조립되는 것인, 입자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생리활성물질은 칼시퀘스트린에 공유 결합된 것인, 입자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생리활성물질은 칼시퀘스트린에 공유결합 되지 않은 것인, 입자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 칼시퀘스트린에 연결된 생리활성물질은 생리활성물질과 칼시퀘스트린 사이에 절단 부위를 포함하는 것인, 입자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 칼시퀘스트린에 연결된 생리활성물질은 생리활성물질과 칼시퀘스트린 사이에 절단 부위를 포함하고,
    상기 절단 부위는 프로테아제, 뉴클레아제, 리파아제, 글리코시다아제, pH, 저산소, 광(photo-), 열, 효소, 초음파 및 x-선 또는 가수분해에 의해 절단되는 것인, 입자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 칼시퀘스트린에 결합된 생리활성물질은 상기 생리활성물질과 칼시퀘스트린 사이가 절단되지 않는 것인, 입자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 칼시퀘스트린의 복수개가 단일의 금속에 결합되는 것인, 입자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 칼시퀘스트린은 서열번호 1 내지 11의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 상동성을 갖는 것인 아미노산을 포함하는 것인, 입자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 칼시퀘스트린은 야생형 칼시퀘스트린의 아미노산 서열 C-말단의 일부가 변형된 것인, 입자.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 칼시퀘스트린은 야생형 칼시퀘스트린의 아미노산 서열 C-말단의 일부가 결실된 것인, 입자.
  17. 제1항 내지 제16항에 있어서,
    상기 칼시퀘스트린은 서열번호 1 내지 11의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하는 것인, 입자.
  18. 제1항 내지 제17항에 있어서,
    상기 칼시퀘스트린은 서열번호 1 내지 11의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 이루어진 것인, 입자.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자는 엘라스틴-유사 폴리펩티드 또는 탄성 중합체를 배제하는 것인, 입자.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자는 VPGXG의 반복 단위(상기 X는 아미노산이다)를 갖는 서열을 배제하는 것인, 입자.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생리활성물질은 고분자 단백질, 펩타이드, 당 단백질, 사이토카인, 성장인자, 혈액제제, 백신, 호르몬, 효소, 항체, 및 합성제제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 입자.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생리활성물질은 인터루킨-2(Interleukin-2), 혈액 인자 VII, 혈액 인자 VIII, 혈액 인자 IX, 면역글로불린, 호세라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP), 사이토카인, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, 콜로니자극인자(GM-CSF), 인간 피브로넥튼엑스트라 도메인 B(human fibronectin extra domain B, EBD), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor,FGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), 인슐린 성장 인자(insulinlike growth factor, IGF), 형질 전환 성장 인자(trans-forming growth factor-α and -β, TGF-α, -β), 뇌 유래 신경 영양 인자(brain-derived neutrophic factor, BDNF), 혈소판 유래 성장 인자(plateletderived growth factor, PDGF), 태반 성장 인자(placental growth factor, PlGF), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 엑센딘, 소마토스타틴(somatostatin), LHRH(luteinizing hormone-releasing hormone), 아드레노코티코트로픽 호르몬(adrenocorticotropic hormone), 성장호르몬-방출 호르몬(growth hormone-releasing hormone), 옥시토신(oxytocin), 티모신 알파-1(thymosin alpha-1), 코티코트로핀-방출인자(corticotropin-releasing factor), 칼시토닌(calcitonin), 비발리루딘(bivalirudin), 바소프레신(vasopressin), 포스포리파제-활성화 단백질(PLAP), 인슐린, 종양 괴사 인자(TNF), 소낭-자극 호르몬, 갑상선-자극 호르몬, 항이뇨 호르몬, 색소성 호르몬, 부갑상선 호르몬, 황체분비호르몬, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(Calcitonin Gene Related Peptide, CGPR), 엔케팔린(enkephalin), 소마토메딘, 에리스로포이에틴, 시상하부 분비 인자, 프롤락틴, 만성 고나도트로핀, 조직 플라스미노겐 활성화제, 성장호르몬 분비 펩타이드(growth hormone releasing peptide; GHPR), 흉선 체액성 인자(thymic humoral factor;THF), 아스파라기나제, 아르기나제, 아르기닌 데아미나제, 아데노신 데아미나제, 과산화물 디스뮤타제, 엔도톡시나제, 카탈라제, 키모트립신, 리파제, 우리카제, 아데노신 디포스파타제, 티로시나제, 빌리루빈 옥시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코다제, 갈락토시다제, 글루코세레브로시다제, 글루코우로니다제, 케라틴세포 성장 인자(Keratinocyte growth factor, KGF), 엑세나타이드(Exenatide), 독소루비신(Doxorubicin), 항 혈관 내피 성장 인자 항체(vascular endothelial growth factor, Anti-VEGF scFv), SARS Cov2 RBD(receptor binding domain), 표피 성장 인자 (epidermal growth factor, EGF), 섬유아세포 성장 인자 (Fibroblast growth factor-2), 뼈 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP2), 형질 전환 성장 인자(trans-forming growth factor), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 글루카곤-유사 펩티드-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1), TEV 프로테아제, HRP 효소, 인간성장호르몬 (hGH) 및 조혈성장인자(G-CSF)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 입자.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생리활성물질은 관심 폴리펩티드인 것인, 입자.
  24. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    상기 생리활성물질은 2 내지 1000개의 아미노산 길이를 갖는 것인, 입자.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생리활성물질은 관심 화학물질인 것인, 입자.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 생리활성물질은 면역조절 화합물, 항암제, 항바이러스제, 항박테리아제, 항진균제 및 구충제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 입자.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 잇어서,
    상기 입자의 평균 직경은 10nm 내지 1cm인 것인, 입자.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자는 온도 변화에 의해 조립되지 않는 것인, 입자.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 입자는 중합체를 배제하는 것인, 입자.
  30. 생리활성물질을 이를 필요로 하는 대상체에 전달하는데 사용하기 위한 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 입자.
  31. 조직 재생에 사용하기 위한 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 입자.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 입자를 포함하는 피부 상처, 당뇨병, 염증 질환, 안과 질환, 조직재생, 감염병 및 암질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  33. 제32항에 있어서,
    약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더욱 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  34. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 입자 또는 제32항에 따른 약학적 조성물을 포함하는 염증 질환, 감염병 및 암질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료용 백신.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 백신은 어쥬번트(adjuvant)를 포함하는 것인, 백신
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서,
    상기 백신은 동결건조된 것인, 백신.
  37. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생리활성물질의 반감기는 상기 생리활성물질이 입자화되기 전과 비교하여 증가된 것인, 입자.
  38. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생리활성물질의 반감기는 상기 생리활성물질이 입자화되기 전과 비교하여 적어도 10% 증가된 것인, 입자.
  39. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생리활성물질의 체내 안정성은 상기 생리활성물질이 입자화되기 전과 비교하여 증가된 것인, 입자.
  40. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생리활성물질의 체내 안정성은 상기 생리활성물질이 입자화되기 전과 비교하여 적어도 10% 증가된 것인, 입자.
  41. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생리활성물질의 효과 지속성은 생리활성물질의 체내 안정성이 증가함에 따라, 상기 생리활성물질이 입자화되기 전화 비교하여 증가된 것인, 입자.
  42. 칼시퀘스트린 및 상기 칼시퀘스트린에 연결되도록 구성된 생리활성물질을 포함하는 입자 제조용 키트.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 칼시퀘스트린과 이온 결합하도록 구성된 금속을 더욱 포함하는 것인, 키트.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서,
    상기 칼시퀘스트린은 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 칼시퀘스트린이고, 상기 생리활성물질은 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 생리활성물질이고, 그리고/또는 상기 금속은 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 금속인 것인, 키트.
  45. 칼시퀘스트린 및 상기 칼시퀘스트린에 연결되도록 구성된 생리활성물질을 포함하는 칼시퀘스트린 기반의 금속이온 반응성 입자 제조용 키트.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키트는 아연, 칼슘, 마그네슘, 철, 구리 및 망간으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인, 키트.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 칼시퀘스트린과 융합된 생리활성물질은 이를 코팅하는 뉴클레오티드 분자 형태로 포함되어 있는 것인, 키트.
  48. 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 칼시퀘스트린과 융합된 생리활성물질은 이를 코팅하는 핵산을 포함하는 발현 벡터 형태로 포함되어 있는 것인, 키트.
  49. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 칼시퀘스트린과 융합된 생리활성물질은 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 세포의 형태로 포함되어 있는 것인, 키트.
  50. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 입자의 제조 방법으로, 상기 방법은:
    상기 칼시퀘스트린과 연결된 생리활성물질과 금속을 혼합하는 단계를 포함하는 것인 포함하는 것인, 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    상기 생리활성물질에 칼시퀘스트린을 연결하는 단계를 더욱 포함하는 것인, 방법.
  52. 제50항에 있어서,
    상기 칼시퀘스트린과 생리활성물질을 포함하는 서열을 재조합 발현시키는 단계를 더욱 포함하는 것인, 방법.
  53. 제50항 내지 제52항에 있어서,
    상기 칼시퀘스트린과 연결된 생리활성물질을 정제하는 단계를 더욱 포함하는 것인, 방법.
  54. A) 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
    B) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 형질도입하여 형질전환체를 얻는 단계;
    C) 상기 형질전환체로부터 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질을 포함하는 단백질을 발현시키는 단계; 및
    D) 금속이온을 이용하여 상기 발현된 칼시퀘스트린과 결합된 생리활성물질을 포함하는 단백질을 입자화하는 단계;를 포함하는 금속이온 반응성 입자의 제조방법.
  55. 제54항에 있어서,
    상기 숙주세포는 에스체리치아 콜리, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스, 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스, 슈도모나스 종, 효모, 곤충세포, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN, MDCK 세포주, 및 식물세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 방법.
  56. A) 칼시퀘스트린과 생리활성물질을 반응시켜 화학적 접합(Chemical conjugation)을 형성하는 단계; 및
    B) 금속이온을 이용하여 상기 칼시퀘스트린과 접합된 생리활성물질을 입자화하는 단계;를 포함하는 금속이온 반응성 입자의 제조방법.
  57. 제56항에 있어서,
    상기 생리활성물질을 칼시퀘스트린과 화학적 접합을 형성할 수 있도록 준비하는 단계;를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  58. 생리활성물질을 이를 필요로 하는 대상체에 전달하는 방법으로, 상기 방법은:
    제50항 내지 제57항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 입자를 제조하는 단계, 및
    상기 입자를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  59. 생리활성물질을 이를 필요로 하는 대상체에 전달하는 방법으로, 상기 방법은 대상체에 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 따른 입자를 형성하기 위하여 칼시퀘스트린, 생리활성물질 및 금속을 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  60. 제59항에 있어서,
    상기 칼시퀘스트린은 생리활성물질에 연결된 것인, 방법.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서,
    상기 투여는 칼시퀘스트린 및 생리활성물질을 코딩하는 뉴클레오티드 분자를 대상체에서 발현시키는 것을 포함하는 것인, 방법.
  62. 제59항 또는 제60항에 있어서,
    상기 투여는 칼시퀘스트린을 코딩하는 제1뉴클레오티드 분자 및 생리활성물질을 코딩하는 제2뉴클레오티드 분자를 대상체에서 발현하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  63. 제59항 내지 제62항에 있어서,
    상기 투여는 비경구, 경구, 피하, 국소, 근육내, 경피, 협측, 설하, 비강내, 경혈관, 피하, 안와 또는 호흡기 투여를 포함하는 것인 방법.
  64. 제59항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생리활성물질은 대상체의 질병의 표적 부위에 직접 투여되는 것인, 방법.
  65. 제59항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생리활성물질은 대상체의 질병의 표적 부위에 직접 투여되지 않는 것인, 방법.
  66. 제59항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생리활성물질이 입자로부터 방출되는 단계를 더욱 포함하는 것인, 방법.
  67. 제59항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생리활성물질이 유리 형태로 입자로부터 방출되는 단계를 더욱 포함하는 것인, 방법.
  68. 제59항 내지 66항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생리활성물질이 칼시퀘스트린에 연결된 상태로 입자로부터 방출되는 단계를 더욱 포함하는 것인, 방법.
  69. 본 출원에 개시된 하나 또는 그 이상의 요소를 특징으로 하는 제품 또는 방법의 사용.
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