WO2022131764A1 - 세포막 투과성을 갖는 신규 펩타이드 - Google Patents

세포막 투과성을 갖는 신규 펩타이드 Download PDF

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WO2022131764A1
WO2022131764A1 PCT/KR2021/018999 KR2021018999W WO2022131764A1 WO 2022131764 A1 WO2022131764 A1 WO 2022131764A1 KR 2021018999 W KR2021018999 W KR 2021018999W WO 2022131764 A1 WO2022131764 A1 WO 2022131764A1
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peptide
drug
cell
present
group
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PCT/KR2021/018999
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English (en)
French (fr)
Inventor
장관영
김병수
강서희
한송이
서유선
나혜림
이다슬
하지희
이연주
Original Assignee
주식회사 아이큐어비앤피
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells

Definitions

  • the present invention relates to a novel peptide having cell membrane permeability, and more particularly, to a novel peptide having cell membrane permeability exhibiting improved cell permeability compared to a commercial TAT peptide.
  • biologically active substances made of polymers such as proteins and DNA cannot pass through the hydrophilic and hydrophobic phospholipid bilayers, so they cannot penetrate the cell membrane and enter the cell.
  • cell penetrating peptides are known that can cross the cell membrane without the aid of other molecules such as receptors.
  • Cell penetrating peptides are also called CPP (Cell penetrating peptide) and MTS (membrane-translocating sequences). They pass through the cell membrane in a form bound to a transport target or in a mixed form, and transport targets such as proteins, DNA, and RNA into cells as well as in cells. It can also be transported into the cytoplasm, intracellular organelles, and even the nucleus.
  • CPP Cell penetrating peptide
  • MTS membrane-translocating sequences
  • HIV-1 Human Immunodeficiency Virus-1
  • TAT TAT
  • TAT peptide By using TAT peptide to deliver ⁇ -galactosidase, horseradish peroxidase, RNase A, domain of Pseudomonas exotoxin A (PE), etc. into cells, studies have been conducted on their functions and localization within cells. It was found that it was due to endocytosis involving Lipid Raft, which occurred after interaction with heparan sulfate.
  • a cell-penetrating peptide called Penetratin (Antp) consisting of 16 amino acid sequences derived from Antennapedia homeoprotein, a transcription factor essential for the development of Drosophila, derived from VP22, a protein expressed by HSV-1 (Herpes simplex virus type 1)
  • These conventional cell-penetrating peptides are sequences derived from viral proteins such as HIV-1, those derived from proteins expressed by other species such as Drosophila, or characteristic amino acid sequences through amino acid sequence analysis constituting conventional cell-penetrating peptides. Since it is a selected and artificially synthesized amino acid sequence, there is a possibility that side effects such as an immune response may occur when applied to and used in the human body.
  • CPP variants derived from TCTP protein representing a series of sequences are commercially available TAT peptides. It was confirmed that it exhibits superior cell permeability, and the present invention has been completed.
  • R1 is any one amino acid selected from the group consisting of A, V, I, L, S, F, K and R,
  • R2 is any one amino acid selected from the group consisting of S, L, F, T and Y,
  • R3 is any one amino acid selected from the group consisting of E, L, A and R,
  • R4 is any one amino acid selected from the group consisting of Q, H, T, L, D and R,
  • R5 is any one amino acid selected from the group consisting of L, S, V, A, K and H;
  • R6 is any one dipeptide selected from the group consisting of DK, EK, QK, NK, KK and FK.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for promoting cell permeation of a substance containing a peptide.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for promoting cell permeation of a substance consisting of a peptide.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for promoting cell permeation of a substance consisting essentially of peptides.
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the peptide.
  • Another object of the present invention is to provide a vector comprising the polynucleotide.
  • Another object of the present invention is to provide a cell transformed with the vector.
  • Another object of the present invention is to provide a use of a substance containing the peptide for preparing a preparation for promoting cell permeation.
  • Another object of the present invention is to provide a method for promoting cell permeation comprising administering to an individual in need thereof an effective amount of a composition containing the peptide.
  • Another object of the present invention is to provide a complex comprising the peptide and a biologically active material.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for gene therapy comprising a fusion of the peptide and a genetic material as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for gene therapy comprising a fusion of the peptide and a genetic material.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for gene therapy essentially consisting of a fusion of the peptide and a genetic material.
  • Another object of the present invention is to provide the use of a fusion of the peptide and a genetic material for preparing a gene therapy agent.
  • Another object of the present invention is to provide a gene therapy method comprising administering an effective amount of a composition comprising a fusion of the peptide and a genetic material to an individual in need thereof.
  • Another object of the present invention is
  • the present invention provides a cell-penetrating peptide consisting of the following amino acid sequence:
  • R1 is any one amino acid selected from the group consisting of A, V, I, L, S, F, K and R,
  • R2 is any one amino acid selected from the group consisting of S, L, F, T and Y,
  • R3 is any one amino acid selected from the group consisting of E, L, A and R,
  • R4 is any one amino acid selected from the group consisting of Q, H, T, L, D and R,
  • R5 is any one amino acid selected from the group consisting of L, S, V, A, K and H;
  • R6 is any one dipeptide selected from the group consisting of DK, EK, QK, NK, KK and FK.
  • the present invention provides a composition for promoting cell permeation of a substance containing the peptide of the present invention.
  • the present invention provides a composition for promoting cell permeation of a substance consisting of the peptide of the present invention.
  • the present invention provides a composition for promoting cell permeation of a substance consisting essentially of the peptide of the present invention.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the peptide.
  • the present invention provides a vector comprising the polynucleotide.
  • the present invention provides a cell transformed with the vector.
  • the present invention provides the use of a substance containing the peptide for preparing an agent for promoting cell permeation.
  • the present invention provides a method for promoting cell permeation comprising administering to an individual in need thereof an effective amount of a composition comprising a substance including the peptide.
  • the present invention provides a complex comprising the peptide and a biologically active material.
  • the present invention provides a composition for gene therapy comprising a fusion of the peptide and a genetic material as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for gene therapy comprising a fusion of the peptide and a genetic material.
  • the present invention provides a composition for gene therapy essentially consisting of a fusion of the peptide and the genetic material.
  • the present invention provides the use of a fusion of the peptide and a genetic material to prepare a gene therapy agent.
  • the present invention provides a gene therapy method comprising administering to an individual in need thereof an effective amount of a composition comprising a fusion of the peptide and a genetic material.
  • b) provides a method for delivering a biologically active material comprising the step of injecting the complex into a living body or cell of a mammal other than a human.
  • range format various aspects or conditions related to the invention may be suggested in a range format.
  • the description of the range value includes the corresponding boundary value, that is, all values above the lower limit and below the upper limit unless otherwise specified. It should be understood that the description in range format is merely for convenience and brevity, and should not be construed as an inflexible limitation on the scope of the present invention. Accordingly, statements of ranges are to be considered as specifically disclosing all possible subranges as well as individual numerical values within that range.
  • a statement of a range such as 7 to 170 refers to individual numbers within the range, for example 9, 27, 35, 101, and 155, as well as 10-127, 23 to 35, 80 to 100, 50 Subranges such as to 169 are to be considered as specifically disclosed. This applies regardless of the width of the range.
  • the term 'comprising' is used synonymously with 'comprising' or 'characterized', and in the composition or method, additional component elements or method steps not mentioned are not excluded. .
  • the term “consisting of” means excluding additional elements, steps, or ingredients not specifically described.
  • the term “essentially consisting of” means that, in the scope of a composition or method, it may include substances or steps that do not substantially affect the basic properties thereof in addition to the substances or steps described.
  • 'peptide' and 'protein' are used according to their conventional (conventional) meaning, that is, they refer to an arrangement of amino acids.
  • a peptide is not limited to a specific length, but in the context of the present invention generally refers to a fragment of a full-length protein, and is subjected to post-translational modifications such as glycosylation, acetylation, phosphorylation, etc. and other methods known in the art. It may include formulas (naturally occurring and non-naturally occurring formulas) and may be expressed as 'polypeptides'.
  • the peptides and proteins of the present invention can be prepared using any of a variety of known recombinant and/or synthetic techniques, illustrative examples of which are further described below.
  • the present invention provides a cell-penetrating peptide consisting of the following amino acid sequence:
  • R1 is any one amino acid selected from the group consisting of A, V, I, L, S, F, K and R,
  • R2 is any one amino acid selected from the group consisting of S, L, F, T and Y,
  • R3 is any one amino acid selected from the group consisting of E, L, A and R,
  • R4 is any one amino acid selected from the group consisting of Q, H, T, L, D and R,
  • R5 is any one amino acid selected from the group consisting of L, S, V, A, K and H;
  • R6 is any one dipeptide selected from the group consisting of DK, EK, QK, NK, KK and FK.
  • the peptide of the present invention is a novel peptide having cell membrane permeability and has excellent cell membrane permeability itself.
  • the "cell membrane” refers to a membrane that forms a boundary between the cell and the outside of the cell.
  • the cell membrane may be a cell membrane of a single cell or multicellular organism belonging to any living organism, for example, bacteria (Bacteria), archaea (Archaea) and eukaryotes (Eukarya).
  • the eukaryote may be any organism belonging to the kingdom Protista, Fungus, Plantae, and Animalia.
  • the animal may be any animal, including a human.
  • the "cell membrane” may be any type of cell membrane.
  • the “cell” may be selected from the group consisting of epithelial cells, muscle cells, immune cells and endothelial cells, but is not limited thereto.
  • the cells form the lining of organs in direct contact with the outside of the body, such as endothelium, epithelium, and mucous membrane, or cells of the cell layer covering the surface of any organ or blood vessel in the body.
  • the cells include skin epithelial cells, hair follicle epithelial cells, mucosal epithelial cells, corneal epithelial cells, scalp epithelial cells, corneal endothelial cells, and vascular endothelial cells.
  • the mucosal epithelial cells may be epithelial cells of one or more mucous membranes selected from the group consisting of nasal, lung, vaginal, rectal, anus, urethral, sublingual, ocular, conjunctival and oral mucosa.
  • the vascular endothelial cells may be endothelial cells of various arteries, veins, capillaries, endothelial cells of various arteries, veins, capillaries, including cerebral vessels forming the blood-brain barrier (BBB), endothelial cells of lymphatic vessels, endothelial cells of the inner wall of the heart, and the like.
  • BBB blood-brain barrier
  • the cells may be various cancer cells including cervical cancer, breast cancer, liver cancer, lung cancer, and the like.
  • the cell may be a cell having receptors for various substances such as hormones, chemical messengers of the nervous system, and drugs, for example, insulin receptor, glucagon-like-protein 1 (Glucagon-like- It may be a cell having a protein 1, GLP1) receptor, but the cell is not limited to the above example.
  • proteases include, for example, achromopeptidase, aminopeptidase, ancrod, angiotensin converting enzyme, bromelain , calpain, calpain I, calpain II, carboxypeptidase A, carboxypeptidase B, carboxypeptidase G G), carboxypeptidase P, carboxypeptidase W, carboxypeptidase Y, caspase 1, caspase 2, caspase caspase 3, caspase 4, caspase 5, caspase 6, caspase 7, caspase 8, caspase 9 (caspase 9), caspase 10 (caspase 10), caspase 11 (caspase 11), caspase 12 (caspase 12), caspase 13 (caspase 13), cathepsin B (cathepsin B
  • protease (protease B. licheniformis, alkaline or alcalase), Bacillus polymyxa-derived protease (protease from Bacillus polymyxa), Bacillus polymyxa from Bacillus sp), protease from Rhizopus sp., protease S (protease S), proteasomes, proteinase from Aspergillus oryzae, protease Inase 3, proteinase A, proteinase K, protein C, pyroglutamate aminopeptidase, renin , streptokinase, subtilisin, thermolysin, thrombin, tissue plasminogen activator, trypsin, tryptase and uro Kinase (urokinase), etc. are mentioned. Those skilled in the art can easily determine which protease is appropriate in consideration of the chemical specificity of the fragment to be produced.
  • the peptide can be prepared by any suitable procedure known to those skilled in the art, such as recombinant technology.
  • the polypeptides of the invention can be prepared by direct peptide synthesis using solid-phase techniques.
  • the synthesis can be initiated by attaching functional units called linkers to small porous beads and inducing them to continue the peptide chain.
  • the peptide is covalently bound to the beads and is prevented from falling off by the filtration process until it is cleaved by a specific reactant such as trifluoroacetic acid (TFA).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the SPPS method can be performed by using microwave technology together, and the microwave technology can reduce the time required for coupling and deprotection of each cycle by applying heat during the peptide synthesis process.
  • the thermal energy may prevent folding or aggregation of the expanded peptide chain and promote chemical bonding.
  • the peptide of the present invention can be prepared by the liquid phase peptide synthesis method, and the specific method thereof is referred to the following documents: US Patent No. 5,516,891.
  • the peptide of the present invention can be synthesized by various methods such as a method of mixing the solid phase synthesis method and the liquid phase synthesis method, and the preparation method is not limited to the means described herein.
  • Protein synthesis can be performed using manual techniques or by automation. Automated synthesis can be accomplished using, for example, an Applied Biosystems 431A peptide synthesizer (Perkin Elmer). Alternatively, the various fragments can be chemically synthesized separately and combined using chemical methods to produce the molecule of interest.
  • all of the peptides are in the form of D-form or L-form, a peptide composed of only part of the D-form or L-form sequence, or their racemate form through a conventional peptide synthesis method or manufacturing method known to those skilled in the art. It can be manufactured and used. In addition, in order to increase the stability of the peptide, other conventional modifications known in the art are possible.
  • the peptide may include a conventional variant.
  • the mutant is an arbitrary change in the amino acid sequence of the 'peptide', and may include one or more substitutions, deletions, additions and/or insertions.
  • Such variants may be naturally occurring, or may be modified or modified, for example, by one or more of the above peptide sequences of the present invention using any of a number of techniques well known in the art, and their It can be produced synthetically by assessing biological activity.
  • the variant comprises conservative substitutions.
  • a 'conservative substitution' refers to a substitution in which an amino acid is substituted with another amino acid having similar properties, so that those skilled in the art can predict that the secondary structure and hydropathic nature (hydropathic nature) of the peptide are substantially unchanged.
  • the following groups of amino acids exhibit conservative changes: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; and (5) phe, tyr, trp, his.
  • Modifications may be carried out within the structure of the peptides of the present invention, and functional molecules encoding peptide variants or derivatives having desired (desired) characteristics may be obtained.
  • those skilled in the art can change one or more codons based on protein codon information known in the art. have.
  • variants may also contain non-conservative alterations.
  • the variant peptide may differ from the native sequence by substitution, deletion or addition of 5 amino acids or less.
  • Variants may also be altered, for example, by deletion or addition of amino acids with minimal effect on the secondary structure and hydropathic properties of the peptide.
  • the peptide may include a signal (or leader) sequence at the N-terminus of the protein, and this sequence directs transport of the protein simultaneously with or after translation.
  • the peptide may also be associated (conjugated) with a linker sequence or other sequence to facilitate the synthesis, purification or identification of the peptide (eg polyHis), or to enhance binding of the peptide to a solid support.
  • a chemoselective ligation technique may be used to modify the peptide of the present invention, for example, by attaching a polymer in a site-specific and controlled manner. can do.
  • These techniques rely on the attachment of a chemoselective anchor into the protein backbone, typically by either chemical or recombinant means, and subsequent modification with a polymer carrying a complementary linker.
  • the assembly process and the covalent structure of the obtained protein-polymer conjugate are controlled, thereby enabling rational optimization of drug properties such as efficacy and pharmacokinetic properties. Their pharmacokinetic properties are improved, for example, by allowing selective attachment of PEGs.
  • the peptide of the present invention may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt.
  • the pharmaceutically acceptable salts include, for example, hydrochloride, sulfate, phosphate, acetate, citrate, tartrate, succinate, lactate, maleate, fumarate, oxalate, methanesulfonate, or paratoluenesulfonate. , but is not limited thereto.
  • the peptide may be selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 10.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 10 exhibits excellent cell membrane permeability compared to the permeability of the conventional TAT protein, and the higher the treatment concentration, the higher the intracellular permeability. was confirmed to indicate
  • the present invention also provides a composition for promoting cell permeation of a substance containing a peptide.
  • the composition may be used to deliver a substance, more specifically, a biologically active substance to a living tissue or blood, or to promote cell permeation.
  • the composition may be delivered through cells constituting a living tissue or through cell-to-cell junctions, but there is no limitation on the delivery method.
  • the substance penetrates into the cell (in the cytoplasm or the nucleus) and is involved in the regulation of physiological activity or is capable of expressing a pharmacological effect, or in various in vivo sites such as cells, tissues, interstitial cells, and blood that need to be transported and acted upon. It means a substance having biological activity.
  • the material is a compound (chemical compound), protein, glycoprotein, peptide, nucleotide, nucleic acid, carbohydrate, lipid, glycolipid, natural product, semi-synthetic substance, nano It may be one or more selected from the group consisting of particles, liposomes, lipid-based formulations, viruses, quantum dots, fluorochromes, and drugs.
  • the living tissue means one or more epithelial tissue, muscle tissue, nervous tissue, and connective tissue, and each organ may consist of one or more tissues, so mucosa, skin, brain, lung, liver, kidney, spleen, lung, heart, stomach , large intestine, digestive tract, bladder, ureter, urethra, ovary, testis, genitalia, muscle, blood, blood vessels, lymphatic vessels, lymph nodes, thymus, pancreas, adrenal gland, thyroid gland, parathyroid gland, larynx, tonsils, bronchi, alveoli
  • each organ may consist of one or more tissues, so mucosa, skin, brain, lung, liver, kidney, spleen, lung, heart, stomach , large intestine, digestive tract, bladder, ureter, urethra, ovary, testis, genitalia, muscle, blood, blood vessels, lymphatic vessels, lymph nodes, thymus, pancreas, adrenal gland, thyroid gland, parathyroid gland,
  • Cells constituting the living tissue are epithelial cells, muscle cells, nerve cells, gland cells, glial cells, germ cells, stem cells, mesenchymal cells, mesenchymal stem cells, osteoblasts, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, blood cells Various cells such as cells, hematopoietic cells, lung cells, hepatocytes, fibroblasts, immune cells, endothelial cells, adipocytes, and chondrocytes may be included, but the examples are not limited thereto.
  • Epithelial cells include mucosal epithelial cells, hair follicle epithelial cells, digestive tract epithelial cells, respiratory epithelial cells, genital epithelial cells, urinary epithelial cells, and the like.
  • Endothelial cells include, but are not limited to, vascular endothelial cells or lymphatic endothelial cells.
  • the composition may be for delivering a substance through a mucous membrane or skin, but is not limited to the above example.
  • composition of the present invention can be used for various purposes depending on the substances included in the composition together with the peptide.
  • a composition of the invention can be used to treat a disease in a human or animal.
  • the type of the disease is not limited, but it may be a disease that delivers a drug at a high concentration into cells, tissues, or blood or requires improved drug delivery, for example, treated with a gene therapy drug or a protein therapeutic drug with a large molecular weight
  • a variety of diseases can be applied to diseases that can become a disease or a therapeutic agent that requires a change in the route of administration.
  • the disease is, for example, breast cancer, liver cancer, brain cancer, prostate cancer, uterine cancer, ovarian cancer, stomach cancer, esophageal cancer, colorectal cancer, rectal cancer, thyroid cancer, blood cancer, skin cancer, cancer including lung cancer, diabetes, obesity, asthma, alopecia, etc. may be, but is not limited thereto.
  • peptides can be used in various molecules to diagnose contrast agents, diagnostic reagents and kits, and can also be used in health functional foods (health functional food compositions) and cosmetics (cosmetic compositions), but is not limited to the above examples.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding a peptide.
  • 'DNA', 'polynucleotide' and 'nucleic acid' refer to a DNA molecule isolated from the total genomic DNA of a particular species.
  • a DNA fragment (segment) encoding a polypeptide is one or more coding sequences that have been substantially isolated or purified from the total genomic DNA of a species from which the DNA fragment can be obtained. refers to a piece of DNA made up of
  • the terms 'DNA fragment' and 'polynucleotide' include DNA fragments and smaller fragments of such fragments, and also include recombinant vectors (eg, plasmids, cosmids, phagemids, bactericidal viruses, viruses, etc.).
  • the polynucleotide sequence of the present invention expresses, or is modified to express, a protein, peptide, etc., and includes a genomic sequence, an extra-genomic sequence, a sequence encoded in a plasmid, and smaller engineered gene fragments, and the like. Such fragments may be isolated naturally, or they may be synthetically modified by human hands.
  • polynucleotides may be single-stranded (code sequence or antisense sequence), or may be double-stranded, and may be DNA molecules (genomic, cDNA or synthetic) or RNA molecules. Additional coding or non-coding sequences may be present in the polynucleotides of the invention. Polynucleotides may also be linked to other molecules and/or support materials.
  • a polynucleotide may comprise a native sequence, or it may comprise a variant, or a biologically functional equivalent of the sequence.
  • Polypeptide variants may comprise one or more substitutions, additions, deletions and/or insertions, as further described below, preferably such modifications such that the desired activity of the encoded polypeptide is substantially reduced compared to the unmodified polypeptide. It is performed in a line that does not decrease to . The effect on the activity of the encoded polypeptide can generally be assessed as described herein.
  • the polynucleotide provided in the present invention is not particularly limited in its specific sequence as long as it encodes the peptide of the present invention or a mutant peptide thereof, and any combination of nucleotide sequence (nucleic acid sequence) construction is allowed.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 may be expressed by a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • polynucleotide of the present invention can be combined with other DNA sequences, such as promoters, polyadenylation signals, additional restriction enzyme sites, multiple cloning sites, and other coding fragments (segments), regardless of the length of the coding sequence itself. and, as a result, their overall length can vary considerably. Therefore, it is contemplated that polynucleotide fragments of almost any length are applicable, and preferably their overall length may be limited by ease of manufacture and use in the intended recombinant DNA protocol.
  • Polynucleotides and fusions thereof can be prepared, manipulated, and/or expressed using any of the well-established techniques known and available in the art.
  • a polynucleotide sequence encoding a peptide of the invention, or a functional equivalent thereof can be used in a recombinant DNA molecule to direct expression of the polypeptide in an appropriate host cell. Due to the inherent degeneracy of the genetic code, other DNA sequences encoding substantially identical or functionally equivalent amino acid sequences can be generated, which are cloned and cloned into a given polypeptide. It can be used to express
  • RNA transcript in which preferred codons in a particular prokaryotic host or eukaryotic host have an increased rate of protein expression or a desired property (eg, a half-life longer than the half-life of a transcript generated from a naturally occurring sequence).
  • a desired property eg, a half-life longer than the half-life of a transcript generated from a naturally occurring sequence
  • polynucleotide sequences of the present invention can be prepared by methods generally known in the art to alter the peptide coding sequence for a variety of reasons (including, but not limited to alterations that alter the cloning, processing, expression and/or activity of the gene product). can be manipulated using
  • the present invention provides a vector comprising the polynucleotide and a host cell transformed with the vector.
  • a nucleotide sequence encoding a polypeptide or functional equivalent can be inserted into an appropriate expression vector (i.e., a vector containing elements (elements) necessary for transcription and translation of the inserted coding sequence).
  • An expression vector comprising a sequence encoding a polypeptide of interest, and appropriate transcriptional control elements (elements) and translational control elements (elements) can be constructed by methods well known to those skilled in the art. These methods include in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques, and in vivo genetic recombination. These methods are described in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1989).
  • the expression vector/host system includes, but is not limited to, bacteria transformed with, for example, recombinant bacteriophage, plasmid, or cosmid DNA expression vector; yeast transformed with a yeast expression vector; insect cell lines infected with viral expression vectors (eg, baculovirus); plant cell lines transformed with viral expression vectors (eg, cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV) or bacterial expression vectors (eg, Ti or pBR322 plasmids); or microorganisms such as animal cell lines.
  • bacteria transformed with, for example, recombinant bacteriophage, plasmid, or cosmid DNA expression vector e.g, yeast transformed with a yeast expression vector
  • insect cell lines infected with viral expression vectors eg, baculovirus
  • plant cell lines transformed with viral expression vectors eg, cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV
  • bacterial expression vectors eg, Ti or pBR322 plasmid
  • the 'control elements' or 'regulatory sequences' present in an expression vector are untranslated regions (enhancers, promoters, 5' and 3' untranslated regions) that interact with host cell proteins to effect transcription and translation. . These elements (elements) may have different strength and specificity. Depending on the vector system and host used, any number of appropriate transcription elements and translation elements (including constitutive promoters and inducible promoters) may be used.
  • an inducible promoter such as the hybrid lacZ promoter of the PBLUESCRIPT phagemid (Stratagene, La Jolla, Calif.) or the PSPORT1 plasmid (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) may be used.
  • promoters derived from mammalian genes or mammalian viruses are generally preferred.
  • SV40 or EBV-based vectors may be usefully used together with an appropriate selection marker.
  • a number of expression vectors can be selected depending on the intended use for the expression of the peptide. For example, if large quantities are required, vectors directed at high levels of expression of the fusion protein that are easily purified can be used.
  • Such vectors include, but are not limited to, the following: Multifunctional E. coli cloning vectors and expression vectors, such as BLUESCRIPT ((Stratagene), wherein the sequence encoding the polypeptide of interest is ⁇ -galactosid ligated in the vector in frame with the sequence for the amino-terminal Met of the second agent and the following 7 residues, resulting in a hybrid protein); pIN vector (Van Heeke and Schuster, J. Biol. Chem.
  • the pGEX vector can also be used to express foreign polypeptides as fusion proteins with glutathione Stransferase (GST).
  • GST glutathione Stransferase
  • fusion proteins are soluble and can be readily purified from lysed cells by adsorption to glutathione-agarose beads followed by elution in the presence of free glutathione.
  • Proteins constructed in these systems can be designed to contain heparin, thrombin, or Factor Xa protease cleavage sites so that the cloned polypeptide can be released from the GST moiety.
  • yeast Sacharomyces cerevisiae
  • a number of vectors including constitutive promoters or inducible promoters eg alpha factor, alcohol oxidase and PGH
  • constitutive promoters or inducible promoters eg alpha factor, alcohol oxidase and PGH
  • PGH inducible promoters
  • expression of a sequence encoding a polypeptide can be driven by any of a number of promoters.
  • viral promoters eg, the 35S promoter and 19S promoter of CaMV
  • ⁇ (omega) leader sequence from TMV Takamatsu, EMBO J). .6:307-311 (1987)
  • a plant promoter eg, a small subunit of RUBISCO or a heat shock promoter
  • a plant promoter eg, a small subunit of RUBISCO or a heat shock promoter
  • It can be introduced into plant cells by a. This technique is known in the art.
  • Insect systems can also be used to express the desired polypeptide.
  • Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) is used as a vector to express a foreign gene in Spodoptera frugiperda cells or Trichoplusia larvae.
  • a sequence encoding a polypeptide may be cloned into a non-essential region of a virus and placed under the control of a polyhedrin promoter, for example, a polyhedrin gene or the like. Successful insertion of the polypeptide-encoding sequence results in the inactivation of the polyhedrin gene and production of a recombinant virus that lacks the coat protein.
  • the recombinant virus can then be used, for example, to infect S. frugiperda cells or Trichoplusia larvae, etc., in which the desired polypeptide can be expressed (Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3224-3227 (1994)).
  • a number of virus-based expression systems are generally available.
  • a sequence encoding a polypeptide of interest can be linked within an adenovirus transcription/translation complex consisting of a late promoter and a tripartite leader sequence. have. Insertion into a nonessential E1 or E3 region of the viral genome can be used to obtain a viable virus capable of expressing the polypeptide in an infected host cell.
  • transcription enhancers eg, Rous Sarcoma Virus (RSV) enhancer
  • RSV Rous Sarcoma Virus
  • a specific initiation signal may be used.
  • Such signals include the ATG start codon and adjacent sequences.
  • additional transcriptional control signals or translational control signals may not be required.
  • an exogenous translation control signal including the ATG start codon must be provided.
  • the start codon must be within the correct reading frame, to ensure translation of the entire insert.
  • Exogenous translation elements (elements) and start codons can come from a variety of origins (both natural and synthetic). The efficiency of expression can be enhanced by incorporating enhancers appropriate for the particular cell line being used.
  • the host cell line may also be selected for its ability to modulate the expression of the inserted sequence or to process (process) the expressed protein in a desired manner.
  • Such alterations of the polypeptide include, but are not limited to, acetylation, carboxylation, glycosylation, phosphorylation, lipidation, and acylation.
  • Post-translational processing which cleaves the 'prepro' form of a protein, can be used to facilitate correct insertion, folding and/or function.
  • Other host cells e.g. CHO, HeLa, MDCK, HEK293 and W138, which have specific cellular machinery and characteristic mechanisms for such post-translational activity
  • a cell line stably expressing a desired polynucleotide can be transformed using an expression vector, which includes an origin of viral replication and/or an endogenous expression element (element), and the same vector or a separate vector may include a selectable marker gene on the expression vector.
  • the cells After introduction of the vector, the cells can be grown for 1-2 days in enriched media, and then converted to selective media.
  • the purpose of a selection marker is to confer resistance to selection, and its presence permits growth and recovery of cells in which the introduced sequence is being successfully expressed.
  • Resistant clones of stably transformed cells can be proliferated using tissue culture techniques appropriate for the cell type.
  • selection systems can be used to recover transformed cell lines.
  • selection systems include, but are not limited to, herpes simplex virus thymidine kinase (Wigler et al., Cell 11:223-232 (1977)) and adenine phosphoribosyltransferase (Lowy), which can be used in tk-cells or aprt-cells, respectively. et al., Cell 22:817-823 (1990)) gene.
  • Antimetabolite tolerance, antibiotic tolerance, or herbicide tolerance can also be used as a basis for selection.
  • dhfr which confers, for example, resistance to methotrexate (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77:3567-70 (1980)); npt, which confers resistance to aminoglycosides, neomycin and G-418 (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1-14 (1981)); and als or pat, which confers resistance to chlorsulfron and phosphinotricin acetyltransferase, respectively (Murry, supra).
  • trpB which allows cells to use indole in place of tryptophan
  • hisD which enables cells to use histinol in place of histidine
  • Visible markers such as anthocyanin, ⁇ -glucuronidase and its substrate GUS, and luciferase and its substrate luciferin are gaining popularity and are used to identify transformants as well as specific vectors It is also widely used to quantify the amount of transient protein expression or stable protein expression due to the system.
  • a variety of labeling and conjugation techniques are known to those skilled in the art, and can be used in a variety of nucleic acid assays and amino acid assays.
  • As a means for preparing a labeled hybridization probe or a labeled PCR probe to detect a sequence related to a polynucleotide oligolabeling, nick translation, end-labeled or labeled and PCR amplification using nucleotides.
  • the sequence or any portion thereof may be cloned into a vector.
  • RNA polymerase eg, T7, T3, or SP6
  • reporter molecules or labels include radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent or chromogenic agents, substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, and the like.
  • Host cells transformed with the desired polynucleotide sequence can be cultured under conditions suitable for expression of the protein and recovery from cell culture.
  • the protein produced by the recombinant cell may be secreted or contained within the cell, depending on its sequence and/or vector.
  • expression vectors comprising the polynucleotides of the present invention can be designed to contain a signal sequence that directs secretion of the polypeptide through a prokaryotic cell membrane or a eukaryotic cell membrane.
  • Other recombinant constructs may be used to link a sequence encoding a polypeptide of interest with a sequence encoding a polypeptide domain that facilitates purification of a water soluble protein.
  • polypeptides and fragments thereof of the present invention can be produced by direct peptide synthesis using a solid phase technique.
  • Protein synthesis may be performed using a manual technique or may be performed by automation. Automated synthesis can be accomplished using, for example, Applied Biosystems 431 A Peptide Syntthesizer (Perkin Elmer).
  • the various fragments can be chemically synthesized individually and then combined using chemical methods to produce a full length molecule.
  • a polynucleotide encoding a polypeptide of the present invention can be delivered to a subject in vivo using, for example, gene therapy techniques.
  • Gene therapy generally refers to the transfection of a heterologous nucleic acid into a specific cell, target cell of a mammal, particularly a human, having a disorder or condition for which such treatment is desired. Nucleic acid is introduced into a selected target cell, and heterologous DNA is expressed thereby producing an encoded therapeutic product.
  • RNA viruses such as adenoviruses, herpes viruses, vaccinia, adeno-associated virus (AAV), or preferably retroviruses.
  • retroviral vector may be a murine or avian retroviral derivative, or a lentiviral vector.
  • a preferred retroviral vector may be a lentiviral vector.
  • retroviral vectors into which a single exogenous gene can be inserted include, but are not limited to, Moloney murine leukemia virus (MoMuLV), Harvey murine sarcoma virus (HaMuSV), murine mammary tumor virus (MuMTV) , SIV, BIV, HIV and Rous Sarcoma Virus (RSV).
  • MoMuLV Moloney murine leukemia virus
  • HaMuSV Harvey murine sarcoma virus
  • MuMTV murine mammary tumor virus
  • SIV BIV
  • HIV Rous Sarcoma Virus
  • RSV Rous Sarcoma Virus
  • a number of additional retroviral vectors may incorporate multiple genes. All of these vectors may contain a selectable marker gene so that the transduced cells can be identified and produced. For example, by inserting a desired zinc finger-derived DNA binding polypeptide sequence into a viral vector along with other genes encoding ligands for receptors on specific target cells, the vector may become target specific
  • Retroviral vectors can be made target specific, for example, by inserting a polynucleotide encoding a polypeptide.
  • targeting may be accomplished by using an antibody that targets a retroviral vector.
  • Those skilled in the art are familiar with specific polynucleotide sequences that can be inserted into the retroviral genome to enable target-specific delivery of a retroviral vector comprising a zinc finger-nucleotide binding protein polynucleotide. It can be easily confirmed without excessive experimentation.
  • helper cell line comprising a plasmid encoding all structural genes of a retrovirus under the control of regulatory sequences in the LTR. These plasmids lack a nucleotide sequence that enables a packaging mechanism to recognize RNA transcripts for encapsulation.
  • helper cell lines deficient in packaging signals include, but are not limited to, PSI.2, PA317 and PA12, and the like. These cell lines produce empty virions because the genome is not packaged.
  • the retroviral vector is introduced into cells in which the packaging signal is intact and the structural gene has been replaced with another gene of interest, the vector can be packaged and a vector virion can be produced.
  • the vector virions produced by the method can then be used to infect tissue cell lines (eg, NIH3T3 cells), thereby producing large amounts of chimeric retroviral virions.
  • the present invention provides the use of a substance containing the peptide for preparing a preparation for promoting cell permeation.
  • the present invention provides a method for promoting cell permeation comprising administering to an individual in need thereof an effective amount of a composition comprising a substance containing the peptide.
  • the 'effective amount' of the present invention refers to an amount that exhibits an effect of improving, detecting, diagnosing, or promoting cell permeation when administered to a subject, and the 'subject' includes an animal, preferably a mammal, particularly a human. It may be an animal, and it may be an animal-derived cell, tissue, organ, or the like.
  • the present invention also provides a complex comprising the peptide and a biologically active substance.
  • the complex refers to one or more peptides containing one or more biologically active substances.
  • the peptide and the biologically active material may be included in a ratio of 1:1, 1: many, many: 1, and many: many.
  • the peptide and the biologically active material may be included in a molar ratio of 1:1 to 1:100, or 100:1 to 1:1.
  • the molar ratio is exemplary and not limited thereto.
  • the complex includes all those produced by simply mixing a peptide and a biologically active material, a mixture formed by mixing a peptide and a biologically active material, or connecting or conjugating them by a chemical bond.
  • the complex may be linked by a physical bond, a chemical bond, a covalent bond, or a non-covalent bond, or may be linked in an integrated or fused form using a mediator.
  • the target substance is a protein
  • the peptide coding sequence is added to the protein-coding sequence and linked with several linkers, and it can penetrate cells in the form of a fusion protein or can be transported to tissues or blood, but forms a complex. There is no limit on how to do it.
  • the "complex" may be in a state in which the peptide and the biologically active material are simply mixed.
  • the "complex" may be a complex formed by mixing the peptide and the biologically active material.
  • the peptide and the biologically active material may be dissolved in a buffer and mixed in a predetermined molar ratio, and for stabilization after mixing, at a constant temperature, for example, at room temperature, or at 4 refrigeration temperature for a certain period of time, for example, 1 second to 1 hour.
  • a constant temperature for example, at room temperature, or at 4 refrigeration temperature for a certain period of time, for example, 1 second to 1 hour.
  • the above temperature and time are exemplary and not limited thereto.
  • the "complex" may be a complex formed by expressing the peptide and the biologically active material in a fusion state.
  • the peptide and the biologically active material are fusion proteins (fusion protein) can be expressed.
  • fusion protein fusion protein
  • any linker may be included between the peptide and the biologically active material.
  • the linker may be a peptide linker consisting of one or more amino acids.
  • the peptide linker may be, for example, a polypeptide consisting of any amino acids from 1 to 100 or from 2 to 50 amino acids.
  • the peptide linker may include, for example, Gly, Asn and Ser residues, and may also include neutral amino acids such as Thr and Ala. Suitable amino acid sequences for peptide linkers are known in the art.
  • the length of the linker can be variously determined within the limit that does not affect the function of the complex. That is, the linker may include 1 to 100 or 2 to 50 of one or more selected from the group consisting of Gly, Asn, Ser, Thr and Ala in total, but is not limited thereto.
  • the biologically active material penetrates into the cell (in the cytoplasm or nucleus) and is involved in the regulation of physiological activity or is capable of expressing a pharmacological effect, or within a cell, within a tissue, or within a cell to be transported and acted upon. It refers to a substance having biological activity in various parts of the body, such as epilepsy and blood.
  • the biologically active material is a compound (chemical compound), protein, glycoprotein, peptide, nucleotide, nucleic acid, carbohydrate, lipid, glycolipid, natural product, semi-synthetic substance, It may be at least one selected from the group consisting of nanoparticles, liposomes, lipid-based formulations, viruses, quantum dots, fluorochromes, and drugs.
  • the drug (drug) is a compound drug (chemical drug), bio drug (biodrug), nucleic acid drug (nucleic acid drug), peptide drug (peptide drug), protein drug (protein drug), natural product Natural product drug, semi-synthetic drug, lipid drug, enzyme, regulatory factor, growth factor, hormone, contrast agent) and an antibody (antibody) may be at least one selected from the group consisting of.
  • the present invention also provides a composition for gene therapy comprising the fusion of the peptide and a genetic material as an active ingredient.
  • the present invention also provides the use of the fusion of the peptide and genetic material for the manufacture of a gene therapy agent.
  • the present invention also provides a gene therapy method comprising administering to an individual in need thereof an effective amount of a composition comprising a fusion of the peptide and a genetic material.
  • the genetic material may be expressed as “nucleic acid”, and includes DNA, decoy DNA, plasmid, siRNA, shRNA, oligonucleic acid, aptamer, antisense oligonucleotide, antisense RNA, microRNA (microRNA), oligoribonucreo locked nucleic acids (LNA), Peptide Nucleic Acids (PNA), phosphorodiamidate morpholino oligomer to maximize structural stability in vivo by biochemically modifying antisense oligonucleotides, etc. (PMO), hexitol nucleic acids (HNA), etc., but are not limited thereto.
  • b) provides a method for delivering a biologically active material comprising the step of injecting the complex into a living body or cell of a mammal other than a human.
  • novel cell-penetrating peptide of the present invention can effectively penetrate into a living body such as cells, tissues, and blood.
  • FIGS. 1a to 1f is after treatment with the peptides of the present invention at various concentrations in BEAS-2B cells or HeLa cells, after 15 minutes (1a, 1b), after 30 minutes (1c, 1d), and after 2 hours (1e, 1f) These are the results of analyzing the degree of intracellular permeation.
  • FIGS. 2a and 2b is that the peptides of the present invention were treated in BEAS-2B cells or HeLa cells at various concentrations, and analyzed by fluorescence microscopy after 30 minutes in BEAS-2B cells (2a), in HeLa cells 2 It is the result of analysis with a fluorescence microscope after time (2b).
  • FIGS. 3a and 3b treated BEAS-2B cells or HeLa cells with various concentrations of the peptides of the present invention, and analyzed the degree of cytotoxicity in BEAS-2B cells after 24 hours and 48 hours (3a) , the result of analyzing the degree of cytotoxicity in HeLa cells after 24 and 48 hours (3b).
  • each of the peptides of SEQ ID NOs: 1 to 10 shown in Table 1 below was prepared to have a purity of 95% or more. This peptide synthesis was commissioned by Icure Pepgen Co., Ltd. and proceeded.
  • the intracellular permeation pattern of the peptide of the present invention was confirmed with a fluorescence microscope.
  • each of the peptides of SEQ ID NOs: 1 to 10 prepared in Example 1 was labeled with a rhodamine fluorescent dye.
  • intracellular peptide concentrations were evaluated after 15 minutes, 30 minutes, and 2 hours.
  • TAT peptide GRKKRRQRRR
  • BEAS-2B cells or HeLa cells were treated with the peptides BCP3, BCP4, and BCP5 at concentrations of 10 ⁇ M and 50 ⁇ M, and the control TAT was also treated with the same concentration.
  • cell culture slides were inoculated during cell inoculation, because plastics cause fluorescence interference when observed under a fluorescence microscope. After washing, a glass cover glass was adhered to the slide glass using a mounting medium with DAPI, and the sample was observed under a fluorescence microscope 400 times.
  • BCP3, BCP4 and BCP5 were all confirmed to exhibit significantly improved cell permeability than TAT used as a control.
  • cytotoxicity was confirmed as follows.
  • Peptides prepared in cells in the same manner as in Example 2 were treated in culture medium at different concentrations (0, 1, 10, 100 ⁇ M), and treated for 24 hours and 48 hours. Add 10ul of CCK-8 to each well, and after 3 hours in a 5% CO 2 incubator maintained at 37°C humidified, absorbance at 460 nm using a microplate absorbance reader (SYNERGY H1 microplate reader, BIO-TEK) was measured.
  • a microplate absorbance reader SYNERGY H1 microplate reader, BIO-TEK
  • novel cell-penetrating peptide of the present invention can effectively penetrate into living bodies such as cells, tissues, and blood, and thus has very high industrial applicability.

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Abstract

본 발명은 세포막 투과성을 갖는 신규 펩타이드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상용 TAT 펩타이드와 비교하여 향상된 세포 투과성을 나타내는 세포 투과성 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 신규 세포 투과성 펩타이드는 세포, 조직, 혈액 등 생체 내로 효과적으로 침투할 수 있다.

Description

세포막 투과성을 갖는 신규 펩타이드
본 출원은 2020년 12월 15일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2020-0175667호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 세포막 투과성을 갖는 신규 펩타이드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상용 TAT 펩타이드와 비교하여 향상된 세포 투과성을 나타내는 세포막 투과성을 갖는 신규 펩타이드에 관한 것이다.
일반적으로 단백질, DNA와 같은 고분자로 된 생물학적 활성 물질은 친수성 및 소수성의 인지질 이중층을 통과할 수 없기 때문에 세포막을 투과해 세포 내로 들어갈 수 없다. 하지만 수용체와 같은 다른 분자의 도움 없이 세포막을 가로지를 수 있는 세포 투과성 펩타이드(Cell penetrating peptide)가 알려져 있다.
세포 투과성 펩타이드는 CPP(Cell penetrating peptide), MTS(membrane-translocating sequences)라고도 불리는 데, 수송대상체에 결합된 형태 또는 혼합된 형태로 세포막을 통과해 단백질, DNA, RNA 등의 운반 대상을 세포 내 뿐만 아니라 세포질, 세포내 소기관, 핵 안에까지 운반할 수 있다.
HIV-1(Human immunodeficiency virus-1)의 감염 기작 중 하나로 TAT라는 물질의 세포막을 투과하는 현상이 확인된 첫 번째 단백질로써, 이로부터 유래한 TAT 펩타이드는 가장 많이 적용되고 활발한 연구가 진행되고 있다.
TAT 펩타이드를 이용하여 β-galactosidase, horseradish peroxidase, RNase A, domain of Pseudomonas exotoxin A (PE)등을 세포내로 전달해서 그 기능과 세포 내의 localization에 대한 연구가 진행된 바 있고, TAT 펩타이드는 세포막에 존재하는 Heparan sulfate와의 상호작용 후 발생하는 Lipid Raft가 관여하는 엔도시토시스(Endocytosis)에 의한 것임을 밝혀졌다.
이외에도, 초파리의 발생과정에 필수적인 전사인자인 Antennapedia homeoprotein으로부터 유래한 16개의 아미노산 서열로 구성된 Penetratin (Antp)이라는 세포 투과성 펩타이드, HSV-1 (Herpes simplex virus type 1)이 발현하는 단백질인 VP22로부터 유래한 동명의 세포 투과성 펩타이드 VP22, 인공적으로 합성해낸 27개의 아미노산 서열로 이루어진 Transportan, 세포 투과성 펩타이드에서 가장 중요한 기능을 담당할 것이라고 예상되는 아르기닌을 인공적으로 반복시킨 폴리아르기닌 (Poly-Arginine) 등이 세포 투과성 펩타이드로 잘 알려져 있다.
이러한 종래 세포 투과성 펩타이드들은 HIV-1과 같은 바이러스 단백질로부터 유래한 서열이거나, 초파리와 같은 다른 종이 발현하는 단백질로부터 유래한 것들이거나, 종래 세포 투과성 펩타이드를 구성하는 아미노산 서열 분석을 통해 특징적인 아미노산 서열을 선정, 인공적으로 합성해 낸 아미노산 서열이라는 점에서, 인체에 적용해서 사용할 때에 면역 반응 등의 부작용을 일으킬 소지가 있었다.
또한, 이들은 비교적 긴 아미노산 사슬로 이루어져 있어서 원치 않는 면역반응을 일으킬 가능성이 더 크고, 전달하고자 하는 단백질의 구조 및 기능에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 세포 내로 전달하고자 하는 생물학적 활성 물질과 연결할 때에 효율이 저하되는 문제가 있었다.
한편, 최근에 치료목적의 약물과 펩타이드 그리고 단백질을 세포 안으로 도입하는 실험들이 활발히 진행되고 있다. 그러나 이들 방법은 모두 일부의 세포에만 핵산을 전달할 수 있다는 한계이며, 세포막에 손상을 입혀 독성을 나타내는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자는 생물학적 활성물질을 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있는 세포 투과성 펩타이드를 개발하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 일련의 서열을 나타내는 TCTP 단백질 (translationally controlled tumor protein) 유래의 CPP 변이체들이 상용 TAT 펩타이드보다 월등한 세포 투과성을 나타낸다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드를 제공하는 것이다:
MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6
상기 식에서,
R1은 A, V, I, L, S, F, K 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R2는 S, L, F, T 및 Y로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
R3는 E, L, A 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R4는 Q, H, T, L, D 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
R5는 L, S, V, A, K 및 H로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R6는 DK, EK, QK, NK, KK 및 FK로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 디펩타이드이다.
본 발명의 다른 목적은 펩타이드를 포함하는 물질의 세포 투과 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 펩타이드로 이루어지는 물질의 세포 투과 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 펩타이드로 필수적으로 이루어지는 물질의 세포 투과 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포 투과 촉진용 제제를 제조하기 위한 상기 펩타이드를 포함하는 물질의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 물질을 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 세포 투과 촉진 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드 및 생물학적 활성물질을 포함하는 복합체(complex)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드와 유전물질의 융합체를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드와 유전물질의 융합체로 이루어지는 유전자 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드와 유전물질의 융합체로 필수적으로 이루어지는 유전자 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 유전자 치료용 제제를 제조하기 위한 상기 펩타이드와 유전물질의 융합체의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드와 유전물질의 융합체를 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 유전자 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은
a) 상기 펩타이드를 생물학적 활성물질과 결합시켜 복합체를 제조하는 단계; 및
b) 상기 복합체를 인간을 제외한 포유동물의 생체 또는 세포 내로 주입하는 단계를 포함하는 생물학적 활성물질의 전달방법을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드를 제공한다:
MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6
상기 식에서,
R1은 A, V, I, L, S, F, K 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R2는 S, L, F, T 및 Y로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
R3는 E, L, A 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R4는 Q, H, T, L, D 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
R5는 L, S, V, A, K 및 H로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R6는 DK, EK, QK, NK, KK 및 FK로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 디펩타이드이다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 포함하는 물질의 세포 투과 촉진용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 펩타이드로 이루어지는 물질의 세포 투과 촉진용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 펩타이드로 필수적으로 이루어지는 물질의 세포 투과 촉진용 조성물을 제공한다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포 투과 촉진용 제제를 제조하기 위한 상기 펩타이드를 포함하는 물질의 용도를 제공한다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 물질을 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 세포 투과 촉진 방법을 제공한다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드 및 생물학적 활성물질을 포함하는 복합체(complex)를 제공한다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드와 유전물질의 융합체를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드와 유전물질의 융합체로 이루어지는 유전자 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드와 유전물질의 융합체로 필수적으로 이루어지는 유전자 치료용 조성물을 제공한다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유전자 치료용 제제를 제조하기 위한 상기 펩타이드와 유전물질의 융합체의 용도를 제공한다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드와 유전물질의 융합체를 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 유전자 치료 방법을 제공한다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
a) 상기 펩타이드를 생물학적 활성물질과 결합시켜 복합체를 제조하는 단계; 및
b) 상기 복합체를 인간을 제외한 포유동물의 생체 또는 세포 내로 주입하는 단계를 포함하는 생물학적 활성물질의 전달방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 실시는, 특별히 반대로 나타내지 않는 이상, 본 발명이 속하는 기술 분야 내의 분자생물학 및 재조합 DNA 기술의 종래 방법을 사용하고, 설명을 위한 목적으로서 대부분이 아래(문헌)에 기재되어있다. 이러한 기술은 문헌 중에 상세하게 설명된다: Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, ed., 1984).
본 명세서에 인용되는 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그 전체가 참고로서 본 명세서에 원용된다.
본 명세서에 개시된 내용 전반에 걸쳐서, 본 발명과 관련된 다양한 양상 또는 조건들이 범위 형식으로 제안될 수 있다. 본 명세서에서 범위값의 기재는, 별다른 언급이 없는 한 해당 경계값을 포함하는 것으로서 즉, 하한값 이상 내지 상한값 이하의 값을들 모두 포함하는 의미이다. 범위 형식의 서술은 단순히 편의성 및 간략성을 위한 것이며, 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한(inflexible limitation)으로서 해석되지 않아야 하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 서술은 상기 범위 내의 개별적인 수치값들뿐만 아니라 모든 가능한 하부범위(subrange)를 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 7 내지 170과 같은 범위의 서술은 상기 범위 내의 개별적 수치들, 예를 들어, 9, 27, 35, 101, 및 155 뿐만 아니라, 10 내지 127, 23 내지 35, 80 내지 100, 50 내지 169 등과 같은 하부범위들을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭과 무관하게 적용된다.
본 발명의 용어 '~을 포함하는(comprising)'이란 '함유하는' 또는 '특징으로 하는'과 동일하게 사용되며, 조성물 또는 방법에 있어서, 언급되지 않은 추가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 또한 용어 “로 이루어지는(consisting of)”이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 “필수적으로 이루어지는(essentially consisting of)”이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 물질 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계 등을 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 사용된 용어 '펩타이드' 및 '단백질'은 통상(종래)의 의미에 따라 사용되는 것으로, 즉 아미노산의 배열을 의미한다. 펩타이드는 특정의 길이로 한정되지 않지만, 본 발명의 문맥에서는 일반적으로 전장(full length) 단백질의 단편을 나타내며, 번역후의 수식, 예를 들면 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등 및 해당 분야에 공지된 다른 수식(자연적으로 발생하는 수식 및 비자연적 발생의 수식)을 포함할 수 있고 '폴리펩타이드'로 표현될 수도 있다. 본 발명의 펩타이드 및 단백질은 임의의 다양한 공지의 재조합 및/또는 합성의 기술을 이용하여 제조될 수 있으며, 그 예시적인 실시예는 이하에서 추가로 설명한다.
본 발명은 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드를 제공한다:
MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6
상기 식에서,
R1은 A, V, I, L, S, F, K 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R2는 S, L, F, T 및 Y로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
R3는 E, L, A 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R4는 Q, H, T, L, D 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
R5는 L, S, V, A, K 및 H로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
R6는 DK, EK, QK, NK, KK 및 FK로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 디펩타이드이다.
본 발명의 상기 펩타이드는 세포막 투과성이 있는 신규한 펩타이드로서 그 자체로 세포막 투과성이 우수하다.
본 발명에서 상기 "세포막"은 세포와 세포 외부의 경계를 짓는 막을 의미한다. 본 발명의 일 양태로서, 상기 세포막은 임의의 생명체, 예를 들어 세균 (Bacteria), 고세균 (Archaea) 및 진핵생물 (Eukarya)에 속하는 단세포 또는 다세포 생물의 세포의 막일 수 있다. 상기 진핵생물은 원생생물계 (Protista), 균계 (Fungus), 식물계 (Plantae), 및 동물계 (Animalia)에 속하는 임의의 생물일 수 있다. 상기 동물은 사람을 포함하는 임의의 동물이 될 수 있다.
본 발명에서, 상기 "세포막"은 임의의 종류의 세포의 막이 될 수 있다. 예를 들어, 상기 "세포"는 상피세포, 근육세포, 면역세포 및 내피세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 세포는 내피 (endothelium), 상피 (epithelium), 점막 (mucous membrane) 등 체외와 직접 맞닿아 있는 기관의 벽 (lining)을 이루거나, 또는 체내에서 어떤 장기 또는 혈관의 표면을 덮는 세포층의 세포가 될 수 있다. 본 발명의 일 양태로서, 상기 세포는 피부 상피세포, 모낭 상피세포, 점막 상피세포, 각막 상피세포, 두피 상피세포, 각막 내피세포, 혈관 내피세포를 포함한다. 예를 들어, 상기 점막 상피세포는 비강, 폐, 질, 직장, 항문, 요도, 설하, 안구, 결막 및 구강 점막으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 점막의 상피세포일 수 있다. 예컨대 상기 혈관 내피세포는 혈액뇌장벽 (BBB)을 이루고 있는 뇌혈관을 비롯한 각종 동맥, 정맥, 모세혈관의 내피세포, 림프관 내피세포, 심장 안벽의 내피세포 등이 될 수 있다. 또한 상기 세포는 자궁경부암, 유방암, 간암, 폐암 등을 포함하는 다양한 암세포가 될 수 있다. 또한 상기 세포는 호르몬, 신경계의 화학전달 물질, 약물 등 다양한 물질의 수용체 (receptor)를 가진 세포가 될 수 있으며, 예를 들어 인슐린 수용체 (insulin receptor), 글루카곤-유사-단백질 1 (Glucagon-like-protein 1, GLP1) 수용체를 갖는 세포가 될 수 있으나, 상기 세포는 상기 예시에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 펩타이드는 당업계에 공지된 이용가능한 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 일례로 임의의 다양한 단백질 분해효소를 이용하여 제조될 수 있다. 예시적인 프로테아제(단백질분해효소)로서는, 예를 들면, 아크로모펩티다아제(achromopeptidase), 아미노펩티다제(aminopeptidase), 안크로드(ancrod), 안지오텐신 변환 효소(angiotensin converting enzyme), 브로멜라인(bromelain), 칼파인(calpain), 칼파인 I(calpain I), 칼파인 II(calpain II), 카르복시펩티다제 A(carboxypeptidase A), 카르복시펩티다제 B(carboxypeptidase B), 카르복시펩티다제 G(carboxypeptidase G), 카르복시펩티다제 P(carboxypeptidase P), 카르복시펩티다제 W(carboxypeptidase W), 카르복시펩티다제 Y(carboxypeptidase Y), 카스파아제 1(caspase 1), 카스파아제 2(caspase 2), 카스파아제 3(caspase 3), 카스파아제 4(caspase 4), 카스파아제 5(caspase 5), 카스파아제 6(caspase 6), 카스파아제 7(caspase 7), 카스파아제 8(caspase 8), 카스파아제 9(caspase 9), 카스파아제 10 (caspase 10), 카스파아제 11(caspase 11), 카스파아제 12 (caspase 12), 카스파아제 13 (caspase 13), 카텝신 B(cathepsin B), 카텝신 C(cathepsin C), 카텝신 D(cathepsin D), 카텝신 E(cathepsin E), 카텝신 G(cathepsin G), 카텝신 H(cathepsin H), 카텝신 L(cathepsin L), 키모파파인(chymopapain), 키마아제(chymase), 키모트립신(chymotrypsin), 크로스 트리파인(clostripain), 콜라게나제(collagenase), 보체 C1r(complement C1r), 보체 C1s (complement C1s), 보체 D인자(complement Factor D), 보체 I인자(complement factor I), 쿠쿠미신(cucumisin), 디펩티딜펩티다제 IV(dipeptidyl peptidase IV), 백혈구 엘라스타제(elastase, leukocyte), 췌장 엘라스타제(elastase, pancreatic), 엔도프로테이나제 Arg-C( endoproteinase Arg-C), 엔도프로테이나제 Asp-N(endoproteinase Asp-N), 엔도프로테이나제 Glu-C(endoproteinase Glu-C), 엔도프로테이나제 Lys-C(endoproteinase Lys-C), 엔테로키나제(enterokinase), Xa 인자(factor Xa), 피신(ficin), 퓨린(furin), 그란자임 A(granzyme A), 그란자임 B(granzyme B), HIV 프로테아제(HIV Protease), IGase, 칼리크레인 조직(kallikrein tissue), 일반 류신 아미노펩티다제(leucine aminopeptidase, general), 세포기질 류신 아미노펩티다제(leucine aminopeptidase, cytosol), 마이크로솜 류신 아미노펩티다제(leucine aminopeptidase, microsomal), 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease), 메티오닌 아미노펩티다제(methionine aminopeptidase), 뉴트라제(neutrase), 파파인(papain), 펩신(pepsin), 플라스민(plasmin), 프롤리다제(prolidase), 프로나제 E(pronase E), 전립선 특이적 항원(prostate specific antigen), Streptomyces griseus 유래의 호알카리성 프로테아제(protease alkalophilic from Streptomyces griseus), Aspergillus 유래의 프로테아제(protease from Aspergillus), Aspergillus saitoi 유래의 프로테아제(protease from Aspergillus saitoi), Aspergillus sojae 유래의 프로테아제(protease from Aspergillus sojae), B. licheniformis 프로테아제(protease B. licheniformis, alkaline or alcalase), Bacillus polymyxa 유래의 프로테아제(protease from Bacillus polymyxa), Bacillus sp유래의 프로테아제(protease from Bacillus sp), Rhizopus sp.유래의 프로테아제(protease from Rhizopus sp.), 프로테아제 S(protease S), 프로테아좀류(proteasomes), Aspergillus oryzae 유래의 프로테이나제(proteinase from Aspergillus oryzae), 프로테이나제 3(proteinase 3), 프로테이나제 A(proteinase A), 프로테이나제 K(proteinase K), 프로테인 C(protein C), 피로글루타메이트 아미노펩티다제(pyroglutamate aminopeptidase), 레닌(rennin), 스트렙토키나제(streptokinase), 서브틸리신(subtilisin), 서몰리신(thermolysin), 트롬빈(thrombin), 조직 플라스미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator), 트립신(trypsin), 트립타제(tryptase) 및 우로키나제(urokinase) 등을 들 수 있다. 당업자라면 제작하고자하는 단편의 화학적 특이성을 고려하여, 어떤 단백질분해효소가 적절할지 용이하게 결정 가능하다.
본 발명에서 상기 펩타이드는 당분야의 숙련자에게 공지된 임의의 적합한 절차, 예컨대 재조합 기법에 의해 제조될 수 있다. 재조합 제조 방법에 부가하여, 본 발명의 폴리펩티드는 고상 기법을 이용한 직접적 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다.
고체상 펩타이드 합성(SPPS) 방법은 작은 다공성의 비드(beads)에 링커(linkers)라 불리는 기능성 유닛(functional units)을 부착하여 펩타이드 사슬을 이어 나갈 수 있도록 유도함으로써 합성을 개시할 수 있다. 액체상 방법과 달리 펩타이드는 비드와 공유 결합하여 TFA(trifluoroacetic acid)와 같은 특정 반응물에 의해 절단되기 전까지 여과(filtration) 과정에 의해 떨어져 나가는 것을 방지한다. 고체상에 부착된 펩타이드의 N-말단 아민과 N-보호 아미노산 유닛(N-protected amino acid unit)이 결합하는 보호(protection) 과정, 탈보호(deprotection) 과정, 다시 드러난 아민 그룹(amine group)과 새로운 아미노산이 결합하는 커플링(coupling) 과정의 사이클(cycle, deprotection-wash-coupling-wash)이 반복되면서 합성이 이루어지게 된다. 상기 SPPS 방법은 마이크로파(microwave) 기술을 함께 이용하여 수행할 수 있으며, 마이크로파 기술은 펩타이드 합성 과정에서 열을 가해줌으로써 각 사이클의 커플링과 탈보호에 요구되는 시간을 단축시킬 수 있다. 상기 열 에너지는 확장되는 펩타이드 사슬이 접히거나(folding) 집합체를 형성하는 것(aggregation)을 방지하고 화학적 결합을 촉진시킬 수 있다.
또한 액체상 펩타이드 합성법에 의해 본 발명의 펩타이드를 제작할 수 있으며, 이의 구체적 방법은 하기의 문헌들을 참조로 한다: US 등록특허 제 5,516,891. 또한 본 발명의 펩타이드는 상기 고체상 합성법과 액체상 합성법을 혼합하는 방법 등의 다양한 방법으로 합성 가능하며, 본 명세서에 기술된 수단에 그 제조 방법이 제한되지 않는다.
단백질 합성은 수동 기법을 이용해서 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화된 합성은, 예를 들어 Applied Biosystems 431A 펩티드 합성기(Perkin Elmer)를 이용해서 달성될 수 있다. 대안적으로, 다양한 단편이 별도로 화학적으로 합성되고 화학적 방법을 이용하여 조합되어 목적 분자를 제조할 수 있다.
본 발명에서 상기 펩타이드는 당업자에게 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법 혹은 제조 방법을 통하여 D-form이나 L-form, 서열 중 일부만 D-form이나 L-form으로 구성된 펩타이드, 또는 이들의 라세미체 형태로 모두 제작하여 사용될 수 있다. 또한 펩타이드의 안정성을 높이기 위해 그 외의 당업계에 공지된 통상적인 변형이 가능하다.
본 발명에서 상기 펩타이드는 통상적인 변이체를 포함할 수 있다. 상기 변이체는, 상기 '펩타이드'의 아미노산 서열에 임의의 변경이 발생한 것으로서, 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 이러한 변이체는 자연적으로 발생되는 것일 수 있고, 또는 본 기술분야에 잘 알려진 임의의 다수의 기술을 이용하여, 예를 들어 본 발명의 상기 펩타이드 서열 중의 하나 이상을 수정 또는 변형하고 본 명세서에 기재된 이들의 생물학적 활성을 평가하는 것에 의해 합성적으로 생성될 수 있다.
본 발명의 일양태로서, 상기 변이체(variant)는 보존적 치환을 포함한다. '보존적 치환'이란, 어느 아미노산이 유사한 특성을 가지는 다른 아미노산으로 치환되어 당업자라면 그 펩타이드의 2차 구조 및 감수성질(hydropathic nature, 소수성 또는 친수성 성질)이 실질적으로 비변화되었다고 예측할 수 있는 치환이다. 일반적으로 하기 아미노산 군이 보존성 변화를 나타낸다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his.
변형(modification)은 본 발명의 펩타이드의 구조 내에 수행되는 것일 수 있고, 원하는(바람직한) 특징을 가지고 있는 펩타이드 변이체 또는 파생물(derivatives)을 암호화하는 기능적 분자를 수득할 수 있다. 본 발명의 상기 펩타이드와 등가(equivalent)의 또는 향상된(improved) 변이체를 제작하기 위해 펩타이드의 아미노산 서열을 변경하고자 하는 경우, 당업자는 당업계에 알려진 단백질 코돈 정보에 기초하여 하나 이상의 코돈을 변화시킬 수 있다.
또한 상기 변이체는 비보존적 변경을 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 변이체 펩타이드는 5개 아미노산 또는 그것보다 적은 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 천연 서열과는 다를 수 있다. 변이체는 또한, 예를 들어 상기 펩타이드의 2차 구조 및 감수(hydropathic) 특성에 대해서 가지는 영향이 최소인 아미노산의 결실 또는 부가에 의해 변경될 수 있다.
본 발명에서 상기 펩타이드는 단백질의 N-말단에 시그널(또는 리더) 서열을 포함할 수 있고, 이 서열은 번역과 동시에 또는 번역 후에 그 단백질의 이송을 지시한다. 상기 펩타이드는, 또한 펩타이드의 합성, 정제 또는 동정을 용이하게 하기 위해(예를 들면 폴리His), 또는 펩타이드의 고체 지지체에 대한 결합을 증강하기 위해, 링커 서열 또는 다른 서열과 결합(컨쥬게이트)될 수 있다.
본 발명의 일양태에서 본 발명의 상기 펩타이드를 변경하기 위하여 화학선택적 결찰(chemoselective ligation)기술이 이용될 수 있으며, 예를 들어 부위 특이적인 방식 및 제어된 방식으로 중합체(polymer)를 부착하는 것에 의할 수 있다. 이러한 기술은 대표적으로 화학적 수단 또는 재조합 수단 중 하나에 의해 단백질 골격 내로 화학 선택적인 앵커(chemoselective anchor)가 결합하는 것과, 상보적인 링커를 운반하는 중합체로 후속적 변경하는 것에 의존한다. 결과적으로, 조립 공정 및 얻어진 단백질-중합체 결합체(protein-polymer conjugate)의 공유결합 구조는 제어되며, 그것에 따라 유효성 및 약물 동태학적 특성 등과 같은 약물 특성의 합리적 최적화가 가능하게 된다. 예컨대 PEG의 선택적인 부착을 허용함으로써 이들의 약동학적 특성을 개선한다.
본 발명의 상기 펩타이드에는 약학적으로 허용가능한 염의 형태가 포함이 될 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은 예를 들어, 염산염, 황산염, 인산염, 초산염, 구연산염, 주석산염, 숙신산염, 젖산염, 말레산염, 푸마르산염, 옥살산염, 메탄술폰산염, 또는 파라톨루엔술폰산염 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일양태에서 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 1 내지 10의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 종래의 TAT 단백질의 투과율과 비교하여 탁월한 세포막 투과도를 나타내며, 처리농도가 높을수록 세포 내 투과율은 급격히 증가하는 양상을 나타내는 것으로 확인되었다.
본 발명은 또한 펩타이드를 포함하는 물질의 세포 투과 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 물질, 보다 구체적으로는 생물학적 활성물질을 생체 조직 또는 혈중으로 전달시키거나 세포 투과를 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 조성물은 생체 조직을 구성하는 세포 또는 세포 간 연접을 통하여 전달될 수 있으나 전달 방식에는 제한이 없다.
상기 물질은 세포 내 (세포질 또는 핵 내)로 투과되어 생리활성조절에 관여하거나 약리효과를 발현할 수 있는 것 또는 운반되어 작용해야 하는 세포 내, 조직 내, 세포간질, 혈액 등 다양한 생체 내 부위에서 생물학적 활성을 갖는 물질을 의미한다. 예를 들어, 본 발명에 있어서 상기 물질은 화합물 (chemical compound), 단백질, 당단백질, 펩타이드, 뉴클레오티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 당지질, 천연물 (natural product), 반합성 물질 (semi-synthetic substance), 나노입자, 리포좀, 지질 기반 제제 (lipid-based formulation), 바이러스, 양자점 (quantum dots), 형광색소 (fluorochrome) 및 약물 (drug)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 생체 조직은 하나 이상의 상피조직, 근육조직, 신경조직, 결합조직을 의미하며 각 장기는 하나 이상의 조직으로 이루어질 수 있으므로, 점막, 피부, 뇌, 폐, 간, 신장, 비장, 폐장, 심장, 위장, 대장, 소화관, 방광, 요관, 요도, 난소, 정소, 생식기, 근육, 혈액, 혈관, 림프관, 림프절, 흉선, 췌장, 부신, 갑상선, 부갑상선, 후두, 편도, 기관지, 폐포의 다양한 생체 장기가 포함될 수 있으나, 상기 예시에 제한되지 않는다.
상기 생체 조직을 구성하는 세포는 상피세포, 근육세포, 신경세포, 선세포, 신경교세포, 생식세포, 줄기세포, 중간엽세포, 중간엽줄기세포, 골아세포, 골세포, 조골세포, 파골세포, 혈구세포, 조혈세포, 폐세포, 간세포, 섬유아세포, 면역세포, 내피세포, 지방세포, 연골세포 등 다양한 세포가 포함될 수 있으나, 상기 예시에 제한되지 않는다.
상피세포에는 점막상피세포, 모낭상피세포, 소화관상피세포, 호흡기상피세포, 생식기상피세포, 비뇨기상피세포 등이 포함된다. 내피세포는 혈관내피세포 또는 림프관내피세포 등이 있으나, 상기 예시에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 조성물은 점막 또는 피부를 통하여 물질을 전달시키기 위한 것일 수 있으나, 상기 예시에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 상기 펩타이드와 함께 조성물 내에 포함된 물질에 따라 다양한 용도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 인간 또는 동물에서 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 질환의 종류에는 제한이 없으나, 세포, 조직, 혈액 내로 높은 농도로 약물을 전달하거나 개선된 약물의 전달이 필요한 질환이 될 수 있으며, 예를 들어 유전자 치료제 약물 또는 분자량이 큰 단백질 치료제 약물로 치료될 수 있는 질환이나 투여경로의 변경이 필요한 치료제에 대한 다양한 질환 적용 가능하다. 상기 질환은 예컨대 유방암, 간암, 뇌암, 전립선암, 자궁암, 난소암, 위암, 식도암, 대장암, 직장암, 갑상선암, 혈액암, 피부암, 폐암 등을 포함하는 암, 당뇨병, 비만, 천식, 탈모증 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 시험관내에서 세포막 투과성 또는 상기 펩타이드를 이용한 약물의 세포막을 통한 세포내 전달을 관찰하기 위한 연구 목적으로 활용할 수도 있고, 암, 당뇨병 등 유전자 치료제 약물 또는 분자량이 큰 단백질 치료제 약물로 치료되는 질환의 치료에도 활용할 수 있다. 상기 펩타이드를 다양한 분자에 활용하여 조영제, 진단 시약 및 키트 등의 진단에도 활용할 수 있으며, 건강기능식품 (건강기능식품 조성물), 화장품 (화장료 조성물)에도 활용할 수 있으나, 상기 예시에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 'DNA', '폴리뉴클레오티드' 및 '핵산'은 특정한 종의 총 게놈 DNA에서 단리되어 있는 DNA 분자를 가리킨다. 그러므로, 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 조각(부분, segment)이란, 그 DNA 조각을 얻을 수 있는 종(species)의 총 게놈 DNA로부터 실질적으로 단리되거나, 또는 정제되어 있는 하나 이상의 코딩 서열(coding sequence)로 이루어지는 DNA 조각을 가리킨다. 용어 'DNA 조각' 및 '폴리뉴클레오티드'는 DNA 조각 및 상기 조각의 더 작은 단편을 포함하고, 또한 재조합 벡터(예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 살균 바이러스, 바이러스 등을 포함한다)를 포함한다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 단백질, 펩타이드 등을 발현하거나, 또는 발현할 수 있도록 개조된 것으로서, 게놈 서열, 게놈 외(extra-genomic) 서열, 플라스미드에 암호화된 서열 및 보다 작은 조작된 유전자 조각 등을 포함한다. 이러한 조각은 자연적으로 단리될 수 있고, 또는 사람의 손에 의해 합성적으로 변형될 수 있다.
당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(코드서열 또는 안티센스 서열)일 수 있고, 또는 이중 가닥일 수 있으며, 그리고 DNA 분자 (게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. 추가의 코딩(coding) 또는 비코딩(non-coding) 서열이 본발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있다. 또한 폴리뉴클레오티드는 다른 분자 및/또는 지지 재료에 연결될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 천연 서열을 포함할 수 있고, 또는 변이체, 또는 상기 서열의 생물학적인 기능적 등가물을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드 변이체는 아래에 추가로 기재된 것과 같은, 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있으며, 바람직하게 이러한 변형은 암호화된 폴리펩타이드의 원하는 활성이 비변형 폴리펩타이드와 비교하여 실질적으로 감소되지 않는 선에서 수행되는 것이다. 암호화된 폴리펩타이드의 활성에 대한 효과는 일반적으로 본 명세서에 기술된 바와 같이 평가될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 상기 펩타이드 또는 이의 변이체 펩타이드를 암호화하는 한, 그 구체적 서열이 특별히 제한되지 않고 어떠한 조합의 염기 서열(핵산 서열) 구성이 허용된다. 일례로, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 발현될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 그 코딩 서열 자체의 길이에 관계없이, 예컨대 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 추가적인 제한효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 코딩 조각(부분, segment) 등과 같은 다른 DNA 서열과 결합될 수 있고, 그 결과 자신의 전체 길이는 상당히 달라질 수 있다. 그러므로 거의 모든 길이의 폴리뉴클레오티드 단편이 적용될 수 있는 것으로 고려되며, 바람직하게 의도하는 재조합 DNA 프로토콜에서 제조 및 사용의 용이함에 의하여 그 전체 길이가 제한될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 및 이의 융합물은, 당업계에 공지되었고 이용가능한 것으로서 잘 확립된 기술들 중 임의의 것을 이용하여, 제조, 조작 및/또는 발현될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩타이드, 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 적절한 숙주 세포내에서 상기 폴리펩타이드의 발현을 지향하는 재조합 DNA 분자 내에 이용될 수 있다. 유전 암호(genetic code)의 고유한 축중(degeneracy)으로 인하여, 실질적으로(substantially) 동일하거나 또는 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 암호화하는 다른 DNA 서열들이 생성될 수 있고, 이들 서열들은 클로닝 및 주어진 폴리펩타이드를 발현하는데 이용될 수 있다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 몇몇의 경우에 있어서 천연에 존재하지 않는 코돈을 보유하는 뉴클레오타이드 서열(폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열)을 생산하는 것이 유리한 경우가 있다. 예를 들어, 특정 원핵 생물 숙주 또는 진핵생물 숙주에서 선호되는 코돈들이 단백질 발현 비율 증가 또는 원하는 특성(예를 들어, 천연에 존재하는 서열로부터 생성되는 전사물의 반감기보다 긴 반감기)을 가지는 재조합 RNA 전사물을 생산하도록 선택될 수 있다.
또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 다양한 이유(유전자 산물의 클로닝, 프로세싱, 발현 및/또는 활성을 변형하는 변경을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)로 펩타이드 암호화 서열을 변경하도록 당해 분야에서 일반적으로 공지 방법을 사용하여 조작될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
원하는 폴리펩타이드를 발현시키기 위해, 폴리펩타이드 또는 기능적 등가물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 적절한 발현 벡터(즉, 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위해 필요한 요소(엘레먼트)를 포함한 벡터) 내에 삽입할 수 있다. 당업자에게 잘알려진 방법으로 목적(interest)하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열, 및 적절한 전사 제어 요소(엘레먼트) 및 번역 제어 요소(엘레먼트)를 포함하는 발현벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법들은 in vitro 재조합 DNA 기술들, 합성 기술, 및 in vivo 유전자 재조합을 포함한다. 이러한 방법들은 하기의 문헌에 기재되어있다: Sambrook et al., Molecular Cloning,A Laboratory Manual(1989) 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(1989).
다양한 발현벡터/숙주 시스템이 공지되어있으며, 폴리뉴클레오티드 서열을 함유시키고 그리고 발현시키기 위해 이용될 수 있다. 상기 발현벡터/숙주 시스템은, 이들로서 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 재조합 박테리오파지, 플라스미드, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질 전환된 세균; 효모 발현벡터로 형질 전환된 효모; 바이러스 발현벡터(예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포계; 바이러스 발현 벡터(예를 들어, cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV) 또는 세균 발현 벡터(예를 들어, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포계; 또는 동물세포계 등의 미생물을 포함한다.
발현 벡터 내에 존재하는 '제어 요소(엘레먼트)' 또는 '조절 서열' 은, 전사 및 번역을 실행하도록 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 비번역 영역(인핸서, 프로모터, 5' 및 3' 비번역 영역)이다. 이러한 요소(엘레먼트)는 그 강도(strength) 및 특이성(specificity)을 달리할 수 있다. 이용되는 벡터계 및 숙주에 따라, 얼마든지 적절한 전사 요소 및 번역 요소(항시성 프로모터(constitutive promoter) 및 유도성 프로모터(inducible promoter) 포함)이 이용될 수 있다.
예를 들어, 세균계에 클로닝을 할 경우, PBLUESCRIPT 파지미드(Stratagene,La Jolla,Calif.) 또는 PSPORT1 플라스미드(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)의 하이브리드 lacZ 프로모터 등과 같은 유도성 프로모터가 이용될수 있다. 포유동물 세포계에 있어서, 포유동물 유전자들 또는 포유동물 바이러스들로 부터 유래하는 프로모터가 일반적으로 바람직하다. 폴리펩타이드를 암호화는 서열의 다중 복제본들(multiple copies)을 포함하는 세포주를 생성하는 것이 필요한 경우, SV40 또는 EBV 기반의 벡터들이 적절한 선택 마커와 함께 유용하게 이용될 수 있다.
세균계에 있어서, 다수의 발현벡터들이 펩타이드 발현을 위해 의도된 용도에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 대량으로 필요한 경우, 용이하게 정제되는 융합 단백질의 높은 수준으로의 발현을 지향하는 벡터들이 이용될 수 있다. 그러한 벡터로서, 이에 한정되는 것은 아니지만, 하기의 것들을 포함한다: 다기능성 E.coli 클로닝 벡터 및 발현 벡터, 예를 들어 BLUESCRIPT((Stratagene), 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열이 β-갈락토시다제의 아미노-말단 Met 및 그에 후속하는 7개 잔기에 대한 서열과 인 프레임(in frame)으로 벡터 내에 연결되고, 그 결과 하이브리드 단백질이 생산된다); pIN 벡터(Van Heeke 및 Schuster, J.Biol.Chem.264:5503 5509(1989)); 등등. pGEX 벡터(Promega,Madison,Wis.)도 또한 글루타티온 S전이효소(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩타이드들을 발현시키기 위해 이용될 수 있다. 일반적으로 그러한 융합 단백질은 가용성이며, 그리고 글루타티온-아가로오스 비즈(glutathione-agarose bead)에 흡착시키고 뒤이어 유리 글루타티온(free glutathione)의 존재하에서 용출시킴으로서, 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. 이러한 시스템에서 제작된 단백질들은, 복제된 폴리펩타이드가 GST moiety로부터 방출될수 있도록, 헤파린, 트롬빈, 또는 Factor Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하여 설계될 수 있다.
효모(Saccharomyces cerevisiae)에 있어서, 항시적(constitutive) 프로모터 또는 유도성 프로모터들(예를 들어 알파 인자, 알코올 옥시다제 및 PGH)을 포함한 다수의 벡터가 이용될 수 있다. 이는 Ausubel et al(supra). 및 Grant et al., Methods Enzymol.153:516~544(1987)등을 참조로 하여 이해될 수 있다.
식물 발현 벡터를 이용할 경우, 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 발현은 임의의 다수의 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 프로모터(예를 들어, CaMV의 35S 프로모터 및 19S프로모터)는 단독으로 이용될 수 있고, 또는 TMV로부터 유래하는 ω(오메가) 리더 서열과 조합하여 이용될 수 있다(Takamatsu, EMBO J.6:307~311(1987)). 혹은, 식물 프로모터(예를 들어, RUBISCO의 작은 서브유닛 또는 열 쇼크 프로모터(heat shock promoter)를 이용할 수 있다(Coruzzi,G. et al., EMBO J. 3:1671~1680(1984); Broglie et al., Science 224:838~843(1984); 및 Winter et al., Results Probl. Cell Differ.17:85~105(1991)). 이들 구축물들은 직접적 DNA 형질전환 또는 병원체-매개성 트랜스펙션에 의해 식물세포 내에 도입될 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있다.
곤충계 또한 목적하는 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 시스템에서, AcNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)가 Spodoptera frugiperda 세포 또는 Trichoplusia larvae에 있어서 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 이용된다. 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 바이러스의 비필수 영역 내에 클로닝 될 수 있고, 예를 들어, polyhedrin 유전자 등, polyhedrin 프로모터의 제어 하에 위치될 수 있다. 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 성공적인 삽입은 polyhedrin 유전자가 불활성화되게 만들고 코트(coat) 단백질이 결손되어있는 재조합 바이러스를 생산한다. 그 다음에 상기 재조합 바이러스는 예를 들어 S.frugiperda 세포 또는 Trichoplusia larvae 등을 감염시키기 위해 사용될 수 있고, 여기서 목적하는 폴리펩타이드가 발현될 수 있다(Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3224~3227(1994)).
포유동물 숙주 세포에 있어서, 다수의 바이러스-기반 발현 시스템이 일반적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 아데노바이러스가 발현 벡터로서 이용될 경우, 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 후기 프로모터(late promoter) 및 3자 리더 서열(tripartite leader)로 구성되는 아데노바이러스 전사/번역 복합체 내에 연결될 수 있다. 바이러스 게놈(genome)의 비필수 E1 또는 E3 영역으로의 삽입을 이용하여, 감염된 숙주 세포에서 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 생존 바이러스를 얻을 수 있다. 또한 포유동물 숙주 세포의 발현 증대를 위하여 전사 인핸서(예를 들어 Rous Sarcoma Virus(RSV) 인핸서)가 이용될 수 있다.
또한, 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 보다 효율적인 번역을 위하여, 특정 시작 신호(initiation signal)이 이용될 수 있다. 이러한 신호로는 ATG 시작 코돈 및 인접 서열을 들 수 있다. 폴리펩타이드를 암호화하는 서열, 이의 시작 코돈, 및 상류 서열(upstream sequence)이 적절한 발현 벡터 내에 삽입될 경우, 추가의 전사 제어 시그널 또는 번역 제어 시그널이 필요하지 않을 수 있다. 그러나 오직 코딩 서열만, 또는 이의 일부만이 삽입될 경우, ATG 시작 코돈을 포함하는 외인성 번역 제어 시그널이 제공되어야 한다. 또한 시작 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해, 올바른 리딩 프레임 내에 있어야한다. 외인성 번역 요소들(엘리먼트) 및 시작 코돈은 다양한 기원(천연 및 합성의 양쪽 모두)에서 유래할 수 있다. 발현의 효율은 이용되는 특정 세포계에 적절한 인핸서를 넣는 것에 의해 증강될 수 있다.
또한 숙주 세포주는, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 또는 원하는 방식으로 발현된 단백질을 처리(프로세싱)하는 그 능력에 따라 선택될 수 있다. 폴리펩타이드의 그러한 변경으로서는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함한다. 단백질의 'prepro' 형태를 절단하는 번역후 프로세싱(post-translational processing)은, 정확한 삽입, 접힘 및/또는 기능을 촉진시키기 위해 이용될 수 있다. 다른 숙주 세포(예를 들면 CHO, HeLa, MDCK, HEK293 및 W138, 이들은 그러한 번역-후 활성에 대한 특정 세포 기구(machinery) 및 특징적 매커니즘(mechanisms)을 가진다)는 외래 단백질의 정확한 변경(modification) 및 가공(processing)을 보장하기 위해 선택될 수 있다.
장기적으로, 재조합 단백질의 고수율의 생산을 위해서는, 안정적인 발현이 일반적으로 바람직하다. 예를 들어, 목적하는 폴리뉴클레오티드를 안정적으로 발현하는 세포주는 발현 벡터를 이용하여 형질전환 될 수 있으며, 상기 발현 벡터는 바이러스복제 기점 및/또는 내인성 발현 요소(엘리먼트), 및 동일한 벡터 또는 별개의 벡터 상에서 선택마커 유전자를 포함할 수 있다.
상기 벡터의 도입 후, 세포는 증식배지(enriched media)에서 1~2일간 증식될 수 있으며, 그 후에 선택 배지(selective media)로 변환된다. 선택 마커의 목적은 선택에 대한 내성을 부여하는 것이며, 그리고 이의 존재는 도입된 배열이 성공적으로 발현되고 있는 세포의 성장 및 회수를 허용한다. 안정적으로 형질 전환된 세포의 내성 클론은 그 세포형(cell type)에 적절한 조직배양 기술을 이용하여 증식될 수 있다.
다수의 선택 시스템을 이용하여 형질전환된 세포주를 회수할 수 있다. 이러한 선택시스템으로서는, 이에 제한되지 않지만, 각각, tk-세포 또는 aprt-세포에 사용될 수 있는, herpes simplex virus thymidine kinase (Wigler et al., Cell 11:223~232(1977)) 및 adenine phosphoribosyltransferase (Lowy et al., Cell 22:817~823(1990)) 유전자를 들수 있다.
또한 대사길항물질(antimetabolite) 내성, 항생물질 내성, 또는 제초제 내성이 선택을 위한 기초로서 이용될 수 있다. 예를 들어 methotrexate에 대한 내성을 부여하는 dhfr(Wigler et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:3567~70(1980)); 아미노글리코시드, 네오마이신 및 G-418에 대한 내성을 부여하는 npt(Colbere-Garapin et al., J.Mol.Biol.150:1~14(1981)); 및 각각 클로르설프론 및 포스피노트리신 아세틸 전이효소(phosphinotricin acetyltransferase)에 대한 내성을 부여하는 als 또는 pat(전술한 Murry, 문헌 참조). 추가적인 선택 유전자가 공지되어 있으며, 예를 들어 세포가 트립토판 대신에 인돌을 이용하는 것을 가능하게 하는trpB, 또는 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀(histinol)을 이용하는 것을 가능하게 하는 hisD 등이 있다(Hartman 및 Mulligan, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:8047~51(1988)). 안토시아닌, β-글루쿠로니다제와 이의 기질인 GUS, 및 루시페라제와 이의 기질인 루시페린과 같은 가시의 마커(visible marker)들은 인기를 얻고 있으며, 형질 전환체를 동정하기 위해서 뿐만아니라 특정 벡터 시스템에 기인하는 일시적인(transient) 단백질 발현 또는 안정적인 단백질 발현의 양을 정량하기 위해서도 널리 이용되고 있다.
폴리뉴클레오티드가 코드하는 산물에 특이적인 다클론 항체 또는 단일 클론 항체 중 어느 하나를 이용하여, 상기 폴리뉴클레오티드가 코드하는 산물의 발현을 검출 및 측정하기 위한 다양한 프로토콜들이 당업계에 알려져 있다. 예로서, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), RIA(radioimmunoassay) 및 FACS(fluorescence activated cell sorting) 등을 들 수 있다. 상기 어세이 방법 및 추가의 다른 어세이 방법은 하기의 문헌을 참조로 할 수 있다: Hampton et al., Serological Methods,a Laboratory Manual(1990) 및 Maddox et al., J.Exp.Med.158:1211~1216(1983). 다양한 표지 기술 및 컨쥬게이션(cojugation) 기술이 당업자에게 공지되었으며, 이는 다양한 핵산 어세이(assay) 및 아미노산 어세이에 이용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 관련된 서열을 검출하기 위해 표지된 혼성화(labeled hybridization) 프로브 또는 표지된 PCR 프로브를 제작하기 위한 수단으로는, 올리고표지(oligolabeling), 닉 트랜슬레이션(nick translation), 말단 표지 또는 표지된 뉴클레오타이드를 사용하는 PCR 증폭을 들 수 있다. 또는, mRNA 프로브의 생산을 위해, 상기 서열 또는 그 임의의 부분이 벡터 내에 클로닝될 수 있다. 그러한 벡터는 당업계에 공지되어 시판되고 있으며, 적절한 RNA 중합효소(예를 들어 T7, T3, 또는 SP6) 및 표지된 뉴클레오타이드를 첨가함으로써 in vito 상에서 RNA 프로브를 합성하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 절차들은 시판되고 있는 다양한 키트를 이용하여 수행될 수 있다. 적절한 리포터 분자 또는 표지로서는, 방사성핵종(radionuclides), 효소, 형광제, 화학발광, 또는 발색제(chromogenic agent), 기질, 보인자, 억제제, 자기(magnetic) 입자 등을 들 수 있다.
목적하는 폴리뉴클레오티드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 단백질의 발현 및 세포 배양물로부터의 회수에 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다. 재조합 세포에 의해 생산된 단백질은 그 서열 및/또는 벡터에 따라 분비되거나 또는 세포 내에 함유되어 있을 수 있다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 원핵세포 막 또는 진핵세포막을 통해 폴리펩타이드의 분비를 지향하는 시그널 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을, 수용성 단백질의 정제를 촉진하는 폴리펩타이드 도메인을 암호화하는 서열과 연결하기 위해, 다른 재조합 구축물들이 이용될 수 있다.
재조합 생산 방법에 더하여, 본 발명의 폴리펩타이드 및 그 단편은 고체상 기술(solid phase technique)을 이용한 직접적 펩타이드 합성에 의해 생산될 수 있다. 단백질 합성은 수동 기술(manual technique)을 이용하여 수행될 수 있으며 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화 합성은, 예를 들어 Applied Biosystems 431 A Peptide Syntthesizer(Perkin Elmer)를 이용하여 달성될 수 있다. 또는, 다양한 단편들이 개별적으로 화학적으로 합성되고, 그후 전장(full length) 분자를 생산하기 위해 화학적 방법을 이용하여 조합될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 유전자 치료 기술을 이용하여 생체 내(in vivo)로 피험체에 전달될 수 있다. 유전자 치료란 일반적으로 이러한 치료가 요구되는 장애 또는 증상을 가지는, 포유동물, 특히 사람의 특정 세포, 표적 세포에 대한 이종의 핵산 이입을 가리킨다. 핵산이 선택된 표적 세포에 도입되고, 이종의 DNA가 발현되며 그것에 따라 코드된 치료 산물이 생산된다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 유전자 치료에 이용 가능한 다양한 바이러스 벡터로서, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아(vaccinia), AAV(adeno-associated virus), 또는 바람직하게 레트로바이러스와 같은 RNA 바이러스를 들 수 있다. 바람직하게, 레트로바이러스 벡터는 설치류(murine) 또는 조류(avian)의 레트로바이러스 유도체이거나, 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 바람직한 레트로바이러스 벡터는 렌티 바이러스 벡터일 수 있다. 단일 외인성 유전자가 삽입될 수 있는 레트로바이러스 벡터의 예로서, 이에 제한되는 것은 아니나, 하기의 것들을 포함한다: Moloney murine leukemia virus (MoMuLV), Harvey murine sarcoma virus (HaMuSV), murine mammary tumor virus (MuMTV), SIV, BIV, HIV and Rous Sarcoma Virus (RSV). 다수의 추가적인 레트로바이러스 벡터들은 다수의 유전자를 함유(incorporate)할 수 있다. 이들 모든 벡터는 형질도입된 세포가 동정되고 생산될수 있도록, 선택 마커 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 목적하는 징크핑거(zinc finger)-유래 DNA 결합 폴리펩타이드 서열을, 특정 표적 세포 상의 수용체를 위한 리간드를 암호화하는 다른 유전자와 함께 바이러스성 벡터에 삽입함으로써, 상기 벡터가 표적 특이적이 될 수 있다.
레트로바이러스 벡터는, 예를 들어, 폴리펩타이드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 삽입함으로써 표적 특이적이 될 수 있다. 예시적으로, 표적화는 레트로바이러스 벡터를 표적하는 항체를 이용함으로써 달성할 수 있다. 당업자는, 징크핑거(zinc finger)-뉴클레오타이드 결합 단백질 폴리뉴클레오티드를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 표적 특이적으로 전달할 수 있도록 하기 위한, 레트로바이러스 게놈 중에 삽입될 수 있는 특이적 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서 정통하고 있어 과도한 실험을 하지 않고도 용이하게 확인할 수 있다.
재조합 레트로바이러스는 결손(defective)되어 있기 때문에, 감염성 벡터 입자를 생산하기 위한 보조(assistance)가 필요하다. 이러한 보조는, 예를 들어 LTR 내 조절 서열의 제어하에서 레트로바이러스의 모든 구조 유전자를 코드하는 플라스미드를 포함한 헬퍼(helper) 세포주를 이용함으로써, 제공될 수 있다. 이들 플라스미드는 캡슐화(encapsulation)를 위한 RNA 전사물을 인식하는 패키징 매커니즘(packaging mechanism)을 가능하게 하는 뉴클레오타이드 서열을 상실하고 있다. 패키징 시그널이 결손되어 있는 헬퍼 세포주로서는, 이에 제한되지 않지만, 예를 들어 PSI.2, PA317 및 PA12 등을 포함한다. 이들 세포주는 게놈이 패키징되어 있지 않기 때문에 빈 비리온(empty virion)을 생산한다. 만일 패키징 시그널이 온전하고 구조유전자가 목적하는 다른 유전자로 대체된 세포 중에 레트로바이러스 벡터가 도입된다면, 상기 벡터는 패키지되고 벡터 비리온(vector virion)을 생산할 수 있다. 그 다음에, 상기 방법에 의해 생산된 백터 비리온은 조직 세포주(예를 들어, NIH3T3 세포)를 감염하는데 사용될 수 있고, 이로써 다량의 키메라 레트로바이러스 비리온(chimeric retroviral virion)이 생산된다.
본 발명은 세포 투과 촉진용 제제를 제조하기 위한 상기 펩타이드를 포함하는 물질의 용도를 제공한다.
본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 물질을 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 세포 투과 촉진 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 ‘유효량'이란 개체에게 투여하였을 때, 세포 투과의 개선, 검출, 진단 또는 세포 투과 촉진 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 ‘개체’란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 펩타이드 및 생물학적 활성물질을 포함하는 복합체(complex)를 제공한다.
본 발명에 있어서 복합체는 하나 이상의 펩타이드에 하나 이상의 생물학적 활성물질이 포함된 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 "복합체"에서 상기 펩타이드와 생물학적 활성물질은 1 : 1, 1 : 다수, 다수 : 1, 다수 : 다수의 비율로 포함된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 펩타이드와 상기 생물학적 활성물질은 1 : 1 내지 1 : 100, 또는 100 : 1 내지 1 : 1의 몰비로 포함된 것일 수 있다. 그러나 상기 몰비는 예시적인 것이며 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 상기 복합체는 펩타이드와 생물학적 활성물질이 단순히 혼합 (mixing)된 것, 펩타이드와 생물학적 활성물질이 혼합되어 형성된 것, 또는 이들이 화학결합에 의해 연결되거나 컨쥬게이션되어 생성된 것을 모두 포함한다. 또한 복합체는 물리적 결합, 화학적 결합, 공유 결합, 비공유 결합으로 연결되거나, 매개체를 이용하여 통합된 또는 융합된 형태로 연결될 수 있다. 목적 물질이 단백질인 경우는 단백질을 코딩하는 서열에 펩타이드의 코딩 서열을 추가하여 여러 링커와 연결한 후 융합 단백질 (fusion protein)의 형태로 세포를 투과하거나 조직, 혈액으로 운반될 수 있으나 복합체를 형성하는 방법에는 제한이 없다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 "복합체"는 상기 펩타이드와 생물학적 활성물질이 단순히 혼합 (mixture)된 상태일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 "복합체"는 상기 펩타이드와 생물학적 활성물질이 혼합 (mixture)에 의해 복합체를 이룬 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 펩타이드와 생물학적 활성물질은 완충액에 용해되어 일정 몰비로 혼합될 수 있으며, 혼합 후 안정화를 위해 일정한 온도, 예를 들어 상온에서, 또는 4 냉장 온도에서 일정 시간, 예를 들어 1 초 내지 1 시간 동안 방치될 수 있다. 상기 온도 및 시간은 예시적인 것이며 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 "복합체"는 상기 펩타이드와 생물학적 활성물질이 서로 융합 (fusion)된 상태로 발현되어 이룬 복합체가 될 수 있다. 예를 들어, 하나의 벡터 내에 상기 펩타이드와 생물학적 활성물질을 발현하는 유전자를 삽입한 후, 상기 벡터로 생물을 형질전환시켜 벡터에 삽입된 유전자를 발현하도록 하면, 상기 펩타이드와 생물학적 활성물질이 융합 단백질 (fusion protein)로서 발현될 수 있다. 융합 단백질로 발현될 때, 상기 펩타이드와 생물학적 활성물질 간에 임의의 링커가 포함되도록 할 수 있다. 예를 들어 상기 링커는 1 개 이상의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커가 될 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 예를 들어, 1 내지 100 개 또는 2 내지 50 개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 펩타이드 링커는, 예컨대, Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 한편, 상기 링커는 상기 복합체의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 즉, 상기 링커는 Gly, Asn, Ser, Thr 및 Ala로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 총 1 내지 100 개 또는 2 내지 50 개 포함하여 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 생물학적 활성물질은 세포 내 (세포질 또는 핵 내)로 투과되어 생리활성조절에 관여하거나 약리효과를 발현할 수 있는 것 또는 운반되어 작용해야 하는 세포 내, 조직 내, 세포간질, 혈액 등 다양한 생체 내 부위에서도 생물학적 활성을 갖는 물질을 의미한다. 예를 들어, 본 발명에 있어서 생물학적 활성물질은 화합물 (chemical compound), 단백질, 당단백질, 펩타이드, 뉴클레오티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 당지질, 천연물 (natural product), 반합성 물질 (semi-synthetic substance), 나노입자, 리포좀, 지질 기반 제제 (lipid-based formulation), 바이러스, 양자점 (quantum dots), 형광색소 (fluorochrome) 및 약물 (drug)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 약물 (drug)은 화합물 약물 (chemical drug), 바이오 약물 (biodrug), 핵산 약물 (nucleic acid drug), 펩타이드 약물 (peptide drug), 단백질 약물 (protein drug), 천연물 약물 (natural product drug), 반합성 약물 (semi-synthetic drug), 지질 약물 (lipid drug), 효소 (enzyme), 조절 인자 (regulatory factor), 성장인자 (growth factor), 호르몬 (hormone), 조영제 (contrast agent) 및 항체 (antibody)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 펩타이드와 유전물질의 융합체를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 유전자 치료용 제제를 제조하기 위한 상기 펩타이드와 유전물질의 융합체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 펩타이드와 유전물질의 융합체를 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 유전자 치료 방법을 제공한다.
상기 유전물질이란 "핵산"으로 표현될 수 있으며, DNA, decoy DNA, plasmid, siRNA, shRNA, 올리고핵산, 압타머 (aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 RNA, 마이크로 RNA (microRNA), 올리고리보뉴크레오티드, 및 전달 RNA (transfer RNA) 등이 가능하며, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 생화학적으로 변형하여 생체내에서의 구조적 안정성을 극대화하기 위한 locked nucleic acids (LNA), Peptide Nucleic Acids (PNA), phosphorodiamidate morpholino oligomer (PMO), hexitol nucleic acids (HNA) 등이 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다
또한 본 발명은
a) 상기 펩타이드를 생물학적 활성물질과 결합시켜 복합체를 제조하는 단계; 및
b) 상기 복합체를 인간을 제외한 포유동물의 생체 또는 세포 내로 주입하는 단계를 포함하는 생물학적 활성물질의 전달방법을 제공한다.
본 발명의 신규한 세포 투과성 펩타이드는 세포, 조직, 혈액 등 생체 내로 효과적으로 침투할 수 있다.
도 1a 내지 1f를 포함하는 도 1은 본 발명의 펩타이드들을 다양한 농도로 BEAS-2B 세포 또는 HeLa 세포에 처리하고, 15 분 후(1a, 1b), 30분 후 (1c, 1d) 및 2시간 후(1e, 1f) 세포 내 투과정도를 분석한 결과이다.
도 2a 및 2b를 포함하는 도 2는 본 발명의 펩타이드를 다양한 농도로 BEAS-2B 세포 또는 HeLa 세포에 처리하고, BEAS-2B 세포에서 30 분 후 형광 현미경으로 분석하였고(2a), HeLa 세포에서 2 시간 후 형광 현미경으로 분석한 결과(2b)이다.
도 3a 및 도3b를 포함하는 도 3은 본 발명의 펩타이드를 다양한 농도로 BEAS-2B 세포 또는 HeLa 세포에 처리하고, BEAS-2B 세포에서 24 시간 및 48 시간 후 세포 독성 정도를 분석하였고(3a), HeLa 세포에서 24 시간 및 48 시간 후 세포 독성 정도를 분석한 결과이다(3b).
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 세포 투과성 펩타이드의 제작
세포 투과성을 나타내는 펩타이드를 제작하기 위해 하기 표 1에 나타낸 서열번호 1 내지 10의 각 펩타이드를 순도 95% 이상이 되도록 제작하였다. 이 펩타이드 합성은 아이큐어펩젠㈜에 의뢰하여 진행하였다.
서열번호 명칭 서열
서열번호 1 BCP 1 MIIFRASEQLDK
서열번호 2 BCP 2 MIIFRVLEQSEK
서열번호 3 BCP 3 MIIFRIFLHLQK
서열번호 4 BCP 3 MIIFRLFLHLNK
서열번호 5 BCP 3 MIIFRLSATVKK
서열번호 6 BCP 3 MIIFRSTALVKK
서열번호 7 BCP 3 MIIFRLSATA KK
서열번호 8 BCP 3 MIIFRFYEDA FK
서열번호 9 BCP 3 MIIFRKKEDKDK
서열번호 10 BCP 3 MIIFRRLRRHKK
서열번호 11 TAT (대조군) GRKKRRQRRR
실시예 2: 세포 투과성 펩타이드의 세포 내 투과 양상 확인
본 발명의 펩타이드의 세포 내 투과 양상을 형광 현미경으로 확인하였다.
이를 위하여 상기 실시예 1에서 제작한 서열번호 1 내지 10의 각 펩타이드의 아미노 말단에 로다민(Rhodamine) 형광 염료를 표지(labelling) 하였다. BEAS-2B 세포 또는 HeLa 세포에 다양한 농도의 BCP1 내지 BCP10의 펩타이드를 처리한 후 15분, 30분 및 2시간 경과 후 세포 내 펩타이드의 농도를 평가하였다. 대조군으로는 TAT 펩타이드(GRKKRRQRRR) (서열번호 11)를 사용하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 BCP1 내지 BCP10의 펩타이드는 모두 대조군으로 사용된 TAT보다 월등히 향상된 세포 투과도를 나타낸 것으로 확인되었다
그 다음으로, 10μM 과 50μM의 농도로 펩타이드 BCP3, BCP4, BCP5를 BEAS-2B 세포 또는 HeLa 세포에 처리하였고, 대조군 TAT도 같은 농도로 처리하였다. 단, 세포 접종시 세포 배양 슬라이드에 접종하였는데, 이는 형광 현미경 관찰시 플라스틱은 형광간섭현상을 유발하기 때문이다. 세척 후 mounting medium with DAPI를 사용하여 유리 커버 글라스를 슬라이드 글라스에 밀착시켜 형광 현미경 400배로 시료를 관찰하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, BCP3, BCP4 및 BCP5는 모두 대조군으로 사용된 TAT보다 월등히 향상된 세포 투과도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 세포 투과성 펩타이드의 세포 독성 확인
본 발명의 펩타이드의 세포 내 투과 활성이 세포독성으로 인해 세포막이 약해져서 발생한 것인지 확인하기 위해 다음과 같이 세포독성을 확인하였다.
상기 실시예 2와 동일한 방법으로 세포에 준비한 펩타이드들을 농도별(0, 1, 10, 100 μM)로 배양배지에 처리하고, 24 시간과 48 시간 처리하였다. 각 웰에 10ul의 CCK-8을 첨가하고 37℃의 가습조건이 유지되는 5% CO2 인큐베이터에서 3시간 후 마이크로 플레이트 흡광도 판독기(SYNERGY H1 microplate reader, BIO-TEK)를 사용하여 460 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 10μM의 농도까지 아무런 세포독성을 나타내지 않았으며, 100μM의 농도에서도 세포 투과도 실험 결과에 영향을 줄 수 있는 정도의 세포독성은 확인되지 않았다.
본 발명의 신규 세포 투과성 펩타이드는 세포, 조직, 혈액 등 생체 내로 효과적으로 침투할 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.

Claims (17)

  1. 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드:
    MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6
    상기 식에서,
    R1은 A, V, I, L, S, F, K 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
    R2는 S, L, F, T 및 Y로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
    R3는 E, L, A 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
    R4는 Q, H, T, L, D 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
    R5는 L, S, V, A, K 및 H로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
    R6는 DK, EK, QK, NK, KK 및 FK로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 디펩타이드이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항의 펩타이드를 포함하는 물질의 세포 투과 촉진용 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  6. 제5항의 벡터로 형질전환된 세포.
  7. 세포 투과 촉진용 제제를 제조하기 위한 제1항 또는 제2항의 펩타이드를 포함하는 물질의 용도.
  8. 제1항 또는 제2항의 펩타이드를 포함하는 물질을 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 세포 투과 촉진 방법.
  9. 제1항 또는 제2항의 펩타이드 및 생물학적 활성물질을 포함하는 복합체(complex).
  10. 제9항에 있어서, 상기 생물학적 활성물질은 화합물 (chemical compound), 단백질, 당단백질, 펩타이드, 뉴클레오티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 당지질, 천연물 (natural product), 반합성 물질 (semi-synthetic substance), 나노입자, 리포좀, 지질 기반 제제 (lipid-based formulation), 바이러스, 양자점 (quantum dots), 형광색소 (fluorochrome) 및 약물 (drug)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 복합체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 약물은 화합물 약물 (chemical drug), 바이오 약물 (biodrug), 핵산 약물 (nucleic acid drug), 펩타이드 약물 (peptide drug), 단백질 약물 (protein drug), 천연물 약물 (natural product drug), 반합성 약물 (semi-synthetic drug), 지질 약물 (lipid drug), 효소 (enzyme), 조절 인자 (regulatory factor), 성장인자 (growth factor), 호르몬 (hormone), 조영제 (contrast agent) 및 항체 (antibody)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 복합체.
  12. 제1항 또는 제2항의 펩타이드와 유전물질의 융합체를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료용 조성물.
  13. 유전자 치료용 제제를 제조하기 위한 제1항 또는 제2항의 펩타이드와 유전물질의 융합체의 용도.
  14. 제1항 또는 제2항의 펩타이드와 유전물질의 융합체를 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 유전자 치료 방법.
  15. a) 제1항 또는 제2항의 펩타이드를 생물학적 활성물질과 결합시켜 복합체를 제조하는 단계; 및
    b) 상기 복합체를 인간을 제외한 포유동물의 생체 또는 세포 내로 주입하는 단계를 포함하는 생물학적 활성물질의 전달방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 생물학적 활성물질은 화합물 (chemical compound), 단백질, 당단백질, 펩타이드, 뉴클레오티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 당지질, 천연물 (natural product), 반합성 물질 (semi-synthetic substance), 나노입자, 리포좀, 지질 기반 제제 (lipid-based formulation), 바이러스, 양자점 (quantum dots), 형광색소 (fluorochrome) 및 약물 (drug)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 약물은 화합물 약물 (chemical drug), 바이오 약물 (biodrug), 핵산 약물 (nucleic acid drug), 펩타이드 약물 (peptide drug), 단백질 약물 (protein drug), 천연물 약물 (natural product drug), 반합성 약물 (semi-synthetic drug), 지질 약물 (lipid drug), 효소 (enzyme), 조절 인자 (regulatory factor), 성장인자 (growth factor), 호르몬 (hormone), 조영제 (contrast agent) 및 항체 (antibody)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
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