KR20220085522A - 세포막 투과성을 갖는 신규 펩타이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포막 투과성을 갖는 신규 펩타이드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상용 TAT 펩타이드와 비교하여 향상된 세포 투과성을 나타내는 세포 투과성 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 신규 세포 투과성 펩타이드는 세포, 조직, 혈액 등 생체 내로 효과적으로 침투할 수 있다.

Description

세포막 투과성을 갖는 신규 펩타이드{Novel peptides having cell penetrating activity}

본 발명은 세포막 투과성을 갖는 신규 펩타이드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상용 TAT 펩타이드와 비교하여 향상된 세포 투과성을 나타내는 세포막 투과성을 갖는 신규 펩타이드에 관한 것이다.

일반적으로 단백질, DNA와 같은 고분자로 된 생물학적 활성 물질은 친수성 및 소수성의 인지질 이중층을 통과할 수 없기 때문에 세포막을 투과해 세포 내로 들어갈 수 없다. 하지만 수용체와 같은 다른 분자의 도움 없이 세포막을 가로지를 수 있는 세포 투과성 펩타이드(Cell penetrating peptide)가 알려져 있다.

세포 투과성 펩타이드는 CPP(Cell penetrating peptide), MTS(membrane-translocating sequences)라고도 불리는 데, 수송대상체에 결합된 형태 또는 혼합된 형태로 세포막을 통과해 단백질, DNA, RNA 등의 운반 대상을 세포 내 뿐만 아니라 세포질, 세포내 소기관, 핵 안에까지 운반할 수 있다.

HIV-1(Human immunodeficiency virus-1)의 감염 기작 중 하나로 TAT라는 물질의 세포막을 투과하는 현상이 확인된 첫 번째 단백질로써, 이로부터 유래한 TAT 펩타이드는 가장 많이 적용되고 활발한 연구가 진행되고 있다.

TAT 펩타이드를 이용하여 β-galactosidase, horseradish peroxidase, RNase A, domain of Pseudomonas exotoxin A (PE)등을 세포내로 전달해서 그 기능과 세포 내의 localization에 대한 연구가 진행된 바 있고, TAT 펩타이드는 세포막에 존재하는 Heparan sulfate와의 상호작용 후 발생하는 Lipid Raft가 관여하는 엔도시토시스(Endocytosis)에 의한 것임을 밝혀졌다.

이외에도, 초파리의 발생과정에 필수적인 전사인자인 Antennapedia homeoprotein으로부터 유래한 16개의 아미노산 서열로 구성된 Penetratin (Antp)이라는 세포 투과성 펩타이드, HSV-1 (Herpes simplex virus type 1)이 발현하는 단백질인 VP22로부터 유래한 동명의 세포 투과성 펩타이드 VP22, 인공적으로 합성해낸 27개의 아미노산 서열로 이루어진 Transportan, 세포 투과성 펩타이드에서 가장 중요한 기능을 담당할 것이라고 예상되는 아르기닌을 인공적으로 반복시킨 폴리아르기닌 (Poly-Arginine) 등이 세포 투과성 펩타이드로 잘 알려져 있다.

이러한 종래 세포 투과성 펩타이드들은 HIV-1과 같은 바이러스 단백질로부터 유래한 서열이거나, 초파리와 같은 다른 종이 발현하는 단백질로부터 유래한 것들이거나, 종래 세포 투과성 펩타이드를 구성하는 아미노산 서열 분석을 통해 특징적인 아미노산 서열을 선정, 인공적으로 합성해 낸 아미노산 서열이라는 점에서, 인체에 적용해서 사용할 때에 면역 반응 등의 부작용을 일으킬 소지가 있었다.

또한, 이들은 비교적 긴 아미노산 사슬로 이루어져 있어서 원치 않는 면역반응을 일으킬 가능성이 더 크고, 전달하고자 하는 단백질의 구조 및 기능에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 세포 내로 전달하고자 하는 생물학적 활성 물질과 연결할 때에 효율이 저하되는 문제가 있었다.

한편, 최근에 치료목적의 약물과 펩타이드 그리고 단백질을 세포 안으로 도입하는 실험들이 활발히 진행되고 있다. 그러나 이들 방법은 모두 일부의 세포에만 핵산을 전달할 수 있다는 한계이며, 세포막에 손상을 입혀 독성을 나타내는 문제점이 있다.

이에, 본 발명자는 생물학적 활성물질을 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있는 세포 투과성 펩타이드를 개발하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 일련의 서열을 나타내는 TCTP 단백질 (translationally controlled tumor protein) 유래의 CPP 변이체들이 상용 TAT 펩타이드보다 월등한 세포 투과성을 나타낸다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드를 제공하는 것이다:

MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6

상기 식에서,

R1은 A, V, I, L, S, F, K 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,

R2는 S, L, F, T 및 Y로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,

R3는 E, L, A 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,

R4는 Q, H, T, L, D 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,

R5는 L, S, V, A, K 및 H로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,

R6는 DK, EK, QK, NK, KK 및 FK로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 디펩타이드이다.

본 발명의 다른 목적은 펩타이드를 포함하는 물질의 세포 투과 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.

전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드를 제공한다:

MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6

상기 식에서,

R1은 A, V, I, L, S, F, K 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,

R2는 S, L, F, T 및 Y로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,

R3는 E, L, A 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,

R4는 Q, H, T, L, D 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,

R5는 L, S, V, A, K 및 H로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,

R6는 DK, EK, QK, NK, KK 및 FK로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 디펩타이드이다.

전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 포함하는 물질의 세포 투과 촉진용 조성물을 제공한다.

전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명의 실시는, 특별히 반대로 나타내지 않는 이상, 본 발명이 속하는 기술 분야 내의 분자생물학 및 재조합 DNA 기술의 종래 방법을 사용하고, 설명을 위한 목적으로서 대부분이 아래(문헌)에 기재되어있다. 이러한 기술은 문헌 중에 상세하게 설명된다: Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, ed., 1984).

본 명세서에 인용되는 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그 전체가 참고로서 본 명세서에 원용된다.

본 명세서에 개시된 내용 전반에 걸쳐서, 본 발명과 관련된 다양한 양상 또는 조건들이 범위 형식으로 제안될 수 있다. 본 명세서에서 범위값의 기재는, 별다른 언급이 없는 한 해당 경계값을 포함하는 것으로서 즉, 하한값 이상 내지 상한값 이하의 값을들 모두 포함하는 의미이다. 범위 형식의 서술은 단순히 편의성 및 간략성을 위한 것이며, 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한(inflexible limitation)으로서 해석되지 않아야 하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 서술은 상기 범위 내의 개별적인 수치값들뿐만 아니라 모든 가능한 하부범위(subrange)를 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 7 내지 170과 같은 범위의 서술은 상기 범위 내의 개별적 수치들, 예를 들어, 9, 27, 35, 101, 및 155 뿐만 아니라, 10 내지 127, 23 내지 35, 80 내지 100, 50 내지 169 등과 같은 하부범위들을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭과 무관하게 적용된다.

본 발명의 용어 '~을 포함하는(comprising)'이란 '함유하는' 또는 '특징으로 하는'과 동일하게 사용되며, 조성물 또는 방법에 있어서, 언급되지 않은 추가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다.

본 명세서 사용된 용어 '펩타이드' 및 '단백질'은 통상(종래)의 의미에 따라 사용되는 것으로, 즉 아미노산의 배열을 의미한다. 펩타이드는 특정의 길이로 한정되지 않지만, 본 발명의 문맥에서는 일반적으로 전장(full length) 단백질의 단편을 나타내며, 번역후의 수식, 예를 들면 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등 및 해당 분야에 공지된 다른 수식(자연적으로 발생하는 수식 및 비자연적 발생의 수식)을 포함할 수 있고 “폴리펩타이드”로 표현될 수도 있다. 본 발명의 펩타이드 및 단백질은 임의의 다양한 공지의 재조합 및/또는 합성의 기술을 이용하여 제조될 수 있으며, 그 예시적인 실시예는 이하에서 추가로 설명한다.

본 발명은 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드를 제공한다:

MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6

상기 식에서,

R1은 A, V, I, L, S, F, K 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,

R2는 S, L, F, T 및 Y로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,

R3는 E, L, A 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,

R4는 Q, H, T, L, D 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,

R5는 L, S, V, A, K 및 H로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,

R6는 DK, EK, QK, NK, KK 및 FK로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 디펩타이드이다.

본 발명의 상기 펩타이드는 세포막 투과성이 있는 신규한 펩타이드로서 그 자체로 세포막 투과성이 우수하다.

본 발명에서 상기 "세포막"은 세포와 세포 외부의 경계를 짓는 막을 의미한다. 본 발명의 일 양태로서, 상기 세포막은 임의의 생명체, 예를 들어 세균 (Bacteria), 고세균 (Archaea) 및 진핵생물 (Eukarya)에 속하는 단세포 또는 다세포 생물의 세포의 막일 수 있다. 상기 진핵생물은 원생생물계 (Protista), 균계 (Fungus), 식물계 (Plantae), 및 동물계 (Animalia)에 속하는 임의의 생물일 수 있다. 상기 동물은 사람을 포함하는 임의의 동물이 될 수 있다.

본 발명에서, 상기 "세포막"은 임의의 종류의 세포의 막이 될 수 있다. 예를 들어, 상기 "세포"는 상피세포, 근육세포, 면역세포 및 내피세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 세포는 내피 (endothelium), 상피 (epithelium), 점막 (mucous membrane) 등 체외와 직접 맞닿아 있는 기관의 벽 (lining)을 이루거나, 또는 체내에서 어떤 장기 또는 혈관의 표면을 덮는 세포층의 세포가 될 수 있다. 본 발명의 일 양태로서, 상기 세포는 피부 상피세포, 모낭 상피세포, 점막 상피세포, 각막 상피세포, 두피 상피세포, 각막 내피세포, 혈관 내피세포를 포함한다. 예를 들어, 상기 점막 상피세포는 비강, 폐, 질, 직장, 항문, 요도, 설하, 안구, 결막 및 구강 점막으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 점막의 상피세포일 수 있다. 예컨대 상기 혈관 내피세포는 혈액뇌장벽 (BBB)을 이루고 있는 뇌혈관을 비롯한 각종 동맥, 정맥, 모세혈관의 내피세포, 림프관 내피세포, 심장 안벽의 내피세포 등이 될 수 있다. 또한 상기 세포는 자궁경부암, 유방암, 간암, 폐암 등을 포함하는 다양한 암세포가 될 수 있다. 또한 상기 세포는 호르몬, 신경계의 화학전달 물질, 약물 등 다양한 물질의 수용체 (receptor)를 가진 세포가 될 수 있으며, 예를 들어 인슐린 수용체 (insulin receptor), 글루카곤-유사-단백질 1 (Glucagon-like-protein 1, GLP1) 수용체를 갖는 세포가 될 수 있으나, 상기 세포는 상기 예시에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 펩타이드는 당업계에 공지된 이용가능한 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 일례로 임의의 다양한 단백질 분해효소를 이용하여 제조될 수 있다. 예시적인 프로테아제(단백질분해효소)로서는, 예를 들면, 아크로모펩티다아제(achromopeptidase), 아미노펩티다제(aminopeptidase), 안크로드(ancrod), 안지오텐신 변환 효소(angiotensin converting enzyme), 브로멜라인(bromelain), 칼파인(calpain), 칼파인 I(calpain I), 칼파인 II(calpain II), 카르복시펩티다제 A(carboxypeptidase A), 카르복시펩티다제 B(carboxypeptidase B), 카르복시펩티다제 G(carboxypeptidase G), 카르복시펩티다제 P(carboxypeptidase P), 카르복시펩티다제 W(carboxypeptidase W), 카르복시펩티다제 Y(carboxypeptidase Y), 카스파아제 1(caspase 1), 카스파아제 2(caspase 2), 카스파아제 3(caspase 3), 카스파아제 4(caspase 4), 카스파아제 5(caspase 5), 카스파아제 6(caspase 6), 카스파아제 7(caspase 7), 카스파아제 8(caspase 8), 카스파아제 9(caspase 9), 카스파아제 10 (caspase 10), 카스파아제 11(caspase 11), 카스파아제 12 (caspase 12), 카스파아제 13 (caspase 13), 카텝신 B(cathepsin B), 카텝신 C(cathepsin C), 카텝신 D(cathepsin D), 카텝신 E(cathepsin E), 카텝신 G(cathepsin G), 카텝신 H(cathepsin H), 카텝신 L(cathepsin L), 키모파파인(chymopapain), 키마아제(chymase), 키모트립신(chymotrypsin), 크로스 트리파인(clostripain), 콜라게나제(collagenase), 보체 C1r(complement C1r), 보체 C1s (complement C1s), 보체 D인자(complement Factor D), 보체 I인자(complement factor I), 쿠쿠미신(cucumisin), 디펩티딜펩티다제 IV(dipeptidyl peptidase IV), 백혈구 엘라스타제(elastase, leukocyte), 췌장 엘라스타제(elastase, pancreatic), 엔도프로테이나제 Arg-C( endoproteinase Arg-C), 엔도프로테이나제 Asp-N(endoproteinase Asp-N), 엔도프로테이나제 Glu-C(endoproteinase Glu-C), 엔도프로테이나제 Lys-C(endoproteinase Lys-C), 엔테로키나제(enterokinase), Xa 인자(factor Xa), 피신(ficin), 퓨린(furin), 그란자임 A(granzyme A), 그란자임 B(granzyme B), HIV 프로테아제(HIV Protease), IGase, 칼리크레인 조직(kallikrein tissue), 일반 류신 아미노펩티다제(leucine aminopeptidase, general), 세포기질 류신 아미노펩티다제(leucine aminopeptidase, cytosol), 마이크로솜 류신 아미노펩티다제(leucine aminopeptidase, microsomal), 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease), 메티오닌 아미노펩티다제(methionine aminopeptidase), 뉴트라제(neutrase), 파파인(papain), 펩신(pepsin), 플라스민(plasmin), 프롤리다제(prolidase), 프로나제 E(pronase E), 전립선 특이적 항원(prostate specific antigen), Streptomyces griseus 유래의 호알카리성 프로테아제(protease alkalophilic from Streptomyces griseus), Aspergillus 유래의 프로테아제(protease from Aspergillus), Aspergillus saitoi 유래의 프로테아제(protease from Aspergillus saitoi), Aspergillus sojae 유래의 프로테아제(protease from Aspergillus sojae), B. licheniformis 프로테아제(protease B. licheniformis, alkaline or alcalase), Bacillus polymyxa 유래의 프로테아제(protease from Bacillus polymyxa), Bacillus sp유래의 프로테아제(protease from Bacillus sp), Rhizopus sp.유래의 프로테아제(protease from Rhizopus sp.), 프로테아제 S(protease S), 프로테아좀류(proteasomes), Aspergillus oryzae 유래의 프로테이나제(proteinase from Aspergillus oryzae), 프로테이나제 3(proteinase 3), 프로테이나제 A(proteinase A), 프로테이나제 K(proteinase K), 프로테인 C(protein C), 피로글루타메이트 아미노펩티다제(pyroglutamate aminopeptidase), 레닌(rennin), 스트렙토키나제(streptokinase), 서브틸리신(subtilisin), 서몰리신(thermolysin), 트롬빈(thrombin), 조직 플라스미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator), 트립신(trypsin), 트립타제(tryptase) 및 우로키나제(urokinase) 등을 들 수 있다. 당업자라면 제작하고자하는 단편의 화학적 특이성을 고려하여, 어떤 단백질분해효소가 적절할지 용이하게 결정 가능하다.

본 발명에서 상기 펩타이드는 당분야의 숙련자에게 공지된 임의의 적합한 절차, 예컨대 재조합 기법에 의해 제조될 수 있다. 재조합 제조 방법에 부가하여, 본 발명의 폴리펩티드는 고상 기법을 이용한 직접적 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다(Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)).

고체상 펩타이드 합성(SPPS) 방법은 작은 다공성의 비드(beads)에 링커(linkers)라 불리는 기능성 유닛(functional units)을 부착하여 펩타이드 사슬을 이어 나갈 수 있도록 유도함으로써 합성을 개시할 수 있다. 액체상 방법과 달리 펩타이드는 비드와 공유 결합하여 TFA(trifluoroacetic acid)와 같은 특정 반응물에 의해 절단되기 전까지 여과(filtration) 과정에 의해 떨어져 나가는 것을 방지한다. 고체상에 부착된 펩타이드의 N-말단 아민과 N-보호 아미노산 유닛(N-protected amino acid unit)이 결합하는 보호(protection) 과정, 탈보호(deprotection) 과정, 다시 드러난 아민 그룹(amine group)과 새로운 아미노산이 결합하는 커플링(coupling) 과정의 사이클(cycle, deprotection-wash-coupling-wash)이 반복되면서 합성이 이루어지게 된다. 상기 SPPS 방법은 마이크로파(microwave) 기술을 함께 이용하여 수행할 수 있으며, 마이크로파 기술은 펩타이드 합성 과정에서 열을 가해줌으로써 각 사이클의 커플링과 탈보호에 요구되는 시간을 단축시킬 수 있다. 상기 열 에너지는 확장되는 펩타이드 사슬이 접히거나(folding) 집합체를 형성하는 것(aggregation)을 방지하고 화학적 결합을 촉진시킬 수 있다.

또한 액체상 펩타이드 합성법에 의해 본 발명의 펩타이드를 제작할 수 있으며, 이의 구체적 방법은 하기의 문헌들을 참조로 한다: US 등록특허 제 5,516,891. 또한 본 발명의 펩타이드는 상기 고체상 합성법과 액체상 합성법을 혼합하는 방법 등의 다양한 방법으로 합성 가능하며, 본 명세서에 기술된 수단에 그 제조 방법이 제한되지 않는다.

단백질 합성은 수동 기법을 이용해서 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화된 합성은, 예를 들어 Applied Biosystems 431A 펩티드 합성기(Perkin Elmer)를 이용해서 달성될 수 있다. 대안적으로, 다양한 단편이 별도로 화학적으로 합성되고 화학적 방법을 이용하여 조합되어 목적 분자를 제조할 수 있다.

본 발명에서 상기 펩타이드는 당업자에게 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법 혹은 제조 방법을 통하여 D-form이나 L-form, 서열 중 일부만 D-form이나 L-form으로 구성된 펩타이드, 또는 이들의 라세미체 형태로 모두 제작하여 사용될 수 있다. 또한 펩타이드의 안정성을 높이기 위해 그 외의 당업계에 공지된 통상적인 변형이 가능하다.

본 발명에서 상기 펩타이드는 통상적인 변이체를 포함할 수 있다. 상기 변이체는, 상기 '펩타이드'의 아미노산 서열에 임의의 변경이 발생한 것으로서, 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 이러한 변이체는 자연적으로 발생되는 것일 수 있고, 또는 본 기술분야에 잘 알려진 임의의 다수의 기술을 이용하여, 예를 들어 본 발명의 상기 펩타이드 서열 중의 하나 이상을 수정 또는 변형하고 본 명세서에 기재된 이들의 생물학적 활성을 평가하는 것에 의해 합성적으로 생성될 수 있다.

본 발명의 일양태로서, 상기 변이체(variant)는 보존적 치환을 포함한다. '보존적 치환'이란, 어느 아미노산이 유사한 특성을 가지는 다른 아미노산으로 치환되어 당업자라면 그 펩타이드의 2차 구조 및 감수성질(hydropathic nature, 소수성 또는 친수성 성질)이 실질적으로 비변화되었다고 예측할 수 있는 치환이다. 일반적으로 하기 아미노산 군이 보존성 변화를 나타낸다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his.

변형(modification)은 본 발명의 펩타이드의 구조 내에 수행되는 것일 수 있고, 원하는(바람직한) 특징을 가지고 있는 펩타이드 변이체 또는 파생물(derivatives)을 암호화하는 기능적 분자를 수득할 수 있다. 본 발명의 상기 펩타이드와 등가(equivalent)의 또는 향상된(improved) 변이체를 제작하기 위해 펩타이드의 아미노산 서열을 변경하고자 하는 경우, 당업자는 당업계에 알려진 단백질 코돈 정보에 기초하여 하나 이상의 코돈을 변화시킬 수 있다.

또한 상기 변이체는 비보존적 변경을 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 변이체 펩타이드는 5개 아미노산 또는 그것보다 적은 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 천연 서열과는 다를 수 있다. 변이체는 또한, 예를 들어 상기 펩타이드의 2차 구조 및 감수(hydropathic) 특성에 대해서 가지는 영향이 최소인 아미노산의 결실 또는 부가에 의해 변경될 수 있다.

본 발명에서 상기 펩타이드는 단백질의 N-말단에 시그널(또는 리더) 서열을 포함할 수 있고, 이 서열은 번역과 동시에 또는 번역 후에 그 단백질의 이송을 지시한다. 상기 펩타이드는, 또한 펩타이드의 합성, 정제 또는 동정을 용이하게 하기 위해(예를 들면 폴리His), 또는 펩타이드의 고체 지지체에 대한 결합을 증강하기 위해, 링커 서열 또는 다른 서열과 결합(컨쥬게이트)될 수 있다.

본 발명의 일양태에서 본 발명의 상기 펩타이드를 변경하기 위하여 화학선택적 결찰(chemoselective ligation)기술이 이용될 수 있으며, 예를 들어 부위 특이적인 방식 및 제어된 방식으로 중합체(polymer)를 부착하는 것에 의할 수 있다. 이러한 기술은 대표적으로 화학적 수단 또는 재조합 수단 중 하나에 의해 단백질 골격 내로 화학 선택적인 앵커(chemoselective anchor)가 결합하는 것과, 상보적인 링커를 운반하는 중합체로 후속적 변경하는 것에 의존한다. 결과적으로, 조립 공정 및 얻어진 단백질-중합체 결합체(protein-polymer conjugate)의 공유결합 구조는 제어되며, 그것에 따라 유효성 및 약물 동태학적 특성 등과 같은 약물 특성의 합리적 최적화가 가능하게 된다(예를 들면, Kochendoerfer, Current Opinion in Chemical Biology 9:555~560, 2005를 참조). 예컨대 PEG의 선택적인 부착을 허용함으로써 이들의 약동학적 특성을 개선한다.

본 발명의 상기 펩타이드에는 약학적으로 허용가능한 염의 형태가 포함이 될 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은 예를 들어, 염산염, 황산염, 인산염, 초산염, 구연산염, 주석산염, 숙신산염, 젖산염, 말레산염, 푸마르산염, 옥살산염, 메탄술폰산염, 또는 파라톨루엔술폰산염 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일양태에서 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 1 내지 10의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 종래의 TAT 단백질의 투과율과 비교하여 탁월한 세포막 투과도를 나타내며, 처리농도가 높을수록 세포 내 투과율은 급격히 증가하는 양상을 나타내는 것으로 확인되었다.

본 발명은 또한 펩타이드를 포함하는 물질의 세포 투과 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 물질, 보다 구체적으로는 생물학적 활성물질을 생체 조직 또는 혈중으로 전달시키거나 세포 투과를 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 조성물은 생체 조직을 구성하는 세포 또는 세포 간 연접을 통하여 전달될 수 있으나 전달 방식에는 제한이 없다.

상기 물질은 세포 내 (세포질 또는 핵 내)로 투과되어 생리활성조절에 관여하거나 약리효과를 발현할 수 있는 것 또는 운반되어 작용해야 하는 세포 내, 조직 내, 세포간질, 혈액 등 다양한 생체 내 부위에서 생물학적 활성을 갖는 물질을 의미한다. 예를 들어, 본 발명에 있어서 상기 물질은 화합물 (chemical compound), 단백질, 당단백질, 펩타이드, 뉴클레오티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 당지질, 천연물 (natural product), 반합성 물질 (semi-synthetic substance), 나노입자, 리포좀, 지질 기반 제제 (lipid-based formulation), 바이러스, 양자점 (quantum dots), 형광색소 (fluorochrome) 및 약물 (drug)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 생체 조직은 하나 이상의 상피조직, 근육조직, 신경조직, 결합조직을 의미하며 각 장기는 하나 이상의 조직으로 이루어질 수 있으므로, 점막, 피부, 뇌, 폐, 간, 신장, 비장, 폐장, 심장, 위장, 대장, 소화관, 방광, 요관, 요도, 난소, 정소, 생식기, 근육, 혈액, 혈관, 림프관, 림프절, 흉선, 췌장, 부신, 갑상선, 부갑상선, 후두, 편도, 기관지, 폐포의 다양한 생체 장기가 포함될 수 있으나, 상기 예시에 제한되지 않는다.

상기 생체 조직을 구성하는 세포는 상피세포, 근육세포, 신경세포, 선세포, 신경교세포, 생식세포, 줄기세포, 중간엽세포, 중간엽줄기세포, 골아세포, 골세포, 조골세포, 파골세포, 혈구세포, 조혈세포, 폐세포, 간세포, 섬유아세포, 면역세포, 내피세포, 지방세포, 연골세포 등 다양한 세포가 포함될 수 있으나, 상기 예시에 제한되지 않는다.

상피세포에는 점막상피세포, 모낭상피세포, 소화관상피세포, 호흡기상피세포, 생식기상피세포, 비뇨기상피세포 등이 포함된다. 내피세포는 혈관내피세포 또는 림프관내피세포 등이 있으나, 상기 예시에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 양태로서, 상기 조성물은 점막 또는 피부를 통하여 물질을 전달시키기 위한 것일 수 있으나, 상기 예시에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 상기 펩타이드와 함께 조성물 내에 포함된 물질에 따라 다양한 용도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 인간 또는 동물에서 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 질환의 종류에는 제한이 없으나, 세포, 조직, 혈액 내로 높은 농도로 약물을 전달하거나 개선된 약물의 전달이 필요한 질환이 될 수 있으며, 예를 들어 유전자 치료제 약물 또는 분자량이 큰 단백질 치료제 약물로 치료될 수 있는 질환이나 투여경로의 변경이 필요한 치료제에 대한 다양한 질환 적용 가능하다. 상기 질환은 예컨대 유방암, 간암, 뇌암, 전립선암, 자궁암, 난소암, 위암, 식도암, 대장암, 직장암, 갑상선암, 혈액암, 피부암, 폐암 등을 포함하는 암, 당뇨병, 비만, 천식, 탈모증 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 시험관내에서 세포막 투과성 또는 상기 펩타이드를 이용한 약물의 세포막을 통한 세포내 전달을 관찰하기 위한 연구 목적으로 활용할 수도 있고, 암, 당뇨병 등 유전자 치료제 약물 또는 분자량이 큰 단백질 치료제 약물로 치료되는 질환의 치료에도 활용할 수 있다. 상기 펩타이드를 다양한 분자에 활용하여 조영제, 진단 시약 및 키트 등의 진단에도 활용할 수 있으며, 건강기능식품 (건강기능식품 조성물), 화장품 (화장료 조성물)에도 활용할 수 있으나, 상기 예시에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “DNA”, “폴리뉴클레오티드” 및 “핵산”은 특정한 종의 총 게놈 DNA에서 단리되어 있는 DNA 분자를 가리킨다. 그러므로, 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 조각(부분, segment)이란, 그 DNA 조각을 얻을 수 있는 종(species)의 총 게놈 DNA로부터 실질적으로 단리되거나, 또는 정제되어 있는 하나 이상의 코딩 서열(coding sequence)로 이루어지는 DNA 조각을 가리킨다. 용어 'DNA 조각' 및 ‘폴리뉴클레오티드’는 DNA 조각 및 상기 조각의 더 작은 단편을 포함하고, 또한 재조합 벡터(예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 살균 바이러스, 바이러스 등을 포함한다)를 포함한다.

당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 단백질, 펩타이드 등을 발현하거나, 또는 발현할 수 있도록 개조된 것으로서, 게놈 서열, 게놈 외(extra-genomic) 서열, 플라스미드에 암호화된 서열 및 보다 작은 조작된 유전자 조각 등을 포함한다. 이러한 조각은 자연적으로 단리될 수 있고, 또는 사람의 손에 의해 합성적으로 변형될 수 있다.

당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(코드서열 또는 안티센스 서열)일 수 있고, 또는 이중 가닥일 수 있으며, 그리고 DNA 분자 (게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. 추가의 코딩(coding) 또는 비코딩(non-coding) 서열이 본발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있다. 또한 폴리뉴클레오티드는 다른 분자 및/또는 지지 재료에 연결될 수 있다.

폴리뉴클레오티드는 천연 서열을 포함할 수 있고, 또는 변이체, 또는 상기 서열의 생물학적인 기능적 등가물을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드 변이체는 아래에 추가로 기재된 것과 같은, 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있으며, 바람직하게 이러한 변형은 암호화된 폴리펩타이드의 원하는 활성이 비변형 폴리펩타이드와 비교하여 실질적으로 감소되지 않는 선에서 수행되는 것이다. 암호화된 폴리펩타이드의 활성에 대한 효과는 일반적으로 본 명세서에 기술된 바와 같이 평가될 수 있다.

본 발명에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 상기 펩타이드 또는 이의 변이체 펩타이드를 암호화하는 한, 그 구체적 서열이 특별히 제한되지 않고 어떠한 조합의 염기 서열(핵산 서열) 구성이 허용된다. 일례로, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 발현될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 그 코딩 서열 자체의 길이에 관계없이, 예컨대 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 추가적인 제한효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 코딩 조각(부분, segment) 등과 같은 다른 DNA 서열과 결합될 수 있고, 그 결과 자신의 전체 길이는 상당히 달라질 수 있다. 그러므로 거의 모든 길이의 폴리뉴클레오티드 단편이 적용될 수 있는 것으로 고려되며, 바람직하게 의도하는 재조합 DNA 프로토콜에서 제조 및 사용의 용이함에 의하여 그 전체 길이가 제한될 수 있다.

폴리뉴클레오티드 및 이의 융합물은, 당업계에 공지되었고 이용가능한 것으로서 잘 확립된 기술들 중 임의의 것을 이용하여, 제조, 조작 및/또는 발현될 수 있다. 예를들어, 본 발명의 펩타이드, 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 적절한 숙주 세포내에서 상기 폴리펩타이드의 발현을 지향하는 재조합 DNA 분자 내에 이용될 수 있다. 유전 암호(genetic code)의 고유한 축중(degeneracy)으로 인하여, 실질적으로(substantially) 동일하거나 또는 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 암호화하는 다른 DNA 서열들이 생성될 수 있고, 이들 서열들은 클로닝 및 주어진 폴리펩타이드를 발현하는데 이용될 수 있다.

당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 몇몇의 경우에 있어서 천연에 존재하지 않는 코돈을 보유하는 뉴클레오타이드 서열(폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열)을 생산하는 것이 유리한 경우가 있다. 예를들어, 특정 원핵 생물 숙주 또는 진핵생물 숙주에서 선호되는 코돈들이 단백질 발현 비율 증가 또는 원하는 특성(예를들어, 천연에 존재하는 서열로부터 생성되는 전사물의 반감기보다 긴 반감기)을 가지는 재조합 RNA 전사물을 생산하도록 선택될 수 있다.

또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 다양한 이유(유전자 산물의 클로닝, 프로세싱, 발현 및/또는 활성을 변형하는 변경을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)로 펩타이드 암호화 서열을 변경하도록 당해 분야에서 일반적으로 공지 방법을 사용하여 조작될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

원하는 폴리펩타이드를 발현시키기 위해, 폴리펩타이드 또는 기능적 등가물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 적절한 발현 벡터(즉, 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위해 필요한 요소(엘레먼트)를 포함한 벡터) 내에 삽입할 수 있다. 당업자에게 잘알려진 방법으로 목적(interest)하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열, 및 적절한 전사 제어 요소(엘레먼트) 및 번역 제어 요소(엘레먼트)를 포함하는 발현벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법들은 in vitro 재조합 DNA 기술들, 합성 기술, 및 in vivo 유전자 재조합을 포함한다. 이러한 방법들은 하기의 문헌에 기재되어있다: Sambrook et al., Molecular Cloning,A Laboratory Manual(1989) 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(1989).

다양한 발현벡터/숙주 시스템이 공지되어있으며, 폴리뉴클레오티드 서열을 함유시키고 그리고 발현시키기 위해 이용될 수 있다. 상기 발현벡터/숙주 시스템은, 이들로서 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 재조합 박테리오파지, 플라스미드, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질 전환된 세균; 효모 발현벡터로 형질 전환된 효모; 바이러스 발현벡터(예를들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포계; 바이러스 발현 벡터(예를 들어, cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV) 또는 세균 발현 벡터(예를들어, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포계; 또는 동물세포계 등의 미생물을 포함한다.

발현 벡터 내에 존재하는 “제어 요소(엘레먼트)” 또는 “조절 서열” 은, 전사 및 번역을 실행하도록 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 비번역 영역(인핸서, 프로모터, 5' 및 3' 비번역 영역)이다. 이러한 요소(엘레먼트)는 그 강도(strength) 및 특이성(specificity)을 달리할 수 있다. 이용되는 벡터계 및 숙주에 따라, 얼마든지 적절한 전사 요소 및 번역 요소(항시성 프로모터(constitutive promoter) 및 유도성 프로모터(inducible promoter) 포함)이 이용될 수 있다.

예를들어, 세균계에 클로닝을 할 경우, PBLUESCRIPT 파지미드(Stratagene,La Jolla,Calif.) 또는 PSPORT1 플라스미드(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)의 하이브리드 lacZ 프로모터 등과 같은 유도성 프로모터가 이용될수 있다. 포유동물 세포계에 있어서, 포유동물 유전자들 또는 포유동물 바이러스들로 부터 유래하는 프로모터가 일반적으로 바람직하다. 폴리펩타이드를 암호화는 서열의 다중 복제본들(multiple copies)을 포함하는 세포주를 생성하는 것이 필요한 경우, SV40 또는 EBV 기반의 벡터들이 적절한 선택 마커와 함께 유용하게 이용될 수 있다.

세균계에 있어서, 다수의 발현벡터들이 펩타이드 발현을 위해 의도된 용도에 따라 선택될 수 있다. 예를들어, 대량으로 필요한 경우, 용이하게 정제되는 융합 단백질의 높은 수준으로의 발현을 지향하는 벡터들이 이용될 수 있다. 그러한 벡터로서, 이에 한정되는 것은 아니지만, 하기의 것들을 포함한다: 다기능성 E.coli 클로닝 벡터 및 발현 벡터, 예를들어 BLUESCRIPT((Stratagene), 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열이 β-갈락토시다제의 아미노-말단 Met 및 그에 후속하는 7개 잔기에 대한 서열과 인 프레임(in frame)으로 벡터 내에 연결되고, 그 결과 하이브리드 단백질이 생산된다); pIN 벡터(Van Heeke 및 Schuster, J.Biol.Chem.264:5503 5509(1989)); 등등. pGEX 벡터(Promega,Madison,Wis.)도 또한 글루타티온 S전이효소(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩타이드들을 발현시키기 위해 이용될 수 있다. 일반적으로 그러한 융합 단백질은 가용성이며, 그리고 글루타티온-아가로오스 비즈(glutathione-agarose bead)에 흡착시키고 뒤이어 유리 글루타티온(free glutathione)의 존재하에서 용출시킴으로서, 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. 이러한 시스템에서 제작된 단백질들은, 복제된 폴리펩타이드가 GST moiety로부터 방출될수 있도록, 헤파린, 트롬빈, 또는 Factor Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하여 설계될 수 있다.

효모(Saccharomyces cerevisiae)에 있어서, 항시적(constitutive) 프로모터 또는 유도성 프로모터들(예를들어 알파 인자, 알코올 옥시다제 및 PGH)을 포함한 다수의 벡터가 이용될 수 있다. 이는 Ausubel et al(supra). 및 Grant et al., Methods Enzymol.153:516~544(1987)등을 참조로 하여 이해될 수 있다.

식물 발현 벡터를 이용할 경우, 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 발현은 임의의 다수의 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 예를들어, 바이러스 프로모터(예를들어, CaMV의 35S 프로모터 및 19S프로모터)는 단독으로 이용될 수 있고, 또는 TMV로부터 유래하는 ω(오메가) 리더 서열과 조합하여 이용될 수 있다(Takamatsu, EMBO J.6:307~311(1987)). 혹은, 식물 프로모터(예를들어, RUBISCO의 작은 서브유닛 또는 열 쇼크 프로모터(heat shock promoter)를 이용할 수 있다(Coruzzi,G. et al., EMBO J. 3:1671~1680(1984); Broglie et al., Science 224:838~843(1984); 및 Winter et al., Results Probl. Cell Differ.17:85~105(1991)). 이들 구축물들은 직접적 DNA 형질전환 또는 병원체-매개성 트랜스펙션에 의해 식물세포 내에 도입될 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지이며, 하기의 문헌을 참조로 할 수 있다: Hobbs in McGraw Hill, Yearbook of Science and Technology, pp.191~196(1992) 등.

곤충계 또한 목적하는 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 이용될 수 있다. 예를들어, 하나의 시스템에서, AcNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)가 Spodoptera frugiperda 세포 또는 Trichoplusia larvae에 있어서 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 이용된다. 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 바이러스의 비필수 영역 내에 클로닝 될 수 있고, 예를들어, polyhedrin 유전자 등, polyhedrin 프로모터의 제어 하에 위치될 수 있다. 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 성공적인 삽입은 polyhedrin 유전자가 불활성화되게 만들고 코트(coat) 단백질이 결손되어있는 재조합 바이러스를 생산한다. 그 다음에 상기 재조합 바이러스는 예를들어 S.frugiperda 세포 또는 Trichoplusia larvae 등을 감염시키기 위해 사용될 수 있고, 여기서 목적하는 폴리펩타이드가 발현될 수 있다(Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3224~3227(1994)).

포유동물 숙주 세포에 있어서, 다수의 바이러스-기반 발현 시스템이 일반적으로 이용 가능하다. 예를들어, 아데노바이러스가 발현 벡터로서 이용될 경우, 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 후기 프로모터(late promoter) 및 3자 리더 서열(tripartite leader)로 구성되는 아데노바이러스 전사/번역 복합체 내에 연결될 수 있다. 바이러스 게놈(genome)의 비필수 E1 또는 E3 영역으로의 삽입을 이용하여, 감염된 숙주 세포에서 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 생존 바이러스를 얻을 수 있다. (Logan 및 Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.81: 3655~3659(1984)). 또한 포유동물 숙주 세포의 발현 증대를 위하여 전사 인핸서(예를들어 Rous Sarcoma Virus(RSV) 인핸서)가 이용될 수 있다.

또한, 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 보다 효율적인 번역을 위하여, 특정 시작 신호(initiation signal)이 이용될 수 있다. 이러한 신호로는 ATG 시작 코돈 및 인접 서열을 들 수 있다. 폴리펩타이드를 암호화하는 서열, 이의 시작 코돈, 및 상류 서열(upstream sequence)이 적절한 발현 벡터 내에 삽입될 경우, 추가의 전사 제어 시그널 또는 번역 제어 시그널이 필요하지 않을 수 있다. 그러나 오직 코딩 서열만, 또는 이의 일부만이 삽입될 경우, ATG 시작 코돈을 포함하는 외인성 번역 제어 시그널이 제공되어야 한다. 또한 시작 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해, 올바른 리딩 프레임 내에 있어야한다. 외인성 번역 요소들(엘리먼트) 및 시작 코돈은 다양한 기원(천연 및 합성의 양쪽 모두)에서 유래할 수 있다. 발현의 효율은 이용되는 특정 세포계에 적절한 인핸서(예를 들면 문헌 Scharf et al., Results Probl.Cell Differ.20:125~162(1994))에 기재되는 인핸서 등)를 넣는 것에 의해 증강될 수 있다.

또한 숙주 세포주는, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 또는 원하는 방식으로 발현된 단백질을 처리(프로세싱)하는 그 능력에 따라 선택될 수 있다. 폴리펩타이드의 그러한 변경으로서는 , 이에 제한되는 것은 아니지만, 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함한다. 단백질의 'prepro' 형태를 절단하는 번역후 프로세싱(post-translational processing)은, 정확한 삽입, 접힘 및/또는 기능을 촉진시키기 위해 이용될 수 있다. 다른 숙주 세포(예를 들면 CHO, HeLa, MDCK, HEK293 및 W138, 이들은 그러한 번역-후 활성에 대한 특정 세포 기구(machinery) 및 특징적 매커니즘(mechanisms)을 가진다)는 외래 단백질의 정확한 변경(modification) 및 가공(processing)을 보장하기 위해 선택될 수 있다.

장기적으로, 재조합 단백질의 고수율의 생산을 위해서는, 안정적인 발현이 일반적으로 바람직하다. 예를 들어, 목적하는 폴리뉴클레오티드를 안정적으로 발현하는 세포주는 발현 벡터를 이용하여 형질전환 될 수 있으며, 상기 발현 벡터는 바이러스복제 기점 및/또는 내인성 발현 요소(엘리먼트), 및 동일한 벡터 또는 별개의 벡터 상에서 선택마커 유전자를 포함할 수 있다.

상기 벡터의 도입 후, 세포는 증식배지(enriched media)에서 1~2일간 증식될 수 있으며, 그 후에 선택 배지(selective media)로 변환된다. 선택 마커의 목적은 선택에 대한 내성을 부여하는 것이며, 그리고 이의 존재는 도입된 배열이 성공적으로 발현되고 있는 세포의 성장 및 회수를 허용한다. 안정적으로 형질 전환된 세포의 내성 클론은 그 세포형(cell type)에 적절한 조직배양 기술을 이용하여 증식될 수 있다.

다수의 선택 시스템을 이용하여 형질전환된 세포주를 회수할 수 있다. 이러한 선택시스템으로서는, 이에 제한되지 않지만, 각각, tk-세포 또는 aprt-세포에 사용될 수 있는, herpes simplex virus thymidine kinase (Wigler et al., Cell 11:223~232(1977)) 및 adenine phosphoribosyltransferase (Lowy et al., Cell 22:817~823(1990)) 유전자를 들수 있다.

또한 대사길항물질(antimetabolite) 내성, 항생물질 내성, 또는 제초제 내성이 선택을 위한 기초로서 이용될 수 있다. 예를들어 methotrexate에 대한 내성을 부여하는 dhfr(Wigler et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:3567~70(1980)); 아미노글리코시드, 네오마이신 및 G-418에 대한 내성을 부여하는 npt(Colbere-Garapin et al., J.Mol.Biol.150:1~14(1981)); 및 각각 클로르설프론 및 포스피노트리신 아세틸 전이효소(phosphinotricin acetyltransferase)에 대한 내성을 부여하는 als 또는 pat(전술한 Murry, 문헌 참조). 추가적인 선택 유전자가 공지되어 있으며, 예를들어 세포가 트립토판 대신에 인돌을 이용하는 것을 가능하게 하는trpB, 또는 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀(histinol)을 이용하는 것을 가능하게하는 hisD 등이 있다(Hartman 및 Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:8047~51(1988)). 안토시아닌, β-글루쿠로니다제와 이의 기질인 GUS, 및 루시페라제와 이의 기질인 루시페린과 같은 가시의 마커(visible marker)들은 인기를 얻고 있으며, 형질 전환체를 동정하기 위해서 뿐만아니라 특정 벡터 시스템에 기인하는 일시적인(transient) 단백질 발현 또는 안정적인 단백질 발현의 양을 정량하기 위해서도 널리 이용되고 있다(Rhodes et al., Methods Mol.Biol.55:121~131(1995)).

폴리뉴클레오티드가 코드하는 산물에 특이적인 다클론 항체 또는 단일 클론 항체 중 어느 하나를 이용하여, 상기 폴리뉴클레오티드가 코드하는 산물의 발현을 검출 및 측정하기 위한 다양한 프로토콜들이 당업계에 알려져 있다. 예로서, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), RIA(radioimmunoassay) 및 FACS(fluorescence activated cell sorting) 등을 들 수 있다. 상기 어세이 방법 및 추가의 다른 어세이 방법은 하기의 문헌을 참조로 할 수 있다: Hampton et al., Serological Methods,a Laboratory Manual(1990) 및 Maddox et al., J.Exp.Med.158:1211~1216(1983). 다양한 표지 기술 및 컨쥬게이션(cojugation) 기술이 당업자에게 공지되었으며, 이는 다양한 핵산 어세이(assay) 및 아미노산 어세이에 이용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 관련된 서열을 검출하기 위해 표지된 혼성화(labeled hybridization) 프로브 또는 표지된 PCR 프로브를 제작하기 위한 수단으로는, 올리고표지(oligolabeling), 닉 트랜슬레이션(nick translation), 말단 표지 또는 표지된 뉴클레오타이드를 사용하는 PCR 증폭을 들 수 있다. 또는, mRNA 프로브의 생산을 위해, 상기 서열 또는 그 임의의 부분이 벡터 내에 클로닝될 수 있다. 그러한 벡터는 당업계에 공지되어 시판되고 있으며, 적절한 RNA 중합효소(예를들어 T7, T3, 또는 SP6) 및 표지된 뉴클레오타이드를 첨가함으로써 in vito 상에서 RNA 프로브를 합성하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 절차들은 시판되고 있는 다양한 키트를 이용하여 수행될 수 있다. 적절한 리포터 분자 또는 표지로서는, 방사성핵종(radionuclides), 효소, 형광제, 화학발광, 또는 발색제(chromogenic agent), 기질, 보인자, 억제제, 자기(magnetic) 입자 등을 들 수 있다.

목적하는 폴리뉴클레오티드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 단백질의 발현 및 세포 배양물로부터의 회수에 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다. 재조합 세포에 의해 생산된 단백질은 그 서열 및/또는 벡터에 따라 분비되거나 또는 세포 내에 함유되어 있을 수 있다.

당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 원핵세포 막 또는 진핵세포막을 통해 폴리펩타이드의 분비를 지향하는 시그널 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을, 수용성 단백질의 정제를 촉진하는 폴리펩타이드 도메인을 암호화하는 서열과 연결하기 위해, 다른 재조합 구축물들이 이용될 수 있다.

재조합 생산 방법에 더하여, 본 발명의 폴리펩타이드 및 그 단편은 고체상 기술(solid phase technique)을 이용한 직접적 펩타이드 합성에 의해 생산될 수 있다(Merrifield, J.Am.Chem.Soc.85:2149~2154(1963)). 단백질 합성은 수동 기술(manual technique)을 이용하여 수행될 수 있으며 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화 합성은, 예를들어 Applied Biosystems 431 A Peptide Syntthesizer(Perkin Elmer)를 이용하여 달성될 수 있다. 또는, 다양한 단편들이 개별적으로 화학적으로 합성되고, 그후 전장(full length) 분자를 생산하기 위해 화학적 방법을 이용하여 조합될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호하는 폴리뉴클레오티드는, 예를들어 유전자 치료 기술을 이용하여 생체 내(in vivo)로 피험체에 전달될 수 있다. 유전자 치료란 일반적으로 이러한 치료가 요구되는 장애 또는 증상을 가지는, 포유동물, 특히 사람의 특정 세포, 표적 세포에 대한 이종의 핵산 이입을 가리킨다. 핵산이 선택된 표적 세포에 도입되고, 이종의 DNA가 발현되며 그것에 따라 코드된 치료 산물이 생산된다.

본 명세서에 개시된 바와 같은 유전자 치료에 이용 가능한 다양한 바이러스 벡터로서, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아(vaccinia), AAV(adeno-associated virus), 또는 바람직하게 레트로바이러스와 같은 RNA 바이러스를 들 수 있다. 바람직하게, 레트로바이러스 벡터는 설치류(murine) 또는 조류(avian)의 레트로바이러스 유도체이거나, 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 바람직한 레트로바이러스 벡터는 렌티 바이러스 벡터일 수 있다. 단일 외인성 유전자가 삽입될 수 있는 레트로바이러스 벡터의 예로서, 이에 제한되는 것은 아니나, 하기의 것들을 포함한다: Moloney murine leukemia virus (MoMuLV), Harvey murine sarcoma virus (HaMuSV), murine mammary tumor virus (MuMTV), SIV, BIV, HIV and Rous Sarcoma Virus (RSV). 다수의 추가적인 레트로바이러스 벡터들은 다수의 유전자를 함유(incorporate)할 수 있다. 이들 모든 벡터는 형질도입된 세포가 동정되고 생산될수 있도록, 선택 마커 유전자를 포함할 수 있다. 예를들어, 목적하는 징크핑거(zinc finger)-유래 DNA 결합 폴리펩타이드 서열을, 특정 표적 세포 상의 수용체를 위한 리간드를 암호화하는 다른 유전자와 함께 바이러스성 벡터에 삽입함으로써, 상기 벡터가 표적 특이적이 될 수 있다.

레트로바이러스 벡터는, 예를들어, 폴리펩타이드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 삽입함으로써 표적 특이적이 될 수 있다. 예시적으로, 표적화는 레트로바이러스 벡터를 표적하는 항체를 이용함으로써 달성할 수 있다. 당업자는, 징크핑거(zinc finger)-뉴클레오타이드 결합 단백질 폴리뉴클레오티드를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 표적 특이적으로 전달할 수 있도록하기 위한, 레트로바이러스 게놈 중에 삽입될 수 있는 특이적 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서 정통하고 있어 과도한 실험을 하지 않고도 용이하게 확인할 수 있다.

재조합 레트로바이러스는 결손(defective)되어 있기 때문에, 감염성 벡터 입자를 생산하기 위한 보조(assistance)가 필요하다. 이러한 보조는, 예를들어 LTR 내 조절 서열의 제어하에서 레트로바이러스의 모든 구조 유전자를 코드하는 플라스미드를 포함한 헬퍼(helper) 세포주를 이용함으로써, 제공될 수 있다. 이들 플라스미드는 캡슐화(encapsulation)를 위한 RNA 전사물을 인식하는 패키징 매커니즘(packaging mechanism)을 가능하게 하는 뉴클레오타이드 서열을 상실하고 있다. 패키징 시그널이 결손되어 있는 헬퍼 세포주로서는, 이에 제한되지 않지만, 예를들어 PSI.2, PA317 및 PA12 등을 포함한다. 이들 세포주는 게놈이 패키징되어 있지 않기 때문에 빈 비리온(empty virion)을 생산한다. 만일 패키징 시그널이 온전하고 구조유전자가 목적하는 다른 유전자로 대체된 세포 중에 레트로바이러스 벡터가 도입된다면, 상기 벡터는 패키지되고 벡터 비리온(vector virion)을 생산할 수 있다. 그 다음에, 상기 방법에 의해 생산된 백터 비리온은 조직 세포주(예를들어, NIH3T3 세포)를 감염하는데 사용될 수 있고, 이로써 다량의 키메라 레트로바이러스 비리온(chimeric retroviral virion)이 생산된다.

본 발명의 신규한 세포 투과성 펩타이드는 세포, 조직, 혈액 등 생체 내로 효과적으로 침투할 수 있다.

도 1a 내지 1f를 포함하는 도 1은 본 발명의 펩타이드들을 다양한 농도로 BEAS-2B 세포 또는 HeLa 세포에 처리하고, 15 분 후(1a, 1b), 30분 후 (1c, 1d) 및 2시간 후(1e, 1f) 세포 내 투과정도를 분석한 결과이다.
도 2a 및 2b를 포함하는 도 2는 본 발명의 펩타이드를 다양한 농도로 BEAS-2B 세포 또는 HeLa 세포에 처리하고, BEAS-2B 세포에서 30 분 후 형광 현미경으로 분석하였고(2a), HeLa 세포에서 2 시간 후 형광 현미경으로 분석한 결과(2b)이다.
도 3a 및 도3b를 포함하는 도 3은 본 발명의 펩타이드를 다양한 농도로 BEAS-2B 세포 또는 HeLa 세포에 처리하고, BEAS-2B 세포에서 24 시간 및 48 시간 후 세포 독성 정도를 분석하였고(3a), HeLa 세포에서 24 시간 및 48 시간 후 세포 독성 정도를 분석한 결과이다(3b).

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 세포 투과성 펩타이드의 제작

세포 투과성을 나타내는 펩타이드를 제작하기 위해 하기 표 1에 나타낸 서열번호 1 내지 10의 각 펩타이드를 순도 95% 이상이 되도록 제작하였다. 이 펩타이드 합성은 아이큐어펩젠㈜에 의뢰하여 진행하였다.

실시예 2: 세포 투과성 펩타이드의 세포 내 투과 양상 확인

본 발명의 펩타이드의 세포 내 투과 양상을 형광 현미경으로 확인하였다.

이를 위하여 상기 실시예 1에서 제작한 서열번호 1 내지 10의 각 펩타이드의 아미노 말단에 로다민(Rhodamine) 형광 염료를 표지(labelling) 하였다. BEAS-2B 세포 또는 HeLa 세포에 다양한 농도의 BCP1 내지 BCP10의 펩타이드를 처리한 후 15분, 30분 및 2시간 경과 후 세포 내 펩타이드의 농도를 평가하였다. 대조군으로는 TAT 펩타이드(GRKKRRQRRR)를 사용하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 BCP1 내지 BCP10의 펩타이드는 모두 대조군으로 사용된 TAT보다 월등히 향상된 세포 투과도를 나타낸 것으로 확인되었다

그 다음으로, 10μM 과 50μM의 농도로 펩타이드 BCP3, BCP4, BCP5를 BEAS-2B 세포 또는 HeLa 세포에 처리하였고, 대조군 TAT도 같은 농도로 처리하였다. 단, 세포 접종시 세포 배양 슬라이드에 접종하였는데, 이는 형광 현미경 관찰시 플라스틱은 형광간섭현상을 유발하기 때문이다. 세척 후 mounting medium with DAPI를 사용하여 유리 커버 글라스를 슬라이드 글라스에 밀착시켜 형광 현미경 400배로 시료를 관찰하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, BCP3, BCP4 및 BCP5는 모두 대조군으로 사용된 TAT보다 월등히 향상된 세포 투과도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 세포 투과성 펩타이드의 세포 독성 확인

본 발명의 펩타이드의 세포 내 투과 활성이 세포독성으로 인해 세포막이 약해져서 발생한 것인지 확인하기 위해 다음과 같이 세포독성을 확인하였다.

상기 실시예 2와 동일한 방법으로 세포에 준비한 펩타이드들을 농도별(0, 1, 10, 100 μM)로 배양배지에 처리하고, 24 시간과 48 시간 처리하였다. 각 웰에 10ul의 CCK-8을 첨가하고 37℃의 가습조건이 유지되는 5% CO₂ 인큐베이터에서 3시간 후 마이크로 플레이트 흡광도 판독기(SYNERGY H1 microplate reader, BIO-TEK)를 사용하여 460 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 10μM의 농도까지 아무런 세포독성을 나타내지 않았으며, 100μM의 농도에서도 세포 투과도 실험 결과에 영향을 줄 수 있는 정도의 세포독성은 확인되지 않았다.

본 발명의 신규 세포 투과성 펩타이드는 세포, 조직, 혈액 등 생체 내로 효과적으로 침투할 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.

<110> ICURE BNP Co., Ltd icurePEPGEN co.,Ltd. <120> Novel peptides having cell penetrating activity <130> NP20-0108 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCP 1 <400> 1 Met Ile Ile Phe Arg Ala Ser Glu Gln Leu Asp Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCP 2 <400> 2 Met Ile Ile Phe Arg Val Leu Glu Gln Ser Glu Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCP 3 <400> 3 Met Ile Ile Phe Arg Ile Phe Leu His Leu Gln Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCP 4 <400> 4 Met Ile Ile Phe Arg Leu Phe Leu His Leu Asn Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCP 5 <400> 5 Met Ile Ile Phe Arg Leu Ser Ala Thr Val Lys Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCP 6 <400> 6 Met Ile Ile Phe Arg Ser Thr Ala Leu Val Lys Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCP 7 <400> 7 Met Ile Ile Phe Arg Leu Ser Ala Thr Ala Lys Lys 1 5 10 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCP 8 <400> 8 Met Ile Ile Phe Arg Phe Tyr Glu Asp Ala Phe Lys 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCP 9 <400> 9 Met Ile Ile Phe Arg Lys Lys Glu Asp Lys Asp Lys 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCP 10 <400> 10 Met Ile Ile Phe Arg Arg Leu Arg Arg His Lys Lys 1 5 10

Claims (6)

1. 하기의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과성 펩타이드:
   MIIFR-R1-R2-R3-R4-R5-R6
   상기 식에서,
   R1은 A, V, I, L, S, F, K 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
   R2는 S, L, F, T 및 Y로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
   R3는 E, L, A 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
   R4는 Q, H, T, L, D 및 R로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이며,
   R5는 L, S, V, A, K 및 H로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산이고,
   R6는 DK, EK, QK, NK, KK 및 FK로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 디펩타이드이다.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 10으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
3. 제1항 또는 제2항의 펩타이드를 포함하는 물질의 세포 투과 촉진용 조성물.
   
4. 제1항 또는 제2항의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
   
5. 제4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
   
6. 제5항의 벡터로 형질전환된 세포.

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