JP3469247B2 - 組換えリボヌクレアーゼタンパク質 - Google Patents
組換えリボヌクレアーゼタンパク質Info
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、関心の細胞に毒性であるリボヌクレアーゼ
分子の生産に関する。
分子の生産に関する。
発明の背景
リボヌクレアーゼＡ（“RNase A"）のようなリボヌク
レアーゼ及びそれらの腫瘍細胞に対する細胞毒性は、19
60年代及び1970年代に行われた研究から十分に証明され
ており、Roth J.（1963,Cancer Res.23:657−666）に報
告されている。ヒト血清も、組織特異的様式で発現され
るいくつかのRNase（Reddi,E.,1975,Biochem.Biophys.R
es.Commun.67:110−118,Blankら、Human body fluid ri
bonucleases:detection,interrelationships and signi
ficance 1−203−209（IRL Press,London,1981））を含
むことが発見されている。好酸球のホスト防御活性に関
連するタンパク質はRNaseと相同であり、RNase活性を発
現する（Gleichら、1986,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 83:
3146−3150;Slifmanら、1986,J.Immunol,137:2913−291
7）。これにより、ヒト血清RNaseはホスト防御活性も有
すると信じられている。
レアーゼ及びそれらの腫瘍細胞に対する細胞毒性は、19
60年代及び1970年代に行われた研究から十分に証明され
ており、Roth J.（1963,Cancer Res.23:657−666）に報
告されている。ヒト血清も、組織特異的様式で発現され
るいくつかのRNase（Reddi,E.,1975,Biochem.Biophys.R
es.Commun.67:110−118,Blankら、Human body fluid ri
bonucleases:detection,interrelationships and signi
ficance 1−203−209（IRL Press,London,1981））を含
むことが発見されている。好酸球のホスト防御活性に関
連するタンパク質はRNaseと相同であり、RNase活性を発
現する（Gleichら、1986,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 83:
3146−3150;Slifmanら、1986,J.Immunol,137:2913−291
7）。これにより、ヒト血清RNaseはホスト防御活性も有
すると信じられている。
これらに加えて、初期の研究は、ラナ・ピピエンス
（Rana pipiens）の卵母細胞からの抗腫瘍タンパク質が
RNase Aとの相同性を有することを発見した（Ardelt
ら、1991,J.Biol.Chem.256:245−251）。このタンパク
質はONCONASE と呼ばれている（Alfacell Corporatio
n,N.J.,例えばDarzynkiewiczら（1988）Cell Tissue Ki
net.21,169−182,Mikulskiら、（1990）Cell Tissue Ki
net.23,237−246も参照のこと）。このタンパク質は米
国特許第4,888,172号にも記載される。種々の固体腫瘍
の患者における単一治療剤（Mikulskiら（1993）Int.J.
of Oncology 3,57−64）として、又は進行した膵臓癌の
患者におけるタモキシフェンと組み合わせたONCONASE
のフェーズＩ及びフェーズI/II臨床試験が現在完了して
いる（Chunら（1995）Proc Amer Soc Clin Oncol 14 N
o.157,210）。細胞型特異物リガンドへのONCONASE の
コンジュゲーションはその腫瘍細胞に対する能力を増加
させた（Rybakら（1993）Drug Delivery 1,3−10）。ま
とめると、これらの結果は、ONCONASE が、潜在的な選
択物細胞殺傷剤の製造に有利である特性を有することを
示す。
（Rana pipiens）の卵母細胞からの抗腫瘍タンパク質が
RNase Aとの相同性を有することを発見した（Ardelt
ら、1991,J.Biol.Chem.256:245−251）。このタンパク
質はONCONASE と呼ばれている（Alfacell Corporatio
n,N.J.,例えばDarzynkiewiczら（1988）Cell Tissue Ki
net.21,169−182,Mikulskiら、（1990）Cell Tissue Ki
net.23,237−246も参照のこと）。このタンパク質は米
国特許第4,888,172号にも記載される。種々の固体腫瘍
の患者における単一治療剤（Mikulskiら（1993）Int.J.
of Oncology 3,57−64）として、又は進行した膵臓癌の
患者におけるタモキシフェンと組み合わせたONCONASE
のフェーズＩ及びフェーズI/II臨床試験が現在完了して
いる（Chunら（1995）Proc Amer Soc Clin Oncol 14 N
o.157,210）。細胞型特異物リガンドへのONCONASE の
コンジュゲーションはその腫瘍細胞に対する能力を増加
させた（Rybakら（1993）Drug Delivery 1,3−10）。ま
とめると、これらの結果は、ONCONASE が、潜在的な選
択物細胞殺傷剤の製造に有利である特性を有することを
示す。
しかしながら、これはヒト由来タンパク質でないの
で、ヒトに用いる場合に不要な免疫応答を刺激する傾向
がある。これにより、ヒトにおけるその免疫原性を削減
しながらこの分子の潜在的細胞毒性特性を保持すること
が要求されよう。更に、特定の細胞に標的づけするため
によりよく他の分子に化学的にコンジュゲートされ又は
組換え的に連結され得るように、組換えでのこの分子の
誘導体を作ることが要求されよう。本明細書に記載され
る本発明に至るまでは、ONCONASE に関連する活性を細
胞毒性分子を組換えで発現することは困難であった。組
換え分子のイチオニン−グルタミン酸アミノ末端が分子
が大きな酵素活性を有することを妨げると考えられる
が、この問題を解決するための手段は、本明細書の本発
明まではなかった。
で、ヒトに用いる場合に不要な免疫応答を刺激する傾向
がある。これにより、ヒトにおけるその免疫原性を削減
しながらこの分子の潜在的細胞毒性特性を保持すること
が要求されよう。更に、特定の細胞に標的づけするため
によりよく他の分子に化学的にコンジュゲートされ又は
組換え的に連結され得るように、組換えでのこの分子の
誘導体を作ることが要求されよう。本明細書に記載され
る本発明に至るまでは、ONCONASE に関連する活性を細
胞毒性分子を組換えで発現することは困難であった。組
換え分子のイチオニン−グルタミン酸アミノ末端が分子
が大きな酵素活性を有することを妨げると考えられる
が、この問題を解決するための手段は、本明細書の本発
明まではなかった。
更に、タンパク質デザイン技術の進展は免疫毒性の抗
体部分に関連する免疫毒性のいくつかを緩和しそうであ
る（Birdら、1988,Science 242:423;Hustonら、1988,Pr
oc Natl Acad Sci USA 85:5879;Werdら、1989,Nature 3
41:544）、患者の免疫抑制以外の毒素部分の免疫原性に
ついての解決策はない（Khazaeliら、1988,Proceedings
of AACR 29:418）。これにより、ラナ・ピピエンス（R
ana pipiens）由来の毒素成分の免疫原性を減らすであ
ろう方法及び組成物についての継え間ない必要性があ
る。
体部分に関連する免疫毒性のいくつかを緩和しそうであ
る（Birdら、1988,Science 242:423;Hustonら、1988,Pr
oc Natl Acad Sci USA 85:5879;Werdら、1989,Nature 3
41:544）、患者の免疫抑制以外の毒素部分の免疫原性に
ついての解決策はない（Khazaeliら、1988,Proceedings
of AACR 29:418）。これにより、ラナ・ピピエンス（R
ana pipiens）由来の毒素成分の免疫原性を減らすであ
ろう方法及び組成物についての継え間ない必要性があ
る。
化学的（Rybakら（1991）J.Biol.Chem 266,1202−212
07,Newtonら（1992）J.Biol.Chem 267,19572−19578）
又は組換え的手段（RybakらProc.Natl.Acad.Sci.USA 8
9,3165,Newtonら（1994）J.Biol.Chem.269,26739−2674
5）による腫瘍関連抗原に関連するRNase Aスーパーファ
ミリーの非細胞毒性ヒトメンバーは、植物及びバクテリ
ア毒素を用いる現在のストラテジーより少ない免疫原性
で腫瘍細胞を選択的に殺すためのストラテジーを供する
ことが示されている（Rybak,S.M.＆Youle,R.J.（1991）
Immunol.and Allergy Clinics of North America 11:2,
359−380）。関心のヒト由来リボヌクレアーゼは、好酸
球由来ニューロトキシン（EDN）及びアンギオゲニンを
含む。
07,Newtonら（1992）J.Biol.Chem 267,19572−19578）
又は組換え的手段（RybakらProc.Natl.Acad.Sci.USA 8
9,3165,Newtonら（1994）J.Biol.Chem.269,26739−2674
5）による腫瘍関連抗原に関連するRNase Aスーパーファ
ミリーの非細胞毒性ヒトメンバーは、植物及びバクテリ
ア毒素を用いる現在のストラテジーより少ない免疫原性
で腫瘍細胞を選択的に殺すためのストラテジーを供する
ことが示されている（Rybak,S.M.＆Youle,R.J.（1991）
Immunol.and Allergy Clinics of North America 11:2,
359−380）。関心のヒト由来リボヌクレアーゼは、好酸
球由来ニューロトキシン（EDN）及びアンギオゲニンを
含む。
発明の概要
我々は、細胞毒性が高く、ネイティブONCONASE （nO
nc）の修飾体であるRNaseをいかに作製するかを発見し
た。nOncが組換え発現された場合、大きな細胞毒性を有
することは見い出されなかった。しかしながら、我々の
改良した型（rOnc）は高い細胞毒性を有し、さもなけれ
ばネイティブONCONASE 分子の利点を保持し、ここで特
定の場合にはそれらは増加された細胞毒性特性も有す
る。rOnc分子は単独で用いても便利には化学的コンジュ
ゲートを形成するように用いてもよく、そして標的組換
え免疫融合体を形成する。これらのrOnc分子は腫瘍細胞
成長を減少させるために用いることができる、nOncの有
効な組換え形態は、有利にはその組換え分子が組換えに
より、関心の他の治療又は標的分子に融合するのを許容
する。更に、rOnc分子は、以下に示すように、細胞毒性
を増強するように修飾することができる。nOncは、標的
化剤を用いずに腫瘍細胞増殖を減少又は阻害するために
患者に直接単独で投与することができる点で特有のリボ
ヌクレアーゼであるので、我々のnOnc由来分子も要求さ
れる。
nc）の修飾体であるRNaseをいかに作製するかを発見し
た。nOncが組換え発現された場合、大きな細胞毒性を有
することは見い出されなかった。しかしながら、我々の
改良した型（rOnc）は高い細胞毒性を有し、さもなけれ
ばネイティブONCONASE 分子の利点を保持し、ここで特
定の場合にはそれらは増加された細胞毒性特性も有す
る。rOnc分子は単独で用いても便利には化学的コンジュ
ゲートを形成するように用いてもよく、そして標的組換
え免疫融合体を形成する。これらのrOnc分子は腫瘍細胞
成長を減少させるために用いることができる、nOncの有
効な組換え形態は、有利にはその組換え分子が組換えに
より、関心の他の治療又は標的分子に融合するのを許容
する。更に、rOnc分子は、以下に示すように、細胞毒性
を増強するように修飾することができる。nOncは、標的
化剤を用いずに腫瘍細胞増殖を減少又は阻害するために
患者に直接単独で投与することができる点で特有のリボ
ヌクレアーゼであるので、我々のnOnc由来分子も要求さ
れる。
本発明は、本発明の選択的細胞毒性試薬を作り出すた
めにリガンドに結合したrOncを用いて細胞を選択的に殺
す方法も含む。本方法は、殺されるべき細胞に試薬を特
異的に送るリガンド結合成分を有する本発明の細胞毒性
試薬に、殺されるべき細胞を接触させることを含む。こ
の本発明の方法は、要求されない細胞の型を選択的に殺
すことにより試験管内での細胞分離のため、例えば骨髄
剥離を患う患者への移植の前に骨髄において、又は移植
片対ホストの病気を引きおこすであろう白血病細胞又は
Ｔ細胞を殺すために用いることができる。その毒素は培
養中に不要な細胞を選択的に殺すのにも用いることがで
きる。
めにリガンドに結合したrOncを用いて細胞を選択的に殺
す方法も含む。本方法は、殺されるべき細胞に試薬を特
異的に送るリガンド結合成分を有する本発明の細胞毒性
試薬に、殺されるべき細胞を接触させることを含む。こ
の本発明の方法は、要求されない細胞の型を選択的に殺
すことにより試験管内での細胞分離のため、例えば骨髄
剥離を患う患者への移植の前に骨髄において、又は移植
片対ホストの病気を引きおこすであろう白血病細胞又は
Ｔ細胞を殺すために用いることができる。その毒素は培
養中に不要な細胞を選択的に殺すのにも用いることがで
きる。
人体に適応させた型の我々のrOnc分子は、アンギオゲ
ニン又はヒト好酸球由来ニューロトキシン（EDN）のよ
うな哺乳動物又はヒト由来RNaseのrOnc由来分子への移
植部分についても記述される。本発明の好ましい実施形
態は、EDNのアミノ末端をrOnc分子のアミノ末端上にお
く分子である。リボヌクレアーゼ活性及び試験管内抗腫
瘍効果に関するこれらのハイブリッドタンパク質の驚く
べき特性が記載される。
ニン又はヒト好酸球由来ニューロトキシン（EDN）のよ
うな哺乳動物又はヒト由来RNaseのrOnc由来分子への移
植部分についても記述される。本発明の好ましい実施形
態は、EDNのアミノ末端をrOnc分子のアミノ末端上にお
く分子である。リボヌクレアーゼ活性及び試験管内抗腫
瘍効果に関するこれらのハイブリッドタンパク質の驚く
べき特性が記載される。
図面の簡単な説明
図面の凡例
図１は、以下に記載されるラナ（Rana）クローン９の
予想されるアミノ酸配列（配列番号:2）及びnOncのアミ
ノ酸配列（配列番号:1）での配列アラインメントを示
す。ボールド部分はnOncとラナクローン９との間の同一
の残基を示す。ドットは、PCRクローンにおいて見い出
せなかったアミノ酸を示す。
予想されるアミノ酸配列（配列番号:2）及びnOncのアミ
ノ酸配列（配列番号:1）での配列アラインメントを示
す。ボールド部分はnOncとラナクローン９との間の同一
の残基を示す。ドットは、PCRクローンにおいて見い出
せなかったアミノ酸を示す。
図2A及び2Bは、実施例に例示されるDNA構成物の配置
を示す。ラナ・ピピエンスDNAが得られたPCR産物はラナ
９として同定される。そのＮ−及びＣ−末端は合成的に
満たされており、Ｎ末端のEDN/Oncハイブリッドについ
て〔Met−（−１）〕rOnc又はEDNをコードする構成物内
nOncとして同定される。対応するアミノ酸残基を各々の
構成物の下に示す。図2Bは、nOnc（配列番号:3）、rEDN
（配列番号:4）、位置20においてAspのかわりにGly
（Ｇ）を含む〔Met−（−１）〕rOnc（配列番号:5）、
アミノ酸位置26においてAspを有するrEDN(1-21)rOnc
（配列番号:6）及び位置26においてGlyを有するrEDN
(1-21)rOncG26（配列番号:7）のＮ末端配列の配列アラ
インメントを示す。ボールド文字は保存性残基を示し、
大文字は、ラナクローン９から予想される配列を示す。
を示す。ラナ・ピピエンスDNAが得られたPCR産物はラナ
９として同定される。そのＮ−及びＣ−末端は合成的に
満たされており、Ｎ末端のEDN/Oncハイブリッドについ
て〔Met−（−１）〕rOnc又はEDNをコードする構成物内
nOncとして同定される。対応するアミノ酸残基を各々の
構成物の下に示す。図2Bは、nOnc（配列番号:3）、rEDN
（配列番号:4）、位置20においてAspのかわりにGly
（Ｇ）を含む〔Met−（−１）〕rOnc（配列番号:5）、
アミノ酸位置26においてAspを有するrEDN(1-21)rOnc
（配列番号:6）及び位置26においてGlyを有するrEDN
(1-21)rOncG26（配列番号:7）のＮ末端配列の配列アラ
インメントを示す。ボールド文字は保存性残基を示し、
大文字は、ラナクローン９から予想される配列を示す。
図3A−3Dは、nOnc,rEDN,〔Met−（−１）〕rOnc又は
ハイブリッドタンパク質によるヒト腫瘍細胞におけるタ
ンパク質合成の阻害を示す。細胞（104）を個々の96ウ
エルマイクロタイター培養プレート中にプレートし、48
時間、種々の濃度の各々の剤で処理した。細胞生存力
を、以下の実施例セクションに記載されるように決定し
た。１超の個体の実験からの結果を組み合わせて平均デ
ータ点を算出した。それらがそのシンボルより大きい場
合、その平均の標準誤差を示す。細胞系:ACHN、腎臓癌
（図3A）;MDA−MB−231（図3B）及びHS 578T（図3D）、
乳癌;SF−539（図3C）、CNS癌;EDN（中あき三角形）;nO
nc（中あき四角形）；〔Met−（−１）〕rOnc（中ぬり
三角形）;rEDN(1-21)rOnc（中あき円）;rEDN(1-21)rOnc
G26（中ぬり円）。
ハイブリッドタンパク質によるヒト腫瘍細胞におけるタ
ンパク質合成の阻害を示す。細胞（104）を個々の96ウ
エルマイクロタイター培養プレート中にプレートし、48
時間、種々の濃度の各々の剤で処理した。細胞生存力
を、以下の実施例セクションに記載されるように決定し
た。１超の個体の実験からの結果を組み合わせて平均デ
ータ点を算出した。それらがそのシンボルより大きい場
合、その平均の標準誤差を示す。細胞系:ACHN、腎臓癌
（図3A）;MDA−MB−231（図3B）及びHS 578T（図3D）、
乳癌;SF−539（図3C）、CNS癌;EDN（中あき三角形）;nO
nc（中あき四角形）；〔Met−（−１）〕rOnc（中ぬり
三角形）;rEDN(1-21)rOnc（中あき円）;rEDN(1-21)rOnc
G26（中ぬり円）。
図４は、RNase Aスーパーファミリーのいくつかのメ
ンバーの配列アラインメントを示す。カエルレクチンは
ラナ・カテスベイアナ（Rana catesbeiana）からのも
の、ONCONASE 、EDN,ECP（ヒト好酸球カチオン性タン
パク質）、Angはウシアンギオゲニン、精液はウシ精液R
Nase、そしてRNase Aはウシ膵臓RNase Aである（各々配
列番号:8、１及び９−13）。全てのメンバー内で保存さ
れるアミノ酸は大文字で示し、そして活性部位残基H12,
K41、及びH119（RNase Aナンバリング）はアスタリスク
で示す。
ンバーの配列アラインメントを示す。カエルレクチンは
ラナ・カテスベイアナ（Rana catesbeiana）からのも
の、ONCONASE 、EDN,ECP（ヒト好酸球カチオン性タン
パク質）、Angはウシアンギオゲニン、精液はウシ精液R
Nase、そしてRNase Aはウシ膵臓RNase Aである（各々配
列番号:8、１及び９−13）。全てのメンバー内で保存さ
れるアミノ酸は大文字で示し、そして活性部位残基H12,
K41、及びH119（RNase Aナンバリング）はアスタリスク
で示す。
図５は、MetSerOnc及びMetSer−又はMetGlu−OncFvs
によるタンパク質合成の阻害を示す。一本鎖抗体rOnc融
合タンパク質;E6FB〔Met−（−１）〕SerrOnc（中ぬり
円）、〔Met−（−１）〕SerrOnc−Ang FBE 6（中あき
四角）及び〔Met−（−１）〕GlurOnc FBE 6（中ぬり四
角）の細胞毒性効果を、SF539細胞内のタンパク質合成
の阻害を決定することにより、非標的化組換えタンパク
質〔Met−（−１）〕SerrOnc（中あき円）と比較した。
細胞を、10％熱不活性化胎児ウシ血清を加えたダルベッ
コの最小必須培地内の96ウエルマイクロタイタープレー
ト内にプレートした。全量を10μｌにし、そのプレート
を３日間、37℃でインキュベートした。0.1mCiの
〔14C〕ロイシンを含むリン酸緩衝塩類溶液を２〜４時
間加え、その細胞を:PHD細胞ハーベスターを用いてガラ
スファイバーフィルター上に収集し、水で洗い、エタノ
ールで乾燥して計数した。その結果は、偽処理ウエル内
の〔14C〕ロイシン組込みのパーセントとして表現され
る。
によるタンパク質合成の阻害を示す。一本鎖抗体rOnc融
合タンパク質;E6FB〔Met−（−１）〕SerrOnc（中ぬり
円）、〔Met−（−１）〕SerrOnc−Ang FBE 6（中あき
四角）及び〔Met−（−１）〕GlurOnc FBE 6（中ぬり四
角）の細胞毒性効果を、SF539細胞内のタンパク質合成
の阻害を決定することにより、非標的化組換えタンパク
質〔Met−（−１）〕SerrOnc（中あき円）と比較した。
細胞を、10％熱不活性化胎児ウシ血清を加えたダルベッ
コの最小必須培地内の96ウエルマイクロタイタープレー
ト内にプレートした。全量を10μｌにし、そのプレート
を３日間、37℃でインキュベートした。0.1mCiの
〔14C〕ロイシンを含むリン酸緩衝塩類溶液を２〜４時
間加え、その細胞を:PHD細胞ハーベスターを用いてガラ
スファイバーフィルター上に収集し、水で洗い、エタノ
ールで乾燥して計数した。その結果は、偽処理ウエル内
の〔14C〕ロイシン組込みのパーセントとして表現され
る。
図6A及び6Bは、細胞系SF 539、ヒトグリオーム細胞、
並びにMetLysTryrOncと呼ばれるrOnc融合タンパク質
（中あき円、図6A）;MetAlaAlaTyrOnc（中ぬり円、図6
A）；並びにシグナルペプチド、MetKDELSerrOnc（中あ
き円、図6B）及びMetNLSerrOnc（中ぬり円、図6B）との
rOnc融合タンパク質を用いて、図3A−3Dに記載されるよ
うなアッセイにおけるタンパク質合成の阻害を示す。
並びにMetLysTryrOncと呼ばれるrOnc融合タンパク質
（中あき円、図6A）;MetAlaAlaTyrOnc（中ぬり円、図6
A）；並びにシグナルペプチド、MetKDELSerrOnc（中あ
き円、図6B）及びMetNLSerrOnc（中ぬり円、図6B）との
rOnc融合タンパク質を用いて、図3A−3Dに記載されるよ
うなアッセイにおけるタンパク質合成の阻害を示す。
図７は、細胞系SF 539、ヒトグリオーマ細胞を用いて
図3A−3Dについて記載されるようなアッセイにおけるタ
ンパク質合成の阻害を示し、MetSerOncに対応する３つ
の融合タンパク質（Met−Serアミノ末端を有する配列番
号:39）:MetSerOnc（中ぬり円）、MetSerOnc C4（配列
番号:39のアミノ酸位置５においてCysを有するMetSerOn
c、中ぬり四角）及びMetSerOnc C72（配列番号:39のア
ミノ酸位置73においてCysを有するMetSerOnc、中あき
円）を比較する。
図3A−3Dについて記載されるようなアッセイにおけるタ
ンパク質合成の阻害を示し、MetSerOncに対応する３つ
の融合タンパク質（Met−Serアミノ末端を有する配列番
号:39）:MetSerOnc（中ぬり円）、MetSerOnc C4（配列
番号:39のアミノ酸位置５においてCysを有するMetSerOn
c、中ぬり四角）及びMetSerOnc C72（配列番号:39のア
ミノ酸位置73においてCysを有するMetSerOnc、中あき
円）を比較する。
詳細な記載
本発明は、細胞、特に腫瘍細胞を選択的に殺し標的化
するのに用いることができる高い活性で細胞毒性のリボ
ヌクレアーゼ分子を供する。特定の実施形態において、
その分子は、高い活性及び細胞毒性を有するが、ヒトに
おいて免疫原性が弱い重なる利点を有するヒト由来のリ
ボヌクレアーゼからの配列を組み込むようにデザインさ
れる。本発明のrOnc分子は、組換えnOnc由来配列である
ものである。
するのに用いることができる高い活性で細胞毒性のリボ
ヌクレアーゼ分子を供する。特定の実施形態において、
その分子は、高い活性及び細胞毒性を有するが、ヒトに
おいて免疫原性が弱い重なる利点を有するヒト由来のリ
ボヌクレアーゼからの配列を組み込むようにデザインさ
れる。本発明のrOnc分子は、組換えnOnc由来配列である
ものである。
nOnc分子は後の配列番号:1のアミノ酸配列を有する。
ウシ膵臓RNase Aは後の配列番号:13のアミノ酸配列を有
する。他に示さなければ、本明細書に記載されるアミノ
酸配列位置は、RNaseの分野で一般に用いられる引用配
列であるような、配列番号:13の標準のウシ膵臓RNase A
配列の枠として用いる。このような位置デザインがクレ
ームされる分子自体のアミノ酸の数を示すのではなく、
クレームされる分子配列をウシRNaseとアラインした時
にクレームされる分子内での残基のある位置を示すもの
であることが理解されるはずである。
ウシ膵臓RNase Aは後の配列番号:13のアミノ酸配列を有
する。他に示さなければ、本明細書に記載されるアミノ
酸配列位置は、RNaseの分野で一般に用いられる引用配
列であるような、配列番号:13の標準のウシ膵臓RNase A
配列の枠として用いる。このような位置デザインがクレ
ームされる分子自体のアミノ酸の数を示すのではなく、
クレームされる分子配列をウシRNaseとアラインした時
にクレームされる分子内での残基のある位置を示すもの
であることが理解されるはずである。
本明細書に記載され、クレームされるrOnc分子は、好
ましくは、アミノ酸位置26,40,58,84,95及び110に対応
するアミノ酸位置でのシステイン残基；位置41のリシン
及び位置119のヒスチジンを、ウシRNase A（配列番号1
3）を引用して有する（このような位置は配列番号:1に
示されるnOnc配列のアミノ酸位置19,30,48,68,75及び90
並びに87及び104に各々相当する）。
ましくは、アミノ酸位置26,40,58,84,95及び110に対応
するアミノ酸位置でのシステイン残基；位置41のリシン
及び位置119のヒスチジンを、ウシRNase A（配列番号1
3）を引用して有する（このような位置は配列番号:1に
示されるnOnc配列のアミノ酸位置19,30,48,68,75及び90
並びに87及び104に各々相当する）。
本発明のrOnc分子は、以下に定義されるように、測定
可能なリボヌクレアーゼ活性を有するものである。その
リボヌクレアーゼは、（ａ）メチオニンで始まり、次に
グルタミン酸（Glu）以外のいずれかのアミノ酸がある
アミノ末端；（ｂ）ウシRNase Aのアミノ酸配列（配列
番号:13）の番号を引用して決定した位置におけるアミ
ノ酸位置26,40,58,84,95及び110におけるシステイン；
位置41におけるリシン及び位置119におけるヒスチジ
ン；並びに（ｃ）nOnc由来アミノ酸配列も有するであろ
う。
可能なリボヌクレアーゼ活性を有するものである。その
リボヌクレアーゼは、（ａ）メチオニンで始まり、次に
グルタミン酸（Glu）以外のいずれかのアミノ酸がある
アミノ末端；（ｂ）ウシRNase Aのアミノ酸配列（配列
番号:13）の番号を引用して決定した位置におけるアミ
ノ酸位置26,40,58,84,95及び110におけるシステイン；
位置41におけるリシン及び位置119におけるヒスチジ
ン；並びに（ｃ）nOnc由来アミノ酸配列も有するであろ
う。
好ましくは、rOnc分子は、
Met−Ala;
Met−Ala−Ala−Ser;
Met−Arg;
Met−（Ｊ）；
Met−Lys−（Ｊ）；
Met−Arg−（Ｊ）；
Met−Lys;
Met−Lys−Pro;
Met−Lys−（Ｊ）−Pro（配列番号:14）；
Met−Lys−Pro−（Ｊ）（配列番号:15）；
Met−Asn;
Met−Gln;
Met−Asn−（Ｊ）；
Met−Gln−（Ｊ）；
Met−Asn−（Ｊ）−Pro（配列番号:16）；
Met−（Ｊ）−Lys;
Met−（Ｊ）−Lys−Pro（配列番号:17）；及び
Met−（Ｊ）−Pro−Lys（配列番号:18）；
（ここで、（Ｊ）はSer,Tyr又はThrである）からなる群
から選択されるアミノ末端を有するだろう。
から選択されるアミノ末端を有するだろう。
更に、rOnc分子は、nOncのアミノ酸位置２（ウシRNas
e Aの配列を引用して位置４）のアスパラギン酸が欠失
され又はAlaもしくはAsnにより置換されるように修飾さ
れるのが好ましい。
e Aの配列を引用して位置４）のアスパラギン酸が欠失
され又はAlaもしくはAsnにより置換されるように修飾さ
れるのが好ましい。
rOnc分子の他の形態において、その分子は、EDNのア
ミノ末端由来の配列及び次のrOncからの配列によりコー
ドされるアミノ末端を用いるであろう。このような形態
において、そのアミノ酸配列は、式： Met（−１）EDN(1-m)Onc(n-104) （式中、Met（−１）はMetのアミノ末端残基でいい;EDN
(1-m)は、EDN（配列番号:9）のアミノ酸位置１で始ま
り、それに続いて、EDNのアミノ酸位置“m"までを含
む、長さのアミノ酸の連続配列をいい;Onc(n-104)は、
アミノ酸位置“n"で始まりそれに続いて配列番号:1に示
すようなアミノ酸位置104までを含む連続アミノ酸の配
列をいい、ここで、 ｍが21であるなら、ｎは16又は17であり； ｍが22であるなら、ｎは17であり； ｍが20であるなら、ｎは16であり； ｍが19であるなら、ｎは15であり； ｍが18であるなら、ｎは14であり； ｍが17であるなら、ｎは12又は13であり； ｍが16であるなら、ｎは11,12,13又は14であり； ｍが15であるなら、ｎは10であり； ｍが14であるなら、ｎは９であり； ｍが13であるなら、ｎは８であり；そして ｍが５であるなら、ｎは１である）の配列と実質的に
同一である配列からなる群から選択されるものである。
ミノ末端由来の配列及び次のrOncからの配列によりコー
ドされるアミノ末端を用いるであろう。このような形態
において、そのアミノ酸配列は、式： Met（−１）EDN(1-m)Onc(n-104) （式中、Met（−１）はMetのアミノ末端残基でいい;EDN
(1-m)は、EDN（配列番号:9）のアミノ酸位置１で始ま
り、それに続いて、EDNのアミノ酸位置“m"までを含
む、長さのアミノ酸の連続配列をいい;Onc(n-104)は、
アミノ酸位置“n"で始まりそれに続いて配列番号:1に示
すようなアミノ酸位置104までを含む連続アミノ酸の配
列をいい、ここで、 ｍが21であるなら、ｎは16又は17であり； ｍが22であるなら、ｎは17であり； ｍが20であるなら、ｎは16であり； ｍが19であるなら、ｎは15であり； ｍが18であるなら、ｎは14であり； ｍが17であるなら、ｎは12又は13であり； ｍが16であるなら、ｎは11,12,13又は14であり； ｍが15であるなら、ｎは10であり； ｍが14であるなら、ｎは９であり； ｍが13であるなら、ｎは８であり；そして ｍが５であるなら、ｎは１である）の配列と実質的に
同一である配列からなる群から選択されるものである。
他のかわりの実施形態において、rOnc分子は、そのカ
ルボキシル末端においてアンギオゲニンからの配列、例
えば配列番号:11に例示される配列又は配列番号20のア
ミノ酸位置101〜107における配列に融合されるであろ
う。ヒトアンギオゲニンの核酸配列は周知であり、米国
特許出願第08/125,462号に記載される。
ルボキシル末端においてアンギオゲニンからの配列、例
えば配列番号:11に例示される配列又は配列番号20のア
ミノ酸位置101〜107における配列に融合されるであろ
う。ヒトアンギオゲニンの核酸配列は周知であり、米国
特許出願第08/125,462号に記載される。
好ましいrOnc核酸配列は、配列番号:20,22,24,26,28
及び30の配列と実質的に同一である好ましいrOncアミノ
酸配列をコードする配列である（対応する核酸配列は各
々配列番号19,21,23,25,27及び29に示される）。最も好
ましいrOncアミノ酸配列は、実質的に、配列番号:20,2
2,24及び26に記載される配列と同一である配列である。
それらに対応する核酸配列も好ましく、それらの保存的
に修飾された変異体を含む配列番号19,21,23及び25に示
される。最も好ましい配列は、nOncのアミノ酸残基20
（Asp）がGlyで置換された、nOnc配列の16〜104アミノ
酸に移植されたEDNのアミノ末端の１〜21（典型的には2
1）のアミノ酸を含むアミノ末端を用いる配列番号:22を
含む。好ましい、rOnc配列は、任意に、配列番号:39を
引用して、アミノ酸位置５もしくは73に相当する位置に
Cys、又はCysの位置のアミノ酸配列88にAlaを含むであ
ろう。
及び30の配列と実質的に同一である好ましいrOncアミノ
酸配列をコードする配列である（対応する核酸配列は各
々配列番号19,21,23,25,27及び29に示される）。最も好
ましいrOncアミノ酸配列は、実質的に、配列番号:20,2
2,24及び26に記載される配列と同一である配列である。
それらに対応する核酸配列も好ましく、それらの保存的
に修飾された変異体を含む配列番号19,21,23及び25に示
される。最も好ましい配列は、nOncのアミノ酸残基20
（Asp）がGlyで置換された、nOnc配列の16〜104アミノ
酸に移植されたEDNのアミノ末端の１〜21（典型的には2
1）のアミノ酸を含むアミノ末端を用いる配列番号:22を
含む。好ましい、rOnc配列は、任意に、配列番号:39を
引用して、アミノ酸位置５もしくは73に相当する位置に
Cys、又はCysの位置のアミノ酸配列88にAlaを含むであ
ろう。
本明細書に供されるrOnc配列の比較は、膵臓RNase A
スーパーファミリー内の記載される配列に対して行うこ
とができる。このようなメンバーの多くは周知であり、
これらに限定されないが、ラナ・カテスベイアナ（Rana
catesbeiana）からのカエルレクチン（Titaniら.,Bioc
hemistry 26:2189（1987））;ONCONASE （Ardelt,W.
ら、J.Biol.Chem.266:245（1991））；好酸球由来ニュ
ーロトキシン（EDN）（Rosenbergら.,前掲）；ヒト好酸
球カチオン性タンパク質（ECP）（Rosenbergら.,J.Exp.
Med.170:163（1989））；アンギオゲニン（Ang）（Fet
t,J.W.ら.,Biochemistry 24:5480（1985））；ウシ精液
RNase（Preussら.,Nuc.Acids.Res.18:1057（1990））；
及びウシ膵臓RNase（Beintamaら.,Prog.Biophys.Mol.Bi
ol.51:165（1988））を含む。これら全てのタンパク質
についての文献は、本明細書に引用により組み込まれ
る。このようなRNaseについてのアミノ酸配列アライン
メントは、図４並びに引用により本明細書に組み込まれ
るYouleら（Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Systems 10:1
−28（1993））及び米国特許出願通し番号08/125,462号
に示される。
スーパーファミリー内の記載される配列に対して行うこ
とができる。このようなメンバーの多くは周知であり、
これらに限定されないが、ラナ・カテスベイアナ（Rana
catesbeiana）からのカエルレクチン（Titaniら.,Bioc
hemistry 26:2189（1987））;ONCONASE （Ardelt,W.
ら、J.Biol.Chem.266:245（1991））；好酸球由来ニュ
ーロトキシン（EDN）（Rosenbergら.,前掲）；ヒト好酸
球カチオン性タンパク質（ECP）（Rosenbergら.,J.Exp.
Med.170:163（1989））；アンギオゲニン（Ang）（Fet
t,J.W.ら.,Biochemistry 24:5480（1985））；ウシ精液
RNase（Preussら.,Nuc.Acids.Res.18:1057（1990））；
及びウシ膵臓RNase（Beintamaら.,Prog.Biophys.Mol.Bi
ol.51:165（1988））を含む。これら全てのタンパク質
についての文献は、本明細書に引用により組み込まれ
る。このようなRNaseについてのアミノ酸配列アライン
メントは、図４並びに引用により本明細書に組み込まれ
るYouleら（Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Systems 10:1
−28（1993））及び米国特許出願通し番号08/125,462号
に示される。
定義
本明細書で他に示さない限り、本明細書に用いられる
全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する当業者
により一般に理解されるのと同じ意味を有する。Single
tonら（（1994）Dictionary of Microbiology and Mole
cular Biology,second edition,John Wiley and Sons
（New York））、並びにHale及びMarham（（1991）The
Harper Collins Dictionary of Biology,Harper Perenn
ial,NY）は、本明細書に用いられる用語の多くの一般的
辞書を当業者に供する。本明細書に記載されるものと同
様又は同等であるいずれかの方法及び材料を、本発明の
実施及びテストに用いることができるが、好ましい方法
及び材料が記載される、本発明の目的のため、以下の用
語は次のように定義される。
全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する当業者
により一般に理解されるのと同じ意味を有する。Single
tonら（（1994）Dictionary of Microbiology and Mole
cular Biology,second edition,John Wiley and Sons
（New York））、並びにHale及びMarham（（1991）The
Harper Collins Dictionary of Biology,Harper Perenn
ial,NY）は、本明細書に用いられる用語の多くの一般的
辞書を当業者に供する。本明細書に記載されるものと同
様又は同等であるいずれかの方法及び材料を、本発明の
実施及びテストに用いることができるが、好ましい方法
及び材料が記載される、本発明の目的のため、以下の用
語は次のように定義される。
アミノ酸は、本明細書で、IUPAC−IUB生化学命名協会
により推奨される一般的に知られる３文字記号又は１文
字記号のいずれかにより言及され得る。同様に、ヌクレ
オチドは、それらの一般的に許容される一文字コードに
より言及され得る。
により推奨される一般的に知られる３文字記号又は１文
字記号のいずれかにより言及され得る。同様に、ヌクレ
オチドは、それらの一般的に許容される一文字コードに
より言及され得る。
用語“測定可能なリボヌクレアーゼ活性”又は“大き
なリボヌクレアーゼ活性”とは、タンパク質合成を、酸
沈澱性タンパク質への〔35S〕メチオニンの組込みによ
り測定しながら阻害するウサギ網状赤血球ライゼートア
ッセイに加えた時に40未満のIC50（ng/m）を有する分
子をいう。IC50は、アッセイにおいて50％だけタンパク
質合成を阻害するのに必要なタンパク質の濃度である。
そのライゼートアッセイは、Promega Corporation,Madi
son,WIから市販されるPromegaライゼートアッセイキッ
トに記載されるように行うことができる。高分子量RNA
及びtRNAを用いるリボヌクレアーゼ活性は、公開されて
いるプロトコル（Newton,D.L.ら（1996）Biochemistry
35:545−553）に従う過塩素酸可溶性ヌクレオチドの形
成により37℃で決定される。ポリ（A,C）UpG及びポリＵ
と共に、リボヌクレアーゼ活性は、DePriscoら.,並びに
Libonati及びFloridi（DePrisco,R.,ら、（1984）Bioch
imica et Biophysica Acta 788:356−363;Libonati,M.
ら．（1969）European J.Biochem.8:81−87）に従って
アッセイされる。活性は、260nmにおける吸光度の時間
での増加を測定することによりアッセイされる。インキ
ュベーション混合物（10mMイミダゾール、0.1M NaCl,pH
6.5又はpH7の1m）は、25℃において基質及び適切な量
の酵素溶液を含む。試験管内翻訳アッセイ（St.Clair,
D.K.ら（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.84,8330−8334）及
び３−（4,5−ジメチルチアゾール−２−イル）−2,5−
ジフェニルテトラゾリウムブロマイド；チアゾリルブル
ー（MMT）を用いる細胞生存率アッセイ（Mossman,T.（1
983）J.Immunol.Methods 65:55−63）は、上述のように
行われる（Pearson,J.Wら（1991）J.Natl.Cancer Inst.
83:1386−1391）。
なリボヌクレアーゼ活性”とは、タンパク質合成を、酸
沈澱性タンパク質への〔35S〕メチオニンの組込みによ
り測定しながら阻害するウサギ網状赤血球ライゼートア
ッセイに加えた時に40未満のIC50（ng/m）を有する分
子をいう。IC50は、アッセイにおいて50％だけタンパク
質合成を阻害するのに必要なタンパク質の濃度である。
そのライゼートアッセイは、Promega Corporation,Madi
son,WIから市販されるPromegaライゼートアッセイキッ
トに記載されるように行うことができる。高分子量RNA
及びtRNAを用いるリボヌクレアーゼ活性は、公開されて
いるプロトコル（Newton,D.L.ら（1996）Biochemistry
35:545−553）に従う過塩素酸可溶性ヌクレオチドの形
成により37℃で決定される。ポリ（A,C）UpG及びポリＵ
と共に、リボヌクレアーゼ活性は、DePriscoら.,並びに
Libonati及びFloridi（DePrisco,R.,ら、（1984）Bioch
imica et Biophysica Acta 788:356−363;Libonati,M.
ら．（1969）European J.Biochem.8:81−87）に従って
アッセイされる。活性は、260nmにおける吸光度の時間
での増加を測定することによりアッセイされる。インキ
ュベーション混合物（10mMイミダゾール、0.1M NaCl,pH
6.5又はpH7の1m）は、25℃において基質及び適切な量
の酵素溶液を含む。試験管内翻訳アッセイ（St.Clair,
D.K.ら（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.84,8330−8334）及
び３−（4,5−ジメチルチアゾール−２−イル）−2,5−
ジフェニルテトラゾリウムブロマイド；チアゾリルブル
ー（MMT）を用いる細胞生存率アッセイ（Mossman,T.（1
983）J.Immunol.Methods 65:55−63）は、上述のように
行われる（Pearson,J.Wら（1991）J.Natl.Cancer Inst.
83:1386−1391）。
“nOnc由来”アミノ酸配列は、nOncアミノ酸配列（配
列番号:1）のアミノ酸位置１（Gluがpyro Gluにおきか
わる）、2,3,4,5,6,7,8,11,12,13,14,15,16,18,19,20,2
2,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,41,
42,43,44,45,46,47,50,52,54,56,59,60,61,62,63,64,6
5,66,67,68,69,70,71,72,73,74,76,80,81,82,84,85,86,
87,91,92,93,95、又は96で始まる配列の群から選択され
る６アミノ酸の連続配列と同一である６連続アミノ酸の
少なくとも１のストリングを含むものである。
列番号:1）のアミノ酸位置１（Gluがpyro Gluにおきか
わる）、2,3,4,5,6,7,8,11,12,13,14,15,16,18,19,20,2
2,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,41,
42,43,44,45,46,47,50,52,54,56,59,60,61,62,63,64,6
5,66,67,68,69,70,71,72,73,74,76,80,81,82,84,85,86,
87,91,92,93,95、又は96で始まる配列の群から選択され
る６アミノ酸の連続配列と同一である６連続アミノ酸の
少なくとも１のストリングを含むものである。
特定の核酸配列の“保存的に修飾された変異体”と
は、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコード
する核酸、又は核酸がアミノ酸配列をコードしないな
ら、本質的に同一の配列をいう。遺伝子コードの縮重の
ため、大数の機能的同一の核酸がいずれかの所定のポリ
ペプチドをコードする。例えば、コドンGLA,GCC,GCG及
びGCUは全てアミノ酸アラニンをコードする。これによ
り、アラニンがコドンにより特定される各々の位置にお
いて、そのコドンは、そのコードされたポリぺプチドを
変えずに、記載される対応するコドンのいずれかに変え
ることができる。このような核酸変異は保存的に修飾さ
れた変異体の一種である“サイレント変異”である。ポ
リペプチドをコードする本明細書の各々の核酸は、その
核酸の各々の可能なサイレント変異体を記述する。当業
者は、（通常、メチオニンのための唯一のコドンである
AUGを除く）核酸における各々のコドンが、修飾されて
機能的に同一の分子を作り出すことができることが認め
られよう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各
々のサイレント変異体は、各々の記載される配列に含ま
れる。更に、当業者は、単一のアミノ酸又はコード化配
列中のアミノ酸の数％を変換、付加又は削除する個々の
置換、欠失又は付加は、その変換が化学的に類似したア
ミノ酸であるアミノ酸の置換を生ずる場合、“保存的に
改変された変異体”であることを認めるであろう。機能
的に類似したアミノ酸を供する保存的置換テーブルは当
該技術で公知である。以下の６つのグループ各々は、互
いに保存的置換であるアミノ酸を含む。
は、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコード
する核酸、又は核酸がアミノ酸配列をコードしないな
ら、本質的に同一の配列をいう。遺伝子コードの縮重の
ため、大数の機能的同一の核酸がいずれかの所定のポリ
ペプチドをコードする。例えば、コドンGLA,GCC,GCG及
びGCUは全てアミノ酸アラニンをコードする。これによ
り、アラニンがコドンにより特定される各々の位置にお
いて、そのコドンは、そのコードされたポリぺプチドを
変えずに、記載される対応するコドンのいずれかに変え
ることができる。このような核酸変異は保存的に修飾さ
れた変異体の一種である“サイレント変異”である。ポ
リペプチドをコードする本明細書の各々の核酸は、その
核酸の各々の可能なサイレント変異体を記述する。当業
者は、（通常、メチオニンのための唯一のコドンである
AUGを除く）核酸における各々のコドンが、修飾されて
機能的に同一の分子を作り出すことができることが認め
られよう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各
々のサイレント変異体は、各々の記載される配列に含ま
れる。更に、当業者は、単一のアミノ酸又はコード化配
列中のアミノ酸の数％を変換、付加又は削除する個々の
置換、欠失又は付加は、その変換が化学的に類似したア
ミノ酸であるアミノ酸の置換を生ずる場合、“保存的に
改変された変異体”であることを認めるであろう。機能
的に類似したアミノ酸を供する保存的置換テーブルは当
該技術で公知である。以下の６つのグループ各々は、互
いに保存的置換であるアミノ酸を含む。
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン
（Ｔ）； ２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）； ３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）； ４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）； ５）イソロイシン（Ｚ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン
（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び ６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプ
トファン（Ｗ）。
（Ｔ）； ２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）； ３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）； ４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）； ５）イソロイシン（Ｚ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン
（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び ６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプ
トファン（Ｗ）。
Creighton（1984）Proteins W.H.Freeman and compan
yも参照のこと。
yも参照のこと。
用語“単離”又は“生物学的に純粋”とは、その天然
の環境で見い出されるな通常それに伴う構成物が実質的
又は本質的にない材料をいう。その単離された材料は、
任意に、その自然の環境内の材料と共に見い出されない
材料を含む。本明細書に記載されるrOncsは単離され、
それらが関係のないラナ・ピピエンスタンパク質の欠如
下で組換え生産されるので、生物学的に純粋である。し
かしながら、それらは、異種細胞構成物、リガンド結合
成分、及びラベル等を含む。
の環境で見い出されるな通常それに伴う構成物が実質的
又は本質的にない材料をいう。その単離された材料は、
任意に、その自然の環境内の材料と共に見い出されない
材料を含む。本明細書に記載されるrOncsは単離され、
それらが関係のないラナ・ピピエンスタンパク質の欠如
下で組換え生産されるので、生物学的に純粋である。し
かしながら、それらは、異種細胞構成物、リガンド結合
成分、及びラベル等を含む。
用語“核酸”とは、一本鎖又は二本鎖形態のいずれか
のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリ
マーをいい、他に限定しなければ、天然のヌクレオチド
と同様に核酸にハイブリダイズする天然のヌクレオチド
の周知のアナログを含む。他に示さなければ、特定の核
酸配列はその相補配列を含む。核酸は、それが特定の核
酸と同じであるか又は特定の核酸と相補的である他の核
酸をコードする。
のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリ
マーをいい、他に限定しなければ、天然のヌクレオチド
と同様に核酸にハイブリダイズする天然のヌクレオチド
の周知のアナログを含む。他に示さなければ、特定の核
酸配列はその相補配列を含む。核酸は、それが特定の核
酸と同じであるか又は特定の核酸と相補的である他の核
酸をコードする。
“発現ベクター”は、細胞により転写され翻訳され得
るrOncポリペプチドをコードする核酸を含む組換え発現
カセットを含む。組換え発現カセットは、標的細胞内で
特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素と共
に、組換え又は合成で作られた核酸構成物である。発現
ベクターは、プラスミド、ウィルス、又は核酸フラグメ
ントの一部であり得る。典型的には、発現ベクターの組
換え発現カセット部分は転写されるべき核酸、及びプロ
モーターを含む。
るrOncポリペプチドをコードする核酸を含む組換え発現
カセットを含む。組換え発現カセットは、標的細胞内で
特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素と共
に、組換え又は合成で作られた核酸構成物である。発現
ベクターは、プラスミド、ウィルス、又は核酸フラグメ
ントの一部であり得る。典型的には、発現ベクターの組
換え発現カセット部分は転写されるべき核酸、及びプロ
モーターを含む。
タンパク質を引用して用いられる用語“組換え”と
は、細胞が、その起源がその細胞に対して外因性である
核酸によりコードされるペプチド又はタンパク質を発現
することを示す。組換え細胞は、その細胞のネイティブ
（非組換え）形態において見い出されない遺伝子を発現
することができる。組換え細胞は、その遺伝子が人工的
な手段により細胞内に再導入される細胞のネイティブ形
態において見い出される遺伝子を、異種プロモーターの
制御下で発現することもできる。
は、細胞が、その起源がその細胞に対して外因性である
核酸によりコードされるペプチド又はタンパク質を発現
することを示す。組換え細胞は、その細胞のネイティブ
（非組換え）形態において見い出されない遺伝子を発現
することができる。組換え細胞は、その遺伝子が人工的
な手段により細胞内に再導入される細胞のネイティブ形
態において見い出される遺伝子を、異種プロモーターの
制御下で発現することもできる。
特定の核酸又はポリペプチド配列の文脈における用語
“サブ配列”とは、特定の核酸又はポリペプチドに等し
い又はそれより小さい核酸又はポリペプチドの領域をい
う。
“サブ配列”とは、特定の核酸又はポリペプチドに等し
い又はそれより小さい核酸又はポリペプチドの領域をい
う。
核酸ハイブリダイゼーション実験例えばサザン及びノ
ーザンハイブリダイゼーションの文脈における“ストリ
ンジエントハイブリダイゼーション洗浄条件”は配列依
存性であり、異なる環境パラメータ下において異なる。
核酸のハイブリダイゼーションへの更なる案内は、Tijs
sen（（1993 Laboratory Techniques in Biochemistry
and Molecular Biology−−Hybridization with Nuclei
c Acid Probes Part I,Chapter 2“Overview of princi
ples of hybridization and the strategy of nucleic
acid probe assays",Elsevier,New York）に見い出され
る。一般に、高いストリンジェント洗浄条件は、所定の
イオン強度及びpHにおいて特定の配列について熱的融点
より約５℃低いように選択される。Tmは、標的配列の50
％が完全に適合したプローブにハイブリダイズする（所
定のイオン強度及びpH下での）温度である。極めてスト
リンジェントな条件は、特定のプローブについてTm点に
等しいように選択される。ストリンジェント条件下で互
いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードする
ポリペプチドが実質的に同一であるなら、なお実質的に
同一である。これは、例えば核酸のコピーが、遺伝コー
ドにより許容される最大のコドン縮重を用いて作られた
場合におこる。
ーザンハイブリダイゼーションの文脈における“ストリ
ンジエントハイブリダイゼーション洗浄条件”は配列依
存性であり、異なる環境パラメータ下において異なる。
核酸のハイブリダイゼーションへの更なる案内は、Tijs
sen（（1993 Laboratory Techniques in Biochemistry
and Molecular Biology−−Hybridization with Nuclei
c Acid Probes Part I,Chapter 2“Overview of princi
ples of hybridization and the strategy of nucleic
acid probe assays",Elsevier,New York）に見い出され
る。一般に、高いストリンジェント洗浄条件は、所定の
イオン強度及びpHにおいて特定の配列について熱的融点
より約５℃低いように選択される。Tmは、標的配列の50
％が完全に適合したプローブにハイブリダイズする（所
定のイオン強度及びpH下での）温度である。極めてスト
リンジェントな条件は、特定のプローブについてTm点に
等しいように選択される。ストリンジェント条件下で互
いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードする
ポリペプチドが実質的に同一であるなら、なお実質的に
同一である。これは、例えば核酸のコピーが、遺伝コー
ドにより許容される最大のコドン縮重を用いて作られた
場合におこる。
２つの核酸又はポリペプチド配列の文脈における用語
“同一”とは、特定の比較窓にわたって最大の一致でア
ラインした場合に同じである２つの配列中の残基をい
う。配列同一性のパーセンテージがタンパク質プロペプ
チドを引用して用いられる場合、同一でない残基部分
は、保存的アミノ酸置換によりしばしば異なり、ここで
アミノ酸残基は同様の化学特性（例えば電荷又は疎水
性）の他のアミノ酸残基に置換され、それゆえその分子
の機能的特性を変化させないことが認められる。配列が
保存的置換において異なる場合、置換の保存的性質を正
すために、配列同一性の割合（％）は上昇するよう調整
することができる。この調整を行うための手段は当業者
に公知である。典型的には、これは、全てのミスマッチ
よりむしろ部分的なミスマッチとして保存的置換を点数
化することにより、配列同一性の割合を増加させること
に関する。これにより、例えば、同一のアミノ酸なら１
のスコアが供され、非保存性置換なら０のスコアが供さ
れ、保存性置換なら０と１との間のスコアが供される。
保存性置換の点数化は、例えばプログラムPC/GENE（Int
elligenetics,Mountain View,California,USA）におい
て扱われるMeyer及びMiller（Computer Applic.Biol.Sc
i.,4:11−17（1988））のアルゴリズムに従って計算さ
れる。
“同一”とは、特定の比較窓にわたって最大の一致でア
ラインした場合に同じである２つの配列中の残基をい
う。配列同一性のパーセンテージがタンパク質プロペプ
チドを引用して用いられる場合、同一でない残基部分
は、保存的アミノ酸置換によりしばしば異なり、ここで
アミノ酸残基は同様の化学特性（例えば電荷又は疎水
性）の他のアミノ酸残基に置換され、それゆえその分子
の機能的特性を変化させないことが認められる。配列が
保存的置換において異なる場合、置換の保存的性質を正
すために、配列同一性の割合（％）は上昇するよう調整
することができる。この調整を行うための手段は当業者
に公知である。典型的には、これは、全てのミスマッチ
よりむしろ部分的なミスマッチとして保存的置換を点数
化することにより、配列同一性の割合を増加させること
に関する。これにより、例えば、同一のアミノ酸なら１
のスコアが供され、非保存性置換なら０のスコアが供さ
れ、保存性置換なら０と１との間のスコアが供される。
保存性置換の点数化は、例えばプログラムPC/GENE（Int
elligenetics,Mountain View,California,USA）におい
て扱われるMeyer及びMiller（Computer Applic.Biol.Sc
i.,4:11−17（1988））のアルゴリズムに従って計算さ
れる。
比較のための配列のアラインメントの方法は当該技術
で公知である。比較のための配列の最適のアラインメン
トは、Smith及びWaterman（（1981）Adv.Appl.Math.2:4
82の局所的相同性アルゴリズムにより;Needleman及びWu
nsch（（1970）J.Mol.Biol.48:443の相同性アラインメ
ントアルゴリズムにより;Pearson及びLipman（（1988）
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85.2444）の類似性方法につい
ての調査により；これらのプログラムのコンピュータ化
操作（例えばこれらに限定されないが、the PC/Geneプ
ログラムのCLUSTAL（Intelligenetics,Mountain View,C
alifornia）,GAP,BESTFIT,FASTA,及びTFASTA（Wisconsi
n Genetics Software Package,Genetics Computer Grou
p（GCG）,575 Science Dr.,Madison,Wisconsin,USA））
により行うことができる。CLUSTALプログラムはHiggins
及びSharp（（1988）Gene,73:237−244）並びにHiggins
及びSharp（（1989）Computer Applications in the Bi
osciences 5:151−153）;Corpet,ら．（（1988）Nuclei
c Acids Research 16,10881−90）;Huang,ら．（1992）
Computer Applications in the Biosciences 8,155−6
5），及びPearson,ら．（（1994）Methods in Molecula
r Biology 24,307−31）に十分に開示される。アライン
メントは、しばしば視察及び手動のアラインメントによ
り行われる。
で公知である。比較のための配列の最適のアラインメン
トは、Smith及びWaterman（（1981）Adv.Appl.Math.2:4
82の局所的相同性アルゴリズムにより;Needleman及びWu
nsch（（1970）J.Mol.Biol.48:443の相同性アラインメ
ントアルゴリズムにより;Pearson及びLipman（（1988）
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85.2444）の類似性方法につい
ての調査により；これらのプログラムのコンピュータ化
操作（例えばこれらに限定されないが、the PC/Geneプ
ログラムのCLUSTAL（Intelligenetics,Mountain View,C
alifornia）,GAP,BESTFIT,FASTA,及びTFASTA（Wisconsi
n Genetics Software Package,Genetics Computer Grou
p（GCG）,575 Science Dr.,Madison,Wisconsin,USA））
により行うことができる。CLUSTALプログラムはHiggins
及びSharp（（1988）Gene,73:237−244）並びにHiggins
及びSharp（（1989）Computer Applications in the Bi
osciences 5:151−153）;Corpet,ら．（（1988）Nuclei
c Acids Research 16,10881−90）;Huang,ら．（1992）
Computer Applications in the Biosciences 8,155−6
5），及びPearson,ら．（（1994）Methods in Molecula
r Biology 24,307−31）に十分に開示される。アライン
メントは、しばしば視察及び手動のアラインメントによ
り行われる。
ポリペプチドの文脈における用語“実質的同一性”又
は“実質的類似性”とは、ポリペプチドが、引用配列と
少なくとも70％の配列同一性、又は好ましくは引用配列
と80％、もしくはより好ましくは85％の配列同一性、又
は最も好ましくは約10〜20アミノ酸残基の比較窓にわた
って90％の同一性の配列を含むことを示す。２つのポリ
ペプチド配列が実質的に同一であることの示唆は、１つ
のペプチドが第２のペプチドに対して生じた抗体と免疫
学的に反応することである。これにより、ポリペプチド
は、例えば２つのポリペプチドが保存的置換によっての
み異なる場合に、第２のポリペプチドと実質的に同一で
ある。
は“実質的類似性”とは、ポリペプチドが、引用配列と
少なくとも70％の配列同一性、又は好ましくは引用配列
と80％、もしくはより好ましくは85％の配列同一性、又
は最も好ましくは約10〜20アミノ酸残基の比較窓にわた
って90％の同一性の配列を含むことを示す。２つのポリ
ペプチド配列が実質的に同一であることの示唆は、１つ
のペプチドが第２のペプチドに対して生じた抗体と免疫
学的に反応することである。これにより、ポリペプチド
は、例えば２つのポリペプチドが保存的置換によっての
み異なる場合に、第２のポリペプチドと実質的に同一で
ある。
２つの核酸配列が実質的に同一であることの１つの指
摘は、１番目の核酸がコードするポリペプチドが、２番
目の核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に
交差反応することである。
摘は、１番目の核酸がコードするポリペプチドが、２番
目の核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に
交差反応することである。
２つの核酸配列が実質的に同一であることを指摘は、
２つの分子がストリンジェント条件下で互いにハイブリ
ダイズすることである。ストリンジェント条件は配列依
存性であり、異なる環境パラメータ下で異なる。一般
に、ストリンジェント条件は、所定のイオン強度及びpH
において特定の配列について熱的融点（Tm）より約５℃
〜20℃低くなるよう選択される。Tmは、標的配列の50％
が完全に適応したプローブとハイブリダイズする（所定
のイオン強度及びpH下での）温度である。しかしなが
ら、ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズし
ない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的
に同一でなくてもなお実質的に同一である。これは、例
えば核酸のコピーが遺伝コードにより許容される最大の
コドン縮重を用いて作られる場合におこる。
２つの分子がストリンジェント条件下で互いにハイブリ
ダイズすることである。ストリンジェント条件は配列依
存性であり、異なる環境パラメータ下で異なる。一般
に、ストリンジェント条件は、所定のイオン強度及びpH
において特定の配列について熱的融点（Tm）より約５℃
〜20℃低くなるよう選択される。Tmは、標的配列の50％
が完全に適応したプローブとハイブリダイズする（所定
のイオン強度及びpH下での）温度である。しかしなが
ら、ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズし
ない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的
に同一でなくてもなお実質的に同一である。これは、例
えば核酸のコピーが遺伝コードにより許容される最大の
コドン縮重を用いて作られる場合におこる。
本明細書に用いられる用語“特異的に送り出す（特異
的デリバリー）”とは、標的分子を欠く細胞又は組織に
は会合しないが特定の標的分子又はマーカーを有する細
胞又は組織との優先的な会合をいう。もちろん、分子と
非標的細胞又は組織との間にある程度の非特定の相互作
用がおこり得ることが認められる。しかしながら、特異
的デリバリーは、標的分子の特定の認識を通して媒介さ
れることで区別することができる。典型的な特異的デリ
バリーは、送り出された分子と標的分子を欠く細胞との
間より送り出された分子と標的細胞を有する細胞との間
のかなり強い会合を生ずる特異的デリバリーは、典型的
には、標的分子又はマーカーを欠く細胞又は組織と比べ
て、標的分子を有する細胞又は組織に対する送り出され
た分子の（単位時間当りの）量で２倍超、好ましくは５
倍超、より好ましくは10倍超、そして最も好ましくは10
0倍超、増加する。
的デリバリー）”とは、標的分子を欠く細胞又は組織に
は会合しないが特定の標的分子又はマーカーを有する細
胞又は組織との優先的な会合をいう。もちろん、分子と
非標的細胞又は組織との間にある程度の非特定の相互作
用がおこり得ることが認められる。しかしながら、特異
的デリバリーは、標的分子の特定の認識を通して媒介さ
れることで区別することができる。典型的な特異的デリ
バリーは、送り出された分子と標的分子を欠く細胞との
間より送り出された分子と標的細胞を有する細胞との間
のかなり強い会合を生ずる特異的デリバリーは、典型的
には、標的分子又はマーカーを欠く細胞又は組織と比べ
て、標的分子を有する細胞又は組織に対する送り出され
た分子の（単位時間当りの）量で２倍超、好ましくは５
倍超、より好ましくは10倍超、そして最も好ましくは10
0倍超、増加する。
本明細書に用いられる用語“残基”とは、ポリペプチ
ドに組み込まれたアミノ酸をいう。そのアミノ酸は天然
のアミノ酸であり得、そして他に限定しなければ、天然
のアミノ酸と同様に機能し得る天然のアミノ酸の周知の
アナログを含み得る。
ドに組み込まれたアミノ酸をいう。そのアミノ酸は天然
のアミノ酸であり得、そして他に限定しなければ、天然
のアミノ酸と同様に機能し得る天然のアミノ酸の周知の
アナログを含み得る。
“融合タンパク質”又は分子が他の分子に“連結され
る”場合とは、１つのポリペプチドのアミノ末端と他の
ポリペプチドのカルボキシ末端との間に形成されたペプ
チドを通して２又はそれ超のポリペプチドの連結により
形成されたキメラ分子をいう。融合タンパク質又は連結
した分子は、その構成分子の化学的カプリングにより形
成されるか、又は一本鎖の連続する融合タンパク質をコ
ードする核酸配列からの一本鎖ポリペプチドとして表現
され得る。一本鎖融合タンパク質は、一本鎖の連続した
ポリペプチド骨格を有する融合タンパク質である。
る”場合とは、１つのポリペプチドのアミノ末端と他の
ポリペプチドのカルボキシ末端との間に形成されたペプ
チドを通して２又はそれ超のポリペプチドの連結により
形成されたキメラ分子をいう。融合タンパク質又は連結
した分子は、その構成分子の化学的カプリングにより形
成されるか、又は一本鎖の連続する融合タンパク質をコ
ードする核酸配列からの一本鎖ポリペプチドとして表現
され得る。一本鎖融合タンパク質は、一本鎖の連続した
ポリペプチド骨格を有する融合タンパク質である。
本明細書に用いられる“リガンド”又は“リガンド結
合成分”とは、一般に、分子を特異的に送り出し、標的
細胞上のレセプターと反応し又はさもなければそれを認
識もしくはそれと結合することができる全ての分子をい
う。特に、リガンドの例は、これらに限られないが、抗
体、リンホカイン、サイトカイン、レセプタータンパク
質、例えばCD4及びCD8、可溶化レセプタータンパク質、
例えば可溶性CD4、ホルモン、成長因子、及び要求され
る標的細胞に特異的に結合する他のものを含む。
合成分”とは、一般に、分子を特異的に送り出し、標的
細胞上のレセプターと反応し又はさもなければそれを認
識もしくはそれと結合することができる全ての分子をい
う。特に、リガンドの例は、これらに限られないが、抗
体、リンホカイン、サイトカイン、レセプタータンパク
質、例えばCD4及びCD8、可溶化レセプタータンパク質、
例えば可溶性CD4、ホルモン、成長因子、及び要求され
る標的細胞に特異的に結合する他のものを含む。
rOnc由来核酸及びポリペプチドの作製
rOnc由来ポリペプチドをコードするいくつかの特定の
核酸が本明細書に記載される。これらの核酸は、標準的
な組換え又は合成技術を用いて行うことができる。本発
明の核酸を仮定すれば、当業者は、同じポリペプチドを
コードする核酸のような機能的に等価な核酸を含む種々
のクローンを作製することができる。これらの目的を達
成するためのクローニング方法及び核酸の配列を確認す
るための配列決定法は当該技術で公知である。適切なク
ローニング及び配列決定技術の例、並びに多くのクロー
ニング課題を通して当業者に指示するのに十分な説明
は、Berger及びKimmel（Guide to Molecular Cloning T
echniques,Methods in Enzymology volume 152 Academi
c Press,Inc.,San Diego,CA（Berger））;Sambrookら
（（1989）Molecular Cloning−A Laboratory Manual
（2nd ed.）Vol.1−３）；並びにCurrent Protocols in
Molecular Biology（F.M.Ausubel et al.,eds.,Curren
t Protocols,a joint venture between Greene Publish
ing Associates,Inc.and John Wiley ＆ Sons,Inc.,（1
994 Supplement）（Ausubel））に見い出される。生物
学的試薬及び実験装置の製造元からの製品情報は、周知
の生物学的方法に役立つ情報も提供する。このような製
造元は、SIGMA chemical company（Saint Louis,MO）,R
＆D systems（Minneapolis,MN）,Pharmacia LKB Biotec
hnology（Piscataway,NJ）,CLONTECH Laboratories,In
c.（Palo Alto,CA）,Chem Genes Corp.,Aldrich Chemic
al Company（Milwaukee,WI）,Glen Research,Inc.,GIBC
O BRL Life Technologies,Inc.（Gaithersberg,MD）,Fl
uka Chemica−Biochemika Analytika（Fluka Chemie A
G,Buchs,Switzerland）,Invitrogen,San Diego,CA,及び
Applied Biosystems（Foster City,CA）、並びに当業者
に周知である多くの他の商業的ソースを含む。
核酸が本明細書に記載される。これらの核酸は、標準的
な組換え又は合成技術を用いて行うことができる。本発
明の核酸を仮定すれば、当業者は、同じポリペプチドを
コードする核酸のような機能的に等価な核酸を含む種々
のクローンを作製することができる。これらの目的を達
成するためのクローニング方法及び核酸の配列を確認す
るための配列決定法は当該技術で公知である。適切なク
ローニング及び配列決定技術の例、並びに多くのクロー
ニング課題を通して当業者に指示するのに十分な説明
は、Berger及びKimmel（Guide to Molecular Cloning T
echniques,Methods in Enzymology volume 152 Academi
c Press,Inc.,San Diego,CA（Berger））;Sambrookら
（（1989）Molecular Cloning−A Laboratory Manual
（2nd ed.）Vol.1−３）；並びにCurrent Protocols in
Molecular Biology（F.M.Ausubel et al.,eds.,Curren
t Protocols,a joint venture between Greene Publish
ing Associates,Inc.and John Wiley ＆ Sons,Inc.,（1
994 Supplement）（Ausubel））に見い出される。生物
学的試薬及び実験装置の製造元からの製品情報は、周知
の生物学的方法に役立つ情報も提供する。このような製
造元は、SIGMA chemical company（Saint Louis,MO）,R
＆D systems（Minneapolis,MN）,Pharmacia LKB Biotec
hnology（Piscataway,NJ）,CLONTECH Laboratories,In
c.（Palo Alto,CA）,Chem Genes Corp.,Aldrich Chemic
al Company（Milwaukee,WI）,Glen Research,Inc.,GIBC
O BRL Life Technologies,Inc.（Gaithersberg,MD）,Fl
uka Chemica−Biochemika Analytika（Fluka Chemie A
G,Buchs,Switzerland）,Invitrogen,San Diego,CA,及び
Applied Biosystems（Foster City,CA）、並びに当業者
に周知である多くの他の商業的ソースを含む。
本発明の核酸組成物は、RNA,cDNA、ゲノムDNA、又は
種々の組合せのハイブリッドにかかわらず、生物学的ソ
ースから単離されるか、又は試験管内で合成される。本
発明の核酸は、形質転換又は形質導入された細胞中、形
質転換又は形質導入された細胞ライゼート中、又は部分
的に精製もしくは実質的に純粋を形態で存在する。
種々の組合せのハイブリッドにかかわらず、生物学的ソ
ースから単離されるか、又は試験管内で合成される。本
発明の核酸は、形質転換又は形質導入された細胞中、形
質転換又は形質導入された細胞ライゼート中、又は部分
的に精製もしくは実質的に純粋を形態で存在する。
分子プローブとして用いるための配列を増幅するため
又は後のサブクローニングのための核酸フラグメントを
形成するための試験管内増幅技術は周知である。このよ
うな試験管内増幅法を通して当業者に指図するのに十分
な技例の例、例えばポリメラーゼ鎮反応（PCR）、リガ
ーゼ鎮反応（LCR）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅及び他のR
NAポリメラーゼ媒介技術（例えばNASBA）は、Berger,sa
mbrookら．（（1989）Molecular Cloning−A Laborator
y Manual（2nd Ed）Vol.1−３）；及びAusubel,並びにm
ullisら（（1987）米国特許第4,683,202号;PCR Protoco
ls A Guide to Methods and Applications（（Innis et
al.eds）Academic Press Inc.San Diego,CA（1990）
（Innis））;Arnheim ＆ Levinson（（October 1,199
0）Ｃ＆EN 36−47）;The Journal of NIH Research
（（1991）3,81−94）;Kwohら．（（1989）Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 86,1173）;Guatelliら．（（1990）Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 87,1874）;Lomellら．（（1989）J.C
lin.Chem 35,1826）;Landegrenら（（1988）science 24
1,1077−1080）;Van Brunt（（1990）Biotechnology 8,
291−294）;Wu及びWallace,（（1989）Gene 4,560）;Ba
rringerら．（（1990）Gene 89,117）、並びにSooknana
n及びMalek（（1995）Biotechnology 13:563−564）に
見い出される。試験管内で増幅された核酸の改良された
方法は、Wallaceら（米国特許第5,426,039号）に記載さ
れる。
又は後のサブクローニングのための核酸フラグメントを
形成するための試験管内増幅技術は周知である。このよ
うな試験管内増幅法を通して当業者に指図するのに十分
な技例の例、例えばポリメラーゼ鎮反応（PCR）、リガ
ーゼ鎮反応（LCR）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅及び他のR
NAポリメラーゼ媒介技術（例えばNASBA）は、Berger,sa
mbrookら．（（1989）Molecular Cloning−A Laborator
y Manual（2nd Ed）Vol.1−３）；及びAusubel,並びにm
ullisら（（1987）米国特許第4,683,202号;PCR Protoco
ls A Guide to Methods and Applications（（Innis et
al.eds）Academic Press Inc.San Diego,CA（1990）
（Innis））;Arnheim ＆ Levinson（（October 1,199
0）Ｃ＆EN 36−47）;The Journal of NIH Research
（（1991）3,81−94）;Kwohら．（（1989）Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 86,1173）;Guatelliら．（（1990）Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 87,1874）;Lomellら．（（1989）J.C
lin.Chem 35,1826）;Landegrenら（（1988）science 24
1,1077−1080）;Van Brunt（（1990）Biotechnology 8,
291−294）;Wu及びWallace,（（1989）Gene 4,560）;Ba
rringerら．（（1990）Gene 89,117）、並びにSooknana
n及びMalek（（1995）Biotechnology 13:563−564）に
見い出される。試験管内で増幅された核酸の改良された
方法は、Wallaceら（米国特許第5,426,039号）に記載さ
れる。
例えば試験管内rOnc核酸増幅方法において、又はrOnc
核酸を検出するために核酸プローブとして用いるための
プローブとしての使用のためのオリゴヌクレオチドは、
典型的には、例えばNeedham−VanDevanterら（（1989）
nucleic Acids Res.,12:6159−6168）に記載されるよう
な、例えば自動合成機を用いて、Beaucage及びCaruther
s（（1981）,Tetrahedron Letts.,22（20）:1859−186
2）により記載される固相ホスホルアミジトトリエステ
ル法に従って化学的に合成される。オリゴヌクレオチド
は、注文生産され、当業者に周知の種々の商業的ソース
からオーダーすることができる。オリゴヌクレオチドの
精製は、必要なら、典型的には、Pearson及びRegnier
（（1983）J.Chrom.255:137−149）に記載されるよう
に、ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動又は陰イオ
ン交換HPLCのいずれかにより行われる。合成オリゴヌク
レオチドの配列は、Maxam及びGilbert（1980）（Grossm
an and Moldave（eds.）Academic Press,New York,Meth
od in Enzymology 65:499−560）の化学的デグラデーシ
ョン法を用いて確認することができる。
核酸を検出するために核酸プローブとして用いるための
プローブとしての使用のためのオリゴヌクレオチドは、
典型的には、例えばNeedham−VanDevanterら（（1989）
nucleic Acids Res.,12:6159−6168）に記載されるよう
な、例えば自動合成機を用いて、Beaucage及びCaruther
s（（1981）,Tetrahedron Letts.,22（20）:1859−186
2）により記載される固相ホスホルアミジトトリエステ
ル法に従って化学的に合成される。オリゴヌクレオチド
は、注文生産され、当業者に周知の種々の商業的ソース
からオーダーすることができる。オリゴヌクレオチドの
精製は、必要なら、典型的には、Pearson及びRegnier
（（1983）J.Chrom.255:137−149）に記載されるよう
に、ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動又は陰イオ
ン交換HPLCのいずれかにより行われる。合成オリゴヌク
レオチドの配列は、Maxam及びGilbert（1980）（Grossm
an and Moldave（eds.）Academic Press,New York,Meth
od in Enzymology 65:499−560）の化学的デグラデーシ
ョン法を用いて確認することができる。
当業者は、所定の核酸配列において要求される変換を
行う多くの方法を認めるだろう。このような公知の方法
は、部位特異的変異誘発、縮重したオリゴヌクレオチド
を用いるPCR増幅、核酸を含む細胞の、変異誘発剤又は
放射線への露出、要求されるオリゴヌクレオチドの化学
合成（例えば大きな核酸を作り出すための連結及び又は
クローニングと組合わせたもの）及び他の公知の技術を
含む。Giliman及びSmith（（1979）Gene 8:81−97）;Ro
bertsら．（（1987）Nature 328:731−734）並びにSamb
rookら．（（1989）Molecular Cloning−A Laboratory
Manual（2nd Ed）Vol.1−３）;Innis,Ausbel,Berger,Ne
edham VanDevanter及びMullis（全て前掲）を参照のこ
と。
行う多くの方法を認めるだろう。このような公知の方法
は、部位特異的変異誘発、縮重したオリゴヌクレオチド
を用いるPCR増幅、核酸を含む細胞の、変異誘発剤又は
放射線への露出、要求されるオリゴヌクレオチドの化学
合成（例えば大きな核酸を作り出すための連結及び又は
クローニングと組合わせたもの）及び他の公知の技術を
含む。Giliman及びSmith（（1979）Gene 8:81−97）;Ro
bertsら．（（1987）Nature 328:731−734）並びにSamb
rookら．（（1989）Molecular Cloning−A Laboratory
Manual（2nd Ed）Vol.1−３）;Innis,Ausbel,Berger,Ne
edham VanDevanter及びMullis（全て前掲）を参照のこ
と。
本発明のポリペプチドは、広範囲の公知の方法におい
て合成で調製することができる。比較的短い大きなのポ
リペプチドは、典型的には、慣用的な技術に従って、溶
液又は固体支持体内において合成される。例えば、Merr
itield（（1963）J.Am.Chem.Soc.85:2149−2154）を参
照のこと。種々の自動合成機及びシーケンサーが市販さ
れており、周知のプロトコルに従って用いることができ
る。例えば、Stewart及びYoung（（1984）Solid Phase
Peptide Synthesis,2d.ed.Pierce Chemical co）を参照
のこと。ポリペプチドは、そのポリペプチドをコードす
る核酸の組換え発現、及びその後の標準的技術を用いる
精製により製造することができる。
て合成で調製することができる。比較的短い大きなのポ
リペプチドは、典型的には、慣用的な技術に従って、溶
液又は固体支持体内において合成される。例えば、Merr
itield（（1963）J.Am.Chem.Soc.85:2149−2154）を参
照のこと。種々の自動合成機及びシーケンサーが市販さ
れており、周知のプロトコルに従って用いることができ
る。例えば、Stewart及びYoung（（1984）Solid Phase
Peptide Synthesis,2d.ed.Pierce Chemical co）を参照
のこと。ポリペプチドは、そのポリペプチドをコードす
る核酸の組換え発現、及びその後の標準的技術を用いる
精製により製造することができる。
本発明の核酸及びポリペプチドの保存的改変物の作製
当業者は、開示される配列の多くの保存的変異が実質
的に同一のrOncを生産することを認めるであろう。例え
ば、遺伝コードの縮重のため、“サイレント置換”（即
ちコードされたポリペプチドにおいて変化を生じない核
酸配列の置換）は、アミノ酸をコードする各々の核酸配
列の内在する特徴である。同様に、アミノ酸配列におけ
る１又はいくつかのアミノ酸が高い類似特性で異なるア
ミノ酸で置換されている保存的アミノ酸置換（定義セク
ション、前掲を参照のこと）は、開示されるアミノ酸配
列と、又はアミノ酸をコードする開示される核酸配列と
高い類似性を有するとしても直ちに同定される。このよ
うに保存的に置換された（又は改変された）各々の明ら
かに開示された配列の変異は本発明の特徴である。
的に同一のrOncを生産することを認めるであろう。例え
ば、遺伝コードの縮重のため、“サイレント置換”（即
ちコードされたポリペプチドにおいて変化を生じない核
酸配列の置換）は、アミノ酸をコードする各々の核酸配
列の内在する特徴である。同様に、アミノ酸配列におけ
る１又はいくつかのアミノ酸が高い類似特性で異なるア
ミノ酸で置換されている保存的アミノ酸置換（定義セク
ション、前掲を参照のこと）は、開示されるアミノ酸配
列と、又はアミノ酸をコードする開示される核酸配列と
高い類似性を有するとしても直ちに同定される。このよ
うに保存的に置換された（又は改変された）各々の明ら
かに開示された配列の変異は本発明の特徴である。
当業者は、所定の核酸配列において要求される変換を
行う多くの方法を認めるだろう。このような公知の方法
は、部位特異的変異誘発、縮重したオリゴヌクレオチド
を用いるPCR増幅、核酸を含む細胞の、変異誘発剤又は
放射線への露出、要求されるオリゴヌクレオチドの化学
合成（例えば大きな核酸を作り出すための連結部及び又
はクローニングと組合わせたもの）及び他の公知の技術
を含む。Giliman及びSmith（（1979）Gene 8:81−97）;
Robertsら．（（1987）Nature 328:731−734）並びにSa
mbrook,らInnis,Ausbel,Berger,Needham VanDevanter及
びMullis（全て前掲）を参照のこと。
行う多くの方法を認めるだろう。このような公知の方法
は、部位特異的変異誘発、縮重したオリゴヌクレオチド
を用いるPCR増幅、核酸を含む細胞の、変異誘発剤又は
放射線への露出、要求されるオリゴヌクレオチドの化学
合成（例えば大きな核酸を作り出すための連結部及び又
はクローニングと組合わせたもの）及び他の公知の技術
を含む。Giliman及びSmith（（1979）Gene 8:81−97）;
Robertsら．（（1987）Nature 328:731−734）並びにSa
mbrook,らInnis,Ausbel,Berger,Needham VanDevanter及
びMullis（全て前掲）を参照のこと。
最も一般的には、ポリぺプチド配列は、対応する核酸
配列を変化させ、そのポリペプチドを発現させることに
より変えられる。しかしながら、ポリペプチド配列は、
任意に、いずれかの要求されるポリペプチドを作り出す
ために、市販のペプチド合成機を用いて合成して作られ
る（Merrifield,並びにStewart及びYoung、前掲を参照
のこと）。
配列を変化させ、そのポリペプチドを発現させることに
より変えられる。しかしながら、ポリペプチド配列は、
任意に、いずれかの要求されるポリペプチドを作り出す
ために、市販のペプチド合成機を用いて合成して作られ
る（Merrifield,並びにStewart及びYoung、前掲を参照
のこと）。
当業者は、供される配列及びリボヌクレアーゼ全般に
関する当該技術の知識に基づいて本発明の要求される核
酸又はポリペプチドを選択することができる。RNaseの
物理的特徴及び一般的特性は当業者に周知である。RNas
eにおける特定の変異の特定の効果は周知である。更
に、タンパク質及び核酸の性質に関する一般的知識によ
り、当業者は、本明細書に列記される配列において開示
される核酸及びポリペプチドに類似した又はそれと等価
な活性を有する適切な配列を選択することができる。本
明細書の定義セクションは、典型的な保存性アミノ酸置
換を記載する。
関する当該技術の知識に基づいて本発明の要求される核
酸又はポリペプチドを選択することができる。RNaseの
物理的特徴及び一般的特性は当業者に周知である。RNas
eにおける特定の変異の特定の効果は周知である。更
に、タンパク質及び核酸の性質に関する一般的知識によ
り、当業者は、本明細書に列記される配列において開示
される核酸及びポリペプチドに類似した又はそれと等価
な活性を有する適切な配列を選択することができる。本
明細書の定義セクションは、典型的な保存性アミノ酸置
換を記載する。
最後に、核酸及びポリペプチドへのほとんどの改変
は、要求される特徴のための適切なアッセイにおける慣
用的なスクリーニング技術により評価される。例えば、
ポリペプチドの免疫学的特徴における変化は、適切な免
疫学的アッセイによって検出することができる。他の特
性、例えば標的核酸への核酸ハイブリダイゼーション、
タンパク質の酸化還元もしくは熱的安定性、熱的ヒステ
リシス、疎水性、タンパク質分解に対する感受性、又は
凝集する傾向は、全て標準的技術に従ってアッセイされ
る。
は、要求される特徴のための適切なアッセイにおける慣
用的なスクリーニング技術により評価される。例えば、
ポリペプチドの免疫学的特徴における変化は、適切な免
疫学的アッセイによって検出することができる。他の特
性、例えば標的核酸への核酸ハイブリダイゼーション、
タンパク質の酸化還元もしくは熱的安定性、熱的ヒステ
リシス、疎水性、タンパク質分解に対する感受性、又は
凝集する傾向は、全て標準的技術に従ってアッセイされ
る。
rOnc融合タンパク質及び他の治療成分
rOnc分子は、種々の薬理剤を含む薬理剤又はカプセル
化システムも含み得る。それらは、典型的には、要求さ
れる細胞にrOncを向けるための標的化分子として機能す
るためのリガンドを含むであろう。rOncは、rOncを送り
出すのを助けるであるリガンド又はアンチセンス分子に
直接、結合させることができる。例えば、配列番号:40
−61を参照のこと。rOncは、細胞内でrOncを方向づける
ために、配列番号:32（及び配列番号:31）のアミノ酸位
置１〜７に記載されるもののような核局在化シグナル
（“NLS"）を含むように処理することもできる。あるい
は、配列番号:31の位置８のMet及び位置22−24の対応す
る核酸が省略されており、又は省略することができる。
NLSについての核酸配列は、配列番号:31の核酸１−21で
ある。シグナルペプチドは、配列番号:63のアミノ酸位
置１−25にも例示される。
化システムも含み得る。それらは、典型的には、要求さ
れる細胞にrOncを向けるための標的化分子として機能す
るためのリガンドを含むであろう。rOncは、rOncを送り
出すのを助けるであるリガンド又はアンチセンス分子に
直接、結合させることができる。例えば、配列番号:40
−61を参照のこと。rOncは、細胞内でrOncを方向づける
ために、配列番号:32（及び配列番号:31）のアミノ酸位
置１〜７に記載されるもののような核局在化シグナル
（“NLS"）を含むように処理することもできる。あるい
は、配列番号:31の位置８のMet及び位置22−24の対応す
る核酸が省略されており、又は省略することができる。
NLSについての核酸配列は、配列番号:31の核酸１−21で
ある。シグナルペプチドは、配列番号:63のアミノ酸位
置１−25にも例示される。
rOnc分子は遺伝子治療の適用に独特に適用される。そ
れらは、他の治療剤に融合させることができ、例えばそ
れらは抗Ｂ細胞リンパ腫抗体に融合させることができよ
う。例えば、以下により詳細に説明されるであろうよう
に、抗トランスフェリンレセプター抗体又は抗結腸癌抗
体に組換えで融合したrOnc分子は活性であった。上述の
通り、nOncは、生体内で抗腫瘍効果を有し、血清又はra
sのような成長促進剤により刺し殺された迅速に分割す
る細胞を優先的に殺す。その分子は、細胞内で直ちにイ
ンターナライズされる。それらの活性は、細胞内で分子
を方向づけるために、核局在化シグナル等にそれらを連
結することにより、更に容易にすることができる。腫瘍
細胞における特別の使用は、酵素をRNaseによるデグラ
デーションにしむけるテロメラーゼを標的化することで
あろう。
れらは、他の治療剤に融合させることができ、例えばそ
れらは抗Ｂ細胞リンパ腫抗体に融合させることができよ
う。例えば、以下により詳細に説明されるであろうよう
に、抗トランスフェリンレセプター抗体又は抗結腸癌抗
体に組換えで融合したrOnc分子は活性であった。上述の
通り、nOncは、生体内で抗腫瘍効果を有し、血清又はra
sのような成長促進剤により刺し殺された迅速に分割す
る細胞を優先的に殺す。その分子は、細胞内で直ちにイ
ンターナライズされる。それらの活性は、細胞内で分子
を方向づけるために、核局在化シグナル等にそれらを連
結することにより、更に容易にすることができる。腫瘍
細胞における特別の使用は、酵素をRNaseによるデグラ
デーションにしむけるテロメラーゼを標的化することで
あろう。
我々は、マイクロインジェクション研究においてOnc
がrasと共同作用することを見い出した。これは、Onc及
びrasが細胞内で一緒でなければならないことを意味す
る。Oncは、それ自体の経路を経て細胞に入った時にras
と共同作用しない。CAAX（配列番号:33）モチーフは、
形質膜においてrasを局在化するために必要とされる。
（Ｃ＝Cys,A＝脂肪族アミノ酸、Ｘ＝S,M,C,A、又はＱ、
一例はCys−Val−Ile−MTe（配列番号:34）である）。
重要なのは、この型の配列は、異種タンパク質を形質膜
に標的化することが示されていることである（Hancock,
J.,Cadwallader,K.,Paterson,H.及びC.Marshall（199
1）EMBOJ.10:4033）。実施例で供されるようなCAAX（配
列番号:33）シグナル、又は以下に記載されるようなKDE
LをコードするDNAにrOnc遺伝子を連結することが要求さ
れるであろう。
がrasと共同作用することを見い出した。これは、Onc及
びrasが細胞内で一緒でなければならないことを意味す
る。Oncは、それ自体の経路を経て細胞に入った時にras
と共同作用しない。CAAX（配列番号:33）モチーフは、
形質膜においてrasを局在化するために必要とされる。
（Ｃ＝Cys,A＝脂肪族アミノ酸、Ｘ＝S,M,C,A、又はＱ、
一例はCys−Val−Ile−MTe（配列番号:34）である）。
重要なのは、この型の配列は、異種タンパク質を形質膜
に標的化することが示されていることである（Hancock,
J.,Cadwallader,K.,Paterson,H.及びC.Marshall（199
1）EMBOJ.10:4033）。実施例で供されるようなCAAX（配
列番号:33）シグナル、又は以下に記載されるようなKDE
LをコードするDNAにrOnc遺伝子を連結することが要求さ
れるであろう。
テロメラーゼは、“普遍的癌標的”として研究されて
いる（G.B.Morin,JNCI.（1995）87:859）。それは、核
の中に位置するRNAタンパク質である。テロメラーゼRNA
に対するアンチセンスは、その酵素の機能を阻害し、癌
細胞の増殖をブロックすることができることが示されて
いる（J.Fengら、Science（1995）269:1236）。RNase
は、酵素の活性も破壊することができる。Oncは、テロ
メラーゼを含む細胞抽出液とインキュベートした場合、
酵素の活性を破壊することもできる。（配列番号:32に
示されるような）NLS/Onc分子は、それがテロメラーゼ
を分解できるようにOncを核に導くために作製すること
ができる。我々の用いるNLSは、核の抗原の機能を妨害
する目的のため、タンパク質を核に再び向かわせること
が示されている（S.Bioca,M.S.Neuberger and A Cattan
eo,（1990）9:101）。我々のNLS/Onc分子は細胞を殺す
のに有効である。
いる（G.B.Morin,JNCI.（1995）87:859）。それは、核
の中に位置するRNAタンパク質である。テロメラーゼRNA
に対するアンチセンスは、その酵素の機能を阻害し、癌
細胞の増殖をブロックすることができることが示されて
いる（J.Fengら、Science（1995）269:1236）。RNase
は、酵素の活性も破壊することができる。Oncは、テロ
メラーゼを含む細胞抽出液とインキュベートした場合、
酵素の活性を破壊することもできる。（配列番号:32に
示されるような）NLS/Onc分子は、それがテロメラーゼ
を分解できるようにOncを核に導くために作製すること
ができる。我々の用いるNLSは、核の抗原の機能を妨害
する目的のため、タンパク質を核に再び向かわせること
が示されている（S.Bioca,M.S.Neuberger and A Cattan
eo,（1990）9:101）。我々のNLS/Onc分子は細胞を殺す
のに有効である。
その組換え分子のアミノ末端配列は、標的細胞のサイ
トソルへ分子を転移されるのに要求される場合に好まし
い。このようなシグナルペプチドは、典型的には、タン
パク質のアミノ末端に挿入される。例えば、（Metの後
の）本明細書に記載される組換え分子の最初のアミノ酸
はKDEL（配列番号:64）であり得、そしてその分子を小
胞体にシグナルを送るのを達成するであろう。本明細書
に“内質保持配列”として言及されるKDEL,KDELの繰返
し、又はタンパク質を小胞体内に維持し、又はリサイク
ルするよう機能する他の配列を用いることができる。
トソルへ分子を転移されるのに要求される場合に好まし
い。このようなシグナルペプチドは、典型的には、タン
パク質のアミノ末端に挿入される。例えば、（Metの後
の）本明細書に記載される組換え分子の最初のアミノ酸
はKDEL（配列番号:64）であり得、そしてその分子を小
胞体にシグナルを送るのを達成するであろう。本明細書
に“内質保持配列”として言及されるKDEL,KDELの繰返
し、又はタンパク質を小胞体内に維持し、又はリサイク
ルするよう機能する他の配列を用いることができる。
任意に、リガンドに結合したrOnc分子は、カプセル化
システム、例えば更なる治療組成物、例えば好ましくは
循環系への直接的露出からシールドされた薬剤、核酸
（例えばアンチセンス核酸）、又は他の治療成分を含む
リポソーム又はミセルを含み得る。抗体に結合したリポ
ソームを調製する手段は当業者に公知である。例えば米
国特許第4,957,735（Connorら、Pharm.Ther.,28:341−3
65（1985）を参照のこと。
システム、例えば更なる治療組成物、例えば好ましくは
循環系への直接的露出からシールドされた薬剤、核酸
（例えばアンチセンス核酸）、又は他の治療成分を含む
リポソーム又はミセルを含み得る。抗体に結合したリポ
ソームを調製する手段は当業者に公知である。例えば米
国特許第4,957,735（Connorら、Pharm.Ther.,28:341−3
65（1985）を参照のこと。
当業者は、リガンド分子又は他の治療構成物及びrOnc
分子がいずれかの順番で一緒に連結され得ることを認め
るであろう。これにより、リガンドがポリペプチドであ
る場合、rOncはそのリガンドのアミノもしくはカルボキ
シ末端のいずれかに連結され得、又はその結合が分子の
各々の活性を妨害しない限り、いずれかの分子の内部領
域に連結され得る。
分子がいずれかの順番で一緒に連結され得ることを認め
るであろう。これにより、リガンドがポリペプチドであ
る場合、rOncはそのリガンドのアミノもしくはカルボキ
シ末端のいずれかに連結され得、又はその結合が分子の
各々の活性を妨害しない限り、いずれかの分子の内部領
域に連結され得る。
その分子は、当業者に公知であるいくつかの手段のい
ずれかにより結合させることができる。典型的には、rO
ncは、リガンドに、直接的に又はリンカー（スペーサ
ー）を通してコンジュゲートされるであろう。しかしな
がら、rOnc及びリガンド又は他の治療剤の両方がポリペ
プチドであるなら、一本鎖融合タンパク質としてキメラ
分子を組換え発現するのが好ましい。
ずれかにより結合させることができる。典型的には、rO
ncは、リガンドに、直接的に又はリンカー（スペーサ
ー）を通してコンジュゲートされるであろう。しかしな
がら、rOnc及びリガンド又は他の治療剤の両方がポリペ
プチドであるなら、一本鎖融合タンパク質としてキメラ
分子を組換え発現するのが好ましい。
一実施形態において、rOnc分子は他の分子（例えばサ
イトトキシン、ラベル、リガンド、又は薬剤もしくはリ
ポソーム）に化学的にコンジュゲートされる。分子を化
学的にコンジュゲートする手段は当業者に公知である。
イトトキシン、ラベル、リガンド、又は薬剤もしくはリ
ポソーム）に化学的にコンジュゲートされる。分子を化
学的にコンジュゲートする手段は当業者に公知である。
剤を抗体又は他のポリペプチド標的化分子に結合させ
るための手順は、その剤の化学構造により種々であろ
う。ポリペプチドは、典型的には、種々の官能基；例え
ば他の分子をそれに結合するrOnc分子上の適切な官能基
との反応のために利用できるカルボン酸（COOH）又は遊
離アミン（−NH2）基を含む。
るための手順は、その剤の化学構造により種々であろ
う。ポリペプチドは、典型的には、種々の官能基；例え
ば他の分子をそれに結合するrOnc分子上の適切な官能基
との反応のために利用できるカルボン酸（COOH）又は遊
離アミン（−NH2）基を含む。
あるいは、リガンド及び／又はrOnc分子は、更なる反
応性官能基を露出し又はそれに結合するために誘導化す
ることができる。その誘導化は、いくつかのリンカー分
子のいずれか、例えばPierce Chemical Company,Rockfo
rd.Illinotsから利用できるものの結合に関連し得る。
応性官能基を露出し又はそれに結合するために誘導化す
ることができる。その誘導化は、いくつかのリンカー分
子のいずれか、例えばPierce Chemical Company,Rockfo
rd.Illinotsから利用できるものの結合に関連し得る。
本明細書に用いられる“リンカー”は、２つの分子を
連結するのに用いられる分子である。そのリンカーは、
両方の分子に共有結合を形成することができる。適切な
リンカーは当業者に公知であり、これらに限定されない
が、直鎖もしくは分枝鎖炭素リンカー、ヘテロ環式リン
カー、又はペプチドリンカーを含む。両方の分子がポリ
ペプチドである場合、そのリンカーは、それらの側鎖を
通して（例えばシステインへのジスルフィド結合を通し
て）構成アミノ酸に連結され得る。しかしながら、好ま
しい実施形態において、リンカーは、末端アミノ酸のα
炭素原子及びカルボキシル基に連結されよう。
連結するのに用いられる分子である。そのリンカーは、
両方の分子に共有結合を形成することができる。適切な
リンカーは当業者に公知であり、これらに限定されない
が、直鎖もしくは分枝鎖炭素リンカー、ヘテロ環式リン
カー、又はペプチドリンカーを含む。両方の分子がポリ
ペプチドである場合、そのリンカーは、それらの側鎖を
通して（例えばシステインへのジスルフィド結合を通し
て）構成アミノ酸に連結され得る。しかしながら、好ま
しい実施形態において、リンカーは、末端アミノ酸のα
炭素原子及びカルボキシル基に連結されよう。
特定の剤上の基と反応性のある１の官能基、及び抗体
と反応性のある他の基を有する二種官能性リンカーを、
要求されるイムノコンジュゲートを形成するのに用いる
ことができる。あるいは、誘導化は、リガンドの化学的
処理、例えば遊離アルデヒド基を作り出すためのペルイ
オデートでのグリコプロテイン抗体の糖成分のグリコー
ル開裂を含み得る。抗体上の遊離アルデヒド基は剤に結
合するための剤上の遊離アミン又はヒドラジン基と反応
し得る（米国特許第4,671,958号を参照のこと）。抗体
又は抗体フラグメントのようなポリペプチド上の遊離ス
ルフヒドリル基を形成するための手順も周知である（米
国特許第4,659,839号を参照のこと）。
と反応性のある他の基を有する二種官能性リンカーを、
要求されるイムノコンジュゲートを形成するのに用いる
ことができる。あるいは、誘導化は、リガンドの化学的
処理、例えば遊離アルデヒド基を作り出すためのペルイ
オデートでのグリコプロテイン抗体の糖成分のグリコー
ル開裂を含み得る。抗体上の遊離アルデヒド基は剤に結
合するための剤上の遊離アミン又はヒドラジン基と反応
し得る（米国特許第4,671,958号を参照のこと）。抗体
又は抗体フラグメントのようなポリペプチド上の遊離ス
ルフヒドリル基を形成するための手順も周知である（米
国特許第4,659,839号を参照のこと）。
放射性核種金属キーレート剤、毒素及び薬剤を含む種
々の化合物の、抗体のようなタンパク質への結合のため
の多くの手順及びリンカー分子が周知である。例えば、
引用により本明細書に組み込まれる欧州特許出願第188,
256号；米国特許第4,671,958、4,659,839、4,414,148、
4,699,784;4,680,338;4,569,789;及び4,589,071号；並
びにBorlinghausら（Chancer Res.47:4671−4075（198
7）を参照のこと。特に、種々のイムノトキシンの生産
は当該技術において公知であり、例えば引用により本明
細書に組み込まれる“Monoclonal Antibody−Toxin Con
jugates:Aiming the Magic Bullet,"（Thorpeら.,Monoc
lonal Antibodies in Clinical Medicine,Academic Pre
ss,pp.168−190（1982））,Waldman（Science,252:1657
（1991）、米国特許第4,545,985号及び4,894,443号にお
いて見い出すことができる。
々の化合物の、抗体のようなタンパク質への結合のため
の多くの手順及びリンカー分子が周知である。例えば、
引用により本明細書に組み込まれる欧州特許出願第188,
256号；米国特許第4,671,958、4,659,839、4,414,148、
4,699,784;4,680,338;4,569,789;及び4,589,071号；並
びにBorlinghausら（Chancer Res.47:4671−4075（198
7）を参照のこと。特に、種々のイムノトキシンの生産
は当該技術において公知であり、例えば引用により本明
細書に組み込まれる“Monoclonal Antibody−Toxin Con
jugates:Aiming the Magic Bullet,"（Thorpeら.,Monoc
lonal Antibodies in Clinical Medicine,Academic Pre
ss,pp.168−190（1982））,Waldman（Science,252:1657
（1991）、米国特許第4,545,985号及び4,894,443号にお
いて見い出すことができる。
特定の環境において、キメラ分子がその標的部位に達
した時にリガンドからrOncを遊離することが要求され
る。それゆえ、標的部位の近傍において開裂する結合を
含むキメラコンジュゲートは、そのエフェクターが標的
部位において遊離される場合に用いることができる。リ
ガンドから剤を遊離するための結合の開裂は、酵素活性
又はイムノコンジュゲートが標的細胞の内側又は標的部
位の近傍のいずれかにおいてさらされる条件により刺し
殺され得る。標的部位が腫瘍であるなら、腫瘍部位にお
いて存在する条件下で開裂可能であるリンカー（例えば
腫瘍関連酵素又は酸性pHに露出された場合）を用いるこ
とができる。
した時にリガンドからrOncを遊離することが要求され
る。それゆえ、標的部位の近傍において開裂する結合を
含むキメラコンジュゲートは、そのエフェクターが標的
部位において遊離される場合に用いることができる。リ
ガンドから剤を遊離するための結合の開裂は、酵素活性
又はイムノコンジュゲートが標的細胞の内側又は標的部
位の近傍のいずれかにおいてさらされる条件により刺し
殺され得る。標的部位が腫瘍であるなら、腫瘍部位にお
いて存在する条件下で開裂可能であるリンカー（例えば
腫瘍関連酵素又は酸性pHに露出された場合）を用いるこ
とができる。
いくつかの異なる開裂性リンカーが当業者に知られて
いる。米国特許第4,618,492号;4,542,225号、及び4,62
5,014号を参照のこと。これらのリンカー基からの剤の
遊離のためのメカニズムは、例えば、光不安定性結合の
照射及び酸触媒性加水分解を含む。米国特許第4,671,95
8号は、例えば、患者の補足システムのタンパク質分解
酵素により生体内で標的部位で開裂されるリンカーを含
むイムノコンジュゲートの記載を含む。種々の放射性診
断化合物、放射性治療化合物、薬剤、毒素、及び他の剤
を抗体に結合させることについて報告されている多数の
方法に関して、当業者は、抗体又は他のポリペプチドに
所定の剤を結合するための適切な方法を決定することが
できるであろう。
いる。米国特許第4,618,492号;4,542,225号、及び4,62
5,014号を参照のこと。これらのリンカー基からの剤の
遊離のためのメカニズムは、例えば、光不安定性結合の
照射及び酸触媒性加水分解を含む。米国特許第4,671,95
8号は、例えば、患者の補足システムのタンパク質分解
酵素により生体内で標的部位で開裂されるリンカーを含
むイムノコンジュゲートの記載を含む。種々の放射性診
断化合物、放射性治療化合物、薬剤、毒素、及び他の剤
を抗体に結合させることについて報告されている多数の
方法に関して、当業者は、抗体又は他のポリペプチドに
所定の剤を結合するための適切な方法を決定することが
できるであろう。
rOnc分子又は融合タンパク質の生産
関心の分子が比較的小さい（即ち約50アミノ酸未満）
場合、それらは標準的な化学的ペプチド合成技術を用い
て合成することができる。関心の２つの分子が比較的短
い場合、そのキメラ分子は一本鎖の連続ポリペプチドと
して合成することができる。あるいは、その分子は、別
個に合成して、次に１つの分子のアミノ末端の、他方の
分子のカルボキシ末端との縮合によりペプチド結合を形
成することにより融合させることができる。あるいは、
その分子は、各々ペプチドスペーサー分子の一端と縮合
させて連続した融合タンパク質を形成することができ
る。
場合、それらは標準的な化学的ペプチド合成技術を用い
て合成することができる。関心の２つの分子が比較的短
い場合、そのキメラ分子は一本鎖の連続ポリペプチドと
して合成することができる。あるいは、その分子は、別
個に合成して、次に１つの分子のアミノ末端の、他方の
分子のカルボキシ末端との縮合によりペプチド結合を形
成することにより融合させることができる。あるいは、
その分子は、各々ペプチドスペーサー分子の一端と縮合
させて連続した融合タンパク質を形成することができ
る。
配列のＣ末端アミノ酸が不溶性支持体に結合され、次
にその配列の残りのアミノ酸が連続的に付加される固相
合成法が、本発明のポリペプチドの化学的合成のための
好ましい方法である。固相合成のための技術は、引用に
より本明細書に組み込まれるBarany及びMerrifield（So
lid−Phase Peptide Synthesis;pp.3−284 in The Pept
ides:Analysis,Synthesis,Biology.Vol.2:Special Meth
ods in Peptide Synthesis,Part A.,）Merrifield,ら．
（J.Am.Chem.Soc.,85:2149−2156（1963）），並びにSt
ewartら，（Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pi
erce Chem.Co.,Rockford,Ill.（1984））に記載され
る。
にその配列の残りのアミノ酸が連続的に付加される固相
合成法が、本発明のポリペプチドの化学的合成のための
好ましい方法である。固相合成のための技術は、引用に
より本明細書に組み込まれるBarany及びMerrifield（So
lid−Phase Peptide Synthesis;pp.3−284 in The Pept
ides:Analysis,Synthesis,Biology.Vol.2:Special Meth
ods in Peptide Synthesis,Part A.,）Merrifield,ら．
（J.Am.Chem.Soc.,85:2149−2156（1963）），並びにSt
ewartら，（Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pi
erce Chem.Co.,Rockford,Ill.（1984））に記載され
る。
好ましい実施形態において、本発明のキメラ融合タン
パク質は、組換えDNA法を用いて合成される。一般に、
これは、融合タンパク質をコードするDNA配列を作り、
特定のプロモーターの制御下で発現カセット中にそのDN
Aをおき、宿主内でそのタンパク質を発現させ、その発
現したタンパク質を単離し、そして必要に応じてそのタ
ンパク質を再生することに関する。
パク質は、組換えDNA法を用いて合成される。一般に、
これは、融合タンパク質をコードするDNA配列を作り、
特定のプロモーターの制御下で発現カセット中にそのDN
Aをおき、宿主内でそのタンパク質を発現させ、その発
現したタンパク質を単離し、そして必要に応じてそのタ
ンパク質を再生することに関する。
本発明の融合タンパク質をコードするDNA及びrOnc分
子自体は、いずれかの適切な方法、例えば適切な配列の
クローニング及び制限、又は全て引用により本明細書に
組み込まれるNarangら（Meth.Enzymol.68:90−99（197
9））のホスホトリエステル法;Brownら，（Meth.Enzymo
l.68:109−151（1979））のホスホジエステル法;Beauca
geら（Tetra.Lett.,22:1859−1862（1981））のジエチ
ルホスホルアミジト法及び米国特許第4,458,066号の固
体支持体法のような方法による直接的化学合成により調
製することができる。
子自体は、いずれかの適切な方法、例えば適切な配列の
クローニング及び制限、又は全て引用により本明細書に
組み込まれるNarangら（Meth.Enzymol.68:90−99（197
9））のホスホトリエステル法;Brownら，（Meth.Enzymo
l.68:109−151（1979））のホスホジエステル法;Beauca
geら（Tetra.Lett.,22:1859−1862（1981））のジエチ
ルホスホルアミジト法及び米国特許第4,458,066号の固
体支持体法のような方法による直接的化学合成により調
製することができる。
化学的合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを作り出
す。これは、相補的配列とのハイブリダイゼーションに
より、又はテンプレートとして一本鎖を用いてDNAポリ
メラーゼでの重合化により、二本鎖DNAに転化すること
ができる。当業者は、DNAの全体の化学合成が約100塩基
の配列に制限されるが、短い配列の連結によりより長い
配列を得ることができることを認めるであろう。
す。これは、相補的配列とのハイブリダイゼーションに
より、又はテンプレートとして一本鎖を用いてDNAポリ
メラーゼでの重合化により、二本鎖DNAに転化すること
ができる。当業者は、DNAの全体の化学合成が約100塩基
の配列に制限されるが、短い配列の連結によりより長い
配列を得ることができることを認めるであろう。
あるいは、サブ配列はクローンすることができ、適切
なサブ配列は、適切な制限酵素を用いて開裂することが
できる。次にそのフラグメントを連結して要求されるDN
A配列を作ることができる。
なサブ配列は、適切な制限酵素を用いて開裂することが
できる。次にそのフラグメントを連結して要求されるDN
A配列を作ることができる。
好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質
又はrOnc分子をコードするDNAは、ポリメラーゼ鎖反応
（PCR）のようなDNA増幅法を用いてクローンすることが
できる。２分子が一緒に連結されるなら、当業者は、そ
の分子が１又は複数のアミノ酸からなるペプチドスペー
サーにより分離することができることを認めるだろう。
一般に、スペーサーは、タンパク質を連結すること又は
それらの間の特定の距離又は他の空間的関係を保護する
こと以外に特定の生物活性を有さないであろう。しかし
ながら、そのスペーサーの構成アミノ酸は、ホールディ
ング、正味の電荷、又は疎水性のような分子の特定の特
性に影響を与えるように選択することができる。
又はrOnc分子をコードするDNAは、ポリメラーゼ鎖反応
（PCR）のようなDNA増幅法を用いてクローンすることが
できる。２分子が一緒に連結されるなら、当業者は、そ
の分子が１又は複数のアミノ酸からなるペプチドスペー
サーにより分離することができることを認めるだろう。
一般に、スペーサーは、タンパク質を連結すること又は
それらの間の特定の距離又は他の空間的関係を保護する
こと以外に特定の生物活性を有さないであろう。しかし
ながら、そのスペーサーの構成アミノ酸は、ホールディ
ング、正味の電荷、又は疎水性のような分子の特定の特
性に影響を与えるように選択することができる。
rOnc分子又は融合タンパク質をコードする核酸配列
は、種々の宿主細胞、例えば大腸菌、他のバクテリア宿
主、イースト、及び種々の高等真核細胞、例えばCOS,CH
O及びHeLa細胞系及びミエローマ細胞系において発現さ
せることができる。組換えタンパク質遺伝子に、各々の
宿主のための適切な発現調節配列に作用的に結合される
であろう。大腸菌について、これは、プロモーター、例
えばT7,trp、又はラムダプロモーター、リボソーム結合
部位及び好ましくは転写終了シグナルを含む。真核細胞
について、調節配列は、プロモーター及び好ましくは、
イムノグロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウィルス
等由来のエンハンサー、並びにポリアデニル化配列を含
むであろう。そしてそれはスプライスドナー及びアクセ
プター配列を含み得る。
は、種々の宿主細胞、例えば大腸菌、他のバクテリア宿
主、イースト、及び種々の高等真核細胞、例えばCOS,CH
O及びHeLa細胞系及びミエローマ細胞系において発現さ
せることができる。組換えタンパク質遺伝子に、各々の
宿主のための適切な発現調節配列に作用的に結合される
であろう。大腸菌について、これは、プロモーター、例
えばT7,trp、又はラムダプロモーター、リボソーム結合
部位及び好ましくは転写終了シグナルを含む。真核細胞
について、調節配列は、プロモーター及び好ましくは、
イムノグロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウィルス
等由来のエンハンサー、並びにポリアデニル化配列を含
むであろう。そしてそれはスプライスドナー及びアクセ
プター配列を含み得る。
本発明の発現ベクター又はプラスミドは、公知の方
法、例えば大腸菌について塩化カルシウム形態転換及び
哺乳動物細胞についてリン酸カルシウム処理又はエレク
トロポレーションにより、所定の宿主細胞に移すことが
できる。プラスミドにより形質転換された細胞は、プラ
スミド上に含まれる遺伝子、例えばamp,gpt,neo及びhyg
により供される抗生物質に対する耐性により選択するこ
とができる。
法、例えば大腸菌について塩化カルシウム形態転換及び
哺乳動物細胞についてリン酸カルシウム処理又はエレク
トロポレーションにより、所定の宿主細胞に移すことが
できる。プラスミドにより形質転換された細胞は、プラ
スミド上に含まれる遺伝子、例えばamp,gpt,neo及びhyg
により供される抗生物質に対する耐性により選択するこ
とができる。
発現された後、組換えrOnc又は融合タンパク質は、当
該技術の標準的手順、例えば硫酸アンモニウム沈澱、ア
フイニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル
電気泳動等（全般的に、R.Scopes,Protein Purificatio
n,Springer−Verlag,N.Y.（1982）,Deutscher,Methods
in Enzymology Vol.182:Guide to Protein Purificatio
n.,Academic Press,Inc.N.Y.（1990）を参照のこと）に
従って精製することができる。少なくとも約90〜95％の
均一性の実質的に純粋な組成物が好ましく、98〜99％又
はそれ超の均一性が医薬として用いるために最も好まし
い。精製した後、次に、部分的に又は要求される均一性
まで、ポリペプチドは治療に用いることができる。
該技術の標準的手順、例えば硫酸アンモニウム沈澱、ア
フイニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル
電気泳動等（全般的に、R.Scopes,Protein Purificatio
n,Springer−Verlag,N.Y.（1982）,Deutscher,Methods
in Enzymology Vol.182:Guide to Protein Purificatio
n.,Academic Press,Inc.N.Y.（1990）を参照のこと）に
従って精製することができる。少なくとも約90〜95％の
均一性の実質的に純粋な組成物が好ましく、98〜99％又
はそれ超の均一性が医薬として用いるために最も好まし
い。精製した後、次に、部分的に又は要求される均一性
まで、ポリペプチドは治療に用いることができる。
従って、本発明は、上述の核酸配列を含む宿主細胞及
び発現ベクターも提供する。
び発現ベクターも提供する。
更に、本発明は、本発明の選択的細胞毒性試薬を作る
ために、リガンドに連結したrOncを用いて細胞を選択的
に殺す方法を含む。その方法は、殺されるべき細胞に試
薬を特異的に送り出すリガンドを有する本発明の細胞毒
性試薬に、殺すべき細胞を接触させることを含む。この
本発明の方法は、例えば、移植片対ホストの病気を引き
おこすであろう白血病細胞又はＴ細胞を殺すために、放
射により骨髄剥離を患う患者への移植の前に骨髄におい
て、不要な細胞の型を選択的に殺すことにより試験管内
で細胞分離を行うために用いることができる。
ために、リガンドに連結したrOncを用いて細胞を選択的
に殺す方法を含む。その方法は、殺されるべき細胞に試
薬を特異的に送り出すリガンドを有する本発明の細胞毒
性試薬に、殺すべき細胞を接触させることを含む。この
本発明の方法は、例えば、移植片対ホストの病気を引き
おこすであろう白血病細胞又はＴ細胞を殺すために、放
射により骨髄剥離を患う患者への移植の前に骨髄におい
て、不要な細胞の型を選択的に殺すことにより試験管内
で細胞分離を行うために用いることができる。
試験管内での使用の方法について、好ましくは、この
方法に用いられる試薬の哺乳動物タンパク質は、その試
薬が使用を意図する種に対して異種である。好ましく
は、ヒトにおける使用のために、細胞毒性試薬は、ヒト
に適応させたキメラ抗体及びヒトに適応させたrOncを含
む融合タンパク質である。本発明の特定の生体内方法
は、哺乳動物において癌を化学治療的に緩和する方法で
あって、細胞毒性の量の本発明による選択的細胞毒性試
薬を投与することを含む方法を含む。その方法は、特
に、細胞毒性試薬にセンシティブな腫瘍を治療するのに
役立つ。特定の関心の腫瘍は、膵臓、直腸胸及び腎臓腫
瘍を含む。
方法に用いられる試薬の哺乳動物タンパク質は、その試
薬が使用を意図する種に対して異種である。好ましく
は、ヒトにおける使用のために、細胞毒性試薬は、ヒト
に適応させたキメラ抗体及びヒトに適応させたrOncを含
む融合タンパク質である。本発明の特定の生体内方法
は、哺乳動物において癌を化学治療的に緩和する方法で
あって、細胞毒性の量の本発明による選択的細胞毒性試
薬を投与することを含む方法を含む。その方法は、特
に、細胞毒性試薬にセンシティブな腫瘍を治療するのに
役立つ。特定の関心の腫瘍は、膵臓、直腸胸及び腎臓腫
瘍を含む。
医薬組成物
rOnc分子及び本発明のそれらを用いる融合タンパク質
は、診断及び／又は治療処置のために、エーロゾルによ
り又は経皮により、非経口的、局所的、経口的、又は局
所的投与のために役立つ。その医薬組成物は、投与の方
法により種々の単位投与形態で投与することができる。
例えば、経口投与に適した単位投与形態は、粉末、錠
剤、丸剤、カプセル及びロゼンジを含む。本分子及び融
合タンパク質、並びに本発明の医薬組成物は、経口的に
投与した時に消化から保護されなければならないことが
認められる。これは、典型的には、そのタンパク質を、
酸及び酵素加水分解に対してそのタンパク質を耐性にす
る組成物と複合化することにより、又はそのタンパク質
を、リポソームのような適切な耐性担体中に充填するこ
とにより達成される。タンパク質を消化から保護する手
段は当該技術で公知である。
は、診断及び／又は治療処置のために、エーロゾルによ
り又は経皮により、非経口的、局所的、経口的、又は局
所的投与のために役立つ。その医薬組成物は、投与の方
法により種々の単位投与形態で投与することができる。
例えば、経口投与に適した単位投与形態は、粉末、錠
剤、丸剤、カプセル及びロゼンジを含む。本分子及び融
合タンパク質、並びに本発明の医薬組成物は、経口的に
投与した時に消化から保護されなければならないことが
認められる。これは、典型的には、そのタンパク質を、
酸及び酵素加水分解に対してそのタンパク質を耐性にす
る組成物と複合化することにより、又はそのタンパク質
を、リポソームのような適切な耐性担体中に充填するこ
とにより達成される。タンパク質を消化から保護する手
段は当該技術で公知である。
本発明の医薬組成物は、静脈内投与又は体腔もしくは
器官のルーメン内への投与のような非経口的投与につい
て特に役立つ。投与のための組成物は、一般に、医薬と
して許容される担体、好ましくは水性担体中に溶かした
キメラ分子の溶液を含むであろう。種々の水性担体、例
えば緩衝塩類溶液等を用いることができる。これらの溶
液は滅菌状態であり、一般に不要な物質を含まない。こ
れらの組成物は、慣用的な公知の滅菌技術により滅菌す
ることができる。その組成物は、適切な生理条件に必要
とされるような医薬として許容される補助剤、例えばpH
調節及び緩衝剤、毒性調節剤等。例えば、酢酸ナトリウ
ム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、
乳酸ナトリウム等を含み得る。これらの製剤中の治療分
子の濃度は極めて広範囲であり得、選択された投与の特
定の態様及び患者の必要に従って、主に流体容量、粘
度、体重等から選択されよう。
器官のルーメン内への投与のような非経口的投与につい
て特に役立つ。投与のための組成物は、一般に、医薬と
して許容される担体、好ましくは水性担体中に溶かした
キメラ分子の溶液を含むであろう。種々の水性担体、例
えば緩衝塩類溶液等を用いることができる。これらの溶
液は滅菌状態であり、一般に不要な物質を含まない。こ
れらの組成物は、慣用的な公知の滅菌技術により滅菌す
ることができる。その組成物は、適切な生理条件に必要
とされるような医薬として許容される補助剤、例えばpH
調節及び緩衝剤、毒性調節剤等。例えば、酢酸ナトリウ
ム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、
乳酸ナトリウム等を含み得る。これらの製剤中の治療分
子の濃度は極めて広範囲であり得、選択された投与の特
定の態様及び患者の必要に従って、主に流体容量、粘
度、体重等から選択されよう。
これにより、静脈内投与のための典型的な医薬組成物
は、１日当り患者当り約0.1〜10mgであろう。１日当り
患者当り0.1から約100mgまでの投与量が、特にその薬剤
を血液内でなく隔離した部位、例えば体腔又は器官のル
ーメン内に投与する時に用いることができる。非経口投
与可能な組成物を調製するための実際の方法は当業者に
周知又は明らかであろうし、Remington's Pharmaceutic
al Science,15th ed（Mack Publishing Company,Easto
n,Pennsylvania（1980）のような出版物により詳細に記
載される。
は、１日当り患者当り約0.1〜10mgであろう。１日当り
患者当り0.1から約100mgまでの投与量が、特にその薬剤
を血液内でなく隔離した部位、例えば体腔又は器官のル
ーメン内に投与する時に用いることができる。非経口投
与可能な組成物を調製するための実際の方法は当業者に
周知又は明らかであろうし、Remington's Pharmaceutic
al Science,15th ed（Mack Publishing Company,Easto
n,Pennsylvania（1980）のような出版物により詳細に記
載される。
本rOnc分子もしくは融合タンパク質又はその混合物
（即ち他のタンパク質との混合物）を含む組成物は、治
療処置のために投与することができる。治療的適用のた
めに、組成物は、関心の細胞を殺すのに十分な量である
細胞毒性量で、病気を患う患者に投与される。これを達
成するのに適した量は、“治療に有効な投与量”として
定義される。これに有効な量は病気の厳しさ及び患者の
健康の全般的状態によるであろう。
（即ち他のタンパク質との混合物）を含む組成物は、治
療処置のために投与することができる。治療的適用のた
めに、組成物は、関心の細胞を殺すのに十分な量である
細胞毒性量で、病気を患う患者に投与される。これを達
成するのに適した量は、“治療に有効な投与量”として
定義される。これに有効な量は病気の厳しさ及び患者の
健康の全般的状態によるであろう。
本組成物の単一又は多量の投与を、その投与量並びに
患者により必要とされ許容される頻度により、行うこと
ができる。いずれの場合にも、本組成物は患者を有効に
治療するのに十分な量の本発明のタンパク質を供するべ
きである。
患者により必要とされ許容される頻度により、行うこと
ができる。いずれの場合にも、本組成物は患者を有効に
治療するのに十分な量の本発明のタンパク質を供するべ
きである。
本明細書に言及される全ての特許、出願及び出版物は
引用により本明細書に組み込まれる。以下の実施例は詳
説目的のために供され、いずれかの方法によって本発明
を限定するものとして解釈すべきでない。
引用により本明細書に組み込まれる。以下の実施例は詳
説目的のために供され、いずれかの方法によって本発明
を限定するものとして解釈すべきでない。
実施例
実施例１
rOnc及びEDNとのOncコンジュゲートのクローニング及び
発現 A.材料 ネイティブONCONASE （“nOnc"）（配列番号:1）（A
rdeltら（1991）J.Biol.Chem.256,245−251）及び組換
えヒトEDN（“rEDN"）（配列番号:9）（Newtonら（199
4）J.Biol.Chem.269,26739−26745）を、各々記載され
るようにラナ・ピピエンス卵母細胞（NASCO,Fort Atkin
son,WI）及び大腸菌から精製した。変性させたタンパク
質に対する抗体を、ASsay Research,Inc.（College Par
k,MD）により精製した。PCR及びPCR産物の直接的クロー
ニングを行うための試薬をPerkin−Elmer Corp.（Norwa
lk,CT）及びInvitrogen（San Diego,（Ａ）から各々得
た。リボヌクレアーゼアッセイのための基質を、Sigma
（St.Louis,MO）及びBoehringer Mannheim（Indianapol
is,IN）から購入した。その作製及び組換えタンパク質
の発現に用いる材料及びそれらのソース並びに網状赤血
球ライゼートは、Newtonら（Biochemistry 35:545（199
6）に記載される。
発現 A.材料 ネイティブONCONASE （“nOnc"）（配列番号:1）（A
rdeltら（1991）J.Biol.Chem.256,245−251）及び組換
えヒトEDN（“rEDN"）（配列番号:9）（Newtonら（199
4）J.Biol.Chem.269,26739−26745）を、各々記載され
るようにラナ・ピピエンス卵母細胞（NASCO,Fort Atkin
son,WI）及び大腸菌から精製した。変性させたタンパク
質に対する抗体を、ASsay Research,Inc.（College Par
k,MD）により精製した。PCR及びPCR産物の直接的クロー
ニングを行うための試薬をPerkin−Elmer Corp.（Norwa
lk,CT）及びInvitrogen（San Diego,（Ａ）から各々得
た。リボヌクレアーゼアッセイのための基質を、Sigma
（St.Louis,MO）及びBoehringer Mannheim（Indianapol
is,IN）から購入した。その作製及び組換えタンパク質
の発現に用いる材料及びそれらのソース並びに網状赤血
球ライゼートは、Newtonら（Biochemistry 35:545（199
6）に記載される。
B.オンコナーゼのPCRクローニング
ラナ・ピピエンスゲノムDNAを、プロテインキナーゼ
Ｋを用いて標準的手順に従って単離した（Maniatis,T.,
Fritsch,E.F.＆ Sanbrook,J.Molecular Cloning,a labo
ratory manual（Cold Spring Harbor,Laboratory,Cold
Spring Harbor,New York,1982）。一連の縮重プライマ
ーを、公開させたnOnc配列の種々の領域中のアミノ酸に
対応するようにデザインした（Ardeltら（1991）J.Bio
l.Chem.256,245−251）。そのPCR反応を、100μｌ中15
μｇのゲノムDNAを用いて、製造元の説明に従って行っ
た。DNAを除く全ての試薬を組み合わせ、８分間、95℃
でインキュベートして、TagDNAポリメラーゼを加える前
にいずれの残ったプロテインキナーゼＫも不活性化し
た。94℃、１分の変性、55℃、２分のアニーリング、及
び72℃、２分のプライマー伸長の40サイクルについてPC
Rを行った。いくつかのプライマーの対により、予想さ
れる大きさの産物を供した。最も大きな産物（252bp）
は、アミノ酸残基15−23（AG（GA）GATGT（GT）GATTG
（TC）GATAA（CT）ATCATG）（配列番号:35）をコードす
る正プライマー及びアミノ酸残基90−98（TGTGA（AG）A
A（CT）CAGGC（AC）CC（TA）GT（GT）CA（CT）TTT）
（配列番号:36）をコードする逆プライマーを用いて得
た。このフラグメントをTAクローニングによりpCRTM I
Iにサブクローンし、適切な大きさの挿入物を有するク
ローンを通接配列決定し、nOncのアミノ酸残基16−98
（“Rana9"）（配列番号:2）をコードすることが見い出
された。対応する核酸配列を配列番号:37に示す。
Ｋを用いて標準的手順に従って単離した（Maniatis,T.,
Fritsch,E.F.＆ Sanbrook,J.Molecular Cloning,a labo
ratory manual（Cold Spring Harbor,Laboratory,Cold
Spring Harbor,New York,1982）。一連の縮重プライマ
ーを、公開させたnOnc配列の種々の領域中のアミノ酸に
対応するようにデザインした（Ardeltら（1991）J.Bio
l.Chem.256,245−251）。そのPCR反応を、100μｌ中15
μｇのゲノムDNAを用いて、製造元の説明に従って行っ
た。DNAを除く全ての試薬を組み合わせ、８分間、95℃
でインキュベートして、TagDNAポリメラーゼを加える前
にいずれの残ったプロテインキナーゼＫも不活性化し
た。94℃、１分の変性、55℃、２分のアニーリング、及
び72℃、２分のプライマー伸長の40サイクルについてPC
Rを行った。いくつかのプライマーの対により、予想さ
れる大きさの産物を供した。最も大きな産物（252bp）
は、アミノ酸残基15−23（AG（GA）GATGT（GT）GATTG
（TC）GATAA（CT）ATCATG）（配列番号:35）をコードす
る正プライマー及びアミノ酸残基90−98（TGTGA（AG）A
A（CT）CAGGC（AC）CC（TA）GT（GT）CA（CT）TTT）
（配列番号:36）をコードする逆プライマーを用いて得
た。このフラグメントをTAクローニングによりpCRTM I
Iにサブクローンし、適切な大きさの挿入物を有するク
ローンを通接配列決定し、nOncのアミノ酸残基16−98
（“Rana9"）（配列番号:2）をコードすることが見い出
された。対応する核酸配列を配列番号:37に示す。
C.プラスミド作製、発現、タンパク質精製及び試験管内
アッセイ nOncのＮ−及び−Ｃ−末端を、nOncのアミノ酸残基１
−15又はＮ末端におけるEDNのアミノ酸残基１−21及び
Ｃ末端におけるnOncのアミノ酸残基99−104でのオーバ
ーラップ伸長（Hortenら（1990）Biotechniques 8,528
−532）によるスプライシングのPCR技術を用いて再構成
した。そのアセンブルした遺伝子を、バクテリア発現ベ
クターpET−lld（Novagen,Madison,WI）のXba I及びBam
H I部位の間に挿入した。全ての手順は、本質的にNewto
nら（（1994）J.Biol.Chem.269,26739−26745）に記載
されるように行った。供給元（Novagen,Medison WI）に
より推奨されるように、BL21（DE3）大腸菌細胞内でプ
ラスミドを発現させた。その融合タンパク質を（Ｍ−Se
phadex Ｃ−50カラム（Pharmacia Biotech Inc.,Pisca
taway,NJに適用する前にNewtonら（（1994）J.Biol Che
m.269,26739−26745に記載されるように封入体から単離
し、変性し、そして透析した。そのタンパク質を、10％
グリセロールを含む20mM Tris−HCl,pH7.5中NaCl勾配10
−0.5μ）で溶出した。95％超への最終的精製を、平衡
化したSephadeyG−100上で５％ギ酸で溶出するサイズ排
除クロマトグラフィーにより行った。そのタンパク質を
プールし、YM3膜（Amicon,Beverly,MA）を用いるアミコ
ン限外ろ過により濃縮（又は凍結乾燥）し、アッセイす
る前に、10％グリセロールを含む20mM Tris−HCl,pH7.5
に対して透析した。
アッセイ nOncのＮ−及び−Ｃ−末端を、nOncのアミノ酸残基１
−15又はＮ末端におけるEDNのアミノ酸残基１−21及び
Ｃ末端におけるnOncのアミノ酸残基99−104でのオーバ
ーラップ伸長（Hortenら（1990）Biotechniques 8,528
−532）によるスプライシングのPCR技術を用いて再構成
した。そのアセンブルした遺伝子を、バクテリア発現ベ
クターpET−lld（Novagen,Madison,WI）のXba I及びBam
H I部位の間に挿入した。全ての手順は、本質的にNewto
nら（（1994）J.Biol.Chem.269,26739−26745）に記載
されるように行った。供給元（Novagen,Medison WI）に
より推奨されるように、BL21（DE3）大腸菌細胞内でプ
ラスミドを発現させた。その融合タンパク質を（Ｍ−Se
phadex Ｃ−50カラム（Pharmacia Biotech Inc.,Pisca
taway,NJに適用する前にNewtonら（（1994）J.Biol Che
m.269,26739−26745に記載されるように封入体から単離
し、変性し、そして透析した。そのタンパク質を、10％
グリセロールを含む20mM Tris−HCl,pH7.5中NaCl勾配10
−0.5μ）で溶出した。95％超への最終的精製を、平衡
化したSephadeyG−100上で５％ギ酸で溶出するサイズ排
除クロマトグラフィーにより行った。そのタンパク質を
プールし、YM3膜（Amicon,Beverly,MA）を用いるアミコ
ン限外ろ過により濃縮（又は凍結乾燥）し、アッセイす
る前に、10％グリセロールを含む20mM Tris−HCl,pH7.5
に対して透析した。
高分子量RNA及びtRNAを用いるリボヌクレアーゼ活性
を、公開されたプロトコル（Newtonら（1996）Biochem.
35:545−553）に従う過塩素酸可溶性ヌクレオチドの形
成を通して37℃で、公開されたプロトコル（Newtonら、
（1994）J.Neurosci 14,538−544）に従って決定した。
ポリ（A,C）,UpG及びポリＵで、DePriscoら，並びにLib
onati及びFlorida Depriscoら．（1984）Biochimica et
Biophysica Acta 788,356−363,Libonati,M.＆ Florid
i,A.（1969）European J.Biochem.8,81−87に従って、
リボヌクレアーゼ活性を分光光度測定でアッセイした。
要約すると、260nmでの吸光度の増加を測定することに
より活性をアッセイした。インキュベーション混合物
（1mの10mMイミダゾール、0.1M NaCl,pH6.5又はpH7）
は、25℃において基質及び適切な量の酵素を含んでい
た。３−（4,5−ジメチルチアゾール−２−イル−2,5−
ジフェニルテトラゾリウムブロマイド；チアゾリルブル
ー〕（MTT）（Mossman,T.（1983）は、Immunol Method
65,55−63）を用いる試験管内翻訳アッセイ（St.Clair
ら（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.84,8330−8334）、及び
細胞生存アッセイ（Pearsonら、（1991）J.Natl.Cancer
Inst.83,1386−1391）を上述の通り行った。
を、公開されたプロトコル（Newtonら（1996）Biochem.
35:545−553）に従う過塩素酸可溶性ヌクレオチドの形
成を通して37℃で、公開されたプロトコル（Newtonら、
（1994）J.Neurosci 14,538−544）に従って決定した。
ポリ（A,C）,UpG及びポリＵで、DePriscoら，並びにLib
onati及びFlorida Depriscoら．（1984）Biochimica et
Biophysica Acta 788,356−363,Libonati,M.＆ Florid
i,A.（1969）European J.Biochem.8,81−87に従って、
リボヌクレアーゼ活性を分光光度測定でアッセイした。
要約すると、260nmでの吸光度の増加を測定することに
より活性をアッセイした。インキュベーション混合物
（1mの10mMイミダゾール、0.1M NaCl,pH6.5又はpH7）
は、25℃において基質及び適切な量の酵素を含んでい
た。３−（4,5−ジメチルチアゾール−２−イル−2,5−
ジフェニルテトラゾリウムブロマイド；チアゾリルブル
ー〕（MTT）（Mossman,T.（1983）は、Immunol Method
65,55−63）を用いる試験管内翻訳アッセイ（St.Clair
ら（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.84,8330−8334）、及び
細胞生存アッセイ（Pearsonら、（1991）J.Natl.Cancer
Inst.83,1386−1391）を上述の通り行った。
D.〔Met−（−１）〕rOnc及びrOncキメラのクローニン
グ及び発現 ８の異なるオリゴヌクレオチドプライマーを、nOncの
一次アミノ酸構造内の特定領域に対応するようにデザイ
ンし（Ardeltら（（1991）J.Biol.Chem.256,245−25
1）、ラナ・ピピエンスゲノムDNAの増幅を、上述の通り
熱的サイクラー内で行った。nOncのアミノ酸残基15〜23
及び90〜98に対応する各々のプライマー対は252bpフラ
グメントを形成した。本明細書でラナ・クローン９と呼
ぶこのPCR産をpCRTMII内にクローン化し、配列分析によ
り、そのPCR産物がアミノ酸残基16〜98からのOnc（全部
で104アミノ酸）をコードすることを確認した（図
１）。
グ及び発現 ８の異なるオリゴヌクレオチドプライマーを、nOncの
一次アミノ酸構造内の特定領域に対応するようにデザイ
ンし（Ardeltら（（1991）J.Biol.Chem.256,245−25
1）、ラナ・ピピエンスゲノムDNAの増幅を、上述の通り
熱的サイクラー内で行った。nOncのアミノ酸残基15〜23
及び90〜98に対応する各々のプライマー対は252bpフラ
グメントを形成した。本明細書でラナ・クローン９と呼
ぶこのPCR産をpCRTMII内にクローン化し、配列分析によ
り、そのPCR産物がアミノ酸残基16〜98からのOnc（全部
で104アミノ酸）をコードすることを確認した（図
１）。
全体の組換えOnc（“rOnc"）遺伝子（配列番号:38）
を、PCR伸長により作製し、上述の方法を用いて発現ベ
クターにクローン化した（Newtonら（1994）J.Biol.Che
m.269,26739−26745）。rOncのアミノ及びカルボキシ末
端を、各々nOncの最初の15及び最後の６アミノ酸を挿入
して完成させた。半合成rOnc遺伝子の配置を図2Aの上に
示す。そのプライマーを、ラナ・クローン9 PCR産物のD
NA配列とオーバーラップするようデザインした。そのプ
ラスミドをBL21（DE3）大腸菌内で発現させ、組換えタ
ンパク質を、CM Sephadex Ｃ−50カラムに適用する前
にNewtonら（（1994）J.Biol.Chem.269,26739−26745に
記載されるように封入体から単離した。サイズ排除クロ
マトグラフィーにより95％超までの最終的精製を達成し
た。この発現システムにおいてバクテリアから得たrOnc
は、ネイティブタンパク質（配列番号:1）の真のピログ
ルタミンアミノ酸残基（＜Glu−１）と対照的に、アミ
ノ末端の〔Met−（−１）〕において付加的なメチオニ
ンを含む（配列番号:9）。
を、PCR伸長により作製し、上述の方法を用いて発現ベ
クターにクローン化した（Newtonら（1994）J.Biol.Che
m.269,26739−26745）。rOncのアミノ及びカルボキシ末
端を、各々nOncの最初の15及び最後の６アミノ酸を挿入
して完成させた。半合成rOnc遺伝子の配置を図2Aの上に
示す。そのプライマーを、ラナ・クローン9 PCR産物のD
NA配列とオーバーラップするようデザインした。そのプ
ラスミドをBL21（DE3）大腸菌内で発現させ、組換えタ
ンパク質を、CM Sephadex Ｃ−50カラムに適用する前
にNewtonら（（1994）J.Biol.Chem.269,26739−26745に
記載されるように封入体から単離した。サイズ排除クロ
マトグラフィーにより95％超までの最終的精製を達成し
た。この発現システムにおいてバクテリアから得たrOnc
は、ネイティブタンパク質（配列番号:1）の真のピログ
ルタミンアミノ酸残基（＜Glu−１）と対照的に、アミ
ノ末端の〔Met−（−１）〕において付加的なメチオニ
ンを含む（配列番号:9）。
活性部位残基のアラインメントを維持しながら〔Met
−（−１）〕rOncをヒトに適合させるために（図2B）、
ラナ・クローン９のＮ末端も、ヒト好酸球RNase,EDNの
最初の21アミノ酸残基（図2B,rEDN(1-21)Onc）をコード
するオリゴヌクレオチドで再構成した。PCRクローニン
グは、配列誤差を生じ得る。実際、EDN(1-21)Oncをコー
ドする遺伝子のDNA配列は、ＡからＧへの置換を含んで
おり、それはキメラ（nOnc中残基20）において位置26の
AspからGlyへの変化を生じ、図2BにおいてrEDN(1-21)rO
ncG26としてデザインされる。コード化rEDN(1-21)rOnc
を含む他のプラスミドを配列決定し、正確なDNA配列を
有することを見い出した。その変異は、電界のあるアミ
ノ酸の小さな中性残基での置換を生ずるので、その変異
キメラも発現し、活性についてキヤラクタライズした。
更に、〔Met−（−１）〕rOncを位置20においてAspから
Glyに変異させた（rOncGly20、図2A及びＢ）。
−（−１）〕rOncをヒトに適合させるために（図2B）、
ラナ・クローン９のＮ末端も、ヒト好酸球RNase,EDNの
最初の21アミノ酸残基（図2B,rEDN(1-21)Onc）をコード
するオリゴヌクレオチドで再構成した。PCRクローニン
グは、配列誤差を生じ得る。実際、EDN(1-21)Oncをコー
ドする遺伝子のDNA配列は、ＡからＧへの置換を含んで
おり、それはキメラ（nOnc中残基20）において位置26の
AspからGlyへの変化を生じ、図2BにおいてrEDN(1-21)rO
ncG26としてデザインされる。コード化rEDN(1-21)rOnc
を含む他のプラスミドを配列決定し、正確なDNA配列を
有することを見い出した。その変異は、電界のあるアミ
ノ酸の小さな中性残基での置換を生ずるので、その変異
キメラも発現し、活性についてキヤラクタライズした。
更に、〔Met−（−１）〕rOncを位置20においてAspから
Glyに変異させた（rOncGly20、図2A及びＢ）。
E.Onc,EDN、〔Met−（−１）〕rOnc及びハイブリッドrO
ncタンパク質のリボヌクレアーゼ活性 nOnc（Lin,J.J.ら（1994）Biochem.Biophys,Res.Comm
un.204,156−162）及びEDN（Saxenaら（1992）J.Biol.C
hem.267,21982−21986）の両方は、それらの各々の核分
解活性に依存するメカニズムによりウサギ網状赤血球ラ
イゼート内の試験管内翻訳の潜在的インヒビターであ
る。表１に示すように、ウサギ網状赤血球ライゼートへ
のnOnc又はEDNの添加は、〔35S〕メチオニンの酸沈澱性
タンパク質への組込みにより測定されるようなタンパク
質合成の阻害を引きおこした。nOnc及びEDNの両方は各
々に0.2及び1.3ng/mのIC50で、タンパク質合成を阻害
したので、〔Met−（−１）〕rOnc、〔Met−（−１）〕
rOncG20、及びrEDN(1-21)rOncG26はかなり小さい能力で
あった（各々98,28及び28ng/mのIC50）。このアッセ
イにおける最少の活性のRNaseは1600ng/mのrEDN
(1-21)rOncであった。脂質リボヌクレアーゼインヒビタ
ー（PRI）はEDNに堅く結合し、その酵素活性を阻害する
（Sorrentinoら（1992）J.Biol.Chem.267,14859−1486
5）が、そのEDN及び膵臓RNaseスーパーファミリーの他
のメンバーとの相同性にかかわらず、nOnc活性はPRIに
よりほとんど影響を受けない（Wu,Y.Nら（1993）Journa
l of Biological Chemistry 268,10686−10693及び表
１）。この点に関してrEDN(1-21)rOncの活性は、nOncと
同様に、ほとんどPRIにより影響を受けず、他方Gly変異
を有するハイブリッドRNaseは、その活性がPRIにより大
きく阻害される（21倍）点においてEDNと同様にふるま
う。
ncタンパク質のリボヌクレアーゼ活性 nOnc（Lin,J.J.ら（1994）Biochem.Biophys,Res.Comm
un.204,156−162）及びEDN（Saxenaら（1992）J.Biol.C
hem.267,21982−21986）の両方は、それらの各々の核分
解活性に依存するメカニズムによりウサギ網状赤血球ラ
イゼート内の試験管内翻訳の潜在的インヒビターであ
る。表１に示すように、ウサギ網状赤血球ライゼートへ
のnOnc又はEDNの添加は、〔35S〕メチオニンの酸沈澱性
タンパク質への組込みにより測定されるようなタンパク
質合成の阻害を引きおこした。nOnc及びEDNの両方は各
々に0.2及び1.3ng/mのIC50で、タンパク質合成を阻害
したので、〔Met−（−１）〕rOnc、〔Met−（−１）〕
rOncG20、及びrEDN(1-21)rOncG26はかなり小さい能力で
あった（各々98,28及び28ng/mのIC50）。このアッセ
イにおける最少の活性のRNaseは1600ng/mのrEDN
(1-21)rOncであった。脂質リボヌクレアーゼインヒビタ
ー（PRI）はEDNに堅く結合し、その酵素活性を阻害する
（Sorrentinoら（1992）J.Biol.Chem.267,14859−1486
5）が、そのEDN及び膵臓RNaseスーパーファミリーの他
のメンバーとの相同性にかかわらず、nOnc活性はPRIに
よりほとんど影響を受けない（Wu,Y.Nら（1993）Journa
l of Biological Chemistry 268,10686−10693及び表
１）。この点に関してrEDN(1-21)rOncの活性は、nOncと
同様に、ほとんどPRIにより影響を受けず、他方Gly変異
を有するハイブリッドRNaseは、その活性がPRIにより大
きく阻害される（21倍）点においてEDNと同様にふるま
う。
これらのタンパク質のリボヌクレアーゼ活性を、高及
び低分子量基質を用いるアッセイにおいても評価した。
表２に示すように、EDN及びnOncは、先に公開された結
果（Ardeltら．（1991）J.Biol.Chem.256,245−251,Sor
rentinoら．（1992）J.Biol.Chem.267,14859−14865,Ar
deltら．（1994）Protein Sci 3,Suppl.1,137）と一貫
して異なる基質特異性を有する。表１に供される結果で
一貫して、〔Met−（−１）〕rOnc（配列番号:39）及び
rEDN(1-21)rOncは、全ての基質で極めて小さな活性であ
った（用いてアッセイ条件下で検出できないか又は極め
て小さい活性）。驚くことに、ハイブリッドタンパク質
を含むGlyは、特にEDN酵素活性について最適な条件下
で、大きなリボヌクレアーゼ活性を示した。EDNは中性p
Hにおいてより活性であり（Sorrentinoら（1992）J.Bio
l.Chem.267,14859−14865）、表２に見られるように、p
H6と比較してpH7.5においてtRNAのEDNデグラデーション
の著しい増加があった（42.3倍）。また、EDNと同様
に、Gly含有ハイブリッドは６から7.5へのpHシフトで活
性が増加し（21.7倍）、他方nOncは６〜6.5の範囲の至
適pHで、一貫してpH7.5で活性を失った（Ardeltら（199
1）J.Biol.Chem.256,245−251,Ardeltら（1994）Protei
n Sci 3,Suppl.1,137）。Gly含有ハイブリッドタンパク
質の増強されたEDN様活性は、EDNのための優れた基質で
あるポリ（A,C）でのそのふるまいによっても証明され
る。表２で見ることができるように、rEDN(1-21)rOncG2
6のみがこの基質でEDNの酵素活性の約50％を示し、他方
他のRNaseの活性は無視できるものである。ポリ（Ｕ）
でも同様の結果が観察された。対照的に、最適なオンコ
ナーゼ（Onconase）基質であるUpGではrEDN又はrEDN
(1-21)rOncG26の活性は検出できなかった（Ardeltら（1
994）Protein Sci 3,Suppl.1,137）。要約すると、〔Me
t−（−１）〕rOnc及びrEDN(1-21)rOncの両方はnOnc又
はrEDNより小さい酵素活性である。rEDN(1-21)rOncG26
は、所定の基質及びEDNのための最適の条件を用いてア
ッセイした時、大きなEDN様酵素活性を示すが、それは
いずれのアッセイにおいてもEDNほど活性ではない、こ
れは、減ぜられた酵素基質相互作用から、又はこのハイ
ブリッド酵素のためのサブ最適アッセイ条件の使用から
生じ得るのであろう。
び低分子量基質を用いるアッセイにおいても評価した。
表２に示すように、EDN及びnOncは、先に公開された結
果（Ardeltら．（1991）J.Biol.Chem.256,245−251,Sor
rentinoら．（1992）J.Biol.Chem.267,14859−14865,Ar
deltら．（1994）Protein Sci 3,Suppl.1,137）と一貫
して異なる基質特異性を有する。表１に供される結果で
一貫して、〔Met−（−１）〕rOnc（配列番号:39）及び
rEDN(1-21)rOncは、全ての基質で極めて小さな活性であ
った（用いてアッセイ条件下で検出できないか又は極め
て小さい活性）。驚くことに、ハイブリッドタンパク質
を含むGlyは、特にEDN酵素活性について最適な条件下
で、大きなリボヌクレアーゼ活性を示した。EDNは中性p
Hにおいてより活性であり（Sorrentinoら（1992）J.Bio
l.Chem.267,14859−14865）、表２に見られるように、p
H6と比較してpH7.5においてtRNAのEDNデグラデーション
の著しい増加があった（42.3倍）。また、EDNと同様
に、Gly含有ハイブリッドは６から7.5へのpHシフトで活
性が増加し（21.7倍）、他方nOncは６〜6.5の範囲の至
適pHで、一貫してpH7.5で活性を失った（Ardeltら（199
1）J.Biol.Chem.256,245−251,Ardeltら（1994）Protei
n Sci 3,Suppl.1,137）。Gly含有ハイブリッドタンパク
質の増強されたEDN様活性は、EDNのための優れた基質で
あるポリ（A,C）でのそのふるまいによっても証明され
る。表２で見ることができるように、rEDN(1-21)rOncG2
6のみがこの基質でEDNの酵素活性の約50％を示し、他方
他のRNaseの活性は無視できるものである。ポリ（Ｕ）
でも同様の結果が観察された。対照的に、最適なオンコ
ナーゼ（Onconase）基質であるUpGではrEDN又はrEDN
(1-21)rOncG26の活性は検出できなかった（Ardeltら（1
994）Protein Sci 3,Suppl.1,137）。要約すると、〔Me
t−（−１）〕rOnc及びrEDN(1-21)rOncの両方はnOnc又
はrEDNより小さい酵素活性である。rEDN(1-21)rOncG26
は、所定の基質及びEDNのための最適の条件を用いてア
ッセイした時、大きなEDN様酵素活性を示すが、それは
いずれのアッセイにおいてもEDNほど活性ではない、こ
れは、減ぜられた酵素基質相互作用から、又はこのハイ
ブリッド酵素のためのサブ最適アッセイ条件の使用から
生じ得るのであろう。
F. RNaseによる４つのヒト腫瘍細胞系におけるタンパ
ク質合成の阻害 〔Met−（−１）〕rOnc及び２つのハイブリッドRNase
の細胞毒性効果を、MTTアッセイを用いて細胞生存性を
測定することによりrEDN及びnOncと比較した。図３に示
すように、nOncは全ての４つのヒト腫瘍細胞系において
腫瘍細胞生存性を減少させた。示される濃度において、
rEDNはいずれの細胞系の生存性にも効果を有さなかっ
た。nOncと対照的に、〔Met−（−１）〕rOnc及び〔Met
−（−１）〕rOncG20は一貫して、全ての４つの細胞系
において毒性が少なかった。しかし、rEDN(1-21)rOncG2
6は、ヒト腎臓癌細胞であるACHNにおいてnOncより細胞
毒性であり、ヒト乳癌細胞系のMDA−MB−231において等
しく細胞毒性であった。rEDN(1-21)rOncG26はSF−539及
びHS 578Tヒトグリオーム並びに乳癌細胞系各々におい
てnOncより活性がなかった。それはなお、位置26にAsn
を含む〔Met−（−１）〕rOnc又はrEDN(1-21)rOncタン
パク質より活性であった。
ク質合成の阻害 〔Met−（−１）〕rOnc及び２つのハイブリッドRNase
の細胞毒性効果を、MTTアッセイを用いて細胞生存性を
測定することによりrEDN及びnOncと比較した。図３に示
すように、nOncは全ての４つのヒト腫瘍細胞系において
腫瘍細胞生存性を減少させた。示される濃度において、
rEDNはいずれの細胞系の生存性にも効果を有さなかっ
た。nOncと対照的に、〔Met−（−１）〕rOnc及び〔Met
−（−１）〕rOncG20は一貫して、全ての４つの細胞系
において毒性が少なかった。しかし、rEDN(1-21)rOncG2
6は、ヒト腎臓癌細胞であるACHNにおいてnOncより細胞
毒性であり、ヒト乳癌細胞系のMDA−MB−231において等
しく細胞毒性であった。rEDN(1-21)rOncG26はSF−539及
びHS 578Tヒトグリオーム並びに乳癌細胞系各々におい
てnOncより活性がなかった。それはなお、位置26にAsn
を含む〔Met−（−１）〕rOnc又はrEDN(1-21)rOncタン
パク質より活性であった。
G.ハイブリッドRNaseの構造分析
ハイブリッドRNaseのモデリングは、Oncについての構
造のアラインメント（Mosimann S.C.,Ardelt W.,James
M.N.G.,（1994）,P30タンパク質の精密化した1.7ÅＸ線
結晶構造、抗腫瘍活性を有する両性数のリボヌクレアー
ゼ（J.Mol.Biol 236,1141−1153）及びEDN（Mosimann
S.C.Newton D.L.,Youle R.J.,James M.,X−ray crystal
lograplic structure of recombinant eosinophil−der
ived neurotoxin at 1.83Å resolution J.Mol.Biol.）
に基づいた。これ及び次のアラインメントは、ALIGN（S
atow Y.,Cohen G.H.,Padlan E.A.,Davies,D.R.,（198
6）,J.Mol.Biol 190,593−604）を用いて行った。
造のアラインメント（Mosimann S.C.,Ardelt W.,James
M.N.G.,（1994）,P30タンパク質の精密化した1.7ÅＸ線
結晶構造、抗腫瘍活性を有する両性数のリボヌクレアー
ゼ（J.Mol.Biol 236,1141−1153）及びEDN（Mosimann
S.C.Newton D.L.,Youle R.J.,James M.,X−ray crystal
lograplic structure of recombinant eosinophil−der
ived neurotoxin at 1.83Å resolution J.Mol.Biol.）
に基づいた。これ及び次のアラインメントは、ALIGN（S
atow Y.,Cohen G.H.,Padlan E.A.,Davies,D.R.,（198
6）,J.Mol.Biol 190,593−604）を用いて行った。
H.ハイブリッドRNaseの構造のモデリング
Onc及びEDNの座標をＣαトレースアラインメントに基
づいて重ね合わせた。保存的ゾーン、特に活性部位にお
ける残基は、両方の構造を比べた場合、極めて少しの置
換しか示さなかった（90のＣα原子対について1.44Åの
球状r.m.s.d.）。そのハイブリッドタンパク質を、手動
の再構成及びTOM（Combillaw C.,Horjales E.,（198
7）,J.Mol.Graph 5,174−177）を用いる幾何学的標準化
によりモデル化した。次に、rEDN(1-21)rOnc及びrEDN
(1-21)rOncG26のモデルを、全ての非水素原子について1
5Å２の全体のＢ因子にアサインし、独立して、プログ
ラムXPLORでのポテンシャルエネルギー最小化の300サイ
クルにかけた（Brunger A.（1992）XPLOR:a system for
X−ray crystallogvrphy and NMR.,New Haven:Yale Un
iversity Press）。その最小化は、両方の場合で実質的
に同一の構造を生じ、Ｃαトレースアラインメントに基
づく最も高い距離は変異した残基26のＣαについて0.44
であった。最終的なモデルの幾何学的質は、PROCHECKで
評価した（Laskowski R.A.,MacArthur M.W.,Moss D.S.,
Thornton J.M.,（1993）,J.Appl.Crystallogr 26,283−
291）。
づいて重ね合わせた。保存的ゾーン、特に活性部位にお
ける残基は、両方の構造を比べた場合、極めて少しの置
換しか示さなかった（90のＣα原子対について1.44Åの
球状r.m.s.d.）。そのハイブリッドタンパク質を、手動
の再構成及びTOM（Combillaw C.,Horjales E.,（198
7）,J.Mol.Graph 5,174−177）を用いる幾何学的標準化
によりモデル化した。次に、rEDN(1-21)rOnc及びrEDN
(1-21)rOncG26のモデルを、全ての非水素原子について1
5Å２の全体のＢ因子にアサインし、独立して、プログ
ラムXPLORでのポテンシャルエネルギー最小化の300サイ
クルにかけた（Brunger A.（1992）XPLOR:a system for
X−ray crystallogvrphy and NMR.,New Haven:Yale Un
iversity Press）。その最小化は、両方の場合で実質的
に同一の構造を生じ、Ｃαトレースアラインメントに基
づく最も高い距離は変異した残基26のＣαについて0.44
であった。最終的なモデルの幾何学的質は、PROCHECKで
評価した（Laskowski R.A.,MacArthur M.W.,Moss D.S.,
Thornton J.M.,（1993）,J.Appl.Crystallogr 26,283−
291）。
ハイブリッドRNaseを含むGlyとAsp間の活性の著しい
差についての構造的基板は、特に残基26が活性部位から
離れているのでこれらのタンパク質のモデリングからは
明らかでない。ペンタヌクレオチドと複合化したRNase
Aの高い相同性の構造（Fontecilla−Camps J.C.,delore
ns R.,leDu M.H.,Cuchillo C.M.,（1994）,J.Biol Chem
269,21526−21531）をハイブリッドタンパク質モデル
の構造と重ね合わせた場合、そのヌクレオチドも変異の
領域から遠いことが観察された。しかしながら、異なる
RNaseにおけるポリヌクレオチド鎖の配列は必ずしも一
致しない。EDNの構造において、活性部位におけるもの
に加えて、２番目の硫酸イオンが見い出された（Mosima
nn S.C.,Newton D.L.,Youle R.J.James M.,X−ray crys
tallographic structure of recombinant eosinophil−
derived neurotoxin at 1.83Å resolution J.Mol.Bio
l）。この第２の硫酸は、開裂するヌクレオチドからの
リン酸を置換するが、RNase A−ペンタヌクレオチド複
合体内の同じ位置に位置するリン酸イオンはないようで
ある。更に、この複合体中のリン酸の１つは、それが両
分子内で異なるトポロジーを有するループ内に位置する
ので、Onc内に対を有さない残基であるLys−66と塩橋を
形成している。これにより、キメラ内でのAsp及びGly変
異体間での酵素活性の差が基質についての結合アフィニ
ティーの変化に関連するか否かは未解決の問題のままで
ある。
差についての構造的基板は、特に残基26が活性部位から
離れているのでこれらのタンパク質のモデリングからは
明らかでない。ペンタヌクレオチドと複合化したRNase
Aの高い相同性の構造（Fontecilla−Camps J.C.,delore
ns R.,leDu M.H.,Cuchillo C.M.,（1994）,J.Biol Chem
269,21526−21531）をハイブリッドタンパク質モデル
の構造と重ね合わせた場合、そのヌクレオチドも変異の
領域から遠いことが観察された。しかしながら、異なる
RNaseにおけるポリヌクレオチド鎖の配列は必ずしも一
致しない。EDNの構造において、活性部位におけるもの
に加えて、２番目の硫酸イオンが見い出された（Mosima
nn S.C.,Newton D.L.,Youle R.J.James M.,X−ray crys
tallographic structure of recombinant eosinophil−
derived neurotoxin at 1.83Å resolution J.Mol.Bio
l）。この第２の硫酸は、開裂するヌクレオチドからの
リン酸を置換するが、RNase A−ペンタヌクレオチド複
合体内の同じ位置に位置するリン酸イオンはないようで
ある。更に、この複合体中のリン酸の１つは、それが両
分子内で異なるトポロジーを有するループ内に位置する
ので、Onc内に対を有さない残基であるLys−66と塩橋を
形成している。これにより、キメラ内でのAsp及びGly変
異体間での酵素活性の差が基質についての結合アフィニ
ティーの変化に関連するか否かは未解決の問題のままで
ある。
２つのEDN−Oncハイブリッドの活性の差についての構
造的基盤は明らかでないが、rEDN(1-21)rOncG26ハイブ
リッドのEDN様のふるまいは、Ｎ末端領域の形状に寄与
し得るようである。なぜなら、nOnc中のピログルタミン
酸及びEDN中のLys−１の両方は活性部位の領域に位置す
るからである。（Mosimann S.C.,Ardelt W.,James M.N.
G.,（1994）,Refined 1.7A Ｘ−ray crystallographic
structure of p−30 protein,an amphibian ribonucle
ase with anti−tumor activity J Mol Biol 236,1141
−1153;Mosimann S.C.,Newton D.L.,Youle R.J.,James
M.,X−ray crystallographic structure of recombinan
t eosinophil−derived neurotoxin at 1.83A resoluti
on J Mol Biol）。更に、〔Met−（−１）〕rOnc内のGl
y変異の導入は酵素活性に大きな影響を与えなかった。R
Nase AのB1サブ部位におけるＣより優るＵの選択性は、
特定の残基（Asp−83）の存在に関連している（DelCard
ayre S.B.Raines R.T.,（1995）。残基間の水素結合は
リボヌクレアーゼＡのヌクレオチド特異性を媒介する
（J.Mol.Biol 252,328−336）。nOnc中の対応する残基
もアスパラギン酸（Asp−67）であるが、EDNにおいては
この位置がヒスチジン（His−82）により占有されてい
る。EDNがポリ（A,C）に対してより活性であることは、
おそらくそれがnOnc及びRNase Aにおいてアスパラギン
酸であるのに対してヒスチジン残基を含むので、B1サブ
部位においてＣを“好む”ことを示唆する。まとめる
と、これは、rEDNに関するハイブリッドを含むGlyの活
性の減少を説明し得るであろう。なぜなら、この仮説に
従うと、rOnc配列により供されるAsp残基の存在はＣよ
りもＵの結合を好むであろうからである。PRI阻害の差
に関して、ハイブリッドタンパク質とRNase Aとの間の
重ね合わせは、EDN−Oncキメラ内のAsp−26が、PRIと接
触すると報告されているRNase A中のAsn−27と等しい位
置にあることを証明する（Kobe B.,Deisenhofer J.,（1
995）,Nature 374,183−186）。更に、両方のキメラに
おけるAsp−24はこの領域において極めて近接してい
る。これにより、この領域における負の電荷の蓄積はイ
ンヒビターによる結合を防ぎ得るであろう。もしそうな
ら、AspのGlyへの置換は、負の電荷を減少させ、結合能
力をもとにもどすであろう。
造的基盤は明らかでないが、rEDN(1-21)rOncG26ハイブ
リッドのEDN様のふるまいは、Ｎ末端領域の形状に寄与
し得るようである。なぜなら、nOnc中のピログルタミン
酸及びEDN中のLys−１の両方は活性部位の領域に位置す
るからである。（Mosimann S.C.,Ardelt W.,James M.N.
G.,（1994）,Refined 1.7A Ｘ−ray crystallographic
structure of p−30 protein,an amphibian ribonucle
ase with anti−tumor activity J Mol Biol 236,1141
−1153;Mosimann S.C.,Newton D.L.,Youle R.J.,James
M.,X−ray crystallographic structure of recombinan
t eosinophil−derived neurotoxin at 1.83A resoluti
on J Mol Biol）。更に、〔Met−（−１）〕rOnc内のGl
y変異の導入は酵素活性に大きな影響を与えなかった。R
Nase AのB1サブ部位におけるＣより優るＵの選択性は、
特定の残基（Asp−83）の存在に関連している（DelCard
ayre S.B.Raines R.T.,（1995）。残基間の水素結合は
リボヌクレアーゼＡのヌクレオチド特異性を媒介する
（J.Mol.Biol 252,328−336）。nOnc中の対応する残基
もアスパラギン酸（Asp−67）であるが、EDNにおいては
この位置がヒスチジン（His−82）により占有されてい
る。EDNがポリ（A,C）に対してより活性であることは、
おそらくそれがnOnc及びRNase Aにおいてアスパラギン
酸であるのに対してヒスチジン残基を含むので、B1サブ
部位においてＣを“好む”ことを示唆する。まとめる
と、これは、rEDNに関するハイブリッドを含むGlyの活
性の減少を説明し得るであろう。なぜなら、この仮説に
従うと、rOnc配列により供されるAsp残基の存在はＣよ
りもＵの結合を好むであろうからである。PRI阻害の差
に関して、ハイブリッドタンパク質とRNase Aとの間の
重ね合わせは、EDN−Oncキメラ内のAsp−26が、PRIと接
触すると報告されているRNase A中のAsn−27と等しい位
置にあることを証明する（Kobe B.,Deisenhofer J.,（1
995）,Nature 374,183−186）。更に、両方のキメラに
おけるAsp−24はこの領域において極めて近接してい
る。これにより、この領域における負の電荷の蓄積はイ
ンヒビターによる結合を防ぎ得るであろう。もしそうな
ら、AspのGlyへの置換は、負の電荷を減少させ、結合能
力をもとにもどすであろう。
実施例II
rOnc−抗体融合タンパク質
更なるrOnc−抗体及びリガンドタンパク質を作製し
た。それは高度に活性である。E6FB〔Met−（−１）〕S
errOncは、配列番号:40に示す核酸配列及び配列番号:41
に示すアミノ酸配列を有し、抗トランスフェリンレセプ
ター抗体である抗体E6からのFv配列を含むrOnc分子であ
る。配列番号:41のアミノ酸位置１−237におけるE6の配
列を参照のこと。“FB"とは、抗体及び分子のrOnc部分
を連結するのに用いられ、配列番号:40の核酸位置712〜
750で見い出されるリンカーをいう。この分子は、アミ
ノ酸位置252において、GluのかわりにSerを含む。E6FB
〔Met−（−１）〕GlurOncとは、配列番号:40の配列を
いう。同様のハイブリッド分子を作製した。Met−NLS
（シグナルペプチド）−Gln−rOnc FBE6についての核酸
及びＴミ酸配列を配列番号:42及び43に示す。他のE6/rO
nc分子位をMet−Ser−rOncA87 FBE6とデザインし、配列
番号:44及び45に見い出される。“A87"とは、Alaがアミ
ノ酸位置87にある事実をいう。
た。それは高度に活性である。E6FB〔Met−（−１）〕S
errOncは、配列番号:40に示す核酸配列及び配列番号:41
に示すアミノ酸配列を有し、抗トランスフェリンレセプ
ター抗体である抗体E6からのFv配列を含むrOnc分子であ
る。配列番号:41のアミノ酸位置１−237におけるE6の配
列を参照のこと。“FB"とは、抗体及び分子のrOnc部分
を連結するのに用いられ、配列番号:40の核酸位置712〜
750で見い出されるリンカーをいう。この分子は、アミ
ノ酸位置252において、GluのかわりにSerを含む。E6FB
〔Met−（−１）〕GlurOncとは、配列番号:40の配列を
いう。同様のハイブリッド分子を作製した。Met−NLS
（シグナルペプチド）−Gln−rOnc FBE6についての核酸
及びＴミ酸配列を配列番号:42及び43に示す。他のE6/rO
nc分子位をMet−Ser−rOncA87 FBE6とデザインし、配列
番号:44及び45に見い出される。“A87"とは、Alaがアミ
ノ酸位置87にある事実をいう。
Met−Ser−rOnc−Ang−FBE6は配列番号:46及び47に示
す。E6FB Met−Ser−rOncは配列番号:48及び49に示す。
す。E6FB Met−Ser−rOncは配列番号:48及び49に示す。
Met−Glu−rOnc FBE6は配列番号:50及び51に示す。
Met−Ser−rOnc FBE6は、アミノ酸位置２においてSer
がGluを置換することを除いて配列番号:50及び51に示
す。
がGluを置換することを除いて配列番号:50及び51に示
す。
MOC31及びMOC162は、Dr.Hennie Hoogenboomが得た17
−１−Ａ汎癌（pancarcinoma）抗原に対して生じた抗直
腸癌抗体をいう。これらの抗体のFv領域をrOncに融合し
た。MetSerrOncA87 FBMOC31についての核酸及びアミノ
酸配列を配列番号:52及び53に示す。MOC31FBMeTSerrOnc
についての核酸及びアミノ酸配列を配列番号:54及び55
に示す。MetSerrOncFBMOC161についての核酸及びアミノ
酸配列を配列番号:56及び57に示す。
−１−Ａ汎癌（pancarcinoma）抗原に対して生じた抗直
腸癌抗体をいう。これらの抗体のFv領域をrOncに融合し
た。MetSerrOncA87 FBMOC31についての核酸及びアミノ
酸配列を配列番号:52及び53に示す。MOC31FBMeTSerrOnc
についての核酸及びアミノ酸配列を配列番号:54及び55
に示す。MetSerrOncFBMOC161についての核酸及びアミノ
酸配列を配列番号:56及び57に示す。
リガンドIL2（インターロイキン２）を更にrOncに組
換えで融合させた。IL2FBMetSerrOnCについては配列番
号:58及び59を参照のこと。MetSerrOncFBIL2については
配列番号:60及び61を参照のこと。
換えで融合させた。IL2FBMetSerrOnCについては配列番
号:58及び59を参照のこと。MetSerrOncFBIL2については
配列番号:60及び61を参照のこと。
（トランスフェリンレセプターを有する）SF539細胞
におけるタンパク質合成の阻害を、〔Met−（−１）Se
r〕rOnc,E6FB〔Met−（−１）Ser〕rOnc,〔Met−（−
１）Ser〕rOnc−AngFBE6及び〔Met−（−１）Glu〕rOnc
FBE6構成物について、上述の通り測定し、nOncと比較
した。その結果を表３に示す。３つのE6構成物は、特
に、２つの非E6分子より45倍までの差の極めて高レベル
の活性を有した。図５も参照のこと。MetSerrOncAng分
子を、配列番号:47のアミノ酸１−107に対応させて作製
した。
におけるタンパク質合成の阻害を、〔Met−（−１）Se
r〕rOnc,E6FB〔Met−（−１）Ser〕rOnc,〔Met−（−
１）Ser〕rOnc−AngFBE6及び〔Met−（−１）Glu〕rOnc
FBE6構成物について、上述の通り測定し、nOncと比較
した。その結果を表３に示す。３つのE6構成物は、特
に、２つの非E6分子より45倍までの差の極めて高レベル
の活性を有した。図５も参照のこと。MetSerrOncAng分
子を、配列番号:47のアミノ酸１−107に対応させて作製
した。
配列表
（２）配列番号:1の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:104アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号:1:
（２）配列番号:2の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:83アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号:2:
（２）配列番号:3の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:28アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号:3:
（２）配列番号:4の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:34アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号:4:
（２）配列番号:5の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:28アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号:5:
（２）配列番号:6の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:34アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号:6:
（２）配列番号:7の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:34アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号:7:
（２）配列番号:8の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:111アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号:8:
（２）配列番号:9の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:134アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号:9:
（２）配列番号:10の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:133アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号:10:
（２）配列番号:11の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:125アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号:11:
（２）配列番号:12の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:124アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号:12:
（２）配列番号:13の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:124アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号:13:
（２）配列番号:14の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:4アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号:14:
（２）配列番号:15の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:4アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号:15:
（２）配列番号:16の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:4アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号:16:
（２）配列番号:17の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:4アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号:17:
（２）配列番号:18の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:4アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号:18:
（２）配列番号:19の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:321塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型:DNA
（xi）配列の記載：配列番号:19:
（２）配列番号:20の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:107アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号:20:
（２）配列番号:21の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:333塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型:DNA
（xi）配列の記載：配列番号:21:
（２）配列番号:22の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:111アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号:22:
（２）配列番号:23の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:315塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型:DNA
（xi）配列の記載：配列番号:23:
（２）配列番号:24の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:105アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号:24:
（２）配列番号:25の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:315塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型:DNA
（xi）配列の記載：配列番号:25:
（２）配列番号:26の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:105アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号:26:
（２）配列番号:27の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:318塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型:DNA
（xi）配列の記載：配列番号:27:
（２）配列番号:28の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:106アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号:28:
（２）配列番号:29の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:321塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型:DNA
（xi）配列の記載：配列番号:29:
（２）配列番号:30の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:107アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号:30:
（２）配列番号:31の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:336塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型:DNA
（xi）配列の記載：配列番号:31:
（２）配列番号:32の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:112アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号:32:
（２）配列番号:33の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:4アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号:33:
（２）配列番号:34の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:4アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号:34:
（２）配列番号:35の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:27塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型:DNA
（xi）配列の記載：配列番号:35:
（２）配列番号:36の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:27塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型:DNA
（xi）配列の記載：配列番号:36:
（２）配列番号:37の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:249塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型:DNA
（xi）配列の記載：配列番号:37:
（２）配列番号:38の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:315塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型:DNA
（xi）配列の記載：配列番号:38:
（２）配列番号:39の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:105アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：タンパク質
（xi）配列の記載：配列番号:39:
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
//(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/54
Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
(Ｃ１２Ｎ 5/10
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(72)発明者 ボクィー，リュイス
アメリカ合衆国，メリーランド 21702,
フレデリック，グリーンウェイ ドライ
ブ 187
(72)発明者 ウロダワー，アレクサンダー
アメリカ合衆国，メリーランド 21702,
フレデリック，ブットジャック ドライ
ブ 5512
(56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，1991
年，Ｖｏｌ．266，ｐ．245−251
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C12N 9/00 - 9/99
A61K 38/00 - 48/00
C12N 1/00 - 5/28
ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ
Ｓ（ＳＴＮ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (31)
- 【請求項１】（ａ）測定可能なリボヌクレアーゼ活性
と；（ｂ）メチオニンで始まり、次にグルタミン酸以外
のいずれかのアミノ酸が続くアミノ末端と；（ｃ）ウシ
RNaseA（配列番号:13）で特定されるアミノ酸位置を基
準にして決定した位置において、アミノ酸位置26,40,5
8,84,95及び110におけるシステイン；位置41におけるリ
シン；並びに位置119におけるヒスチジンと；（ｄ）nOn
c由来のアミノ酸配列と、を有するリボヌクレアーゼ分
子。 - 【請求項２】Met−Lys;Met−Tyr;Met−Ser;Met−Ala;Me
t−Arg;及びMet−Asnからなる群から選択されるアミノ
末端を有する請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 - 【請求項３】Met−Ala; Met−Ala−Ala; Met−Ala−Ala−Ser; Met−Arg; Met−（Ｊ）； Met−Lys−（Ｊ）； Met−Arg−（Ｊ）； Met−Lys; Met−Lys−Pro; Met−Lys−（Ｊ）−Pro（配列番号:14）； Met−Lys−Pro−（Ｊ）（配列番号:15）； Met−Asn; Met−Gln; Met−Asn−（Ｊ）； Met−Gln−（Ｊ）； Met−Asn−（Ｊ）−Pro（配列番号:16）； Met−（Ｊ）−Lys; Met−（Ｊ）−Lys−Pro（配列番号:17）；及び Met−（Ｊ）−Pro−Lys（配列番号:18）； （ここで、（Ｊ）はSer,Tyr又はThrである） からなる群から選択されるアミノ末端を有する請求項１
に記載のリボヌクレアーゼ。 - 【請求項４】Met−Alaのアミノ末端を有する請求項１に
記載のリボヌクレアーゼ。 - 【請求項５】Met−Argのアミノ末端を有する請求項１に
記載のリボヌクレアーゼ。 - 【請求項６】Met−Lysのアミノ末端を有する請求項１に
記載のリボヌクレアーゼ。 - 【請求項７】Met−Asnのアミノ末端を有する請求項１に
記載のリボヌクレアーゼ。 - 【請求項８】Met−Glnのアミノ末端を有する請求項１に
記載のリボヌクレアーゼ。 - 【請求項９】Met−Ser;Met−Tyr又はMet−Thrからなる
群から選択されるアミノ末端を有する請求項１に記載の
リボヌクレアーゼ。 - 【請求項１０】nOncのアミノ酸位置２（ウシRNaseの配
列を基準にして位置４）のアスパラギン酸が削除され、
又はAlaもしくはAsnにより置換されていることを特徴と
する請求項３に記載のリボヌクレアーゼ。 - 【請求項１１】rOncからの配列の前に、EDNのアミノ末
端由来の配列によりコードされるアミノ末端を有する分
子を含む請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 - 【請求項１２】前記アミノ酸配列が、式： Met（−１）EDN(1-m)Onc(n-104) （式中、Met（−１）はMetのアミノ末端残基であり;EDN
(1-m)は、EDN（配列番号:9）のアミノ酸位置１で始ま
り、それに続いて、EDNのアミノ酸位置“m"までを含む
長さのアミノ酸の隣接配列であり;Onc(n-104)は、配列
番号:1に示す配列の、アミノ酸位置“n"で始まり、それ
に続いて、アミノ酸位置104までを含む隣接アミノ酸の
配列であり、ここで、 ｍが21である場合、ｎは16又は17であり； ｍが22である場合、ｎは17であり； ｍが20である場合、ｎは16であり； ｍが19である場合、ｎは15であり； ｍが18である場合、ｎは14であり； ｍが17である場合、ｎは12又は13であり； ｍが16である場合、ｎは11,12,13又は14であり； ｍが15である場合、ｎは10であり； ｍが14である場合、ｎは９であり； ｍが13である場合、ｎは８であり；そして ｍが５である場合、ｎは１である） の配列と実質的に同一である配列からなる群から選択さ
れる配列であることを特徴とする請求項11に記載のリボ
ヌクレアーゼ。 - 【請求項１３】配列番号:28に記載の配列と実質的に同
一であるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のリボヌク
レアーゼ。 - 【請求項１４】配列番号:22に記載の配列と実質的に同
一であるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のリボヌク
レアーゼ。 - 【請求項１５】配列番号:24に記載の配列と実質的に同
一であるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のリボヌク
レアーゼ。 - 【請求項１６】配列番号:26に記載の配列と実質的に同
一であるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のリボヌク
レアーゼ。 - 【請求項１７】配列番号:30に記載の配列と実質的に同
一であるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のリボヌク
レアーゼ。 - 【請求項１８】配列番号:32に記載の配列と実質的に同
一であるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のリボヌク
レアーゼ。 - 【請求項１９】配列番号:2に記載の配列と実質的に同一
であるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のリボヌクレ
アーゼ。 - 【請求項２０】アンギオゲニン由来のカルボキシル末端
を含む請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 - 【請求項２１】配列番号:20に記載の配列と実質的に同
一であるアミノ酸配列を含む請求項20に記載のリボヌク
レアーゼ。 - 【請求項２２】リガンド結合成分又はラベルに連結した
請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。 - 【請求項２３】前記分子が抗体に連結している請求項22
に記載のリボヌクレアーゼ分子。 - 【請求項２４】請求項１に記載のアミノ酸配列をコード
する核酸配列。 - 【請求項２５】細胞毒性の量の請求項１に記載のリボヌ
クレアーゼと、医薬として許容される担体と、を含む医
薬組成物。 - 【請求項２６】前記リボヌクレアーゼが、リガンド結合
成分に連結している請求項25に記載の医薬組成物。 - 【請求項２７】殺すべき細胞を、リガンド結合成分に連
結した請求項１に記載のリボヌクレアーゼに接触させる
ことを含む細胞を選択的に殺す方法。 - 【請求項２８】核局在化シグナルを更に有する請求項１
に記載のリボヌクレアーゼ分子。 - 【請求項２９】内質保持配列を更に有する請求項１に記
載のリボヌクレアーゼ分子。 - 【請求項３０】請求項１に記載のリボヌクレアーゼをコ
ードする核酸を含むベクター。 - 【請求項３１】請求項１に記載のリボヌクレアーゼをコ
ードする核酸を含む宿主細胞。
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