DE69731463T2

DE69731463T2 - Rekombinante ribonuklease proteine

Info

Publication number: DE69731463T2
Application number: DE69731463T
Authority: DE
Inventors: M. Susanna RYBAK; L. Dianne NEWTON; Lluis Boque; Alexander Wlodawer
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1996-02-21
Filing date: 1997-02-19
Publication date: 2005-10-27
Anticipated expiration: 2017-02-20
Also published as: EP0896625A2; WO1997031116A2; JP3469247B2; ATE281528T1; NZ331298A; WO1997031116A3; CN1229498C; IL125771A0; EP0896625B1; IL125771A; CN1212016A; JP2000505300A; ES2232860T3; AU726379B2; AU2130697A; DE69731463D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Herstellung von Ribonukleasemolekülen, die für interessierende Zellen toxisch sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Ribonukleasen wie z. B. Ribonuklease A ("RNase A") und ihre Zytotoxizität gegen Tumorzellen sind aus Studien gut dokumentiert, die in den 60-er und 70-er Jahren durchgeführt wurden und in Roth, J., 1963, Cancer Res. 23: 657–666 überprüft sind. Von menschlichem Serum wurde auch entdeckt, daß es verschiedene RNasen enthält (Reddi, E., 1975, Biochem. Biophys. Res. Commun. 67: 110–118, Blank et al., Human body fluid ribonucleases: detection, interrelationships and significance 1-203-209 (IRL Press, London, 1981)), die in einer gewebespezifischen Weise exprimiert werden. Die an der Wirtsverteidigungsaktivität des Eosinophils beteiligten Proteine sind zu RNasen homolog und exprimieren RNase-Aktivität (Gleich et al., 1986 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83: 3146–3150; Slifman et al., 1986, J. Immunol., 137: 2913–2917). Somit wurde von RNasen von menschlichem Serum angenommen, daß sie auch Wirtsverteidigungsaktivitäten aufweisen.
Zu diesen frühen Studien gab es ferner die Entdeckung, daß ein Antitumorprotein von Eizellen von Rana pipiens Homologie zu RNase A aufweist (Ardelt et al., 1991, J. Biol. Chem. 256: 245–251). Dieses Protein wurde als ONCONASE^®, Alfacell Corporation, N.J., bezeichnet. Siehe auch z. B. Darzynkiewicz et al. (1988) Cell Tissue Kinet. 21, 169–182, Mikulski et al. (1990) Cell Tissue Kinet. 23, 237–246. Dieses Protein ist auch im US-Patent Nr. 4 888 172 beschrieben. Klinische Versuche der Phase I und Phase I/II von ONCONASE^® als einziges therapeutisches Mittel bei Patienten mit einer Vielzahl von festen Tumoren (Mikulski et al. (1993) Int. J. of Oncology 3, 57–64) oder in Kombination mit Tamoxifen bei Patienten mit fortgeschrittenem Bauchspeicheldrüsenkarzinom wurden in letzter Zeit vollendet (Chun et al. (1995) Proc. Amer. Soc. Clin. Oncol. 14 Nr. 157, 210). Die Konjugation von ONCONASE^® mit zellentypspezifischen Liganden erhöhte ihre Wirksamkeit gegen Tumorzellen (Rybak et al. (1993) Drug Delivery 1, 3–10). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, daß ONCONASE^® Eigenschaften aufweist, die für die Erzeugung eines leistungsfähigen selektiven Zellenabtötungsmittels vorteilhaft sind.
Da dies jedoch kein vom Menschen abgeleitetes Protein ist, ist es für die Stimulation von unerwünschten Immunreaktionen anfällig, wenn es bei Menschen verwendet wird. Somit wäre es erwünscht, die leistungsfähigen zytotoxischen Eigenschaften dieses Moleküls beizubehalten, während seine Immunogenität bei Menschen verringert wird. Ferner wäre es erwünscht, Derivate dieses Moleküls rekombinant zu erzeugen, so daß es besser mit anderen Molekülen zum Abzielen auf spezifische Zellen chemisch konjugiert oder rekombinant verbunden werden kann. Bis zur hierin beschriebenen Erfindung hat es sich als schwierig erwiesen, ein aktives zytotoxisches Molekül, das zu ONCONASE^® verwandt ist, rekombinant zu exprimieren. Obwohl angenommen wurde, daß das aminoendständige Ende von Methionin-Glutaminsäure des rekombinanten Moleküls verhinderte, daß das Molekül eine signifikante enzymatische Aktivität aufweist, stand ein Mittel zum Lösen dieses Problems bis zur Erfindung hierin nicht bevor.
Obwohl Fortschritte in Proteinkonstruktionsverfahren versprechen, einiges der Immunogenität, die mit dem Antikörperteil von Immunotoxinen verbunden ist, zu mildern (Bird et al., 1988, Science 242: 423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879; Ward et al., 1989, Nature 341: 544), stand ferner für die Immunogenität des anderen Toxinteils als Immunsuppression der Patienten keine Lösung bevor (Khazaeli et al., 1988, Proceedings of AACR 29: 418). Somit besteht ein fortbestehender Bedarf für Verfahren und Zusammensetzungen, die die Immunogenität des von Rana pipiens abgeleiteten toxische Anteils verringern würden.
Von nicht-zytotoxischen menschlichen Mitgliedern der RNase-A-Superfamilie, die mit zu einem Tumor gehörenden Antigenen durch ein chemisches (Rybak et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 1202–21207, Newton et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 19572–19578) oder ein rekombinantes Mittel (Rybak et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3165, Newton et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 26739–26745) verbunden sind, wurde gezeigt, daß sie eine Strategie zum selektiven Abtöten von Tumorzellen mit weniger Immunogenität bieten als derzeitige Strategien, die Pflanzen- und Bakterientoxine verwenden, Rybak, S. M. & Youle, R. J. (1991) Immunol. and Allergy Clinics of North America 11: 2, 359–380. Vom Menschen abgeleitete interessierende Ribonukleasen umfassen von Eosinophil abgeleitetes Neurotoxin (EDN) und Angiogenin.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Wir haben entdeckt, wie RNasen zu konstruieren sind, die stark zytotoxisch sind und die Modifikationen der natürlichen ONCONASE^® (nOnc) sind. Wenn die nOnc rekombinant exprimiert wurde, wurde nicht festgestellt, daß sie signifikante Zytotoxizität aufwies. Unsere modifizierten Versionen (rOnc) sind jedoch stark zytotoxisch und behalten ansonsten die Vorteile der natürlichen ONCONASE^®-Moleküle bei, während sie in einigen Fällen auch erhöhte zytotoxische Eigenschaften aufweisen. Die rOnc-Moleküle können allein verwendet werden oder zweckmäßigerweise verwendet werden, um chemische Konjugate zu bilden ebenso wie gezielte rekombinante Immunofusionen zu bilden. Diese rOnc-Moleküle können verwendet werden, um das Tumorzellenwachstum zu verringern. Eine wirksame rekombinante Form von nOnc ermöglicht vorteilhafterweise, daß das rekombinante Molekül mit anderen interessierenden therapeutischen oder abzielenden Molekülen rekombinant fusioniert wird. Ferner kann das rOnc-Molekül modifiziert werden, um die Zytotoxizität zu verstärken, wie nachstehend zu sehen ist. Unsere von nOnc abgeleiteten Moleküle sind auch wünschenswert, da nOnc insofern eine einzigartige Ribonuklease ist, als sie allein direkt an Patienten verabreicht werden kann, um das Tumorzellenwachstum ohne die Verwendung eines abzielenden Mittels zu verringern und zu hemmen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Verfahren zum selektiven Abtöten von Zellen unter Verwendung einer rOnc, die an einen Liganden gebunden ist, um ein selektives zytotoxisches Reagenz der vorliegenden Erfindung zu erzeugen. Das Verfahren umfaßt das Kontaktieren der abzutötenden Zellen mit einem zytotoxischen Reagenz der vorliegenden Erfindung mit einem Ligandenbindungsanteil, der das Reagenz spezifisch an die abzutötenden Zellen abgibt. Dieses Verfahren der vorliegenden Erfindung kann für die Zellentrennung in vitro durch selektives Abtöten ungewollter Arten von Zellen, beispielsweise im Knochenmark vor der Transplantation in einen Patienten, der einer Markabtragung durch Strahlung unterzogen wird, oder zum Abtöten von Leukämiezellen oder T-Zellen, die eine Transplantat-Gegen-Wirt-Krankheit verursachen würden, verwendet werden. Die Toxine können auch verwendet werden, um selektiv ungewollte Zellen in einer Kultur abzutöten.
Humanisierte Versionen unserer rOnc-Moleküle werden auch beschrieben, die Teile von von Säugern oder Menschen abgeleiteten RNasen wie z. B. Angiogenin oder von menschlichem Eosinophil abgeleitetes Neurotoxin (EDN) auf die von rOnc abgeleiteten Moleküle pfropfen. Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung ist ein Molekül, bei dem das aminoendständige Ende von EDN am aminoendständigen Ende der rOnc-Moleküle angeordnet wird. Die überraschenden Eigenschaften dieser Hybridproteine mit Bezug auf die Ribonukleaseaktivität und In-vitro-Antitumoreffekte werden beschrieben.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
FIGURENLEGENDEN
1 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz des Rana-Klons 9 (SEQ ID NR.: 2), die nachstehend beschrieben wird, und die Sequenzanordnung mit der Aminosäuresequenz von nOnc (SEQ ID NR.: 1). Der Fettdruck gibt identische Reste zwischen nOnc und dem Rana-Klon 9 an. Die Punkte geben fehlende Aminosäuren in dem PCR-Klon an.
Die 2A und 2B zeigen die Konfiguration der DNA-Gebilde, die in den Beispielen veranschaulicht sind. Das PCR-Produkt, das von DNA von Rana pipiens erhalten wird, ist als Rana 9 identifiziert. Die N- und C-Enden sind in den Gebilden, die [Met-(–1)]rOnc oder EDN codieren, für die N-endständige EDN/Onc-Hybride synthetisch eingefüllt und als Onc identifiziert. Entsprechende Aminosäurereste sind unter jedem Gebilde angegeben. 2B zeigt die Sequenzanordnung der N-endständigen Sequenzen von nOnc (SEQ ID NR.: 3), rEDN (SEQ ID NR.: 4), [Met-(–1)]rOnc, das in der Position 20 ein Gly (G) anstelle von Asp enthält (SEQ ID NR.: 5), rEDN_(1–21)rOnc mit einem Asp in der Aminosäureposition 26 (SEQ ID NR.: 6) und rEDN_(1–21)rOncG26 mit einem Gly in der Position 26 (SEQ ID NR.: 7). Fette Buchstaben geben bewahrte Reste an, Großbuchstaben zeigen die vom Rana-Klon 9 abgeleitete Sequenz.
Die 3A–3D zeigen die Hemmung der Proteinsynthese in menschlichen Tumorzellen durch nOnc, rEDN, [Met-(–1)]rOnc oder Hybridproteine. Zellen (10⁴) wurden in individuellen Mikrotiter-Kulturplatten mit 96 Vertiefungen ausgestrichen und mit veränderlichen Konzentrationen jedes Mittels für 48 h behandelt. Die Zellenlebensfähigkeit wurde wie im nachstehenden Beispielabschnitt beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse von mehr als einem individuellen Experiment wurden kombiniert, um die mittleren Datenpunkte zu ergeben. Standardfehler der Mittelwerte, wenn sie größer sind als das Symbol, sind gezeigt. Zellinien: ACHN, Nierenkrebs (3A); MDA-MB-231 (3B) und HS 578T (3D), Brustkrebs; SF-539 (3C), CNS, Krebs. EDN (leere Dreiecke); nOnc (leere Quadrate); [Met-(–1)]rOnc, (ausgefüllte Dreiecke); rEDN_(1–21)rOnc, (leere Kreise); rEDN_(1–21)rOncG26 (ausgefüllte Kreise).
4 zeigt eine Sequenzanordnung von einigen Mitgliedern der RNase-A-Superfamilie: Froschlectin stammt von Rana catesbeiana, ONCONASE^®, EDN, ECP (menschliches kationisches Eosinophilprotein), Ang ist Rinderangiogenin, Sperma ist Rindersperma-RNase und RNase A ist Rinderbauchspeicheldrüsen-RNase A (SEQ ID NRN. 8, 1 bzw. 9–13). In allen Mitgliedern bewahrte Aminosäuren sind in Großbuchstaben und Reste der aktiven Stellen H12, K41 und H119 (RNase-A-Numerierung) sind mit einem Stern markiert.
5 zeigt die Hemmung der Proteinsynthese durch MetSerOnc und MetSer- oder MetGlu-OncFvs. Die zytotoxische Wirkung der Ein-Ketten-Antikörper-rOnc-Fusionsproteine; E6FB[Met-(–1)]SerrOnc (ausgefüllte Kreise), [Met-(–1)]SerrOnc-AngFBE6 (leere Quadrate) und [Met-(–1)]GlurOncFBE6 (ausgefüllte Quadrate), wurden mit dem nicht-gezielten rekombinanten Protein, [Met-(–1)]SerrOnc (leere Kreise) durch Bestimmen der Hemmung der Proteinsynthese in SF 539 Zellen verglichen. Die Zellen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in Dulbecco's minimalem essentiellen Medium, das mit 10% wärmeinaktiviertem fötalen Rinderserum ergänzt war, ausgestrichen. In einem Gesamtvolumen von 10 μl wurden Zugaben durchgeführt und die Platten wurden bei 37°C für 3 Tage inkubiert. Phosphatgepufferte Salzlösung, die 0,1 mCi [¹⁴C]-Leucin enthielt, wurde für 2–4 h zugegeben und die Zellen wurden auf Glasfaserfiltern unter Verwendung eines PHD-Zellenernters geerntet, mit Wasser gewaschen, mit Ethanol getrocknet und gezählt. Die Ergebnisse wurden als Prozent des [¹⁴C]-Leucin-Einschlusses in den Mock-behandelten Vertiefungen ausgedrückt.
Die 6A und 6B zeigen die Hemmung der Proteinsynthese in einem Test, wie für die 3A–3D beschrieben, unter Verwendung der Zellinie SF539, von menschlichen Gliomzellen und von rOnc-Fusionsproteinen, die als MetLysTyrrOnc (leere Kreise, 6A); MetAlaAlaTyrOnc (ausgefüllte Kreise, 6A) bezeichnet sind; und rOnc-Fusionsproteinen mit Signalpeptiden, MetKDELSerrOnc (leere Kreise, 6B) und MetNLSSerrOnc (ausgefüllte Kreise, 6B).
7 zeigt die Hemmung der Proteinsynthese in einem Test, wie für die 3A–3D beschrieben, unter Verwendung der Zellinie SF539, von menschlichen Gliomzellen, und den Vergleich von drei Fusionsproteinen entsprechend MetSerOnc (SEQ ID NR.: 39 mit einem Met-Ser-aminoendständigen Ende): MetSerOnc (ausgefüllte Kreise), MetSerOncC4 (MetSerOnc mit einem Cys in der Aminosäureposition 5 von SEQ ID NR.: 39, ausgefüllte Quadrate) und MetSerOncC72 (MetSerOnc mit einem Cys in der Aminosäureposition 73 von SEQ ID NR.: 39, leere Kreise).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Diese Erfindung stellt sehr aktive und zytotoxische Ribonukleasemoleküle bereit, die verwendet werden können, um Zellen, insbesondere Tumorzellen, selektiv abzutöten und auf diese abzuzielen. In einigen Ausführungsbeispielen sind die Moleküle dazu ausgelegt, Sequenzen von vom Menschen abgeleiteten Ribonukleasen zu integrieren, die auch sehr aktiv und zytotoxisch sind, die jedoch den weiteren Vorteil haben, daß sie bei Menschen weniger immunogen sind. Die rOnc-Moleküle der vorliegenden Erfindung sind diejenigen, die rekombinante von nOnc abgeleitete Sequenzen sind.
Das nOnc-Molekül weist eine Aminosäuresequenz auf, die in SEQ ID NR.: 1 dargelegt ist. Rinderbauchspeicheldrüsen-RNase-A weist eine Aminosäuresequenz auf, die in SEQ ID NR.: 13 dargelegt ist. Wenn nicht anders angegeben, verwenden die hierin beschriebenen Aminosäuresequenzpositionen die Rinderbauchspeicheldrüsen-RNase-A-Sequenz SEQ ID NR.: 13 als Bezugsrahmen, da dies die Bezugssequenz ist, die üblicherweise auf dem RNase-Gebiet verwendet wird. Es sollte selbstverständlich sein, daß solche Positionsbezeichnungen nicht die Anzahl von Aminosäuren im beanspruchten Molekül an sich angeben, sondern angeben, wo im beanspruchten Molekül der Rest vorkommt, wenn die beanspruchte Molekülsequenz auf Rinder-RNase ausgerichtet wird.
Die hierin beschriebenen und beanspruchten rOnc-Moleküle weisen vorzugsweise Cysteinreste in den Aminosäurepositionen entsprechend den Aminosäurepositionen 26, 40, 58, 84, 95 und 110; ein Lysin in der Position 41 und ein Histidin in der Position 119 mit Bezug auf die Rinder-RNase-A, SEQ ID NR.: 13, auf (solche Positionen entsprechen den Aminosäurepositionen Nummern 19, 30, 48, 68, 75 und 90 bzw. 87 und 104 der nOnc-Sequenz, die in SEQ ID NR.: 1 dargelegt ist).
Die rOnc-Moleküle dieser Erfindung sind diejenigen, die eine meßbare Ribonukleaseaktivität aufweisen, wie nachstehend definiert. Die Ribonukleasen besitzen auch (a) ein aminoendständiges Ende, das mit einem Methionin beginnt, dem eine beliebige andere Aminosäure als Glutaminsäure (Glu) folgt; (b) ein Cystein in den Aminosäurepositionen 26, 40, 58, 84, 95 und 110; ein Lysin in der Position 41 und ein Histidin in der Position 119, wobei solche Positionen mit Bezug auf diejenigen in der Aminosäuresequenz von Rinder-RNase-A (SEQ ID NR.: 13) bestimmt werden, und (c) eine von nOnc abgeleitete Aminosäuresequenz.
Vorzugsweise weisen die rOnc-Moleküle ein aminoendständiges Ende auf, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgendem besteht:
Met-Ala;
Met-Ala-Ala-Ser;
Met-Arg;
Met-(J);
Met-Lys-(J);
Met-Arg-(J);
Met-Lys;
Met-Lys-Pro;
Met-Lys-(J)-Pro (SEQ ID NR.: 14);
Met-Lys-Pro-(J) (SEQ ID NR.: 15);
Met-Asn;
Met-Gln;
Met-Asn-(J);
Met-Gln-(J);
Met-Asn-(J)-Pro (SEQ ID NR.: 16);
Met-(J)-Lys;
Met-(J)-Lys-Pro (SEQ ID NR.: 17); und
Met-(J)-Pro-Lys (SEQ ID NR.: 18);
wobei (J) Ser, Tyr oder Thr ist.
Ferner ist es bevorzugt, daß die rOnc-Moleküle so modifiziert werden, daß die Asparaginsäure der Aminosäureposition 2 von nOnc (Position 4 mit Bezug auf die Sequenz von Rinder-RNase-A) deletiert oder durch Ala oder Asn ersetzt wird.
In alternativen Formen der rOnc-Moleküle verwenden die Moleküle ein aminoendständiges Ende, das durch eine Sequenz, die vom aminoendständigen Ende von EDN abgeleitet ist, gefolgt von einer Sequenz von nOnc, codiert wird. In solchen Formen ist es bevorzugt, daß die Aminosäuresequenz eine ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus denjenigen Sequenzen besteht, die zu jenen mit der folgenden Formel im Wesentlichen identisch sind: Met(–1)EDN_(1–m)Onc_(n–104) wobei sich Met(–1) auf einen aminoendständigen Rest von Met bezieht; wobei sich EDN_(1–m) auf eine zusammenhängende Sequenz von Aminosäuren mit einer Länge bezieht, die mit der Aminosäureposition 1 von EDN (SEQ ID NR.: 9) beginnt und sich zur Aminosäureposition "m" von EDN fortsetzt und diese einschließt; wobei sich Onc_(n–104) auf eine Sequenz von zusammenhängenden Aminosäuren bezieht, die mit der Aminosäureposition "n" beginnt und sich zur Aminosäureposition 104 fortsetzt und diese einschließt, wie in SEQ ID NR.: 1 dargelegt; so daß
wenn m 21 ist, n 16 oder 17 ist;
wenn m 22 ist, n 17 ist;
wenn m 20 ist, n 16 ist;
wenn m 19 ist, n 15 ist;
wenn m 18 ist, n 14 ist;
wenn m 17 ist, n 12 oder 13 ist;
wenn m 16 ist, n 11, 12, 13 oder 14 ist;
wenn m 15 ist, n 10 ist;
wenn m 14 ist, n 9 ist;
wenn m 13 ist, n 8 ist; und
wenn m 5 ist, n 1 ist.
In anderen alternativen Ausführungsbeispielen wird das rOnc-Molekül am Carboxylende mit einer Sequenz von Angiogenin, wie z. B. der Sequenz, die in SEQ ID NR.: 11 oder jener in den Aminosäurepositionen 101 bis 107 von SEQ ID NR.: 20 veranschaulicht ist, fusioniert. Die Nukleinsäuresequenz für menschliches Angiogenin ist bekannt und ist in der US-Patentanmeldung Nr. 08/125 462 dargelegt.
Bevorzugte rOnc-Nukleinsäuresequenzen sind diejenigen, die bevorzugte rOnc-Aminosäuresequenzen codieren, die im wesentlichen zu jenen in SEQ ID NRN.: 20, 22, 24, 26, 28 und 30 (entsprechende Nukleinsäuresequenzen sind in SEQ ID NRN.: 19, 21, 23, 25, 27 bzw. 29 dargelegt) identisch sind. Am meisten bevorzugte rOnc-Aminosäuresequenzen sind diejenigen, die zu denjenigen im wesentlichen identisch sind, die in SEQ ID NRN.: 20, 22, 24 und 26 dargelegt sind. Ihre entsprechenden Nukleinsäuresequenzen sind auch bevorzugt und sind in SEQ ID NRN.: 19, 21, 23 und 25 dargelegt, einschließlich konservativ modifizierter Varianten derselben. Die am meisten bevorzugte Sequenz umfaßt SEQ ID NR.: 22, eine, die ein aminoendständiges Ende verwendet und 1 bis 21 (typischerweise 21) Aminosäuren des aminoendständigen Endes von EDN umfaßt, das auf 16 bis 104 Aminosäuren der nOnc-Sequenz gepfropft ist, wobei der Aminosäurerest 20 in nOnc (Asp) durch Gly ersetzt ist. Bevorzugte rOnc-Sequenzen enthalten ferner wahlweise ein Cys in einer Position entsprechend der Aminosäureposition 5 oder 73 oder Ala in der Aminosäureposition 88 anstelle von Cys mit Bezug auf SEQ ID NR.: 39.
Vergleiche der rOnc-Sequenzen, die hier bereitgestellt werden, können an beschriebenen Sequenzen in der Bauchspeicheldrüsen-RNase-A-Superfamilie vorgenommen werden. Viele von solchen Mitgliedern sind bekannt und umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf Froschlectin von Rana catesbeiana (Titani et al., Biochemistry 26: 2189 (1987)); ONCONASE^® (Ardelt, W. et al., J. Biol. Chem. 266: 245 (1991)); von Eosinophil abgeleitetes Neurotoxin (EDN) (Rosenberg et al., oben); menschliches kationisches Eosinophilprotein (ECP) (Rosenberg et al., J. Exp. Med. 170: 163 (1989)); Angiogenin (Ang) (Fett, J. W. et al., Biochemistry 24: 5480 (1985)); Rindersperma-RNase (Preuss et al., Nuc. Acids. Res. 18: 1057 (1990)); und Rinderbauchspeicheldrüsen-RNase (Beintama et al., Prog. Biophys. Mol. Biol. 51: 165 (1988)). Die Aminosäuresequenzanordnung für solche RNasen ist auch in 4 und in Youle et al., Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Systems 10: 1–28 (1993) und in der US-Patentanmeldung Seriennr. 08/125 462, dargelegt.
Definitionen
Wenn hierin nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie üblicherweise von einem üblichen Fachmann, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden. Singleton et al. (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology zweite Ausgabe, John Wiley and Sons (New York), und Hale und Marham (1991) The Harper Collins Dictionary of Biology Harper Perennial, NY, versehen einen Fachmann mit einem allgemeinen Wörterbuch mit vielen der in dieser Erfindung verwendeten Begriffe. Obwohl beliebige Verfahren und Materialien, die zu den hierin beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind, bei der Ausführung oder beim Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe nachstehend definiert.
Aminosäuren können hierin entweder mit ihren allgemein bekannten Symbolen aus drei Buchstaben oder mit den Symbolen mit einem Buchstaben, die von der IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission empfohlen werden, bezeichnet werden. Nukleotide können ebenso mit ihren allgemein anerkannten Codes mit einem Buchstaben bezeichnet werden.
Die Begriffe "meßbare Ribonukleaseaktivität" oder "signifikante Ribonukleaseaktivität" beziehen sich auf ein Molekül, das einen IC₅₀ (ng/ml) von weniger als 40 aufweist, wenn es zu einem Kaninchen-Retikulozytenlysat-Test zugegeben wird, wobei die Proteinsynthese gehemmt wird, wie durch die Integration von [³⁵S]Methionin in säureausfällbares Protein gemessen. IC₅₀ ist die Konzentration an Protein, die zum Hemmen der Proteinsynthese um 50% im Test erforderlich ist. Der Lysattest kann durchgeführt werden, wie im Promega-Lysattestsatz beschrieben, der von der Promega Corporation, Madison, WI, kommerziell erhältlich ist. Die Ribonukleaseaktivität unter Verwendung von RNA und tRNA mit hohem Molekulargewicht wird bei 37°C durch die Bildung von in Perchlorsäure löslichen Nukleotiden gemäß veröffentlichten Protokollen (Newton, D. L. et al. (1996) Biochemistry 35: 545–553) bestimmt. Mit Poly (A, C) UpG und Poly U wird die Ribonukleaseaktivität gemäß DePrisco et al. und Libonati und Floridi (DePrisco, R., et al. (1984) Biochimica et Biophysica Acta 788: 356–363; Libonati, M. et al. (1969) European J. Biochem. 8: 81–87) getestet. Die Aktivität wird durch Messen der Steigerung des Absorptionsvermögens bei 260 nm mit der Zeit getestet. Inkubationsgemische (1 ml von 10 mM Imidazol, 0,1 M NaCl, pH 6,5 oder pH 7) enthalten ein Substrat und geeignete Mengen an Enzymlösung bei 25°C. Der In-vitro-Translationstest (St. Clair, D. K., et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 8330–8334) und die Zellenlebensfähigkeitstests unter Verwendung des (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid; Thiazolylblau) (MMT) (Mossman, T. (1983) J. Immunol. Methods 65: 55–63) werden durchgeführt, wie vorher beschrieben (Pearson, J. W., et al. (1991) J. Natl. Cancer Inst. 83: 1386–1391).
Eine "von nOnc abgeleitete" Aminosäuresequenz ist eine, die mindestens eine Kette von sechs zusammenhängenden Aminosäuren enthält, die zu einer zusammenhängenden Sequenz von sechs Aminosäuren identisch ist, die aus der Gruppe von Sequenzen ausgewählt ist, die in den Aminosäurepositionen 1 (wobei Glu pyroGlu ersetzt), 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50, 52, 54, 56, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 76, 80, 81, 82, 84, 85, 86, 87, 91, 92, 93, 95 oder 96 der nOnc-Aminosäuresequenz (SEQ ID NR.: 1) beginnen.
"Konservativ modifizierte Variationen" einer speziellen Nukleinsäuresequenz beziehen sich auf diejenigen Nukleinsäuren, die identische oder im wesentlichen identische Aminosäuresequenzen codieren, oder bei denen die Nukleinsäure keine Aminosäuresequenz zu im wesentlichen identischen Sequenzen codiert. Aufgrund der Entartung des genetischen Codes codieren eine große Anzahl von funktional identischen Nukleinsäuren irgendein gegebenes Polypeptid. Die Codone GCA, GCC, GCG und GCU codieren beispielsweise alle die Aminosäure Alanin. Somit kann in jeder Position, in der ein Alanin durch ein Codon festgelegt ist, das Codon zu irgendeinem der entsprechenden beschriebenen Codone geändert werden, ohne das codierte Polypeptid zu verändern. Solche Nukleinsäurevariationen sind "stille Variationen", die eine Spezies von konservativ modifizierten Variationen sind. Jede Nukleinsäuresequenz hierin, die ein Polypeptid codiert, beschreibt auch jede mögliche stille Variation der Nukleinsäure. Ein Fachmann wird erkennen, daß jedes Codon in einer Nukleinsäure (außer AUG, das gewöhnlich das einzige Codon für Methionin ist) modifiziert werden kann, um ein funktional identisches Molekül zu ergeben. Folglich ist jede stille Variation einer Nukleinsäure, die ein Polypeptid codiert, in jeder beschriebenen Sequenz impliziert. Ferner wird ein Fachmann erkennen, daß einzelne Substitutionen, Deletionen oder Additionen, die eine einzelne Aminosäure oder einen kleinen Prozentsatz von Aminosäuren in einer codierten Sequenz ändern, hinzufügen oder deletieren, "konservativ modifizierte Variationen" sind, wobei die Veränderungen zur Substitution einer Aminosäure mit einer chemisch ähnlichen Aminosäure führen. Tabellen für konservative Substitutionen, die funktional ähnliche Aminosäuren bereitstellen, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Die folgenden sechs Gruppen enthalten jeweils Aminosäuren, die konservative Substitutionen gegeneinander sind:

1) Alanin (A), Serin (S), Threonin (T);
2) Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E);
3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
4) Arginin (R), Lysin (K);
5) Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V); und
6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W).

Siehe auch Creighton (1984) Proteins W. H. Freeman and Company.
Die Begriffe "isoliert" oder "biologisch rein" beziehen sich auf ein Material, das von Komponenten, die es normalerweise begleiten, wie in seiner natürlich vorkommenden Umgebung gefunden, im wesentlichen frei ist. Das isolierte Material umfaßt wahlweise ein Material, das nicht bei dem Material in seiner natürlichen Umgebung zu finden ist. Die hierin beschriebenen rOncs sind isoliert und biologisch rein, da sie bei Abwesenheit von nicht verwandten Proteinen von Rana pipiens rekombinant hergestellt werden. Sie können jedoch heterologe Zellenkomponenten, einen Ligandenbindungsanteil, einen Marker und dergleichen umfassen.
Der Begriff "Nukleinsäure" bezieht sich auf ein Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotid-Polymer in entweder ein- oder doppelsträngiger Form und umfaßt, wenn nicht ansonsten eingegrenzt, bekannte Analoge von natürlichen Nukleotiden, die mit Nukleinsäuren in einer Weise ähnlich zu natürlich vorkommenden Nukleotiden hybridisieren. Wenn nicht anders angegeben, umfaßt eine spezielle Nukleinsäuresequenz deren komplementäre Sequenz. Eine Nukleinsäure codiert eine andere Nukleinsäure, wenn sie dieselbe ist wie die festgelegte Nukleinsäure oder zur festgelegten Nukleinsäure komplementär ist.
Ein "Expressionsvektor" umfaßt eine rekombinante Expressionskassette, die eine Nukleinsäure umfaßt, die ein rOnc-Polypeptid codiert, das durch eine Zelle transkribiert und translatiert werden kann. Eine rekombinante Expressionskassette ist ein Nukleinsäuregebilde, das rekombinant oder synthetisch erzeugt wird, mit einer Reihe von festgelegten Nukleinsäureelementen, die die Transkription einer speziellen Nukleinsäure in einer Zielzelle ermöglichen. Der Expressionsvektor kann ein Teil eines Plasmids, eines Virus oder eines Nukleinsäurefragments sein. Typischerweise umfaßt der Teil der rekombinanten Expressionskassette des Expressionsvektors eine zu transkribierende Nukleinsäure und einen Promotor.
Der Begriff "rekombinant", wenn mit Bezug auf ein Protein verwendet, gibt an, daß ein Zelle ein Peptid oder Protein exprimiert, das durch eine Nukleinsäure codiert wird, deren Ursprung für die Zelle exogen ist. Rekombinante Zellen können Gene exprimieren, die innerhalb der natürlichen (nicht-rekombinanten) Form der Zelle nicht zu finden sind. Rekombinante Zellen können auch Gene exprimieren, die in der natürlichen Form der Zelle zu finden sind, wobei die Gene durch ein künstliches Mittel, beispielsweise unter der Steuerung eines heterologen Promotors, wieder in die Zeile eingeführt werden.
Der Begriff "Teilsequenz" im Zusammenhang mit einer speziellen Nukleinsäure oder einer speziellen Polypeptidsequenz bezieht sich auf einen Bereich der Nukleinsäure oder des Polypeptids, der gleich der speziellen Nukleinsäure oder dem speziellen Polypeptid oder kleiner als dieses) ist.
"Stringente Hybridisierungswaschbedingungen" im Zusammenhang mit Nukleinsäure-Hybridisierungsexperimenten, wie z. B. Southern- und Northern-Hybridisierungen sind sequenzabhängig und sind unter verschiedenen Umgebungsparametern unterschiedlich. Eine ausgedehnte Führung zur Hybridisierung von Nukleinsäuren ist in Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes Teil I, Kapitel 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York, zu finden. Im allgemeinen werden sehr stringente Waschbedingungen so ausgewählt, daß sie etwa 5°C niedriger sind als der thermische Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert. Die T_m ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert), bei der 50% der Zielsequenz mit einer vollkommen abgeglichenen Sonde hybridisiert. Sehr stringente Bedingungen werden so ausgewählt, daß sie gleich dem T_m-Punkt für eine spezielle Sonde sind. Nukleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen nicht miteinander hybridisieren, sind immer noch im wesentlichen identisch, wenn die Polypeptide, die sie codieren, im wesentlichen identisch sind. Dies geschieht z. B., wenn eine Kopie einer Nukleinsäure unter Verwendung der durch den genetischen Code zugelassenen maximalen Codondegeneration erzeugt wird.
Der Begriff "identisch" im Zusammenhang mit zwei Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen bezieht sich auf die Reste in den zwei Sequenzen, die gleich sind, wenn sie für maximale Übereinstimmung über ein festgelegtes Vergleichsfenster ausgerichtet sind. Wenn der Prozentsatz der Sequenzidentität in Bezug auf Proteine oder Peptide verwendet wird, wird erkannt, daß die Restpositionen, die nicht identisch sind, sich häufig durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden, wobei Aminosäurereste gegen andere Aminosäurereste mit ähnlichen chemischen Eigenschaften (z. B. Ladung oder Hydrophobizität) substituiert sind und daher die funktionalen Eigenschaften des Moleküls nicht ändern. Wenn sich Sequenzen in konservativen Substitutionen unterscheiden, kann der Prozentsatz an Sequenzidentität nach oben eingestellt werden, um die konservative Art der Substitution zu korrigieren. Mittel zum Durchführen dieser Einstellung sind Fachleuten gut bekannt. Typischerweise beinhaltet dies das Bewerten einer konservativen Substitution vielmehr als teilweise als als vollständige Fehlübereinstimmung, wodurch der Prozentsatz an Sequenzidentität erhöht wird. Wenn einer identischen Aminosäure beispielsweise eine Bewertung von 1 gegeben wird und einer nicht-konservativen Substitution eine Bewertung von Null gegeben wird, wird einer konservativen Substitution somit eine Bewertung zwischen Null und 1 gegeben. Die Bewertung von konservativen Substitutionen wird z. B. gemäß dem Algorithmus von Meyers und Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4: 11–17 (1988), berechnet, z. B. wie im Programm PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Kalifornien, USA) implementiert.
Verfahren zur Anordnung von Sequenzen zum Vergleich sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Eine optimale Anordnung von Sequenzen zum Vergleich kann durch den Algorithmus der lokalen Homologie von Smith und Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482; durch den Homologieanordnungsalgorithmus von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443; durch das Verfahren der Suche nach Ähnlichkeit von Pearson und Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444; durch computerisierte Implementierungen dieser Algorithmen (einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf CLUSTAL im PC/Gene-Programm von Intelligenetics, Mountain View, Kalifornien, GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Softwarepaket, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, USA), durchgeführt werden; das CLUSTAL-Programm ist von Higgins und Sharp (1988) Gene, 73: 237–244, und Higgins und Sharp (1989) Computer Applications in the Biosciences 5: 151–153; Corpet, et al. (1988) Nucleic Acids Research 16, 10881–90; Huang, et al. (1992) Computer Applications in the Biosciences 8, 155–65, und Pearson, et al. (1994) Methods in Molecular Biology 24, 307–31, gut beschrieben. Die Anordnung wird auch häufig durch Untersuchung und manuelle Anordnung durchgeführt.
Der Begriff "wesentliche Identität" oder "wesentliche Ähnlichkeit" im Zusammenhang mit einem Polypeptid gibt an, daß ein Polypeptid eine Sequenz mit mindestens 70% Sequenzidentität zu einer Bezugssequenz oder vorzugsweise 80% oder bevorzugter 85% Sequenzidentität zur Bezugssequenz oder am meisten bevorzugt 90% Identität über ein Vergleichsfenster von etwa 10–20 Aminosäureresten umfaßt. Eine Angabe, daß zwei Polypeptidsequenzen im wesentlichen identisch sind, ist, daß ein Peptid mit Antikörpern, die gegen das zweite Peptid erhöht sind, immunologisch reaktiv ist. Somit ist ein Polypeptid beispielsweise im wesentlichen identisch zu einem zweiten Polypeptid, wenn sich die zwei Peptide nur durch eine konservative Substitution unterscheiden.
Eine Angabe, daß zwei Nukleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist, daß das Polypeptid, das die erste Nukleinsäure codiert, mit dem Polypeptid, das durch die zweite Nukleinsäure codiert wird, immunologisch kreuzreaktiv ist.
Eine weitere Angabe, daß zwei Nukleinsäuresequenzen im wesentlichen identisch sind, ist, daß die zwei Moleküle unter stringenten Bedingungen miteinander hybridisieren. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und sind unter verschiedenen Umgebungsparametern unterschiedlich. Im allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, daß sie etwa 5°C bis 20°C niedriger sind als der thermische Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert. Die T_m ist die Temperatur (unter einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert), bei der 50% der Zielsequenz mit einer vollständig abgeglichenen Sonde hybridisiert. Nukleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen nicht miteinander hybridisieren, sind jedoch immer noch im wesentlichen identisch, wenn die Polypeptide, die sie codieren, im wesentlichen identisch sind. Dies geschieht z. B., wenn eine Kopie einer Nukleinsäure unter Verwendung der durch den genetischen Code zugelassenen maximalen Codondegeneration erzeugt wird.
Der Begriff "spezifisch abgeben", wie hierin verwendet, bezieht sich auf den bevorzugten Zusammenhang eines Moleküls mit einer Zelle oder Gewebe, die/das ein spezielles Zielmolekül oder einen Marker trägt, und nicht mit Zellen oder Gewebe, denen dieses Zielmolekül fehlt. Es wird natürlich erkannt, daß ein bestimmter Grad an nicht-spezifischer Wechselwirkung zwischen einem Molekül und einer Nicht-Ziel-Zelle oder Nicht-Ziel-Gewebe auftreten kann. Trotzdem kann eine spezifische Abgabe unterschieden werden, wie durch die spezifische Erkennung des Zielmoleküls vermittelt. Typischerweise führt die spezifische Abgabe zu einem viel stärkeren Zusammenhang zwischen dem abgegebenen Molekül und Zellen, die das Zielmolekül tragen, als zwischen dem abgegebenen Molekül und Zellen, denen das Zielmolekül fehlt. Die spezifische Abgabe führt typischerweise zu einer größeren als 2-fachen, vorzugsweise größeren als 5-fachen, bevorzugter größeren als 10-fachen und am meisten bevorzugt größeren als 100-fachen Erhöhung der Menge des abgegebenen Moleküls (pro Einheitszeit) an eine Zelle oder Gewebe, die/das das Zielmolekül trägt, im Vergleich zu einer Zelle oder Gewebe, der/dem das Zielmolekül oder der Marker fehlt.
Der Begriff "Rest", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Aminosäure, die in ein Polypeptid integriert ist. Die Aminosäure kann eine natürlich vorkommende Aminosäure sein und kann, wenn nicht ansonsten eingegrenzt, bekannte Analoge von natürlichen Aminosäuren umfassen, die in einer ähnlichen Weise wie natürlich vorkommende Aminosäuren funktionieren können.
Ein "Fusionsprotein", oder wenn ein Molekül an ein anderes "gebunden" ist, bezieht sich auf ein chimäres Molekül, das durch die Verbindung von zwei oder mehr Polypeptiden durch eine Peptidbindung gebildet wird, welche zwischen dem Aminoende eines Polypeptids und dem Carboxylende eines anderen Polypeptids gebildet wird. Das Fusionsprotein oder die verbundenen Moleküle können durch die chemische Kopplung der Bestandteilsmoleküle gebildet werden oder es kann als einzelnes Polypeptid von einer Nukleinsäuresequenz, die ein einzelnes zusammenhängendes Fusionsprotein codiert, exprimiert werden. Ein Ein-Ketten- Fusionsprotein ist ein Fusionsprotein mit einem einzelnen zusammenhängenden Polypeptidgerüst.
Ein "Ligand" oder ein "Ligandenbindungsanteil", wie hierin verwendet, bezieht sich im allgemeinen auf alle Moleküle, die in der Lage sind, ein Molekül, das mit einem Rezeptor an einer Zielzelle reagiert oder diesen anderweitig erkennt oder an diesen bindet, spezifisch abzugeben. Insbesondere umfassen Beispiele von Liganden, sind jedoch nicht begrenzt auf Antikörper, Lymphokine, Cytokine, Rezeptorproteine wie z. B. CD4 und CD8, solubilisierte Rezeptorproteine wie z. B. lösliches CD4, Hormone, Wachstumsfaktoren und dergleichen, die gewünschte Zielzellen spezifisch binden.
Herstellung von von rOnc abgeleiteten Nukleinsäuren und Polypeptiden
Verschiedene spezifische Nukleinsäuren, die von rOnc abgeleitete Polypeptide codieren, werden hierin beschrieben. Diese Nukleinsäuren können unter Verwendung von rekombinanten oder synthetischen Standardverfahren hergestellt werden. Wenn die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung gegeben sind, kann ein Fachmann eine Vielfalt von Klonen konstruieren, die funktional äquivalente Nukleinsäuren enthalten, wie z. B. Nukleinsäuren, die dasselbe Polypeptid codieren. Klonierungsmethodologien zum Bewerkstelligen dieser Zwecke und Sequenzanalyseverfahren zum Überprüfen der Sequenz von Nukleinsäuren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Beispiele von geeigneten Klon- und Sequenzanalyseverfahren und Anweisungen, die ausreichen, um Fachleute durch viele Klonierungsprüfungen zu leiten, sind in Berger und Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology Band 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning – A Laboratory Manual (2. Ausgabe) Band 1–3; und Current Protocols in Molecular Biology F. M. Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols, ein Gemeinschaftsunternehmen zwischen Greene Publishing Associates, Inc., und John Wiley & Sons, Inc., (1994 Ergänzung) (Ausubel), zu finden. Produktinformationen von Herstellern von biologischen Reagenzien und einer Versuchsausrüstung sehen auch eine Information vor, die bei bekannten biologischen Verfahren nützlich ist. Solche Hersteller umfassen SIGMA chemical company (Saint Louis, MO), R&D Systems (Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem. Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersberg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz), Invitrogen, San Diego, CA, und Applied Biosystems (Foster City, CA) sowie viele andere kommerzielle Quellen, die einem Fachmann bekannt sind.
Die Nukleinsäurezusammensetzungen dieser Erfindung, ob RNA, cDNA, genomische DNA oder eine Hybride der verschiedenen Kombinationen, werden von biologischen Quellen isoliert oder in vitro synthetisiert. Die Nukleinsäuren der Erfindung liegen in transformierten oder transfizierten Zellen, in transformierten oder transfizierten Zellysaten oder in einer teilweise gereinigten oder im wesentlichen reinen Form vor.
In-vitro-Amplifikationsverfahren, die zum Amplifizieren von Sequenzen zur Verwendung als Molekularsonden oder zum Erzeugen von Nukleinsäurefragmenten zum anschließenden Subklonieren geeignet sind, sind bekannt. Beispiele von Verfahren, die ausreichen, um Fachleute durch solche In-vitro-Amplifikationsverfahren zu leiten, einschließlich der Polymerasekettenreaktion (PCR), der Ligasekettenreaktion (LCR), der Qβ-Replikaseamplifikation und anderer durch RNA-Polymerase vermittelter Verfahren (z. B. NASBA), sind in Berger, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning – A Laboratory Manual (2. Ausg.) Band 1–3; und Ausubel, sowie Mullis et al., (1987) US-Patent Nr. 4 683 202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. Hrsg.) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (1. Oktober 1990) C&EN 36–47; The Journal Of NIH Research (1991) 3, 81–94; (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem. 35, 1826; Landegren et al. (1988) Science 241, 1077–1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8, 291–294; Wu und Wallace (1989) Gene 4, 560; Barringer et al. (1990) Gene 89, 117, und Sooknanan und Malek (1995) Biotechnology 13: 563– 564, zu finden. Verbesserte Verfahren zum Klonen von in vitro amplifizierten Nukleinsäuren sind in Wallace et al., US-Pat. Nr. 5 426 039 beschrieben.
Oligonukleotide zur Verwendung als Sonden, z. B. in In-vitro-rOnc-Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren oder zur Verwendung als Nukleinsäuresonden, um rOnc-Nukleinsäuren nachzuweisen, werden typischerweise gemäß dem Festphasen-Phosphoramidittriester-Verfahren chemisch synthetisiert, welches von Beaucage und Caruthers (1981), Tetrahedron Letts., 22(20): 1859–1862, beschrieben ist, z. B. unter Verwendung eines automatisierten Synthesizers, z. B. wie in Needham-VanDevanter et al. (1984) Nucleic Acids Res., 12: 6159–6168, beschrieben. Oligonukleotide können auch spezifisch hergestellt und aus einer Vielzahl von kommerziellen Quellen, die Fachleuten bekannt sind, bestellt werden. Die Reinigung von Oligonukleotiden, wenn sie erforderlich ist, wird typischerweise entweder durch native Acrylamidgel-Elektrophorese oder durch Anionenaustausch-HPLC durchgeführt, wie in Pearson und Regnier (1983) J. Chrom. 255: 137–149, beschrieben. Die Sequenz der synthetischen Oligonukleotide kann unter Verwendung des chemischen Abbauverfahrens von Maxam und Gilbert (1980) in Grossman und Moldave (Hrsg.) Academic Press, New York, Methods in Enzymology 65: 499–560 s, überprüft werden.
Ein Fachmann wird viele Weisen zum Erzeugen von gewünschten Änderungen in einer gegebenen Nukleinsäuresequenz erkennen. Solche gut bekannten Verfahren umfassen ortsgerichtete Mutagenese, PCR-Amplifikation unter Verwendung von degenerierten Oligonukleotiden, das Aussetzen von Zellen, die die Nukleinsäure enthalten, Mutagenmitteln oder Strahlung, chemische Synthese eines gewünschten Oligonukleotids (z. B. in Verbindung mit Ligation und/oder Klonieren, um große Nukleinsäuren zu erzeugen) und andere gut bekannte Verfahren. Siehe Giliman und Smith (1979) Gene 8: 81–97; Roberts et al. (1987) Nature 328: 731–734, und Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning – A Laboratory Manual (2. Ausg.) Band 1–3; Innis, Ausbel, Berger, Needham VanDevanter und Mullis (alle oben).
Polypeptide der Erfindung können in einer breiten Vielfalt von gut bekannten Weisen synthetisch hergestellt werden. Polypeptide mit relativ kurzer Größe werden typischerweise in Lösung oder auf einem festen Träger gemäß herkömmlichen Verfahren synthetisiert. Siehe z. B. Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149–2154. Verschiedene automatische Synthesizer und Sequenatoren sind kommerziell erhältlich und können gemäß bekannten Protokollen verwendet werden. Siehe z. B. Stewart und Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Ausg., Pierce Chemical Co. Polypeptide werden auch durch rekombinante Expression einer Nukleinsäure, die das Polypeptid codiert, gefolgt von Reinigung unter Verwendung von Standardverfahren, hergestellt.
Herstellung von konservativen Modifikationen der Nukleinsäuren und Polypeptide der Erfindung
Ein Fachmann wird erkennen, daß viele konservativen Veränderungen der offenbarten Sequenzen eine im wesentlichen identische rOnc ergeben. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes sind beispielsweise "stille Substitutionen" (d. h. Substitutionen einer Nukleinsäuresequenz, die nicht zur Veränderung eines codierten Polypeptids führen) ein impliziertes Merkmal jeder Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäure codiert. Ebenso werden konservative Aminosäuresubstitutionen in einer oder einigen Aminosäuren in einer Aminosäuresequenz mit verschiedenen Aminosäuren mit stark ähnlichen Eigenschaften substituiert (siehe Definitionsabschnitt oben), werden auch leicht als sehr ähnlich zu einer offenbarten Aminosäuresequenz oder zu einer offenbarten Nukleinsäuresequenz, die eine Aminosäure codiert, identifiziert. Solche konservativ substituierten (oder modifizierten) Variationen von jeder explizit offenbarten Sequenz sind ein Mermal der vorliegenden Erfindung.
Ein Fachmann wird viele Weisen zum Erzeugen von Veränderungen in einer gegebenen Nukleinsäuresequenz erkennen. Solche gut bekannten Verfahren umfassen ortsgerichtete Mutagenese, PCR-Amplifikation unter Verwendung von degenerierten Oligonukleotiden, Aussetzen von Zellen, die die Nukleinsäure enthalten, Mutagenmitteln oder Strahlung, chemische Synthese eines gewünschten Oligonukleotids (z. B. in Verbindung mit Ligation und/oder Klonen, um große Nukleinsäuren zu erzeugen) und andere gut bekannte Verfahren. Siehe Giliman und Smith (1979) Gene 8: 81–97, Roberts et al. (1987) Nature 328: 731–734, und Sambrook, Innis, Ausbel, Berger, Needham VanDevanter und Mullis (alle oben).
Am üblichsten werden Polypeptidsequenzen durch Ändern der entsprechenden Nukleinsäuresequenz und Exprimieren des Polypeptids geändert. Polypeptidsequenzen werden jedoch auch wahlweise synthetisch unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Peptidsynthesizern erzeugt, um ein beliebiges gewünschtes Polypeptid zu erzeugen (siehe Merrifield und Stewart und Young, oben).
Ein Fachmann kann eine gewünschte Nukleinsäure oder ein gewünschtes Polypeptid der Erfindung auf der Basis der bereitgestellten Sequenzen und des Wissens auf dem Fachgebiet bezüglich Ribonukleasen im allgemeinen auswählen. Die physikalischen Eigenschaften und allgemeinen Merkmale von RNasen sind geschulten Ausführenden bekannt. Die spezifischen Wirkungen von einigen Mutationen in RNasen sind bekannt. Überdies ermöglicht die allgemeine Kenntnis hinsichtlich der Art von Proteinen und Nukleinsäuren einem Fachmann, geeignete Sequenzen mit einer Aktivität ähnlich oder äquivalent zu den Nukleinsäuren und Polypeptiden, die in den Sequenzauflistungen hierin offenbart sind, auszuwählen. Der Definitionsabschnitt hierin beschreibt beispielhafte konservative Aminosäuresubstitutionen.
Schließlich werden die meisten Modifikationen an Nukleinsäuren und Polypeptiden durch Routinescreeningverfahren in geeigneten Tests auf die gewünschte Eigenschaft ausgewertet. Änderungen des immunologischen Charakters eines Polypeptids können beispielsweise durch einen geeigneten immunologischen Test nachgewiesen werden. Modifikationen anderer Eigenschaften wie z. B. Nukleinsäurehybridisierung mit einer Zielnukleinsäure, Redox- oder thermische Stabilität eines Proteins, thermische Hysterese, Hydrophobizität, Anfälligkeit für Proteolyse oder die Tendenz zu aggregieren, werden alle gemäß Standardverfahren getestet.
rOnc-Fusionsproteine und andere therapeutische Anteile
Die rOnc-Moleküle können auch pharmakologische Mittel oder Einkapselungssysteme umfassen, die verschiedene pharmakologische Mittel enthalten. Sie umfassen typischerweise einen Liganden, der als abzielendes Molekül wirkt, um die rOnc auf gewünschte Zellen zu richten. Die rOnc kann direkt an einen Liganden oder ein Antisense-Molekül gebunden werden, welches bei der Abgabe der rOnc unterstützt. Siehe beispielsweise SEQ ID NRN.: 40–61. Die rOnc kann auch so konstruiert werden, daß sie ein Kernlokalisierungssignal ("NLS") enthält, wie z. B. jenes, das in den Aminosäurepositionen 1 bis 7 in SEQ ID NR.: 32 (und SEQ ID NR.: 31) beschrieben ist, um die rOnc innerhalb der Zelle zu richten. Alternativ wurden das Met in der Position 8 und die entsprechenden Nukleinsäuren in den Positionen 22–24 von SEQ ID NR.: 31 weggelassen und können weggelassen werden. Die Nukleinsäuresequenz für das NLS sind die Nukleinsäuren 1–21 von SEQ ID NR.: 31. Ein Signalpeptid wird auch in den Aminosäurepositionen 1–25 von SEQ ID NR.: 63 veranschaulicht.
Die rOnc-Moleküle sind einzigartig für Gentherapieanwendungen ausgelegt. Sie können mit anderen therapeutischen Mitteln fusioniert werden, beispielsweise könnten sie mit einem Anti-B-Zellen-Lymphoma-Antikörper fusioniert werden. Wie nachstehend genauer erläutert wird, waren beispielsweise rOnc-Moleküle, die rekombinant mit einem Anti-Transferrinrezeptor-Antikörper oder einem Anti-Dickdarmkrebs-Antikörper fusioniert wurden, aktiv. Wie vorstehend erwähnt, weist nOnc Antitumorwirkungen in vivo auf und tötet sich schnell teilende Zellen, die durch Serum oder Wachstumsförderungsmittel wie z. B. Ras stimuliert werden, bevorzugt ab. Die Moleküle werden leicht in der Zelle verinnerlicht. Ihre Aktivität kann ferner durch Verbinden von ihnen mit einem Kernlokalisierungssignal und dergleichen erleichtert werden, um die Moleküle innerhalb der Zelle umzulenken. Von spezieller Verwendung in Tumorzellen wäre es, Telomerase, ein Enzym, das dem Abbau durch RNase unterliegt, abzuzielen.
Wir haben festgestellt, daß Onc mit Ras in Mikroinjektionsstudien synergiert. Dies bedeutet, daß Onc und Ras in der Zelle zusammen vorhanden sein müssen. Onc synergiert nicht mit Ras, wenn es in die Zelle über seinen eigenen Weg eintritt. Ein CAAX-(SEQ ID NR.: 33)Motiv ist erforderlich, um Ras an der Plasmamembran zu lokalisieren (C = Cys, A = eine aliphatische Aminosäure, X = S, M, C, A oder Q, ein Beispiel ist Cys-Val-Ile-Met (SEQ ID NR.: 34)). Bedeutenderweise wurde von dieser Art Sequenz gezeigt, daß sie heterologe Proteine auf die Plasmamembran abzielt (Hancock, J., Cadwallader, K., Paterson, H. und C. Marshall (1991) EMBO J. 10: 4033). Es wäre erwünscht, das rOnc-Gen mit DNA zu verbinden, die ein CAAX-(SEQ ID NR.: 33)Signal, wie im Beispiel gegeben, oder KDEL, wie nachstehend beschrieben, codiert.
Telomerase wird als "universelles Krebsziel" untersucht (G. B. Morin, JNCI. (1995) 87: 859). Es ist ein RNA-Protein, das sich im Kern befindet. Es wurde gezeigt, daß Antisense zu Telomerase-RNA die Funktion des Enzyms hemmen und das Wachstum von Krebszellen blockieren kann (J. Feng et al., Science (1995) 269: 1236). RNase kann auch die Aktivität des Enzyms zerstören. Man kann auch die Aktivität des Enzyms zerstören, wenn es mit einem Zellenextrakt inkubiert wird, der Telomerase enthält. Ein NLS/Onc-Molekül (wie z. B. jenes, das in SEQ ID NR.: 32 dargelegt ist) kann veranlaßt werden, Onc zum Kern zu leiten, so daß es die Telomerase abbauen kann. Von dem NLS, das wir verwendet haben, wurde gezeigt, daß es Proteine für das Ziel der Störung der Funktion eines Kernantigens zum Kern umlenkt (S. Biocca, M. S. Neuberger und A. Cattaneo, (1990) 9: 101). Unser NLS/Onc-Molekül ist beim Abtöten von Zellen wirksam.
Eine aminoendständige Sequenz zum rekombinanten Molekül kann bevorzugt sein, wenn es erwünscht ist, das Molekül in das Cytosol von Zielzellen zu verlagern. Ein solches Signalpeptid wird typischerweise am Aminoende des Proteins eingefügt. Die ersten Aminosäuren der hierin beschriebenen rekombinanten Moleküle (nach Met) könnten beispielsweise KDEL (SEQ ID NR.: 64) sein und würden das Signalisieren des Moleküls zum endoplasmatischen Retikulum durchführen. Aminosäuresequenzen, die KDEL, Wiederholungen von KDEL oder andere Sequenzen umfassen, die funktionieren, um Proteine im endoplasmatischen Retikulum zu halten oder in dieses zurückzuführen, die hier als "endoplasmatische Retentionssequenzen" bezeichnet werden, können verwendet werden.
Wahlweise kann das an einen Liganden gebundene rOnc-Molekül ein Einkapselungssystem umfassen, wie z. B. ein Liposom oder eine Mizelle, das/die eine zusätzliche therapeutische Zusammensetzung enthält, wie z. B. ein Arzneimittel, eine Nukleinsäure (z. B. eine Antisense-Nukleinsäure), oder einen anderen therapeutischen Anteil, der vorzugsweise vom direkten Aussetzen dem Kreislaufsystem abgeschirmt ist. Mittel zur Herstellung von Liposomen, die an Antikörper gebunden sind, sind Fachleuten gut bekannt. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4 957 735, Connor et al., Pharm. Ther., 28: 341–365 (1985).
Ein Fachmann wird erkennen, daß das Ligandenmolekül oder eine andere therapeutische Komponente und das rOnc-Molekül in einer beliebigen Reihenfolge miteinander verbunden werden können. Wenn der Ligand ein Polypeptid ist, kann das rOnc-Molekül somit entweder mit dem Amino- oder dem Carboxyende des Liganden verbunden werden oder kann auch mit einem internen Bereich eines Moleküls verbunden werden, solange die Bindung die jeweiligen Aktivitäten der Moleküle nicht stört.
Die Moleküle können durch ein beliebiges einer Anzahl von Mitteln, die Fachleuten gut bekannt sind, gebunden werden. Typischerweise wird die rOnc entweder direkt oder durch ein Verbindungsstück (Zwischenstück) mit dem Liganden konjugiert. Wenn jedoch sowohl die rOnc als auch der Ligand oder ein anderes Therapeutikum Polypeptide sind, ist es bevorzugt, das chimäre Molekül als Ein-Ketten-Fusionsprotein rekombinant zu exprimieren.
In einem Ausführungsbeispiel wird das rOnc-Molekül chemisch mit einem anderen Molekül (z. B. einem Cytotoxin, einem Marker, einem Liganden oder einem Arzneimittel oder Liposom) konjugiert. Mittel zum chemischen Konjugieren von Molekülen sind Fachleuten gut bekannt.
Das Verfahren zum Binden eines Mittels an einen Antikörper oder ein anderes auf ein Polypeptid abzielendes Molekül variiert gemäß der chemischen Struktur des Mittels. Polypeptide enthalten typischerweise eine Vielzahl von funktionalen Gruppen, z. B. Carbonsäure-(COOH) oder freie Amin-(-NH₂)Gruppen, die zur Reaktion mit einer geeigneten funktionalen Gruppe an einem rOnc-Molekül zur Verfügung stehen, um das andere Molekül daran zu binden.
Alternativ kann der Ligand und/oder das rOnc-Molekül derivatisiert werden, um zusätzliche reaktive funktionale Gruppen freizulegen oder zu binden. Die Derivatisierung kann das Binden eines beliebigen einer Anzahl von Verbindungsmolekülen wie z. B. jenen, die von Pierce Chemical Company, Rockford Illinois, erhältlich sind, beinhalten.
Ein "Verbindungsstück", wie hierin verwendet, ist ein Molekül, das verwendet wird, um zwei Moleküle zu verbinden. Das Verbindungsstück ist in der Lage, kovalente Bindungen mit beiden Molekülen zu bilden. Geeignete Verbindungsstücke sind Fachleuten gut bekannt und umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf gerad- oder verzweigtkettige Kohlenstoffverbindungsstücke, heterocyclische Kohlenstoffverbindungsstücke oder Peptidverbindungsstücke. Wenn beide Moleküle Polypeptide sind, können die Verbindungsstücke mit den Bestandteilsaminosäuren über ihre Seitengruppen (z. B. über eine Disulfidbindung mit Cystein) verbunden werden. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel werden die Verbindungsstücke jedoch mit den Alpha-Kohlenstoffamino- und -carboxylgruppen der endständigen Aminosäuren verbunden.
Ein bifunktionales Verbindungsstück mit einer funktionalen Gruppe, die mit einer Gruppe an einem speziellen Mittel reaktiv ist, und einer anderen Gruppe, die mit einem Antikörper reaktiv ist, kann verwendet werden, um ein gewünschtes Immunkonjugat zu bilden. Alternativ kann die Derivatisierung die chemische Behandlung des Liganden, z. B. Glycolspaltung des Zuckeranteils eines Glycoprotein-Antikörpers mit Perjodat, um freie Aldehydgruppen zu erzeugen, beinhalten. Die freien Aldehydgruppen am Antikörper können mit freien Amin- oder Hydrazingruppen an einem Mittel zur Reaktion gebracht werden, um das Mittel daran zu binden. (Siehe US-Patent Nr. 4 671 958). Verfahren zum Erzeugen von freien Sulfhydrylgruppen an Polypeptiden, wie z. B. Antikörpern oder Antikörperfragmenten, sind auch bekannt (Siehe US-Pat. Nr. 4 659 839).
Viele Verfahren und Verbindungsmoleküle zum Binden verschiedener Verbindungen, einschließlich Radionuklid-Metall-Chelaten, Toxinen und Arzneimitteln, an Proteine, wie z. B. Antikörper, sind bekannt. Siehe beispielsweise die europäische Patentanmeldung Nr. 188 256; US-Patent Nrn. 4 671 958, 4 659 839, 4 414 148, 4 699 784; 4 680 338; 4 569 789; und 4 589 071; und Borlinghaus et al. Cancer Res. 47: 4071–4075 (1987). Insbesondere ist die Herstellung von verschiedenen Immunotoxinen innerhalb des Fachgebiets gut bekannt und ist beispielsweise in "Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet", Thorpe et al., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, S. 168–190 (1982), Waldmann, Science, 252: 1657 (1991), US-Patent Nrn. 4 545 985 und 4 894 443, zu finden.
Unter einigen Umständen ist es erwünscht, die rOnc vom Liganden zu befreien, wenn das chimäre Molekül seine Zielstelle erreicht hat. Daher können chimäre Konjugate mit Verbindungen, die in der Nähe der Zielstelle spaltbar sind, verwendet werden, wenn der Effektor an der Zielstelle freigesetzt werden soll. Das Spalten der Verbindung, um das Mittel vom Liganden freizusetzen, kann durch enzymatische Aktivität oder Bedingungen, denen das Immunkonjugat entweder innerhalb der Zielzelle oder in der Nähe der Zielzelle ausgesetzt wird, ausgelöst werden. Wenn die Zielstelle ein Tumor ist, kann ein Verbindungsstück, das unter Bedingungen, die an der Tumorstelle vorliegen (z. B. wenn es mit einem Tumor verbundenen Enzymen oder einem sauren pH-Wert ausgesetzt wird), spaltbar ist, verwendet werden.
Eine Anzahl von verschiedenen spaltbaren Verbindungsstücken sind Fachleuten bekannt. Siehe US-Pat. Nrn. 4 618 492; 4 542 225 und 4 625 014. Die Mechanismen zum Freisetzen eines Mittels von diesen Verbindungsgruppen umfassen beispielsweise Bestrahlung einer photolabilen Bindung und säurekatalysierte Hydrolyse. Das US-Pat. Nr. 4 671 958 umfaßt beispielsweise eine Beschreibung von Immunkonjugaten mit Verbindungsstücken, die an der Zielstelle in vivo durch die proteolytischen Enzyme des Komplementsystems des Patienten gespalten werden. Angesichts der großen Anzahl von Verfahren, die zum Binden einer Vielfalt von radiodiagnostischen Verbindungen, radiotherapeutischen Verbindungen, Arzneimitteln, Toxinen und anderen Mitteln an Antikörper berichtet wurden, kann ein Fachmann ein geeignetes Verfahren zum Binden eines gegebenen Mittels an einen Antikörper oder ein anderes Polypeptid bestimmen.
Herstellung von rOnc-Molekülen oder Fusionsproteinen
Wenn die interessierenden Moleküle relativ kurz sind (d. h. weniger als etwa 50 Aminosäuren), können sie unter Verwendung von chemischen Standard-Peptidsyntheseverfahren synthetisiert werden. Wenn zwei interessierende Moleküle relativ kurz sind, kann das chimäre Molekül als einzelnes zusammenhängendes Polypeptid synthetisiert werden. Alternativ können die Moleküle separat synthetisiert und dann durch Kondensation des Aminoendes von einem Molekül mit dem Carboxylende des anderen Moleküls fusioniert werden, wodurch eine Peptidbindung gebildet wird. Alternativ können die Moleküle jeweils mit einem Ende eines Peptidabstandsmoleküls kondensiert werden, wodurch ein zusammenhängendes Fusionsprotein gebildet wird.
Die Festphasensynthese, bei der die C-endständige Aminosäure der Sequenz an einen unlöslichen Träger gebunden wird, gefolgt von sequentieller Addition der restlichen Aminosäuren in der Sequenz, ist das bevorzugte Verfahren für die chemische Synthese der Polypeptide dieser Erfindung. Verfahren zur Festphasensynthese sind von Barany und Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; S. 3–284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Band 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Teil A., Merrifield, et al., J. Am. Chem. Soc., 85: 2149–2156 (1963), und Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Ausg., Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984), beschrieben.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel werden die chimären Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von rekombinanter DNA-Methodologie synthetisiert. Dies beinhaltet im allgemeinen das Erzeugen einer DNA-Sequenz, die das Fusionsprotein codiert, das Anordnen der DNA in einer Expressionskassette unter der Steuerung eines speziellen Promotors, Exprimieren des Proteins in einem Wirt, Isolieren des exprimierten Proteins und, falls erforderlich, Renaturieren des Proteins.
DNA, die die Fusionsproteine dieser Erfindung sowie die rOnc-Moleküle selbst codiert, kann durch ein beliebiges geeignetes Verfahren hergestellt werden, einschließlich beispielsweise Klonen und Restriktion von geeigneten Sequenzen oder direkte chemische Synthese durch Verfahren wie z. B. das Phosphotriesterverfahren von Narang et al. Meth. Enzymol. 68: 90–99 (1979); das Phosphodiesterverfahren von Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109–151 (1979); das Diethylphosphoramidit-Verfahren von Beaucage et al., Tetra. Lett., 22: 1859–1862 (1981); und das Verfahren mit festem Träger von US-Patent Nr. 4 458 066.
Die chemische Synthese erzeugt ein einsträngiges Oligonukleotid. Dieses kann durch Hybridisierung mit einer komplementären Sequenz oder durch Polymerisation mit einer DNA-Polymerase unter Verwendung des einzelnen Strangs als Schablone in doppelsträngige DNA umgewandelt werden. Ein Fachmann würde erkennen, daß, obwohl die chemische Synthese von DNA auf Sequenzen von etwa 100 Basen begrenzt ist, längere Sequenzen durch die Ligation von kürzeren Sequenzen erhalten werden können.
Alternativ können Teilsequenzen kloniert und die geeigneten Teilsequenzen unter Verwendung von geeigneten Restriktionsenzymen gespalten werden. Die Fragmente können dann ligiert werden, um die gewünschte DNA-Sequenz zu erzeugen.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel kann DNA, die Fusionsproteine oder rOnc-Moleküle der vorliegenden Erfindung codiert, unter Verwendung von DNA-Amplifikationsverfahren wie z. B. Polymerasekettenreaktion (PCR) kloniert werden.
Wenn zwei Moleküle miteinander verbunden sind, wird ein Fachmann erkennen, daß die Moleküle durch ein Peptidzwischenstück, das aus einer oder mehreren Aminosäuren besteht, getrennt sein können. Im allgemeinen weist das Zwischenstück keine andere spezifische biologische Aktivität auf, als die Proteine zu verbinden oder einen gewissen minimalen Abstand oder eine andere räumliche Beziehung zwischen ihnen zu bewahren. Die Bestandteilsaminosäuren des Zwischenstücks können jedoch ausgewählt werden, um eine gewisse Eigenschaft des Moleküls zu beeinflussen, wie z. B. die Faltung, Nettoladung oder Hydrophobizität.
Die Nukleinsäuresequenzen, die die rOnc-Moleküle oder die Fusionsproteine codieren, können in einer Vielfalt von Wirtszellen, einschließlich E. coli, anderen bakteriellen Wirten, Hefe und verschiedenen höheren eukaryotischen Zellen, wie z. B. den COS-, CHO- und HeLa-Zellinien und Myelomzellinien, exprimiert werden. Das rekombinante Proteingen wird wirksam mit geeigneten Expressionsleitsequenzen für jeden Wirt verbunden. Für E. coli umfaßt dies einen Promotor wie z. B. die T7-, trp- oder Lambda-Promotoren, eine Ribosombindungsstelle und vorzugsweise ein Transkriptionsbeendungssignal. Für eukaryotische Zellen umfassen die Leitsequenzen einen Promotor und vorzugsweise einen Verstärker, der von Immunoglobulingenen, SV40, Zytomegalovirus usw. abgeleitet wird, und eine Polyadenylierungssequenz und kann Spleißdonor- und -akzeptorsequenzen umfassen.
Die Expressionsvektoren oder Plasmide der Erfindung können in die gewählte Wirtszelle durch gut bekannte Verfahren, wie z. B. Kalziumchlorid-Transformation für E. coli und Kalziumphosphat-Behandlung oder Elektroporation für Säugerzellen, überführt werden. Durch die Plasmide transformierte Zellen können durch Resistenz gegen Antibiotika ausgewählt werden, die durch Gene verliehen wird, die an den Plasmiden enthalten sind, wie z. B. die amp-, gpt-, neo- und hyg-Gene.
Einmal exprimiert, können die rekombinanten rOnc- oder Fusionsproteine gemäß Standardverfahren des Fachgebiets gereinigt werden, einschließlich Ammoniumsulfatausfällung, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und dergleichen (siehe im allgemeinen R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Band 182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. N.Y. (1990)). Im wesentlichen reine Zusammensetzungen mit mindestens etwa 90 bis 95% Homogenität sind bevorzugt und mit 98 bis 99% oder mehr Homogenität für pharmazeutische Verwendungen sind am meisten bevorzugt. Sobald sie teilweise oder bis zur Homogenität, wie gewünscht, gereinigt sind, können die Polypeptide dann therapeutisch verwendet werden.
Folglich stellt diese Erfindung auch Wirtszellen und Expressionsvektoren mit den vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen bereit.
Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum selektiven Abtöten von Zellen unter Verwendung einer an einen Liganden gebundenen rOnc, um ein selektives zytotoxisches Reagenz der vorliegenden Erfindung zu erzeugen. Das Verfahren umfaßt das Kontaktieren der abzutötenden Zellen mit einem zytotoxischen Reagenz der vorliegenden Erfindung mit einem Ligandenbindungsanteil, der das Reagenz spezifisch an die abzutötenden Zellen abgibt. Dieses Verfahren der vorliegenden Erfindung kann zur Zellentrennung in vitro durch selektives Abtöten von ungewollten Arten von Zellen verwendet werden, beispielsweise im Knochenmark vor der Transplantation in einen Patienten, der einer Markabtragung durch Strahlung unterzogen wird, zum Abtöten von Leukämiezellen oder T-Zellen, die eine Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit verursachen würden.
Für Verfahren zur Verwendung in vivo ist das Säugerprotein des Reagenz, das bei diesem Verfahren verwendet wird, vorzugsweise für die Spezies, in denen das Reagenz zur Verwendung vorgesehen ist, endogen.
Zur Verwendung bei Menschen ist das zytotoxische Reagenz vorzugsweise ein Fusionsprotein mit einem humanisierten chimären Antikörper und einer humanisierten rOnc. Spezifische in-vivo-Verfahren dieser Erfindung umfassen ein Verfahren für die chemotherapeutische Linderung von Krebs in Säugern, umfassend das Verabreichen einer zytotoxischen Menge eines erfindungsgemäßen selektiven zytotoxischen Reagenz. Die Verfahren sind zur Behandlung von Tumoren, die gegen die zytotoxischen Reagenzien empfindlich sind, besonders nützlich. Tumore von speziellem Interesse umfassen Bauchspeicheldrüsen-, Dickdarm-, Brust- und Nierentumore.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die rOnc-Moleküle und die diese verwendenden Fusionsproteine dieser Erfindung sind zur parenteralen, örtlichen, oralen oder lokalen Verabreichung wie z. B. durch Aerosol oder transdermal zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung nützlich. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einer Vielzahl von Einheitsdosierungsformen in Abhängigkeit von dem Verabreichungsverfahren verabreicht werden. Einheitsdosierungsformen, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, umfassen beispielsweise Pulver, Tabletten, Pillen, Kapseln und Pastillen. Es wird erkannt, daß die betreffenden Moleküle und Fusionsproteine und pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung, wenn sie oral verabreicht werden, vor der Verdauung geschützt werden müssen. Dies wird typischerweise entweder durch Komplexieren des Proteins mit einer Zusammensetzung, um es gegen saure und enzymatische Hydrolyse beständig zu machen, oder durch Verpacken des Proteins in einem geeignet beständigen Träger wie z. B. einem Liposom durchgeführt. Mittel zum Schützen von Proteinen vor der Verdauung sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung sind zur parenteralen Verabreichung, wie z. B. intravenösen Verabreichung oder Verabreichung in eine Körperhöhle oder einen Hohlraum eines Organs, besonders nützlich. Die Zusammensetzungen zur Verabreichung umfassen üblicherweise eine Lösung des chimären Moleküls, das in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, vorzugsweise einem wässerigen Träger, gelöst ist. Eine Vielzahl von wässerigen Trägern können verwendet werden, z. B. gepufferte Salzlösung und dergleichen. Diese Lösungen sind steril und im allgemeinen frei von unerwünschtem Stoff. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche, gut bekannte Sterilisationsverfahren sterilisiert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch verträgliche Hilfssubstanzen, wie erforderlich, um physiologische Zustände anzunähern, wie z. B. pH-Einstell- und Puffermittel, Toxizitätseinstellmittel und dergleichen, beispielsweise Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kalziumchlorid, Natriumlactat und dergleichen, enthalten. Die Konzentration des therapeutischen Moleküls in diesen Formulierungen kann umfangreich variieren und wird hauptsächlich auf der Basis von Fluidvolumina, Viskositäten, des Körpergewichts und dergleichen gemäß der speziellen ausgewählten Verabreichungsart und den Bedürfnissen des Patienten ausgewählt.
Somit wäre eine typische pharmazeutische Zusammensetzung zur intravenösen Verabreichung etwa 0,1 bis 10 mg pro Patient pro Tag. Dosierungen von 0,1 bis zu etwa 100 mg pro Patient pro Tag können verwendet werden, insbesondere wenn das Arzneimittel an einen verschlossenen Ort und nicht in den Blutstrom verabreicht wird, wie z. B. in eine Körperhöhle oder in einen Hohlraum eines Organs. Aktuelle Verfahren zur Herstellung von parenteral verabreichbaren Zusammensetzungen sind Fachleuten bekannt oder für diese ersichtlich und sind in solchen Veröffentlichungen wie Remington's Pharmaceutical Science, 15. Ausg., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), genauer beschrieben.
Die Zusammensetzungen, die die vorliegenden rOnc-Moleküle oder die Fusionsproteine oder einen Cocktail davon (d. h. mit anderen Proteinen) enthalten, können für therapeutische Behandlungen verabreicht werden. In therapeutischen Anwendungen werden Zusammensetzungen an einen Patienten, der unter einer Krankheit leidet, in einer zytotoxischen Menge, einer Menge, die ausreicht, um interessierende Zellen abzutöten, verabreicht. Eine angemessene Menge, um dies zu bewerkstelligen, ist als "therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Mengen, die für diese Verwendung wirksam sind, hängen von der Schwere der Krankheit und vom allgemeinen Zustand der Gesundheit des Patienten ab.
Einzelne oder mehrere Verabreichungen der Zusammensetzungen können in Abhängigkeit von der Dosierung und Häufigkeit, wie für den Patienten erforderlich und von diesem toleriert, verabreicht werden. In jedem Fall sollte die Zusammensetzung eine ausreichende Menge der Proteine dieser Erfindung bereitstellen, um den Patienten wirksam zu behandeln.
Alle Patente, Anmeldungen und Veröffentlichungen, die hierin zitiert sind, werden durch den Hinweis hierin aufgenommen. Die folgenden Beispiele sind nur für Erläuterungszwecke vorgesehen und sollen in keiner Weise als Begrenzung der Erfindung aufgefaßt werden.
BEISPIELE
Beispiel I. Klonieren und Expression von rOnc und Onc-Konjugaten mit EDN
A. Materialien. Natürliche ONCONASE^® ("nOnc") (SEQ ID NR.: 1) Ardelt et al. (1991) J. Biol. Chem. 256, 245–251, und rekombinantes menschliches EDN ("rEDN") (SEQ ID NR.: 9) Newton et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 26739–26745, wurden aus Eizellen von Rana pipiens, NASCO, Fort Atkinson, WI, bzw. Escherichia coli, wie beschrieben, gereinigt. Antikörper für die denaturierten Proteine wurden von Assay Research, Inc., College Park, MD, hergestellt. Reagenzien zum Durchführen von PCR und direktem Klonieren von PCR-Produkten erhielten wir von Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT, bzw. von Invitrogen, San Diego, CA. Substrate für die Ribonukleasetests wurden von Sigma, St. Louis, MO, und Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, erworben. Die Materialien und ihre Quellen, die bei der Konstruktion und Expression der rekombinanten Proteine verwendet wurden, sowie das Kaninchen-Reticulozytenlysat sind von Newton et al. Biochemistry 35: 545 (1996), beschrieben.
B. PCR-Klonieren von Onconase. Genomische DNA von Rana pipiens wurde gemäß Standardverfahren unter Verwendung von Proteinase K., Maniatis, T., Fritsch, E. F. & Sambrook, J. Molecular Cloning, a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982), isoliert. Eine Reihe von degenerierten Primern wurden als Aminosäuren in verschiedenen Bereichen der veröffentlichten nOnc-Sequenz entsprechend bestimmt, Ardelt et al. (1991) J. Biol. Chem. 256, 245–251. Die PCR-Reaktion wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von 15 μg genomischer DNA in 100 μl durchgeführt. Alle Reagenzien außer der DNA wurden kombiniert und bei 95°C für 8 min. inkubiert, um jegliche restliche Proteinase K vor der Zugabe der Taq-DNA-Polymerase zu inaktivieren. PCR wurde für 40 Zyklen Denaturierung bei 94°C für 1 min., Ausheilen für 2 min. bei 55°C und Primerverlängerung für 2 min. bei 72°C durchgeführt. Verschiedene Paare von Primern ergaben Produkte mit der erwarteten Größe. Das größte Produkt (252 Bp) wurde unter Verwendung der Vorwärts-Primer codierenden Aminosäurereste 15–23 (AG(GA)GATGT(GT)GATTG(TC)GATAA(CT)ATCATG) (SEQ ID NR.: 35) und der Rückwärts-Primer codierenden Aminosäurereste 90–98 (TGTGA(AG)AA(CT)CAGGC(AC)CC(TA)GT(GT)CA(CT)TTT) (SEQ ID NR.: 36) erhalten. Dieses Fragment wurde durch TA-Klonieren in pCR^TMII subkloniert und ein Klon, der einen Einschub mit der geeigneten Größe trug, wurde direkt sequenziert und von diesem wurde festgestellt, daß er die Aminosäurereste 16–98 von nOnc ("Rana 9") (SEQ ID NR.: 2) codierte. Die entsprechende Nukleinsäuresequenz ist in SEQ ID NR.: 37 dargelegt.
C. Plasmidkonstruktion, Expression, Proteinreinigung und In-vitro-Tests. Die N- und C-Enden von nOnc wurden unter Verwendung des PCR-Verfahrens des Spleißens durch Überlappungsverlängerung, Horten et al. (1990) BioTechniques 8, 528–532, mit den Aminosäureresten 1–15 von nOnc oder Aminosäureresten 1–21 von EDN am N-Ende und den Aminosäureresten 99–104 von nOnc am C-Ende rekonstruiert. Die zusammengefügten Gene wurden zwischen die XbaI- und BamHI-Stellen des bakteriellen Expressionsvektors, pET-11d, Novagen, Madison, WI, eingefügt. Alle Verfahren wurden im wesentlichen, wie in Newton et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 26739–26745, beschrieben, durchgeführt. Die Plasmide wurden in BL21(DE3) E. coli Zellen exprimiert, wie vom Lieferanten, Novagen, Madison, WI, empfohlen. Die Fusionsproteine wurden von Einschlusskörpern isoliert, denaturiert, renaturiert und dialysiert, wie in Newton et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 26739–26745, beschrieben, bevor sie auf eine CM-Sephadex C-50 Säule, Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, aufgebracht wurden. Die Proteine wurden mit einem NaCl-Gradienten (0–0,5 M) in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, enthaltend 10% Glycerin, eluiert. Endreinigung auf > 95% wurde durch Größenausschlußchromatographie an Sephadex G-100, mit 5% Ameisensäure ins Gleichgewicht gebracht und eluiert, erreicht. Die Proteine wurden gesammelt, durch Amicon-Ultrafiltration unter Verwendung einer YM3-Membran konzentriert (oder lyophilisiert), Amicon, Beverly, MA, und gegen 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, enthaltend 10% Glycerin, dialysiert, bevor sie getestet wurden.
Die Ribonukleaseaktivität unter Verwendung von RNA und tRNA mit hohem Molekulargewicht wurde gemäß veröffentlichten Protokollen, Newton et al. (1994) J. Neurosci 14, 538–544, bei 37°C durch die Bildung von in Perchlorsäure löslichen Nukleotiden gemäß veröffentlichten Protokollen (Newton et al. (1996) Biochem. 35: 545–553) bestimmt. Mit Poly (A, C), UpG und Poly U wurde die Ribonukleaseaktivität spektrophotometrisch gemäß DePrisco et al. und Libonati und Florida DePrisco et al. (1984) Biochimica et Biophysica Acta 788, 356–363, Libonati, M. & Floridi, A. (1969) European J. Biochem. 8, 81–87, getestet. Kurz gesagt, die Aktivität wurde durch Messen der Zunahme des Absorptionsvermögens bei 260 nm getestet. Inkubationsgemische (1 ml 10 mM Imidazol, 0,1 M NaCl, pH 6,5 oder pH 7) enthielten Substrat und geeignete Mengen an Enzymlösung bei 25°C. Der In-vitro-Translationstest, St. Clair et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 8330–8334, und die Zellenlebensfähigkeitstests, Pearson et al., (1991) J. Natl. Cancer Inst. 83, 1386–1391, unter Verwendung des (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazoliumbromid; Thiazolylblau] (MTT) Mossman, T. (1983) J. Immunol. Methods 65, 55–63, wurden wie vorher beschrieben durchgeführt.
D. Klonieren und Expression von [Met-(–1)]rOnc und rOnc-Chimären. Acht verschiedene Oligonukleotidprimer wurden als spezifischen Bereichen in der primären Aminosäurestruktur von nOnc entsprechend bestimmt, Ardelt et al. (1991) J. Biol. Chem. 256, 245–251, und die Amplifikation von genomischer DNA von Rana pipiens wurde in einer Wärmezyklusvorrichtung, wie vorstehend beschrieben, ausgeführt. Ein Primerpaar entsprechend den Aminosäureresten 15 bis 23 bzw. 90 bis 98 von nOnc erzeugte ein Fragment mit 252 Bp. Dieses PCR-Produkt, das hier als Rana-Klon 9 bezeichnet ist, wurde in pCR^TMII kloniert und die Sequenzanalyse bestätigte, daß das PCR-Produkt Onc (104 Aminosäuren insgesamt) vom Aminosäurerest 16 bis 98 codierte (1).
Das gesamte rekombinante Onc-("rOnc")Gen (SEQ ID NR.: 38) wurde durch PCR-Verlängerung konstruiert und in einen Expressionsvektor unter Verwendung einer vorher beschriebenen Methodologie, Newton et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 26739–26745, kloniert. Die Amino- und Carboxylenden von rOnc wurden durch Einfügen der ersten 15 bzw. letzten 6 Aminosäurereste von nOnc vervollständigt. Die Konfiguration des halbsynthetischen rOnc-Gens ist an der Oberseite von 2A dargestellt. Die Primer wurden so gestaltet, daß sie mit der DNA-Sequenz des PCR-Produkts des Rana-Klons 9 überlappten. Das Plasmid wurde in BL21(DE3) E. coli exprimiert und das rekombinante Protein wurde aus Einschlusskörpern isoliert, wie in Newton et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 26739–26745, beschrieben, bevor es auf eine CM Sephadex C-50 Säule aufgebracht wurde. Die Endreinigung auf > 95% wurde durch Größenausschlußchromatographie erzielt. Die aus den Bakterien in diesem Expressionssystem erhaltene rOnc enthält ein zusätzliches Methionin am Aminoende [Met-(–1)] (SEQ ID NR.: 39) im Gegensatz zum authentischen Pyroglutamyl-Aminosäurerest (<Glu-1) des natürlichen Proteins (SEQ ID NR.: 1).
Um [Met-(–1)]rOnc zu humanisieren, während die Anordnung der Reste der aktiven Stelle aufrechterhalten wird (2B), wurde das N-Ende des Rana-Klons 9 auch mit Oligonukleotiden wiederhergestellt, die für die ersten 21 Aminosäurereste einer menschlichen Eosinophil-RNase, EDN (2B, rEDN_(1–21)Onc), codierten. PCR-Klonieren kann zu Sequenzfehlern führen. Tatsächlich enthielt die DNA-Sequenz des Gens, das EDN_(1–21)Onc codiert, eine A-G-Substitution, die zu einer Änderung von Asp zu Gly in der Position 26 in der Chimäre (Rest 20 in nOnc) führte und als rEDN_(1–21)rOncG₂₆ in 2B bezeichnet ist. Ein weiteres Plasmid, das codierendes rEDN_(1–21)rOnc enthielt, wurde sequenziert und von diesem festgestellt, daß es die korrekte DNA-Sequenz aufwies. Da die Mutation zur Substitution einer geladenen Aminosäure mit einem kleinen neutralen Rest führte, wurde die Mutantenchimäre auch exprimiert und nach Aktivität charakterisiert. Außerdem wurde [Met-(–1)]rOnc in der Position 20 von Asp zu Gly mutiert (rOncGly₂₀, 2A und B).
E. Ribonukleaseaktivität von Onc, EDN, [Met-(–1)]rOnc und Hybrid-rOnc-Proteinen. Sowohl nOnc (Lin, J. J., et al. (1994) Biochem Biophys Res Commun 204, 156–162) als auch EDN (Saxena et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 21982–21986) sind leistungsfähige Inhibitoren der In-vitro-Translation im Kaninchen-Reticulozytenlysat durch Mechanismen, die von ihren jeweiligen nukleolytischen Aktivitäten abhängen. Wie in Tabelle 1 dargestellt, verursachte die Zugabe von nOnc oder EDN zu einem Kaninchen-Retikulozytenlysat die Hemmung der Proteinsynthese, wie durch den Einschluß von [³⁵S]Methionin in säureausfällbares Protein gemessen. Während sowohl nOnc als auch EDN die Proteinsynthese mit IC₅₀s von 0,2 bzw. 1,3 ng/ml hemmten, waren [Met-(–1)]rOnc, [Met-(–1)]rOncG20 und rEDN_(1–21)rOncG26 beträchtlich weniger leistungsfähig (IC₅₀s 98, 28 bzw. 28 ng/ml). Die am wenigsten aktive RNase in diesem Test war rEDN_(1–21)rOnc mit einem IC₅₀ von 1600 ng/ml. Ein Plazenta-Ribonukleaseinhibitor (PRI) bindet eng an EDN und hemmt seine enzymatische Aktivität, Sorrentino et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 14859–14865, dennoch wird die nOnc-Aktivität durch PRI sehr wenig beeinträchtigt, Wu, Y. N., et al. (1993) Journal of Biological Chemistry 268, 10686–10693, und Tabelle 1, trotz seiner Homologie zu EDN und anderen Mitgliedern der Bauchspeicheldrüsen-RNase-Superfamilie. In dieser Hinsicht ist es interessant, daß die Aktivität von rEDN_(1–21)-rOnc wie nOnc kaum durch PRI beeinflußt wird, während die Hybrid-RNase mit der Gly-Mutation sich nun insofern mehr wie EDN verhält, als ihre Aktivität durch PRI signifikant gehemmt wird (21-fach).
Die Ribonukleaseaktivität dieser Proteine wurde auch in Tests unter Verwendung von Substraten mit hohem und niedrigem Molekulargewicht beurteilt. Wie in Tabelle 2 gezeigt, weisen EDN und nOnc verschiedene Substratspezifitäten auf, die mit vorher veröffentlichten Ergebnissen konsistent sind (Ardelt et al. (1991) J. Biol. Chem. 256, 245–251, Sorrentino et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 14859–14865, Ardelt et al. (1994) Protein Sci. 3, Erg. 1, 137). Konsistent mit den in Tabelle 1 dargestellten Ergebnissen waren [Met-(–1)]rOnc (SEQ ID NR.: 39) und rEDN_(1–21)rOnc viel weniger aktiv mit allen Substraten (nicht nachweisbar oder sehr wenig Aktivität unter den verwendeten Testbedingungen). Überraschenderweise zeigte das Gly enthaltende Hybridprotein signifikante Ribonukleaseaktivität insbesondere unter Bedingungen, die für die EDN-Enzymaktivität optimal sind. EDN ist bei einem neutralen pH-Wert aktiver (Sorrentino et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 14859–14865) und, wie in Tabelle 2 zu sehen, besteht eine deutliche Zunahme des EDN-Abbaus von tRNA bei pH 7,5 im Vergleich zu pH 6 (42,3-fach). Indem sie sich wie EDN verhält, nimmt die Gly enthaltende Hybride auch in der Aktivität mit einer pH-Verschiebung von 6 zu 7,5 (21,7-fach) zu, während nOnc bei pH 7,5 konsistent mit ihrem pH-Optimum, das im Bereich von 6–6,5 liegt, an Aktivität verliert (Ardelt et al. (1991) J. Biol. Chem. 256, 245–251, Ardelt et al. (1994) Protein Sci. 3, Erg. 1, 137). Die verstärkte EDN-artige Aktivität des Gly enthaltenden Hybridproteins wird auch durch sein Verhalten mit Poly (A, C) bewiesen, das ein ausgezeichnetes Substrat für EDN ist. Wie in Tabelle 2 zu sehen ist, exprimiert nur rEDN_(1–21)rOncG26 fast 50% der enzymatischen Aktivität von EDN mit diesem Substrat, wohingegen die Aktivität der anderen RNasen vernachlässigbar ist. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Poly(U) beobachtet. Im Gegensatz dazu bestand keine nachweisbare Aktivität von rEDN oder rEDN_(1–21)rOncG26 mit UpG, einem optimalen Onconase-Substrat (Ardelt et al. (1994) Protein Sci. 3, Erg. 1, 137). Zusammengefaßt sind sowohl [Met-(–1)]rOnc als auch rEDN_(1–21)rOnc weniger enzymatisch aktiv als nOnc oder rEDN. Obwohl rEDN_(1–21)rOncG26 signifikante EDN-artige enzymatische Aktivität exprimiert, wenn es unter Verwendung von definierten Substraten und Bedingungen, die für EDN optimal sind, getestet wird, ist es in jedem Test nicht so aktiv wie EDN. Dies könnte aus einer beeinträchtigten Enzym-Substrat-Wechselwirkung oder aus der Verwendung von weniger als optimalen Testbedingungen für dieses Hybridenzym resultieren.
Tabelle 1 Aktivität von [Met-(–1)]rOnc oder Hybridproteinen im Kaninchen-Retikulozytenlysat im Vergleich zu rEDN oder nOnc in Gegenwart oder Abwesenheit von PRI
Tabelle 2 Aktivität von RNasen an verschiedenen Substraten
F. Hemmung der Proteinsynthese in vier menschlichen Tumorzellinien durch RNasen. Die zytotoxische Wirkung von [Met-(–1)]rOnc und der zwei Hybrid-RNasen wurde mit rEDN und nOnc durch Bestimmen der Zellenlebensfähigkeit unter Verwendung des MTT-Tests verglichen. Wie in 3 dargestellt, senkte nOnc die Tumorzellenlebensfähigkeit in allen vier menschlichen Tumorzellinien. Bei den gezeigten Konzentrationen hatte rEDN keine Wirkung auf die Lebensfähigkeit von irgendwelchen der Zellinien. Im Gegensatz zu nOnc waren [Met-(–1)]rOnc sowie [Met-(–1)]rOncG20 konsistent weniger zytotoxisch in allen vier Zellinien. Dennoch war rEDN_(1–21)rOncG26 zytotoxischer als nOnc in ACHN, menschlichen Nierenkarzinomzellen, und gleich zytotoxisch in der menschlichen MDA-MB-231-Brustkarzinom-Zellinie. Obwohl rEDN_(1–21)rOncG26 in den menschlichen SF-539- und HS 578T-Gliom- bzw. Brustkrebs-Zellinien weniger aktiv war als nOnc, war es immer noch aktiver als [Met-(–1)]rOnc oder rEDN_(1–21)rOnc-Protein, das Asn in der Position 26 enthielt.
G. Strukturanalyse der Hybrid-RNasen. Das Modellieren der Hybrid-RNase basierte auf der Anordnung der Strukturen für Onc (Mosimann S. C., Ardelt W., James M. N. G., (1994), Refined 1.7 A X-ray crystallographic structure of P-30 protein, an amphibian ribonuclease with anti-tumor activity (J. Mol. Biol. 236, 1141–1153) und EDN (Mosimann, S. C., Newton D. L., Youle R. J., James M., X-ray crystallographic structure of recombinant eosinophil-derived neurotoxin at 1.83A resolution J. Mol. Biol.). Diese und anschließende Anordnungen wurden unter Verwendung von ALIGN (Satow Y., Cohen G. H., Padlan E. A., Davies D. R., (1986), J. Mol. Biol. 190, 593–604) ausgeführt.
H. Modellieren der Strukturen der Hybrid-RNasen. Die Koordinaten für Onc und EDN wurden auf der Basis der C^α-Spurenausrichtung überlagert. Reste in bewahrten Zonen, insbesondere in der aktiven Stelle, zeigten sehr wenig Verschiebung, wenn beide Strukturen verglichen wurden (global r. m. s. d. von 1,44 A für 90 C^α Atompaare). Das Hybridprotein wurde durch manuelles Umkonstruieren und Geometrieregulierung unter Verwendung von TOM (Cambillau C., Horjales E., (1987), J. Mol. Graph 5, 174–177) modelliert.
Anschließend wurde den Modellen für rEDN_(1–21)rOnc und rEDN_(1–21)rOncG26 ein Gesamt-B-Faktor von 15 A² für alle Nicht-Wasserstoff-Atome zugeordnet und sie wurden unabhängig 300 Zyklen einer Positionsenergieminimierung mit dem Programm XPLOR (Brunger A. (1992) XPLOR: a system for X-ray crystallography and NMR., New Haven: Yale University Press) unterzogen. Die Minimierung ergab virtuell identische Strukturen in beiden Fällen, wobei der höchste Abstand auf der Basis von c^α-Spurenausrichtung 0,44 für das C^α des mutierten Rests 26 ist. Die Geometriequalität der Endmodelle wurde mit PROCHECK (Laskowski R. A., MacArthur M. W., Moss D. S., Thornton J. M., (1993), J. Appl. Crystallogr 26, 283–291) beurteilt.
Die strukturelle Basis für die deutlichen Unterschiede in der Aktivität zwischen den Gly und Asp enthaltenden Hybrid-RNasen ist aus der Modellierung dieser Proteine nicht offensichtlich, insbesondere da der Rest 26 von der aktiven Stelle entfernt ist. Wenn die sehr homologe Struktur von RNase A, die mit einem Pentanukleotid komplexiert ist (Fontecilla-Camps J. C., deLorens R., leDu M. H., Cuchillo C. M., (1994), J. Biol. Chem. 269, 21526–21531), auf die Struktur des Hybridproteinmodells überlagert wurde, wurde auch beobachtet, daß das Nukleotid vom Bereich der Mutation entfernt war. Die Anordnung der Polynukleotidkette in den verschiedenen RNasen muß jedoch nicht notwendigerweise übereinstimmen. In der Struktur von EDN wurde ein zweites Sulfation zusätzlich zu dem einen an der aktiven Stelle gefunden (Mosimann, S. C., Newton D. L., Youle R. J., James M., X-ray crystallographic structure of recombinant eosinophil-derivated neurotoxin at 1.83A resolution J. Mol. Biol.). Dieses zweite Sulfat ersetzt wahrscheinlich ein Phosphat vom zu spaltenden Nukleotid, aber kein Phosphation befindet sich in der äquivalenten Position im RNase-A-Pentanukleotid-Komplex. Überdies bildet eines der Phosphate in diesem Komplex eine Salzbrücke mit Lys-66, einem Rest, der kein Gegenstück in Onc aufweist, da er sich in einer Schleife mit einer unterschiedlichen Topologie in beiden Molekülen befindet. Ob der Unterschied in der enzymatischen Aktivität zwischen den Asp- und Gly-Mutanten in der Chimäre mit einer Änderung in der Bindungsaffinität für das Substrat in Zusammenhang steht, bleibt eine offene Frage.
Obwohl die strukturelle Basis für den Unterschied in den Aktivitäten der zwei EDN-Onc-Hybride nicht klar ist, kann das EDN-artige Verhalten der rEDN_(1–21)rOncG26-Hybride wahrscheinlich der Konfiguration des N-endständigen Bereichs zugeschrieben werden, da sich sowohl die Pyroglutaminsäure in nOnc als auch Lys-1 in EDN in dem Bereich der aktiven Stelle befinden (Mosimann, S. C., Ardelt W., James M. N. G., (1994), Refined 1.7 A X-ray crystallographic structure of P-30 protein, an amphibian ribonuclease with anti-tumor activity J. Mol. Biol. 236, 1141–1153; Mosimann S. C., Newton D. L., Youle R. J., James M., X-ray crystallographic structure of recombinant eosinophil-derived neurotoxin at 1.83A resolution J. Mol. Biol.). Außerdem beeinflußte die Einführung einer Gly-Mutation in [Met-(–1)]rOnc die enzymatische Aktivität nicht signifikant. Die Bevorzugung von U gegenüber C am B1-Teilbindungsort von RNase A wurde mit der Anwesenheit eines speziellen Rests (Asp-83) in Zusammenhang gesehen (DelCardayre S. B., Raines R. T., (1995), A residue to residue hydrogen bond mediates the nucleotide specificity of ribonuclease A J. Mol. Biol. 252, 328–336). Der entsprechende Rest in nOnc ist auch eine Asparaginsäure (Asp-67), während diese Position in EDN mit einem Histidin (His-82) belegt ist. EDN ist gegen Poly (A, C) aktiver, was darauf hinweist, daß es C am B1-Teilbindungsort "bevorzugt", möglicherweise da es einen Histidinrest im Gegensatz zur Asparaginsäure in nOnc und RNase A enthält. Zusammengenommen könnte dies die verringerte Aktivität der Gly enthaltenden Hybride relativ zu rEDN erklären, da gemäß dieser Hypothese die Anwesenheit des Asp-Rests, die durch die rOnc-Sequenz beigetragen wird, die Bindung von U gegenüber C begünstigen würde. Mit Bezug auf den Unterschied in der PRI-Hemmung demonstriert die Überlagerung zwischen den Hybridproteinen und RNase A, daß Asp-26 in den EDN-Onc-Chimären in der äquivalenten Position zu Asn-27 in RNase A liegt, von dem berichtet wurde, daß es mit PRI in Kontakt steht (Kobe B., Deisenhofer J., (1995), Nature 374, 183–186). Außerdem liegt Asp-24 in beiden Chimären sehr nahe an diesem Bereich. Somit könnte die Ansammlung von negativen Ladungen in diesem Bereich die Bindung durch den Inhibitor verhindern. Wenn ja, würde die Substitution von Asp gegen Gly die negative Ladung verringern und die Bindungskapazität wiederherstellen.
Beispiel II. rOnc-Antikörper-Fusionsproteine
Zusätzliche rOnc-Antikörper- und Ligandenproteine wurden hergestellt und sind sehr aktiv. E6FB[MetI-(–1)]SerrOnc ist ein rOnc-Molekül mit der in SEQ ID NR.: 40 dargelegten Nukleinsäuresequenz und der in SEQ ID NR.: 41 dargelegten Aminosäuresequenz und umfaßt die Fv-Sequenz vom Antikörper E6, ein Anti-Transferrin-Rezeptor-Antikörper. Siehe Sequenzen für E6 in den Aminosäurepositionen 1–237 in SEQ ID NR.: 41. "FB" bezieht sich auf ein Verbindungsstück, das verwendet wird, um den Antikörper und den rOnc-Teil des Moleküls zu verbinden, und ist in den Nukleinsäurepositionen 712 bis 750 in SEQ ID NR.: 40 zu finden. Dieses Molekül umfaßt ein Ser in der Aminosäureposition 252 anstelle eines Glu. E6FB[Met-(–1)]GlurOnc bezieht sich auf die Sequenz in SEQ ID NR.: 40. Ähnliche Hybridmoleküle wurden hergestellt. Die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen für Met-NLS(Signalpeptid)-Gln-rOncFBE6 sind in SEQ ID NRN. 42 und 43 dargelegt. Ein weiteres E6/rOnc-Molekül ist als Met-Ser-rOncA87FBE6 bezeichnet und ist in SEQ ID NRN.: 44 und 45 zu finden. "A87" bezieht sich auf die Tatsache, daß ein Ala in der Aminosäureposition 87 vorkommt.
Met-Ser-rOnc-Ang-FBE6 ist in SEQ ID NRN.: 46 und 47 dargelegt.
E6FBMet-Ser-rOnc ist in SEQ ID NRN.: 48 und 49 dargelegt.
Met-Glu-rOncFBE6 ist in SEQ ID NRN.: 50 und 51 dargelegt.
Met-Ser-rOncFBE6 ist in SEQ ID NRN.: 50 und 51 dargelegt, mit der Ausnahme, daß Ser Glu in der Aminosäureposition 2 ersetzt.
MOC31 und MOC162 beziehen sich auf Anti-Dickdarmkrebs-Antikörper, die gegen das 17-1-A-Pankarzinomantigen gerichtet sind, die von Dr. Hennie Hoogenboom erhalten wurden. Der Fv-Bereich dieser Antikörper wurde mit rOnc fusioniert. Die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen für MetSerrOnc A87 FBMOC31 sind in SEQ ID NRN.: 52 und 53 dargelegt. Die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen für MOC31FBMetSerrOnc sind in SEQ ID NRN: 54 und 55 dargelegt. Die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen für MetSerrOncFBMOC161 sind in SEQ ID NRN. 56 und 57 dargelegt.
Der Ligand IL2 (Interleukin 2) wurde ebenso rekombinant mit rOnc fusioniert. Siehe SEQ ID NRN: 58 und 59 für IL2FBMetSerrOnc. Siehe SEQ ID NRN.: 60 und 61 für MetSerrOncFBIL2.
Die Hemmung der Proteinsynthese in SF539-Zellen (die den Transferrinrezeptor tragen) wurde, wie vorstehend beschrieben, für [Met-(–1)Ser]rOnc-, E6FB[Met-(–1)Ser]rOnc-; [Met-(–1)Ser]rOnc-AngFBE6- und [Met-(–1)Glu]rOncFBE6-Gebilde gemessen und mit nOnc verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Die drei E6-Gebilde hatten insbesondere ein sehr hohes Niveau an Aktivität – bis zu 45-facher Unterschied gegenüber den zwei Nicht-E6-Molekülen. Siehe auch 5. Das MetSerOncAng-Molekül wurde entsprechend den Aminosäuren 1–107 von SEQ ID NR.: 47 hergestellt.
Tabelle 3 Aktivität von modifizierter rOnc und modifiziertem rOncFvs bei der Proteinsynthese
Die Konzentrationen, die zum Hemmen der Proteinsynthese um 50% in menschlichen SF539-Gliomzellen erforderlich sind. NSD, keine signifikante Differenz.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Ribonukleasemolekül mit: (a) einem aminoendständigen Ende, das mit einem Methionin beginnt, dem eine beliebige andere Aminosäure als Glutaminsäure folgt; (b) wenn es für maximale Übereinstimmung mit SEQ ID NR.: 13 angeordnet ist, einem Cystein in den Aminosäurepositionen 26, 40, 58, 84, 95 und 110; einem Lysin in der Position 41 und einem Histidin in der Position 119, und (c) einer von nOnc abgeleiteten Aminosäuresequenz, wobei das Ribonukleasemolekül eine meßbare Ribonukleaseaktivität aufweist.
Ribonuklease nach Anspruch 1, die ein aminoendständiges Ende aufweist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus: Met-Lys; Met-Tyr; Met-Ser; Met-Ala; Met-Arg; und Met-Asn besteht.
Ribonuklease nach Anspruch 1, welche ein aminoendständiges Ende aufweist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgendem besteht: Met-Ala; Met-Ala-Ala; Met-Ala-Ala-Ser; Met-Arg; Met-(J); Met-Lys-(J); Met-Arg-(J); Met-Lys; Met-Lys-Pro; Met-Lys-(J)-Pro (SEQ ID NR.: 14); Met-Lys-Pro-(J) (SEQ ID NR.: 15); Met-Asn; Met-Gln; Met-Asn-(J); Met-Gln-(J); Met-Asn-(J)-Pro (SEQ ID NR.: 16); Met-(J)-Lys; Met-(J)-Lys-Pro (SEQ ID NR.: 17); und Met-(J)-Pro-Lys (SEQ ID NR.: 18); wobei (J) Ser, Tyr oder Thr ist.
Ribonuklease nach Anspruch 1, welche ein aminoendständiges Ende von Met-Ala aufweist.
Ribonuklease nach Anspruch 1, welche ein aminoendständiges Ende von Met-Arg aufweist.
Ribonuklease nach Anspruch 1, welche ein aminoendständiges Ende von Met-Lys aufweist.
Ribonuklease nach Anspruch 1, welche ein aminoendständiges Ende von Met-Asn aufweist.
Ribonuklease nach Anspruch 1, welche ein aminoendständiges Ende von Met-Gln aufweist.
Ribonuklease nach Anspruch 1, welche ein aminoendständiges Ende aufweist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Met-Ser; Met-Tyr oder Met-Thr besteht.
Ribonuklease nach Anspruch 3, wobei Asparaginsäure der Aminosäureposition 2 von nOnc (Position 4 mit Bezug auf die Sequenz von Rinder-RNase) deletiert oder durch Ala oder Asn ersetzt ist.
Ribonuklease nach Anspruch 1 mit einem Molekül mit einem aminoendständigen Ende, das durch eine Sequenz codiert ist, die vom aminoendständigen Ende von EDN abgeleitet ist, welcher eine Sequenz von rOnc folgt.
Ribonuklease nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz eine Sequenz mit der folgenden Formel umfaßt: von Met(–1)eosinophil abgeleitetes Neurotoxin_(1–m)Onc_(n–104) wobei sich Met(–1) auf einen aminoendständigen Rest von Met bezieht; wobei sich von Eosinophil abgeleitetes Neurotoxin_(1–m) auf eine zusammenhängende Sequenz von Aminosäuren mit einer Länge bezieht, die mit der Aminosäureposition 1 von von Eosinophil abgeleitetem Neurotoxin (SEQ ID NR.: 9) beginnt und sich zur Aminosäureposition "m" von von Eosinophil abgeleitetem Neurotoxin fortsetzt und diese einschließt; wobei sich Onc_(n–104) auf eine Sequenz von zusammenhängenden Aminosäuren bezieht, die mit der Aminosäureposition "n" beginnt und sich zur Aminosäureposition 104 fortsetzt und diese einschließt, wie in SEQ ID NR.: 1 dargelegt; und wobei "m" die Aminosäureposition von von Eosinophil abgeleitetem Neurotoxin ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 5, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 und 22; so daß wenn m 21 ist, n 16 oder 17 ist; wenn m 22 ist, n 17 ist; wenn m 20 ist, n 16 ist; wenn m 19 ist, n 15 ist; wenn m 18 ist, n 14 ist; wenn m 17 ist, n 12 oder 13 ist; wenn m 16 ist, n 11, 12, 13 oder 14 ist; wenn m 15 ist, n 10 ist; wenn m 14 ist, n 9 ist; wenn m 13 ist, n 8 ist; und wenn m 5 ist, n 1 ist.
Ribonuklease nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz, die zu jener von SEQ ID NR.: 28 identisch ist.
Ribonuklease nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz, die zu jener von SEQ ID NR.: 22 identisch ist.
Ribonuklease nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz, die zu jener von SEQ ID NR.: 24 identisch ist.
Ribonuklease nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz, die zu jener von SEQ ID NR.: 26 identisch ist.
Ribonuklease nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz, die zu jener von SEQ ID NR.: 30 identisch ist.
Ribonuklease nach Anspruch 1 mit einer Aminosäuresequenz, die zu jener von SEQ ID NR.: 32 identisch ist.
Ribonuklease nach Anspruch 1, welche eine Aminosäuresequenz umfaßt, die zu jener von SEQ ID NR.: 2 identisch ist.
Ribonuklease nach Anspruch 1 mit einem carboxylendständigen Ende, das von Angiogenin entsprechend der Aminosäuresequenz der Positionen 101 bis 107 von SEQ ID NR.: 20 abgeleitet ist.
Ribonuklease nach Anspruch 20 mit einer Aminosäuresequenz, die zu jener von SEQ ID NR.: 20 identisch ist.
Fusionsprotein mit der Ribonuklease nach Anspruch 1, welches mit einem Ligandenbindungsanteil oder -marker verbunden ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 23 [22], wobei der Ligandenbindungsanteil einen Antikörper umfaßt.
Isolierte Nukleinsäuresequenz, die das Ribonukleasemolekül nach Anspruch 1 codiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung mit einer zytotoxischen Menge einer Ribonuklease nach Anspruch 1 und einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 26 [25], wobei die Ribonuklease mit einem Ligandenbindungsanteil verbunden ist.
Verfahren zum selektiven Abtöten von Zellen, umfassend das Kontaktieren von abzutötenden Zellen mit einer Ribonuklease nach Anspruch 1, die mit einem Ligandenbindungsanteil verbunden ist.
Ribonukleasemolekül nach Anspruch 1, welches ferner ein Kernlokalisierungssignal aufweist.
Ribonukleasemolekül nach Anspruch 1, welches ferner eine endoplasmatische Retentionssequenz aufweist.
Vektor mit einer Nukleinsäure, die eine Ribonuklease nach Anspruch 1 codiert.
Wirtszelle mit einer Nukleinsäure, die eine Ribonuklease nach Anspruch 1 codiert.