DE69925817T2

DE69925817T2 - Rekombinante onconase und fusionsproteine davon

Info

Publication number: DE69925817T2
Application number: DE69925817T
Authority: DE
Inventors: M. David Goldenberg; Hans Hansen; Shui-On Leung
Original assignee: Immunomedics Inc
Current assignee: Immunomedics Inc
Priority date: 1998-03-11
Filing date: 1999-03-11
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2019-03-12
Also published as: AU2975199A; ES2241268T3; PT1062348E; ATE297996T1; JP2002512774A; EP1062348B1; WO1999046389A1; CA2323631A1; EP1062348A1; DE69925817D1; AU748992B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinant hergestellte Onconase-Moleküle und Fusionsproteine, die diese enthalten.
Onconase ist eine Nicht-Säuger-Ribonuklease (RNase) mit einem Molekulargewicht von 12.000, die aus Oozyten und frühen Embryonen von Rana pipiens gereinigt wird. Onconase bewirkt eine potente Inhibition der Proteinsynthese in Kaninchen-Retikulozyten-Lysat (IC₅₀ 10^–11 M) und bei Mikroinjektion in Xenopus-Oozyten (IC₅₀ 10^–10 M). Anders als andere Mitglieder der RNase A Superfamilie, baut Onconase Oozyten-rRNA nicht ab. Bei Bindung an die Zelloberflächenrezeptoren sensitiver Zellen und zytosolischer Internalisierung verursacht Onconase Zelltod als Ergebnis der starken Inhibition der Proteinsynthese durch einen Mechanismus, an dem die Inaktivierung zellulärer RNA beteiligt ist. Onconase wird nicht durch Säugerplazenta-Ribonuklease-Inhibitor inhibiert, was die verstärkte Zytotoxizität von Onconase im Vergleich zu den Säugerenzymen erklären könnte.
Toxikologische Tierstudien belegen, dass Onconase eine vorhersagbare, Dosis-abhängige und reversible Toxizität sowohl bei Ratten (Dosisbereich 0,01–0,02 mg/kg) als auch bei Hunden (0,005–0,15 mg/kg) zeigt. Mäuse, die mit dem aggressiven M109 Madison-Lungenkarzinom beimpft wurden, und mit sowohl täglichen als auch wöchentlichen Schemata für intraperitoneal verabreichte Onconase behandelt wurden, zeigten eine signifikant verlängerte Überlebensdauer. Die auffälligsten Ergebnisse wurden bei einer Gruppe von Mäusen beobachtet, die mit einem wöchentlichen Plan für Onconase behandelt wurden, wobei 6 von 18 Tieren Langzeitüberleben zeigten und offenbar von Krebs geheilt waren.
Onconase hat in klinischen Studien gezeigt, dass sie Anti-Tumor-Aktivität gegen eine Vielzahl solider Tumore besitzt. In diesem Zusammenhang ist sie sowohl alleine als auch in Kombination mit anderen Anti-Tumormitteln, wie z.B. Tamoxifen, verwendet worden, wenn Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs behandelt wurden. Bei ihrer Verwendung als Anti-Tumormittel kann Onconase mit einem Marker konjugiert werden, der sie zielgerichtet zu einem bestimmten Zelltyp lenkt.
Bei einer Phase I-Studie wurden Patienten, die an einer Vielzahl wiederkehrender und resistenter Tumoren litten, intravenös mit Onconase behandelt. Eine Dosis von 60–690 μg/m² an Onconase führte zu möglichen Nebenwirkungen, wie Rötung, Myalgien, vorübergehendem Schwindelgefühl und allgemein verringertem Appetit. Die beobachteten Toxizitäten, einschließlich der Dosis-begrenzenden renalen Toxizität, die sich in zunehmender Proteinurie, peripherem Ödem, Azotämie, einer verminderten Kreatinin-Clearance, sowie Müdigkeit manifestierten, waren Dosisabhängig und reversibel, was in Übereinstimmung mit den tiertoxikologischen Studien steht. Es waren keine klinischen Anzeichen einer echten immunologischen Sensibilisierung erkennbar, selbst nach wiederholten, wöchentlichen intravenösen Dosen von Onconase. Die maximal tolerierte Dosis, hauptsächlich abhängig von der renalen Toxizität, wurde mit 960 μg/m² ermittelt. Es gab außerdem einige objektive Reaktionen bei nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom, Ösophagus- und colorektalen Karzinomen. Nichtsdestoweniger wurde Onconase von den Tieren gut vertragen, und die Mehrzahl der getesteten menschlichen Patienten zeigte ein übereinstimmendes und reversibles klinisches Toxizitätsmuster und verblieb ohne die meisten der toxischen Reaktionen, die mit der Mehrzahl der chemotherapeutischen Mittel assoziiert ist, wie etwa Knochenmarkdepression und Haarausfall.
Onconase besitzt somit viele wünschenswerte Eigenschaften, einschließlich geringer Größe, tierischer Herkunft und Anti-Tumorwirkungen in vitro und in vivo. Sie wird gut vertragen und widersteht humanen RNase-Inhibitoren. Jedoch besitzt die aus Rana pipiens-Oozyten gereinigte Onconase unerwünschte Eigenschaften. Die Tatsache, dass sie aus einer natürlichen Quelle erhalten wird, macht es schwieriger und teurer, sie in hinreichenden Mengen zu erhalten. Da sie nicht vom Menschen und nicht einmal aus Säugern stammt, stimuliert sie typischerweise unerwünschte Immunantworten bei Menschen. Dementsprechend wäre es vorteilhaft, auf rekombinantem Wege native Onconase zu produzieren, die die zytotoxischen Eigenschaften der aus Rana pipiens-Oozyten gereinigten Onconase beibehält, jedoch nicht die unerwünschten Immunantworten beim Menschen besitzt.
Versuche, native Onconase durch rekombinante DNA-Verfahren in E. coli herzustellen, sind gescheitert. Onconase besitzt einen N-terminalen Pyroglutamylrest, der für eine korrekte Faltung des Moleküls benötigt wird. Dieser Rest bildet einen Teil der Phosphat-bindenden Tasche von Onconase aus und ist essentiell für die RNase- und Anti-Tumoraktivität. Das Startcodon in E. coli setzt N-Formyl-Methionin in Peptiden als den N-terminalen Aminosäurerest ein. Daher besitzt die native Onconase, die rekombinant in E. coli produziert wurde, kein Pyroglutamyl als N-terminalen Rest.
Die WO 97/3116 beansprucht, das Problem der Herstellung einer modifizierten Onconase, die ihre zytotoxische Aktivität beibehält, gelöst zu haben. Sie offenbart eine rekombinante Ribonuklease, die ein aminoterminales Ende besitzt, das mit einem Methionin beginnt, gefolgt von einer Aminosäure, die etwas anderes als Glutaminsäure ist, mit einem Cystein an den Positionen 26, 40, 58, 84, 95 und 110, einem Lysin an der Position 41, und einem Histidin an der Position 119 von boviner RNase A, sowie eine von nativer Onconase abgeleitete Aminosäuresequenz. Die WO 97/3116 erkennt nicht die Wichtigkeit von Pyroglutamat als dem N-terminalen Rest und erzeugt kein Onconase-Molekül mit einem N-terminalen Pyroglutamat. Im Gegensatz dazu schlägt die WO 97/3116 die Anfügung einer aminoterminalen Sequenz und/oder die Fusion des N-Terminus mit einem Liganden-Molekül vor.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt die Nukleinsäuresequenz und die Aminosäuresequenz von NfM-Onconase.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine rekombinant hergestellte Onconase-scFv bereitzustellen, wobei diese RNase Pyroglutamat als den N-terminalen Rest enthält und wobei das scFv ein LL2-scFv ist; diese Onconase soll die zytotoxischen Eigenschaften von Onconase beibehalten, während die unerwünschten Nebenwirkungen beseitigt werden.
Diese und andere Aufgaben gemäß der Erfindung werden von einem Onconase-LL2-scFv-Molekül erfüllt, das Pyroglutamat als N-terminalen Rest trägt, wobei dieses Onconase-Molekül rekombinant in E. coli hergestellt wird. Das rekombinant hergestellte Onconase-Molekül besitzt die Sequenz und Struktur der aus Rana pipiens gereinigten Onconase.
Das Fusionsprotein kann rekombinant hergestellt werden, indem man eine Nukleinsäuresequenz exprimiert, die für Onconase und eine zielsteuernde Gruppierung codiert. Die zielsteuernde Gruppierung ist ein Antikörper-Fragment, welches scFv ist.
Es wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die rekombinant hergestelltes Onconase-Fusionsprotein gemäß der Erfindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger beinhaltet. Die Zusammensetzungen sind nützlich bei einem Verfahren zur Behandlung von Lymphom, was die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des rekombinant hergestellten Onconase-Fusionsproteins gemäß der Erfindung an ein Subjekt, das einer solchen Behandlung bedarf, beinhaltet.
Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung ersichtlich werden. Dies ist jedoch so zu verstehen, dass die detaillierte Beschreibung und die spezifischen Beispiele, obwohl sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung darstellen, nur zur Veranschaulichung angegeben sind, da verschiedene Änderungen und Modifikationen innerhalb des Geists und Schutzumfangs der Erfindung dem Fachmann aus dieser detaillierten Beschreibung erkennbar sein werden.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Es ist überraschender Weise entdeckt worden, dass ein Onconase-Molekül, das (1) die Sequenz der nativen Onconase besitzt, (2) die korrekte Faltung der nativen Onconase beibehält, und (3) eine zytotoxische Aktivität besitzt, die ähnlich derjenigen von Onconase ist, die aus den Oozyten von Rana pipiens gereinigt wird, rekombinant in E. coli hergestellt werden kann. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird die cDNA, die für Onconase codiert, um ein Triplett verlängert, das für N-Formyl-Methionin codiert. Bei rekombinanter Expression besitzt die mutante Onconase N-Formyl-Methionin als N-terminale Aminosäure und Glutaminyl als den vorletzten N-terminalen Rest. Das in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung produzierte Expressionsprodukt wird hier als NfM-Onconase bezeichnet. Nach der Expression wird der N-Formyl-Methioninrest abgespalten und der vorletzte Glutaminylrest wird zyklisiert, um Onconase mit einem N-terminalen Pyroglutamatrest, die hier als rOnconase bezeichnet wird, zu produzieren. rOnconase besitzt dieselbe Struktur und Funktion wie native Onconase.
Definitionen
Sofern nicht anders definiert, haben alle verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, mit der sie üblicherweise vom Durchschnittsfachmann verstanden werden.
Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe wie folgt definiert:
Die Bezugnahme auf Aminosäuren erfolgt über deren Namen oder entweder über ihre allgemein bekannten Dreibuchstaben-Symbole oder über die Einbuchstaben-IUPAC-Symbole. Die Bezugnahme auf Nukleotide erfolgt über ihre allgemein akzeptierten Einbuchstaben-Codes.
„Konservativ modifizierte Variationen" einer bestimmten Nukleinsäuresequenz beziehen sich auf diejenigen Nukleinsäuren, die für identische oder im wesentlichen identische Aminosäuresequenzen codieren, oder, da wo die Nukleinsäure nicht für eine Aminosäuresequenz codiert, auf im wesentlichen identische Sequenzen. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes kann ein beliebiges gegebenes Polypeptid von einer großen Anzahl funktionell identischer Nukleinsäuren codiert werden. Beispielsweise codieren die Codons GCA, GCC, GCG und GCU alle die Aminosäure Alanin. Somit kann an jeder Position, an der Alanin durch ein Codon spezifiziert wird, das Codon zu jedem der entsprechenden, beschriebenen Codons abgeändert werden, ohne das codierte Polypeptid zu verändern. Jedes Codon in einer Nukleinsäure, mit Ausnahme von AUG, das Methionin codiert, kann modifiziert werden, um ein funktionell identisches Molekül zu erhalten. Die hier beschriebenen Nukleinsäuresequenzen umfassen auch diese Veränderungen.
„Konservativ modifizierte Variationen" einer Aminosäuresequenz beinhalten individuelle Substitutionen, die eine einzelne Aminosäure oder einen kleinen Prozentsatz von Aminosäuren in einer codierten Sequenz verändern, wobei die Veränderungen im Austausch einer Aminosäure gegen eine chemisch ähnliche Aminosäure resultieren. Konservative Substitutionen sind Fachleuten wohlbekannt. Die folgenden sechs Gruppen enthalten jeweils Aminosäuren, die konservative Austausche für einander sind:

1. Alanin, Serin, Threonin
2. Asparaginsäure, Glutaminsäure
3. Asparagin, Glutamin
4. Arginin, Lysin
5. Isoleucin, Leucin, Methionin, Valin und
6. Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan

"Konservativ modifizierte Variationen" einer Aminosäuresequenz beinhalten auch Deletionen oder Additionen einer einzelnen Aminosäure oder eines kleinen Prozentanteils von Aminosäuren in einer codierten Sequenz, wenn die Additionen und Deletionen im Austausch einer Aminosäure durch eine chemisch ähnliche Aminosäure resultieren. Die hier beschriebenen Aminosäuresequenzen umfassen auch diese Variationen.
Die Begriffe „isoliert" oder „biologisch rein" beziehen sich auf Material, das weitgehend oder im wesentlichen frei von Bestandteilen ist, die dieses Material, so wie es in seiner natürlichen Umgebung zu finden ist, normalerweise begleiten. Das isolierte Material kann optional Materialien beinhalten, die nicht zusammen mit dem Material in dessen natürlicher Umgebung gefunden werden.
Der Begriff „Nukleinsäure" bezieht sich auf ein Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotid-Polymer, entweder in einzelsträngiger oder in doppelsträngiger Form; der Begriff umfasst, wenn nicht anderweitig beschränkt, bekannte Analoga von natürlichen Nukleotiden, die in einer Weise mit Nukleinsäuren hybridisieren, die der von natürlich vorkommenden Nukleotiden ähnlich ist. Sofern nicht anders angegeben, beinhaltet eine bestimmte Nukleinsäuresequenz auch ihre Komplementärsequenz.
Ein „Expressionsvektor" beinhaltet eine rekombinante Expressionskassette, umfassend eine Nukleinsäure, die für ein Polypeptid gemäß der Erfindung codiert, und die von einer Zelle transkribiert und translatiert werden kann. Eine rekombinante Expressionskassette ist ein Nukleinsäurekonstrukt, welches rekombinant oder synthetisch erzeugt wurde, mit einer Reihe spezifizierter Nukleinsäureelemente, die die Transkription einer bestimmten Nukleinsäure in einer Zielzelle ermöglichen. Der Expressionsvektor kann Teil eines Plasmids, Virus oder Nukleinsäurefragments sein. Typischer Weise beinhaltet der rekombinante Expressionskassettenanteil des Expressionsvektors eine zu transkribierende Nukleinsäure und einen funktionsfähig damit verbundenen Promotor.
Der Begriff „rekombinant" zeigt dann, wenn er im Hinblick auf ein Protein verwendet wird, an, dass eine Zelle ein Peptid oder Protein exprimiert, welches durch eine Nukleinsäure codiert ist, deren Ursprung für die Zelle exogen ist. Rekombinante Zellen können Gene exprimieren, die bei der nativen (nicht-rekombinanten) Form der Zelle nicht zu finden sind. Rekombinante Zellen können auch Gene exprimieren, die bei der nativen Form der Zelle zu finden sind, wobei die Gene durch künstliche Mittel erneut in die Zelle eingeführt werden, z.B. unter der Kontrolle eines heterologen Promotors.
Der Begriff „weitgehende Identität" oder „weitgehende Ähnlichkeit" im Kontext eines Polypeptids zeigt an, dass ein Polypeptid eine Sequenz mit wenigstens 80%, bevorzugter 90% und am bevorzugtesten wenigstens 95% Identität gegenüber einer Referenzsequenz umfasst. Zwei Polypeptide, die weitgehend identisch sind, bedeuten, dass eines der Polypeptide immunologisch mit den Antikörpern reagieren kann, die gegen das zweite Peptid erzeugt wurden. Zwei Nukleinsäuren sind im wesentlichen identisch, wenn die beiden Moleküle unter stringenten Bedingungen miteinander hybridisieren. Im allgemeinen werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie für eine spezifische Sequenz bei definierter Ionenstärke und definiertem pH etwa 5°C bis 20°C unterhalb des thermischen Schmelzpunktes (T_m) liegen. Die T_m ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke und definiertem pH), bei der 50% der Zielsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisieren. Jedoch sind Nukleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen nicht miteinander hybridisieren, immer noch weitgehend identisch, wenn die von ihnen codierten Polypeptide weitgehend identisch sind.
Ein „Antikörper" beinhaltet sowohl ganze Antikörper als auch Antikörper-Fragmente, wie etwa F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, Fv und dergleichen, einschließlich Hybridfragmenten. Ebenfalls nutzbar sind alle Subfragmente, die die hypervariable, Antigen-bindende Region eines Immunglobulins beibehalten.
Eine „zielsteuernde Gruppierung" ist ein Antikörper, Zytokin oder Wachstumsfaktor, der spezifisch für einen Marker auf dem gegebenen Zelltyp ist. Eine zielsteuernde Gruppierung kann verwendet werden, um in spezifischer Weise ein angehängtes Molekül an einen gegebenen Zelltyp auszuliefern, bevorzugt in Assoziation mit dem Marker, der mit diesem Zelltyp zusammenhängt.
Ein „Fusionsprotein" ist ein chimäres Molekül, das durch das Verbinden zweier oder mehrerer Polypeptide, insbesondere von Onconase und einer zielsteuernden Gruppierung, gebildet wird. Die Onconase und die zielsteuernde Gruppierung werden über eine Peptidbindung verbunden, die zwischen dem Amino-Terminus der zielsteuernden Gruppierung und dem Carboxy-Terminus der Onconase ausgebildet wird, und ihre Expression erfolgt rekombinant durch eine Nukleinsäuresequenz, die für das Fusionsprotein codiert. Ein Einzelketten-Fusionsprotein ist ein Fusionsprotein, das ein einzelnes zusammenhängendes Polypeptid-Rückgrat besitzt.
Ein „chemisches Konjugat" ist ein Konjugat, das durch die chemische Kopplung von Onconase und einer zielsteuernden Gruppierung gebildet wird.
Ein „pharmazeutisch akzeptabler Träger" ist ein Material, das als Vehikel für die Verabreichung von Onconase oder Fusionsprotein verwendet werden kann, da dieses Material inert oder in anderer Weise medizinisch geeignet ist und mit dem Fusionsprotein oder „bewaffneten" Liganden kompatibel ist.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung kann die Nukleinsäure, die für die native Onconase codiert, durch die Klonierung und Restriktion geeigneter Sequenzen hergestellt werden, oder unter Verwendung der DNA-Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion (PCR). Die Aminosäuresequenz von Onconase kann aus Ardelt et al., J. Biol. Chem., 256: 245 (1991) erhalten werden, und cDNA-Sequenzen, die für native Onconase codieren, oder eine konservativ modifizierte Variante davon, können durch Verfahren gensynthetisiert werden, die ähnlich der en bloc V-Gen-Zusammensetzung bei der hLL2-Humanisierung sind (Leung et al., Mol. Immunol., 32: 1413 (1995)). Für die Expression in E. coli wird ein Translationsstartcodon ATG im Leseraster der Onconase-cDNA-Sequenz vorgeschaltet. Das translatierte Protein enthält dann ein zusätzliches Met an der Position -1.
Alternativ kann die Nukleinsäure, die für native Onconase codiert, in vitro synthetisiert werden. Die chemische Synthese erzeugt ein einzelsträngiges Oligonukleotid. Dieses kann durch Hybridisieren mit einer komplementären Sequenz oder durch Polymerisieren mittels einer DNA-Polymerase unter Verwendung des Einzelstranges als Matrize in eine doppelsträngige DNA umgewandelt werden. Während die chemische Synthese auf Sequenzen von etwa 100 Basen begrenzt ist, können längere Sequenzen durch das Ligieren kürzerer Sequenzen erhalten werden.
Wie angemerkt, wird ein Gen, das für native Onconase oder eine konservativ modifizierte Variation davon codiert, modifiziert, um ein Codon für N-Formyl-Methionin am N-Terminus zu beinhalten. Das so erhaltene NfM-Onconasegen wird funktionsfähig mit einem geeigneten E. coli-Promotor, wie etwa dem T7-, trp- oder Lambda-Promotor, verbunden und in eine Expressionskassette inseriert. Vorzugsweise werden außerdem eine Ribosomenbindungsstelle und ein Transkriptionsterminationssignal in die Expressionskassette einbezogen. Ein Expressionsvektor, der die Kassette enthält, wird durch Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, in einen E. coli- Expressionswirt übertragen. Die transformierten Zellen können über Antibiotikaresistenzen selektiert werden, die durch in dem Expressionsvektor enthaltene Markergene verliehen werden.
Der transformierte E. coli-Wirt exprimiert NfM-Onconase-LL2-scFv, die in einem Einschlusskörper enthalten sein kann. Obwohl Onconase starke RNase-Aktivität besitzt, besitzt NfM-Onconase diese nicht. Dies liegt daran, dass das N-terminale Pyroglutamat der Onconase Bestandteil des aktiven Zentrums ist, wie dies durch die Kristallstruktur von Onconase gezeigt wird. Die inhärente Natur des bakteriellen Expressionssystems, die ein N-terminales Met benötigt, bedeutet, dass das bakterielle Expressionsprodukt inaktiv ist. Dies ermöglicht die rekombinante Expression von NfM-Onconase-LL2-scFv in bakteriellen Expressionssystemen. Obwohl NfM-Onconase nicht toxisch ist, kann sie auch in Form inaktiver Einschlusskörper exprimiert werden.
NfM-Onconase kann gemäß Standardverfahren, einschließlich Ammoniumsulfatfällung, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie und Gelelektrophorese, isoliert und gereinigt werden. Weitgehend reine Zusammensetzungen mit wenigstens etwa 90–95% Homogenität und vorzugsweise mit 98–99% Homogenität, sind bevorzugt.
Nach der Reinigung der NfM-Onconase und der erneuten Faltung des Moleküls, wenn dieses in einem Einschlusskörper exprimiert wurde, wird das N-Formyl-Methionin durch Verdau mit Aminopeptidase entfernt. Eine geeignete Aminopeptidase ist Aeromonas-Aminopeptidase, wie dies von Shapiro et al., Anal. Biochem. 175: 450–461 (1988) offenbart wurde. Die Inkubation des resultierenden Produkts führt zu einer spontanen Zyklisierung des N-terminalen Glutaminrestes, um ein Molekül mit der Struktur und Funktion der nativen Onconase auszubilden.
Die rekombinant produzierte Onconase kann als Alternative oder Ergänzung zu bestehenden Toxinen verwendet werden.
Ein exemplarisches Antigen, auf das abgezielt werden kann, sind glykosylierte Zelloberflächenantigene, die auf soliden Tumoren exprimiert werden, wie etwa karzinoembryonales Antigen (CEA). CEA stellt aus verschiedenen Gründen ein attraktives Antigen-Ziel dar. Es ist ein Tumor-assoziiertes Antigen, das bei normalen Geweben fehlt oder nur schwach exprimiert wird, während es bei der großen Mehrzahl von Karzinomen, die ihren Ursprung in der Brust, dem Dickdarm, der Lunge, der Bauchspeicheldrüse, den Eierstöcken und der medullären Schilddrüse haben, hochgradig exprimiert wird. Die hohen Sterblichkeitsraten in Verbindung mit suboptimalen diagnostischen und therapeutischen Optionen für diese malignen Erkrankungen resultieren in einem ernsten und andauernden öffentlichen Gesundheitsproblem. Hier ist ein Fusionsprotein von Onconase (Onconase-LL2-scFv) beschrieben, das RNase aus Rana pipiens beinhaltet.
CEA ist ein glykosyliertes Zelloberflächenprotein von etwa 180 kDa, und es ist ein Antigen solider Tumoren, das klinisch ausgedehnt untersucht wurde, sowohl als zirkulierender Tumormarker als auch als antigenes Ziel für radiomarkierte mAbs (monoklonale Antikörper) zur Bilderzeugung und Therapie. Eine Reihe von Anti-CEA-Antikörpern ist für die klinische Diagnostik in Phase I-III und in therapeutischen Studien untersucht worden. Beispielhaft für einen anti-CEA mAb ist der mAb MN14. Eine humanisierte Version dieses mAb, hMN-14, bei dem die humane konstante Region und Gerüstregion die entsprechenden Maussequenzen ersetzen, ist konstruiert und exprimiert worden und ist der bei diesen klinischen Studien verwendete mAb. Ein ^99mTc-markiertes Fab'-Fragment eines anderen, verwandten anti-CEA mAb, Immu-4, ist nützlich für die Detektion und Stadienbestimmung von Colonkrebs.
Weitere exemplarische Antigene zur Zielsteuerung beinhalten verschiedene auf B-Zellen beschränkte CD-Antigene (CD: Differenzierungscluster, Clusters of Differentiation), einschließlich CD19 bis CD22, CD37 und HLA-DR. Bevorzugte Antigene sind CD20, das mit einer hohen Antigendichte bei einem breiten Spektrum maligner B-Zell-Erkrankungen exprimiert wird, von akuter lymphozytärer Leukämie (ALL) bis zu den stärker differenzierten B-Zell- (B-CLL) und Nicht-Hodgkin-Lymphomen (NHL) und sogar bis zu Haarzellleukämie (HCL), sowie CD22, ein effizient internalisierendes Antigen, das mit praktisch allen Nicht-Hodgkin-Lymphomen assoziiert ist.
Ein Antikörper, um Onconase zu Nicht-Hodgkin-Lymphomen zu lenken, ist LL2 (IgG2a/kappa), ein muriner monoklonaler Antikörper. Die Ergebnisse zeigen, dass LL2 nach der Bindung an die Zelloberfläche rasch internalisiert wird, wobei dimeres IgG oder F(ab')₂ eine größere Geschwindigkeit zeigen als monomeres Fab'. Der Antikörper scheint hauptsächlich in Lysosomen abgebaut zu werden, da sein Abbau in Gegenwart von Lysosomen-Inhibitoren, wie etwa Ammoniumchlorid oder Leupeptin, signifikant inhibiert wird.
Die VK- und VH-Sequenzen von LL2 können mittels PCR-Amplifikation unter Verwendung des von Orlandi et al., PNAS, 86: 3833 (1989) beschriebenen Verfahrens und der dort beschriebenen Primer kloniert werden.
Geeignete Antikörper-Fragmente für diese Antigene beinhalten F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, Fv und dergleichen, einschließlich Hybridfragmenten. Ebenfalls nutzbar sind alle Subfragmente, die die hypervariable, Antigen-bindende Region eines Immunglobulins beibehalten, einschließlich genetisch hergestellter und/oder rekombinanter Proteine, egal ob einzelkettig oder mehrkettig, in die eine Antigen-Bindestelle einbezogen ist, und die ansonsten in vivo im wesentlichen in der gleichen Weise wie natürliche Immunglobulinfragmente als zielsteuernde Gruppierungen fungieren.
Einzelkettige Bindemoleküle sind in dem US-Patent 4,946,778 offenbart. Fab'-Antikörperfragmente können praktischer Weise durch reduktive Spaltung von F(ab')₂-Fragmenten hergestellt werden, die ihrerseits durch den Pepsinverdau von intaktem Immunglobulin erzeugt werden können. Fab-Antikörperfragmente können durch den Papainverdau von intaktem Immunglobulin unter reduzierenden Bedingungen erhalten werden, oder durch die Spaltung von F(ab)₂-Fragmenten, die aus einem vorsichtigen Papainverdau von ganzem Ig resultieren. Die Fragmente können auch mittels Gentechnik hergestellt werden.
Zytokin-Rezeptoren, wie etwa IL-1R, IL-2R, IL-4R, IL-6R, IL-7R, IL-9R, IL-13R und IL-15R können ebenfalls durch zielsteuernde Gruppierungen angesteuert werden. Bei einer Ausführungsform können Zytokin-Rezeptoren zu der Oberfläche von Zellen gesteuert werden, denen normalerweise solche Rezeptoren fehlen, und zwar durch die Verwendung von mAb-Rezeptor-Konjugaten, wie dies in der ebenfalls anhängigen Anmeldung mit der Seriennummer 08/949,758, eingereicht am 14. Oktober 1997, beschrieben ist. Rezeptoren für Wachstumsfaktoren wie Insulin und epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) können ebenfalls verwendet werden, um rOnconase zu einem bestimmten Zelltyp zu lenken.
Fusionsproteine, einschließlich der Rana pipiens RNase-LL2-scFv gemäß der Erfindung, können rekombinant hergestellt werden, indem man die gleiche basale Methodik, wie oben beschrieben, verwendet. Beispielsweise kann cDNA, die für NfM-Onconase codiert, in ein Plasmid inseriert werden, das außerdem cDNA enthält, die für ein einzelkettiges Antikörperfragment (scFv) codiert. Da der N-terminale Pyroglutamylrest essentiell für die RNase und die zytotoxische Aktivität der Onconase ist, wird die NfM-Onconase-cDNA so inseriert, dass das Expressionsprodukt [NfM-Onconase]-[scFv] ist. Die rekombinant erzeugten Fusionsproteine können gereinigt, das N-Formyl-Methionin kann entfernt, und der endständige Glutaminylrest kann zyklisiert werden, um Pyroglutamat gemäß der obigen Beschreibung für die rekombinant hergestellte Onconase zu erzeugen.
Die rekombinant hergestellten Onconase-Fusionsproteine gemäß der Erfindung werden in pharmazeutische Zusammensetzungen für die Lymphom-Behandlung formuliert. In diesem Kontext umfassen die Zusammensetzungen eine Lösung des Onconase-Fusionsproteins, gelöst in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, bevorzugt in einem wässrigen Träger, wie etwa gepufferter Saline. Diese Lösungen sind steril und können Hilfsstoffe, wie etwa Mittel zur pH-Einstellung und Puffermittel, sowie Mittel zur Einstellung der Toxizität, beinhalten.
Die Dosierung des Onconase-Moleküls (Fusionsproteins) gemäß der Erfindung beträgt etwa 0,1 bis 10 mg pro Patient pro Tag, obwohl Dosierungen von bis zu 100 mg pro Patient pro Tag verwendet werden können, insbesondere, wenn der Arzneistoff lokal und nicht in den Blutstrom verabreicht wird. Ebenso wie native Onconase wird die rekombinant hergestellte Onconase gemäß der Erfindung rasch von den Zellen internalisiert, hat Anti-Tumor-Wirkungen in vivo, und tötet bevorzugt sich rasch teilende Tumorzellen ab. Chemische Konjugate und Fusionsproteine sorgen für eine spezifischere Zielsteuerung dieser rekombinant hergestellten Onconase zu bestimmten Zellen.
Bei therapeutischen Anwendungen werden die Zusammensetzungen einem an einer Krankheit leidenden Patienten in einer zytotoxischen Menge verabreicht, die als diejenige Menge definiert ist, die hinreichend ist, um die Zellen von Interesse abzutöten. Eine Menge, die dies erfolgreich realisiert, wird als eine „therapeutisch wirksame Menge" definiert. Die exakte Menge wird vom Schweregrad der Erkrankung und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten abhängen.
In Abhängigkeit von der benötigten Dosierung können einzelne oder mehrfache Gaben der Zusammensetzungen verabreicht werden.
Die Onconase-Fusionsproteine gemäß der Erfindung können auch verwendet werden, um Zellpopulationen in vitro zu behandeln. Beispielsweise können diese verwendet werden, um unerwünschte Zelltypen im Knochenmark vor der Transplantation in einen Patienten, der sich der Knochenmarkbeseitigung unterzieht, selektiv abzutöten.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung, sind jedoch nicht als einschränkend zu betrachten.
Beispiel 1: Synthese von PCR-amplifizierter DNA. die für NfM-Onconase codiert
Ein 139-Mer DNA-Nukleotid, ONCO-N, mit der Sinnstrangsequenz [5'-TGG CTA ACG TTT CAG AAG AAA CAT ATC ACG AAT ACA CGA GAT GTA GAC TGG GAC AAT ATA ATG TCT ACG AAT CTG TTT CAC TGT AAG GAT AAG AAT ACC TTT ATA TAC AGT CGG CCA GAG CCT GTA AAG GCT ATC TGT A-3'], codierend für eine N-terminale Sequenz (46 Aminosäuren) der rekombinanten Onconase, wird mittels eines automatischen DNA-Synthesegeräts (Applied Biosystems 392 DNA/RNA Synthesizer) synthetisiert und als Matrize für die PCR-Amplifikation mit den flankierenden Primern ONNBACK [5'-AAG CTT CAT ATG CAG GAT TGG CTA ACG TTT CAG AAG AAA-3'] und ONNFOR [5'-CTT ACT CGC GAT AAT GCC TTT ACA GAT AGC CTT TAC AGG CTC TG-3'] verwendet. Das resultierende doppelsträngige PCR-Produkt enthält eine cDNA-Sequenz, die für 54 Aminosäurereste der N-terminalen Hälfte von Onconase codiert. ONNBACK enthält die Restriktionsstellen Hindlll (AAAGCTT) und Ndel (CATATG), um die Subklonierung entweder in einen Stufenvektor oder um eine im Leseraster erfolgende Ligation (Ndel-Stelle) in den bakteriellen Expressionsvektor zu erleichtern. Die Nrul-Stelle (TCGCGA) ist in den ONNFOR-Prmer eingebaut, um die im Leseraster erfolgende Ligation mit derjenigen cDNA zu erleichtern, die für die C-terminale Hälfte der Onconase codiert.
In entsprechender Weise wird ein 137-Mer DNA-Nukleotid, ONCO-C, mit der Sinnstrangsequenz [TGC TGA CTA CTT CCG AGT TCT ATC TGT CCG ATT GCA ATG TGA CTT CAC GGC CCT GCA AAT ATA AGC TGA AGA AAA GCA CTA ACA AAT TTT GCG TAA CTT GCG AGA ACC AGG CTC CTG TAC ATT TCG TTG GAG TCG GG-3'], das für die C-terminale Sequenz (46 Aminosäuren) von Onconase codiert, synthetisiert und einer PCR-Amplifikation mit den Primern ONCBACK [5'-ATT ATC GCG AGT AAG AAC GTG CTG ACT ACT TCC GAG TTC TAT-3'] und ONCFOR [5'-TTA GGA TCC TTA GCA GCT CCC GAC TCC AAC GAA ATG TAC-3'] unterzogen. Das fertige doppelsträngige PCR-Produkt enthält eine cDNA-Sequenz, die für die 51 Aminosäuren der restlichen C-terminalen Hälfte von Onconase codiert. Eine Nrul-Stelle erlaubt die im Leseraster erfolgende Ligation mit der N-terminalen Hälfte der PCR-amplifizierten DNA, die in ONCBACK eingebaut ist. Ein Stopcodon (kursiv und fett dargestellt) und BamHl-Restriktionsstellen (unterstrichen) für die Subklonierung in Stufenvektoren oder Expressionsvektoren wurden in die ONCFOR-Sequenz einbezogen.
Die PCR-amplifizierte DNA, die für die N-, bzw. C-terminale Hälfte von NfM-Onconase codiert, wurde, nachdem sie mit den geeigneten Restriktionsenzymen behandelt worden war, an den Nrul-Stellen verbunden und in einen Stufenvektor, z.B. pBluescript von Stratagene, subkloniert. Die ligierte Sequenz sollte für ein Polypeptid von 105 Aminosäuren und mit einem N-terminalen Met codieren.
Beispiel 2: Klonierung der LL2- und MN14-V-Regionsequenzen und Humanisierung von LL2 und MN14
Die V-Regionsequenzen von hLL2 und hMN14 sind veröffentlicht worden (Leung et al., Mol. Immunol., 32:1413 (1995); U.S. 5,874,540). Die VK- und VH-Sequenzen von LL2 und MN14 wurden unter Verwendung veröffentlichter Verfahren und Primer PCR-amplifiziert.
Die Sequenzanalyse der PCR-amplifizierten DNAs zeigte, dass diese für Proteine codierten, die typisch für Antikörper-VK- und VH-Domänen sind. Ein konstruierter chimärer Antikörper auf Basis der PCR-amplifizierten LL2- und MN14-Sequenzen zeigte eine Immunreaktivität, die vergleichbar derjenigen der Eltern-Antikörper war, was die Echtheit der erhaltenen Sequenz bestätigt.
Die Sequenzanalyse des LL2-Antikörpers zeigte die Anwesenheit einer an VK anhängenden N-verknüpften Glykosylierungsstelle in der Gerüstregion 1. Mutationsstudien zeigten, dass die Glykosylierung an der an VK anhängenden Stelle nicht benötigt wurde, um die Immunreaktivität des Antikörpers aufrechtzuerhalten. Ohne die Einbeziehung der FR-1-Glykosylierungsstelle wurden REI-Gerüstsequenzen als Gerüststruktur für die Übertragung der CDRs der leichten Kette und EU/NEWM für die Übertragung der CDRs der schweren Kette von LL2 verwendet. Für die Immunreaktivität des humanisierten LL2 (hLL2) wurde gezeigt, dass diese vergleichbar derjenigen von murinem und chimärem LL2 war. Die Internalisierungsgeschwindigkeit von LL2 wurde durch die Chimärisierung oder Humanisierung des Antikörpers nicht beeinflusst.
Beispiel 3: Konstruktion des Gens, das für das Fusionsprotein aus humanisiertem LL2 und NfM-Onconase codiert
Die VH- und VK-Sequenzen von hLL2 wurden als Matrizen verwendet, um das hLL2-scFv-Gen mittels Standard-PCR-Verfahren zusammenzusetzen. Die Anordnung des Gens war Met(-1)-VL-(GGGS)₄-VH-(His)₆. Es wurde ein Met (ATG)-Startcodon an der Position -1 am N-Terminus des VL-Gens eingebaut, das über einen 16 Aminosäuren-Linker (GGGS)₄ mit der VH-Domäne verbunden war. Ein aus 6 Histidylresten bestehender Schwanz wurde am Carboxy-Terminus der VH-Kette einbezogen, um die Reinigung des Fusionsproteins mittels Metallchelat-Chromatographie zu erleichtern.
Das Immunotoxin-Fusionsproteingen für die NfM-Onconase-hLL2scFv wurde in entsprechender Weise durch Restriktionsverdau und Ligationsverfahren konstruiert. Die cDNA-Sequenz codierte bei ihrer Expression für ein Fusionsprotein der Struktur: NfM-Onconase-[Linker]-VL-(GGGS)₄-VH-(His)₆ .
Es gibt eine Vielzahl von Linkern, die zwischen dem C-Terminus von NfM-Onconase und dem N-Terminus der VL-Domäne eingesetzt werden können. Ein bevorzugter Linker ist die Aminosäuresequenz TRHRQPRGW aus der C-terminalen Position 273–281 von Pseudomonas-Exotoxin (PE). Für diese Sequenz ist gezeigt worden, dass sie eine Erkennungsstelle für die intrazelluläre Spaltung von PE in aktive Fragmente durch Subtilisine ist, wobei die Spaltung zwischen den Resten G und W der Sequenz erfolgt (Chiron et al., J. Biol. Chem., 269: 18167 (1994)). Der Einbau dieser Sequenz erleichtert die Freisetzung von aktiver rOnconase nach der Internalisierung des Fusions-Immunotoxins. Alternativ kann ein 13 Aminosäurereste großer Abstandshalter, bestehend aus den Aminosäureresten 48–60 von Fragment B des Staphylokokken-Proteins A, eingesetzt für die Konstruktion einer EDN-scFv-Fusion, stattdessen verwendet werden, um eine flexible Verknüpfung zwischen der rOnconase und scFv zu ermöglichen (Tai et al., Biochemistry, 29: 8024 (1990) und Rybak et al., Tumor Targeting, 1: 141 (1995)).
Beispiel 4: Konstruktion des Gens, welches für das Fusionsprotein aus humanisiertem MN14 und NfM-Onconase codiert
MN14 scFv wurde mittel PCR-Amplifikation von cDNA aus humanisiertem MN14-Transfektom erzeugt. Der für MN14 scFv verwendete Linker war ein 15 Aminosäuren-Linker (GGSGS)₃, und die Orientierung war VL-Linker-VH. Nach Bestätigung der DNA-Sequenzen wurde das einkettige Konstrukt in ein geeignetes, durch Restriktion geschnittenes Expressionsplasmid, das für andere scFv verwendet wurde, subkloniert. Dieses Konstrukt wurde dann zur Expression in BL21 (λDE3) E. coli transformiert.
Es wurde außerdem ein weiteres einkettiges Konstrukt hergestellt. Dieses wurde mit der entgegengesetzten 5'-3'-Orientierung der schweren und leichten Kette in pCANTABE5E (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) zusammengebaut und in Phagen exprimiert. Die spezifische Bindung von rekombinanten Phagen, die dieses scFv exprimieren, wurde mittels ELISA gezeigt.
Die Sequenz VL-Linker-VH wurde für die Konstruktion von Onconase-MN14-Fusionsprotein verwendet, wie unten schematisch dargestellt. Das DNA-Fragment, das für Onconase codiert, wurde gemäß Beispiel 1 erhalten. Zwischen der Onconase-Sequenz und dem scFv wurde ein 23-Aminosäuren-Linker verwendet (Kurucz et al., (1995)). Alternativ wurde der (GGSGS)₃-Linker verwendet, der bei der Konstruktion des oben beschriebenen MN14-scFv eingesetzt worden war. Eine bevorzugte Anordnung dieses Fusionsproteins war: Onconase-Linker-VL-(GGSGS)₃-VH .
Beispiel 5: Expression und Reinigung von hLL2-scFv. hMN14-scFv. NfM-Onconase-hLL2-scFv-Immunotoxin und NfM-Onconase-hMN14-scFv-Immunotoxin
Ein Vektor für die Expression von hMN14-scFv und hLL2-scFv ist der kommerziell erhältliche, vom T7-Promotor angetriebene pET-Vektor (Novagen, Madison, Wl). Die DNA-Expressionsvektoren scFvhMN14-pET und scFvhLL2-pET sind von pET abgeleitet und enthalten die scFv-Sequenz für hMN14 oder hLL2 in Fusion mit PE40, das durch eine Sall/Xhol-Deletion zerstört worden war, mit einem T7-Promotor.
Die NfM-Onconase-cDNA wurde mit Ndel/BamHl verdaut und in die entsprechenden Stellen der Vektoren scFvhMN14-pET und scFvhLL2-pET kloniert, wonach die Sequenzen bestätigt wurden. Eine redundante Sequenz zwischen der BamHl-Stelle und der Eagl-Stelle in dem Expressionsvektor scFvhMN14-pET wurde durch Restriktionsverdau, Gelreinigung und erneute Ligation entfernt. Für das entfernte Fragment wurde ermittelt, dass es einen Teil von scFvMN14 und das defekte PE40-Gen enthielt. Der endgültige scFvhMN14-NfM-Onconase-Expressionsvektor wurde im Weiteren sequenziert und als rOnpET bezeichnet.
Die im großen Maßstab erfolgende Expression des rekombinanten Proteins, ausgehend von dem T7-gesteuerten rOnpET-Vektor, erfordert einen geeigneten E. coli-Wirt, wie etwa BL21, der ein λDE3-Lysogen gemäß obiger Beschreibung enthält. Der rOnpET-Vektor wurde verwendet, um kompetente BL21/λDE3-Zellen durch Elektroporation zu transformieren. Die Kolonien, die die Selektion auf Amp-Agarplatten überlebten, wurden gepickt und in einem Schüttelinkubator bei 37°C in 3 ml LB-Amp gezüchtet. Nach der Inkubation für 8–10 Stunden wurden 100 μl der Kultur auf 25 ml „Superbroth" (LB, supplementiert mit 0,5% Glukose, 1,6 mM MgSO₄ und 100 μg/ml Ampicillin) in einem 500 ml Erlenmeyerkolben übertragen, um die Belüftung beim Schütteln zu verbessern. Die Kultur wurde über Nacht in dem Schüttelinkubator bei 37°C inkubiert. Die Kultur wurde dann auf einen Liter Superbroth übertragen und in einem Schüttelinkubator bei 37°C weiter inkubiert. IPTG mit einer Endkonzentration von 1 mM wurde zu der Kultur hinzugegeben, wenn die OD₆₅₀ der Kultur 1 erreicht hatte (etwa nach 2,5 Stunden). Man ließ die Inkubation für 1–3 Stunden weiterlaufen, bevor die Kultur abgestoppt wurde, um die Einschlusskörper zu isolieren. Zehn μl der Kultur wurden unter reduzierenden Bedingungen auf einem 15% SDS-PAGE-Gel analysiert. Die Kolonien mit dem höchsten Niveau der Induktion wurden als Stammkulturen aufgehoben und gefroren bei –70°C gelagert.
Das λDE3-Lysogen trägt das induzierbare T7-RNA-Polymerase-Gen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression der T7-Polymerase durch die Zugabe von IPTG induziert wurde, und dass die exprimierte T7-Polymerase wiederum die Transkription des von T7 angetriebenen rekombinanten Proteins aktivierte. Die von dem T7-Promotor aus angetriebene Transkription war so effizient, dass das Protein im Übermaß exprimiert wurde und sich im Zytoplasma in Form von Einschlusskörpern ablagerte.
Die Isolierung der Einschlusskörper bringt die Lyse der Zellen durch Homogenisieren in Gegenwart von Lysozymen mit sich, um die Einschlusskörper als unlösliche Pellets freizusetzen. Die gewaschenen Einschlusskörper wurden in denaturierendem Puffer gelöst, der 7M an Guanidin-HCI enthielt. Die Disulfid-Bindungen wurden mittels Dithioerythritol reduziert, gefolgt von erneuter Faltung mittels tropfenweiser Verdünnung des denaturierten Proteins in Renaturierungspuffer, der Arginin-HCI und oxidiertes Glutathion enthält.
Beispiel 6: Expression und Reinigung von NfM-Onconase
Es wurde ein 6 Liter-Kultur-Äquivalent renaturierter Einschlusskörper aus Beispiel 5 gereinigt. Der geerntete Zellbrei wurde unter Verwendung einer „Tissuemizer" Spitze (Thomas, Swedesboro, NJ) in TES-Puffer (50 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl und 20 mM EDTA), enthaltend 180 μg/ml Lysozym, resuspendiert. Nach der Inkubation bei 22°C für eine Stunde wurden die Zellen wiederum suspendiert und für 50 Minuten bei 27.000 g zentrifugiert. Das Pellet wurde durch 3-4-maliges Resuspendieren und Abzentrifugieren mit TES-Puffer (enthaltend 2,5% Triton-X-100) gewaschen, und dann 4-mal mit TES. Die Einschlusskörper wurden in 5 bis 10 ml Denaturierungspuffer (7 M Guanidin-HCl, 0,1 M Tris, pH 8,0 und 5 mM EDTA) durch Ultraschallbehandlung oder Gewebeaufschluss resuspendiert und auf eine Proteinkonzentration von 10 mg/ml verdünnt.
Das Protein wurde mit Dithioerythritol (65 mM) für 4 bis 24 Stunden bei 22°C reduziert und rasch über einem schwachen Strom in Rückfaltungs-Puffer (0,1 M Tris, pH 8,0, 0,5 Arginin-HCI, 2 mM EDTA und 0,9 mM oxidiertes Glutathion) verdünnt. Nach der Inkubation bei 10°C für 36 bis 72 Stunden wurde die erneut gefaltete NfM-Onconase gegen 0,15 M Natriumacetat (pH 5) dialysiert und dann auf eine HiLoad 16/20 SP-Kationenaustauscher-FPLC-Säule geladen. Nach dem Pufferaustausch in 0,15 M Natriumacetat (pH 5) bildeten sich Präzipitate. Diese wurden mittels Zentrifugation entfernt. Es wurde eine Elution mit einem 0–1 M linearen Gradienten aus Natriumchlorid verwendet, und Fraktionen, die Extinktions-Peaks entsprachen, wurden mittels SDS-PAGE (15%) analysiert. Die meisten der Säulen-gebundenen Proteine eluierten bei 0,5 M NaCl.
Die eluierten Produkte wurden grob auf drei Fraktionen aufgeteilt. Fraktion I stellte den Hauptpeak. Die Fraktionen II und III waren relativ kleinere Peaks, die vor Fraktion I eluierten, wobei Fraktion II einen Schulter-Peak von Fraktion I darstellte.
Beispiel 7: Entfernung des Met von der NfM-Onconase und den NfM-Onconase-Fusionsproteinen
Die N-terminalen Met-Reste von NfM-Onconase, NfM-Onconase-hMN14-scFv und NfM-Onconase-hLL2-scFv wurden gemäß Shapiro et al. (1988) entfernt. 100–200 μg/ml der gereinigten und renaturierten Proteine wurden mit 0,5 μg/ml an Aeromonas proteolytica-Aminopeptidase (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) in 200 mM Natriumphosphat, pH 7,5 für 18 Stunden bei 37°C inkubiert.
Beispiel 8: Präparation der Antikörper-rOnconase-Konjugate
Es wurden Disulfid-verknüpfte Konjugate gemäß der Beschreibung von Newton et al., J. Biol. Chem., 267: 19572 (1992) (geringfügig abgewandelt) hergestellt. Der 2-Iminothiolan-modifizierte Antikörper wurde über Nacht bei 23°C mit einem 40-fachen Überschuss an rOnconase, modifiziert mit N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (SPDP) (1,1 bis 1,3 Mol SPDP/Mol rOnconase) inkubiert (siehe Rybak et al., J. Biol. Chem., 266: 21202 (1991)). Die Thioether-verknüpften Konjugate wurden gemäß Standardverfahren unter Verwendung von m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) hergestellt (Gulberg et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 139:1239 (1986)). Zwei getrennte Röhrchen mit 2 mg Antikörper wurden mit einem 5-fachen molaren Überschuss an MBS (Stammlösung, 30 mM in Dimethylformamid) für 10 Minuten bei 23°C inkubiert. Die Röhrchen wurden vereint und auf eine PD 10-Säule aufgetragen, die mit Puffer A (0,1 M NaPO₄, pH 7,5, mit 0,1 M NaCl) äquilibriert worden war. Die Peak-Fraktionen, die jeweils 1,5 ml enthielten, wurden vereint. Puffer A wurde ausgetauscht durch Puffer B (0,1 M Na-Acetat, pH 4,5, enthaltend 0,1 M NaCl), indem man eine wiederholte Konzentrierung, gefolgt von Wiederherstellung des erhaltenen Rückstandes mit Puffer B unter Verwendung von Centricon 10 Mikrokonzentratoren (Amicon) durchführte. Die SPDP-modifizierte rOnconase wurde für 30 Minuten bei 23°C mit 23 mM Dithiothreitol reduziert und einer Gelfiltration auf einer PD 10-Säule unterzogen, die mit Puffer A äquilibriert worden war. Die Peak-Fraktionen, jeweils etwa 1,5 ml, wurden zu Röhrchen hinzugegeben, die 750 μl an MBS-modifiziertem Antikörper enthielten, wonach über Nacht bei 23°C inkubiert wurde. Am nächsten Tag wurden die Konjugate mit 0,5 mM N-Ethylmaleimid (20 mM) in Dimethylformamid für wenigstens eine Stunde inkubiert, bevor die Reinigung über Größenausschluss-basierte Hochleistungsflüssigchromatographie auf einer TSK 3000 Säule (Toso Haas Corp., PA) unter Äquilibrierung und Elution mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, erfolgte. Die Fließgeschwindigkeit betrug 0,5 ml/min, und es wurden 1-Minuten-Fraktionen gesammelt. Die Peak-Fraktionen wurden vereint und mittels SDS-PAGE analysiert, um die Menge an freiem Liganden und rOnconase in den Konjugaten zu bestimmen.
Beispiel 9: In vitro-Aktivität von rOnconase und rOnconase-Immunotoxinen
Die Fähigkeit von rOnconase, die Proteinsynthese in einem Kaninchen-Retikulozyten-Lysat zu inhibieren, wurde unter Verwendung von Protokollen gemäß der Beschreibung von St. Clair et al., PNAS USA, 84: 8330 (1987) bestimmt. Alle Fraktionen wurden durch Superose 12 FPLC geleitet, bevor sie auf ihre Aktivität hin getestet wurden. Da jedoch Aminopeptidase ein Molekulargewicht von 29 kD und NfM-Onconase ein Molekulargewicht von 12 kD besitzt, konnten die beiden nicht durch Größenausschluss-Chromatographie unter Verwendung von Superose 12 FPLC getrennt werden. Nichtsdestoweniger bestätigten die Ergebnisse, dass rOnconase die Proteinsynthese inhibiert.
Native Onconase (AlfaCell), Fraktion I ohne Behandlung mit Aminopeptidase (Negativkontrolle) und die Fraktionen I, II und III, die mit Aminopeptidase (AP) bei verschiedenen molaren Konzentrationen behandelt worden waren, wurden zu dem in vitro-Translationssystem hinzugegeben. Der Einbau von ³²Met wurde nach der Inkubation des Gemischs mit oder ohne Ribonukleasen in einem Szintillationszähler gemessen, um die Proteinsyntheserate zu bestimmen. Die Proteinkonzentrationen der verschiedenen Proben wurden zur gleichen Zeit mittels BCA-Test (Pierce) unter Verwendung von BSA als Standard bestimmt.
Die Ergebnisse zeigten, dass Fraktion I (AP) und Onconase (AlfaCell) identische RNase-Aktivitäten aufwiesen. Fraktion II (AP) und Fraktion III (AP) zeigten ebenfalls RNase-Aktivität, jedoch von geringerer Stärke, was anzeigt, dass diese Fraktionen rOnconase enthalten, die sich nicht korrekt rückgefaltet hat. Die Aktivität in den Fraktionen II (AP) und III (AP) war wahrscheinlich ein Überschwappen von Fraktion I (AP). Die Fraktion I (Negativkontrolle) zeigte eine wesentlich niedrigere Aktivität als Fraktion I (AP). Die Zugabe eines Überschusses an Aminopeptidase zu dem Translationssystem änderte die Ergebnisse nicht, was zeigt, dass die niedrigere Aktivität von Fraktion Iim Vergleich zu Fraktion I (AP) nicht durch eine unvollständige Entfernung der Aminopeptidase nach der Entfernung des N-terminalen Met bedingt war, sondern, dass es das N-terminale Met war, das die RNase-Aktivität inhibierte.
Es wurde die Fähigkeit der rOnconase bestimmt, die Proteinsynthese von drei B-Lymphom-Zelllinien, Daudi, Raji, und CA-46, zu inhibieren; eine entsprechende Untersuchung erfolgte bei einer humanen T-Zelllinie, Hut 102. Die Zellen wurden mit Konzentrationen von 2 × 10⁵ Zellen/ml in 96-Well-Mikrotiterplatten über Nacht in geeignetem Vollmedium ausplattiert. Das Vollmedium wurde durch Serum-freies und Leucin-freies Medium ersetzt, das steigende Konzentrationen von rOnconase und rOnconase-Immunotoxin (beide rekombinant hergestellt und chemisch konjugiert) enthielt; die Inkubation erfolgte für 16 Stunden, gefolgt von einem 1-stündigen Puls mit 0,1 μCi von [¹⁴C]-Leucin. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Zellerntegeräts (Skaron) auf Glasfaserfiltern geerntet, mit Wasser gewaschen, mit Ethanol getrocknet und ausgezählt. Die zytotoxischen/zytostatischen Wirkungen auf die Zellen wurden durch ein Verfahren untersucht, das sich nur dadurch unterschied, dass ein 1-stündiger Puls mit 0,5 μCi an [³H]-Thymidin verwendet wurde.
Die Ergebnisse zeigten, dass rOnconase und rekombinant produzierte und chemisch konjugierte rOnconase-Immunotoxine alle die Proteinsynthese inhibierten (IC₅₀ von 10–100 pM) und zytotoxische/zytostatische Wirkungen bei humanen Lymphomzellen hervorriefen. Die in vitro-Zytotoxizität des Immunkonjugats wurde durch Monensin auf IC₅₀ 0,9 pM erhöht. Im Vergleich dazu waren Konjugate von LL2 entweder mit EDN (eosinophile RNase) oder pankreatischer RNase A (hpanc) erheblich weniger zytotoxisch, mit einem IC₅₀ für hLL2-EDN von 70 nM und dem von hLL2-hPanc von über 50 nM. Die Zytotoxizität der LL2-Konjugate im Bezug auf ihre Proteinbestandteile ist in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1
Die Konjugate von hLL2-rOnconase zeigen ähnliche Ergebnisse mit einem IC₅₀ von 400–500 pM, wenn sie auf Daudi-Zellen getestet wurden.
Beispiel 10: In vivo-Aktivität von rOnconase und rOnconase-Immunotoxinen
SCID-Mäuse mit minimaler Erkrankung und mit stärker fortgeschrittenem Daudi-Lymphom wurden mit LL2-rOnconase (100 μg QD x5) behandelt. Die Mäuse zeigten eine verlängerte Lebensspanne von 216% bzw. 135%.

Claims

Rekombinant exprimiertes Fusionsprotein, das ein Molekül umfaßt, welches die Sequenz von RNase von Rana pipiens aufweist, das mit dem Aminoterminus der leichten Kette eines Einzelkettenantikörperfragments (scFv) fusioniert ist, wobei das RNase-Molekül Pyroglutamat als den N-terminalen Rest aufweist und das scFv ein LL2-scFv ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 1, welches die Struktur RNase-Linker-VL-Linker-VH aufweist.
Fusionsprotein nach Anspruch 2, wobei das LL2-scFv humanisiert ist.
Zusammensetzung, die ein Fusionsprotein nach einem der vorangegangenen Ansprüche und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
Verwendung eines rekombinant exprimierten Fusionsproteins nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Lymphom.