DE69827507T2

DE69827507T2 - Trimerisierendes modul

Info

Publication number: DE69827507T2
Application number: DE69827507T
Authority: DE
Inventors: Hans Christian Thoegersen; Michael Etzerodt; Thor Las Holtet; Niels Jonas Heilskov Graversen; Jette Sandholm Kastrup; Bettina Bryde Nielsen; Ingrid Kjoeller Larsen
Original assignee: Roche Bio Denmark AS
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Bird Rock Bio Inc
Priority date: 1997-06-11
Filing date: 1998-06-11
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2018-06-12
Also published as: PT1012280E; CA2304254A1; US20100003719A1; EP1012280B1; ES2231991T3; US7642044B2; ATE282092T1; US8192953B2; CA2304254C; US20070154901A1; DE69827507D1; US8318679B2; AU7906598A; WO1998056906A1; AU736707B2; US20100022756A1; EP1012280A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Design trimerer Polypeptide unter Verwendung von von der Tetranektin-Proteinfamilie stammenden Polypeptidstrukturelementen und deren Verwendung beim rationalen de-novo-Design und bei der Herstellung multifunktionaler Moleküle einschließlich der Verwendung multifunktionaler Moleküle bei der Proteinbank-Technologie wie der Phagen-Display-Technologie, in diagnostischen und therapeutischen Systemen wie der Gentherapie beim Menschen und bildgebende Verfahren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Tetranektin ist ein Ca²⁺ bindendes trimeres C-Typ-Lektin, das im Blutplasma und der extrazellulären Matrix bestimmter Gewebe vorliegt. Die Tetranektin-Proteingruppe umfasst aus dem Menschen und der Maus isoliertes Tetranektin und die sehr nah verwandten, aus dem Knorpel von Rindern (Neame und Boynton, Datenbankzugangsnummer PATCHX:u22298) und aus dem Riffhai („reef shark") isolierten C-Typ-Lektinhomologen (Neame et al., 1992, Neame et al., 1996 und Datenbankzugangsnummer p26258 und PIR2:A37289).
Die reife Tetranektin-Polypeptidkette mit 181 Aminosäureresten wird in drei Exons codiert, wie durch die molekulare Clonierung und Charakterisierung des Gens gezeigt wurde (Berglund & Petersen, 1992; Wewer & Albrechtsen, 1992). Exon 3 des menschlichen Tetranektingens codiert eine separate funktionale und strukturelle Einheit, eine einzelne, langförmige sogenannte Kohlenhydrat-Erkennungsdomäne (CRD) mit drei Intraketten-Disulfidbrücken. Man geht davon aus, dass die Tetranektin-CRD zu einer unterschiedlichen Klasse der C-Typ-Lektine gehört (Day, 1994), die aufgrund von Sequenzhomologie, Konservierung der Disulfidtopologie (Fuhlendorff et al, 1987) und dadurch, dass eine fast konservierte Abfolge von Aminosäureresten, von denen bekannt ist, dass sie an der Bindung von Calciumionen beteiligt sind, mit den C-Typ-Lektinen eindeutig verwandt sind. Auf einem veröffentlichten Poster (Holtet et al. 1996) wurde vorgeschlagen, dass Tetranektin ein Trimer ist und dass die Trimerisierung von dem von Exon 1 codierten Peptid reguliert wird. Es wurde vorgeschlagen, dass das von Exon 1 codierte Peptid „notwendig und ausreichend ist, um die Trimerisierung zu regulieren", während für das Exon-2 codierte Peptid 2 „eine Beteiligung an der Lysin-sensitiven Bindung an Plasminogen" vorgeschlagen wurde.
Tetranektin wurde zuerst als eine Plasmaprotein, das an Plasminogen durch die Bindung an die Kringle-4-Domäne von Plasminogen bindet, identifiziert. Jüngste unveröffentlichte Ergebnisse (Graversen et al., Manuskript für PNAS) beweisen, dass (1) die an der Bindung an Plasminogen beteiligte Stelle im Tetranektin ganz in der CRD-Domäne liegt (codiert von Exon 3), dass (2) die Bindung Calcium-sensitiv ist und dass (3) die Kringle-4-Bindungstelle im Tetranektin mit der vermeintlichen Kohlenhydratbindungsstelle der CRD-Domäne überlappt. Somit gibt es nun den überraschenden definitiven Beweis, dass die TN-Exons 1 und 2, d.h. die trimerisierende Einheit in TN, keine Plasminogen bindende Affinität aufweist. Folglich wird von keinem künstlichen Protein, das eine TTSE-Einheit als Teil seiner Architektur enthält, erwartet, dass es mit Plasminogen oder Plasmin aufgrund der von Tetranektin ererbten Eigenschaften interagiert.
Es wurde auch über Tetranektin berichtet, dass es an sulfatierte Polysaccharide wie Heparin bindet (Clemmensen (1989) Scand J. Clin. Lab. Invest. Bd. 49: 719–725). Wir haben neue Ergebnisse, die zeigen, dass die CRD-Domänen von Tetranektin nicht an dieser Protein-Polysaccharid-Interaktion beteiligt sind. Tatsächlich befindet sich die Stelle im Tetranektin im N-terminalen Bereich von Exon 1 und kann durch Entfernen oder Mutagenese von N-terminalen Lysinresten aufgehoben werden (Graversen et al., Manuskript), Vorgänge, die die Trimerisierung nicht hemmen. TTSE, die das meiste oder das gesamte TN-Exon 1 einschließen, verleihen jeglichem konstruierten Protein, das ein derartiges TTSE als Teil seiner Struktur umfasst, eine Affinität für sulfatierte Polysaccharide. Auf Wunsch kann jedoch diese Affinität durch N-terminale Verkürzung oder Mutagenese von Lysinresten in dem Teil des TTSE verringert oder aufgehoben werden, der den 8–10 N-terminalen Aminosäureresten von Exon 1 entspricht (Graversen et al., unveröffentlicht).
Im Hinblick auf die Gentherapie, die ebenfalls im Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung liegt, gibt es nur eine begrenzte Anzahl an Grundstrategien für die Gentherapie, die bisher in präklinischen Modellen recht vielversprechend waren. Die beiden Hauptstrategien z.B. für die Behandlung maligner Tumoren sind die Cytokingen unterstütze Tumorimpfung und die selektive Prodrugaktivierung. Während sich die erste Strategie auf den starken immunstimulatorischen Effekt einer relativ kleinen Anzahl genetisch modifizierter cytotoxischer T-Zellen oder Tumorzellen verlässt, beruht die zweite auf der Umwandlung eines nicht toxischen Prodrugs in ein toxisches Produkt durch ein Enzym codierendes Gen, wobei die toxische Wirkung auch auf nicht transduzierte teilende Tumorzellen aufgrund eines sogenannten Bystandereffekts ausgeübt wird. Alternativ kann man sich Strategien vorstellen, bei denen der maligne Phänotyp einer Zelle entweder durch Inaktivierung eines Onkogens oder Reetablierung eines inaktivierten Tumorsuppressorgens umgekehrt wird. In beiden Fällen ist ein hoch effizienter Gentransfer zu den Zellen in einem Tumor erforderlich. Obwohl unter bestimmten Umständen eine hohe Effizienz des Gentransfers in vitro und sogar in vivo erzielt werden kann, ist es unwahrscheinlich, dass die Korrektur des malignen Phänotyps, indem die wesentliche Änderung der Onkogene in den Tumorzellen umgekehrt wird, zu normalen Zellen führt. Somit wäre die selektive Induktion des Tumorzelltods durch Verwendung der vorliegenden Erfindung zu bevorzugen und die Entwicklung von Verfahren, die eine derartige Induktion ermöglichen, ist äußerst wichtig.
Ein Hauptproblem in Verbindung mit der Gentherapie ist der Einbau von Fremdmaterial in das Genom. Viren waren jedoch nur teilweise bei der Überwindung dieses Problems erfolgreich. Deshalb richten sich die anfänglichen Anstrengungen bei der Gentherapie immer noch auf die gentechnische Herstellung von Viren, so dass sie als Vektoren verwendet werden könnten, um therapeutische Gene in die Patienten zu transferieren. Bei dem noch sehr unausgereiften in-vivo-Verfahren der somatischen Gentherapie; bei der ein Vektor direkt in den Blutkreislauf oder besonders bevorzugt durch den Transport über die Schleimhaut injiziert werden könnte, könnte die vorliegende Erfindung aufgrund der überraschenden Anzahl von Arten, wie die Gentherapie angegangen werden kann, verwendet werden.
Wahrscheinlich wird bei vielen zukünftigen Gentherapieanwendungen ein synthetisches Hybridsystem verwendet, das gentechnisch hergestellte Viruskomponenten für die zielspezifische Bindung und den Eintritt in den Kern, immunsuppressive Gene aus verschiedenen Viren und einen Mechanismus verwendet, der ortspezifische Integration erlaubt, indem möglicherweise AAV-Sequenzen oder ein gentechnisch hergestelltes retrovirales Integraseprotein verwendet werden. Zusätzlich werden regulatorische Sequenzen aus der Zielzelle selbst verwendet, um die physiologische Expressionskontrolle der eingebauten Gene zuzulassen. Alle diese Komponenten würden in vitro in einer liposomenartigen Formulierung zusammengesetzt werden, wobei zusätzliche Maßnahmen ergriffen werden, um die Immunogenität, wie durch die Verdeckung durch PEG, zu verringern.
Wie erwähnt, ist eines der aktuellen Probleme bei der Gentherapie der effiziente Transfer von Nucleinsäuren zu so vielen spezifischen Zellpopulationen im Körper wie möglich, und es ist oft nicht möglich z.B. einen geeigneten Virusvektor zu finden, der eine bestimmte Zellpopulation effizient und selektiv findet (Review on aspects of gene therapy: Schaper, W & Ito, W.D. Current Opinion in Biotechnology, 1996, Bd. 7, 635–640. Nature Biotechnology, 1998, Bd. 16 ist ein ganzer Band, der sich dem Protein- und Gentransfer widmet).
Vorausgesetzt, es gibt die Möglichkeit der in-vitro-Erzeugung eines menschlichen Antikörpers gegen praktisch jedes Zielantigen durch Phagentechologie, dann folgt daraus, dass TTSE, bei denen eine der Untereinheiten mit einer membranintegrierenden oder -assoziierenden Einheit modifiziert wird, als praktisches Werkzeug zur Erzeugung eines viralen, bakteriellen oder vorzugsweise künstlich zusammenfügten Lipomvehikels verwendet werden können, das den selektiven Transfer des enthaltenen Materials durch Infektion oder Transfektion jeder Zellpopulation zulässt, für die ein derartiger spezifischer Antikörper erzeugt werden kann. Zudem können Vehikel unter Verwendung von TTSE durch Selektion Patienten spezifischer Antikörper oder durch Zusammenfügen von TTSE-Einheiten, die mit scFvs konjugiert sind, individualisiert werden, die aus einer Ansammlung von Antikörpern ausgewählt werden, die durch besondere Krankheitsmarker selektiert werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die hier genannten Erfinder haben überraschend herausgefunden, dass das menschliche Tetranektin-Polypeptid (und Derivate davon) sehr stabile Trimere bilden kann, die viele vorteilhafte Merkmale und Verwendungsmöglichkeiten besitzen. Bemerkenswerterweise schließt das Tetranektin-Molekül ein trimerisierendes Strukturelement ein, das als Träger anderer chemischer Einheiten verwendet werden kann, und dadurch wird ein Trägermolekül von einer bisher nicht gesehenen Vielseitigkeit bereitgestellt.
Früher veröffentlichtes Wissen auf dem Gebiet der Bereitstellung von trimerisierenden Polypeptiden der Wahl schließt die Offenbarung in WO 95/31540 von Hoppe und Reid ein, die ein trimerisierendes Modul, das aus gewundenen Knäuelstrukturen des Collectins besteht, und dessen Anwendung bei der Herstellung von künstlich trimerisierten Proteinen beschreibt. Mehrere interessante Anwendungsbereiche sind jener Patenveröffentlichung und der vorliegenden Offenbarung gemeinsam. Jedoch unterscheiden sich die Eigenschaften der trimerisierenden Module, die von der Tetranektin-Familie stammen, wie hier offenbart, in vielerlei Hinsicht merklich in der fundamentalen Architektur und repräsentieren erstaunlich verbesserte Eigenschaften im Vergleich zur trimerisierenden Collectin-Einheit:

(1) Obwohl die räumlichen Strukturen beider trimerisierenden Module auf einer oberflächlichen Ebene insofern ähnlich erscheinen, dass. beide ternäre gewundene Knäuelstrukturen mit einer ungefähr äquivalenten räumlichen Größe sind, unterscheidet sich die strukturelle Basis zur Annahme dieser räumlichen Konfiguration bei den beiden Proteingruppen merklich. Tatsächlich unterscheidet sie sich so stark, dass man vor der Arbeit von Holtet et al. über die Vernetzung von menschlichem Tetranektin (Holtet et al., 1996) allgemein glaubte, dass diese Proteinfamilie aus Tetrameren bestand (deshalb der Name). Folglich stimmen die Sequenzen der Trimerisierungsmodule der Tetranektin-Familie nicht mit dem erklärten gemeinsamen Motiv überein, das für die Collectin-Familie beschrieben wurde (WO 95/31540, Seite 8).
(2) Die thermische Stabilität des trimerisierenden Tetranektin-Moduls (wie in den Beispielen dargestellt) ist so, dass man zeigen kann, dass das Trimer sogar bei etwa 60°C (Beispiel 4, trimerisiertes Tetranektin) oder bei etwa 70°C (Beispiel 3, trimerisiertes Ubiquitin) existieren kann, während eine Collectin-Trimereinheit bei etwa 50–55°C zerfällt (WO 95/31540, Beispiel 1, Seite 36).
(3) Während es unsicher bleibt, ob die trimerisierende Collectin-Domäne möglicherweise eine Bindung von Fusionspartnern an die C-terminalen Enden des trimerisierenden Moduls zulässt, und während über kein Beispiel einer erfolgreichen oder beanspruchten Bindung eines Fremdproteins (außer für den GST-Fusionspartner) an den N-terminalen Bereich des trimerisierenden Collectin-Moduls berichtet wurde, zeigt die hier offenbarte Information, dass das trimerisierende Tetranektin-Modul vielseitiger ist dadurch, dass es eine Bindung von Fremdproteinen an eines der beiden sowie an beide Enden gleichzeitig zulässt (Beispiele 1–4). Das hat wichtige Konsequenzen, da das trimerisierende Tetranektin-Modul eingesetzt werden kann, um Moleküle zu konstruieren, die gleichzeitig mit zwei sperrigen Interaktionspartnern wie z.B. Zelloberflächen interagieren können (jedes Ende mit einer Bindungsvalenz von bis zu 3).
(4) Das fast völlige Fehlen des Untereinheitenaustausches zwischen Monomeren eines Trimers, das unter Verwendung der hier offenbarten trimerisierenden Tetranektin-Module trimerisiert wurde, korreliert aufgrund des ersten Hauptsatzes der Thermodynamik mit der überraschend hohen Thermostabilität des Komplexes. Es ist deshalb offensichtlich, dass die Vorteile, die der „Aufnahme-und-Misch"-Anwendung der Technologie eigen sind, wie hier offenbart, viel vorteilhafter aufgrund der viel längeren Lebensdauer genutzt werden können, die für die heterofunktionalen Produkte der vorliegenden Erfindung erwartet wird.

Die Polypeptidkonstrukte CIIH6FXTN123, H6FXTN123, H6FXTN12 und H6FXTN23, die alle Teile des Tetranektin-Moleküls umfassen, wurden früher hergestellt (vgl. z.B. WO 94/18227), aber diese Konstrukte wurden alle im Hinblick auf eine erleichterte Expression und/oder Reinigung der von Tetranektin stammenden Einheit der Konstrukte bereitgestellt. Nach bestem Wissen der Erfinder gibt es keine Veröffentlichungen, in denen über irgendeine Verwendung von Tetranektin-Derivaten als „Baublöcke" berichtet wird, an die andere chemische Einheiten vorteilhaft gekoppelt werden könnten.
Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung in ihrem umfassensten Aspekt auf ein monomeres Polypeptidkonstrukt, das mindestens ein trimerisierendes Tetranektin-Strukturelement (nachstehend als TTSE bezeichnet) umfasst, das an mindestens eine heterologe Einheit covalent gebunden ist, wobei das TTSE einen stabilen Komplex mit zwei anderen TTSE bilden kann, unter der Bedingung, dass sich die heterologe Einheit von jedem der Fusionsproteine CIIH6FXTN123, H6FXTN123, H6FXTN12 und H6FXTN23 unterscheidet, deren Sequenzen in den SEQ ID NR 24-27 dargestellt werden. Es wird bevorzugt, dass die heterologe Einheit eine ist, die nicht ausschließlich die Expression und/oder Reinigung des monomeren Polypeptidkonstrukts ermöglicht.
Die Erfindung betrifft ferner oligomere Moleküle, die mindestens zwei derartige monomere Polypeptidkonstrukte umfassen, und die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung der monomeren Polypeptidkonstrukte und der Oligomere. Die Erfindung betrifft ferner einen Kit, der monomere Polypeptidkonstrukte in getrennten Verpackungen umfasst, die gebrauchsfertig in einem „Aufnahme-und-Misch"-Ansatz zur Verwendung der Monomere sind. Dieser Aufnahme-und-Misch-Ansatz soll sowohl therapeutisch als auch diagnostisch eingesetzt werden, z.B. bei einem Tumor mit einem bekannten und spezifischen Epitop, für den ein Antikörper zur Verfügung steht. Der Kit kann dann ein erstes, an einen relevanten Antikörper konjugiertes TTSE und eine zweite Komponente umfassen, die das an eine bildgebende Verbindung gekoppelte TTSE umfasst. In einer zweiten Ausführungsform kann die zweite Komponente ein Arzneistoff oder ein Prodrug umfassen, das für die Behandlung des Tumors relevant ist. In einer noch weiteren Ausführungsform gibt es eine dritte TTSE-Komponente, die eine überwachende Verbindung ist, z.B. den Fortschritt bei der Lenkung zum Ziel zeigt.
Wie aus dieser Veranschaulichung deutlich hervorgeht, betrifft die vorliegende Erfindung zahlreiche Kombinationen, die ein individuelles Design für sehr viele Umstände zulässt.
Schließlich betrifft die Erfindung auch Fragmente, die Nucleinsäuresequenzen umfassen, die die monomere Polypeptidkonstrukte codieren, sowie Vektoren und Zellen, die diese Nucleinsäurefragmente enthalten.
LEGENDEN ZU DEN FIGUREN
1: Aminosäuresequenz des aminoterminalen Bereiches von Tetranektin.
Aminosäuresequenz (im Ein-Buchstaben-Code) von E1 bis L51 von Tetranektin (SEQ ID NR: 7). Exon 1 umfasst die Reste E1 bis D16 bzw. Exon 2 die Reste V17 bis V49. Die alpha-Helix erstreckt sich von L51 bis K52, das den C-terminalen Aminosäurerest in der alpha-Helix ausmacht.
2: Ausrichtung der Aminosäuresequenzen des trimerisierenden Strukturelements der Tetranektin-Proteinfamilie. Aminosäuresequenzen (Ein-Buchstaben-Code), die dem Rest V 17 bis K52 entsprechen, umfassend Exon 2 und die ersten drei Reste von Exon 3 des menschlichen Tetranektins (SEQ ID NR: 7); Maus-Tetranektin (Sørensen et al., Gene 152: 243–245, 1995); aus Riffhai-Knorpel isoliertes zu Tetranektin homologes Protein (Neame und Boynton, 1992, 1996) und aus Rinderknorpel isoliertes zu Tetranektin homologes Protein (Neame und Boynton, Datenbankzugangsnummer PATCHX:u22298). Die Reste an den a- und d-Positionen in den Heptad-Wiederholungen sind fettgedruckt aufgeführt. Die aufgeführte Konsensussequenz des trimerisierenden Strukturelements der Tetranektin-Proteinfamilie umfasst die Reste, die an den a- und d-Positionen in den Heptad-Wiederholungen vorliegen, die in der Figur zusätzlich zu den anderen konservierten Resten des Bereiches dargestellt sind. „hy" bezeichnet einen aliphatischen hydrophoben Rest.
3: Konstruktion der Expressionsplasmide pTH6FXtripa und pTH6FXtripb.
Die amplifizierten DNA-Fragmente tripa und tripb, die die Tetranektin-Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 7) von E1 bis T48 bzw. E1 bis K52 tragen und am 5'-Ende mit Nucleotidsequenzen fusioniert sind, die eine FX_a-Schnittstelle IQGR (SEQ ID NR: 4) und die Erkennungsstellen für die Restriktionsendonucleasen BglII und KpnI codieren, wurden mit den Restriktionsenzymen BcII und HindIII gespalten und in die BamHI- und HindIII-Schnittstellen des Expressionsplasmids pT7H6 (Christensen et al., 1991) unter Verwendung von Standardverfahren ligiert.
4: Vorhergesagte Aminosäuresequenz der Fusionsproteine H6FXtripa (SEQ ID NR: 28) und H6FXtripb (SEQ ID NR: 29), die von den Expressionsplasmiden pTH6FXtripa bzw. pTH6FXtripb codiert werden.
5: Konstruktion der Expressionsplasmide pTH6FXTN123 und pTCIIH6FXTN123.
Das amplifizierte DNA-Fragment, das dem reifen Tetranektin-Monomer mit der gesamten Länge (SEQ ID NR: 7) von E1 bis V181 entspricht und am 5'-Ende mit Nucleotidsequenzen fusioniert ist, die eine FX_a-Schnittstelle IEGR (SEQ ID NR: 10) codieren, wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII gespalten und in die entsprechenden Schnittstellen der Expressionsplasmide pT7H6 (Christensen et al., 1991) und pTCIIH6 unter Verwendung von Standardverfahren ligiert. pTCIIH6 stammte von pT7H6 durch Substitution des NdeI-HindIII-Fragments von pT7H6 mit dem NdeI-HindIII-Fragment von pLcII (Nagai und Thøgersen, 1987), das die ersten 32 Reste des Lambda cII-Proteins MVRANKRNEALRIESALLNKIAMLGTEKTAEG (SEQ ID NR: 11) codiert, das am 3'-Ende mit einer Nucleotidsequenz fusioniert ist, die die H6-Sequenz GSHHHHHHGS (SEQ ID NR: 12) codiert.
6: Vorhergesagte Aminosäuresequenz der Fusionsproteine H6FXTN123 (SEQ ID NR: 25) und CIIH6FXTN123 (SEQ ID NR: 24), die von den Expressionsplasmiden pTH6FXTN123 bzw. pTCIIH6FXTN123 codiert werden.
7: Konstruktion der Expressionsplasmide pTH6FXTN12, pTH6FXTN23 und pTH6FXTN3.
Die amplifizierten DNA-Fragmente, die den Tetranektin-Derivaten TN12 und TN3 von E1 bis V49 bzw. A45 bis V181 (SEQ ID NR: 7) entsprechen und die am 5'-Ende mit Nucleotidsequenzen fusioniert sind, die eine FX_a-Schnittstelle IEGR (SEQ ID NR: 10) codieren, wurden mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII gespalten und in die entsprechenden Schnittstellen des Expressionsplasmids pT7H6 (Christensen et al., 1991) unter Verwendung von Standardverfahren ligiert. Das amplifizierte DNA-Fragment, das dem Tetranektin-Derivat TN23 von V17 bis V181 (SEQ ID NR: 7) entspricht und am 5'-Ende mit Nucleotidsequenzen fusioniert ist, die eine FX_a-Schnittstelle IQGR (SEQ ID NR: 4) codieren, wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII gespalten und in die entsprechenden Schnittstellen des Expressionsplasmids pT7H6 (Christensen et al., 1991) unter Verwendung von Standardverfahren ligiert.
8: Vorhergesagte Aminosäuresequenz der Fusionsproteine H6FXTN12 (SEQ ID NR: 26), H6FXTN23 (SEQ ID NR: 27) und H6FXTN3 (SEQ ID NR: 30), die von den Expressionsplasmiden pTH6FXTN12 bzw. pTH6FXTN12 codiert werden.
9: Gelfiltrationsanalyse von TN123, TN23 und TN3. Die analytische Gelfiltration der rekombinanten Tetranektin-Derivate TN123, TN23 und TN3 erfolgte auf einer Superose 12 HR 10/30-Säule (Pharmacia, Schweden) mit einem Gesamtvolumen von 25 ml in 100 mM NaCl und 50 mM Tris-HCl, pH 8 und einer Flussrate von 0,2 ml/min. Senkrechte Balken bei den Peakmaxima identifizieren die Elutionsprofile für jedes der drei Proteine.
10: Vernetzungsanalyse von TN123 und CIIH6FXTN123. Proben mit TN123, CIIH6FXTN123 und Gemische von beiden wurden mit DMSI inkubiert und durch SDS-PAGE (12%-iges Gel) analysiert. Vor der Zugabe von DMSI wurden die Proteingemische unterschiedlich lange einem Austausch der Untereinheiten durch Inkubation bei 70°C unterzogen. Proteinmarker mit 94, 68, 43 und 30 kDa, von oben nach unten (Spur M). CIIH6FXTN123-Fusionsprotein (Spur 1). TN123 (Spur 2). DMSI behandelter CIIH6FXTN123 (Spuren 3 und 6). DMSI behandeltes TN123 (Spur 4). Identische Proben mit DMSI behandelten Gemischen mit CIIH6FXTN123 und TN123 ohne Hitzeexposition (Spuren 5 und 7) und 2,5 sec, 15 sec, 2,5 min bzw. 10 min hitzebehandelt, vor der Behandlung mit DMSI (Spuren 8–11).
11: Vernetzungsanalyse der rekombinanten Tetranektin-Derivate TN123, TN23, TN3 und H6FXTN12.
Die rekombinanten Proteine TN123, TN23, TN3, H6FXTN12 oder Gemische mit TN123 und jedem der anderen wurde durch SDS-PAGE analysiert. Proteinmarker mit 94, 68, 43, 30, 20 und 14,4 kDa, von oben nach unten (Spur M). TN123 vernetzt mit DMSI (Spur 1). TN123 und H6-rTN12 vernetzt mit DMSI ohne und mit 2-minütiger Hitzebehandlung bei 70°C. (Spuren 2 und 3). H6FXTN12 vernetzt mit DMSI (Spuren 4 und 5). Gemische mit TN123 und H6FXTN12, keine Vernetzung (Spur 6). Vernetzung von TN123 und TN23 ohne und mit 2-minütiger Hitzebehandlung bei 70°C (Spuren 7 und 8). Vernetzung von TN23 (Spur 9). Gemische mit TN123 und TN23 ohne Vernetzung (Spur 10). TN123 vernetzt mit DMSI (Spur 11). Vernetzung von TN123 und TN3 ohne und mit 2-minütiger Hitzebehandlung (Spuren 12 und 13). Vernetzung von TN3 (Spur 14). Gemische mit TN123 und TN3, keine Vernetzung (Spur 15).
12: Auf Vernetzung basierende Analyse der Hitzestabilität des Trimers.
In parallelen Experimenten wurden TN123 und das Fusionsprotein H6FXtripb-UB (SEQ ID NR: 31) mit DMSI bei verschiedenen Temperaturen vernetzt und die Proben durch SDS-PAGE analysiert. Proteinmarker mit 94, 68, 43, 30, 20 und 14,4 kDa, von oben nach unten (Spur M). TN123 ohne Vernetzung (Spur 1). TN123 15 min bei 37°C, 50°C, 60°C bzw. 70°C vernetzt mit DMSI (Spuren 2 bis 5). Das Fusionsprotein H6FXtripb-UB (SEQ ID NR: 31) ohne Vernetzung (Spur 6). H6FXtripb-UB 15 min bei 37°C, 50°C, 60°C bzw. 70°C (Spuren 7 bis 10) vernetzt mit DMSI und H6FXtripb-UB 15 min bei 70°C inkubiert. (Spur 11).
13: Konstruktion des Expressionsplasmids pTH6FXtripb-UB
Das amplifizierte DNA-Fragment, das die Nucleotidsequenz (SEQ ID NR: 16) umfasst, die die Ubiquitin-Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 19) von Q2 bis G76 codiert, wurde mit den Restriktionsenzymen BclI und HindIII gespalten und in die BamHI- und HindIII-Schnittstellen des Expressionsplasmids pT7H6FXtripb (Beispiel 1) unter Verwendung von Standardverfahren ligiert.
14: Vorhergesagte Aminosäuresequenz des Fusionsproteins H6FXtripb-UB (SEQ ID NR: 31), das vom Expressionsplasmid pTH6FXtripb-UB codiert wird.
15: Konstruktion des Expressionsplasmids pTH6FXscFV (CEA6) tripb.
Das mit dem Primerpaar SEQ ID NR: 21 und 22 amplifizierte DNA-Fragment, das die Nucleotidsequenz SEQ ID NR: 20 umfasst, die den Einzelkettenantikörper CEA6, scFV (CEA6), Aminosäuresequenz von Q1 bis A261, codiert, wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und KpnI gespalten und in die BglII- und KpnI-Schnittstellen des Expressionsplasmids pT7H6FXtripb (Beispiel 1) unter Verwendung von Standardverfahren ligiert.
16: Vorhergesagte Aminosäuresequenz des Fusionsproteins H6FXscFV(CEA6) tripb, das vom Expressionsplasmid pH6FXscFV(CEA6)tripb codiert wird.
17: Konstruktion des Expressionsplasmids pTH6FXtripbscFX(CEA6).
Das mit dem Primerpaar SEQ ID NR: 21 und 23 amplifizierte DNA-Fragment, das die Nucleotidsequenz SEQ ID NR: 20 umfasst, die den Einzelkettenantikörper CEA6, scFV (CEA6), Aminosäuresequenz von Q1 bis A261, codiert, wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII gespalten und in die BamHI- und HindIII-Schnittstellen des Expressionsplasmids pT7H6FXtripb (Beispiel 1) unter Verwendung von Standardverfahren ligiert.
18: Vorhergesagte Aminosäuresequenz des Fusionsproteins H6FXtripbscFX(CEA6), das vom Expressionsplasmid pH6FXtripbscFv(CEA6) codiert wird.
19: Konstruktion des Expressionsplasmids pTH6FXscFv(CEA6)tripbscFX(CEA6).
Das mit dem Primerpaar SEQ ID NR: 21 und 23 amplifizierte DNA-Fragment, das die Nucleotidsequenz SEQ ID NR: 20 umfasst, die den Einzelkettenantikörper CEA6, scFV (CEA6), Aminosäuresequenz von Q1 bis A261, codiert, wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII gespalten und in die BamHI und HindIII-Schnittstellen des Expressionsplasmids pT7H6FXscFv(CEA6)tripb (Beispiel 4) unter Verwendung von Standardverfahren ligiert.
20: Vorhergesagte Aminosäuresequenz des Fusionsproteins H6FXscFv(CEA6)tripbscFv(CEA6) (SEQ ID NR: 34), das vom Expressionsplasmid pH6FXscFv(CEA6)tripbscFv(CEA6) codiert wird.
21: Vernetzungsanalyse des H6FXtripbscFv(CEA6)-Fusionsproteins (SEQ ID NR: 33).
In Parallelversuchen wurden die Fusionsproteine H6FXtripbscFv(CEA6) (SEQ ID NR: 33) und TN123 30 min bei Raumtemperatur mit 0 mg/ml, 0,5 mg/ml, 1,0 mg/ml, 1,5 mg/ml bzw. 2,0 mg/ml DMSI vernetzt. Spur 1: H6FXtripbscFv(CEA6) ohne DMSI, H6FXtripbscFv(CEA6) mit 0,5 mg/ml DMSI (Spur 2), H6FXtripbscFv(CEA6) mit 1,0 mg/ml DMSI (Spur 3), H6FXtripbscFv(CEA6) mit 1,5 mg/ml DMSI (Spur 4) und H6FXtripbscFv(CEA6) mit 2,0 mg/ml DMSI (Spur 5). Proteinmarker mit 94, 68, 43, 30, 20 und 14.4 kDa, von oben nach unten (Spur M). Spur 6: TN123 ohne DMSI, TN123 mit 0,5 mg/ml DMSI (Spur 7), TN123 mit 1,0 mg/ml DMSI (Spur 8), TN123 mit 1,5 mg/ml DMSI (Spur 9) und TN123 mit 2,0 mg/ml DMSI (Spur 10).
DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Der in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendete Begriff „trimerisierendes Strukturelement" (TTSE) soll sich auf den Anteil eines Polypeptidmoleküls der Tetranektin-Familie beziehen, der für die Trimerisierung zwischen den Monomeren des Tetranektin-Polypeptids verantwortlich ist. Der Begriff soll auch die Varianten eines TTSE eines natürlich auftretenden Tetranektin-Familienmitglieds umfassen; Varianten, die in der Aminosäuresequenz modifiziert wurden, ohne sich wesentlich nachteilig auf die trimerisierenden Eigenschaften im Vergleich zu denjenigen des nativen Mitgliedmoleküls der Tetranektin-Familie auszuwirken. Spezifische Beispiele derartiger Varianten werden hier im Detail beschrieben, aber es wird im Allgemeinen bevorzugt, dass das TTSE von menschlichem Tetranektin, murinem Tetranektin, C-Typ-Lectin des Rinderknorpels oder C-Typ-Lectin des Haifischknorpels stammt. Besonders bevorzugt sind monomere Polypeptidkonstrukte, die mindestens ein TTSE einschließen, das von menschlichem Tetranektin stammt.
Die Polypeptidsequenz mit 49 Resten, die von den Exons 1 und 2 von Tetranektin (1) codiert werden, scheint einzigartig für die Tetranektin-Proteingruppe zu sein (2), da keine signifikante Sequenzhomologie mit anderen bekannten Polypeptidsequenzen festgestellt wurde. Bei der Vorbereitung für die experimentellen Untersuchungen der Architektur von Tetranektin wurde eine Sammlung rekombinanter Proteine hergestellt, wobei die Sammlung das vollständige Tetranektin, die CRD-Domäne (die etwa dem von Exon 3 codierten Polypeptid entspricht), ein Produkt, das dem Polypeptid entspricht, das von den Exons 2 + 3 codiert wird, ein Produkt, das den Exons 1 + 2 (Holtet et al., 1996; Beispiel 2) entspricht, umfasst. Wie im Detail in Beispiel 2 beschrieben, wissen wir es jetzt besser: Tetranektin ist tatsächlich ein Trimer, aber das Exon-2 codierte Polypeptid kann tatsächlich die Trimersierung selbst bewirken, da durch Beobachtung nachgewiesen wurde, dass das rekombinante, den Exons 2 + 3 entsprechende Protein tatsächlich ein Trimer in Lösung ist.
Die 3D-Strukturanalyse der Kristalle des rekombinanten Tetranektins mit der gesamten Länge (Nielsen et al., 1996; Nielsen, 1996; Larsen et al., 1996; Kastrup, 1996) hat gezeigt, dass das in Exon 2 codierte Polypeptid plus drei in Exon 3 codierte Reste eine dreifach alpha-helikale gewundene Knäuelstruktur bilden.
Aus der Kombination der Sequenz- und der Strukturdaten wird deutlich, dass die Trimerisierung in Tetranektin tatsächlich durch ein Strukturelement erzeugt wird (2), das die Aminosäurereste umfasst, die von Exon zwei und den ersten drei Resten von Exon 3 durch eine ungewöhnliche Heptad-Wiederholungssequenz codiert werden und die offensichtlich einzigartig für Tetranektin und andere Mitglieder seiner Gruppe ist: Diese Aminosäuresequenz (2) wird wie andere alpha-helikale gewundene Knäuel durch zwei Kopien Heptad-Wiederholungen (abcdefg) mit hydrophoben Resten an den a- und d-Positionen charakterisiert. Diesen beiden Heptad-Wiederholungen folgt anschließend eine ungewöhnliche dritte Kopie der Heptad-Wiederholung, wobei Glutamin 44 und Glutamin 47 nicht nur die hydrophoben Reste sowohl an der a- und d-Position ersetzen, sondern direkt an der Bildung der dreifach alpha-helikalen gewundenen Knäuelstruktur beteiligt sind. Diese Heptad-Wiederholungen werden zusätzlich von zwei halben Wiederholungen mit hydrophoben Resten an der d- bzw. a-Position flankiert.
Es ist bekannt, dass die Gegenwart der beta-verzweigten hydrophoben Reste an den a- oder d-Positionen in dem alpha-helikalen gewundenen Knäuel den Zustand der Oligomerisierung beeinflusst. Beim Tetranektin-Strukturelement liegt nur ein konserviertes Valin (Nummer 37) vor. An Sequenzposition 29 im Tetranektin scheinen keine besonderen aliphatischen Reste bevorzugt zu werden.
Zusammengefasst ist offensichtlich, dass die dreisträngige gewundene Knäuelstruktur im Tetranektin in einem hohen Ausmaß durch Interaktionen reguliert wird, die im Bezug auf jene Charakteristika unter der Gruppe der bekannten gewundenen Knäuelproteine unerwartet sind.
Die TTSE bilden überraschend stabile trimere Moleküle (Beispiele 2, 3 und 4). Die experimentellen Beobachtungen, dass (1) ein wesentlicher Teil der rekombinanten Proteine im oligomeren Zustand von trimeren Molekülen sogar bei 70°C existiert – und als diese vernetzt werden können – und (2), dass der Austausch von Monomeren zwischen verschiedenen Trimeren nur nach Exposition gegenüber erhöhten Temperaturen nachgewiesen werden kann, sind Beweis einer extrem hohen Stabilität des trimerisierenden Tetranektin-Strukturelements. Dieses Merkmal muss sich in der Aminosäuresequenz des Strukturelements widerspiegeln. Insbesondere die Gegenwart und Position der Glutamin enthaltenden Wiederholung in der Sequenzabfolge der Heptad-Wiederholungen werden zusammen mit dem Vorhandensein und der relativen Position den anderen konservierten Reste in der Konsensussequenz (2) als wichtig für die Bildung dieser stabilen trimeren Moleküle erachtet. Für die praktischsten Verwendungen sollte der Cysteinrest 50 in Serin, Threonin, Methionin oder in irgend einen anderen Aminosäurerest mutagenisiert werden, um die Bildung einer ungewollten Interketten-Disulfidbrücke zu vermeiden, die schließlich zu einer unkontrollierten Multimerisierung, Aggregation und Präzipitation eines Polypeptidprodukts führen würde, das diese Sequenz trägt.
Insbesondere im Zusammenhang mit dem Trimer stabilisierenden, Exon-1 codierten Polypeptid (Tetranektin-Reste 1 bis 16, vgl. Beispiel 2) ist das trimerisierende Tetranektin-Strukturelement ein wahrhaft autonomes Polypeptidmodul, das seine strukturelle Integrität und Neigung beibehält, einen sehr stabilen homotrimeren Komplex zu erzeugen, sei es, dass es entweder an einem oder beiden Enden an andere Proteine durch eine Peptidbrücke gebunden ist oder nicht. Diese einzigartige Eigenschaft wird in den begleitenden Beispielen dargestellt, die einen experimentellen Beweis bereitstellen, dass Polypeptidsequenzen, die von heterologen Proteinen stammen, leicht trimerisiert werden, wenn sie als Fusionsproteine an das trimerisierende Tetranektin-Strukturelement gebunden werden. Das bleibt, unabhängig davon gültig, ob die heterologen Polypeptidsequenzen aminoterminal oder carboxyterminal an das trimerisierende Element platziert werden, wobei die Bildung eines molekularen Zusammenbaus ermöglicht wird, der bis zu sechs Kopien einer bestimmten Polypeptidsequenz oder funktionale Einheiten enthält, oder die Bildung eines molekularen Zusammenbaus, der bis zu sechs verschiedene Polypeptidsequenzen enthält, von denen jede ihre individuelle funktionale Eigenschaft beiträgt.
Da drei TTSE des natürlich auftretenden menschlichen Tetranektins einen dreifach alphahelikalen gewundenen Knäuel bilden, wird bevorzugt, dass der erfindungsgemäße von den TTSE gebildete stabile Komplex auch einen dreifach helikalen gewundenen Knäuel bildet.
Die „Tetranektin-Familie" sind Polypeptide, die die in 2 dargestellte Konsensussequenz oder eine Sequenz teilen, die auf der Sequenzebene mit dieser Konsensussequenz homolog ist. Deshalb werden erfindungsgemäße monomere Polypeptidkonstrukte bevorzugt, die eine Polypeptidsequenz umfassen, die mindestens 68% Sequenzidentität mit der in 2 dargestellten Konsensussequenz zeigen, jedoch werden höhere Sequenzidentitäten wie mindestens 75%, mindestens 81%, mindestens 87% und mindestens 92% bevorzugt.
Mit dem Begriff „heterologe Einheit" ist hier jegliche chemische Einheit gemeint, die covalent an ein TTSE gebunden werden kann und an die das TTSE nicht nativ covalent gebunden ist. Deshalb kann die heterologe Einheit irgendeine im Fachgebiet bekannte covalente Partnereinheit sein, damit sie die gewünschten Bindungs-, Nachweis- oder Effektor-Eigenschaften bereitstellt. Die heterologe Einheit kann eine Liganden bindende Struktur wie ein Rezeptormolekül oder der Liganden bindende Teil eines Rezeptormoleküls, ein Antikörper, ein Antigen bindendes Antikörperfragment oder ein Molekül mit Antikörpermerkmalen wie z.B. die in EP-A-0 672 142 beschriebenen „Diakörper" sein oder andere Liganden bindende Moleküle wie Avidin oder Streptavidin oder ein Lektin; ein Toxin wie Ricin; eine nachweisbare Markierung wie ein fluoreszenzmarkiertes Molekül; ein radioaktivmarkiertes Molekül, ein enzymmarkiertes Molekül; eine in situ aktivierbare Substanz wie ein Molekül, das durch ein magnetisches Feld oder durch Strahlung induziert werden kann, so dass es radioaktiv oder chemisch aktiv ist; ein Enzym wie Peroxidase; eine radioaktive Einheit wie ein γ-, α-, β^– oder β⁺-emittierendes Molekül z.B. ein Molekül, das eines oder mehr radioaktive Isotope umfasst, ausgewählt aus ¹⁴C, ³H, ³²P, ³³P, ²⁵S, ³⁸S, ³⁶Cl, ²²Na, ²⁴Na, ⁴⁰K, ⁴²K, ⁴³K, und jegliche Isotope, die herkömmlicherweise für die Zwecke zur Vereinfachung des Nachweises von Sonden oder zum Zweck der Bereitstellung von lokalisierter Strahlung verwendet werden, um den Zelltod zu bewirken; ein Cytokin wie ein Interferon oder ein Leukotrien; PNA, ein nicht proteinartiges Polymer wie ein polymeres Alkaloid, ein Polyalkohol, ein Polysaccharid, ein Lipid und ein Polyamin; eine Photovernetzungseinheit, d.h. eine chemische Einheit, die die Vernetzung bei Photoaktivierung bewirkt; und eine Gruppe, die die Konjugation des monomeren Polypeptidkonstrukts an ein Ziel ermöglicht.
Die heterologe Einheit ist vorzugsweise covalent an das TTSE über eine Peptidbindung an den N- oder C-Terminus der TTSE-Peptidkette, über eine Peptidbindung an die Seitenkette im TTSE oder über eine Bindung an einen Cysteinrest gebunden, aber jede Art der covalenten Kopplung von heterologem Material an eine Polypeptidkette ist nützlich. Dem Fachmann sind derartige Möglichkeiten bekannt, z.B. indem er die Ausführungen von WO 95/31540 diesbezüglich liest, die hiermit durch Bezugnahme einbezogen werden.
Jedoch bezieht sich ein interessanter erfindungsgemäßer Aspekt auf ein erfindungsgemäßes monomeres Polypeptidkonstrukt, das zwei heterologe Einheiten umfasst, die über Peptidket ten an den N- bzw. C-Terminus gebunden sind. Dieser Ansatz führt zahlreiche Möglichkeiten im Hinblick auf z.B. die Bindung größerer Einheiten mit erfindungsgemäßen Oligomeren ein, indem man spezifische Aktivitäten hat, die an jedes Ende der Monomere gekoppelt sind (wie nachstehend im Detail erklärt, können die erfindungsgemäßen Oligomere auch eine Version dieses Prinzips nutzen, wobei z.B. ein N-Terminus und ein C-Teriminus eines Oligomers über Peptidbindungen an unabhängige heterologe Einheiten gebunden sind).
Im Allgemeinen wird ein Komplex zwischen zwei oder drei Monomeren auf folgende Weise beschrieben: drei Monomere besitzen ein TTSE, wobei jedes ein Trimer bildet, das als (1 + 1 + 1) bezeichnet wird, während ein Dimer, das zwischen einem Monomer mit zwei TTSE und einem Monomer mit einem TTSE gebildet wird, als (1 + 2) bezeichnet wird. Andere (unerwünschte) Trimere können natürlich gebildet werden z.B. (2 + 2 + 1), wobei zwei TTSE nicht „in Verwendung" sind, aber es wird bevorzugt, dass die erfindungsgemäßen Oligomere alle ihre zur Verfügung stehenden TTSE während der Komplexbildung verwenden. Es sollte auch angemerkt werden, dass mit dem Begriff „monomeres Polypeptidkonstrukt" eine Einzelpolypeptidkette bezeichnet werden soll, die Nicht-Peptidgruppen covalent an die Polypeptidkette gekoppelt haben kann oder nicht gekoppelt haben kann, während „dimeres Polypeptid" oder „Dimer", „trimeres Polypeptid" oder „Trimer" und „Oligomer" (d.h. ein Dimer oder Trimer) im vorliegenden Zusammenhang nicht covalente Komplexe von monomeren Polypeptidkonstrukten bezeichnen sollen. D.h. die herkömmlichen Definitionen von Monomeren und Multimeren gelten nicht in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen.
Das TTSE, wie durch Exon 2 oder die Exons 1 und 2 des menschlichen Tetranektins beispielhaft dargestellt, die vorzugsweise so modifiziert sind, so dass nur eine Heterotrimerisierung zwischen ungleichen (1 + 1 + 1) oder (1 + 2) (vgl. nachstehende Diskussion) Untereinheiten zugelassen wird, können als allgemeiner Affintitätsvermittler eingesetzt werden, der chemisch an jedes Mitglied einer Auswahl von Zielmolekülen gekoppelt werden kann. Nach einer derartigen Konjugation mit TTSE können die Zielmoleküle homo- oder heterotrimerisiert sein, wie für jegliche Anwendung gewünscht. Ein ähnlicher Einsatz der Dimerisierung, wobei als der eine Partner ein Polypeptid verwendet wird, das zwei TTSE-Sequenzen hintereinander trägt, die durch eine Linker-Sequenz mit geeigneter Länge und Eigenschaften getrennt sind, kann noch vorteilhafter sein, da in diesem Fall die absolute Kontrolle der Stöchiometrie bei der Komplexbildung möglich wäre. Somit ist eine wichtige erfindungsgemäße Ausführungsform ein erfindungsgemäßes monomeres Polypeptidkonstrukt, das 2 TTSE umfasst, die covalent durch eine Spacereinheit verbunden sind, die sowohl erlaubt, dass die 2 TTSE an der Komplexbildung teilnehmen, wobei ein drittes TTSE nicht Teil des monomeren Polypeptidkonstrukts ist, aber genauso wichtig ist die erfindungsgemäße Ausführungsform, bei der das monomere Polypeptidkonstrukt ein einziges TTSE umfasst, damit die Trimerisierung zwischen drei Monomeren zugelassen wird und deshalb der optimale Grad an Vielseitigkeit im Hinblick auf die Anzahl funktionaler Einheiten bereitgestellt wird, die leicht in einen einzelnen Komplex eingebaut werden können.
In den Ausführungsformen, bei denen zwei TTSE im selben Monomer vorliegen, wird bevorzugt, dass die Spacereinheit eine Länge und eine Konformation besitzt, die die Komplexbildung unter Einbeziehung aller beider TTSE begünstigt, die covalent durch die Spacereinheit verbunden sind. Auf diese Weise können Probleme, die aus der unerwünschten Bildung von Trimeren der Formate (2 + 1 + 1), (2 + 2 + 2) und (2 + 2 + 1) (wobei nur ein TTSE jedes Monomers an der Komplexbildung teilnimmt) entstehen, beseitigt werden. Konstruktion und Herstellung geeigneter Spacereinheiten sind aus dem Fachgebiet bekannt und werden praktisch durchgeführt, indem Fusionspolypeptide hergestellt werden, die das Format TTSE¹-Spacer-TTSE² haben, wobei die Spacereinheit ein Polypeptidfragment (häufig ein relativ inertes) ist, damit unerwünschte Reaktionen zwischen dem Spacer und der Umgebung oder den TTSE vermieden werden.
Ein typisches Szenario, bei dem eine derartige Modifizierung vorteilhaft sein kann, ist der Fall des immunologischen Nachweises, bei dem ein chemisches Konjugat eines Antikörpers mit Enzymen wie Peroxidase für in-situ-Färbezwecke im Gewebe oder bei Western-Blots verwendet wird.
Ein ähnliches und doch unterschiedliches Anwendungsbeispiel wäre der Einsatz des TTSE, um die Konjugation von z.B. alkalischer Phosphatase und einem Oligonucleotid zu vermitteln, was die in-situ-Identifizierung einer gegebenen mRNA in einer Gewebeprobe gleichzeitig mit der Identifizierung jedes anderen mRNA-Moleküls z.B. durch Verbindung eines zweiten geeigneten Oligonucleotids und eines Signal/Visualisierungsmoleküls unter Verwendung von z.B. des Biotin-Avidin/Streptavidin-Affinitätspaares zur Konjugation zulässt. Der Sinn und Zweck, dass zwei oder mehr selektive Affinitätssysteme für die Konjugation von Oligonucleotidsonden und Nachweismolekülen zur Verfügung stehen, besteht darin, dass so viele verschiedene Sequenzen gleichzeitig nachgewiesen werden können, wie Affinitätsreihen zur Verfügung stehen.
Im Hinblick auf die erforderliche Chemie, um das TTSE als konjugierendes, zur Affinität beitragendes Mittel auszunutzen, hat das Peptid, das Exon 2 entspricht, genügend Affinität für die meisten Zwecke, aber der Einbau aller oder einiger Segmente des Exon-1-Polypeptids dient einer Erhöhung der Affinität und Stabilität. Die Eigenschaften der Tetranektin-Mutanten, von denen viele der hydrophilen (z.B. Lys und Glu) Reste, die zum größten Teil außerhalb der gewundenen Knäuelstruktur liegen, durch Alanin ersetzt wurden, scheinen dem nativen Protein ähnlich zu sein, was nahe legt, dass es tatsächlich möglich ist, ohne die Stabilität der trimeren Struktur stark zu beeinflussen, alle Glu-, Asp- und Lys-Reste durch eine Kombination von Gln, Asn, Arg oder Ala zu ersetzen und dabei eine Sequenz zu erzeugen, die sich als N-terminal blockiertes synthetisches Peptid leicht in eine chemisch stabile aktive Esterkomponente, z.B. einen N-Hydroxysuccinimidester eines acetylierten Peptids, umwandeln würde, die mit jeder exponierten Lysinseitenkette in einem Zielmolekül von Interesse reagieren (und dabei daran koppeln) könnte. Eine derartige Peptidsynthese, Aktivierung und Kopplungschemie wird vom Fachmann auf dem Gebiet der Peptidchemie leicht entworfen und angewandt, so wie das tatsächlich bei jeder anderen Konjugationschemie wie der Bindung und Verwendung von photoaktivierbaren Einheiten, wie z.B. Phenylazide, der Fall ist.
Abschließend scheint es, dass die wichtigste Struktur beim nativen TTSE die in 2 dargestellte Konsensussequenz ist und dass große Variationen in der Polypeptidkette zugelassen werden können. Deshalb ist eine vorteilhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen monomeren Polypeptidkonstrukts eine, bei der mindestens ein Aminosäurerest, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus den Aminosäureresten Nr. 6, 21, 22, 24, 25, 27, 28, 31, 32, 35, 39, 41, 42 besteht, durch irgendwelche nicht helixbrechenden Aminosäurereste ersetzt wird, wobei die Nummerierung der Aminosäurereste sich auf die Aminosäurereste in SEQ ID NR: 7 bezieht. Von all diesen Resten wurde gezeigt, dass sie nicht direkt an den intermolekularen Interaktionen beteiligt sind, die den trimeren Komplex zwischen diesen drei TTSE nativer Tetranektin-Monomere stabilisieren, und man erwartet deshalb, dass diese Aminosäuren sicher durch jede Aminosäure ersetzt werden können, die keine nachteilige Wirkung auf die Helixbildung hat (insbesondere Prolin, das eine starre Krümmung in eine Polypeptidkette einführt).
Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen monomeren Polypeptidkonstrukts ist eine, die frei von jeglichen freien Amino- und/oder Carboxygruppen ist. Dies würde die Synthese eines TTSE mittels Fest- oder Flüssig-Phasen-Peptidsynthese begünstigen, da man keine Schutzgruppen während der Peptidsynthese einführen müsste.
Da man glaubt, dass die Konsensussequenz von 2 wichtig ist, und da diese Konsensussequenz die vorstehend diskutierten Heptad-Wiederholung umfasst, wird erfindungsgemäß bevorzugt, dass das TTSE eine wiederholte Heptad-Sequenz mit der Formel a-b-c-d-e-f-g (N bis C) umfasst, wobei die Reste a und d im Allgemeinen hydrophobe Aminosäuren sind. Da jedoch „a" und „d" in der Dritten der vollständigen Heptad-Sequenzen aller bekannten Mitglieder der Tetranektin-Familie aus Glutamin besteht, wird am meisten bevorzugt, dass das TTSE die Heptad-Wiederholungen 3-mal umfasst und dass in der letzten Heptad-Sequenz ein Glutaminrest auftritt, der den Resten a und d entspricht.
Da Exon 2 der nativen Mitglieder der Tetranektin-Familie die notwenigen Elemente zu enthalten scheint, um eine stabile Trimerisierung zu bewirken, wird bevorzugt, dass das monomere Polypeptidkonstrukt frei von wesentlichen Teilen von Tetranektin ist, das von Exon 3 codiert wird, und/oder wesentliche Teile von Tetranektin fehlen, das von Exon 1 codiert wird. Da jedoch Exon-1 codiertes Material das trimere native Tetranektin zu stabilisieren scheint, wird besonders bevorzugt, dass alle oder ein Teil von Exon 1 ein Teil des monomeren Polypeptidkonstrukts ist und es scheint auch vernünftig zu sein, die ersten drei von Exon 3 codierten Aminosäuren mit einzuschließen, da von diesen bekannt ist, dass sie an der Bildung von nativen dreifach alpha-helikalen gewundenen Knäuelstrukturen im menschlichen Tetranektin beteiligt sind.
Eine besonders interessante erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Möglichkeit, orientierte molekulare Zusammenlagerungen zu konstruieren, wobei sich eine oder mehrere funktionale Einheiten N-terminal des trimerisierenden Elements befinden und eine oder mehrere funktionale Einheiten sich C-terminal des Elements befinden. Derartige Konstruktionsarten können besonders dort vorteilhaft sein, wo erwünscht ist, dass in einer spezifischen molekularen Einheit eingeschlossene verschiedene funktionale Einheiten ein bestimmtes relatives Verhältnis aufweisen. Eine derartige Konstruktionsart kann zusätzlich verwendet werden, wenn eine oder mehrere funktionale Einheiten innerhalb desselben Konstrukts aus strukturellen oder funktionalen Gründen inkompatibel erscheinen. Das kann der Fall sein, wenn eine oder mehrere der funktionalen Einheiten von großen oder sperrigen Proteindomänen exprimiert werden, die aus sterischen Gründen die Bildung der trimeren molekularen Einheit aufgrund von sterischen Einschränkungen verhindern könnten.
Die Möglichkeit, bipolare Dreiwege-Fusionsproteine zu konstruieren, bei denen eine Funktionalität N-terminal zur gewundenen Knäuelstruktur positioniert ist und eine sich unterscheidende Funktionalität C-terminal positioniert ist, ist zusätzlich vorteilhaft bei Anwendungen, bei denen eine große räumliche Trennung zwischen den beiden Funktionalitäten für die optimale Funktion wünschenswert ist. Beispiele einer derartigen Anwendung sind z.B. der Einsatz von Bindungsdomänen (z.B. von Antikörpern stammende Bindungsmodule) zur Erkennung und Bindung an Bindungsstellen, die sich an oder in der Nähe von großen Strukturen wie Zellmemembranen befinden, in Fällen, bei denen es vorteilhaft ist, die Bindung des anderen Endes des trimerisierten Moleküls an ein unterschiedliches, jedoch auch sperriges Ziel zu erlauben.
Deshalb können, wie vorstehend diskutiert, die erfindungsgemäßen Oligomere verwendet werden, um z.B. sperrige Oberflächen durch das Oligomer erfindungsgemäß zu verbinden, umfassend mindestens eine heterologe Einheit, die N-terminal zum TTSE positioniert ist, und mindestens eine heterologe Einheit, die C-terminal zum TTSE positioniert ist. Die beiden heterologen Einheiten können entweder Teil desselben monomeren Polypeptidkonstrukts oder Teile von zwei getrennten monomeren Polypeptidkonstrukten sein.
Die außergewöhnlich hohe Stabilität jedes Trimers, das das trimerisierende Tetranektin-Modul enthält, unter physiologischen Puffer- und Temperaturbedingungen (d.h. kein denaturierendes Mittel, die Temperatur übersteigt nicht 40°C) in Kombination mit der Erleichterung, durch die der Austausch von monomeren Untereinheiten zwischen Trimeren durch Inkubation bei moderat erhöhter Temperatur oder in Gegenwart von denaturierenden Mitteln erfolgen kann, sorgen für eine einzigartige Gelegenheit, das trimerisierende Modul als Vehikel einzusetzen, um die Konstruktion von „Aufnahme-und-Misch"-Konjugaten zuzulassen, die aus zuvor gefertigten Sammlungen homotrimerer Moleküle hergestellt wurden. Um die Vielseitigkeit dieser Konstruktionsmöglichkeiten mittels theoretischer Beispiele darzustellen, lassen Sie uns annehmen, dass (1) eine Sammlung von 20 verschiedenen Antikörperkonstrukten (z.B. im Format eines Einzelketten-Fv), jedes mit seiner eigenen charakteristischen Bindungsspezifität, gewählt wurde und dann durch Fusion mit einem trimerisierenden Tetranektin-Modul in homotrimere Moleküle umgewandelt wurde, und lassen Sie uns auch annehmen, dass eine Reihe von 20 verschiedenen Effektormolekülen (z.B. Toxindomänen) ähnlich hergestellt und auch mit dem trimerisierenden Tetranektin-Modul konjugiert wurde. Ein Anwender, dem vorgefertigte Sammlungen von 20 verschiedenen Antikörperkonstrukten und 20 verschiedenen Toxinkonstruktn bereitgestellt werden – 40 Reagenzien insgesamt – hat dann die Gelegenheit, 400 verschiedene Toxin-Antikörperkonjugate herzustellen, einfach, indem eine erste bevorzugte Komponente aus einer Reagenzsammlung mit einem zweiten bevorzugten Reagenz aus einer anderen Sammlung gemischt wird und dann diese binäre Mischung Bedingungen unterzogen wird, d.h. sanftes Erhitzen oder Inkubation mit einem geeigneten Grad an denaturierendem Mittel, damit der Austausch der Untereinheiten zwischen allen trimeren molekularen Spezies im Gemisch erfolgt. Nach dem Untereinheitenaustauschschritt liegt das gewünschte heterobifunktionale Reagenz im Gemisch als Hauptbestandteil des Gemisches vor und kann dann als solches eingesetzt werden, um einen gegebenen Zweck zu erfüllen, oder es wird alternativ ein einfacher Reinigungsschritt angewendet, um sein bevorzugtes heterofunktionales binäres Reagenz von jeder verbleibenden monofunktionalen Trimerspezies durch einen einfachen Standardproteinreinigungsschritt zu isolieren, der leicht unter Verwendung von Standardverfahren konzipiert werden kann, die in dem Gebiet der Proteinreinigung bekannt sind.
Eine weitere Erhöhung der Vielseitigkeit der „Aufnahme-und-Misch"-Technologie kann erreicht werden, indem ein spezifischer Affinitätsreinigungsmarker bei jeder Aufstellung des trimerisierenden Moduls-Sonde/Effektor/Indikatorkonjugat miteinbezogen wird, das direkt an den Affinitätsmarker oder alternativ über einen spaltbaren Linker (ein Polypeptidsegment, das z.B. einen Faktor X_a oder eine Enterokinase-Erkennungsstelle/Spaltungsstelle beinhaltet) an den Affinitätstag fusioniert ist. Genauer gesagt, falls jede der drei Banken mit Affinitätsmarker a, b bzw. c versehen werden würde, die von den bindenden Substanzen A, B bzw. C erkannt werden würden, könnten reine Heterotrimere, die aus einem Mitglied jeder Bank bestehen, in einem dreistufigen Affinitätsreinigungsverfahren erhalten werden, das konzipiert wurde, um die selektive Gewinnung von nur solchen Trimeren zuzulassen, die Affinität für die Substanzen A und B und C zeigen. Falls aus irgendeinem Grund die nachfolgende Entfernung der Affinitätsmarker wünschenswert wäre und die Konstrukte hergestellt worden wären, um spaltbare Linker einzuschließen, könnte die Isolierung des reinen Heterotrimers, von dem alle Affinitätsmarker entfernt worden wären, durch drei weitere Affinitätsreinigungsschritte erfolgen, die so angeordnet sind, daß nur Material isoliert wird, das weder an Substanz A noch an Substanz B noch an Substanz C bindet.
Offensichtlich gilt der Anwendungsbereich des „Aufnahme-und-Misch"-Designs der durch die Verwender herstellbaren heterofunktionalen Komplexe nicht nur für die Bildung der binären Heterofunktionalität, sondern würde durch logische Erweiterung für die Erzeugung von ternärer Heterofunktionalität gelten: Um sich den Reichtum der Möglichkeiten, die dem Konzept der ternären Heterofunktionalität zu eigen sind, in einem weiteren theoretischen Beispiel zusammen mit den vorstehend gegebenen Richtlinien vorzustellen, würden drei Sätze von Reagenzsammlungen, die jeweils 20 verschiedene funktionale Merkmale umfassen, d.h. eine Sammlung von insgesamt 60 verschiedenen Homotrimeren, eine „Aufnahme-und-Misch"-Zubereitung von 8.000 trifunktionalen Molekülen zulassen.
Das trimerisierende Tetranektin-Grundmodul bildet im Wesentlichen wahllos Homo- und Heterotrimere mit jedem anderen Molekül, das auch ein trimerisierendes Modul enthält. Für einige Anwendungen kann es auch vorteilhaft sein, speziell konstruierte Derivate des trimerisierenden Tetranektin-Moduls zur Verfügung stehen zu haben, die erneut hergestellt wurden, um die Homotrimerbildung nicht zuzulassen und deshalb nur die Heterotrimerisierung zuzulassen. Deshalb wird eine wichtige Ausführungsform des erfindungsgemäßen monomeren Polypeptidkonstrukts so konstruiert/erneut hergestellt, dass die Bildung von Komplexen zwischen identischen TTSE nicht begünstigt wird; das beinhaltet auch, dass die erfindungsgemäßen Oligomere vorteilhafterweise monomere Polypeptidkonstrukte umfassen können, die so konzipiert sind, dass sie die Bildung von Trimeren, die zwei monomere Polypeptidkonstrukte mit identischen TTSE einschließen, nicht begünstigen. Ein Weg, die Bildung der Homotrimerisierung nicht zu begünstigen, wäre mittels der „Druckknopf"-Mutagenese.
Die Konstruktion/erneute Herstellung könnte durch Einführung von Aminosäuresubstitutionen an Stellen im Polypeptid erfolgen, die stark an der Bildung und Stabilität des Trimers beteiligt sind, und gleichzeitig an einem anderen Konstrukt eine ausgleichende Aminosäuresubstitution einführen, die alles in allem die Symmetrie zwischen den einzelnen monomeren Komponenten der dreifach helikalen Struktur entfernt, so dass das strukturelle Komplementaritätsprofil nur die Bildung von Heterotrimeren zulässt, jedoch mit einigen oder jedem der Homotrimerspezies inkompatibel ist.
Eine noch weitere unterschiedliche Art, das trimerisierende Tetranektin-Modul als Vehikel einzusetzen, damit die rationale Bildung der Bifunktionalisierung erfolgt, würde die Verbindung des C-Terminus eines Monomers mit dem N-Terminus eines zweiten Monomers in der dreifach helikalen Struktur erfordern. Die Grundanforderung für ein derartiges intervenierendes Polypeptid ist, dass zugelassene räumliche Abstände zwischen seinen N- und C-Termini mit dem Raum kompatibel sein müssen, der den strukturellen Anforderungen eigen ist, die durch die Architektur des trimerisierenden Tetranektin-Moduls gegeben sind. Die gemäß derartiger Kriterien erlaubte Konstruktion eines intervenierenden verbindenden Polypeptids würde von einem Fachmann auf dem Gebiet der Proteinherstellung leicht durchgeführt werden, da eine umfangreiche Sammlung von Beispielen für den Einsatz von, gewöhnlich flexiblen, Spacersequenzen sowohl in der Natur als auch in konstruierten Proteinen bekannt sind. Aufgrund des erwarteten entropischen Beitrags zur Interaktionsenergie in einem Molekül, in dem zwei der drei trimerisierenden Tetranektin-Module covalent miteinander verbunden sind, würde ein derartiges Molekül eine große Präferenz für die Auswahl jedes Moleküls zeigen, das nur eine einzige Kopie der trimerisierenden Tetranektin-Modulkomponente enthält, da diese Wahl energetisch bevorzugt würde. Deshalb würde die Konjugation einer funktionalen Proteinkomponente an eine geeignet ausgewählte, covalent dimerisierte trimerisierende Tetranektin-Modulkomponente und die Konjugation einer sich unterscheidenden funktionalen Proteinkomponente an ein Einzelkopie-Element der trimerisierenden Sequenz die bevorzugte Bildung eines bifunktionalen 1:1-Komplexes und die Suppression der Bildung jedes anderen Komplexes bereitstellen.
Die erfindungsgemäßen Monomere können durch im Fachgebiet allgemein bekannte Verfahren hergestellt werden, wobei die Verfahren der rekombinanten Proteinproduktion, der Peptidsynthese (flüssige Phase oder feste Phase) und die traditionelle chemische Kopplung heterologer Einheiten an eine Peptidkette oder spezifische Reste ausschließlich oder in Kombination verwendet werden. Deshalb betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen monomeren Polypeptidkonstrukts, wobei das Verfahren

– die Isolierung des monomeren Polypeptidkonstrukts aus einer Kultur, umfassend eine Wirtszelle, die ein Nucleinsäurefragment trägt und exprimiert, dass das monomere Polypeptidkonstrukt codiert,
– die Synthese, mittels chemischer Peptidsynthese, des monomeren Polypeptidkonstrukts und die anschließendene Isolierung des monomeren Polypeptidkonstrukts aus dem Reaktionsgemisch,
– die Herstellung eines TTSE in einer Kultur, umfassend eine Wirtszelle, die ein Nucleinsäurefragment trägt und exprimiert, dass das TTSE codiert, die anschließende covalente Bindung mindestens einer heterologen Einheit an das TTSE und die anschließende Isolierung des sich ergebenden monomeren Polypeptidkonstrukts oder
– die Synthese eines TTSE, mittels chemischer Peptidsynthese, die anschließende covalente Bindung mindestens einer heterologen Einheit an das TTSE, die anschließende Isolierung des sich ergebenden monomeren Polypeptidkonstrukts aus dem Reaktionsgemisch, umfasst und das monomere Polypeptidkonstrukt wahlweise einer weiteren Verarbeitung unterzogen wird.

Das vorstehend erwähnte Nucleinsäurefragment ist ebenfalls Teil der Erfindung und wird als Nucleinsäurefragment in isolierter Form definiert, das ein TTSE, wie hier definiert, codiert oder das den Polypeptidanteil eines erfindungsgemäßen monomeren Polypeptidkonstrukts codiert, vorausgesetzt, dass sich das Nucleinsäurefragment von einem Nucleinsäurefragment unterscheidet, das die nativen Mitglieder der Tetranektin-Familie codiert, und dass sich das Nucleinsäurefragment von einem Nucleinsäurefragment unterscheidet, das irgendeines der Fusionsproteine CIIH6FXTN123, H6FXTN123, H6FXTN12, H6FXTN23 codiert, deren Sequenzen in den SEQ ID NR: 24–27 dargestellt werden.
Die vorstehend erwähnte Wirtszelle (die ebenfalls Teil der Erfindung ist) kann durch herkömmliche gentechnische Verfahren hergestellt werden, umfassend den Einbau eines Nucleinsäurefragments (normalerweise ein DNA-Fragment), das den Polypeptidanteil des erfindungsgemäßen monomeren Polypeptidkonstrukts codiert, in einen geeigneten Expressionsvektor, die Transformation einer geeigneten Wirtszelle mit dem Vektor und Züchten der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des Polypeptidanteils des monomeren Polypeptidkonstrukts zulassen. Das Polypeptid codierende Nucleinsäurefragment kann unter die Kontrolle eines geeigneten Promotors gestellt werden, der ein induzierbarer oder konstitutiver Promotor sein kann. Abhängig vom Expressionssystem kann das Polypeptid aus der extrazellulären Phase, dem Periplasma oder aus dem Cytoplasma der Wirtszelle gewonnen werden.
Geeignete Vektorsysteme und Wirtszellen sind im Fachgebiet gut bekannt, was die große Menge an Literatur und Materialien beweist, die dem Fachmann zur Verfügung steht. Da die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragmenten bei der Konstruktion von Vektoren und in Wirtszellen betrifft, liefert das Folgende eine allgemeine Diskussion, die eine derartige Verwendung und die besonderen Betrachtungen bei der praktischen Anwendung dieses erfindungsgemäßen Aspekts betrifft.
Im Allgemeinen werden natürlich für die Erstclonierung der erfindungsgemäßen Nucleinsequenzen und die Konstruktion der in der Erfindung nützlichen Vektoren Prokaryonten bevor zugt. Beispielsweise kann man zusätzlich zu den in der nachstehenden spezifischeren Offenbarung erwähnten besonderen Stämmen, Stämme wie den E. coli-K12-Stamm 294 (ATCC Nr. 31446), E. coli B und E. coli X 1776 (ATCC Nr. 31537) erwähnen. Diese Beispiele sollen natürlich erläuternd sein und nicht einschränkend.
Man bevorzugt auch für die Expression Prokaryonten, da effiziente Reinigungs- und Proteinrückfaltungsstrategien zur Verfügung stehen. Es können die vorstehend erwähnten Stämme sowie E. coli W3110 (F-, Lambda-, prototroph, ATCC Nr. 273325), Bacilli wie Bacillus subtilis oder andere Enterobacteriaceae wie Salmonella thyphimurium oder Serratia marcesans und verschiedene Pseudomonas-Spezies verwendet werden.
Im Allgemeinen werden Plasmidvektoren, die ein Replikon und Kontrollsequenzen enthalten, die von Spezies stammen, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet. Der Vektor trägt gewöhnlich eine Replikationsstelle sowie markierende Sequenzen, die die phänotypische Selektion in transformierten Zellen bereitstellen können. Beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR322 transformiert, einem Plasmid, das von einer E. coli-Spezies stammt (vgl. z.B. Bolivar et al., 1977). Das pBR322-Plasmid enthält Gene für die Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und stellt somit einfache Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen bereit. Das pBR-Plasmid oder ein anderes mikrobielles Plasmid oder Phage müssen ebenfalls Promotoren enthalten oder modifiziert werden, um Promotoren zu enthalten, die von dem Mikroorganismus für die Expression verwendet werden können.
Jene am häufigsten bei der Konstruktion rekombinanter DNA verwendeten Promotoren schließen die β-Laktamase (Penicillinase)- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979) und ein Tryptophan-(trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., 1979; EPO Anm. Publ. Nr. 0036776) ein. Während diese am häufigsten verwendet werden, wurden andere mikrobielle Promotoren entdeckt und verwendet und Einzelheiten hinsichtlich ihrer Nucleotidsequenzen wurden veröffentlicht, was einen Fachmann befähigt, sie funktional mit Plasmidvektoren zu ligieren (Siebwenlist et al., 1980). Bestimmte Gene aus Prokaryonten können effizient in E. coli von seinen eigenen Promotorsequenzen exprimiert werden, was den Bedarf für die Anfügung anderer Promotoren durch künstliche Mittel ausschließt.
Zusätzlich zu Prokaryonten können auch eukaryontische Mikroben wie Hefekulturen verwendet werden. Saccharomyces cerevisiae oder die gewöhnliche Bäckerhefe ist unter den eukaryontischen Mikroorganismen der am häufigsten verwendete, obwohl allgemein viele andere Stämme zur Verfügung stehen. Zur Expression in Saccharomyces wird gemeinhin beispielsweise das Plasmid YRp7 verwendet (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). Dieses Plasmid enthält bereits das trpl-Gen, das einen Selektionsmarker für einen Hefemutantenstamm bereitstellt, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, 1977). Das Vorliegen der trpl-Läsion als Merkmal des Hefewirtszellengenoms stellt dann eine effektive Umgebung zum Nachweis der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan bereit.
Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren schließen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzman et al., 1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978) wie Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrokinase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofruktokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglyceromutase, Pyruvatkinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase ein. Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide werden die mit diesen Genen assoziierten Teminationssequenzen ebenfalls in den Expressionsvektor 3' der Sequenz ligiert, die exprimiert werden soll, um die Polyadenylierung der mRNA und Termination bereitzustellen.
Andere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil haben, dass die Transkription durch Wachstumsbedingungen kontrolliert wird, sind der Promotorbereich für die Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, abbauende Enzyme, die mit dem Stickstoffmetabolismus assoziiert sind, und die vorstehend erwähnte Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrokinase und für die Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlichen Enzyme. Jeglicher Plasmidvektor, der einen Hefe-kompatiblen Promotor, den Replikationsursprung und Terminationssequenzen enthält, ist geeignet.
Zusätzlich zu Mikroorganismen können auch Zellkulturen, die von multizellulären Organismen stammen, als Wirte verwendet werden. Prinzipiell funktioniert jede derartige Zellkultur, ob von Vertebraten- oder Invertebratenkultur. Jedoch war das Interesse für Vertebratenzellen am größten, und die Vermehrung der Vertebratenzellen in Kultur (Gewebekultur) wurde in den letzten Jahren zum Routineverfahren (Tissue Culture, 1973). Beispiele derartiger nützlicher Wirtszelllinien sind VERO- und HeLa-Zellen, chinesische Hamsterovarien (CHO)-Zelllinien und W138-, BHK-, COS-7-, 293- und MDCK-Zelllinien.
Expressionsvektoren für derartige Zellen schließen (gegebenenfalls) gewöhnlich einen Replikationsursprung, einen vor dem zu exprimierenden Gen befindlichen Promotor zusammen mit irgendwelchen notwendigen ribosomalen Bindungsstellen, RNA-Spleißstellen, der Polyadenylierungsstelle und Transkriptionsterminatorsequenzen ein.
Für die Verwendung in Säugerzellen werden die Kontrollfunktionen auf den Expressionsvektoren häufig durch virales Material bereitgestellt. Beispielsweise stammen die herkömmlich verwendeten Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2 und am häufigsten vom Affenvirus 40 (SV 40). Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus sind besonders nützlich, da sie beide leicht vom Virus als Fragment erhalten werden können, das auch den viralen SV40-Replikationsursprung enthält (Fiers et al., 1978). Kleinere oder größere SV40-Fragmente können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt die etwa 250 bp große Sequenz, die von der HindIII-Schnittstelle bis zur im viralen Replikationsursprung befindlichen BglI-Schnittstelle reicht, ist eingeschlossen. Ferner ist es ebenfalls möglich und häufig wünschenswert, den Promotor oder Kontrollsequenzen zu verwenden, die normalerweise mit der gewünschten Gensequenz assoziiert sind, vorausgesetzt, dass derartige Kontrollsequenzen mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
Ein Replikationsursprung kann entweder durch Konstruktion des Vektors bereitgestellt werden, um einen exogenen Ursprung einzuschließen, wie er von SV40 oder anderen Viren (z.B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV) stammen kann, oder kann durch den chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle bereitgestellt werden. Falls der Vektor in das Wirtszellenchromosom integriert ist, ist letzteres häufig ausreichend.
Bei der Herstellung der monomeren Polypeptidkonstrukte kann es notwendig sein, die Polypeptide weiter zu prozessieren, z.B. durch Einführung von nicht proteinartigen Funktionen in das Polypeptid, indem das Material geeigneten Rückfaltungsbedingungen unterzogen wird (z.B. indem die allgemein anwendbaren in WO 94/18227 vorgeschlagenen Strategien verwendet werden) oder indem unerwünschte Peptideinheiten des Monomers (z.B. expressionsverstärkende Peptidfragmente, die im Endprodukt unerwünscht sind) abgespalten werden.
Im Lichte der vorstehenden Diskussion sind die Verfahren zur rekombinanten Herstellung des erfindungsgemäßen monomeren Polypeptidkonstrukts ebenfalls Teil der Erfindung, so wie es die Vektoren sind, die die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren tragen und/oder sie in einer Wirtszelle oder Zelllinie replizieren können. Der Expressionsvektor kann erfindungsgemäß z.B. ein Plasmid, ein Cosmid, ein Minichromosom oder ein Phage sein. Besonders interessant sind Vektoren, die im Wirtszelllinien-/Zellliniengenom nach der Einführung in den Wirt integriert werden.
Ein weiterer Teil der Erfindung sind transformierte Zellen (nützlich in den vorstehend beschriebenen Verfahren), die die erfindungsgemäßen Nucleinsäurefragmente tragen und sie replizieren können; die Wirtszelle kann ein Mikroorganismus wie ein Bakterium, eine Hefe oder eine Protozoe oder eine Zelle, die von einem mehrzelligen Organismus wie einem Pilz stammt, eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle oder eine Säugerzelle sein. Besonders interessant sind Zellen von den Bakterienspezies Escherichia, Bacillus und Salmonella und ein bevorzugtes Bakterium ist E. coli.
Ein noch anderer Teil der Erfindung betrifft eine stabile Zelllinie, die den Polypeptidanteil eines monomeren Polypeptidkonstrukts erfindungsgemäß produziert, und vorzugsweise trägt die Zelllinie eine erfindungsgemäße Nucleinsäure und exprimiert sie.
Auf der Basis der vorstehenden Diskussionen ist dem Fachmann klar, dass auch die Oligomere, die auf die Komplexbildung zwischen den erfindungsgemäßen monomeren Konstrukten zurückzuführen sind, wichtige Teile der Erfindung sind. Deshalb betrifft die Erfindung ebenfalls ein Oligomer, das aus zwei erfindungsgemäßen monomeren Polypeptidkonstrukten be steht, die mindestens drei TTSE umfassen, oder aus drei erfindungsgemäßen monomeren Polypeptidkonstrukten besteht, die jeweils ein einzelnes TTSE enthalten.
Wie hier erklärt und in den Beispielen dargestellt, sind die erfindungsgemäßen Oligomere bei Temperaturen bis 70°C stabil, und deshalb wird besonders bevorzugt, dass die erfindungsgemäßen Oligomere bei Temperaturen über den physiologischen stabil sind; z.B. dass die Oligomere in einem Temperaturbereich von 50–70°C stabil sind.
Ebenfalls ein Teil der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen dimeren Oligomers, umfassend

– das Zusammenmischen eines monomeren Polypeptidkonstrukts, das zwei TTSE (Konstrukt 1) enthält, mit einem monomeren Polypeptidkonstrukt, das nur ein TTSE (Konstrukt 2) enthält
– das Bewirken der Komplexbildung der beiden TTSE von Konstrukt 1 mit dem TTSE von Konstrukt 2 (dies kann durch Wärmebehandlung erfolgen, d.h. Erhitzung auf eine Temperatur, die die Denaturierung sicherstellt, gefolgt von einer anschließenden Abkühlung, wobei die Renaturierung zugelassen wird, oder dies kann durch Denaturierung/Renaturierung erfolgen, die durch Änderungen in der chemischen Umgebung bewirkt wird) und
– das Isolieren des sich ergebenden Dimers und wahlweise das Unterwerfen des Dimers weiteren Prozessierungsschritten (vgl. die vorstehende Diskussion über weitere Prozessierungsschritte, aber es sollte auch erwähnt werden, dass die weiteren Prozessierungsschritte die nicht covalente Kopplung der interessanten und relevanten Einheiten zum dimeren Oligomer einschließen).

Folglich ist das Verfahren zur Herstellung eines trimeren Oligomers ebenfalls ein Teil der Erfindung und umfasst die Schritte

– des Zusammenmischens dreier erfindungsgemäßer monomerer Polypeptidkonstrukte miteinander,
– des Bewirkens der Komplexbildung zwischen einem TTSE von jedem monomeren Polypeptidkonstrukt und
– des Isolierens des sich ergebenden Trimers und wahlweise das Unterwerfen des Trimers weiteren Prozessierungsschritten.

Die für die Komplexbildung und weiteren Prozessierungsschritte geltenden, vorstehend erwähnten Betrachtungen gelten auch für dieses Verfahren.
Im Hinblick auf die detaillierte vorstehende Diskussion des erfindungsgemäßen „Aufnahme-und-Misch"-Aspekts betrifft auch einen Kit, umfassend

– eine erste Verpackung, die mindestens einen Behälter umfasst, wobei jeder des mindestens einen Behälters ein erfindungsgemäßes monomeres Polypeptidkonstrukt enthält,
– eine zweite Verpackung, die mindestens einen Behälter umfasst, wobei jeder des mindestens einen Behälters in der zweiten Verpackung ein erfindungsgemäßes monomeres Polypeptidkonstrukt enthält, wobei sich die zweite Verpackung von der ersten Verpackung im Hinblick auf die Wahl und/oder die Anzahl der darin eingeschlossenen monomeren Polypeptide unterscheidet und wahlweise
– eine dritte Verpackung, die mindestens einen Behälter umfasst, wobei jeder des mindestens einen Behälters in der dritten Verpackung ein erfindungsgemäßes monomeres Polypeptidkonstrukt enthält, wobei sich die dritte Verpackung von der ersten Verpackung und der zweiten Verpackung im Hinblick auf die Wahl und/oder die Anzahl der darin eingeschlossenen monomeren Polypeptide unterscheidet.

Es wird bevorzugt, dass der mindestens eine Behälter in jeder Verpackung sich gegenseitig unterscheidende monomere Polypeptidkonstrukte enthält, und es wird besonders bevorzugt, dass alle Behälter im Kit sich gegenseitig unterscheidende Polypeptidkonstrukte enthalten.
Ein sehr wichtiger erfindungsgemäßer Aspekt ist die Möglichkeit der Erzeugung eines Systems, das speziell für die individuellen Umstände konzipiert wird. Die Grundidee ist, dass die künstliche Selektion von heterologen Einheiten und fakultativ aktiven Bestandteilen und funktionalen Einheiten zu einem einzigartigen System führen, wie weiter im Folgenden offenbart wird.
Die Verwendung des TTSE als Vehikel für das Zusammenfügen monovalenter scFV- oder Fab-Antikörperfragmente in oligomere und multivalente Einheiten bieten auch Konstruktionsvorteile im Hinblick auf die Erzeugung chimärer künstlicher Antikörper mit wünschenswerten pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften. Kleine Derivate wie monomere scFv-Fragmente oder bivalente „Minikörper" werden schnell aus dem Blutkreislaufsystem entfernt, während vollständige Igs sehr viel länger verbleiben. Dagegen zeigen kleine Derivate wie scFV und Minikörper bessere Extravasationseigenschaften. Deshalb erwartet man, dass Antikörper mit einer erwünschten Spezifität für bestimmte diagnostische und therapeutische Anforderungen optimiert werden können, indem die pharmakologischen Eigenschaften unter Verwendung des TTSE als Vehikel für kontrollierte Oligomerisierung von z.B. ScFv-Fragmenten hergestellt werden.
Ein Beispiel einer derartigen Herstellung wären die Anforderungen für den Transfer einer hohen Dosis eines bildgebenden oder toxinkonjugierten Antikörpers zu einem Tumor, während man sicherstellt, daß die Exposition so niedrig wie möglich ist oder der Bildhindergrund so niedrig wie möglich ist. In einem derartigen Fall könnte ein TTSE konjugiertes scFv-Fragment konstruiert werden, um die starke multivalente Bindung an den Tumor und eine schnelle Clearance des überschüssigen Konjugats aus dem Blutkreislauf zu zeigen.
Folglich betrifft in einem weiteren Aspekt die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines monomeren Polypeptidkonstrukts oder eines Oligomers gemäß der vorliegenden Erfindung als Vehikel zum Zusammenfügen von Antikörperfragmenten in oligomere oder multivalente Einheiten zur Erzeugung chimärer künstlicher Antikörper mit vorselektierten pharmakokinetischen und/oder pharmodynamischen Eigenschaften.
Die Verwendung spezifischer Transfersysteme spielt auch eine wichtige Rolle in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung insofern, dass derartige Systeme im Hinblick auf die unterschiedliche Verwendung der vorliegenden Erfindung sowohl im Hinblick auf eine allgemeinere therapeutische Anwendung als auch im Hinblick auf die Gentherapie verwendet werden können. Beispiele geeigneter Arzneistoffabgabe- und Zielsysteme werden in Nature 392 Erg. (30. April 1998) offenbart.
Folglich kann die Effizienz des Transfers weiter erhöht werden, wenn das Transfersystem, z.B. ein Liposom, mit einer molekularen Einheit, einem „Infektor- oder Transfektor-" Liganden, versehen ist, der von einer internalisierenden Rezeptoreinheit erkannt wird, die für die Zielzellen spezifisch ist. Beispielsweise können Zellen, die endocytotische Rezeptoren zeigen, wie die Mitglieder der LDL-Rezeptorfamilie, sogar effizienter infiziert oder transfiziert werden, entweder indem eine TTSE-Einheit in dem Antikörper enthaltenden Heterotrimer oder in einer unabhängigen TTSE-Einheit eingeschlossen ist, die an eine oder mehrere Domänen des Receptor Associated Protein, RAP, (Ellgaard, L., Holtet, T. L. Nielson, P. R., Etzerodt, M., Gliemann, J. & Thøgersen, H. C. Eur. J. Biochem. 1997, Bd. 244, 554–551) konjugiert ist, das als Ligand für alle Rezeptoren in dieser umfangreichen Familie der Endocytose vermittelnden Rezeptoren erkannt wird.
Folglich ist in einem weiteren Aspekt die Erfindung auf die Verwendung eines monomeren Polypeptidkonstrukts oder eines Oligomers gemäß der vorliegenden Erfindung zur gezielten Gentherapie gerichtet, die den selektiven Transfer des Materials zur Transfektion oder Infektion der spezifischen Zellpopulation beinhaltet.
Die letzendliche Perspektive einer derartigen TTSE vermittelten Gentherapie wäre der Einsatz eines viralen Vektors, der keine anderen Ziele im Patienten außer den Zellen finden würde, die den künstlichen Rezeptorkomplex zeigen.
In einem noch weiteren Aspekt ist die Erfindung auf die Verwendung eines monomeren Polypeptidkonstrukts oder eines Oligomerkonstrukts gemäß der vorliegenden Erfindung gerichtet, wobei mindestens eine heterologe Einheit eine Einheit umfasst, die aus einer Liganden bindenden Struktur wie einem Rezeptormolekül oder dem Liganden bindenden Teil eines Rezeptormoleküls ausgewählt wird, und wobei die Gentherapie den Transfer von Nucleinsäuren zur gewünschten Zellpopulation beinhaltet, indem ein viraler Vektor verwendet wird, der auf Zellen gerichtet ist, die den künstlichen Rezeptorkomplex zeigen, der der heterologen Einheit entspricht.
In einem weiteren Aspekt ist die Erfindung auf die Verwendung eines monomeren Polypeptidkonstrukts oder eines Oligomerkonstrukts gemäß der vorliegenden Erfindung gerichtet, wobei mindestens ein TTSE mit einer Membran integrierenden oder assoziierenden Einheit modifiziert ist, die Affinität für die spezifische Zellpopulation in dem für die Gentherapie relevanten Körper hat.
Ferner wurde ein neuerer Übersichtsartikel über bildgebende Verfahren des therapeutischen Potentials einer Reihe bekannter Antikörperderivate von Paul Carter und Margaret Merchant von Genentech Inc. (Current Opinion in Biotechnology, 1997, Bd. 8, 449–454) veröffentlicht. In direkter Fortführung ihrer Schlussfolgerungen ist es offensichtlich, dass die Oligomerisierung von Antikörperderivaten wie scFv-Derivate die derzeitige Technologie auf dem Gebiet der Designer-Antikörper um viele wichtige Aspekte erweitern kann, auf einige von denen nachstehend näher eingegangen wird (mit Bezugnahme auf den Übersichtsartikel von Carter & Merchant).
Eines der bekannten Probleme, das monoclonalen Maus-Antikörpern zu eigen ist, die durch Übertragung der Maus-Antigenbindungsstelle auf ein menschliches Ig-Gerüst „humanisiert" wurden, besteht darin, dass es häufig sehr schwierig ist, die Antigenität des chimären Produkts bei menschlichen Patienten vollständig zu unterdrücken, was zu – manchmal lebensbedrohlichen – Immunreaktionen bei dem diagnostischen oder therapeutischen humanisierten Antikörperprodukt führt. Man erwartet, dass das Risiko derartiger Nebenwirkungen viel mehr reduziert wird, wenn der Designer-Antikörper aus rein menschlichen Proteinen oder Proteinfragmenten zusammengesetzt ist. Da die hier beschriebene TTSE trimerisierende Einheit mit einem Teil des menschlichen Tetranektins identisch ist, das bereits im menschlichen Plasma und Gewebe vorliegt, gibt es gute Gründe zu erwarten, dass das TTSE keine antigene Reaktion bei einem menschlichen Patienten hervorruft, wenn es als Komponente eines chimären Produkts eingeführt wird, das beim Menschen nicht anderweitig antigen ist.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung in einem Aspekt die Verwendung eines monomeren Polypeptidkonstrukts oder eines Oligomers gemäß der vorliegenden Erfindung als Bestandteil eines chimären Produkts mit geringer antigener Wirkung beim Menschen im Ver gleich zu Formulierungen, die einen oder mehrere Bestandsteile nicht menschlichem Ursprungs umfassen.
Carter & Merchant besprechen ferner die aktuelle Technologie zur Radiomarkierung von Antikörperderivaten. Wiederum bietet die Oligomerisierung unter Verwendung von TTSE elegantere Lösungen für Probleme, die mit der Markierung zusammenhängen, da das TTSE die Möglichkeit bietet, eine oder zwei der monomeren TTSE-Einheiten in einen heterotrimeren Komplex zu konstruieren, um die Stelle, die die Markierung trägt, zu enthalten. Somit kann in diesem Format die Markierung ebenfalls auf den Nicht-Antikörperanteil des Komplexes beschränkt werden, wobei das Antigen bindende Modul komplett unmodifiziert bleibt und der Komplex ferner „im Feld" formuliert werden kann, wie und wann er benötigt wird.
In vielen Rezeptor vermittelten Signalübertragungswegen werden Signale durch die Clusterbildung von Rezeptormolekülen auf der Zellmembran ausgelöst. Die TTSE haben deshalb wichtige Anwendungen bei der Studie und Ausnutzung der Rezeptorsignalgebung, da die Liganden als Oligomere präsentiert werden, indem sie an eine TTSE-Einheit konjugiert werden.
Dies hat auch eine wichtige Anwendung bei den Phagen-Display-Technologien zur Entdeckung neuer Liganden und neuer Rezeptoren, da die Herstellung einer TTSE-Einheit, die hinter einem Kandidaten-Ligandenmolekül fusioniert ist, das Präsentieren eines heterotrimeren Phagenhüllproteins zulässt, bei dem nur eine der monomeren Einheiten mit dem Phagenhüllprotein konjugiert ist. Dies kann durch geeignete Insertion von Amber-Codons an der Fusionsstelle des Phagenhüllproteins mit dem TTSE-Liganden-Segment des Dreiwege-Fusionsproteins erfolgen, das von dem rekombinanten Phagen codiert wird. In geeigneten E. coli-Zellen führt die Gegenwart dieses Amber-Codons bei der Mehrheit der abgelesenen Einheiten zur Translationstermination, und deshalb ist das meiste in das periplamatische Kompartment im phageninfizierten Bakterium sekretierte Fusionsproteinprodukt lösliches TTSE-Liganden-Fusionsprotein, wobei eine Minderheit des Fusionsproteins auch ein Phagenproteinmodul enthält. Die Mehrheit der Trimere, die erzeugt werden, enthalten deshalb meistens eine monomere Einheit, die die Integration (Präsentation) im reifen rekombinanten Phagenpartikel sicherstellt.
Ein weiterer Vorteil der vorstehend beschriebenen Displaytechnologie betrifft die Tatsache, dass sie besonders nützlich für die Selektion auf der Basis einer relativ niedrigen Affinität aufgrund des Beitrags des Entropienutzens ist, der durch die Nähe der drei bindenden Einheiten in einer eingeschränkten räumlichen Anordnung erhalten wird.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung in einem wichtigen Aspekt auch die Proteinbanktechnologie, wobei die vorstehend beschriebenen TTSE verwendet werden.
Die Trimerisierung von in Frage kommenden rekombinanten Liganden ist besonders wichtig, da für viele Rezeptoren das intrazelluläre Signal durch Rezeptorclusterbildung induziert wird, das nur erfolgt, wenn der externe Ligand eine multivalente Bindung an den Rezeptor zeigt, damit zwei oder mehr Rezeptormoleküle überbrückt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das monomere Polypeptidkonstrukt oder Oligomerkonstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung für die gezielte Gentherapie bestimmt, die den selektiven Transfer des Materials zur Transfektion oder Infektion der spezifischen Zellpopulation beinhaltet. Die mindestens eine heterologe Einheit kann eine Einheit umfassen, die aus einer Liganden bindenden Struktur wie einem Rezeptormolekül oder einem Liganden bindenden Teil eines Rezeptormoleküls ausgewählt wird, wobei die Gentherapie den Transfer von Nucleinsäuren zur gewünschten Zellpopulation beinhaltet, indem ein viraler Vektor verwendet wird, der auf Zellen gerichtet ist, die den künstlichen Rezeptorkomplex zeigen, der der heterologen Einheit entspricht.
Wie vorstehend erwähnt, ist ein wichtiger erfindungsgemäßer Aspekt, dass das monomere Polypeptidkonstrukt und/oder Oligomer als Bestandteil eines chimären Produkts mit geringer antigener Wirkung beim Menschen verwendet werden kann. Da das Konstrukt menschlichen Ursprungs ist, nimmt man an, daß die Antigenität im Menschen für Formulierungen relativ gering ist, die eine oder mehrere Komponenten nicht-menschlichen Ursprungs enthalten.
Eine Hauptanwendung eines erfindungsgemäßen monomeren Polypeptidkonstrukts oder Oligomers ist der Transfer eines bildgebenden oder toxinkonjugierten Antikörpers an ein Ziel wie einen Tumor oder die Verwendung als Vehikel, das eine Substanz zu einer Zielzelle oder zu einem Zielgewebe transportiert, als Vehikel zum Zusammenfügen von Antikörperfragmenten in oligomere oder multivalente Einheiten zur Erzeugung chimärer künstlicher Antikörper mit vorgewählten pharmakokinetischen und/oder pharmadynamischen Eigenschaften.
Die fragliche Substanz wird einzeln oder zu mehreren aus der Gruppe der heterologen Einheiten sowie der pharmazeutisch wirksamen Substanzen ausgewählt. Auch ein markiertes Konstrukt, wobei die Markierung an eine oder zwei der monomeren TTSE-Einheiten gekoppelt ist, liegt innerhalb des erfindungsgemäßen Anwendungsbereichs.
Wie zuvor im Detail erklärt, ist eine wichtige und überraschende Anwendung des monomeren Polypeptidkonstrukts oder des Oligomers nach der vorliegenden Erfindung die Proteinbanktechnologie wie die Phagen-Display-Technologie. Die vorliegende Erfindung betrifft auch jegliche Polynucleotidmoleküle wie eine RNA, DNA oder PNA sowie jeden Vektor, der ein oder mehrere TTSE codiert.
Eine weitere erfindungsgemäße Verwendung schließt die Herstellung und Verwendung eines Arzneimittels ein, umfassend das TTSE-Konstrukt und wahlweise einen pharmazeutisch verträglichen Excipienten. Die Zusammensetzung kann durch eine Route verabreicht werden, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der intravenösen Route, der intraarteriellen Route, der transmembranen Route des Buccal-, Anal-, Vaginal- oder Konjunktivalgewebes, der intranasalen Route, der pulmonaren Route, der transdermalen Route, der intramuskulären Route, der subkutanen Route, der intrathekalen Route, durch Impfung in Gewebe wie einen Tumor oder durch ein Implantat.
Das monomere Polypeptidkonstrukt oder das Oligomer ist in einer bevorzugten Ausführungsform in einem Liposom enthalten.
Aufgrund der Offenbarung der vorliegenden Erfindung ist offensichtlich, dass die Behandlung oder das Verhindern einer Erkrankung ein weiterer Aspekt sein kann, umfassend die Verab reichung an einen Patienten, der eine wirksame Menge eines Arzneimittels benötigt, auf das vorstehend Bezug genommen wurde.
Ein Aspekt der verschiedenen erfindungsgemäßen Möglichkeiten, die das Angehen der Gentherapie beim Menschen betrifft, schließt den Fall ein, bei dem mindestens ein TTSE mit einer membranintegrierenden oder assoziierenden Einheit mit einer Affinität für die spezifische Population von für die Gentherapie relevanten Zellen im Körper modifiziert wird.
Wie auf dem herkömmlichen pharmazeutischen Gebiet der vorliegenden Erfindung verwendet, schließt die vorliegende Erfindung ein Verfahren ein, bei dem das monomere Polypeptidkonstrukt oder das Oligomer durch eine Route verabreicht wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der intravenösen Route, der intraarteriellen Route, der transmembranen Route des Buccal-, Anal- oder Vaginalgewebes, der intranasalen Route, der pulmonaren Route, der transdermalen Route, der intramuskulären Route, der subkutanen Route, der intrathekalen Route, der buccalen Route durch Impfung in Gewebe wie einen Tumor oder durch ein Implantat.
Schließlich betrifft die vorliegenden Erfindung auch das Gebiet der Diagnostik, da ein Fachmann leicht erkennen würde, dass das in dieser Beschreibung offenbarte TTSE auch ein Diagnoseverfahren betreffen kann, das ein Konstrukt umfasst, das das monomere Polypeptidkonstrukt oder das Oligomer zusammen mit einer daran gekoppelten Komponente für die Diagnostik umfasst.
BEISPIEL 1
Design und Konstruktion des pTH6trip-E. coli-Expressionsvektors zur Herstellung trimerisierter chimärer Fusionsproteine
Der Plasmidclon pT7H6FXT123 (Beispiel 2) wurde als Matrize für die Amplifizierung in zwei Polymerasekettenreaktionen (PCR) (Saiki et al., 1988) mit den Primerpaaren trip-N (SEQ ID NR: 1) und trip-Ca (SEQ ID NO: 2) bzw. trip-N (SEQ ID NR: 1) und trip-Cb (SEQ ID NR: 3) verwendet. Die amplifizierten DNA-Fragmente, tripa, umfassend die Nucleotidse quenzen, die eine IQGR-Schnittstelle für die Restriktionsprotease FX_a (SEQ ID NR: 4) codieren, gefolgt von zwei Schnittstellen für die Restriktionsnucleasen BglII und KpnI, die Nucleotidsequenz, die die Tetranektin-Polypeptidsequenz für Glu 1 bis Lys 52 (SEQ ID NR: 5) codiert, gefolgt von den Erkennungsstellen für die drei Restriktionsendonucleasen BamHI, HindIII bzw. EcoRI und tripb, umfassend die Nucleotidsequenzen, die eine IQGR-Schnittstelle für die Restriktionsprotease FX_a (SEQ ID NR: 4) codieren, gefolgt von zwei Schnittstellen für die Restriktionsnucleasen BglII und KpnI, die Nucleotidsequenz, die die Tetranektin-Polypeptidsequenz für Glu 1 bis Val 49 (SEQ ID NR: 6) codieren, gefolgt von den Erkennungsstellen für die drei Restriktionsnucleasen BamHI, HindIII bzw. EcoRI, wurden in das Plasmid pT7H6 (Christensen et al., 1991) subcloniert, so dass sich pTtripa bzw. pTtripb ergaben (3 und 4).
BEISPIEL 2
Tetranektin, Lokalisierung des trimerisierenden Strukturelements und Stabilität des dreifach alpha-helikalen gewundenen Knäuels.
Die cDNA, die den Leserahmen codiert, der der reifen Tetranektin-Einzelkette (SEQ ID NR: 7) entspricht, wurde durch spezifische Amplifizierung in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) (Saiki et al., 1988) der Nucleotidsequenzen vom Aminosäurerest Glu1 bis Val181 unter Verwendung der oligo-dT-geprimten 1. Strang-cDNA, die aus menschlicher Gesamt-RNA aus der Plazenta synthetisiert wurde, als Matrize cloniert. Die in der PCR verwendeten Primer waren SEQ ID NR: 8 und SEQ ID NR: 9. Die RNA-Extraktion und cDNA-Synthese erfolgten unter Verwendung von Standardverfahren. Der amplifizierte Leserahmen, der die monomere Untereinheit von Tetranektin codiert, war am 5'-Ende über die PCR-Reaktion mit Nucleotidsequenzen verbunden, die die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 10 codieren, die eine IEGR-Schnittstelle für die Rinder-Restriktionsprotease FX_a ausmacht (Nagai und Thøgersen, 1987). Ein Glycinrest wurde aufgrund des spezifischen Designs des 5'-PCR-Primers (SEQ. ID NR. 8) zwischen dem C-terminalen Argininrest der FX_a-Schnittstelle (SEQ ID NR. 10) und dem Tetranektin-Glu1-Rest eingebaut. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde in den E. coli-Expressionsvektor pT₇H₆ (Christensen et al., 1991) subcloniert, so dass das Plasmid pT₇H₆FX-TN123 produziert wurde, das das Tetranektin-Monomer H6FXTN123 (SEQ ID NR: 25) exprimiert, und in pT₇CIIH₆ subcloniert, das ein Derivat von pT₇H₆ ist, in dem die 32 aminoterminalen Aminosäurereste des Lambda CII-Proteins (SEQ ID NR: 11) 5' von den sechs Histidinresten (SEQ ID NR: 12) eingebaut sind, wie in 5 skizziert, so dass sich pT₇CIIH₆FX-TN123 ergibt, das das Tetranektin-Fusionsprotein CIIH6FXTN123 (SEQ ID NR: 24) exprimiert. Die Aminosäuresequenz der exprimierten Proteine wird in 6 dargestellt (in SEQ ID NR: 7 wird die Aminosäuresequenz des reifen Tetranektin-Proteins angegeben). Ferner wurden drei zusätzliche Tetranektin-Derivate konstruiert (8): H6FXTN12, umfassend die Tetranektin-Aminosäurereste Glu1 bis Val49 (SEQ ID NR: 6), H6FXTN23, umfassend die Tetranektin-Aminosäurereste Val17 bis Val181 (SEQ ID NR: 7) und H6FXTN3 (SEQ ID NR: 30), umfassend die Tetranektin-Aminosäurereste Ala45 bis Val181 (SEQ ID NR: 7). Diese drei Tetranektin-Derivate wurden durch spezifische Amplifizierung in einer PCR unter Verwendung von pT₇H₆FX-TN123 als Matrize und der Primerpaare SEQ ID NR: 8 und SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14 und SEQ ID NR: 9 bzw. SEQ ID NR: 15 und SEQ ID NR: 9 konstruiert. Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden in den E. coli-Expressionsvektor pT₇H₆ subcloniert, so dass die Plasmide pT₇H₆FX-TN12, pT₇H₆FX-TN23 bzw. pT₇H₆-TN3 produziert wurden (7).
Um rekombinantes Tetranektin und seine Derivate herzustellen, wurde jedes der Plasmide pT₇H₆FX-TN123, pT₇CIIH₆FX-TN123, pT₇H₆FX-TN12, pT₇H₆FX-TN23 und pT₇H₆FX-TN3 im mittleren Maßstab (4 × 1 Liter; 2 × TY-Medium, 5 mM MgSO₄ und 100 μg Ampicillin) in E. coli BL21-Zellen gezüchtet, wie von Studier et al. (1990) beschrieben. Bei 37°C exponentiell wachsende Kulturen wurden bei OD₆₀₀ 0,8 mit dem Bakteriophagen Lambda CE6 bei einer Multiplizität von etwa 5 infiziert. Die Kulturen wurden bei 37°C weitere drei Stunden gezüchtet und die Zellen durch Zentrifugation geerntet.
Die Zellen wurden in 150 ml 0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8 und 1 mM EDTA pH 8 resuspendiert. Phenol (100 ml eingestellt auf pH 8) wurde zugegeben und das Gemisch wurde einer Ultraschallbehandlung unterzogen, um das Gesamtprotein zu extrahieren. Das Protein wurde aus der Phenolphase mit 2,5 Volumina Ethanol und durch Zentrifugation präzipitiert.
Das Proteinpellet wurde in einem Puffer gelöst, enthaltend 6M Guanidiniumchlorid, 50 mM Tris-HCl pH 8 und 0,1 M Dithioerythriol. Nach der Gelfiltration auf Sephadex G-25 (Pharma cia, Schweden) in 8 M Harnstoff, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 und 10 mM 2-Mercaptoethanol wurde die Rohproteinzubereitung auf eine Ni²⁺ aktivierte NTA-Agarosesäule (Ni²⁺NTA-Agarose, 75 ml mit 8 M Harnstoff, 1 M HCl, 50 mM Tris-NaCl pH 8 und 10 mM 2-Mercaptoethanol vorgewaschen) zur Reinigung (Hochuli et al., 1988) und zur Rückfaltung der Fusionsproteine H6FXTN123, CIIH6FXTN123, H6FXTN12, H6FXTN23 und H6FXTN3 aufgetragen.
Für diese Studie entschieden wir uns, unsere eigene Ni²⁺-NTA-Agarose-Matrix herzustellen. Es wurde eine Carbodiimid-Kopplung des N-(5-Amino-1-carboxypentyl)iminodiessigsäure-Metallliganden (Syntheseweg, wie von Döbeli & Hochuli (EP-A-0 253 303) beschrieben) an eine starre Agarosematrix (Sepharose CL-6B, Pharmacia, Schweden) durchgeführt:
8 g N-(5-Amino-1-carboxypentyl)iminodiessigsäure aus dem Syntheseverfahren in 50 ml wurde auf pH 10 durch Zugabe von 29 g Na₂CO₃(10 H₂O) eingestellt und einer gerührten Suspension aktivierter Sepharose CL-6B in 1 M Na₂CO₃ zugegeben. Man ließ die Reaktion über Nacht ablaufen. Die Sepharose CL-6B (anfangs 100 ml Suspension) wurde nach Entfernen von Wasser durch Aceton mit 7 g 1,1'-Carbonyldiimidazol unter 15- bis 30-minütigem Rühren aktiviert. Bei der Aktivierung wurde die Sepharose CL-6B mit Aceton, gefolgt von Wasser und 1 M Na₂CO₃ gewaschen.
Die NTA-Agarose-Matrix wurde in eine Säule eingebracht und mit Ni²⁺ „beladen", indem langsam 5 Säulenvolumina einer 10%-igen NiSO₄-Lösung durchgeschickt wurden. Die Ni²⁺-Menge auf der durch dieses Verfahren hergestellten NTA-Agarose-Matrix wurde mit 14 μMol pro ml Matrix bestimmt. Nach dem Beladen wurde die Ni²⁺NTA-Agarosesäule mit zwei Säulenvolumina Wasser, einem Säulenvolumen 1 M Tris-HCl pH 8 und zwei Säulenvolumina Beladungspuffer gewaschen, bevor die Ni²⁺NTA-Agarose-Matrix mit dem Rohproteinextrakten in einem Zerteiler unter Rühren 15 bis 30 min gemischt wurde. Alle für die Flüssigkeitschromatographie hergestellten Puffer wurden vor der Zugabe des Reduktionsmittels und/oder der Verwendung unter vermindertem Druck entgast.
Das Ni²⁺NTA-Agarose-Matrix-Rohextrakt-Gemisch wurde in Standardglassäulen für die Flüssigkeitschromatographie (innerer Durchmesser: 2,6 cm) auf ein Volumen von etwa 40 ml gepackt. Die Säulen wurden mit 200 ml 8 M Harnstoff, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 und 10 mM 2-Mercaptoethanol (Puffer I) und 100 ml 6 M Guanidiniumchlorid, 50 mM Tris-HCl pH 8 und 10 mM 2-Mercaptoethanol (Puffer II) gewaschen und die adsorbierten von Tetranektin stammenden Fusionsproteine H6FXTN123, H6CIIFXTN123, H6FXTN23 und H6FXTN3 wurden unter Verwendung des zyklischen Rückfaltungsverfahrens zurückgefaltet, wie beschrieben (Thøgersen et al., WO 94/18227).
Das Fusionsprotein H6FXTN12 wurde durch Entfernen von Guanidiniumchlorid und 2-Mercaptoethanol von Puffer II in einem Gradienten über 5 Säulenvolumina in 50 mM Tris-HCl pH 8 und 0,5 M NaCl zurückgefaltet. Nach Beendigung der Rückfaltungsverfahren wurden die von Tetranektin stammenden Fusionsproteine von den Ni²⁺NTA-Agarosesäulen mit einem Puffer, enthaltend 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 25 mM EDTA pH 8, eluiert. Die Tetranektin-Fusionsproteine H6FXTN123, H6FXTN23 und H6FXTN3 wurden über Nacht mit FX_a bei 4°C in einem molaren Verhältnis von 1 : 300 gespalten. Nach der FX_a-Spaltung wurden die Proteinproben um das 10-fache durch Ultrafiltration auf YM10-Membranen (Amicon) aufkonzentriert. Nach 10-maliger Verdünnung der Proteinprobe mit 2 mM CaCl₂ wurden die rekombinanten Tetranektin-Derivate TN123, TN23 und TN3 durch Ionenaustauschchromatographie auf Q-Sepharose (Pharmacia, Schweden) in einem linearen Gradienten über 10 Säulenvolumina von 10 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCl₂ bis 10 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM CaCl₂ und 0,5 M NaCl isoliert. Nach der Elution aus den Ni²⁺NTA-Agarosesäulen wurden die Fusionsproteine H6CIIFXTN123 und H6FXTN12 genauso um das 10-fache durch Ultrafiltration auf YM10-Membranen aufkonzentriert und in Puffer, enthaltend 25 mM Tris-HCl pH 8, 25 mM NaCl und 2 mM CaCl₂, vor der Reinigung des richtig gefalteten Monomers durch Ionenaustauschchromatographie auf Q-Sepharose, wie beschrieben, gelfiltriert.
Rekombinantes mittels dieser Verfahren hergestelltes Tetranektin (TN123) mit der gesamten Länge wurde im Hinblick auf die Bindung an Plasminogen-Kringle 4 und an immobilisiertes Fucoidan, die Expression antigener Stellen und die Lokalisierung von Disulfidbrücken analysiert. Bei allen getesteten Kriterien verhielt sich das produzierte TN123 identisch mit dem natürlich isolierten menschlichen Tetranektin (Daten nicht gezeigt). Ferner wurden TN123 und TN3 kristallisiert (Kastrup et al., 1996) und die Struktur wurde ebenfalls bestimmt, wobei alles darauf hinwies, dass tatsächlich ein einzelnes einzigartiges und biologisch aktives gefaltetes Produkt produziert worden war.
Analytische Gelfiltrationsanalyse von rTN-Proteinen.
Die analytische Gelfiltration der rekombinanten Tetranektin-Derivate TN123, TN3 und TN23 (9) erfolgten auf einer Superose 12-HR 10/30-Säule (Pharmacia, Schweden) mit einem Gesamtvolumen von 25 ml in 100 mM NaCl und 50 mM Tris-HCl pH 8 und einer Flussrate von 0,2 ml/min. Der K_av-Wert wird definiert durch K_av = (Ve – Vo)/(Vc – Vo).
Die Gelfiltrationsanalyse von TN123 und TN23 zeigt, dass beide Proteine ausschließlich als Trimere in Lösung gefunden werden (K_av-Werte 0,27 bzw. 0,29), während TN3 monomer zu sein scheint (K_av: 0,41).
Chemische Vernetzung von Tetranektin und Derivaten
Die rekombinanten Tetranektin-Derivate TN123, TN3 und TN23 zusammen mit den Fusionsproteinen CIIH6FXTN123 und H6FXTN12 oder Gemische dieser Derivate wurden bei einer 1 mg/ml Konzentrationen in Vernetzungspuffer (0,1 M Natriumborat, pH 9,1) mit Dimethylsuberimidat (DMSI, Sigma) inkubiert. 10 μl-Aliquots der Proteinlösung wurden 30 Minuten mit 1 μl-Aliquots der DMSI-Stammlösung (20 mg/ml in Vernetzungspuffer) bei 25°C vor Zugabe von 2 μl Quenchingpuffer (3 M Tris-HCl, pH 9) inkubiert. Der Austausch der Untereinheiten zwischen vorgebildeten Homo-Oligomeren wurde induziert, indem Proteingemische einer Hitzeschockbehandlung unterzogen wurden. Fünf μl-Aliquots jeder Proteinlösung (1 mg/ml Stammlösung) wurden bei 0°C in Standard-Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen gemischt, in ein Wasserbad bei 70°C für die angegebenen Zeiträume übertragen und dann 15 Minuten bei 25°C vor der Reaktion mit DMSI weiter inkubiert.
Vor der Analyse der vernetzten Produkte mittels SDS-PAGE (12%-ige Gele) wurden die Reaktionsproben in Gegenwart von SDS und Mercaptoethanol gekocht.
Die Vernetzungsanalyse von TN123 und des Fusionsproteins CIIH6FXTN123 zeigte, dass nach 16 Stunden kein nachweisbarer Austausch der Untereinheiten zwischen vorgefertigten Homo-Oligomeren in einem Gemisch von TN123 und CIIH6FXTN123 bei Raumtemperatur gefunden wurde (10). Der Austausch der Untereinheiten konnte durch Inkubation des Proteingemisches bei 70°C 15 Sekunden oder länger vor dem Abkühlen auf Raumtemperatur und Zugabe von DMSI induziert werden. Die SDS-PAGE-Analyse zeigte die Gegenwart von vier trimeren Banden über 95 kDa (entsprechend den beiden Homotrimeren und zwei Heterotrimeren) und drei dimeren Banden (entsprechend zwei Homodimeren und einem Heterotrimer) im Gel zwischen 43 und 55 kDa in relativ großer Menge in Übereinstimmung mit der zufälligen Assoziierung der monomeren Untereinheiten in Trimere nach dem Austausch der Untereinheiten. Es sollte angemerkt werden, dass die molekularen Gewichtsmarker nur auf den SDS-PAGE-Gelen für die Rohkalibrierung und Orientierung der Gele eingeschlossen wurden.
Die trimere Organisation von Tetranektin wurde ferner durch Vernetzungsstudien der Proteine H6FXTN12, TN23 und TN3 und von Gemischen zwischen ihnen bestätigt (11). Das Tetranektin-Derivat TN3, das nur die CRD enthält, konnte auch nicht bei hohen Proteinkonzentrationen vernetzt werden und interferierte nicht mit der Vernetzung von rTN123. Genauso schien das Derivat TN23, das Exon 2 und die CRD enthielt, nach der Vernetzung monomer zu sein und man fand heraus, dass es nicht mit der Trimerisierung von TN123 während des Austausches der Untereinheiten interferierte. Die dimeren TN23-Moleküle, die in geringer Menge in der Probe gefunden wurden, spiegeln wahrscheinlich kontaminierende falsch gefaltete Disulfidbrücken-Dimere wider. Das Fusionsprotein H6FXTN12 bildete bei der Vernetzung Homotrimere und erzeugte mit TN123 nach dem Austausch der Untereinheiten Heterotrimere. Aufgrund der unterschiedlichen Größe von Tetranektin mit der gesamten Länge (TN123) und H6FXTN12 sind die möglichen neun Proteinbanden, die auf die chemische Vernetzung zurückzuführen sind: Die vier Trimere [(TN123)₃, (TN123)₂(H6FXTN12), (TN123)(H6FXTN12)₂ und (H6FXTN12)₃] bei ca. 95 kDa, 50 kDa, 37 kDa bzw. 20 kDa; die drei Dimere [(TN123)₂, (TN123) (H6FXTN12) und (H6FXTN12)₂] bei ca. 45 kDa, 30 kDa bzw. 15 kDa und die beiden Monomere TN123 bei 23 kDa und H6FXTN12 bei 9 kDa.
Insgesamt zeigen die Gelfiltration und die Vernetzungsanalyse der Tetranektin-Derivate, dass Tetranektin wie die Collectin-Gruppe der C-Typ-Lektine ein trimeres Molekül ist und dass die Aminosäurereste, von denen direkt gezeigt wird, dass sie an der Trimerisierung des Tetranektin-Monomer beteiligt sind, im Exon 2 des Proteins (Val17–Val49) lokalisiert sind. Ferner konnte der Austausch der Untereinheiten zwischen den trimeren Molekülen nur nach Hitzedenaturierung beobachtet werden. Die Aminosäurereste Glu1 bis Asp16 von Tetranektin sind wichtig für die chemische Vernetzung mit DMSI und noch wichtiger scheinen sie das trimere Molekül zu stabilisieren, da die Vernetzungsanalyse des TN123- und TN23-Gemisches keinen Rückgang bei der TN123-Bildung nach der Hitzedenaturierung und dem möglichen Austausch der Untereinheiten zeigte (11). Die Stabilität des Tetranektin-Trimers wurde durch eine Vernetzungsanalyse mit DMSI bei verschiedenen Temperaturen bestätigt. 15 μl TN123 mit einer Konzentration von 0,3 mg/ml wurden 10 min entweder bei 37°C, 50°C, 60°C oder 70°C vor Zugabe von 2 μl DMSI (20 mg/ml) vorinkubiert. Man ließ die Reaktion 15 min ablaufen, bevor die Reaktion mit 5 μl 3M Tris-HCl pH 9,1 gequenchet wurde und man ließ die Reaktionsgemische auf Raumtemperatur abkühlen. Die SDS-PAGE-Analyse der reduzierten Proben (12) zeigte, dass Trimere sogar bei 60°C leicht nachweisbar sind, auch wenn ein kompetitierendes Muster der vernetzenden Proben bei zunehmenden Temperaturen zunimmt. Das Auftreten anderer vernetzender Proben ist wahrscheinlich auf die Auffaltung von CRD zurückzuführen. Die Stabilität des trimerisierenden Tetranektin-Strukturelements wird weiter unter Verwendung eines konstruierten chimären Proteins in Beispiel 3 analysiert.
BEISPIEL 3
Design und Konstruktion des rekombinanten chimären Proteins TRIPB-UB – dem trimerisiernden Tetranektin-Strukturelement und Ubiquitin
Ein freundlicherweise von Dr. O. Wiborg bereitgestellter Plasmidclon, pLCMHF/UB, der eine menschliche Ubiquitin-cDNA-Insertion (SEQ ID NR: 16) trägt, wurde als Matrize verwendet und SEQ ID NR: 17 zusammen mit SEQ ID NR: 18 wurden in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) (Saiki et al., 1988) zur Amplifizierung der Nucleotidsequenz verwendet, die den Aminosäurerest Ile1 bis Gly76 des menschlichen Ubiquitins (SEQ ID NR: 19) codiert. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde nach der Spaltung mit den Restriktionsendonucleasen BamHI und HindIII in die BamHI- und HindIII-Schnittstellen von pTtripb (Beispiel 1) unter Verwendung von Standardverfahren ligiert, sodass sich pTtripb-UB (13) ergab.
Um das chimäre Fusionsprotein H6FXtripb-UB (14, SEQ ID NR: 31) herzustellen, wurde das Plasmid pTtripb-UB im mittleren Maßstab (4 × 1 Liter; 2 × TY-Medium, 5 mM MgSO₄ und 100 μg Ampicillin) in E. Coli BL21-Zellen gezüchtet, wie von Studier et al. (1990) beschrieben. Bei 37°C exponentiell wachsende Kulturen wurden bei OD₆₀₀ von 0,8 mit dem Bakteriophagen Lambda CE6 bei einer Mulitplizität von ungefähr 5 infiziert. Die Kulturen wurden weitere drei Stunden bei 37°C gezüchtet und die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet. Die Zellen wurden in 150 ml 0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8 und 1 mM EDTA pH 8 resuspendiert. Phenol (100 ml eingestellt auf pH 8) wurde zugegeben und das Gemisch einem Ultraschall unterzogen, um das Gesamtprotein zu extrahieren. Das Protein wurde aus der Phenolphase durch 2,5 Volumina Ethanol und durch Zentrifugation präzipitiert. Das Proteinpellet wurde in einem Puffer, enthaltend 6 M Guanidiniumchlorid, 50 mM Tris-HCl pH 8 und 0,1 M Dithioerythriol, gelöst. Nach der Gelfiltration auf Sephadex G-25 (Pharmacia, Schweden) in 8 M Harnstoff, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 und 10 mM 2-Mercaptoethanol wurde die Rohproteinzubereitung auf eine Ni²⁺ aktivierte NTA-Agarosesäule zur Reinigung (Hochuli et al., 1988) und Rückfaltung des Fusionsproteins H6FXtripb-UB aufgetragen.
Die Synthese und das Beladen der Ni²⁺ aktivierten NTA-Agarose-Matrix wird in Beispiel 2 beschrieben. Alle Puffer für die Flüssigkeitschromatographie wurden vor der Verwendung entgast. Das Fusionsprotein H6FXtripb-UB wurde durch Entfernung des Harnstoffes und 2-Mercaptoethanol aus Puffer II in einem Gradienten über 5 Säulenvolumina in 50 mM Tris-HCl pH 8 und 0,5 M NaCl zurückgefaltet. Nach Beendigung des Rückfaltungsverfahrens wurde das H6FXtripb-UB-Fusionsprotein aus den Ni²⁺NTA-Agarosesäulen mit einem Puffer, enthaltend 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 25 mM EDTA pH 8 eluiert und auf einer Sephadex-G50-Säule (Pharmacia) in 0,1 M Natriumborat pH 9-Puffer für die chemische Vernetzungsanalyse mit DMSI einer Gelfiltration unterzogen.
Das Vernetzungsanalyseexperiment wurde sowohl konzipiert, um den oligomeren Status des chimären Fusionsproteins als auch die Hitzestabilität des angenommenen Fusionsproteintrimers zu analysieren, wie in Beispiel 2 beschrieben: Proben mit 15 μl H6FXtripb-UB-Fusionsprotein bei einer Konzentration von etwa 1,0 mg/ml wurden 10 min entweder bei 37°C, 50°C, 60°C oder 70°C vor Zugabe von 2 μl DMSI (20 mg/ml) vorinkubiert. Man ließ die Reaktionen 15 min ablaufen, bevor das Quenchen durch Zugabe von 5 μl 3 M Tris-HCl pH 9,1 erfolgte und man ließ die Reaktionsgemische auf Raumtemperatur abkühlen. Die SDS-PAGE-Analyse der reduzierten Proben (12) zeigten, dass (1) das Fusionsprotein H6FXtripb-UB ein Trimer in Lösung ist (Monomer bei 17 kDa, Dimer bei 35 kDa und Trimer bei 43 kDa) und dass (2) eine wesentliche Menge der trimeren Moleküle sogar bei 70°C vorliegt. Das Auftreten anderer größerer Vernetzungsprodukte ist wahrscheinlich auf die Vernetzung von Trimeren über den Ubiquitin-Anteil des Fusionsproteins zurückzuführen.
BEISPIEL 4
Design und Konstruktion von trimerisierten und hexamerisierten CEA6scFY-Antikörpern scFv(CEA6)-TRIPB, TRIPB-scFV(CEA6) und scFv(CEA6)-TRIPB-scFv(CEA6).
Ein freundlicherweise von Dr: Kevin Pritchard, Cambridge Antibody Technology Ltd., Melbourn, GB, bereitgestellter Plasmidclon, pUC19MCH/CEA6, der eine Nucleotidsequenz (SEQ ID NR: 20) trägt, die den CEA6-Antikörper im Einzelketten Fv (scFv)-Format codiert, auf die direkt ein „myc-Marker" (der ein allgemeiner Reinigungs-/Nachweis-Marker ist) folgt, wurde als Matrize in Polymerasekettenreaktionen (PCR) (Saiki et al., 1988) verwendet, bei denen die Nucleotidesequenz, die scFv + myc-Marker codiert, unter Verwendung der Primerpaare (SEQ ID NR: 21 und SEQ ID NR: 22) und (SEQ ID NR: 21 und SEQ ID NR: 23) amplifiziert wurde, um die PCR-Fragmente „A" und „B" zu erzeugen.
PCR-Fragment „A" wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und KpnI behandelt und das sich ergebende Fragment wurde in mit BglII/KpnI gespaltenen pTripb (Beispiel 1) eingebaut, um den Vektor pTH6FXscFv(CEA6)-tripb (15) zu erhalten, der das H6FXscFv(CEA6) TRIPB-Fusionsprotein (16) codiert. Das PCR-Fragment „B" wurde mit den Restriktions enzymen BamHI und HindIII behandelt und das sich ergebende Fragment wurde in mit BamHI und HindIII gespaltenen pTripb (Beispiel 1) eingebaut, um den Vektor pTH6FXtripb-scFv(CEA6) (17) zu erhalten, der das H6FXTRIPB-scFv(CEA6)-Fusionsprotein (18, SEQ ID NR: 33) codiert, wobei Standardverfahren verwendet wurden.
Um den Expressionsvektor pTH6FXscFv(CEA6)-tripb-scFV(CEA6) (19) zu erzeugen, der das H6FXscFv (CEA6)-TRIPB-scFv(CEA6)-Fusionsprotein (20, SEQ ID NR: 34) codiert, wurde die Insertion im Vektor pTH6FXtripb-scFv(CEA6) unter Verwendung der Restriktionsenzyme BamHI und HindIII herausgespalten und in den Vektor pTH6FXscFv(CEA6)-tripb eingebaut, der mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII behandelt worden war.
Um die chimären Fusionsproteine H6FXscFv(CEA6)-TRIPB (SEQ ID NR: 32), H6FXTRIPB-scFv(CEA6) (SEQ ID NR: 33) und H6FXscFv(CEA6)-TRIPB-scFv(CEA6) (SEQ ID NR: 34) herzustellen, wurden die Plasmide pTH6FXscFv(CEA6)-TRIPB, pTH6FXtripb-scFv(CEA6) und pTH6FXscFv(CEA6)-tripb-scFv(CEA6) im kleinen Maßstab (1 Liter; 2 × TY-Medium, 5 mM MgSO₄ und 100 μg Ampicillin) in E. coli-BL21-Zellen gezüchtet, wie von Studier et al. (1990) beschrieben. Bei 37°C exponentiell wachsende Kulturen wurden bei OD₆₀₀ von 0,8 mit dem Bakteriophagen Lambda CE6 bei einer Multiplizität von etwa 5 infiziert. Die Kulturen wurden bei 37°C weitere drei Stunden gezüchtet und die Zellen durch Zentrifugation geerntet. Die Zellen wurden in 50 ml 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 und 1 mM EDTA pH 8 resuspendiert. Phenol (50 ml eingestellt auf pH 8) wurde jeweils zugegeben, und die Gemische wurden einer Ultraschallbehandlung unterzogen, um das Gesamtprotein zu extrahieren. Nach der Klärung durch Zentrifugation (25 Minuten bei 10.000 g) wurden die Rohproteinfraktionen aus den Phenolphasen durch Zugabe von 2,5 Volumina Ethanol und durch Zentrifugation präzipitiert. Die Proteinpellets wurden in einem Puffer (15–25 ml), enthaltend 6 M Guanidiniumchlorid, 50 mm Tris-HCl pH 8 und 0,1 M Dithioerythriol, gelöst. Nach der Gelfiltration auf Sephadex G-25 (Pharmacia, Schweden) in 8 M Harnstoff, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 und 10 mM 2-Mercaptoethanol wurden die Rohproteinzubereitungen auf Ni²⁺ aktivierte NTA-Agarosesäulen (75 ml-Säulenvolumen) zur Reinigung (Hochuli et al., 1988) aufgetragen. Der Waschpuffer (6 M Guanidin-HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 und 10 mM 2-Mercaptoethanol) wurde dann durch die Säulen gespült, bis stabile Basislinien erhalten wurden. Es konnten dann praktisch reine Fusionsproteine eluiert werden, indem ein pH-Gradient an jede Säule angelegt wurde (1000 ml Gradient in 8 M Harnstoff und 10 mM 2-Mercaptoethanol), der durch lineares (pro Volumen) Mischen der Lösungen, enthaltend 50 mM Natriumdihydrogenphosphat (pH 5 Puffer) und 50 mM Dinatriumhydrogenphosphat (pH 8 Puffer) erhalten wurde.
Zur Vorbereitung der in-vitro-Rückfaltung durch das Verfahren von Thøgersen et al. (WO 94/18227) wurden 20 mg jedes gereinigten Fusionsproteins in Suspensionen in Rückfaltungs-„Puffer B" (nachstehend beschrieben) mit Aliquots von Suspensionen von Ni²⁺ aktivierte NTA-Agarose-Matrix gemischt, die ausreicht, um Säulen mit etwa 75 ml gepacktem Bettvolumen zu erzeugen. Jedes Fusionsprotein wurde dann dem iterativen Rückfaltungsverfahren unterzogen, wie für Plasminogen-Kringle 4 in der Thøgersen et al.-Patentanmeldung (WO 94/18227) beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Rückfaltung der scFv enthaltenden Fusionsproteine bei 10°C unter Verwendung eines Puffers, enthaltend 0,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM Glutathion und 0,2 mM oxidiertes Glutathion, als „Puffer A" und eines Puffers, enthaltend 8 M Harnstoff, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8 und 2 mM Glutathion, als „Puffer B" erfolgte.
Nach Beendigung der Rückfaltung wurde jede Säule mit 300 ml Puffer, enthaltend 0,5 M NaCl und 50 mM Tris-HCl pH 8, gewaschen, um das Glutathion abzuwaschen. Die zurückgefaltete Fraktion jedes Proteins wurde dann von der NTA-Agarose-Matrix durch Zugabe von 20 mM EDTA zum Elutionspuffer eluiert. Nach der Zugabe von festem Harnstoff, um eine Endkonzentration von etwa 8 M für jede Proteinprobe zu erreichen, und der Verdünnung oder Dialyse, um die NaCl-Konzentrationen unter 5 mM zu reduzieren, erfolgte die Endreinigung jedes richtig gefalteten Fusionsproteinprodukts dann durch Ionenaustauschchromatographie (S-Sepharose, Pharmacia, 1,6 (i.D.) durch eine 90 Zentimeter lange Säule in einem Puffer, enthaltend 8 M Harnstoff, 5 mM Tris-HCl (aus 1 M Stammlösung bei pH 8) und 25 mM Natriumacetat (aus 1 M Stammlösung bei pH 5), die bei 2 ml/min eluiert wurde). Nach der Dialyse gegen wässrigen Puffer (z.B. phosphatgepufferte Salzlösung) wurde jedes reine und richtig zurückgefaltete Fusionsprotein in Erträgen von 2–6 mg pro Liter gezüchteter Kultur gewonnen. Jedes Protein kann durch analytische Gelfiltration, chemische Vernetzungsanalyse, durch in-vitro-Affinitätsmessungen und durch in-vivo-Wirksamkeit dargestellt werden, um einen stabilen homotrimeren molekularen Komplex zu bilden: Der oligomere Status des H6FXtripb-scFv-(CEA6)-Fusionsproteins wurde durch chemische Vernetzungsanalyse mit DMSI analysiert: In parallelen Experimenten wurden Proben von H6FXtripb-scFv-(CEA6) bei 0,34 mg/ml und TN123 bei 0,28 mg/ml in 0.1 M Natriumborat 30 min bei Raumtemperatur mit ansteigenden Mengen (0–40 μg in insgesamt 12 μl) von DMSI inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 5 μl 3M Tris-HCl pH 9 gequencht und die Proben wurden durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen (21) analysiert. Hiermit wird wie beim Tetranektin gezeigt, dass das H6FXtripb-scFv-(CEA6)-Fusionsprotein ein Trimer von etwa 38 kDa in Lösung ist.
LITERATUR

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Trimerer Polypeptidkomplex, der drei monomere Polypeptide umfasst, worin (i) jedes der monomeren Polypeptide ein Tetranektin trimerisierendes Strukturelement (TTSE) umfasst, wobei das TTSE ein Polypeptid mit mindestens 68% Aminosäuresequenzidentität zu der in 2 gezeigten Konsensussequenz ist, und (ii) mindestens eines der monomeren Polypeptide mit mindestens einer heterologen Einheit kovalent verbunden ist.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 1, wobei die Sequenzidentität mit der Konsensussequenz mindestens 75% ist.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 1, wobei die Sequenzidentität mit der Konsensussequenz mindestens 81% ist.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 1, wobei die Sequenzidentität mit der Konsensussequenz mindestens 87% ist.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 1, wobei die Sequenzidentität mit der Konsensussequenz mindestens 92% ist.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 1, wobei das TTSE die in 2 gezeigte Konsensussequenz umfasst.
Trimerer Polypeptidkomplex nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das TTSE vom menschlichen Tetranektin, murinen Tetranektin, C-Typ-Lektin von Rinderknorpel oder C-Typ-Lektin von Haifischknorpel abgeleitet ist.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 7, worin das TTSE von menschlichem Tetranektin abgeleitet ist und die in 1 gezeigten Aminosäurereste V17 bis V49 (Exon 2) umfasst.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 8, worin das von menschlichem Tetranektin abgeleitete TTSE weiterhin die in SEQ ID NR.: 7 gezeigten Aminosäurereste C50 bis K52 (Exon 3) umfasst.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 9, worin der Aminosäurerest C50 in einen anderen Aminosäurerest mutagenisiert ist, einschließlich einem Aminosäurerest ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Serin, Threonin und Methionin.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 1, wobei das monomere Polypeptid weiterhin die in 1 gezeigten Aminosäurereste E1 bis D16 (Exon 1) umfasst.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 8, wobei mindestens ein Aminosäurerest von Exon 2, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäurerest Nr. 21, 22, 24, 25, 27, 28, 31, 32, 35, 39, 41, 42, durch einen nicht-Helix brechenden Aminosäurerest ersetzt ist, wobei sich die Aminosäurerest-Nummer auf die in SEQ ID NR.: 7 gezeigten Aminosäurerest beziehen.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 11, wobei Aminosäurerest Nr. 6 durch einen nicht-Helix brechenden Aminosäurerest ersetzt ist, wobei sich die Aminosäurerest-Nummer auf die Aminosäurereste in SEQ ID NR.: 7 bezieht.
Trimerer Polypeptidkomplex nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das TTSE ein Heptad-Repeat mit der Formel a-b-c-d-e-f-g (N bis C) umfasst, wobei die Mehrzahl der Aminosäurereste a und d hydrophobe Aminosäurereste sind.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 14, worin das Heptad dreimal wiederholt ist und worin die Aminosäurereste der Sequenzpositionen a und d beim dritten Auftreten des Heptad-Repeats Glutaminreste sind.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 1, der bei Temperaturen bis 70°C einschließlich des Temperaturbereichs 50–70°C stabil ist.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 1, der bis zu 6 heterologe Einheiten umfasst.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine heterologe Einheit ein Polypeptid ist.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine heterologe Einheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Liganden-bindenden Struktur, einem Toxin, einer nachweisbaren Markierung, einer in situ aktivierbaren Substanz, einem Enzym, einer radioaktiven Einheit, einem Cytokin, einem nicht-proteinartigen Polymer, wie einem polymeren Alkaloid, einem Polyalkohol, einem Polysacharid, einem Lipid und einem Polyamin, einem Photo-Vernetzungsmittel und einem Rest, der die Konjugation des Polypeptids an das Ziel erleichtert.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 19, wobei die Liganden-bindende Struktur ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Rezeptormolekül, dem Liganden-bindenden Teil des Rezeptormoleküls, einem Antikörper, einem Antigen-bindenden Antikörperfragment und einem Molekül mit Antikörper-Eigenschaften.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine heterologe Einheit C-terminal zum monomeren Polypeptid positioniert ist.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine heterologe Einheit N-terminal zum monomeren Polypeptid positioniert ist.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 1, der mindestens eine heterologe Einheit umfasst, die N-terminal zum monomeren Polypeptid positioniert ist und mindestens eine heterologe Einheit umfasst, die C-terminal zum monomeren Polypeptid positioniert ist.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 23, wobei die mindestens eine heterologe Einheit, die N-terminal zum monomeren Polypeptid positioniert ist, sich von der mindestens einen heterologen Einheit, die C-terminal zum monomeren Polypeptid positioniert ist, unterscheidet.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 1, wobei die mindestens eine heterologe Einheit kovalent mit dem monomeren Polypeptid, über eine Peptidbindung zum N- oder C-Terminus der monomeren Polypeptidkette, über eine Peptidbindung zu einer Seitenkette im monomeren Polypeptid, über eine Bindung zu einem Cysteinrest, oder bei mehr als einer heterologen Einheit mit Kombinationen dieser Stellen verknüpft ist.
Trimerer Polypeptidkomplex nach einem der vorstehenden Ansprüche, dem jegliche freie Amino- und/oder Carboxygruppe fehlt.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 1, der homotrimer ist.
Trimerer Polypeptidkomplex nach Anspruch 1, der heterotrimer ist.
Verfahren zur Herstellung eines trimeren Polypeptidkomplexes nach Anspruch 1, das (i) die Expression oder Synthese der monomeren Polypeptide nach Anspruch 1, (ii) das Bewirken der Komplexbindung zwischen den monomeren Polypeptiden und (iii) das Isolieren des resultierenden trimeren Polypeptidkomplexes und wahlweise das Unterwerfen des trimeren Polypeptidkomplexes weiterer Verfahrensschritte umfasst.
Kit, der einen trimeren Polypeptidkomplex nach Anspruch 1 umfasst.
Trimerer Polypeptidkomplex nach einem der Ansprüche 1 bis 28 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung eines trimeren Polypeptidkomplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 28 als ein Bestandteil eines chimären Produkts mit geringer antigener Wirkung in Menschen verglichen mit Formulierungen, die einen oder mehrere Bestandteile nicht-menschlichen Ursprungs umfassen.
Verwendung eines trimeren Polypeptidkomplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 28 als Vehikel für das Zusammenfügen von Antikörperfragmenten in oligomere oder multivalente Einheiten zur Erzeugung von künstlichen chimerären Antikörpern mit vorher gewählten pharmakokinetischen und/oder pharmakodynamischen Eigenschaften.
Verwendung eines trimeren Polypeptidkomplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 28 für Proteinbank-Technologie, wie die Phagen-Display-Technologie.
Verwendung eines trimeren Polypeptidkomplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 28 zur Herstellung eines Arzneimittels.
Verwendung nach Anspruch 35, wobei das Arzneimittel weiterhin einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 35 oder 36, wobei das Arzneimittel über eine Route zu verabreichen ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: der intravenösen Route, der intraarteriellen Route, der transmembranen Route über das Bucca-, Anal-, Vaginal- oder Konjunktivalgewebe, der intranasalen Route, der pulmonalen Route, der transdermalen Route, der intramuskulären Route, der subkutanen Route, der intrathekalen Route, durch Impfung in Gewebe wie einem Tumor, oder durch ein Implantat.
Verwendung nach Anspruch 35, worin das trimere Polypeptid in einem Liposom enthalten ist.