DE68923496T2

DE68923496T2 - Verfahren zur Herstellung von motilinähnlichen Polypeptiden und seine Expression.

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Publication number: DE68923496T2
Application number: DE68923496T
Authority: DE
Inventors: Katsuya Sanwa Kagaku Fujimura; Masayasu Sanwa Kagaku K Kurono; Takahiko Sanwa Kagaku K Mitani; Kiichi Sanwa Kagaku Kenk Sawai; Haruo Sanwa Kagaku K Takahashi; Kenichi Sanwa Kagaku Ke Tanaka
Original assignee: Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd
Current assignee: Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd
Priority date: 1988-08-24
Filing date: 1989-08-17
Publication date: 1996-04-18
Anticipated expiration: 2009-08-18
Also published as: ATE125298T1; US5474913A; JP2753274B2; EP0355720A1; EP0355720B1; CA1339358C; ES2078229T3; KR900003369A; DE68923496D1; KR960011525B1; CN1040822A; JPH0257192A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Motilin-artigem Polypeptid, eine rekombinante DNA dafür und ein Plasmid, in das die rekombinante DNA insertiert ist, gemäß den Ansprüchen 1, 3 und 4. Ein Motilin-artiges Polypeptid, das Leucin anstelle der 13. Aminosäure Methionin von Motilin enthält, ist aus der EP-A-259 891 bekannt.
Das Polypeptid der Erfindung kann als pharmazeutisches Mittel und spezieller zur Heilung von Gastroenteropathien verwendet werden.
Motilin ist eines der Peptidhormone, die zuerst aus der Schleimhaut des oberen Schweinedünndarms isoliert wurden, und seine Aminosäuresequenz wurde von Brown J.C. et al. ["Gastroenterology" Band 62, Seiten 401 - 404 (1972) und "Can. J. Biochem." Band 52, Seiten 7 - 10 (1974)] bestimmt. Das Schweine-Motilin besteht aus 22 Aminosäuren und weist ein Molekulargewicht von ungefähr 2700 auf.
Inzwischen ist es den gegenwärtigen Erfindern gelungen, eine klonierte cDNA zu isolieren, die für einen Human-Motilinvorläufer kodiert, wobei in dessen Nukleotidsequenz ein Teil eingeschlossen ist, der die gleiche Aminosäuresequenz wie diejenige des Schweine-Motilins festlegt, so daß es klargemacht worden ist, daß das Human-Motilin die gleiche Aminosäuresequenz wie diejenige des Schweinemotilins aufweist [Japanisches Patent Nr. Sho 63 - 276489 (A), das der US-Patentanmeldung Ser. No. 07/190849 und der Europäischen Patentanmeldung Nr. 88107108.8 entspricht].
Als physiologische Wirkungen des Motilins sind eine Hypermotilitätswirkung auf das Verdauungssystem und eine kontrahierende Wirkung auf die glatte Muskulatur des Gastroduodenalsystems und des Kolons gut bekannt. Was die Hypermotilitätswirkung betrifft, ist berichtet worden, daß die Rate der Magenentleerung verkürzt wird ["Gastroenterology" Band 80, Seiten 456 - 460 (1981)], und was die kontrahierende Wirkung auf die glatte Muskulatur im Verdauungstrakt betrifft, ist es bekannt, daß Motilin eine starke kontrahierende Wirkung auf das Kaninchen- und menschliche Gastrointestinalsystem zeigt, die unabhängig von einem Nervensystem ist. Darüber hinaus ist kein Bericht über irgendwelche spezifischen Nebenwirkungen erschienen. Deshalb ist es in Betracht gezogen worden, daß Motilin zum Heilen von Gastroenteropathien im Zeitraum nach einer Operation und für eine Diagnose derselben nützlich ist. Im Zusammenhang damit bemerke man bitte, daß Prostaglandin in breitem Umfang zum Heilen von Gastroenteropathien verwendet worden ist, wobei dieses Arzneimittel relativ starke Nebenwirkungen aufweisen kann.
Es ist auch berichtet worden, daß chemisch synthetisierte Motilin- Analoga - wobei das Methionin in der Stellung 13 entweder durch Leucin oder Norleucin substituiert wurde - biologische Wirkungen aufweisen, die denjenigen von reinem nativen Schweine-Motilin ähnlich sind ["Scand. J. Gastroenterology" Band 11, Seiten 119 - 203 (1976) und andere], und demgemäß ist es erwogen worden, daß das Methionin an der Stellung 13 beinahe keinen Einfluß auf die Wirkung des Motilins aufweist.
Gemäß einem breit akzeptierten technischen Verfahren ist Motilin durch Extraktion aus Schweine-Organgewebe erhalten worden, und demgemäß war es ziemlich schwierig, durch derartige Verfahren Motilin in großer Menge zu erhalten. Da Motilin ein Polypeptid ist, das aus 22 Aminosäuren besteht, ist eine Herstellung in großem Maßstab schwierig, selbst wenn eine chemische Synthese angewendet wird. D.h., Motilin ist aufgrund seiner schlechten Herstellbarkeit nicht tatsächlich für die klinische Anwendung verwendet worden, obwohl man seine Wirksamkeit als Mittel zum Heilen von Gastroenteropathien erwartet hat.
Deshalb sind verschiedene Untersuchungen vorgenommen worden, unter Verwendung der sogenannten "Biotechnologie" Polypeptide mit einer Motilin-artigen biologischen Wirkung zu annehmbaren Kosten herzustellen [Japanische Patente Nr. 63 - 71195 (A) und 1 - 102096 (A)].
Ein Grundziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines Motilin-artigen Polypeptids bereitzustellen, das einfacher ist als jegliches Verfahren, das vor dieser Erfindung entwickelt worden ist.
Ein zusätzliches, aber wichtiges Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines Motilin-artigen Polypeptids mit einer ziemlich hohen Effizienz bereitzustellen.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, eine neue rekombinante DNA zur Verwendung bei der Durchführung des Verfahrens bereitzustellen.
Noch ein anderes Ziel der Erfindung ist es, ein exprimierendes Plasmid bereitzustellen, in das die rekombinante DNA insertiert ist.
Gemäß der Erfindung wird das Grundziel durch ein Verfahren zur Herstellung eines Motilin-artigen Polypeptids der Formel (I)
erreicht, worin X ein Rest einer von Met und Asp verschiedenen Aminosäure ist, welches im wesentlichen aus den Schritten besteht:
Synthetisieren eines einzelsträngigen DNA-Fragments, das für ein Leader-Polypeptid der Formel (II)
kodiert, und seines komplementären einzelsträngigen DNA-Fragments;
Herstellen einer ersten doppelsträngigen DNA mit den einzelsträngigen DNA-Fragmenten;
Synthetisieren eines einzelsträngigen DNA-Fragments, das für ein Polypeptid der Formel (I) kodiert, aber mit Asp-Gly-Ile-Leu-Resten an dessen C-Terminus, und seines komplementären einzelsträngigen DNA- Fragments;
Herstellen einer zweiten doppelsträngigen DNA mit den letztgenannten zwei einzelsträngigen DNA-Fragmenten;
Ligieren der ersten doppelsträngigen DNA an die zweite doppelsträngige DNA, so daß die doppelsträngigen DNAs in Tandem-Anordnung vorliegen;
Addition einer Erkennungsstelle eines spezifischen Restriktionsenzyms an jedes terminale Ende des resultierenden doppelsträngigen DNA-Fragments;
Spalten eines Plasmids, das eine andere Erbinformation aufweist, mit besagten Restriktionsenzymen;
Ligieren des doppelsträngigen DNA-Fragments an jede Spaltungsstelle des gespaltenen Plasmids, um ein rekombinantes Plasmid zu konstruieren;
Einführen des rekombinanten Plasmids in einen Prokaryonten, um eine Transformation desselben zu bewirken;
Kultivieren des resultierenden Transformanten, um darin ein Polypeptid herzustellen, das das Leader-Polypeptid der Formel (II) und eine Motilin-artige Gensequenz der Formel (I), aber mit Asp-Gly-Ile-Phe- Met-Resten an deren C-Terminus, als Teil eines Fusionsproteins umfaßt;
Lysieren des Transformanten und Behandeln desselben mit Bromcyan und Endopeptidase, um das Polypeptid der Formel (I) aus dem Fusionsprotein abzutrennen; und
Fraktionieren der resultierenden Mischung, um das Polypeptid der Formel (I) zu reinigen.
Der Grund dafür, daß das Symbol X an der Stellung der 13. Aminosäure als ein Aminosäurerest aufgeführt wird, der von Met und Asp verschieden ist, liegt darin, daß, falls X Met ist, das gewünschte Polypeptid mit einer Motilin-artigen Wirkung nicht erhalten werden kann, da auch am Met in der Stellung 13 eine Spaltung auftritt, wenn das Fusionsprotein mit Bromcyan behandelt wird, und daß, falls X Asp ist, das gewünschte Polypeptid ebenso nicht erhalten werden kann, da auch am Asp in Stellung 13 eine Spaltung aufgrund der Behandlung mit Endopeptitase eintritt, welche erforderlich ist, um überschüssige Aminosäurereste zu entfernen, und zwar aufgrund der Tatsache, daß die einzelsträngige DNA, die dem durch Formel (I) dargestellten Polypeptid entspricht, getrennt synthetisiert wird, um ihre Synthese bequem zu machen, und darin ein Kodon (GAC) vorhanden ist, das nach der Aminosäuresequenz - - - Lys-Gly- Glu- an der C-terminalen Seite für Asp kodiert. Jedes der Polypeptide, das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden soll, weist eine Motilin-artige biologische Wirkung auf, obwohl das Maß an Aktivität verschieden ist, abhängig von der Art des Aminosäurerestes, der durch das Symbol X dargestellt wird. Als Aminosäurerest X in der Stellung 13 ist Leucin (Leu), Valin (Val) oder dergleichen vorzuziehen. Die Polypeptide, in denen der Aminosäurerest in der Stellung 13 Glycin (Gly) oder Prolin (Pro) ist, sind nicht vorzuziehen, da diese eine relativ geringe Aktivität zeigen, wie aus ihrer Stereo-Struktur abgeschätzt wird. Es ist gefunden worden, daß Asparagin (Asn), Glutamin (Gln), Threonin (Thr) und Serin (Ser) als nicht-geladene polare Aminosäuren geeignet sind, da die Polypeptide mit einem derartigen Aminosäurerest die Expressionseffizienz steigern. Der Grund dafür, daß der terminale Aminosäurerest in dem Leader-Polypeptid Methionin (Met) ist, liegt darin, daß der Leader- Sequenzteil so durch Behandlung mit Bromcyan leicht entfernt werden kann. Gemäß dem Verfahren der Erfindung kann die einzelsträngige DNA, die durch die Formel (I) dargestellt wird, gesondert synthetisiert werden, um ihre Synthese einfach zu gestalten.
Die synthetisierte doppelsträngige DNA, die für ein Motilin-artiges Gen kodiert, das an Stellung 13 substituiert ist, kann mit einer herkömmlichen Technik in einen Vektor, wie ein Plasmid, insertiert werden, z.B. indem man das Plasmid aus E. coli entnimmt, das Plasmid reinigt, das Plasmid mit einem Restriktionsenzym behandelt, um dasselbe an einer spezifischen Basenstelle zu schneiden, und die doppelsträngige DNA mit einer DNA-Ligase an die Spaltungsstelle des geschnittenen Plasmids ligiert, um ein Plasmid mit der rekombinanten DNA zu rekonstruieren. Gemäß dem Verfahren der Erfindung kann weiter ein Plasmid, in das zwei oder mehr 13-substituierte Motilin-artige Gene in Tandem-Anordnung insertiert sind, hergestellt werden, indem man ein Plasmid, in das das 13-substituierte Motilin-artige Gen insertiert ist, mit 2 Restriktionsenzymen behandelt, um durch Schneiden des Plasmids an einem Teil stromaufwärts vom 13-substituierten Motilin-artigen Gen und an einem anderen Teil im Plasmid ein Fragment zu gewinnen, ein anderes Plasmid derselben Art, das die rekombinante DNA aufweist, mit dem Restriktionsenzym behandelt, das das gleiche ist, wie dasjenige, das zum Schneiden des ersten Plasmids an dessen innerem Teil verwendet worden ist, und mit einem anderen Restriktionsenzym behandelt, das die Stromabwärts-Stelle des 13-substituierten Motilin-Gen-Teils mit der Spaltungsstelle der besagten Stromaufwärts-Stelle gleich macht, das gewonnene Fragment an die Spaltungsstelle in Tandem-Anordnung mit einer DNA-Ligase ligiert, um ein Plasmid zu rekonstruieren, und, falls notwendig, die Verfahren wiederholt. In diesem Fall ist es vorzuziehen, die 13-substituierten Motilin-Gene mit Peptiden zu verbinden, beispielsweise mit denjenigen, die aus Asp-Gly-Ile-Phe-Met bestehen, da eine Spaltung an der Met-Stellung stattfinden wird, wenn Bromcyan in dem Schritt zur Abtrennung des 13-substituierten Motilin-artigen Polypeptids aus dem Fusionsprotein einwirkt, und eine andere Spaltung am N-Terminus von Asp stattfinden wird, wenn eine Endopeptidase (Asp-N) auf das resultierende Produkt einwirkt, so daß das an der Stellung 13 ausgetauschte Motilin-artige Polypeptid in einer Form, die keinen überschüssigen Peptidrest aufweist, erhalten werden kann.
Das Motilin-artige Polypeptid kann in großer Menge erhalten werden, indem man einen Mikroorganismus oder eine eukaryontische Zelle mit dem Plasmid transformiert, in das ein oder mehrere Motilin-artige Gene insertiert sind, und den Mikroorganismus oder die eukaryontische Zelle kultiviert.
Wie aus dem obigen klar wird, ist die rekombinante DNA gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß das Leader-Polypeptid mindestens 6 nicht-geladenen polaren Aminosäureresten mit Methionin an seinem C- terminalem Ende verknüpft enthält und nach seinem Methionin weiter mit 13-substituiertem Motilin verknüpft ist, in dem der Aminosäurerest an der Stellung 13 von Methionin und Asparaginsäure verschieden ist. In diesem Fall ist es vorzuziehen, daß das Polypeptid, das dem 13-substituierten Motilin entspricht, in Mehrzahl und in Tandem-Anordnung verbunden vorliegt und daß jedes der Polypeptide, für die das 13-substituierte Motilin-Gen kodiert, mit den Peptiden verknüpft ist, die eine Aminosäuresequenz Asp-Gly-Ile-Phe-Met enthalten.
Das Expressionsplasmid gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die genannte rekombinante DNA darin insertiert ist.
Die Erfindung wird nun weiter mit Bezug auf Beispiel und Testbeispiele bezüglich der pharmakologischen Aktivität erklärt, die auf die Zeichnung Bezug nehmen, in der
Fig. 1 eine Darstellung ist, die Schritte zeigt, um ein Plasmid mit einer rekombinanten DNA herzustellen, in das ein Motilinartiges Gen insertiert ist;
Fig. 2 eine Darstellung ist, die der von Fig. 1 ähnlich ist, aber in der zwei Motilin-artige Gene in Tandem-Anordnung in ein Plasmid insertiert sind; und
Fig. 3 ein Schaubild ist, das die Ergebnisse der Wirkungen von 13- Leucin-Motilin (das später als [Leu¹³]-Motilin bezeichnet wird), das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten wurde, und eines reinen Motilins, das gemäß einem herkömmlichen Verfahren erhalten wurde, bei einer Darmkanal- Kontraktion zeigt, die gemäß dem Magnus-Verfahren gemessen wurde.
Im nachstehenden betrifft das Beispiel ein Verfahren zur Herstellung des Motilin-artigen Polypeptids, in dem das Methionin an der Stellung 13 in Motilin zu Leucin ausgewechselt wurde, aber man stelle bitte fest, daß andere 13-substituierte Motilin-artige Polypeptide, in denen der Aminosäurerest in der Stellung 13 von Methionin und Asparaginsäure verschieden ist, durch ein Verfahren, das dem im Beispiel beschriebenen ähnlich ist, hergestellt werden können.

Beispiel

(1) Synthese von DNA, die für das Polypeptid mit einer Motilin-artigen pharmakologischen Aktivität kodiert.

Es ist bereits bekannt, daß das Human-Motilin die folgende Aminosäuresequenz aufweist.
Weiter ist bekannt, daß Met in Stellung 13 fast keinen Einfluß auf die Aktivität des Motilins aufweist.
Deshalb [wurde] das folgende doppelsträngige DNA-Fragment, das in der Formel (2) dargestellt wird, [synthetisiert], umfassend eine Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz von [Leu¹³]-Motilin kodiert, eine andere Nukleotidsequenz, die für eine Leader-Peptidsequenz mit einer Anzahl von nicht-geladenen polaren Aminosäureresten (Met-Thr- Met-Ile-Thr-Asn-Ser-Asn-Gln-Asn-Gln-Asn-Gln-Asn-Gln-Asn-Gln-Asn-Gln-Ile- Phe-Met) kodiert, wobei die Nukleotide, die für das Leader-Peptid kodieren, durch Methionin mit den Nukleotiden, die für die N-terminale Seite von [Leu¹³]-Motilin kodieren, verbunden sind, und noch eine andere Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz (Asp-Gly-Ile-Leu) kodiert, wobei die zuletzt genannte Nukleotidsequenz mit den Nukleotiden verbunden ist, die für die C-terminale Seite von [Leu¹³]-Motilin kodieren. Formel (2)
Die durch die Formel (2) dargestellte doppelsträngige DNA wurde wie unten aufgeführt synthetisiert.
Zuerst wurden unter Verwendung eines DNA-Synthetisierers, der als "Gene-Assembler" durch Pharmacia, Schweden, auf dem Markt ist, die folgenden 6 einzelsträngigen DNAs mit den folgenden Nukleotidsequenzen synthetisiert. Von diesen sind die DNAs (3) und (8), (4) und (7) sowie (5) und (6) zueinander komplementärsträngig, mit Ausnahme einer terminalen Stelle. Formel (3) Formel (4) Formel (5) Formel (6) Formel (7) Formel (8)
Jede der durch die Formeln (3) bis (8) dargestellten einzelsträngigen DNAS wurde mit einer Polynukleotidkinase behandelt, um deren 5'-terminale Stellen zu phosphorylieren, und dann wurde jedes der komplementären DNA-Strangpaare der Formeln (3) und (8), (4) und (7) sowie (5) und (6) verbunden, um 3 doppelsträngige DNAs herzustellen. Die resultierenden doppelsträngigen DNAS wurden in Tandem-Anordnung unter Verwendung von DNA-Ligase ligiert, um das durch die Formel (2) dargestellte DNA-Fragment herzustellen.

(2) Insertion des DNA-Fragments in einen Expressionsvektor

Das Vorgehen oder Verfahren für das Insertieren des DNA-Fragments, das auf die in Punkt (1) beschriebene Weise synthetisiert wurde, in einen Expressionsvektor wird mit Bezug auf Fig. 1 erklärt.
Ein für eine Expression in E. coli zu verwendender, im Handel erhältlicher Vektor ("pKK223-3", durch Pharmacia, Schweden auf dem Markt befindliches Plasmid) wurde unter Verwendung der Restriktionsenzyme HindIII und EcoRI geschnitten. An Enden des resultierenden Plasmid- Fragments wurde unter Verwendung einer DNA-Ligase das synthetisierte DNA- Fragment ligiert, um das Plasmid-Fragment zu einem ringförmigen Plasmid zu rekonstruieren, das als pKMO1 bezeichnet wurde. Das rekonstruierte Plasmid wurde so konstruiert, daß es an einer Position nach 10 Resten der SD-Sequenz stromabwärts vom Tac-Promotor eine Proteinsynthese initiierte, und demgemäß ist es, wenn das Plasmid in E. coli insertiert wird, um dieses zu kultivieren, möglich, unter Verwendung von Isopropylthio-β-D-galaktopyranosid (IPTG) oder dergleichen ein Protein zu erzeugen.
Man bemerke, daß der rekonstruierte Vektor Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme BglII und BamHI aufweist.

(3) Konstruktion eines Expressionsplasmids mit 2 oder mehr Genen von [Leu¹³]-Motilin

Dieses wird mit Bezug auf Fig. 2 erläutert.
Zuerst wird eines der Plasmide (pKMO1), die auf die in Punkt (2) beschriebene Weise erhalten wurden, mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI behandelt, um das Plasmid stromaufwärts vom [Leu¹³]-Motilin-Genteil und an einem Teil im Vektor zu schneiden, um ein Fragment zu erhalten. Dann wurde ein anderes Plasmid (pKMO1) mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BglII behandelt, um das Plasmid zu schneiden, so daß eine Spaltungsstelle im Vektor gleich mit der im ersten Plasmid erhaltenen war und eine andere Spaltungsstelle stromabwärts vom [Leu¹³]-Motilin-Genteil im zweiten Plasmid lag. An Enden des zweiten Plasmidfragments wurde das vom ersten Plasmid gewonnene Fragment unter Verwendung einer DNA-Ligase ligiert, um ein Plasmid zu konstruieren,, das zwei Gene von [Leu¹³]-Motilin aufwies, und wir benannten es "pKMO2". In diesem Fall sind die [Leu¹³]- Motilin-Gene durch ein Peptid verbunden, das für die Aminosäuresequenz Asp-Gly-Ile-Phe-Met kodiert.
Man bemerke, daß die Spaltungsstelle aufgrund des Restriktionsenzyms BamHI und die andere Spaltungsstelle aufgrund des Restriktionsenzyms BglII unter Verwendung der DNA-Ligase so ligiert wurden, daß der resultierende ligierte Teil eine Stelle wurde, die von keinem der Restriktionsenzyme erkannt werden kann. Deshalb kann ein rekonstruiertes Plasmid mit einer fakultativen Anzahl an [Leu¹³]-Motilin-Genen in Tandem- Anordnung und einer Leader-Peptidsequenz stromaufwärts davon über Methionin erhalten werden, indem man die Spaltungs- und Ligierungsverfahren wiederholt.

(4) Herstellung von Fusionsprotein, das 13-Leucin-Motilin enthält.

Ein Plasmid (pKMO4) mit einem Insert einer Tandem-Anordnung von 4 [Leu¹³]-Motilin-Genen wurde verwendet. Das Plasmid wurde durch E. coli (JM105) aufgenommen, und der resultierende Transformant wurde unter Verwendung eines Fermentors (Typ D, hergestellt von Able Co.) bei 30ºC einer Kultivierung unter Luft und Kohlensäure in einem Kulturmedium (beispielsweise 0,5% Casaminosäure, der M-9 Medium zugesetzt war) unterzogen, das Ampicillin (50 ug/ml) enthielt. Als A&sub6;&sub6;&sub0; 0,6 - 0,8 wurde, wurde Isopropylthio-β-D-galaktopyranosid (IPTG) zugesetzt, und dessen Endkonzentration wurde auf 1,5 mM eingestellt.
Danach wurde die Kultivierung 16 Stunden fortgesetzt, und man zentrifugierte (8000 U/min, 4ºC, 5 Minuten), um Zellen zu gewinnen. Ein Teil der Zellen wurde genommen und durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (15%) analysiert, wodurch man fand, daß das gewünschte Fusionsprotein ungefähr 30% des Gesamtproteins erreichte. Es wurde angenommen, daß dieses gute Ergebnis durch die Tatsache herbeigeführt wurde, daß der Leader-Polypeptidsequenzteil in der synthetisierten DNA, die in das Plasmid insertiert war, mit ziemlich erhöhter Wirksamkeit die Bildung von Einschlußkörpern beschleunigte, die gegen Proteasen sehr stabil sind.

(5) Isolierung und Reinigung von [Leu¹³]-Motilin

Ein Zellbrei (100 ml), der auf die in Punkt (4) beschriebene Weise erhalten wurde, wurde in 30 ml 10 mM PBS-EDTA (pH 8,0) suspendiert, und die Suspension wurde mit Ultraschall behandelt, um die Zellen aufzubrechen. Der Zellrückstand wurde durch Zentrifugation (18000 U/min, 30 Minuten) in ein Pellet überführt. Das resultierende Pellet enthielt Fusionsprotein des Leader-Peptids und eines Tetramers von [Leu¹³]-Motilin.
Deshalb wurde das Pellet (Proteinmenge: ungefähr 100 mg) in 30 ml 70%-iger Ameisensäure gelöst. Zu der Lösung wurden 30 mg Bromcyan gegeben, und man ließ über Nacht unter Temperaturbedingungen von unterhalb 37ºC reagieren. Danach wurde destilliertes Wasser (200 ml) dazugegeben, und man gefriertrocknete, um die Ameisensäure und das Bromcyan zu entfernen. Das resultierende getrocknete Pulver wurde in 0,1%-igem Trifluoracetat gelöst, und man entfernte unlösliches Material. Die resultierende Lösung wurde unter den folgenden Bedingungen in eine HPLC injiziert.
Säule: Micropondasphere C-18 (3,9 mm x 15 cm), (hergestellt von Waters Co.)
Durchflußgeschwindigkeit: 0,8 ml / min.
Eluens: Linearer Gradient von 5% bis 70% Acetonitril in 0, 1%-igem Trifluoracetat (40 Minuten).
Fraktionen im Hauptpeak-Teil der HPLC wurden gewonnen und gefriergetrocknet. Ein Teil des getrockneten Pulvers (100 ug) wurde genommen und in 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,0, 100 ul) gelöst. Nachdem man 0,1 ug Endoprotease Asp-N, im Handel durch Böhringer Mannheim GmbH, Deutschland, dazugegeben hatte, ließ man die Lösung 16 Stunden bei 37ºC reagieren. Die Reaktionslösung wurde unter den obigen Bedingungen in eine HPLC injiziert, wodurch man das gewünschte [Leu¹³]-Motilin als Fraktionen in einem Hauptpeak-Teil erhielt.
Die Nukleotidsequenz dieses [Leu¹³]-Motilins wurde unter Verwendung eines Peptid-Sequenzierers, im Handel durch Bio-Systems Co., überprüft, wobei man fand, daß seine Sequenz die richtige war.
Es wurde durch die obigen Verfahren gefunden, daß 400 - 500 mg des gewünschten Motilin-artigen Polypeptids durch die Kultivierung von 1 Liter E. coli erhalten werden können.

Test der biologischen Aktivität

(Messung der Kontraktionswirkung auf den Darmkanal)

Die Kontraktionswirkung auf den Darmkanal wurde gemäß dem Magnus-Verfahren unter Verwendung eines Kaninchen-Duodenums gemessen ["J. Pharm. Pharmac." Band 28, Seiten 650 - 651 (1976)], mit dem im Beispiel erhaltenen [Leu¹³]-Motilin als Testprobe und einem reinen Motilin, das unter Verwendung eines herkömmlichen Extraktionsverfahrens gewonnen wurde, als Kontrollprobe. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt.
Es wird aus der Figur ersichtlich, daß bestätigt wurde, daß das durch das Verfahren dieser Erfindung erhaltene [Leu¹³]-Motilin in gleichem Maß wie das reine Motilin eine Kontraktionswirkung auf den Verdauungskanal besitzt, wenn eine Kontraktion, die durch die Bezugssubstanz Acetylcholin (10&supmin;&sup6; M) verursacht wird, als 100% festgesetzt wird.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids der Formel I)

worin X ein Rest einer von Met und Asp verschiedenen Aminosäure ist,

welches im wesentlichen aus den Schritten besteht:

Synthetisieren eines einzelsträngigen DNA-Fragments, das für ein Leader-Polypeptid der Formel (II)

kodiert, und seines komplementären einzelsträngigen DNA- Fragments;

Herstellen einer ersten doppelsträngigen DNA mit den einzelsträngigen DNA-Fragmenten;

Synthetisieren eines einzelsträngigen DNA-Fragments, das für ein Polypeptid der Formel (I) kodiert, aber mit Asp- Gly-Ile-Leu-Resten an dessen C-Terminus, und seines komplementären einzelsträngigen DNA-Fragments;

Herstellen einer zweiten doppelsträngigen DNA mit den letztgenannten zwei einzelsträngigen DNA-Fragmenten;

Ligieren der ersten doppelsträngigen DNA an die zweite doppelsträngige DNA, so daß die doppelsträngigen DNAs in Tandem-Anordnung vorliegen;

Addition einer Erkennungsstelle eines spezifischen Restriktionsenzyms an jedes terminale Ende des resultierenden doppelsträngigen DNA-Fragments;

Spalten eines Plasmids, das eine andere Erbinformation aufweist, mit besagten Restriktionsenzymen;

Ligieren des doppelsträngigen DNA-Fragments an jede Spaltungsstelle des gespaltenen Plasmids, um ein rekombinantes Plasmid zu konstruieren;

Einführen des rekombinanten Plasmids in einen Prokaryonten, um eine Transformation desselben zu bewirken;

Kultivieren des resultierenden Transformanten, um darin ein Polypeptid herzustellen, das das Leader-Polypeptid der Formel (II) und eine Motilin-artige Gensequenz der Formel (I), aber mit Asp-Gly-Ile-Phe-Met-Resten an deren C-Terminus, als Teil eines Fusionsproteins umfaßt;

Lysieren des Transformanten und Behandeln desselben mit Bromcyan und Endopeptidase, um das Polypeptid der Formel (I) aus dem Fusionsprotein abzutrennen; und

Fraktionieren der resultierenden Mischung, um das Polypeptid der Formel (I) zu reinigen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem das rekombinante Plasmid an einer Stromaufwärts-Position im Plasmid und an einer Position in dem Plasmidteil geschnitten wird, indem man das Plasmid mit zwei verschiedenen Arten von Restriktionsenzymen behandelt, um ein DNA-Fragment zu gewinnen, das für das Polypeptid der Formel (I), aber mit Asp-Gly-Ile-Phe-Met-Resten an dessen C-Terminus, kodiert;

ein anderes rekombinantes Plasmid auf die gleiche Weise wie oben mit dem Restriktionsenzym geschnitten wird, das zum Schneiden an der Position in dem Plasmidteil verwendet wird, und mit einem anderen Restriktionsenzym in einem Stromabwärts-Bereich des Genteils an einer solchen Position geschnitten wird, daß eine Spaltungsposition geschaffen wird, die mit derjenigen der Stromaufwärts-Spaltungsposition gemeinsam ist;

das gewonnene DNA-Fragment unter Verwendung von DNA- Ligase an die Spaltungspsotion des gespaltenen Plasmids ligiert wird, um ein zweites rekombinantes Plasmid mit zwei DNA-Fragmenten zu konstruieren, die für das Polypeptid der Formel (I), aber mit Asp-Gly-Ile-Phe-Met- Resten an dessen C-Terminus anschließend an das DNA- Fragment, das für das Leader-Polypeptid der Formel (II) kodiert, und in Tandem-Anordnung kodieren;

die obigen Verfahren wiederholt werden, um ein Plasmid mit einem Insert zu konstruieren, das das DNA-Fragment, das für das Leader-Polypeptid der Formel (II) kodiert, und anschließend mindestens drei DNA-Fragmente umfaßt, die für das [eine Polypeptid der Formel (I), jedoch mit Asp-Gly-Ile-Phe-Met-Resten an deren C-Terminus, kodieren;

und das resultierende rekombinante Plasmid in den Prokaryonten eingeführt wird, der zur Erzeugung eines Fusionsproteins in dem Mikroorganismus kultiviert wird.

3. Rekombinante DNA, die für ein Motilin-artiges Polypeptid kodiert, die im wesentlichen aus einem einzelsträngigen DNA-Fragment, das für ein Leader-Polypeptid mit der Struktur

kodiert, und dessen komplementärem einzelsträngigem DNA- Fragment sowie aus einer einzelsträngigen DNA, die für ein Polypeptid mit der Struktur

kodiert, worin X ein Rest einer von Met und Asp verschiedenen Aminosäure ist, und dessen komplementärem einzelsträngigem DNA-Fragment besteht.

4. Expressionsvektor zur Herstellung eines Motilin-artigen Polypeptids, in dem eine rekombinante DNA insertiert ist, welche im wesentlichen besteht aus einem einzelsträngigen DNA-Fragment, das für ein Leader-Polypeptid mit der Struktur:

kodiert, dessen komplementärem einzelsträngigem DNA- Fragment, einem einzelsträngigen DNA-Fragment, das für ein Polypeptid mit der Struktur:

kodiert, worin X ein Rest einer von Met und Asp verschiedenen Aminosäure ist, und dessen komplementärem einzelsträngigem DNA-Fragment.

5. Expressionsvektor nach Anspruch 4, in dem mindestens drei der aufeinanderfolgenden einzelsträngigen DNA-Fragmente und ihrer komplementären einzelsträngigen DNA-Fragmente Tandem-artig und wechselseitig durch ein einzelsträngiges Spacer-DNA-Fragment, das für ein(e) [Aminosäuresequenz] Oligopeptid mit der Struktur

Asp-Gly-Ile-Phe-Met

kodiert, und dessen komplementäres einzelsträngiges DNA- Fragment verbunden sind.