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Die Erfindung betrifft ein Protein mit einer
Zellen-aus(ver)breitenden Aktivität wie der von Fibronectin.
lnsbesondere betrifft die Erfindung ein Polypeptid mit
Zellen-ausbreitender Aktivität wie derjenigen von Fibronectin
menschlichen Ursprungs sowie ein Verfahren zu seiner
Herstellung.
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Fibronectin ist ein multifunktionales Glykoprotein, das weit
verbreitet in einer Vielzahl verschiedener tierischer Gewebe
und Körperflüssigkeiten sowie auch auf der Oberfläche
kultivierter Zellen und anderswo vorkommt. Diese Verbindung hat
vielfältige physiologische Wirksamkeiten, so verursacht sie
etwa die Anheftung, Ausbreitung, Auswanderung,
Differenzierung, Proliferation und Phagozytose von Zellen und ist an
Vorgängen, wie etwa der Gewebsregeneration, des
Gewebsaufbaus und dem Schutz vor Infektionen, beteiligt.
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Fibronectin ist ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht
von ca. 250 000 und ist ein Dimer mit einer S-S-Bindung in
der Nähe des C-Terminus. Die Aminosäuresequenz dieses
Moleküls umfaßt drei verschiedene Typen interner repetitiver
Sequenzen und kann in die Typen I, II und III klassifiziert
werden. Zusätzlich hierzu gibt es Domänenstrukturen mit
verschiedenen Funktionen, welche die Anhaftung und
Ausbreitung von Zellen bewirken und die Fähigkeit zur Bindung von
Kollagen, Heparin, Fibrin usw. verleihen. Für diese Domänen
wurden industrielle Anwendungen der in Zusammenhang mit der
Zellanheftung und -ausbreitung stehenden biologischen
Aktivität in Betracht gezogen. Bei der Herstellung eines
Beschichtungsmittels für ein Zellkultursubstrat ist es
beispielsweise möglich, diese Funktion bei der Herstellung
einer Unterlage zu nutzen, an welche Zellen dann binden.
Ferner kann diese Funktion als Beschleuniger der Zellbindung
angewendet werden in Präparationen, wie etwa Collyrium,
Lotionen sowie Mitteln zur Förderung der Wundheilung. Damit
Zellen proliferieren ist es, mit einigen Ausnahmen, nötig,
daß nicht nur allein die Zellanheftung sondern auch das
Phänomen der Ausbreitung (Spreitung) stattfinden.
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Die grundlegende Struktur, welche die für die
Zellanheftungsdomäne von Fibronectin minimal erforderliche Struktur
darstellt, ist die Sequenz Arg-Gly-Asp-Ser (Nature 1984;
309:30-35). In der JA-OS (Tokuhyo) 84-501548 ist ein Peptid
mit Zellen-anheftender Aktivität beschrieben, welches ein
Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 11 500 ist und das
diese Sequenz in seiner Sequenz von 108 Aminosäuren enthält.
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Die Zellanheftungsaktivität dieses Polypeptids mit einem
Molekulargewicht von 11 500 ist jedoch viel geringer als die
von Fibronectin natürlichen Ursprungs, und es ist nicht
unbedingt möglich, diese Aktivität bei den oben erwähnten
praktischen Anwendungen zu nutzen. Diese Schwierigkeit wird
beispielsweise in J. Biol Chem. 260, (1985), 13256-13260
diskutiert. Wir haben ferner dieses Polypeptid vom
Molekulargewicht 11 500 auf gentechnologischem Wege hergestellt
und seine Aktivität mit der von Fibronectin natürlichen
Ursprungs unter Verwendung von normalen Rattennierenzellen
(NRK) verglichen. Das Ergebnis war, daß Fibronectin eine
merkliche Wirkung in einer Dosis von 0,1 bis 1 ug/Schale
aufwies, während eine Dosis von 50 ug/Schale des Polypeptids
mit dem Molekulargewicht 11 500 keine derartige Wirkung
zeigte.
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Die vorliegende Erfindung identifiziert die
Aminosäuresequenz, die eine wesentliche Zellen-ausbreitende Wirkung
besitzt, als das Peptid der Zellen-ausbreitenden Domäne von
Fibronectin und liefert ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
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Die vorliegende Erfindung liefert Polypeptide mit
Zellenausbreitender Aktivität, die eine Aminosäurensequenz der
folgenden allgemeinen Formel (I) haben:
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Die
vorliegende Erfindung liefert ferner rekombinante
Plasmide, die DNA enthalten, welche für die Polypeptide (I)
codiert, sowie Transformanten, welche diese rekombinanten
Plasmide tragen. Die vorliegende Erfindung liefert außerdem
ein Verfahren zur Herstellung der Polypeptide (I) durch
Kultivierung dieser Transformanten und Isolieren der
Polypeptide aus dem Kulturmedium.
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Wir haben gefunden, daß das Polypeptid, für das die oben
genannte JA-OS 84-501548 Zellen-anheftende Aktivität
beansprucht und das ein 11,5 kDalton-Polypeptid (mit einer
Sequenz von 108 Aminosäuren) von Fibronectin humanen Ursprungs
(im folgenden als FN bezeichnet) ist, fast keine
Zellen-ausbreitende Wirkung aufweist, daß jedoch das Peptid mit der
Sequenz von 283 Aminosäuren (Ala¹²³&sup5;-Me¹&sup5;¹&sup7;), das sich vom N-
Terminus des genannten Polypeptids erstreckt, etwa die
gleiche Höhe an Zellen-ausbreitender Aktivität aufweist wie FN.
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Das letztere Peptid und seine gentechnologische Herstellung
sind in der JA-PA 148/88 (5. Januar 1988) und der
entsprechenden US-PA USSN 291,894 (29. Dezember 1988) beschrieben.
Die Beschreibung der US-PA USSN 291,894, wie angemeldet, ist
in den ursprünglich mit der vorliegenden Anmeldung
eingereichten Unterlagen in Kopie enthalten, und auf dieses US-
Dokument (z.B. die Seiten 3 bis 7 und die Beispiele 1, 2 und
4) wird zur näheren Hintergrundinformation hingewiesen.
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Hochgestellte Nummern bei den Aminosäuresymbolen zeigen
vorliegend die Positionsnummer des betreffenden
Aminosäurerests, gezählt vom N-Terminus der Aminosäuren von FN gemäß
der in der EMBL-Datenbank hinterlegten Form, an.
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In weiteren Untersuchungen haben wir unter Anwendung
gentechnologischer Verfahren Polypeptide mit
Zellen-ausbreitender Aktivität hergestellt, welche aufgrund der Deletion
einer Aminosäure oder eines Peptids vom N-Terminus des
Peptides der Länge von 283 Aminosäuren verschiedene
Kettenlängen aufweisen. Wir haben die Zellen-ausbreitende Aktivität
dieser Polypeptide bestimmt und den Zusammenhang zwischen
Kettenlänge des Peptids und der Zellen-ausbreitenden
Aktivität geklärt. Ferner wurde im Verlauf dieser
Forschungsarbeiten gefunden, daß in Abhängigkeit von der Aminosäuresequenz
in der Region des N-Terminus eine bemerkenswerte Änderung in
der Expression des Peptids auftritt. Als Ergebnis hiervon
wurde es möglich, die Sequenz eines Peptids zu
identifizieren, das zusätzlich zu seiner guten Zellen-ausbreitenden
Aktivität auch in großen Mengen exprimiert werden kann
(hinsichtlich dieses Peptids wurde die EP 89 301 440.7
eingereicht), wobei dieses Peptid ein Peptid mit einer Sequenz
von 279 Aminosäuren (Pro¹²³&sup9;-Met¹&sup5;¹&sup7;) umfaßt.
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In weiteren Untersuchungen haben wir ein Peptid mit einer
Sequenz von 274 Aminosäuren (Pro¹²³&sup9;-Asp¹&sup5;¹²) durch Deletion
von fünf Aminosäureresten vom C-terminalen Ende des
letzteren
Peptids (Pro¹²³&sup9;-Met¹&sup5;¹&sup7;) mittels gentechnologischer
Verfahren hergestellt. Es zeigte sich, daß dieses neue Peptid
die gleiche Höhe von Zellen-ausbreitender Aktivität wie FN
aufweist. Die vorliegende Erfindung basiert auf diesen
Erkenntnissen.
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Die gentechnologische Herstellung eines Plasmids, das für
das Peptid mit einer Sequenz von 279 Aminosäuren (Pro¹²³&sup9;-
Met¹&sup5;¹&sup7;) codiert, kann, wie in der US-PA USSN 29 18 94 und der
EP 89 301 440.7 beschrieben, erfolgen.
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Die vollständige Aminosäuresequenz von Fibronectin humanen
Ursprungs und dessen cDNA-Sequenz sind publiziert (The EMBO
Journal 4, (1985), 1755-1759). Die Schritte, durch welche
die der Aminosäuresequenz der Zellanheftungs- und
-ausbreitungs-Domäne von Fibronectin entsprechende cDNA kloniert
werden kann, sind wohl bekannt. Man präpariert
beispielsweise eine poly(A)-haltige RNA-Fraktion aus der Leber, und
kann daraus nach Methoden, wie der nach Okayama-Berg oder
nach Gubler-Hoffmann, eine cDNA-Bibliothek herstellen.
Alternativ hierzu sind derartige cDNA-Bibliotheken auch
käuflich zu erwerben. Sie sind beispielsweise von der Firma
Clontech Laboratories, Inc., erhältlich. Als ein Verfahren,
den gewünschten cDNA-Klon aus der cDNA-Bibliothek zu
erhalten, kann die der Aminosäuresequenz entsprechende DNA mit
den Verfahren der Kolonie- oder Plaque-Hybridisierung als
Sonde verwendet werden. Die Klone, die mit der Sonde
hybridisieren, werden ausgewählt und DNA wird aus dem
Zellsediment oder einer lytischen Phagenlösung extrahiert und mit
Restriktionsenzymen geschnitten. Insertionen werden mit
Hilfe der Elektrophorese bestätigt. Falls nötig, wird im
Southern-Blot-Verfahren geprüft, ob das Insert mit der Sonde
hybridisiert. Im letzten Schritt wird schließlich durch die
Untersuchung der Basensequenz des Inserts nach der Dideoxy-
Methode oder ähnliche die Identität des gewünschten Klons
überprüft.
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Falls nötig, kann der Vektor, der die für die
Zellen-ausbreitende Aktivität von Fibronectin codierende cDNA trägt,
in den Wirtszellen amplifiziert, gereinigt und mit
Restriktionsenzymen gespalten werden, so daß der cDNA-Anteil
entfernt werden kann. Die cDNA-Fragmente können unter
Verwendung der Elektrophorese gereinigt werden. Diese
cDNA-Fragmente werden durch inframe-Ligierung (Ligierung im
Leseraster) unter Verwendung von DNA-Ligase mit
Expressionsvektoren verbunden. Durch Einführen in Wirtszellen ist es dann
möglich, die cDNA zu exprimieren.
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Jeder bekannte Vektor kann als Expressionsvektor für
Escherichia coli als Wirtszelle verwendet werden. Vorzugsweise
wird jedoch ein Wirtszellen/Vektor-System verwendet, dessen
Expression induzierbar ist und das eine starke Promotor-
Aktivität aufweist. Solche Vektoren sind beispielsweise ein
Vektor, der den λPL-Promotor trägt, ein Vektor, der den lac-
Promotor trägt, ein Vektor, der den trp-Promotor trägt, ein
Vektor, der den pst-Promotor trägt, ein Vektor, der sowohl
den lac- als auch den trp-Promotor trägt, ein Vektor, der
den lpp-Promotor trägt, ein Vektor, der sowohl den lpp- als
auch den lac-Promotor trägt, sowie andere bekannte derartige
Vektoren (vgl. Yoshiyuki Sakai, "Vector DNA", Kodansha
Scientific, 1986).
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Es ist auch möglich, Vektoren zu verwenden, worin exogene
Gene downstream von einem Gen für ein Signalpeptid inseriert
werden können, so daß das exprimierte Peptid sezerniert
werden kann.
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Ein Abschnitt gewisser Länge der vom Vektor stammenden
Aminosäuresequenz ist durch die Anbindung an den Vektor
manchmal mit dem N-Terminus des gewünschten Peptids verbunden,
wenn ein Peptid vom Gen für das gewünschte Peptid unter
Verwendung eines Expressionsvektors exprimiert wird, der
downstream von einem Gen für ein Signalpeptid eingebunden
wird, oder unmittelbar unter Verwendung eines
Expressionsvektors.
Das Hinzufügen dieser Sequenz bewirkt keine
wesentliche Änderung der Zellen-ausbreitenden Aktivität des
Polypeptids und dieses kann als solches verwendet werden. Es ist
jedoch möglich, diese Sequenz nötigenfalls mit
gentechnologischen Verfahren zu entfernen. Diese Entfernung umfaßt als
dem Fachmann wohlbekanntes Verfahren die sogenannte "site
specific" Mutagenese. Unter Verwendung eines geeigneten
Restriktionsenzyms spaltet man daher zuerst eine etwas
upstream des Initiationscodons von pTF301, das für die Sequenz
Ala¹²³&sup5;-Met¹&sup5;¹&sup7; codiert, gelegene Schnittstelle und kann dann
durch Einsatz von Exonuk-lease das 5'-Ende der Sequenz
entfernen. Durch Abändern der Reaktionsbedingungen ist es
möglich, ein Plasmid zu erhalten, aus welchem geeignete Teile
des 5'-Terminus der codierenden Region deletiert sind. Man
verwendet dann ein geeignetes Restriktionsenzym zur Spaltung
einer etwas downstream vom Terminationscodon der codierenden
Region dieses Plasmids gelegenen Schnittstelle, trennt die
gespaltene DNA durch Gelelektrophorese auf und kann so
Fragmente der cDNA erhalten, aus welcher verschiedene Teile des
5'-terminalen Stranges entfernt sind. Durch Inserieren
dieser cDNA-Fragmente in einen geeigneten Expressionsvektor
können Peptide verschiedener Kettenlängen exprimiert werden,
in denen Teile der N-terminalen Region der Sequenz Ala¹²³&sup5;-
Met¹&sup5;¹&sup7; (283 Aminosäurereste) deletiert sind.
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Als Expressionsvektor kann irgendein bekannter Vektor
verwendet werden. Zufriedenstellende Ergebnisse wurden bei
direkter Expression unter Verwendung von Vektoren des Typs
pUC erzielt, worin der Abstand zwischen
Ribosomenbindungsstelle und Initiationscodon optimiert wurde.
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Das Ausmaß der Expression kann auch durch Einbindung eines
Transkriptionsterminationssignals downstream vom
Terminations- oder Stopcodon des pUC-Vektors verbessert werden.
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Die Selektion der rekombinanten Klone, welche das Peptid mit
Zellen-ausbreitender Aktivität exprimieren, geschieht in
praktischer Weise durch Immunoscreening. Hierbei werden
Expressionsvektoren, in welche cDNA-Fragmente verschiedener
Längen eingebunden wurden, durch übliche Verfahren in
Escherichia coli-Zellen eingebracht und die erhaltenen
Transformanten werden auf Nitrocellulosefiltern kultiviert. Danach
werden sie lysiert und das Protein aus den Zellen wird auf
den Filtern fixiert. Nach Blockieren der Filter mit Rinder-
Serumalbumin oder dergleichen wird ein monoklonaler
Antikörper zur Wirkung gebracht, der die Zellen-ausbreitende Domäne
von FN erkennt. Der an den Filter gebundene monoklonale
Antikörper wird durch Markierung mit einem zweiten
Antikörper detektiert. Auf diese Weise können Rekombinante
selektiert werden, welche das Peptid mit der Domäne für
Zellausbreitung exprimieren.
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Als nächstes werden solchermaßen selektierte rekombinante
Klone unter für die Expression geeigneten Bedingungen
kultiviert und die Expression des Peptids mit der Domäne für die
Zellausbreitung wird induziert. Zum Nachweis stattgefundener
Expression kann Immunoblotting eingesetzt werden. Hierzu
wird das Gesamtzellprotein der kultivierten Zellen durch
Hitzebehandlung in einem SDS-haltigen Puffer lysiert und
durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt. Das
Elektrophoresemuster wird auf eine Nitrocellulose- oder
Nylonmembran übertragen. Nach Inkubation der Membran mit
einem für die Zellausbreitungsdomäne von FN spezifischen
monoklonalen Antikörper wird ein enzymmarkierter
Sekundärantikörper aufgebracht und die Enzymaktivität des
gebundenen Antikörpers bewirkt eine Farbzunahme in einem
chromogenen Material und erlaubt damit, das Vorhandensein einer
Bande des Peptids mit der Zellausbreitungsdomäne zu
bestätigen.
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Auch ist es durch Analyse der Basensequenz des 5'-Endes der
Insert-Fragmente der erhaltenen Klone möglich, den
N-Terminus des exprimierten Peptids zu identifizieren.
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Zur Herstellung des Peptids mit der Sequenz von 274
Aminosäuren (Pro¹²³&sup9;-Asp¹&sup5;¹²) mittels gentechnologischer Verfahren
ist es praktisch, das Plasmid pTFD707 zu verwenden, das für
die Sequenz von 279 Aminosäuren (Pro¹²³&sup9;-Met¹&sup5;¹&sup7;) codiert.
Durch Austausch des Codons AAA für die fünfte Aminosäure
(Lys¹&sup5;¹³) vom C-Terminus des Peptids mit einer Sequenz von 279
Aminosäuren durch das Terminationscodon TAA ist es möglich,
ein Plasmid herzustellen, das für das Peptid mit einer
Sequenz von 274 Aminosäuren (Pro¹²³&sup9;-Asp¹&sup5;¹²) codiert. Der
Austausch dieser Base kann mittels "site specific" Mutagenese
erfolgen.
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Die Aufreinigung des Peptids mit der Domäne für
Zellausbreitung aus den Rekombinanten kann beispielsweise wie folgt
vorgenommen werden. Das Zellsediment wird in einem Puffer
resuspendiert und lösliche und unlösliche Fraktion werden
durch Ultraschallbehandlung separiert. Die unlösliche
Fraktion wird in einem Puffer solubilisiert, welcher 7 M
Harnstoff enthält. Die löslichen Fraktionen werden vereinigt und
zur affinitätschromatographischen Reinigung auf eine
Sepharose 4B-Säule aufgebracht, an welche der zum Immunoblotting
verwendete Antikörper gebunden ist. Zur Elution verwendet
man einen Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von pH 2,3.
Durch Sammeln der gewünschten Fraktionen durch
Immunoblotting kann das Peptid mit der Domäne für Zellausbreitung
gesammelt werden. Eine weitere Aufreinigung kann
nötigenfalls durch FPLC oder HPLC vorgenommen werden.
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Das solchermaßen erhaltene Peptid mit der
Zellausbreitungsdomäne kann bezüglich seiner Zellen-ausbreitenden Aktivität
an NRK-Zellen vermessen werden. Die Probe wird in einem
Puffer gelöst und zum Beschichten von Mikrotiterplatten
verwendet. Danach werden NRK-Zellen zugegeben und die Platte
wird über eine festgelegte Zeit bei 37ºC inkubiert. Die
Ausbreitung der Zellen wird mikroskopisch begutachtet und
man vergleicht die minimale, die Expression der
Zellen-ausbreitenden Wirkung auslösende Dosis der Probe mit der
hierfür
nötigen Dosis an FN natürlichen Ursprungs. Auf diese
Weise läßt sich die Stärke der Zellen-ausbreitenden
Aktivität ausdrücken.
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Durch die Reihe der oben dargestellten Versuche wurde
gefunden, daß das Peptid mit der Sequenz von 274 Aminosäuren
(Pro¹²³&sup9;-Asp¹&sup5;¹²), das die in der allgemeinen Formel I gezeigte
Sequenz hat, im wesentlichen die gleiche Zellen-ausbreitende
Aktivität wie FN aufweist.
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Die Erfindung wird im Detail in den folgenden Beispielen
erläutert, die sich teilweise auf die beiliegende Zeichnung
beziehen.
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Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der Verfahren, die
in der Konstruktion eines Expressionsplasmids mit
der DNA-Sequenz involviert sind, die für das
Polypeptid einschließlich der Ile¹&sup4;¹&sup0;-Met¹&sup5;¹&sup7;-Sequenz von
Fibronectin codiert;
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Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Verfahren, die
in der Konstruktion eines Expressionsplasmids mit
der DNA-Sequenz involviert sind, die für das
Polypeptid einschließlich der Ala¹²³&sup5;-Met¹&sup5;¹&sup7;-Sequenz von
Fibronectin codiert;
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Fig. 3 ist eine graphische Darstellung der Verfahren, die
in der Konstruktion eines Expressionsplasmids mit
der DNA-Sequenz involviert sind, die für das
Polypeptid einschließlich der Pro¹²³&sup9;-Met¹&sup5;¹&sup7;-Sequenz von
Fibronectin codiert; und
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Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der Verfahren, die
in der Konstruktion eines Expressionsplasmids mit
der DNA-Sequenz involviert sind, die für ein
Polypeptid einschließlich der Pro¹²³&sup9;-Asp¹&sup5;¹²-Sequenz von
Fibronectin codiert.
Beispiel 1
Klonierung des für Ile¹&sup4;¹&sup0;-Met¹&sup5;¹&sup7; (108 Aminosäuren) von
Fibronectin codierenden cDNA-Fragments (vgl. Fig. 1)
(1-1) Herstellung von cDNA-Fragmenten:
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Zuerst wurden 100 ug eines Plasmids, pLF5 (beschrieben in
Biochemistry, 25 (1986), 4936-4941), mit einer Länge von 4,1
kb (KiloBasen), welches die für die Zellen-ausbreitende
Domäne von Fibronectin codierende cDNA-Sequenz enthält, zu
200 ul eines Reaktionsgemisches gegeben, das einen Puffer
zur Verwendung mit dem Restriktionsenzym BalI sowie 100
Einheiten (U) BalI enthielt, und das Gemisch wurde 2 Stunden
bei 37ºC inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf eine
HPLC-Säule mit DEAE-4000 (6x125 mm; Nucleogen) gegeben und
mit einem Konzentrationsgradienten von KCl in einem 30 mM
Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 5 M Harnstoff eluiert und
mit Isopropylalkohol gefällt. Man erhielt 7,5 ug Fragmente
mit 0,75 kb. Als nächstes wurden diese Fragmente mit 30 U
FokI eine Stunde bei 37ºC behandelt. Mit der gleichen
Aufreinigungsmethode erhielt man 60 ng Fragmente mit 92 bp
sowie 140 ng Fragmente mit 203 bp.
(1-2) Herstellung synthetischer DNA-Linker
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Damit die cDNA-Fragmente in einen Vektor eingebunden werden
konnten, wurden Linker am 5'- und am 3'-Ende chemisch wie
folgt synthetisiert: Die Basensequenz ist in Figur 1
gezeigt. Der obere Strang des Linkers am 5'-Ende (Kettenlänge
11), als "5 U" bezeichnet, der untere Strang des Linkers am
5'-Ende (Kettenlänge 7), als "5 L" bezeichnet, der obere
Strang des Linkers am 3'-Ende (Kettenlänge 30), als "3 U"
bezeichnet, sowie der untere Strang des Linkers am 3'-Ende
(Kettenlänge 30), als "3 L" bezeichnet, wurden unter
Verwendung eines DNA-Synthesizers der Firma Applied Biosystems,
Inc., synthetisiert. Nach Entfernung der Schutzgruppen
wurden 5 U und 5 L durch Ionenaustausch-HPLC auf einer TSK-Gel
DEAE-2000-Säule gereinigt und auf SepPak (Waters) entsalzt.
Man erhielt 60 bzw. 40 ug. 3 U und 3 L wurden durch
Elektrophorese
in einem 12% Polyacrylamidgel mit 7 M Harnstoff
aufgetrennt und nach Isolierung aus dem Gel, wie für 5 U und
5 L beschrieben, entsalzt. Man erhielt 32 bzw. 26 ug. Die
Basensequenzen wurden durch Festphasensequenzierung nach der
Maxam-Gilbert-Methode überprüft. Jeder Strang wurde dann am
5'-Terminus wie folgt phosphoryliert. Zunächst wurden 25 ug
DNA in 10 ul destilliertem Wasser gelöst und zu 20 ul einer
Pufferlösung zur Verwendung mit Polynukleotidkinase (PNK)
mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl&sub2; und 10 mM DTT, 1 mM
ATP sowie 5 U PNK gegeben. Das Gemisch wurde eine Stunde bei
37ºC inkubiert. Daraufhin wurde die Reaktion durch
Hitzebehandlung für 10 Minuten bei 65ºC gestoppt. Nach der
Phosphorylierung wurden die Stränge durch Zusammenlagerung
(Annealing) von 5 U mit 5 L sowie von 3 U mit 3 L doppelsträngig
gemacht, d.h. es wurden gleiche Mengen von 5 U und 5 L
miteinander gemischt und 10 Minuten bei 60ºC gehalten, danach
ließ man das Gemisch allmählich auf Raumtemperatur abkühlen
und kühlte weiter bis auf 15ºC. Die Stränge 3 U und 3 L
wurden auf die gleiche Weise behandelt.
(1-3) Bindung von cDNA-Fragmenten und Linkern:
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Die im Abschnitt (1-2) hergestellten beiden Arten von
Linkern und die beiden Arten von im Abschnitt (1-1)
hergestellten DNA-Fragmenten (mit 92 bp und 203 bp Länge) wurden
verwendet und miteinander ligiert (verbunden). Hierzu wurden
0,5 pM jeder Art von cDNA-Fragment sowie 5 pM jeder Art von
Linker zu 20 ul einer Lösung gegeben, welche einen
Ligierungspuffer (66 mM Tris-HCl, pH 7,6, und 6,6 mM MgCl&sub2;) sowie
0,5 mM ATP, 10 mM DTT und 2,8 U T4-DNA-Ligase enthielt. Dies
geschah bei 16ºC; das Gemisch wurde über Nacht inkubiert.
Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten auf 65ºC erhitzt,
danach wurde das zweifache Volumen kaltes Ethanol zugegeben
und das Ganze 30 Minuten bei -70ºC stehengelassen. Hierauf
wurde die ausgefällte DNA durch Zentrifugation isoliert.
Diese DNA wurde in 20 ul eines aus Puffer zur Verwendung mit
EcoRI und 7,5 U EcoRI hergestellten Reaktionsgemisches
gegeben und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Das Gemisch wurde
dann einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, wobei
man Fragmente von 336 bp erhielt. Diese wurden über 10
Stunden bei 37ºC in einem Gelelutionspuffer (0,5 M
Ammoniumacetat, 0,01 mM Magnesiumacetat und 1 mM EDTA) eluiert und
danach mit Ethanol gefällt. Die DNA wurde isoliert. Diese
DNA wurde in 20 ul TE (10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA, pH 8,0)
gelöst.
(1-4) Bindung von mit Linkern verbundenen
cDNA-Fragmenten an einen Vektor
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Zuerst wurde 1 ug des Sekretions-Expressionsvektors pIN-III-
ompA-1 (beschrieben in The EMBO Journal, 3 (1984), 2437-
2442) zusammen mit 5 U EcoRI in Puffer zur Verwendung mit
EcoRI für eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Als nächstes
wurden 0,5 U Alkalische Phosphatase zugegeben und die
Inkubation über eine weitere Stunde fortgesetzt. Das
Reaktionsgemisch wurde zweimal mit Phenol behandelt und durch
Ethanolfällung wurden 0,5 ug DNA erhalten. Diese DNA wurde mit
EcoRI gespalten, dann wurden 0,1 ug desphosphorylierter
Vektor pIN-III-ompA-1 in ein Gemisch mit 0,1 ug der im
obigen Abschnitt (1-3) erhaltenen DNA-Fragmente zusammen mit
10 ul Puffer zur Verwendung von T4-DNA-Ligase, 0,5 mM ATP,
10 mM DTT und 1,8 U T4-DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen des
Reaktionsgemisches von 30 ul gegeben. Dieses Gemisch wurde
über Nacht bei 16ºC inkubiert. Dann wurden 15 ul dieses
Reaktionsgemisches für die Transformation von Escherichia
coli-Zellen eingesetzt.
(1-5) Transformation von Escherichia coli-Zellen:
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Zellen von Escherichia coli SB221 (The EMBO Journal, 3
(1984), 2437-2442) wurden in ein 20 ml-Teströhrchen mit 5 ml
L-Broth (10 g/Liter Bactotrypton; 5 g/Liter Hefeextrakt;
5 g/Liter NaCl; pH 7,2) gegeben und über Nacht unter
Schütteln bei 37ºC kultiviert. Dann wurden 0,05 ml dieser
Kulturbrühe zum Beimpfen von 5 ml frischer L-Broth verwendet und
diese weiter unter Schütteln kultiviert bis die Absorption
bei 600 nm den Wert 0,6 erreichte. Diese Kulturbrühe wurde
auf Eis gekühlt und 5 Minuten bei 5000 Upm bei 4ºC
zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und mit 2,5 ml einer
eiskalten Lösung von 0,1 M MgCl&sub2; gemischt. Danach wurde in
gleicher Weise zentrifugiert und der Überstand abgenommen.
Er wurde mit 1,25 ml eiskalter Lösung von 0,1 M CaCl&sub2;
gemischt, sofort mit eiskaltem Wasser gemischt und 30 Minuten
stehengelassen. Das Gemisch wurde zentrifugiert und der
Überstand abgenommen und danach mit 0,1 ml eiskaltem 0,1 M
CaCl&sub2; zur raschen Suspendierung gemischt. Die Suspension
wurde mit 10 ul des im obigen Abschnitt (1-4) erhaltenen
Reaktionsgemisches vermischt und 30 Minuten im Eisbad
belassen. Als nächstes wurde es 2 Minuten auf 42ºC erwärmt. Dann
wurde 1 ml auf 37ºC erwärmte L-Broth zugesetzt und das Ganze
30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Danach wurde das Gemisch für
eine Stunde unter Schütteln bei 37ºC kultiviert. Die
Kulturbrühe wurde auf L-Agarmedium ausgesät, das 50 ug/ml
Ampicillin enthielt, und nach Bebrütung über Nacht wurden
gewachsene Kolonien isoliert. Es wurden ca. 200 Kolonien erhalten,
von denen vierzehn auf Plasmide hin analysiert wurden.
(1-6) Analyse von Plasmiden:
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Vierzehn Transformanten wurden unter Schütteln über Nacht in
1,5 ml L-Broth mit 50 ug/ml Ampicillin kultiviert, die
Kulturen zentrifugiert und das Zellsediment isoliert. Die
Zellsedimente wurden in 100 ul Lösung A (50 mM Glucose, 10 mM
EDTA, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, und 2 mg/ml Lysozym)
suspendiert und für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Dann wurden 200 ul Lösung B (0,2 M NaOH und 1% SDS) der
Suspension zugesetzt und das Reaktionsgefäß fünfmal rasch
auf den Kopf gestellt. Danach wurde das zweifache Volumen
kaltes Ethanol zugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei
-70ºC stehen gelassen. Danach wurde die DNA durch
Zentrifugation isoliert. Die DNA wurde mit 80% Ethanol gewaschen und
Ethanol und Wasser wurden unter vermindertem Druck
abgezogen. Der Rückstand wurde in einer geringen Menge TE gelöst.
Ein Aliquot der Lösung (0,1 ul) wurde für eine Stunde bei
37ºC in 10 ul eines Reaktionsgemisches mit 5 U EcoRI in
einem Puffer zur Verwendung von EcoRI zur Reaktion gebracht.
Dann wurde das Reaktionsgemisch durch
Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die erwarteten DNA-Banden (bei 0,33 kb)
wurden durch Anfärben mit Ethidiumbromid überprüft mit dem
Ergebnis, daß neun der Klone die gewünschte Bande zeigten.
Die aus diesen neun Klonen extrahierten Plasmide wurden mit
PvuII und HindIII doppelt verdaut. Die Orientierung der
inserierten Fragmente wurde festgestellt, wobei gefunden
wurde, daß acht der Klone das Insert in der richtigen
Orientierung enthielten. Die Plasmide von fünf dieser acht Klone
wurden mit XbaI und HindIII doppelt verdaut und die DNA,
welche die inserierten Fragmente enthielt, isoliert und in
den Phagen M13mp18 und mp19 subkloniert. Die Basensequenz
wurde nach der Dideoxy-Methode analysiert. Es wurde
gefunden, daß drei der Klone die gewünschte Sequenz enthielten.
Die auf diese Weise erhaltenen Plasmide erhielten die
Bezeichnung pTF101.
(1-7) Aufreinigung von Plasmiden:
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Das, wie oben im Abschnitt (1-6) beschrieben, erhaltene
Plasmid pTF101 wurde zur Transformation von Escherichia
coli-Zellen (SB221/pTF101) verwendet und derart
transformierte Zellen wurden in 5 ml L-Broth über Nacht unter
Schütteln bei 37ºC kultiviert. Die Kultur wurde auf 500 ml der
gleichen Kulturbrühe überimpft und die Kultur wurde
fortgesetzt bis eine Absorption von 0,6 bei 660 nm erreicht
wurde. Zu diesem Zeitpunkt wurden 170 ug/ml Chloramphenicol
zugesetzt und die Kultivierung wurde erneut über 10 bis 12
Stunden fortgesetzt. Die Kulturbrühe wurde dann 10 Minuten
bei 5000 Upm zentrifugiert und das Zellsediment in STE (10
mM Tris-HCl, pH 8, 100 mM Nacl und 1 mM EDTA) gewaschen und
erneut in gleicher Weise zentrifugiert, um das Zellsediment
zu erhalten. Das Sediment wurde in 10 ml der Lösung A
suspendiert und 5 Minuten bei Raumtemperatur gehalten bevor
dann 20 ml der Lösung B unter heftigem Rühren zugegeben
wurden und die Suspension für 5 Minuten bei 0ºC stehen
gelassen wurde. Zu dieser Suspension wurden 15 ml 3 M
Kaliumacetat unter heftigem Rühren zugegeben und die Suspension
wurde für 10 Minuten bei 0ºC stehen gelassen. Das Gemisch
wurde 60 Minuten bei 8000 Upm zentrifugiert und der
Überstand isoliert. Dieser wurde daraufhin mit 27 ml (0,6-faches
Volumen) Isopropylalkohol versetzt und das Gemisch wurde 15
Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach wurde
zentrifugiert und der Niederschlag isoliert und in 80%
Ethanol gewaschen. Ethanol und Wasser in dem erhaltenen Gemisch
wurden unter vermindertem Druck abgezogen und der Rückstand
getrocknet. Dieser Rückstand wurde in 4 ml TE gelöst und
dieser Lösung wurden 4,75 g Cäsiumchlorid zugesetzt, gefolgt
von der Zugabe von 5 mg/ml Ethidiumbromid in einem Volumen
von 420 ul. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 0ºC stehen
gelassen. Es wurde dann 10 Minuten bei 8000 Upm
zentrifugiert und der Überstand wurde in ein Beckmann Quick-Seal
Zentrifugengefäß überführt und über Nacht bei 55000 Upm
ultrazentrifugiert. Danach wurden unter UV-Licht
Plasmidbanden mit Hilfe einer Injektionsspritze isoliert. Das
erhaltene Gemisch wurde sieben Mal mit gleichen Volumina von
Isopropylalkohol extrahiert und das verbleibende Ethidiumbromid
entfernt, dann wurde zweimal mit Ethanol gefällt, das
verbleibende Gemisch in 80% Ethanol gewaschen, unter
vermindertem Druck getrocknet und in einem Tropfen TE aufgelöst
(Ausbeute 760 ug).
Beispiel 2
Klonieren des für Ala¹²³&sup5;-Met¹&sup5;¹&sup7; (283 Aminosäuren) von
Fibronectin codierenden cDNA-Fragments (vgl. Fig. 2)
-
Zuerst wurden 50 ug des Plasmids pLF5 in 200 ul eines
Reaktionsgemisches mit 200 U EcoRI-Methylase in einem Puffer zur
Verwendung von EcoRI-Methylase (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2
mM DTT, 10 mM EDTA und 80 uM S-Adenosylmethionin)
eingebracht
und das Gemisch wurde 60 Minuten bei 37ºC inkubiert,
um Schutz der EcoRI-Schnittstellen zu erzielen. Dann wurde
die Reaktion durch Erhitzen auf 65ºC über 20 Minuten
gestoppt und es wurden 96 U PvuII in einem Puffer zur
Verwendung von PvuII zugesetzt. 300 ul des Reaktionsgemisches
wurden über 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Dieses Gemisch
wurde durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und das
Gelstückchen, das die Bande mit 0,60 kb enthielt, wurde
ausgeschnitten. Dieses Gelstückchen wurde in ein
Dialysierröhrchen gegeben, das Elutionspuffer (5 mM
Tris-Acetatpuffer, pH 8,0, und 1 mM EDTA) enthielt, und elektrophoretisch
in dem selben Puffer eluiert, wodurch die DNA eluiert wurde.
Die Elutionsflüssigkeit wurde zweimal mit Phenol extrahiert
und es wurde 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat zugesetzt,
gefolgt von der Zugabe von zwei Volumina Ethanol, und es wurde
zweimal mit Ethanol gefällt. Dann wurde das erhaltene
Gemisch in 80% Ethanol gewaschen, getrocknet und in einer
geringen Menge TE gelöst (Ausbeute 1,2 ug).
-
Ferner wurden 140 ug des im Beispiel A erhaltenen Plasmids
pTF101 in 200 ul eines Reaktionsgemisches mit 144 U PvuII
eingebracht und das Gemisch wurde 60 Minuten bei 37ºC
inkubiert. Dann wurden 150 U EcoRI zugesetzt, die
Reaktionslösung wurde auf ein Volumen von 240 ul gebracht und 60
Minuten bei 37ºC inkubiert. Das erhaltene Gemisch wurde durch
Polyacrylamid-Gelektrophorese aufgetrennt und die Banden
wurden bei 0,25 kb ausgeschnitten. Die DNA wurde aus diesen
Gelbanden, wie oben beschrieben, eluiert und durch
Ethanolfällung isoliert (Ausbeute 0,4 ug). Dann wurden 1,25 ug des
in diesem Beispiel erhaltenen 0,6 kb-Fragments und 0,4 ug
des 0,25 kb-Fragments in einen Ligierungspuffer eingebracht,
welcher 2,8 U T4-DNA-Ligase, 0,5 mM ATP und 10 mM DTT in
50 ul enthielt, und das Gemisch wurde 30 Minuten bei 16ºC
inkubiert. Dann wurden 92 pM phosphorylierter Linker
(pCCGAATTGG) und 1,4 U T4-DNA-Ligase dem Reaktionsgemisch
zugesetzt, das dann auf ein Volumen von 70 ul aufgefüllt und
über Nacht bei 10ºC inkubiert wurde. Die Reaktion wurde
durch Erhitzen auf 65ºC für 10 Minuten gestoppt und der
Puffer so modifiziert, daß er für EcoRI geeignet war; 30 U
EcoRI wurden zugegeben und die Reaktion wurde über 60
Minuten bei 37ºC durchgeführt. Dann wurde das Reaktionsgemisch
durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die Banden
mit 0,86 kb wurden ausgeschnitten. Die DNA in den Banden
wurde, wie oben beschrieben, isoliert (Ausbeute ca. 25 ng).
Dann wurden 20 ng der 0,86 kb-Fragmente mit EcoRI verdaut
und in einen Ligierungspuffer eingebracht, welcher 0,1 ug
dephosphorylierten Vektor pIN-III-ompA-1, 2,8 U
T4-DNA-Ligase, 0,5 mM ATP und 10 mM DTT in einem Gesamtvolumen von 20
ul enthielt; das Gemisch wurde 10 Stunden bei 16ºC inkubiert
und die Hälfte des Reaktionsgemisches wurde zur
Transformation von Escherichia coli-Zellen SB221 nach der oben
beschriebenen Methode eingesetzt. 48 der erhaltenen
transformierten Klone wurden auf Plasmide nach den bereits
beschriebenen Verfahren analysiert und man fand, daß die Plasmide in
sechs dieser Klone die gewünschten Fragmente enthielten.
Diese sechs Plasmide wurden mit BamHI verdaut und die so
erzeugten Fragmente analysiert. Fünf der Klone enthielten
die gewünschten Fragmente in der korrekten Orientierung
inseriert. Drei dieser fünf Klone wurden bezüglich ihrer
Basensequenz untersucht. Für einen der Klone wurde gefunden,
daß er die richtige Basensequenz aufwies. Dieses
rekombinante Plasmid erhielt die Bezeichnung pTF301 und die dieses
Plasmid tragenden Escherichia coli-Zellen SB221 wurden mit
SB221/pTF301 bezeichnet.
Beispiel 3
Klonierung des für Pro¹²³&sup9;-Met¹&sup5;¹&sup7; (275 Aminosäurereste) von
Fibronectin codierende cDNA-Fragment (vgl. Fig. 3)
(3-1) Herstellung von cDNA-Fragmenten
-
Zuerst wurden 100 ug des Plasmids pTF301, welches für das
Peptid 283AA mit Zellen-ausbreitender Aktivität codiert, mit
einem Puffer zur Verwendung des Restriktionsenzyms XbaI und
mit 120 U XbaI in einem Gesamtvolumen von 300 ul gemischt
und für 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Dann wurde die DNA
durch Ethanolfällung isoliert. Die Hälfte der erhaltenen
Menge wurde in 375 ul eines Reaktionsgemisches aus Puffer
zur Verwendung von BAL 31-Nuklease und 36 U BAL 31-Nuklease
eingebracht und das Gemisch wurde bei 30ºC inkubiert; in der
Zeit von 2 Minuten bis 8 Minuten Inkubation wurde jeweils im
Abstand von 30 Sekunden eine Probe des Reaktionsgemisches
entnommen und jeweils in 20 ul 0,5 M EDTA eingebracht, um
die Reaktion zu stoppen. Proben wurden vereinigt und DNA
wurde durch Phenolbehandlung und nachfolgende Ethanolfällung
isoliert. Die erhaltene DNA wurde in 200 ul eines
Reaktionsgemisches von 7 mM Tris-HCl, pH 7,5 mit 0,1 mM EDTA, 10 mM
NaCl, 7 mM Mgcl&sub2;, 0,1 mM dATP, dGTP, dCTP und dTTP, sowie 2 U
Klenow-Fragment eingebracht. Das Gemisch wurde 20 Minuten
bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch 10-minütige
Behandlung bei 65ºC gestoppt und das Reaktionsgemisch wurde
an die Zusammensetzung des Puffers zur Verwendung von
HindIII angeglichen. Dann wurden zu 250 ul dieses
Reaktionsgemisches 60 U HindIII gegeben und das Gemisch wurde eine
Stunde bei 37ºC inkubiert. Dieses Gemisch wurde durch
Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die den Größen von 0,5
bis 0,8 kb entsprechenden Fragmente wurden ausgeschnitten
(Ausbeute 1 ug).
(3-2) Klonierung in pUC119N
-
Zuerst wurden 0,65 ug der im obigen Abschnitt (3-1)
erhaltenen DNA-Fragmente in 30 ul eines Ligasepuffers eingebracht,
der 0,5 ug phosphorylierten NcoI-Linker (d[pAGCCATGGCT]),
2,8 U T4-DNA-Ligase, 0,5 mM ATP und 10 mM DTT enthielt, und
das Gemisch wurde über Nacht bei 10ºC inkubiert. Nach dem
Stoppen der Reaktion durch Erhitzen auf 65ºC für 10 Minuten
wurden 24 U NcoI und 12 U HindIII diesem Reaktionsgemisch
zugesetzt und dieses in einem Gesamtvolumen von 50 ul eine
Stunde bei 37ºC inkubiert. Danach wurde es auf eine 1 ml-
Säule von Sepharose CL-4B aufgetragen; der freie Linker
wurde mit STE-Puffer eluiert.
-
Dann wurden 300 ul DNA-Fraktion isoliert und auf 55 ul
eingeengt. Hiervon wurden 5,5 ul zu 1 ul einer Lösung
zugegeben, welche 0,2 ug des Plasmids pUC119 enthielt, das vorher
durch Behandlung mit NcoI und HindIII dephosphoryliert
worden war. Hierzu wurden 65 ul Lösung A und 6,5 ul Lösung B
aus einem DNA-Ligierungs-Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.)
zugesetzt und das Gemisch wurde über Nacht bei 16ºC inkubiert.
Dann wurden 20 ul des Reaktionsgemisches zur Transformation
von Escherichia coli HB101-Zellen eingesetzt.
-
Zusätzlich wurde pUC119N isoliert, indem eine das
Translationsinitiationscodon des im Handel erhältlichen Vektors
pUC119 (Takara Shuzo Co., Ltd.) umgebende NcoI-Schnittstelle
geschaffen wurde; der Abstand zwischen
Ribosomenbindungsstelle und Initiationskodon wurde außerdem von 7 auf 8 Basen
verändert.
(3-3) Screening der Expressionsplasmide
-
Die im obigen Abschnitt (2) erhaltenen Transformanten wurden
auf einen Nitrocellulosefilter (BA85; S&S) auf L-Agar mit 50
ug/ml Ampicillin übertragen und über Nacht bei 37ºC
inkubiert. Die darauf gewachsenen Kolonien wurden 15 Minuten in
Chloroformdampf eingebracht und der Nitrocellulosefilter
wurde dann in eine Lösung von 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 mit 150
mM NaCl, 5 mM MgCl&sub2;, 3% Rinder-Serumalbumin, 1 ug/ml DNase
und 40 ug/ml Lysozym gelegt; das Gemisch wurde über Nacht
bei Raumtemperatur inkubiert. Der Filter wurde mit einem
monoklonalen anti-FN-Antikörper, FN-10 (Takara Shuzo Co.,
Ltd.) behandelt, welcher spezifisch die Zellen-ausbreitende
Domäne von FN erkennt, und ein mit Peroxidase markierter
Sekundärantikörper wurde aufgebracht. Mit Wasserstoffperoxid
wurde in Gegenwart von 4-Chlor-1-naphthol die Bildung eines
Farbstoffes veranlaßt, durch welchen die aufgetretenen
Transformanten aufgefunden wurden. Durch dieses erste
Screening wurden 52 Kolonien aus 1300 Klonen selektiert, von
denen jede über Nacht unter Schütteln bei 37ºC in 5 ml L-
Broth mit 50 ug/ml Ampicillin kultiviert wurde. Das
Gesamtzellprotein
der erhaltenen Zellen wurde durch
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt und es wurde
Immunoblotting eingesetzt, wobei man den monoklonalen anti-
FN Antikörper, FN-10, reagieren ließ. Es wurde gefunden, daß
Polypeptide mit Molekulargewichten von 22 kDa bis 32 kDa
erzeugt worden waren. Für 11 Klone wurde jeweils die
Basensequenz am 5'-Ende des inserierten Fragments festgestellt;
man fand, daß sie für Aminosäuresequenzen einer Länge von
279, 258, 219, 213, 207, 206, 198, 195, 190, 186 bzw. 178,
gezählt von Met ¹&sup5;¹&sup7; als C-Terminus, codierten.
-
Die Mengen dieser exprimierten Peptide wurden auf SDS-PAGE
miteinander verglichen; das in der größten Menge exprimierte
Peptid war ein Peptid mit einer 279 Aminosäure betragenden
Sequenz (entsprechend etwa 20% des Gesamtzellproteins); dem
am nächsten kamen Peptide mit Sequenzen einer Länge von 206
und 258 Aminosäuren.
-
Das Plasmid, welches das Peptid mit der Sequenz der Länge
von 279 Aminosäuren exprimierte, erhielt die Bezeichnung
pTFD707. Am N-Terminus des durch pTFD707 exprimierten
Peptide fand sich eine Sequenz (GCT) angefügt, welche dem Alanin
des Ursprungsvektors entsprach. Diese Sequenz wurde durch
"site-specific" Mutagenese (ein Verfahren, wie es
beispielsweise in Beispiel 4 der US-PS USSN 291,894 angewendet wird)
entfernt. Ferner wurde, um den Grad der Expression zu
erhöhen, das HindIII-SalI-Fragment mit einer lpp
Terminatorsequenz aus dem Sekretions-Expressionsvektor pIN-III-ompA-I
entfernt und mit der HindIII-SalI-Schnittstelle von pTFD707
verbunden, wodurch man die Plasmide mit der Bezeichnung
pTF7021 erhielt.
Beispiel 4
Konstruktion des für Pro¹²³&sup9;-Asp¹&sup5;¹² (274 Aminosäurereste) von
Fibronectin codierende Plasmid (vgl. Fig. 4)
-
Die Einführung einer Mutation in pTFD707 wurde gemäß des
Verfahrens von Kunkel et al., durchgeführt (Proceedings of
National Academy of Sciences, USA, 82 (1985), 488-492;
Methods in Enzymology, 154 (1987), 367-382). Hierfür wurde das
"site-directed" Mutagenesesystem, Mutan-K(Takara Shuzo)
verwendet.
-
pTFD707 wurde in Escherichia coli BW313 eingeführt und die
Transformanten wurden unter Rühren bei 37 ºC in 100 ml 2X
YT-Medium (1,6 % Bactotrypton, 1 % Hefeextrakt und 0,5 %
NaCl) mit 50 ug/ml Ampicillin kultiviert. Bei einem
Absorptionswert bei 660 nm von 0,3 wurde 1 ml einer M13K07
Phagensuspension mit 10¹&sup0; pfu der Kultur zugegeben und die
Kultivierung wurde 16 Stunden bei 37 ºC fortgesetzt. Das
Kulturmedium wurde zentrifugiert und der Überstand gesammelt;
diesem Überstand wurden 25 ml eines Gemisches aus 2,5 M NaCl
und 20 % Polyethylenglycol 6000 zugegeben und das erhaltene
Gemisch wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen.
Es wurde dann zentrifugiert und 5 ml TE-Puffer wurden dem
Sediment zugegeben. Dieses Gemisch wurde mit einem Gemisch
aus Phenol und Chloroform und dann mit Chloroform alleine
behandelt, ehe eine Ethanolfällung folgte, wodurch
einzelsträngige DNA erhalten wurde. Die 30 ng der erhaltenen
einzelsträngigen DNA wurden in 1 ul eines Annealing-Puffers (20
mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl und 1 mM DTT)
gelöst und zu 1 ul einer Lösung gegeben, die 1 pM eines
phosphorylierten Oligonucleotids d[pGGATGGTTAGTCAATTTC]
enthielt. Das Gemisch wurde durch Erhitzen von 15 Minuten bei
65 ºC und 15 Minuten bei 37 ºC behandelt. Das erhaltene
Gemisch wurde zu 25 ul eines Extensionspuffers (50 mM
Tris-HCl, pH 8,0, 0,60 mM Ammoniumacetat, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 1
mM NAD, 0,5 mM dATP, dGTP, dCTP und dTTP) mit 60 Einheiten
von DNA-Ligase aus E. coli und 1 Einheit von T4 DNA
Polymerase zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei 25
ºC stehengelassen, bevor 3 ul einer 0,2 MLösung von EDTA, pH
8,0 zugegeben wurden, und das Reaktionsgemisch 5 Minuten auf
65ºC erhitzt wurde. Dann wurden 3 ul des Reaktionsgemisches
mit 30 ul kompetenter Zellen von Escherichia coli BMH71-
18muts gemischt, und das Gemisch wurde 30 Minuten bei 0 ºC,
45 Sekunden bei 42 ºC und 2 Minuten bei 0 ºC gehalten. Dann
wurden 300 ul L-Broth zugegeben und das Gemisch wurde 1
Stunde bei 37 ºC stehengelassen. Im nächsten Schritt wurden
10 ul einer Suspension von M13K07 Phagen zugegeben, und das
Gemisch wurde 30 Minuten bei 37 ºC stehengelassen. Daraufhin
wurden die Zellen 16 Stunden bei 37ºC unter Rühren in 1 ml
von 2X YT-Medium kultiviert, das 150 ug/ml Ampicillin und
70 ug/ml Kanamycin enthielt. Die Kultur wurde zentrifugiert
und der Überstand gesammelt. Dann wurden 20 ul des
Überstands mit 80 ul des Kulturmediums einer über Nacht-Kultur
von Escherichia coli JM109 gemischt. Das Gemisch wurde 10
Minuten bei 37 ºC stehengelassen, und ein Teil davon wurde
zur Inokulierung von L-Agar mit 50 ug/ml Ampicillin
verwendet; der Agar wurde bei 37 ºC über Nacht stehengelassen, und
von den erhaltenen Transformanten wurden die Basensequenzen
von sechs der Klone identifiziert. Von diesen sechs Klonen
wiesen fünf die gewünschte Mutation auf. Das erhaltene
rekombinante Plasmid wurde mit pTFD707-45 bezeichnet.
-
Dann wurden 2ug von pTFD707-45 mit BamHI und HindIII
gespalten, der erhaltene Ansatz wurde in einer
Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und das 0,5-kb-Fragment gesammelt.
Getrennt davon wurden 2 ug von pTF7021 mit BamHI und ScaI
gespalten und der Ansatz wurde in einer
Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Das 2,1kb-Fragment wurde erhalten. Im
nächsten Schritt wurden 2 ug pTF7021 mit HindIII und ScaI
gespalten und der Ansatz wurde in einer
Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und das 2,4-kb-Fragment gesammelt. Zu 3
ul einer Lösung mit 5 ng des 0,5-kb-Fragments, 20 ng des
2,1-kb-Fragments und 20 ng des 2,4-kb-Fragments wurden 12 ul
einer Lösung A und 3 ul einer Lösung B von einem
DNA-Ligationskit (Takara Shuzo) zugegeben und das Ganze wurde 30
Minuten bei 16 ºC inkubiert. Dann wurden 10 ul des
Reaktionsgemisches zur Transformation von Escherichia coli
JM109-Zellen verwendet. Ein Plasmid wurde erhalten, das für
die Pro¹²³&sup9;-Asp¹&sup5;¹²-Sequenz (274 Aminosäuren lang) von FN
Codierte und auch die lpp-Terminatorsequenz aufwies. Dieses
rekombinante Plasmid wurde mit pTF7221 bezeichnet, und die
Zellen von Escherichia coli JM109, die dieses Plasmid
trugen, wurden mit Escherichia coli JM109/pTF7221 bezeichnet.
Der Stamm wurde bei der Fermentation Research Institute of
the Agency of Industrial Science and Technology, Japan unter
der Hinterlegungsnummer FERM BP-1915 am 17. Juni 1988
hinterlegt.
-
Zellen von JM109/pTF7221 wurden kultiviert, und es wurde
überprüft, ob sie ein Polypeptid mit einer
Zellen-ausbreitenden Aktivität exprimierten; es wurde gefunden, daß dieses
Protein mindestens 30 % des Gesamtzellproteins ausmachte.
Beispiel 5
Reinigung des Pro¹²³&sup9;-Asp¹&sup5;¹²-Polypeptids (274 Aminosäurereste)
von Fibronectin
-
Das durch Verbinden eines Expressionsvektors mit der für
die Sequenz Pro¹²³&sup9;-Met¹&sup5;¹&sup7; von FN (eine Sequenz von 274
Aminosäuren) codierenden DNA erhaltene Plasmid pTF7221 wurde in
Escherichia coli JM109 eingeführt und ergab so Escherichia
coli JM109/pTF7221. Diese Zellen wurden über Nacht unter
Schütteln bei 37ºC in 5 ml L-Broth mit 50 ug/ml Ampicillin
in einem Teströhrchen kultiviert. Dieses wurde verwendet, um
einen 2 Liter-Erlenmeyerkolben mit 500 ml des gleichen
Mediums zu beimpfen, und die Kultivierung wurde bei einer
Schüttelfrequenz von 180 Upm fortgesetzt. Bei Erreichen einer
Absorption von 0,3 bei 660 nm wurden 2 mM IPTG (Isopropyl-β-
thiogalactosid) zugesetzt und die Zellen 20 Stunden später
geerntet. Ein Teil der isolierten Zellen wurde zum
Immunoblotting eingesetzt. Das Gesamtzellprotein wurde durch SDS-
PAGE isoliert und das Elektrophoresemuster wurde auf eine
Nitrocellulosemembran übertragen. Dann wurde ein
monoklonaler Antikörper (FN-10, Takara Shuzo Co., Ltd.) aufgebracht,
welcher spezifisch die Zellen-ausbreitende Domäne von FN
erkennt, und danach ein mit Peroxidase markierter
Sekundärantikörper. Die Aktivität der an den Sekundärantikörper
gebundenen Peroxidase führte zu einer Farbzunahme in
Gegenwart von 4-Chlornaphthol und Wasserstoffperoxid, und man
fand, daß die gewünschte Bande in der Gegend einer 34 kDa
Bande lag, die kleiner als jene von 279 Aminosäureresten
war. Als nächstes wurde das Gesamtzellsediment in einer
Lösung von 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, mit 5 mM EDTA und 5 mM
Mercaptoethanol suspendiert und mit Ultraschall behandelt.
Diese Suspension wurde zentrifugiert und der Überstand
isoliert und gegen 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) dialysiert. Die
innere Dialyseflüssigkeit wurde auf eine Sepharose 4B-Säule
(8 ml) aufgebracht, an welche der monoklonale Antikörper FN-
10 gebunden war. Die Säule wurde mit Waschpuffer A (20 mM
Tris-HCl, pH 8,0, und 0,15 M KCl) und danach mit Waschpuffer
B (20 mM Tris-HCl, pH 6,4 und 0,15 M KCl) gewaschen.
Schließlich wurde der Elutionspuffer (50 mM Glycin-HCl, pH
2,3 und 0,2 M KCl) eingesetzt und Fraktionen wurden
isoliert. Die gewünschten Fraktionen wurden durch
Immunoblotting erhalten, entsalzt und lyophilisiert und man erhielt
durch Elektrophorese ca. 5 mg nahezu reines Peptid. Als
nächstes wurde dieses Peptid mit Aminopeptidase P (Enzyme
Handbook 1983;Asakura Publishers, S. 534) behandelt und das
N-terminale Methionin entfernt, wonach dann das Peptid
erneut auf die gleiche, oben beschriebene Weise, gereinigt
wurde. Die etwa zehn Aminosäurereste in der
Aminosäuresequenz, beginnend vom N-Terminus, wurden untersucht und man
fand, daß die Sequenz Pro-Thr-Asp-Leu-Arg-Phe-Thr-Asn-Ile-
Gly vorlag, was mit der N-terminalen Sequenz des gewünschten
Peptids übereinstimmte.
Beispiel 6
Bestimmung der Zellen-ausbreitenden Aktivität
-
Die Zellen-ausbreitende Aktivität aller in Beispiel 5
erhaltenen Peptide sowie von FN und den Peptiden der Länge von
108 und 279 Aminosäuren wurde nach der Methode von Ruoslahti
et al., Methods in Enzymology 82, (1981), 803-831, bestimmt.
Die Proben wurden schrittweise in physiologischer
Kochsalzlösung und destilliertem Wasser verdünnt und 50 ul-Aliquote
wurden in die Vertiefungen einer
96-Vertiefungs-Mikrotiterplatte injiziert und man ließ die Proben sich an die
Vertiefungen anhaften. Dann wurde phosphatgepufferte
Kochsalzlösung (PBS) zum Waschen der Platten verwendet, 100 ul 3%
BSA wurden jeder Vertiefung zugesetzt und die Platte wurde
eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Platte wurde zweimal mit
PBS gewaschen und dann wurden in einer Konzentration von 10&sup6;
Zellen/ml in Eagle's Minimal Essential Medium (MEM)
suspendierte normale Rattennieren-Zellen (NRK-49F) in einer Menge
von 100 ul/Vertiefung zugegeben und die Platte wurde 2 bis
3 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die verwendeten NRK-49F-Zellen
wurden als lyophilisierter Stamm zur Lagerung erhalten und
vor Verwendung zunächst vorinkubiert und mit Trypsin
behandelt. Das Ausbreiten der Zellen wurde unter dem Mikroskop
verfolgt und die minimale für eine Zellen-ausbreitende
Aktivität nötige Dosis errechnet. Diese Ergebnisse sind in der
Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1
Polypeptid (Länge der Aminosäuresequenz)
Minimale Dosis für Zellausbreitung ug/Vertiefung (pM/Vertiefung)
-
Wie oben im Einzelnen ausgeführt, liefert die vorliegende
Erfindung ein Peptid, das im wesentlichen die gleiche
Zellen-ausbreitende Aktivität wie FN hat, und sie liefert
ferner ein Verfahren zu seiner Herstellung durch Anwendung
gentechnologischer Verfahren. Das oben erwähnte Polypeptid
kann in pharmazeutischen Zubereitungen verwendet werden für
Anwendungen, wie etwa die Förderung der Wundheilung, in
Collyria (Augenwasser), für die Prävention von Krebsmetastasen,
für die Implantierung künstlicher Organe im Körper und
dergleichen. Es kann ferner auch in Kosmetika, Zahncreme und
dergleichen verwendet werden.