-
Die Erfindung betrifft ein Protein mit
Zellen-aus(ver)breitender Aktivität wie diejenige von Fibronectin. Insbesondere
betrifft die Erfindung ein Polypeptid mit der
Zellen-ausbreitenden Aktivität von Fibronectin menschlichen Ursprungs
sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung.
-
Fibronectin ist ein multifunktionales Glykoprotein, das weit
verbreitet in einer Vielzahl verschiedener tierischer Gewebe
und Körperflüssigkeiten sowie auch auf der Oberfläche
kultivierter Zellen und anderswo vorkommt. Diese Verbindung hat
vielfältige physiologische Wirksamkeiten, so verursacht sie
etwa die Anheftung, Ausbreitung, Auswanderung, Differenzierung,
Proliferation und Phagozytose von Zellen und ist an Vorgängen,
wie etwa der Gewebsregeneration, dem Gewebsaufbau und dem
Schutz vor Infektionen, beteiligt.
-
Fibronectin ist ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von
ca. 250 000 und ist ein Dimer mit einer S-S-Bindung in der Nähe
des C-Terminus. Die Aminosäuresequenz dieses Moleküls umfaßt
drei verschiedene Typen interner repetitiver Sequenzen und kann
in die Typen I, II und III klassifiziert werden. Zusätzlich
hierzu gibt es Domänenstrukturen mit verschiedenen Funktionen,
welche die Anhaftung und Ausbreitung von Zellen bewirken und
die Fähigkeit zur Bindung von Kollagen, Heparin, Fibrin usw.
verleihen. Für diese Domänen wurden industrielle Anwendungen
der in Zusammenhang mit der Zellanheftung und -ausbreitung
stehenden biologischen Aktivität in Betracht gezogen. Bei der
Herstellung eines Beschichtungsmittels für ein
Zellkultursubstrat
ist es beispielsweise möglich, diese Funktion bei der
Herstellung einer Unterlage zu nutzen, an welche Zellen dann
binden. Ferner kann diese Funktion als Beschleuniger der
Zellbindung angewendet werden in Präparationen, wie etwa
Collyrium, Lotionen sowie Mitteln zur Förderung der
Wundheilung. Damit Zellen proliferieren, ist es, mit einigen Aus
nahmen, nötig, daß nicht nur allein die Zellanheftung sondern
auch das Phänomen der Ausbreitung stattfinden.
-
Die grundlegende Struktur, welche die für die
Zellanheftungsdomäne von Fibronectin minimal erforderliche Struktur
darstellt, ist die Sequenz Arg-Gly-Asp-Ser (Nature, 309 (1984),
30-35) In der JA-OS (Tokuhyo) 84-501548 ist ein Peptid mit
Zellen-anheftender Aktivität beschrieben, welches ein
Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 11 500 ist und das diese
Sequenz in seiner Sequenz von 108 Aminosäuren enthält.
-
Die Zellanheftungsaktivität dieses Polypeptids mit einem
Molekulargewicht von 11 500 ist jedoch viel geringer als die
von Fibronectin natürlichen Ursprungs, und es ist nicht
unbedingt möglich, diese Aktivität bei den oben erwähnten
praktischen Anwendungen zu nutzen. Diese Schwierigkeit wird
beispielsweise in J. Biol. Chem. 260 (1985), 13256-13260
diskutiert. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ferner
dieses Polypeptid vom Molekulargewicht 11500 auf
gentechnologischem Wege konstruiert und seine Aktivität mit der von
Fibronectin natürlichen Ursprungs unter Verwendung von normalen
Rattennierenzellen (NRK) verglichen. Das Ergebnis war, daß
Fibronectin eine merkliche Wirkung in einer Dosis von 0,1 bis
1 ug/Schale aufwies, während eine Dosis von 50 ug/Schale des
Polypeptids mit dem Molekulargewicht 11 500 keine derartige
Wirkung zeigte.
-
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Aminosäuresequenz
zu identifizieren, welche eine wesentliche Zellen-ausbreitende
Wirkung wie das Pepetid der Zellen-ausbreitenden Domäne van
Fibronectin aufweist, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung zu
liefern.
-
Kurz zusammengefaßt betrifft die Erfindung Polypeptide mit
Zellen-ausbreitender Aktivität, die eine Aminosäuresequenz der
folgenden Formel [1] aufweisen:
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner rekombinante
Plasmide, welche die DNA enthalten, die für die Polypeptide mit
Zellen-ausbreitender Aktivität und der durch die obige Formel
[I] dargestellten Sequenz codiert, sowie schließlich ein
Verfahren zur Herstellung der Polypeptide der Formel [I] mit
Zellen-ausbreitender Aktivität durch Kultivierung dieser
Transformanten und Isolierung der Polypeptide aus dem
Kulturmedium.
-
Es wurden Peptide mit Zellen-ausbreitender Aktivität untersucht
und mit gentechnologischen Verfahren ein Polypeptid mit einer
Sequenz von 385 Aminosäuren (Ala¹¹³³-Met¹&sup5;¹&sup7;) aus der Zellen-
ausbreitenden Domäne von Fibronectin (nachfolgend abgekürzt als
FN) hergestellt. Es wurde gefunden, daß das Polypeptid etwa den
gleichen Grad an Zellen-ausbreitender Aktivität aufweist wie
FN.
-
Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen Befunden.
-
In dieser Beschreibung weisen die den Aminosäuresymbolen
beigefügten, hochgestellten Nummern auf die Nummer des
Aminosäurerests, gezählt vom N-Terminus, der Aminosäuresequenz von
FN hin, wie sie in der EMBL-Datenbank enthalten ist.
-
Die Erfindung wird nachfolgend im Einzelnen beschrieben.
-
Die Klonierung des cDNA-Fragments, welches für das Peptid aus
FN mit 504 Aminosäuren codiert, erfolgt wie folgt. Zuerst kann,
unter Anwendung der Primer-Extension (Primer-Verlängerung)
Methode aus poly (A)&spplus;-RNA aus menschlicher Leber eine cDNA-
Bibliothek hergestellt werden, welche die für FN benötigte
cDNA-Region enthält. Hierbei wird als Primer ein DNA-Oligomeres
eingesetzt, das zu der für FN codierenden DNA-Sequenz
komplementär ist, und die Bibliothek wird z.B. unter Anwendung des
Verfahrens nach Gubler - Hoffman erhalten. Für das Screening
der Bibliothek kann die Plague-Hybridisierungs-Methode mit
einem cDNA-Fragment für FN, z.B. pLF5 (Biochemistry, 25,
(1986), 4936-4941), angewendet werden. Phagen-DNA wird aus
positiven Plaques isoliert und überprüft, um sicherzugehen, daß
das gewünschte Plasmid darin enthalten ist. Durch die
Kombination dieses cDNA-Fragments mit anderen vorhandenen cDNA-
Fragmenten (z.B. pLF5) ist es möglich, ein Plasmid zu
konstruieren, wie etwa pTF1101, welches z.B. das für die Zellen-
bindende Domäne von FN von Gly¹&sup0;¹&sup4;-Met¹&sup5;¹&sup7; codierende cDNA-
Fragment enthält, oder ein anderes Plasmid, welches das für die
gewünschte Aminosäuresequenz codierende cDNA-Fragment enthält.
-
Als nächstes wird ein geeignetes Restriktionsenzym verwendet,
um eine Schnittstelle etwas upstream vom Initiationscodon von
pTF1101, welches für die Sequenz Gly¹&sup0;¹&sup4;-Met¹&sup5;¹&sup7; codiert, zu
spalten. Dann wird Exonuklease verwendet, mit deren Hilfe es
möglich ist, das 5'-Ende der Sequenz zu entfernen. Durch
Veränderung der Reaktionsbedingungen ist es möglich, ein
Plasmid zu erhalten, aus dem die geeigneten Teile des 5'-
Terminus der codierenden Region deletiert sind. Dann spaltet
man unter Verwendung eines geeigneten Restriktionsenzyms eine
Schnittstelle etwas downstream vom Terminationscodon der
codierenden Region dieses Plasmids und trennt die
herausgespaltene DNA durch Gelelektrophorese ab. Dadurch ist es möglich,
cDNA-Fragmente zu erhalten, aus welchen verschiedene Teile des
5'-terminalen Stranges entfernt worden sind. Durch Insertion
dieser cDNA-Fragmente in einen geeigneten Expressionsvektor ist
es möglich, Peptide verschiedener Länge zu exprimieren, in
denen Teile der N-terminalen Region der Sequenz Gly¹&sup0;¹&sup4;-Met¹&sup5;¹&sup7;
(504 Aminosäurereste) deletiert sind.
-
Als Expressionsvektor kann jeder bekannte Vektor verwendet
werden. Zufriedenstellende Ergebnisse wurden mit direkter
Expression unter Verwendung des Vektors vom Typ pUC erzielt,
worin der Abstand zwischen der Ribosomenbindungsstelle und dem
Initiationscodon optimiert worden ist.
-
Durch Verbinden mit einem Transkriptionsterminationssignal
downstream vom Terminations(Stop)codon des pUC-Vektors kann
ferner der Expressionsgrad verbessert werden.
-
Die Selektion der das Peptid mit Zellen-ausbreitender Aktivität
exprimierenden Rekombinanten kann auf herkömmliche Weise durch
Immunoscreening erfolgen. Das heißt, man bringt
Expressionsvektoren, in welche die cDNA-Fragmente verschiedener Länge
eingebunden sind, auf die übliche Weise in Escherichia coli
Zellen ein und züchtet die erhaltenen Transformanten auf
Nitrocellulose-Membranen. Danach lysiert man diese und fixiert
das Protein aus den Zellen an die Filtermembranen. Nach
Blockieren der Filter mit Rinder-Serumalbumin oder dergleichen
bringt man einen monoklonalen Antikörper zur Wirkung, welcher
die Zellen-ausbreitende Domäne von FN erkennt. Der an das
Filter gebundene monoklonale Antikörper wird durch Markierung
mit einem Sekundärantikörper nachgewiesen. Auf diese Weise ist
es möglich, Rekombinante zu selektieren, welche das Peptid mit
der Zellen-ausbreitenden Domäne exprimieren.
-
Als nächstes werden die solchermaßen selektierten Rekombinanten
unter zur Expression geeigneten Bedingungen kultiviert und die
Expression des Peptids mit der Zellen-ausbreitenden Domäne wird
induziert. Als Kontrolle, daß Expression stattfindet, kann die
Immunoblot-Technik eingesetzt werden. Dazu wird das
Gesamtzellprotein der kultivierten Zellen durch Hitzebehandlung in einem
SDS-haltigen Puffer lysiert und durch SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese aufgetrennt. Das Elektrophoresemuster wird
dann auf eine Nitrocellulose- oder Nylonmembran übertragen.
Nach Inkubation eines für die Zellen-ausbreitende Domäne von FN
spezifischen, monoklonalen Antikörpers mit der Membran wird ein
enzymmarkierter Sekundärantikörper aufgebracht und die
Enzymaktivität des gebundenen Antikörpers verursacht eine
Farbzunahme in einem chromogenen Material. Dadurch ist es möglich,
das Vorhandensein einer Bande des Peptids mit der Zellen-
ausbreitenden Domäne zu bestätigen.
-
Durch Analysieren der Basensequenz am 5'-Ende der inserierten
Fragmente der erhaltenen Klone ist es möglich, den N-Terminus
des exprimierten Peptides zu identifizieren.
-
Am N-Terminus eines mit einem auf diese Weise erhaltenen Klon
hergestellten Peptides finden sich ein vom Initiationscodon von
E. coli stammender Methioninrest und ein vom Nco I-Linker
stammender Alaninrest. Diese Aminosäurereste beeinflussen die
Zellen-ausbreitende Aktivität jedoch nicht. Falls nötig, können
diese zusätzlichen Sequenzen jedoch entfernt werden. Man kann
z.B. unter geeigneten Bedingungen das N-terminale Methionin
während der Kultur der Rekombinanten durch Einwirkung einer
Methionin-Aminopeptidase, die üblicherweise in E. coli erzeugt
wird, entfernen. Diese Entfernung kann auch durch Verwendung
von Methionin-Aminopeptidase mit einem teilaufgereinigten
Peptid bewirkt werden (J. Bacteriol., 169 (1987), 751). Es ist
ferner möglich, das vom Nco I-Linker stammende Alanin durch
Verfahren der "site-specific" Mutagenese zu entfernen.
-
Eine Aufreinigung des Peptids mit der Zellausbreitungsdomäne
kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden. Das
Zellsediment wird in einem Puffer suspendiert und die lösliche von
der unlöslichen Fraktion durch Ultraschallbehandlung getrennt.
Die unlösliche Fraktion wird in einem Puffer solubilisiert,
der 7 M Harnstoff enthält. Die löslichen Fraktionen werden
vereinigt und auf eine Sepharose 4B-Säule aufgetragen, an
welche der im Immunoblotting verwendete Antikörper gebunden
ist. Danach wird eine Affinitätsaufreinigung durchgeführt. Zur
Elution wird ein Puffer mit einem pH-Wert um 2,3 verwendet.
Durch Isolieren der gewünschten Fraktionen durch Immunoblotting
kann das Peptid mit der Zellausbreitungsdomäne isoliert werden.
Falls nötig kann eine weitere Aufreinigung durch FPLC und HPLC
erfolgen.
-
Das so erhaltene Peptid mit der Zellausbreitungsdomäne kann
bezüglich seiner Zellen-ausbreitenden Aktivität gegenüber NRK-
Zellen (normale Rattennierenzellen) vermessen werden. Die Probe
wird in einem Puffer gelöst und zum Beschichten von
Mikrotiterplatten-Vertiefungen verwendet. Danach werden NRK-Zellen
zugesetzt und die Platte über eine definierte Zeit bei 37ºC
inkubiert. Die Ausbreitung der Zellen wird unter dem Mikroskop
beobachtet und die minimale Dosis an Probe pro Vertiefung,
welche eine Expression von Zellen-ausbreitender Aktivität
verursacht, mit der benötigten Dosis an FN natürlichen
Ursprungs verglichen. Auf diese Weise kann die Stärke der Zellen-
ausbreitenden Aktivität ausgedrückt werden.
-
In der oben beschriebenen Versuchsreihe wurde gefunden, daß das
Peptid mit der Sequenz von 385 Aminosäuren (Ala¹¹³³-Met¹&sup5;¹&sup7;) der
in der in der allgemeinen Formel [I] gezeigten Sequenz im
wesentlichen die gleiche Zellen-ausbreitende Aktivität wie FN
aufweist.
-
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Dabei wird zum
Teil auf die beiliegende Zeichnung Bezug genommen:
-
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung des Vorgehens zur
Konstruktion eines Expressionsplasmids, welches die für das die
Gly¹&sup0;¹&sup4;-Met¹&sup5;¹&sup7;-Sequenz von Fibronectin enthaltende Polypeptid
codierende DNA-Sequenz enthält.
Beispiel 1. Konstruktion von Rekombinanten
(1) Konstruktion des für Gly¹&sup0;¹&sup4;-Met¹&sup5;¹&sup7; (504 Aminosäuren) von
Fibronectin codierenden Expressionsplasmids pTF1101 (vgl.
Fig. 1):
(1-1) Synthese der Primer-verlängerten cDNA:
-
Der 17 Basen umfassende Primer (5'-GTCTCCACTGAAGTGC-3'),
welcher zur mRNA-Sequenz von Fibronectin komplementär ist,
wurde unter Verwendung eines DNA-Synthesizers (Applied
Biosystems, Inc., Typ 380A) synthetisch hergestellt. Dieser
synthetische Primer wurde zur Synthese von cDNA aus poly(A)&spplus;-RNA
menschlichen Ursprungs (Clontec Laboratories, Inc.) verwendet.
-
Bei der cDNA-Synthese wurden Reagentien des
cDNA-Synthesesystems der Firma Amersham verwendet. Hierzu gehörten 4 ul eines
5-fach konzentrierten Puffers für die Synthese des ersten
Strangs, 1 ul Natriumpyrophosphatlösung, 1 ul
Ribonukleaseinhibitor (20 Einheiten), 2 ul eines
Desoxyribonukleotidtriphosphat-Gemisches (10 mM), 1 ul synthetischer DNA-Primer
(0,1 ug), 5 uCi [α-³²P]-dCTP und 1 ul poly(A)&spplus;-RNA (1 ug). Diese
Reagentien wurden in der angegebenen Reihenfolge in ein
gekühltes Eppendorf-Reaktionsgefäß gegeben, dessen Inhalt dann
vorsichtig gemischt wurde. Dann wurden 20 Einheiten von Reverse
Transkriptase (1 ug) und destilliertes Wasser auf ein
Gesamtvolumen von 20 ul zugegeben und der Inhalt wurde vorsichtig
gemischt. Das Gemisch wurde 50 Minuten bei 42ºC inkubiert. Das
Reaktionsgefäß wurde zurück in das Eisbad gestellt und die
nachfolgenden Reagentien wurden in der angegebenen Reihenfolge
zugegeben: 37,5 ul eines Puffers zur Verwendung bei der
Synthese des zweiten Stranges, 50 uCi [α-³²P]-dCTP (5 ul), 0,8
Einheiten Ribonuklease H aus Escherichia coli (1 ul), 23
Einheiten Escherichia coli DNA-Polymerase 1 (3,5 ul) sowie 33 ul
Wasser. Der Inhalt des Reaktionsgefäßes wurde vorsichtig
gemischt. Das Reaktionsgefäß wurde zunächst für 60 Minuten bei
12ºC, dann für 60 Minuten bei 22ºC und schließlich 10 Minuten
bei 70ºC inkubiert und dann wieder in das Eisbad gestellt. Dann
wurden 2,0 Einheiten (0,5 ul) T4-DNA-Polymerase zugegeben. Nach
vorsichtigem Mischen des Inhalts wurde das Reaktionsgefäß 10
Minuten bei 37ºC inkubiert. Danach wurde die Reaktion durch
Zugabe von 10 ul 0,25 M EDTA (pH 8,0) und 10 ul 10% SDS
gestoppt. Es wurde zweimal mit Phenol extrahiert und danach ein
gleiches Volumen 4 M Ammoniumacetat zugesetzt, gefolgt von der
Zugabe von zwei Volumina gekühltem Ethanol. Das Gemisch wurde
15 Minuten in Trockeneis gestellt und dann zurück in
Raumtemperatur gebracht. Das Gemisch wurde 10 Minuten zentrifugiert und
der Überstand entfernt. Das Sediment wurde in 50ul TE (10 mM
Tris-HCl und 1 mM EDTA, pH 8,0) gelöst und die Ethanolfällung
einmal wiederholt. Der Niederschlag wurde in 200 ul gekühltem
Ethanol gewaschen, getrocknet und in einer geringen Menge TE
aufgelöst.
(1-2) Ligierung von cDNA mit dem λgt10-Phagenvektor und in
vitro Verpackung:
-
Die im obigen Abschnitt (1-1) erhaltene CDNA Wurde in 16,6 ul
eines Reaktionsgemisches eingebracht, welches 0,5 ug eines
EcoRI-Linkers (d[pGGAATTCC]), Ligierungspuffer und 2,8
Einheiten von T4-DNA-Ligase enthielt. Das Gemisch wurde über Nacht
bei 15ºC inkubiert. Danach wurde die Reaktion durch
zehnminütige Behandlung bei 70ºC gestoppt. Der Puffer wurde auf einen für
die Reaktion von EcoRI geeigneten verändert und 50 Einheiten
EcoRI wurden zugegeben; das Gesamtvolumen wurde vor der
Inkubation von 2 Stunden bei 37ºC auf 100 ul gebracht. Die
Reaktion wurde dann durch zehnminütige Behandlung bei 70ºC
gestoppt. Das gesamte Gemisch wurde auf eine Sephadex G-50-
Säule (1 ml) aufgebracht und die Säule wurde mit STE-Puffer
(100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA, pH 8,0) eluiert.
Auf diese Weise wurde der freie Linker entfernt. Dann wurde die
cDNA-Fraktion gegen 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 0,1 mM EDTA
dialysiert und danach lyophilisiert. Zur erhaltenen Substanz
wurden 333 mM NaCl und 10 mM MgCl&sub2; zugegeben und das Gemisch
wurde auf 4,5 ul gebracht. Danach wurden 0,5 ul (0,25 ug)
λgt10/EcoRI-Arme (Amersham) zugesetzt, gefolgt von 5 ul einer
Lösung B eines DNA-Ligierungs-Reaktionskits (Takara Shuzo). Das
Gemisch wurde für 10 Minuten bei 26ºC inkubiert und die
Reaktion dann durch zehnminütige Behandlung bei 70ºC gestoppt.
Dies erlaubte das Stattfinden einer in vitro
Verpackungsreaktion. In 4 ul Reaktionsflüssigkeit wurden zwei Arten von
Verpackungsextrakten (Stratagene) vorsichtig eingemischt und es
erfolgte die Inkubation bei 22ºC über 2 Stunden, während die
Phagenpartikel gebildet wurden. Dann wurden 500 ul SM-Puffer
(100 mM NaCl, 8 mM MgSO&sub4;, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, und 0,01%
Gelatine) mit 20 ul Chloroform zugegeben und das Gemisch wurde
bei 4ºC gehalten.
(1-3) Plaque-Hybridisierung:
-
Zuerst wurden 100 ul des oben hergestellten Gemisches zu 200 ul
einer Kultur von Escherichia coli NM 514 zugegeben, welche über
Nacht in L-Broth-Kulturlösung mit 4% Maltose kultiviert worden
war, und diese wurde 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Dann wurden
4 ml auf 42ºC erhitztes L-Softagarmedium (L-Broth mit 8% Agar)
zugegeben, bevor es auf eine 20 ml-L-Agarplatte überschichtet
wurde. Diese kultur wurde über Nacht bei 37ºC inkubiert und
Nylonfilter (Hybond N, Amersham) wurden oben auf die Platten
für 30 Sekunden aufgelegt. Die Filter wurden für 5 Minuten auf
mit Denaturierungslösung (0,5 M NaOH und 1,5 M NaCl)
gesättigtes, dickes Filterpapier und danach für 5 Minuten auf mit
Neutralisierungslösung (0,5 M Tris-HCl, pH 7,0, und 1,5 M NaCl)
gesättigtes, dickes Filterpapier gelegt. Als nächstes wurden
die Filter mit 2-fach konzentriertem SSC (0,3 M NaCl und 30 mM
Natriumcitrat, pH 7,0) gewaschen und getrocknet. Sie wurden
durch UV-Bestrahlung bei 300 nm über 5 Minuten fixiert und als
Replikafilter verwendet. Getrennt hiervon wurde eine Sonde zur
Verwendung bei der Hybridisierung hergestellt. Zunächst wurden
4 ug des Plasmids pLF5 mit 12 Einheiten PvuII und dann mit 15
Einheiten EcoRI verdaut und durch Agarose-Gelelektrophorese
erhielt man 100 ng des daraus resultierenden Fragments der
Länge 0,43 kb. Das erhaltene Fragment wurde mit ³²P unter
Verwendung des Multiprime DNA-Markierungssystems der Firma
Amersham nach dem Herstellerprotokoll markiert. Die so
erhaltene, markierte Sonde wies eine Aktivität von 5,5 x 10&sup7; cpm pro
60 ul auf. Die erwähnten Replikafilter wurden in 15 ml einer
Lösung eingebracht, welche 6-fach SSC, 5-fach Denhardt-Lösung
(0,1% Rinder-Serumalbumin, 0,1% Polyvinylpyrrolidon und 0,1%
Ficoll), 0,5% SDS und 80 ug/ml Lachssperma-DNA enthielt, und
der gesamte Ansatz wurde über 4 Stunden bei 65ºC inkubiert,
währenddessen die Vorhybridisierung erfolgte. Als nächstes
wurde eine vorher Hitze-denaturierte, markierte Sonde (2,75 x
10&sup7; dpm) dem Gemisch zugefügt und man ließ die Hybridisierung
über Nacht unter den selben Bedingungen ablaufen. Die Filter
wurden zweimal in 2-fach SSC und 0,1% SDS 15 Minuten bei 65ºC
und dann zweimal in 0,2-fach SSC und 0,1% SDS 15 Minuten bei
65ºC gewaschen. 2-fach SSC wurde für ein kurzes Abspülen
verwendet, und es wurde eine Autoradiographie durchgeführt. Als
deren Ergebnis fand sich ein radioaktives Signal in 250 der 4
x 10³ Plaques.
(1-4) Herstellung von Phagen-DNA und Analyse der inserierten
Fragmente:
-
Phagenklone, die ein positives Signal gaben, wurden in 1 ml SM-
Puffer suspendiert und 250 ul dieser Suspension wurden 0,5 ml
eines Kulturansatzes von Escherichia coli NM514-Zellen
zugesetzt, der über Nacht kultiviert worden war. Das Gemisch
wurde 15 Minuten bei 37ºC inkubiert und man ließ die Phagen
sich anheften; 5 ml L-Broth mit 10 mM MgCl&sub2; wurden zugegeben und
es wurde 4,5 Stunden bei 37ºC unter Schütteln kultiviert. Dem
Kulturansatz wurden 50 ul Chloroform zugesetzt und es wurde für
10 Minuten weiter geschüttelt. Dann wurde der Kulturansatz
zentrifugiert und der Überstand (das Phagenlysat) erhalten.
Dann wurden dem Phagenlysat 20 ug DNase I und 10 ug RNase A
zugegeben und das Gemisch wurde 3 Minuten bei 37ºC inkubiert.
Dann wurden 0,29 g NaCl zusammen mit 0,55 g PEG 6000 zugesetzt
und das Gemisch wurde 2 Stunden auf Eis inkubiert. Durch
Zentrifugieren wurde aus diesem Gemisch ein Sediment erhalten und
in 400 ul TE suspendiert. Es erfolgte zweimalige
Phenolextraktion, einmalige Phenol/Chloroformextraktion und einmalige
Chloroformextraktion, gefolgt von einer Ethanolfällung. Auf
diese Weise erhielt man Phagen-DNA. Die Phagen-DNA wurde in 20
ul TE aufgelöst und in 30 ul eines Reaktionsgemisches mit 20
Einheiten EcoRI eingebracht; das Gemisch wurde 2 Stunden bei
37ºC inkubiert. Die inserierten Fragmente wurden durch
Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Als Ergebnis wurde gefunden,
daß von den 24 Klonen ein Klon ein 1,1 kb-Fragment inseriert
enthielt. Dieses 1,1 kb-Fragment wurde in das Plasmid pUC118
subkloniert und das erhaltene, rekombinante Plasmid erhielt die
Bezeichnung pUFN74. Dieses Plasmid wurde zur Identifizierung
der Basensequenz des inserierten Fragments nach der Dideoxy-
Methode verwendet. Es wurde gefunden, daß dieses Fragment die
cDNA von Fibronectin (The EMBO Journal, 4 (1985), 1755-1759)
beginnend bei G in Position 2990 bis A in Position 4105 war.
Das C in Position 3018, das C in Position 3063 und das C in
Position 3216 waren jedoch jeweils durch A, A bzw. T ersetzt;
hierdurch ergab sich jedoch keine Änderung der dadurch
codierten Aminosäuren.
(1-5) Herstellung eines Eco0109 BamHI-Fragments von pUFN74:
-
Auf 40 ug pUFN74 wurden 200 Einheiten Eco0109 zugegeben und in
einem Reaktionsgemisch von 400 ul 2 Stunden bei 37ºC inkubiert.
Danach wurde die DNA durch Ethanolfällung isoliert. Die Hälfte
der erhaltenen DNA wurde in 200 ul eines Reaktionsgemisches
eingebracht, das 7 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 20 mM NaCl,
7 mM MgCl&sub2;, 20 uM dATP, 20 uM dGTP, 20 uM dCTP, 20 uM dTTP und
2 Einheiten Klenow-Fragment enthielt. Dieses Gemisch wurde 20
Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde die Reaktion
durch zehnminütige Behandlung bei 65ºC gestoppt und dem
Reaktionsgemisch wurde Ligierungspuffer zugesetzt, gefolgt von
der Zugabe von 2,5 nM eines EcoRI-Linkers (d[pCCGAATTCGG)) und
2,8 Einheiten von T4-DNA-Ligase. Dieses Gemisch wurde über
Nacht bei 13ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Erhitzen des
Gemisches gestoppt. Dieses wurde in 400 ul eines
Reaktionsgemisches eingebracht, welches 60 Einheiten BamHI und 50
Einheiten EcoRI enthielt, und der gesamte Ansatz wurde 2
Stunden bei 37ºC inkubiert. Dann wurde durch
Agarose-Gelelektrophorese ein 1,0 kb-Fragment erhalten; die Ausbeute betrug
0,2 ug.
(1-6) Herstellung eines BamHI-HindIII-Fragments von pTF301:
-
Zuerst wurden 200 Einheiten EcoRI-Methylase zu 50 ug pTF301
(konstruiert nach dem in der JA-OS (Tokkai) 89-180900, der US-
PA Nr. 07/291894 (29. Dez. 1988) beschriebenen Verfahren)
zugesetzt und auf 200 ul gebracht; das Reaktionsgemisch wurde
1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Dann wurde das Gemisch 20 Minuten
bei 65ºC behandelt und auf 400 ul gebracht. Dem
Reaktionsgemisch wurden 60 Einheiten BamHI und 60 Einheiten HindIII
zugegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Dann
wurde durch Agarose-Gelelektrophorese ein 0,5 kb-Frgment
erhalten; die Ausbeute betrug 0,1 ug.
(1-7) Konstruktion und Klonierung von für Gly¹&sup0;¹&sup4;-Met¹&sup5;¹&sup7; (504
Aminosäuren) codierenden cDNA-Fragmenten:
-
Zuerst wurden 0,2 ug des im obigen Abschnitt (1-5) erhaltenen
1,0 kb-Fragmentes und 0,1 ug des im obigen Abschnitt (1-6)
erhaltenen 0,5 kb-Fragmentes in 100 ul eines Ligierungspuffers
eingebracht, dem 2,8 Einheiten von T4-DNA-Ligase zugegeben
wurden, und der gesamte Ansatz wurde über Nacht bei 16ºC
inkubiert, bevor zum Stoppen der Reaktion eine Hitzebehandlung
für 10 Minuten bei 70ºC erfolgte. Das Reaktionsgemisch wurde zu
einem für die Verwendung von HindIII geeigneten Puffer gemacht
und 100 ul des Reaktionsgemisches wurden mit 12 Einheiten
HindIII 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Dann wurde der Puffer zu
einem für die Verwendung von EcoRI geeigneten Puffer gemacht
und 10 Einheiten EcoRI wurden zugegeben und der gesamte Ansatz
wurde 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch
Erhitzen gestoppt. Dann wurden 20 ul dieses Reaktionsgemisches
zu 30 ul eines Reaktionsgemisches gegeben, welches 0,16 ug
dephosphoryliertes Plasmid pIN-III-ompA-1, das mit EcoRI-
HindIII behandelt war, und 2,8 Einheiten von T4-DNA-Ligase
enthielt. Dieses Gemisch wurde über Nacht bei 16ºC inkubiert. Die
Hälfte des Reaktionsgemisches wurde zur Transformation von
Escherichia coli HB101-Zellen verwendet. Von den erhaltenen
Transformanten wurden 12 Klone auf das inserierte Fragment hin
untersucht, das sie enthielten. Ihre Basensequenz wurde nach
der Dideoxy-Methode bestimmt und man fand ein Plasmid, welches
die für die Gly¹&sup0;¹&sup4;-Met¹&sup5;¹&sup7;-Sequenz von Fibronectin codierende
cDNA enthielt. Dieses Plasmid erhielt die Bezeichnung pTF1101,
und die dieses Plasmid tragenden Escherichia coli JM109-Zellen
wurden mit JM109/pTF1101 bezeichnet. Der Stamm wurde beim
Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial
Science and Technology, Japan, unter der Hinterlegungsnummer
FERM BP-2156 hinterlegt.
(2) Herstellung von DNA-Fragmenten
-
Zuerst wurden 40 ug des wie oben erwähnt für das
Zell-anheftende Polypeptid mit einer Sequenz von 504 Aminosäuren codierenden
Plasmids pTF1101 2 Stunden bei 37ºC in 102 ul eines
Reaktionsgemisches inkubiert, welches 24 Einheiten des
Restriktionsenzyms XbaI in einem Puffer zur Verwendung dieses
Restriktionsenzyms
enthielt. Dann wurde die Reaktion durch
fünfminütiges Erhitzen des Reaktionsgemisches auf 65ºC gestoppt. Die DNA
wurde durch Ethanolfällung erhalten. Die Hälfte der erhaltenen
DNA wurde bei 30ºC in 116 ul eines Reaktionsgemisches
inkubiert, welches 12 Einheiten von BAL31-Nuklease S in einem zur
Verwendung dieses Enzyms geeigneten Puffer enthielt, und von
der zweiten bis zur achten Minute der Inkubation wurden alle
zwei Minuten 23 ul vom Reaktionsgemisch abgenommen; zu jeder
dieser Portionen wurde Phenol zum Abstoppen der Reakton
zugegeben, bevor die DNA der Portion durch Ethanolfällung
isoliert wurde. Jeweils die Hälfte der hierbei erhaltenen DNA-
Menge wurde zu 40 ul eines Reaktionsgemisches gegeben, welches
0,4 Einheiten von Klenow-Enzym in einem zur Verwendung dieses
Klenow-Enzyms geeigneten Puffer enthielt, und das
Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde
durch fünfminütiges Erhitzen des Reaktionsgemisches auf 65ºC
gestoppt. Dann wurden der Hälfte jedes Reaktionsgemisches 10 ul
einer Lösung zugesetzt, welche 1 ug phosphorylierten NcoI-
Linker (d[AGCCATGGCT]) enthielt, und zu diesem Gemisch wurden
80 ul einer Flüssigkeit A und 20 ul einer Flüssigkeit B aus
einem DNA-Ligierungs-Reaktionskit (Takara Shuzo Co., Ltd.)
zugegeben und die erhaltenen Gemische 30 Minuten bei 16ºC
inkubiert. Dann wurden jeweils 10 ul jedes Reaktionsgemisches
zur Transformation von E. coli JM109-Zellen eingesetzt. Die
erhaltenen Transformanten wurden über Nacht bei 37ºC in
Schüttelkultur in 5 ml L-Broth mit 50 ug/ml Ampicillin
kultiviert. Aus ca. 1,5 ml des Kulturansatzes jeder Probe wurden die
Zellen geerntet und Plasmid-DNA isoliert und gereinigt. Die
erhaltenen DNAs wurden in 100 ul TE gelöst. Dann wurden jeweils
100 ul der auf diese Weise erhaltenen DNA-Lösungen 2 Stunden
bei 37ºC in 126 ul eines Reaktionsgemisches inkubiert, das 12
Einheiten HindIII und 12 Einheiten NcoI in 100 mM Tris-HCl (pH
7,5) mit 7 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl und 7 mM 2-Mercaptoethanol
enthielt. Nach dieser Inkubation wurde 1 ul einer Lösung von 10
ug/ml RNase A zugesetzt und das Gemisch 30 Minuten bei 37ºC
inkubiert. Die erhaltenen Gemische wurden durch Agarose-
Gelelektrophorese behandelt und der DNA von der Länge 0,9 bis
1,5 kb enthaltende Teil des Gels wurde ausgeschnitten. Jede
Portion wurde mit Phenol behandelt und durch Ethanolfällung
wurden DNA-Fragmente erhalten. Diese DNA-Fragmente wurden in 50
ul TE gelöst.
(3) Klonierung in pUC119N
-
Zu 5 ul einer, wie oben im Abschnitt (1) erläutert, erhaltenen
Lösung von DNA-Fragmenten wurden 5 ul einer Lösung zugesetzt,
welche 0,2 ug des mit NcoI und HindIII behandelten und
dephosphorylierten Plasmids pUC119C enthielt; zu diesem Gemisch
wurden 40 ul einer Lösung A und 10 ul einer Lösung B aus dem
DNA-Ligierungs-Kit zugesetzt und das resultierende Gemisch
wurde 30 Minuten bei 16ºC inkubiert. Dann wurden 10 ul dieses
Reaktionsgemisches zur Transformation von E. coli JM109-Zellen
eingesetzt.
-
Der verwendete pUC119N wurde durch Einführen der
NcoI-Schnittstelle in die Translationsinitiationsstelle des handelsüblichen
Vektors pUC119 (Takara) konstruiert, und der Abstand zwischen
der Ribosomenbindungsstelle und dem Initiationsckodon wurde auf
acht Basen gebracht.
(4) Screening der exprimierten Plasmide
-
Die wie im obigen Abschnitt (2) erhaltenen Transformanten
wurden auf einen Nitrocellulosefilter (BA85,
Schleicher&Schuell) übertragen, welcher auf L-Agar mit 50 ug/ml Ampicillin
gelegt war, und 5 Stunden bei 37ºC inkubiert. Dieser
Nitrocellulosefilter wurde auf L-Agar mit 50 ug/ml Ampicillin und 1 mM
Isopropyl-β-thiogalactosid (IPTG) übertragen und die
Kultivierung
über Nacht bei 37ºC fortgesetzt. Die gewachsenen Kolonien
wurden für 15 Minuten mit Chloroformdampf in Kontakt gebracht
und der Nitrocellulosefilter wurde dann 3 Stunden bei
Raumtemperatur in einer Lösung von 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) mit 150 mM
NaCl, 5 mM MgCl&sub2;, 3% Rinder-Serumalbumin, 80 Einheiten/ml von
DNase I und 40 ug/ml von Lysozym inkubiert. Der Filter wurde
zuerst mit monoklonalem anti-FN-Antikörper FN-10 (Takara),
welcher spezifisch die Zellen-bindende Domäne von FN erkennt,
und danach mit einem Peroxidase-markierten Sekundärantikörper
behandelt; dann wurde der Filter zum Entwickeln der Farbe in
Gegenwart von Wasserstoffperoxid und 4-Chlor-1-naphthol
behandelt. Expressionsrekombinante wurden selektiert.
-
Im folgenden Screening wurden 45 Klone von insgesamt 556
selektiert und jeweils separat auf 5 ml L-Broth mit 50 ug/ml
Ampicillin 5 Stunden bei 37ºC kultiviert. Dann wurden 100 mM
IPTG auf eine Endkonzentration von 1 mM zugesetzt und die
Kultur wurde über Nacht bei 37ºC fortgesetzt. Das erhaltene
Gesamtprotein der Bakterienzellen wurde durch
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) auf getrennt und
Immunoblotting eingesetzt, um zu überprüfen, ob das erzeugte Polypeptid
ein Molekulargewicht von 45kDa bis 53 kDa aufwies und mit dem
monoklonalen anti-FN-Antikörper FN-10 reagierte.
-
Aus den oben genannten 45 selektierten Klonen wurden die DNA-
Sequenzen von 5 Klonen ermittelt. Die Ergebnisse sind in der
Tabelle 1 gezeigt. Hieraus wurde das für die 385-Aminosäuren-
Sequenz Ala¹¹³³-Met¹&sup5;¹&sup7; codierende Plasmid mit pTFB800 bezeichnet,
und die dieses Plasmid tragenden E. coli JM109-Zellen erhielten
die Bezeichnung E. coli JM109/pTFB800. Dieser Stamm wurde unter
der Hinterlegungsnummer FERM BP-2126 beim Fermentation Research
Institute of the Agency of Industrial Science and Technology,
Japan, hinterlegt.
Tabelle 1
Klon Nr.
codierende Region
(Anzahl Aminosäurereste)
Beispiel 2 Aufreinigung des Peptids aus Rekombinanten
-
Plasmid pTFB800, welches die Sequenz von 385 Aminosäuren von
Ala¹¹³³ bis Met¹&sup5;¹&sup7; exprimiert, wurde zur Transformation von E.
coli JM109-Zellen eingesetzt und ergab E. coli JM109/pTFB800-
Zellen. Diese Zellen wurden über Nacht bei 37ºC in
Schüttelkultur in 5 ml L-Broth mit 50 ug/ml Ampicillin kultiviert. Dieser
Kulturansatz wurde zum Beimpfen von 250 ml des gleichen
Kulturmediums in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben verwendet, und
dieser Ansatz wurde unter Schütteln bei 120 Upm kultiviert. Bei
Erreichen einer Absorption bei 660 nm von 0,2, wurden dem
Kulturmedium 100 mM IPTG auf eine Endkonzentration von 1 mM
zugesetzt und die Zellen bei Stunde 20 geerntet. Das Sediment
aller Bakterienzellen wurde in einer Lösung von 50 mM Tris-HCl
(pH 7,5) mit 1 mM EDTA suspendiert und die Zellen beschallt.
Diese Suspension wurde zentrifugiert und der Überstand
isoliert. Ein Teil dieses Überstandes wurde zum Immunoblotting
eingesetzt, wobei das Protein des Überstandes durch SDS-PAGE
aufgetrennt und das Elektrophoresemuster auf eine
Nitrocellulose-Membran übertragen wurde. Dann wurde ein monoklonaler
Antikörper (FN-10, Takara) verwendet, um auf die Gegenwart der
Zellen-bindenden Domäne von FN, für welche der Antikörper
spezifisch ist, zu prüfen. Nach Anwendung dieses ersten
Antikörpers wurde ein Peroxidase-markierter Sekundärantikörper
eingesetzt. Die Peroxidaseaktivität wurde dort, wo der
Sekundärantikörper gebunden hatte, in Gegenwart von Wasserstoffperoxid
und 4-Chlor-1-naphthol farbentwickelt und man fand die
gewünschte Bande in der Gegend des Molekulargewichtes von 45
kDa. Als nächstes wurde der verbliebene Teil des Überstandes
über eine mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 äquilibrierte DEAE-
Toyopearl 6505-Säule (25 ml) gegeben. Die Säule wurde mit 100
ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, gewaschen und dann zuerst mit 50 ml
50 mM Tris-HCl, pH 7,5 mit 1000 mM NaCl und dann mit 50 ml 50
mM Tris-HCl, pH 7,5, mit 200 mM NaCl eluiert. Fraktionen wurden
gesammelt. Die gewunschten Fraktionen (DEAE-Rohfraktionen)
wurden durch Immunoblotting identifiziert und vereinigt. Die
DEAE-Rohfraktion wurde auf eine Sepharose 4B-Säule (10 ml)
gegeben, an welche monoklonaler Antikörper FN-10 gebunden war.
Die Säule wurde mit 50 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 mit 100 mM
NaCl und dann mit 20 mM Ammoniumacetat gewaschen. Eluiert wurde
mit 40 mM Essigsäure und Fraktionen wurden gesammelt. Die
gewünschten Fraktionen wurden durch Immunoblotting
identifiziert und vereinigt. Durch Elektrophorese wurden ca. 7 mg
nahezu reines Peptid erhalten. Die Aminosäuresequenz des
Peptids wurde unter Verwendung eines Peptidsequenzators
(477A/120A, Applied Biosystems Inc.) mit Ala-Ala-Pro-Ile-Val-
Asn-Lys ermittelt. Diese Sequenz stimmte mit derjenigen des N-
Terminus des gewünschten Peptids überein, einschließlich eines
vom NcoI-Linker stammenden Alanins am N-Terminus.
Beispiel 3 Bestimmung der Zellen-ausbreitenden Aktivität
-
Die Zellen-ausbreitende Aktivität des in Beispiel 2 erhaltenen,
385 Aminosäuren enthaltenden Polypeptids und von Fibronectin
wurde nach dem Verfahren von Rouslahti et al. (Methods in
Enzymology 82 (1981), 803-831) gemessen. Die Probe wurde
stufenweise in physiologischer Kochsalzlösung und destilliertem
Wasser verdünnt und 50 ul der erhaltenen Lösung wurden in die
Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen
gegeben, welche dann über Nacht bei 4ºC inkubiert wurde, um die
Probe an die Vertiefungen anheften zu lassen. Dann wurde die
Platte zweimal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)
gewaschen, 100 ul 3% Rinder-Serumalbumin wurden in jede
Vertiefung gegeben und die Platte wurde eine Stunde bei 37ºC
inkubiert. Die Platte wurde zweimal mit PBS gewaschen und dann
wurden NRK-Zellen (NRK-49F) als Suspension in einer
Konzentration von 10&sup6; Zellen/ml in Eagle's Minimum Essential Medium
(MEM) in einer Menge von 100 ul/Vertiefung zugesetzt und die
Platte wurde 2 bis 3 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die
verwendeten NRK-49F-Zellen wurden als gefrorener Stamm zur
Lagerung erhalten und zunächst vorinkubiert und dann vor
Verwendung mit Trypsin behandelt. Die Ausbreitung der Zellen
wurde mikroskopisch beobachtet und die minimale zur Erzielung
von Zellen-ausbreitender Aktivität nötige Dosis errechnet.
Diese Ergebnisse sind in der Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Polypeptid
(Länge der Aminosäuresequenz)
Minimale Dosis für Zellausbreitung (ug/Vertiefg.)
-
Wie oben im Einzelnen ausgeführt, liefert die vorliegende
Erfindung ein Peptid, welches Zellen-ausbreitende Aktivität
aufweist, die im wesentlichen der von FN gleich ist, und sie
liefert ferner ein Verfahren zu seiner Herstellung mit
gentechnologischen Methoden. Die oben erwähnten Polypeptide können als
pharmazeutische Zubereitung für Anwendungen, wie zur
Wundheilung, in Collyria, zur Prävention von Krebsmetastasen, für die
Implantation künstlicher Organe in den Körper und dergleichen,
verwendet werden. Sie können auch in Kosmetika, Zahncreme und
dergleichen verwendet werden.