JPH02152990A - 細胞接着活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、フィブロネクチン様の細胞接着活性タンパク
質に関し、更に詳しくは、ヒトフィブロネクチンの細胞
接着活性を有するポリペプチド及びその製造方法に関す
る。 〔従来の技術〕 フィブロネクチン（以下ＩＰＮと略称する）は、初物の
桟々の組織や体液中、また、培養細胞表面など（こ広く
分布する多機能糖タンパク質であり、細胞の接着、伸展
、移動、分化、増殖、貧食作用などの生理作用を示し、
組織修復、組織構築、生体防御などに関与していること
が知らｎている。 フィブロネクチンは、分子量約２５万のポリペプチドか
Ｏ末端付近でＳ−８結合で２童体を形成している。分子
内アミノ酸配列は、繰返しＩｌ造を有し、１．［ｌ、Ｉ
型に分けらｎる。更に、種々の機能をｉＴるドメイン構
造を有し、細胞接着、コラーゲン、ヘパリン及びフィブ
リン等番こ対する結合活性を示す。こわらのドメインの
うち、細胞！ｌ’ｔドメインについては、その生物活性
から産業上の利用が考えられて２つ、例えは、培養基質
のコーティング剤として、細胞が付着する基質の調製番
こ使用することかできる。 また、細胞付看の促進剤として、点眼液、ローション、
外傷治療薬などに便用することかできる、フィブロネク
チンの細胞接着ドメインの基本構造については、その最
小活性単位としてＲ−Ｇ−Ｄ−８配列が明らかにされて
２つ〔ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）第３０９巻、第３
０〜３３頁（１９８４）］、この配列を含む１０８アミ
ノ竣残基から成る分子量１．１５万のポリペプチドが、
細胞接着活性ペプチドとして、特表昭５９−５０１５４
８号公報に記載されている。 〔発明が解決しようとする課題〕 しかしながら、この分子量１．１　ｓ万のポリペプチド
の細胞接着活性は、天然のフィブロネクチン１こ比べて
非常ξこ弱り、前記の用途として用いるには必ずしも実
用的とは言い難い。このことについては、例えばジャー
ナル　オプ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、　Ｏｈｅｍ、　）第２６０巻、第１３２５８〜１
３２６０頁（１９８５）に記載されている。また、本発
明者らは、前記分子１ｉ１．１５万のポリペプチドを遺
伝子工学的に製造し、そのＮＲＫ細胞（ラット腎細胞〕
に対するｍ胞接着活性を、天然のフィブロネクチンご比
較した。その結果、フィブロネクチンは０．１〜１　）
’ｆ／ウェルで活性がみられたのに対し、分子量１．１
５万のポリペプチドでは５０．ｓｆ／ウェルでも活性は
認めらｎ　ｆＡかった。 本発明の目的は、フィブロネクチンの細胞結ロドメイン
ペプチドとして、新たに細胞接着活性を有するアミノ酸
配列を明らか暑こし、その製造方法を提供することにあ
る。 〔課題を解決するための手段〕 本発明を概ＸＱＴれは、本発明の第１の発明はｍ胞ｗｓ
活性ポリペプチドに関する発明であって、下記一般式１
：

【遺伝子配列】

で表わされる配列ｌＴ−はそのＮ末からアミノ酸若しく
はペプチドが欠失した配列を示Ｔ〕で表わされるアミノ
酸配列で示されることを特徴とする。 また本発明の第２の発明は前記一般式１で表わされる細
胞接着活性ポリペプチドをコードＴるＤＮＡを含有せし
めた組換体１ラスミドに関し、また本発明の第３の発明
は前記組換体１ラスミドを導入せしめた形質転換体に蘭
Ｔ６゜史３こ本発明の第４の発明は前記形質転換体を培
養し、該培養物より前記一般式■で表わされる細胞接着
活性メリペ１チドを採取Ｔる細胞接着活性ポリペプチド
を製ａｙる方法に関する。 本発明者らは、細胞接着活性の強りペプチド１ＩｉＩＩ
こついて研究を進め、フィブロネクチンの細胞接置ドメ
インの５０４アミノ酸残基ペプチド（Ｇｌｙ　ｌｌｌ４
−Ｍ・ｔｌＵ？）及びそのＮ東側領域の一部を欠いた一
連のべ１チドを遺伝子工学的に調製し、それらの細胞接
着活性を調べた結果、天然のフィブロネクチンと同等の
細胞接着活性を有Ｔることを見出した。本発明は、これ
らの知見に基づいて達成された。 ｔ２、本明細書に２いて、アミノ酸に付された肩数字は
、ＩＭＢＬデータバンク（ＸＭＢＬ　ＤＡＴＡＥＡＮＫ
　）中のＰＭのｃＤＮＡ配列をｍ訳して得られるアミノ
酸配列の、ｙ＄からのアミノ酸残基数を示Ｔ。 以下、本発明を具体的に説明ＴるＯ ＦＨの５０４アミノ酸残基ペプチドをコードＴるａＤＮ
Ａ断片のクローニングは次の様にして達成される。まず
ヒト肝臓出来のざ１月ＡＪ”　ＲＮＡから１ライマー伸
長法−こよりＩＰＮの必要な領域のｃＤＮ＾を含むｃＤ
ＮＡライブラリーを作製Ｔることができる。ここで１ラ
イマーはＰＭ（１）　ＤＩム配列に相補的なりＮＡオリ
ゴマーを用い、ライブラリーの作製には例えばガブラー
・ホフマン（Ｇｕｂｌ畠ｒ−Ｈｏｆｆｍａｕ　）法が用
いられる。ライブラリーのスクリーニングにはＰＭのａ
ＤＮＡ断片例えばｐＬＦ　５〔バイオケミストリー（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）ｍ　２５巻、第４９３６〜
４９４１頁（１９８８）］を１０−プとＴるプラークハ
イブリダイゼーションを用いる。陽性のプラークから７
アージＤＮＡを調製して、目的のａＤＮＡ断片が含まれ
ることをｉＩ紹Ｔる。この。ＤＭＡ断片と既存のａＤＮ
Ａ断片（例えはｐＬＦ　５　）を組み合わせることによ
り、所望のアミノ酸配列をコードＴ　６０ＤＮＡ断片を
含むプラスミド例えはＰＨの細胞操者ドメインのＱ　１
ｙ　＋ｏ＋ａ　−Ｍｅ　ｔ＋ｓｔｙ　％　：２−ドＴる
ｏ　Ｉ）ＭＡ断片を含むプラスミドｐＴＦ　ｌ　１０１
を構築Ｔることができる。 次に、ＦＮの０１ｙ１１ｕｌ　　Ｍｅｔ　ＩＩＩ？をコ
ードＴ　６　ｐ’ｆ’Ｐ１１０１の開始コドンの少し上
流の一箇所を適当な制限酵素で切断した後、工牛ソヌク
レ了−ゼを作用させて、５’側の配列を除去Ｔることが
できる。反応条件を変えることにより、コード領域の５
１末端が適当薔こ除去された１ラスミドが得られる。こ
れらの１ラスミドのコード領域の終止コドンの少し下流
の一箇所を適当な制限酵素で切断し、断片化したＤＮＡ
をゲル電気泳動で精製Ｔることにより、５°末端が椙々
の部位まで除去されたｃＤＮＡ断片が得られる。これら
のａＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに接続することに
より、０１ｙ１０１１　　ＨｅｔＩＵＦ　（５Ｑ　４ア
ミノ＃！残基）のＮ末領域が除去された種々の鎖長のペ
プチドを発現させることができる。 発現ベクターとしては、既存の丁べてのベクターを使用
丁にとかできるか、本発明者らは、リボゾーム結合部位
と開始コドンの自船を最適化したｐＵｏ　、１％ベクタ
ーを用いる皿受発現で好結果を得ている。 更に、ｐＵＯ，１％ベクターの終止コドンの下流に転写
終結シグナルを附続丁にと化より、発現レベルを向上さ
せることか可能である。 細胞接着活性べ１チドか発現ざｎている組換体の選択は
、イムノスクリーニングによって行うのが好都合である
。Ｔ　ｆＡわち、鎖長の異なるａＮＤＡ＆片を接続した
発現ベクターを常法により大腸菌−こ導入し、得られた
形質転換体をニトロセルロースフィルター上で生育させ
、溶菌後、前体タンパク質をフィルター上番こ固定させ
る。 フィルターをウシ血清アルブミン等でブロッキングした
後、ＰＮの細胞Ｆ！Ｉ！着ドメイドメイン１１ｉＴるモ
ノクローナル抗体を作用させる。フィルターに結合した
モノクローナル抗体を、標識二次抗体で検出Ｔる。この
ようＩこして、細胞！２１！看ドメインペプチドを発現
している組換体を選択Ｔにとができる。 次１こ、選択ざｎた組換体を発現蕃こ適した条件下１こ
培養し、細胞Ｆ！Ｉ着ドメインペプチドの発現を誘導Ｔ
６）＠現の確ｕＩこは、イムノプロッティングの手法か
用いられる。丁なわち、培養菌体の全タンパク質を３Ｄ
ｉ９を含むバッファー中で加熱溶解し、　＋３１ｓ−ホ
゛リアクリルアミド電気泳ｍで分離し、＆ＩＩ＋パター
ンを、ニトロセルブースやナイロンメンプランに移し取
る。−メン１ラン１こＦＮの細胞ＭＩ雪ドメインに特異
的なモノクローナル抗体を作用させ、次いで酵素標！Ｉ
Ｉ＠二抗体を作、４１させて、結合した抗体の酵素活性
を、発色基質で発色させることにより、細胞接着、ドメ
インベ１チドのバンドを確認することができるＯ 吏に、得られたクローンについて挿入断片５′側の塩基
配列を解析することにより、発現しているペプチドのＮ
末端を同定下ることができる〇このよう番こして得られ
たクローンによって生産きれるペプチドのＮ末には大腸
菌の開始コドン由来のＭｅｉ　１３基２よびＮＯＯニリ
ンカー由来のＡｌａ残基が付加しているか、それによっ
てａ胞セ看活性か変化Ｔることはない。しＤ）シ、必要
夢こ応してこれらの付加配列を除去Ｔにとかできるｎ例
えば輩・ｔについては、ａｉ換体Ｉこ含まれるメチオニ
ンアミノペプチダーゼか作用し易い条件下Ｉこ組換体を
培ＩＩＴること４こより、あるいは部分ＹＲ製したペプ
チドＩこ、メチオニンアミノペプチダーゼ（ジャーナル
　オブ　バクテリオロジ−（ｉ　Ｂａａｔ＠ｒｉｏ１．
）　１８９．７５１゜１９８７）を作用させることによ
りＮ末端Ｍ・ｔを除去Ｔにとができる。また、Ｎｏｏニ
リンカー由来のＡｌｍは部位特異的変異の手法で除去丁
にとかできる。 組換体からの細胞従者ドメインペプチドの精製は、例え
ば次のようにＴる。菌体ペレットをバッファーに懸濁し
、超音波処理番こより可溶性画分と不溶性画分に分−け
る。後者は更に７Ｍ尿葉を含むバッファーで可溶化する
。可溶性画分を集めて、イムノプロッティングに用いた
抗体を結合させたセファロース４Ｂのカテム番こかけア
フイニテイ精製を行う。溶出にはｐＨ２，３付近のバッ
ファーを用いる。イムノプロッティングで目的−分を集
めることにより、細胞層着ドメインペプチドを得ること
ができる。必要とあれば、ＦＰＬＯ又はｕｐｒ、、ｏで
更に精製することができる。得らｎｒ＝細胞硬看ドメイ
ンペプチドは、ＮＨＫ細胞（正常ラット腎細胞）Ｉこ対
する細胞接着活性の測定に用いる。試料をバッファーに
溶かして、マイクロプレートＩＣ＠看させπ後、ＮＲＫ
細胞を添加し、３７℃で一定時間インキュベートする。 顕微鏡下で１ｌｆｆ胞の伸展を観察し、伸展活性を発現
Ｔるウェル当たりの最少量を天然のＦＷと比較すること
により、細胞贋者活性の強さを表わＴことができる。 以上の一連の実験８こより、前記一般式■で表わされる
ポリペプチドが、天然のフィブロネクチンと同等の細胞
ＦＩＰ着活性をｗＴることが明らかとなった。 〔＊施例〕 以下本発明を実施何番こより、更に具体的に説明Ｔるが
本発明はこれら実施例に限定されない。 実施例　１　組換体の製作 ＋ＩＩ　ＰＮ　Ｏ）　ｆｌｙ””　−Ｍｅｔ””（５０
４アミノ＃Ｉ残基〕をコードするプラスミドｐＴ’！！
　１１０１の作製〔第１図参照〕。 ｔ２、第１図は、フィブロネクチンのＧ１７１書１４−
Ｍ・ｔｊｌｔＦを含むポリペプチドをコードＴるＤＮＡ
配列を組込んだ発現１ラスミドの構築の工程を示す図で
ある。 （１−１）７ライマー伸長法によるａ　ＤｌｉＡ合属フ
ィブロネクチンＩＩＩＲＮｋ　ｌこ相補的な配列を有す
る１７塩基合成１ライＹ　−（５’ＧＴＯＴＯＯＯＡＯ
ＴＧＡＡＧＴＧＯ３’）をＤＨｋ合成機（Ａｌ１社、３
８０Ａ型）を用いて合成した。この合成プライマーを用
いてヒト肝臓由来ぎり（Ａ）”　ＲＮＡ　（クローンチ
ック社）から、ＱＤＮＡを合成した。 ｏＤＮＡ合成には、アマジャム社ｒ　ｏＤＮＡ　合ｔｃ
システム」に含まれる試薬を用いた。すなわち、５×フ
ア一ストストランド合成バッファー４μ１１ビロリン酸
ナトリウム溶液１μｌい　リボヌクレアーゼインビヒタ
−１μ／（２０ユニツト）、デオキシ三リン酸混液（１
０１！１Ｍ）２μ１１合成りＮＡプライマー１μ／（０
，１μ？）、〔α−”ｐ　）　ａａｒｐ　ｓμ０１及び
ポリ（Ａ）”ＲＮＡＩμ／（１μ？）を水冷下エツペシ
ドル７チュープに順次加え、静かに混和した。２０ユニ
ツト（１μりの逆転写酵紫と蒸留水を加えて全景を２０
μ！とし静かに混和した後、４２℃で５０分間インキエ
ペートした。これを水浴に戻し、セカンドストランド合
成用バッファー３７．５μｌｓ　〔ａ−ｓ”ｐ　）　（
ＩＯＴＰ　５０ａａｉ（５／ｌ／）、大腸菌りｌヌクレ
アーゼＨＯ０８ユニット（ｌμｌ）、大腸Ｍ　ＤＮＡポ
リメツーゼ１の２３ユニツト（３５μり及び水３３μｍ
ｔｅ＊次加え静かに混和した。 １２℃、６０分、次いで２２℃、６０分、更に７０°Ｃ
１１０分インキエペートし、水浴に戻し、２．０ユニツ
ト（０５μｌ）のＴ４Ｄ！ｉＡ〆リメラーゼを加えた。 静かに混和徒、３７℃１０分間インキエペートした。１
０μｌの０．２５　Ｍ　　ＫＤ’ｊ’Ａ（ｐＨ８，０）
及び１０ｐｌの１０％ＢＤＦＪ　ヲ加、ｔｒ反応を停止
させた。フェノール抽出を２回行った後、等触の４Ｍ酢
酸アンモニウムを加え、更に、２倍量の冷エタノールを
加えてドライアイス中に１５分保持後、室温に戻して、
１０分間遠心し上清を除いた。ペレットを５０μｌのＴ
Ｅに溶かし、もう−度エタノール沈殿を行い、更に沈殿
を２００μｌの冷エタノールで洗浄し、乾燥した後、少
量のＴＩに溶かした。 （１−２）　　ｃＤＮＡのχｇｔ１０７アージペク少−
への１９！続と、インビトロパッケー ジング 前項（１−１）で得られた（ＩＩ）ＮＡ、　０．５１４
１のＫｅｏＲＩリンカ−（ａ　（ＰＧＧＡＡＴＴＯＯ）
　）リガーゼバッファー及び２８ユニツトのＴ４ＤＮＡ
リガーゼを含む反応液１６．６ｚ＋／を１５°Ｃ−夜イ
ンキュベートシた後、７０℃、１０分の処理で反応を停
止させた。バッファーを］ＣａｏＲ工の至適条件にした
後、５０ユニツトの、ＷｏｏＲ工を加え、液量を１００
ａ／として３７“Ｃ，２時間インキュベートした後、７
０℃、１０分の処理で反応を止めた。 この全量をセファデックスＧ−５０のカラム（ｌ　ａｔ
　）にかけてｆ９’ｆ’ｌｃバッファー（１００ｍＭＮ
ａｐ／　　１　０　　ｍＭ　　）　　リ　ス　ＨＣＪＩ
　　、　　　ｌ　　ｍＭ　　ＫＤτＡ％　　ｐＨ８，０
）で溶出し、遊離のリンカ−を除去した後、ｏＤＮＡ７
ラクシヨンを、ｌ　Ｑ　ｍＭ　）リスＨＯ／　（１）１
（８，０）、Ｑ、　ｌ　ｍＭ　　ＥＤＴＡに対して透析
し、凍結乾燥した。 これに３３３　ｍＭ　　Ｎ＆０１　、１０　ｍＭ　　Ｍ
ｇＯ１ｓを加えて４．５　μｌとし、χｇｔ　１０　／
　ＶａｏＲエアーム（アマジャム社）０５μ！　（０，
２５μ？）を加え、更に、５μｌのＤＮＡライゲージ冒
ンキンキット酒Ｔｒ）　Ｂ！を加え、２６℃、１０分イ
ンキュベー）Ｌ、、７０℃、１０分で反応を停止した。 これを、インビトロパッケージング反応に供した。 すなわち、反応液４μｌを、２Ｎのパッケージングエキ
ストラクト（ストラテジーン社）と静がに混和し、２２
℃、２時間インキュベートして７ア一ジ粒子を形成させ
、５００μｌの３Ｍバッファー（１００ｍＭ　　Ｎ＆Ｏ
／　、　８　ｍＭ　　Ｍｇ５Ｏｎ、５０ｍＭ　　）リス
ＨＣｊｌ　、　ｐＨ７，５，０，０１％ゼラチン）及び
２０μｌのクロロホルムを加え、４°Ｃに保存した。 （１−３）　　プラークハイブリダイゼーション ７アージ液の１００μｌをあらかじめＬ−ブロス＋０４
％マルトースのＭ地で一夜培養した大ｌｌＩ！菌ＮＭ５
１４の２００μｌに加え、３７°Ｃ１１５分インキエベ
ートし、４２℃に加温した４ｖのＬ−軟寒天培地（Ｌ−
ブロス＋０８％寒天）に加え、あらかじめ調製した２０
肩ｔのｒａ−ｇ天プレート上に重層した。３７℃で一夜
インキユベートシて得られたプレート上にナイマンフィ
ルター（アマジャム社、ハイボンドＮ）を３０秒接触さ
せた後、変性溶液（０，５Ｍ　　ＮａＯ）１，１．５Ｍ
　　Ｎｅｏ／）で妨和した厚手のＰ紙上に５分間置き、
史に中和溶液（０，５Ｍ）リスＭＯ／、　ｐＨ７，０，
１、５Ｍ　ＩＪａｏｔ　）で飽和し７′：沖紙上に５分
間静電した。　次善こ、　　２　　Ｘ　　ＳＳＯ（０，
３Ｍ　　Ｎａ０ｊ−３０ｍＭ　　クエン酸ナトリウム、
ｐＨ７，（＋　）でフィルターを洗浄し風乾した後、３
００　ｎｍのＴＪＶ湘射（５分間）により内定し、レプ
リカフィルタートシた。−方、ハイブリダイゼーション
Ｃご用いるプローブを調製した。Ｔなわち、プラスミド
ｐＬＦ　５の４戸？を、１２ユニツトのｐＹｕ　１１　
％次いで１５ユニツトの１ｏｏＲＩで分解し、アガロー
ス電気泳動で０、４３　ｋｂの剛片１０　Ｑ　ｎｆを回
収した。これを、アマジャム社「マルチプライムＤＮＡ
ラベリングシステム」を虫いて　Ｐでラベルした。方法
は添付のグロトコール屹従った。得られに標識１０−プ
は、ａ　ｏ　ｐｔで５．５Ｘ１０’ｄｐｍ　”ｔあった
。 前述のレプリカフィルターを、ｅｘｓｓａ、ｓｘデンハ
ルト（Ｄｅｎｈａｒｌｔ　）　（ＢＳＡ　ｓポリビニル
ピロリドン、フィコール各０．１％）、０５％ＳＤＳ。 ８０声ｔ／−サケ精子ＤＮＡを含む１５−の溶液中で６
５℃、４時間インキュベートシ、プレハイブリダイゼー
ションを行った。次ｉこ熱変性処理し７′：標識１０−
プ（２，７５Ｘ　１０’ｄｐｍ　）を加え、同条件で一
夜ハイプリダイゼーシｌンを行った。 ７　イルｓ　−％　２　Ｘ　ｓｓｏ、Ｏ１％ＳＤ８　（
７）洗液で６５℃、１５分のインキュベートを２１！１
１１１．次いで０２ＸＳＳ０，０．１％ＳＤＳの洗浄で
６５℃、１５分のインキュベートを２［ｉ１！Ｉ行った
後２　Ｘ　ＳＳＯで軽（リンスし、オートラジオグラフ
ィーを行った。 その結果、４Ｘ１（１’のプラーク中番こ２５０のポジ
ティブシグナルか認めらｎ７：〇 （１−４）　　ファージＤＮＡのｌａ■と押入断片の分
析 ポジティブシグナルを与えに７フージクローン’ｆ−１
ｍｅのＳＭバッファーζこ懸濁し、その２５０μｔを、
あらρ）じめ−梗培養した大腸＠ＮＭ５１４の０．５　
ｍｌ　＋こ加え、３７℃、１５分インキュベートして、
７アージを吸看させ、ｌ　ＯｍＭ　Ｍｇ０１ｇを−含む
Ｌ−ブロス５ｄを加え、３７℃、４．５時間抛とう培養
した。５０声ｔのクロロホルムを加え、更ＳこｌＯ分伽
とうしｒ−後、遠心分離によつ上清（７アージ溶閑Ｒ）
を得＝。浴菌液婆こ２０１２のＤＮａｓｅ工、１０１Ｌ
Ｉｆの１Ｎａａｅ　Ａを加え、３７℃、３０分インキュ
ベートした。１ｊ！−こ０．２９ｆのＮａＯ４，０，５
５ｆのＰ［Ｇ　６０００を加えて、水中で２時間インキ
ュベートした。遠心でベレットを回収し、４００声ｔの
Ｔ］Ｃ１こ懸濁した。フェノール抽出を２１ｇＩ、フェ
ノール／クロロホルム抽出を１回、クロロホルム抽出８
１回行った後、エタノール沈殿により、７アージＤＮＡ
　ｊ）回収した。これを２０．ＩＩｔのＴＩＣｌζｆｔ
ｇかし、２０ユニツトのＨａｏＲ工を含む３０声ｔの反
応液中で３７℃、２時間インキュベートし、アガロース
電気泳動ＩＣより、挿入断片の分析を行った。その結果
、２４クローン中、１クローン１こ１．１　ｋｋ＋の挿
入断片が認めらｎ７：。この１．１ｋｂ断片をプラスミ
ドｐ１１１８にサブクローニングし、得られπ組換体プ
ラスミドをｐ（７ＦＮ　７４と命名した。こｎを用いて
挿入断片の塩基配列をグイデオキシ法で決定したところ
、この断片はフィブロネクチン、ＤＮＡ　Ｃジ　エムボ
　ジャーナル、第４巻、第１７５５〜１７５９頁（１９
８５））ノ２９９０番目のＧから４１０５査目のＡまで
を含むことが判明した。但し、３０１８番目のｏ、３０
６３査目の０．３２１６査目の０はそれぞｎＡ、Ａ。 Ｔに置換していたが、アミノ酸コードに開化はなかった
。 （］　−５）　　ｐＵ？Ｎ　７４のＥａｏＯ１０９−Ｂ
ａｍＨ１断片の調製 ４０／’ｆのｐυＩＦＮ　７４に対し、２００ユニツト
のｍｏｏｏ　１０９を加え、４００メＬの反応液中、３
７℃、２時間インキュベートした。エタノート　リ　ス
　Ｈｏｔ　　、　　ｐＨ７，５、ｌ　　ｍＭ　　Ｉ＋Ｄ
’ｌ’Ａ　　、　　　２　０　　ｍｉｉＭａＯＡ　、　
　７　　ｍＭ　Ｍｇ０Ｌｘ　、　２０　声Ｍ　　ａＡテ
Ｐ　％　ａＧＴ１’　。 ｄＯＴＰ、　ｄＴＴＰ及び２ユニツトのフレノウ酵素を
含む２００声ｔの反応液中、室温１２０分インキュベー
トした。６５℃、１０分で反応を止め、反応液をライゲ
ーションバッファーの組成とし、２、５　ｎｍｏｌｅの
ＥＯｏＲＩリンカ−（（Ｌ（１）Ｃ！０ＧＡＡでＴＯＧ
Ｇ］　）及び２．８ユニツトのＴ　４　ＤＮＡリガーゼ
を加え、１３℃、−夜インキユヘートした。加熱により
反応を止め、６０ユニツトのＢａｍ）１１．５０ユニツ
トのＩＣｏｏＲ工を含む４００　ｆｉｔの反応液中、３
７℃、２時間インキユヘートシた。アガロース電気泳動
疹こよりｌ、　Ｑ　ｋｂの断片０．２７Ｖを得た。 （１−６）　　　ｐＴ？３０１のＢ＆！ＩＩＨＩ　−Ｈ
１ａ４　ｊ断片の調製 ５０１１のＩＩＴＩＦ　３０１　（特願昭６３−１４８
号記載のよう番こして構築した１ラスミド〕に２００ユ
ニツトのＩｏ　ｏＲエメチラーゼを加＜、２ｏｏｐｔの
反応液とし、３７℃、１時間インキュベートした。６５
℃、２０分の処理後、６０ユニツトのＢａｍＨ！　、　
６０ユニツトの１ｆｉｎｄ　ｌを含む４００声りの反応
液とし、３７℃、２時間インキュベートした。アガロー
ス電気泳動によりＱ、　５　ｋｂの断片０．１７Ｉｆを
得た０ （１７）　　ＧｌｙＩＯ”　−Ｍａｔ”Ｉｔ（５０４７
！／酸残基）をコードｊ　６ｏＤ）ＩＡ断片の構築とり
四−ニング （１−５）で得７’：　１．　Ｏｋｂ断片０．２７Ｆ、
（１−６）で得ｙ＝　ｏ、　５　ｋｂ断片０．１　ｆｉ
ｔを１ｏｏ声ｔのライゲーションバッファー中、２．８
ユニツトのＴ　４　ＤＮＡリガーゼを加え％１８℃、−
梗イン中ユベートし、７０℃、１０分の処理で反応を止
めた。反応液をＨｌｎｌ　ｌ用バッファーとし、１２ユ
ニツトのＨ１ｎｄ厘を含む１００メｔの反応液を３７℃
、２時間インキュベートした。更に、バッファーを］Ｃ
ａｏＲＩ用の組成とし、ｌＯユニツシのＥｏ　ｏＲ工を
加えて、３７℃、２時間インキエペートシ、加熱により
反応を止めた。この反応液２０声ｔをあらかじめπｏａ
ＲニーＨ１ｎ＋１厘処理して脱リン酸したプラスミドル
工Ｍ　ｌ　−ａｍｐＡｌの０．１６戸Ｖを２８ユニツト
のＴ　４１）Ｈ＆リガーゼを含む３０声ｔの反応液中、
１６℃、−夜インキユペートし質転換した０得られた形
質転換体の１２クリーンにつき挿入断片を黄べたところ
、５り田−ンに１．５　ｋｂの断片か認められた。その
塩基配列をダイデオキシ法で決定し、フイプ胃ネクチン
の（）１．７１１ｘ４２））らＭｅｔ””　ｆ　：１−
）−Ｔ　６　（ＩＤＮＡ　’に含む７’Ｆスミドを得た
。このプラスミドをｐ’ｒｙ　１１０１と命名し、この
１ラス之ドを保持Ｔる大腸菌ＪＭ１０９をＩ＊ａｈ＊ｒ
ｉａｈｉａ　ｏｏｌｉ　ＪＭ　ｌ　０９　／　ｐτＦＩ
ＩＯＩと表示して、工業技術院微生物工業研究所に寄託
している〔微工研条＊第２１５６号（ＩＦｍＲＭＢＰ　
−２１５６）　］。 （］２　ＤＮＡ断片の調製 細胞受着性ポリペプチド５０４アミノ酸残基をコードす
る前述プラスミドｐＴＦ　１１０１の４０ｆｉｆを制限
酵素Ｘｂａ　Ｉ用緩衝液及び２４ユニツトのＸｂａ　ｌ
を含む１０２，４ｔの反応液中３７℃で２時間インキュ
ベートした後、６５℃、５分インキュベートＴること番
こより反応を停止し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回
収した。この−量をＥＡＬ　３１ヌクレアーゼＳ用緩ｌ
ｌ１Ｒ及び１２−ＬニットαＢＡＴＪ３１ヌクレアーゼ
Ｓを含む反応液１１６声ｊ中、３０℃でインキユベート
し、２分後から８分後まで２分ごとに２３ｐｔずつ分取
し、フェノール処理を行い反応を停止１エタノール沈殿
によりＤＮＡを回収した。これら回収されたＤ１ｉ＆を
それぞれ一量ずつ用いて、クレノウ酵素用霞衝液及び０
．４ユニツトのフレノウ酵素を含む４０声ｔの反応液中
、３７℃で２０分インキュベートした。６５℃で５分イ
ンキュベートする１こリン酸化ＮｏｏＩリンカ−（ｄ　
ＣＡＧＣＯＡ？ＧＧＯＴ］　）１岬を含む溶液ｌＯ／Ｉ
Ｉｔを加え、史１こ、８０ｚｔのＤＮＡライゲーション
キット〔宝酒造（株〕販売〕人液、２０メｔのＢ液を加
え、１６℃で３０分インキュベートした。反応液１０ｐ
Ｌを用いて、大ｙ４菌、ＴＭ１０９を形質転換した。得
らｎた形質転換体を５０声ｆ／−のアンピシリンを含む
５　ｍｅのＬ培地で３７℃−夜振とう培養した後、培養
液１．５−より集菌し、プラスミドＤＮＡの帽り精製を
行つπ。得られｌ”：　ＤＮＡは、それぞれ、１００声
ｔのＴ］Ｃ溶液に溶かし、ＢＡＩＩ　３１ヌクレア一ゼ
処理時間ごとにまとめた。これらのＤＮＡ浴液をそｎぞ
れ１００声を用い、１００　ｍＭ　）リスＨＯ６，ｐＨ
７，５，７ｍＭ　ＭｇＯ１ｔ　１５０　ｍＭ　ＩＪａｏ
ｌ。 ７　ｍＭメルカプトエタノール、１２ユニツトのＨｌｎ
ｄｌ、１２ユニツトのＮＱＯ工を含む１２６ｆｉｔの反
応液中、３７℃で２時間インキュベートし７：後、ｌ　
Ｏｐｆ／ｐＬのＲＮａｓｅ　Ａの溶液をｘｐｔ加え、３
７℃で３０分インキユベートシニ。こｎ％７Ｎａ−Ｘ’
に気泳動にかけ、０．９　ｋｂｐ　〜ｌ、　５ｋｂｐ　
ｌこ相当する断片を切り出し、フェノール処理、エタノ
ール沈殿により断片を回収し、５０ｐｔのＴＥ浴液６ζ
溶刀）　Ｌ　ＤＮＡ断片溶液とした。 ＋３１１ＪＯ１１９Ｎへのクローニングｔｌ＋で得らｆ
ｉ　７’：　ＤＮＡ断片溶液５声ｔＩこあらかじめＮｏ
ｏ工及びＨ１ｎｃＬ厘で処理して脱リン酸しｙ：１ラス
ミドｐｔｒａ　１１９　Ｎ　Ｏ，２声？を含む溶液５声
ｔを加工、更に４０声ｔのＤＮＡライゲーションキット
Ａ液、ｌＯＯ２０Ｂ液を加え、１６℃で３０分インキュ
ベートした。反応液１０ｆｉｔを用いて大腸菌ＪＭＩＯ
９を形質転換した。 な２、ｐｔｙｏ　ｌ　ｌ　９　Ｎ　ｉ！、市販のｐｖｏ
　１１９ベクター〔宝酒造（株）販売〕の翻訳開始コド
ン部位ｊｃＮａｏＩサイトを導入し、更にリポソーム結
合部位と開始コドンの距離を８塩基しπものである。 （４］発現プラスミドのスクリーニング上記（２］で得
られた形質転換体を５０　ｐｆ／ｄのアンピシリンを含
む一寒天培地上のニトロ七ルａ−ｘフイｙｖター（Ｂｉ
１２、Ｓ　＆　Ｂ　［）　Ｂ：移し、３７℃で５時間培
養後、このニトロセルロースフィルターを５０声２／−
のアンピシリン及び１ｍＭの工ＰＴＧ　（インプロピル
−β−チオカラクトシド）を含むＬ寒天培地に移し、３
７℃で一夜培養シた。生育したコロニーをクロロホルム
蒸気中に１５分間接触させた後ニトロセルロースフィル
ターを５０１１ＩＭトリスＨ’ｔＳｐＨ７，５，１５０
ｍＭ　Ｎａ０ｔｓ　５　ｍＭ　ＭｇＣｊＬｇ、３％ウシ
血清アルブミン、８０ユニツト／　ｍｌ　ＤＮａｓｅ　
Ｉ　ｓ　４０　声ｔ／ｍｅリゾチームを含む溶液中、室
温で３時間インキュベートした。フィルターにＰＮの細
胞蚕看ドメインを特異的ＩＣ認識Ｔる抗ＰＨモノクロナ
ール抗体ＩＰＮ−１０Ｃ宝酒造（株）販売〕、次いでパ
ーオキシダーゼ標識第２抗体を作用させ、過酸化水素と
４−クロロナフトールの存在下で発色させること番こよ
り、発現している形質転換体を選別した〇 この−次スクリーニングに２いて、５５６クローンより
４５クローンを選び、それぞれを５０７ｔ／ｄのアンピ
シリンを含む５−のＬ培地中、３７℃で５時間培養し、
１００１１１Ｍ工ＰＴＧをｌ　ｍＭとなるよう加え、更
に３７℃で一夜培養した。 得られた菌体の全タンパク質を５ＤＳ−ポリアクリルア
ミトゲ／Ｉ／１１Ｅ気泳動（３Ｄ８−　ＰＡＧＩＣ）で
分離し、イムノプロッティングを行い、抗７Ｎモノクロ
ナール抗ＦＮ−１０と反応する４　５　Ｋ　Ｄａ〜５３
Ｋ　Ｄａのポリペプチドが生産されていることを確絹し
た。 こわらのうち、５クローンについて挿入断片の塩基配列
を決定したところ、第１表に示さｎる結果を得た。こ几
らのうち、１ＰＨの０１，１６１４　＋＋Ｍｅｔ””　
（５０４アミノ酸残基〕をコードＴる１ラスミドをｐＴ
ＦＢ２００と命名し、これを保持する大腸菌ハ１０９を
Ｅｓｃｈｅｒｉｏｈｉ＆ａｏｌｉ　ＪＭ　１０９／　ｐ
ＴＦＢ２００と表示して、工業技術院微生物工業研究所
に膏託している（微工研条寄＠２１２５号（ｐｇｐｕＢ
ｐ−２１２５））ｏ！ｒ、ＩＦＮのＡ　ｌ　＆　１１３
８−Ｍ・ｔｌＵ＋　（３３５アミノ酸残基〕をコードＴ
る１ラスミドをｐＴＰＢ８００と命名し、これを保持す
る大腸菌ＪＭ　１０９　ｙＥ：ｌ５ｏｈ＠ｒｉａｈｉａ
　ｏｏｌｉ　５Ｍ１０９／　ｐＴＰＢ　８００と表示し
て同じく寄託している（微工研条寄第２１２６号（ｙｙ
ｒＲｙ　ＢＰ　−２１２６））。 ｗＪ１表 クローンＡ　コード領域（アミノ醒残基数〕８００１　
　　　ＴｙｒＩＯ”−Ｍ＠ｔ””　（４９８）００３　
　　　Ｇｌｙ’・”−ＩＪ＠ｔ’・”（５０４ン０２３
Ｇ１ｙＩＩＭ−ＭｅｔＩｉＩＦ（４７８）０３３　　　
　Ａｌａ””　−Ｍ＠ｔ　””　（３８５）０４０　　
　　Ｐｒｏ’・”　−Ｍ＠ｔ　””　（４２８）実施例
　２　組換体からのペプチドの精製ＩＦＮのＡ１，１＋
３６　　ｙｅｔｌｊｌｆ　（３１３５アミノ酸残基）を
コードＴろＤＮＡを発現ベクターに接続して得られたプ
ラスミドＰＴ？Ｂ８０　Ｑを導入し７Ｊｓａｈｓｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ　、ＴＭ　１０９／　ｐＴＰＢ　８００
を、５０声ｔ／ｌｄのアンピシリンを含む５−のＬ培地
中、３７℃で一夜振とう培養した。これを２５０　ｍｅ
の同培地を含む５００Ｗｔの振とう７うＸ：１ｌＩＣ！
１１種し、１２０ｒｐｍで振とう培養した。８６０ｎｍ
の吸光ｙか、０．２の時点で１１００１ＩＩ工ＰＴＧを
１ｍＭとするよう培養液に加え、２０時間後に集菌し１
こ。全菌体ペレットを５０　ｍＭ　）リス”ｔ１ｐ！４
７．５．１１１１ＭＫＤＴＡを含む溶液に懸濁して超音
波処理を行った。 この処理液を遠心分離にρ）け、上清採取した。 この超音波処理上清の一部を用いてイムノプロッティン
グを行った。丁ｔわち、超音波処理上清タンパク質を１
９１１３−ＰＡＧＩＣで分離し、泳動パターンをニトロ
セルロースメンプラン番こ転写した後、１ｐＭの細胞接
着ドメインを特異的に認ｔｌｉＴるそノクロナール抗体
（７Ｎ−１０，宝酒造（株）販売〕を作用させ、次いで
パーオキシダーゼ標ｍ第２抗体を作用させ７：。結合し
た第２抗体のパーオキシダーゼ活性を過酸化水素と４−
クロロナフトールの存在下で発色させ、４５ＫＤａ付近
番こ目的のバンドを確認した。次に全上清を５０ｍＭ　
）リスＭＯＬ　、　ｐ）ｉ　７．５を含むａ衛液平衡化
し７：　ＤＥＡＤ！　−）　！パー＃６５０ｓのカラム
（２５ｍｅ）に通し７：Ｉ、カラムを１ＯＯＷＩｌの５
０ｍＭ）すＸ　［０／。 ＰＨ７，５を含む緩衝液で洗浄した後、５０−の５０ｍ
Ｍ　）リスＨａｔ　、　ＰＨ７，５，１００ｍＭ　Ｎａ
０ｔを含む緩衝液でｆ＃離、次いで５０−の５０１！Ｉ
ＭトリスＨｏｔ％ｐＨ７，５，２００ｍＭ　ＮａＯ４を
含む緩衝液で溶離、分画した。イムノプロッティング１
こより目的画分を集め７’：　（ＤＫＡＫ粗精製固分）
。ＤＩｉｔＡ］Ｉｌ粗精製画分をモノクロナール抗体ア
Ｎ−１０を結合させた七７ア四−ス４Ｂのカラム（１０
ｍ）に通した。カラムを５０−の２０ｍＭ）リスＨｏ１
ｓｐＨ８，０１１００ｍＭ　ＮａＯ２を含む緩衝液でｇ
浄し、次いで２０ｍＭ酢酸アンモニウムｆ８液で洗浄し
た後、４０ｍＭ酢酸で溶出し分画した。イムノプロッテ
ィング８こより目的画分を集め、電気泳動的にほぼ単一
なペプチド約７ｑを得た。、ＡＢＩ社のペプチドシーケ
ンサ−４７７Ａ／１２０Ａを用いて、本ペプチドのアミ
ノ酸配列を調べたところ、Ａｌａ　−Ａｌａ　−Ｐｒｏ
−工ｉｓ　−Ｖａｌ　−Ａｓ＋ａ　−Ｌｙｇの配列が認
められ、ＮＱＯニリン刀−由来のＡｌａをＮ末端にｌ残
基含む目的のペプチドのに末端付近の配列と一致した。 同様にして、第１表−で示される？ＮのＧｌｙ　１６４
・−ｎ＠ｔ””　（４７Ｂアミ／＠残基）、ｚよびＰｒ
ｏ”―・Ｍ＠ｔ””　（４２８７ｉ　／　ｗ１残基）ヲ
コードＴ６プラスミドを含む組換体をそれぞれ培養して
、抗体カラムで精製した。それらのＮ末端領域のアミノ
酸配列分析の結果から、予想通りのペプチドが得られた
ことを確認した。 一方、７ＮのＧ１７’・１４　＋＋　Ｍ・ｌ１ｌｌｆ　
（５Ｑ　４アミノ酸残基）をフードするプラスミドを保
持Ｔる組換体（］Ｃ自ｏｈ＠ｒｉｏｈｉａ　ａｏｌｉ　
ＪＭ　１０９　／　ｐＴＩＰＥ　２００　）どよびＴｙ
ｒ’・ａｍ　　ｙｅｔｌＭｌｆ　（４９３アミノ酸残基
）をコードＴるプラスミドを保持Ｔる組換体をそれぞれ
培養し、抗体カラムで精製して得らｎたペプチドはアミ
ノ酸配列分析の結果から、いすｒＬモＦＮ（７）Ａｉｍ
”’　−Ｍｅｔ”Ｉ？（４８ｌ　７　ｔ　／醗残基）に
相当Ｔるペプチドであることが判明した。この結果は再
現性があり、生産されたペプチドが大腸菌内でプロセシ
ングをうけて安定なぺプチドとしてＡｌ＆”’　−Ｍｅ
ｔｌ１１’　（４８１アミノ酸残基）が得らｎると考え
られる。 ｆｌ　２．１ＰＮＯ）　Ｇ１７”！４−　Ｍｅｔ””　
（５０４アミノ酸残基）をコードするプラスミドｐＴＦ
　１１０１を保持する組換体力）らは目的の５０４アミ
ノ酸残基ペプチドのＮ末端にベクター由来のＡｈａ　−
Ａｓｎ−３ａｒ配列とシグナＡ／配列が付加したペプチ
ドが得られ１こ。 実施例　３１１１胞接看活性の測定 餅化実施例２で得られた各ポリペプチド、及びＦＮの細
胞接着活性をルオスラーテイ（Ｒｕｏｌｌｌａｈｔｉ）
らの方法〔メンツズ　イン　エンザイモロジ−（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　ｌｃｎｚｙｍｏｌｏｚｙ　）　ａ　８
２巻、第８０３〜８３１頁（１９８１）］に準じて測定
した。 試料を生理食塩水又は蒸留水に溶かして段階的薔こ稀釈
し、その５０声ｔを９６穴マイクロプレートに分注し、
４℃、−夜インキユペートして、試料をプレート婆こ吸
！ＩＩさせた。次薔こ、ＰＢＳ　（リン酸緩衝化生坤食
地水）でプレートを２回洗浄し、３％ＢＳＡを１００／
Ｉｔ加え、３７℃、１時間インキュベートして、プレー
トをブロックした。ｐＢＳで２同プレートを洗浄し７：
後、あらかじめイーグルの最小培地（ＭＫＭ　）に１０
＠細胞／ｌＲ１となるようｆこ懸：／Ｑさせたラット腎
細胞（ＮＨＫ　−４９Ｆ）を１００ｆｉｔ／ウエルの割
合で分注し、３７℃で２〜３時間時間インイエベート。 な２、使用しｆ：＝ＮＲＫ　−４９’！ｌａ胞は、凍結
保存した株を＃培養した後、トリプシン処理したものを
用い１こ。 顕微に下で細胞の伸展を観察し、細胞接着活性番こ必要
な最少型を決定した。その結果８第２表番こボＴ。 Ａｌ＆ｌｌｕ　＋Ｍ＠　ｔｊｉｌｔ ｐ　ｒ　ｏ　ｌ　＠　誇Ｍ　ｅ　ｔｌ　Ａ　Ｉ　ＹＧｌ
ｙ　ｌ　＠　４＠　　Ｍ　＠　ｔｌｍ　ｌ　’Ａ１．Ｉ
ＮＦｌ、ｔ１１１１ Ｇ１．＋ＯＩａ　−Ｍ＠ｔｌｓｌＦ （３８５）　　　　０．０８ （４２８）　　　　０．０５ （４７８）　　　　０．０５ （４８１）　　　　０．０３ （５０４）　　　　０．０３ 〔発明の効果〕 以上詳細に説明したように、本発明により、フィブロ車
りチンと同等の細胞接着活性を宥Ｔ６ポリペ１チド２よ
びその遺伝子工学的朧遣方法が提供さｎた。上記ポリペ
プチドは、創傷治癒、点眼薬、ガン転移防止、人工臓器
の人体への定を創等の医薬品として、また化粧品、歯磨
等１こ使用される。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のプラスミド構築の工程図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記一般式 I ： 【遺伝子配列があります】・・・・・・［ I ］〔式中
   Ｘは、Ｈまたは下記式： 【遺伝子配列があります】 で表わされる配列または、そのＮ末からアミノ酸若しく
   はペプチドが欠失した配列を示す〕で表わされるアミノ
   酸配列で示されることを特徴とする細胞接着活性ポリペ
   プチド。 ２、請求項１記載の細胞接着活性ポリペプチドをコード
   するＤＮＡを含有せしめた組換体プラスミド。 ３、請求項２記載の組換体プラスミドを導入せしめた形
   質転換体。 ４、請求項３記載の形質転換体を培養し、該培養物より
   請求項１記載の細胞接着活性ポリペプチドを採取するこ
   とを特徴とする細胞接着活性ポリペプチドの製造方法。