JP2864152B2 - 機能性ポリペプチド - Google Patents
機能性ポリペプチドInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規ポリペプチドに関し、更に詳しくは、
ヒトフィブロネクチンの細胞接着ドメインポリペプチ
ド、及びヒトビトロネクチン、又はヒトコラーゲンXI型
のインスリン結合活性部位ポリペプチドを含有する、新
規な人工の機能性ポリペプチドに関する。
ヒトフィブロネクチンの細胞接着ドメインポリペプチ
ド、及びヒトビトロネクチン、又はヒトコラーゲンXI型
のインスリン結合活性部位ポリペプチドを含有する、新
規な人工の機能性ポリペプチドに関する。
フィブロネクチン（以下、FNと表示する）は血漿や細
胞外マトリックスに存在する糖タンパク質で、多彩な機
能を持つことが知られている〔アニュアル レビュー
オブ バイオケミストリー（Annual Review of Biochem
istry）、第57巻、第375〜413頁（1988）〕。天然のFN
を創傷治癒、点眼薬等の医薬品や化粧品に利用する試み
がなされているが、血液から採取するために供給に制限
があること、コスト高であること、また、病原性の細菌
やウイルス等による汚染の可能性があるなどの理由によ
り、実用化されていない。また、天然のFNの機能ドメイ
ンを取出して利用することも同様の理由から実用化され
ていない。
胞外マトリックスに存在する糖タンパク質で、多彩な機
能を持つことが知られている〔アニュアル レビュー
オブ バイオケミストリー（Annual Review of Biochem
istry）、第57巻、第375〜413頁（1988）〕。天然のFN
を創傷治癒、点眼薬等の医薬品や化粧品に利用する試み
がなされているが、血液から採取するために供給に制限
があること、コスト高であること、また、病原性の細菌
やウイルス等による汚染の可能性があるなどの理由によ
り、実用化されていない。また、天然のFNの機能ドメイ
ンを取出して利用することも同様の理由から実用化され
ていない。
そこで本発明者らは、ヒトFNの細胞接着ドメインをコ
ードするcDNA断片を発現ベクターに接続して大腸菌に導
入することにより、細胞接着活性ポリペプチド及びその
製造方法を開発し、特許出願した（特開昭１−206998
号）。
ードするcDNA断片を発現ベクターに接続して大腸菌に導
入することにより、細胞接着活性ポリペプチド及びその
製造方法を開発し、特許出願した（特開昭１−206998
号）。
一方、ビトロネクチン（以下、VNと表示する）は血中
に多量に存在するタンパク質であり、コラーゲンXI型
（以下、ColXIと表示する）は軟骨に多く存在する細胞
間マトリックスである。
に多量に存在するタンパク質であり、コラーゲンXI型
（以下、ColXIと表示する）は軟骨に多く存在する細胞
間マトリックスである。
VNは、化学と生物、第24巻、第312頁（1986）に記載
されているように多様な生物機能を有し、例えばがんの
転移防止剤や、細胞の無血清培地用基材等の用途が期待
され、コラーゲンも人工皮膚や止血剤等の医用材料とし
て近年、注目されてきている。
されているように多様な生物機能を有し、例えばがんの
転移防止剤や、細胞の無血清培地用基材等の用途が期待
され、コラーゲンも人工皮膚や止血剤等の医用材料とし
て近年、注目されてきている。
VNやコラーゲンの新しい生理機能として、本発明者ら
は先に、VNやコラーゲンがインスリン結合活性を有する
ことを見出し、特許出願をした（特開平１−85934号、
特開平１−86000号、特願昭63−273139号）。
は先に、VNやコラーゲンがインスリン結合活性を有する
ことを見出し、特許出願をした（特開平１−85934号、
特開平１−86000号、特願昭63−273139号）。
VNやコラーゲンはそれぞれインスリン結合担体として
有用であるが、これに細胞接着活性を合せ持たせれば、
各種細胞への親和性を更に高めることができ、細胞接着
活性を合せ持つインスリン結合担体は、成長因子活性、
及びホルモン活性を有するインスリンのホメオスタシス
を調節することが可能であり、糖尿病患者に代表される
種々の疾患々者にインスリンを投与する時、インスリン
の作用部位へのターゲッティングに優れた、持続時間の
長い、安全で、免疫原性のない医薬品を作ることがで
き、インスリンの効果を最大限に発揮させ、かつ、副作
用のない新しい製剤及びドラグデリバリーシステムを構
築することが可能となる。例えば、生化学的研究に有効
な増殖促進試薬が提供され、表皮細胞の増殖を高め、皮
膚の老化を防ぐ有用な化粧品が提供され、更に外傷や外
科手術後の創傷治癒を促進する経皮薬及び治療薬が提供
され、糖尿病の治療に用いる持続性の高い、副作用のな
いインスリン製剤が提供される。
有用であるが、これに細胞接着活性を合せ持たせれば、
各種細胞への親和性を更に高めることができ、細胞接着
活性を合せ持つインスリン結合担体は、成長因子活性、
及びホルモン活性を有するインスリンのホメオスタシス
を調節することが可能であり、糖尿病患者に代表される
種々の疾患々者にインスリンを投与する時、インスリン
の作用部位へのターゲッティングに優れた、持続時間の
長い、安全で、免疫原性のない医薬品を作ることがで
き、インスリンの効果を最大限に発揮させ、かつ、副作
用のない新しい製剤及びドラグデリバリーシステムを構
築することが可能となる。例えば、生化学的研究に有効
な増殖促進試薬が提供され、表皮細胞の増殖を高め、皮
膚の老化を防ぐ有用な化粧品が提供され、更に外傷や外
科手術後の創傷治癒を促進する経皮薬及び治療薬が提供
され、糖尿病の治療に用いる持続性の高い、副作用のな
いインスリン製剤が提供される。
すなわち本発明の目的は、細胞接着活性と、インスリ
ン結合活性とを持つ、新規な人工機能性ポリペプチド、
及びその製造方法を提供することにある。
ン結合活性とを持つ、新規な人工機能性ポリペプチド、
及びその製造方法を提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は人工の機
能性ポリペプチドに関する発明であって、ヒトFNの細胞
接着ドメインポリペプチドと、下記式〔IV〕で表される
配列を少なくとも含むヒトVNのインスリン結合活性部位
ポリペプチド若しくは下記式〔Ｖ〕で表される配列を少
なくとも含むヒトColXIインスリン結合活性部位ポリペ
プチドが、直接又は間接に結合していることを特徴とす
る。
能性ポリペプチドに関する発明であって、ヒトFNの細胞
接着ドメインポリペプチドと、下記式〔IV〕で表される
配列を少なくとも含むヒトVNのインスリン結合活性部位
ポリペプチド若しくは下記式〔Ｖ〕で表される配列を少
なくとも含むヒトColXIインスリン結合活性部位ポリペ
プチドが、直接又は間接に結合していることを特徴とす
る。
また、本発明の第２の発明は、上記第１の発明の機能
性ポリペプチドをコードする遺伝子に関する。
性ポリペプチドをコードする遺伝子に関する。
本発明の第３の発明は、上記第２の発明の遺伝子を組
込んだプラスミドに関する。
込んだプラスミドに関する。
本発明の第４の発明は、上記第３の発明のプラスミド
が導入された形質転換体に関する。
が導入された形質転換体に関する。
本発明の第５の発明は、前記第１の発明の機能性ポリ
ペプチドの製造方法に関する発明であって、上記第４の
発明の形質転換体を培養し、該培養物より前記第１の発
明の機能性ポリペプチドを採取することを特徴とする。
ペプチドの製造方法に関する発明であって、上記第４の
発明の形質転換体を培養し、該培養物より前記第１の発
明の機能性ポリペプチドを採取することを特徴とする。
本発明者らは、インスリン結合活性ポリペプチドとし
て、第１図（前記式IV）で示される、ヒトVNのインスリ
ン結合活性部位を有するポリペプチド、及び第２図（前
記式Ｖ）で示される、ヒトColXIのインスリン結合活性
部位を含有するポリペプチドを、それぞれ遺伝子工学的
に作成した。次いで、これらのインスリン結合活性ポリ
ペプチドがヒトFNの細胞接着ドメインポリペプチドと、
それぞれ、直接又はスペーサーを介して結合した、新規
ポリペプチドの遺伝子工学発現に成功し、本発明を完成
させた。
て、第１図（前記式IV）で示される、ヒトVNのインスリ
ン結合活性部位を有するポリペプチド、及び第２図（前
記式Ｖ）で示される、ヒトColXIのインスリン結合活性
部位を含有するポリペプチドを、それぞれ遺伝子工学的
に作成した。次いで、これらのインスリン結合活性ポリ
ペプチドがヒトFNの細胞接着ドメインポリペプチドと、
それぞれ、直接又はスペーサーを介して結合した、新規
ポリペプチドの遺伝子工学発現に成功し、本発明を完成
させた。
以下、本発明を具体的に説明する。
ヒトFNのタンパク質の一次構造については、ジ エン
ボ ジャーナル（The EMBO Journal）、第４巻、第1755
〜1759頁（1985）に記載されている。また、その細胞接
着ドメインをコードするcDNAクローン（pLF5）について
はバイオケミストリー（Biochemistry）、第25巻、第49
36〜4941頁（1986）に記載されている。本発明者らは、
pLF5から、細胞接着ドメインに対するcDNA断片を取出
し、これを発現ベクターに接続して大腸菌に導入するこ
とにより、細胞接着活性ポリペプチド及びその製造方法
を開発し特許出願した（特開平１−206998号）。本発明
で必要とされる細胞接着ドメインのcDNAは、特開平１−
206998号公報に記載されている組換え体プラスミドpTF7
021を用いることができる。pTF7021はFNのPro1239−Met
1517（279アミノ酸残基）を発現するプラスミドであ
る。pTF7021の翻訳領域のＣ末端の終止コドンの直前に
クローニングサイト、例えばNco Iサイトを導入するこ
とにより、細胞接着ドメインのcDNAと他のポリペプチド
をコードするDNAを連結させることができる。
ボ ジャーナル（The EMBO Journal）、第４巻、第1755
〜1759頁（1985）に記載されている。また、その細胞接
着ドメインをコードするcDNAクローン（pLF5）について
はバイオケミストリー（Biochemistry）、第25巻、第49
36〜4941頁（1986）に記載されている。本発明者らは、
pLF5から、細胞接着ドメインに対するcDNA断片を取出
し、これを発現ベクターに接続して大腸菌に導入するこ
とにより、細胞接着活性ポリペプチド及びその製造方法
を開発し特許出願した（特開平１−206998号）。本発明
で必要とされる細胞接着ドメインのcDNAは、特開平１−
206998号公報に記載されている組換え体プラスミドpTF7
021を用いることができる。pTF7021はFNのPro1239−Met
1517（279アミノ酸残基）を発現するプラスミドであ
る。pTF7021の翻訳領域のＣ末端の終止コドンの直前に
クローニングサイト、例えばNco Iサイトを導入するこ
とにより、細胞接着ドメインのcDNAと他のポリペプチド
をコードするDNAを連結させることができる。
本発明による新規な機能性ポリペプチドは、下記一般
式I: C277−（Ｘ）ｍ−Ｙ−（Ｚ）ｎ 〔式中、C277はヒトFNの細胞接着ドメインのPro1239−S
er1515に相当する277アミノ酸ポリペプチド残基を示
し、下記式II: で表される配列を有し、Ｘはスペーサーを示し、Ｙは前
記式〔IV〕で示されるヒトVNのインスリン結合活性部位
ポリペプチド若しくは前記式〔Ｖ〕で示されるヒトCol
XIのインスリン結合活性部位ポリペプチドを示し、Ｚは
下記式〔III〕、 のポリペプチドを示し、ｍ及びｎは１又は零の数を示
す〕で表されることを特徴とする機能性ポリペプチドで
ある。
式I: C277−（Ｘ）ｍ−Ｙ−（Ｚ）ｎ 〔式中、C277はヒトFNの細胞接着ドメインのPro1239−S
er1515に相当する277アミノ酸ポリペプチド残基を示
し、下記式II: で表される配列を有し、Ｘはスペーサーを示し、Ｙは前
記式〔IV〕で示されるヒトVNのインスリン結合活性部位
ポリペプチド若しくは前記式〔Ｖ〕で示されるヒトCol
XIのインスリン結合活性部位ポリペプチドを示し、Ｚは
下記式〔III〕、 のポリペプチドを示し、ｍ及びｎは１又は零の数を示
す〕で表されることを特徴とする機能性ポリペプチドで
ある。
式Ｉ中におけるスペーサーは、細胞接着活性ポリペプ
チドとインスリン結合活性ポリペプチドの分子間距離を
調節するための挿入配列でもあり、任意のアミノ酸又は
ポリペプチドを用いることができ、また必要に応じ除去
することもできる。本発明の例で示せば、C277とヒトVN
のインスリン結合活性部位ポリペプチドの間にはMet−G
lyが、C277とヒトColXIのインスリン結合活性部位ポリ
ペプチドの間にはMet−Valが挿入されている。
チドとインスリン結合活性ポリペプチドの分子間距離を
調節するための挿入配列でもあり、任意のアミノ酸又は
ポリペプチドを用いることができ、また必要に応じ除去
することもできる。本発明の例で示せば、C277とヒトVN
のインスリン結合活性部位ポリペプチドの間にはMet−G
lyが、C277とヒトColXIのインスリン結合活性部位ポリ
ペプチドの間にはMet−Valが挿入されている。
なお、本明細書において、細胞接着活性ポリペプチド
のアミノ酸に付された肩数字は、EMBL データバンク
（EMBL DATA BANK）中のFNのcDNA配列を翻訳して得られ
るアミノ酸配列に付されたＮ末からのアミノ酸残基数を
示す。
のアミノ酸に付された肩数字は、EMBL データバンク
（EMBL DATA BANK）中のFNのcDNA配列を翻訳して得られ
るアミノ酸配列に付されたＮ末からのアミノ酸残基数を
示す。
ヒトVNのインスリン結合活性部位ポリペプチドとは、
第１図で示されるアミノ酸配列を少なくとも含み、遺伝
子工学的に生産することができる。
第１図で示されるアミノ酸配列を少なくとも含み、遺伝
子工学的に生産することができる。
ヒトVNのインスリン結合活性は以下の方法で検出され
る。
る。
すなわち、ヒトVN又は例えば化学的に分解したポリペ
プチドを適当な濃度のSDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動（SDS−PAGE）で分離し、これをニトロセルロース
膜へブロッティングする。これにパーオキシダーゼ標識
したインスリンをPBS中で反応させ、充分に洗浄した後
に、４−クロロ−１−ナフトールと過酸化水素を基質と
して標識パーオキシダーゼ活性を検出する。
プチドを適当な濃度のSDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動（SDS−PAGE）で分離し、これをニトロセルロース
膜へブロッティングする。これにパーオキシダーゼ標識
したインスリンをPBS中で反応させ、充分に洗浄した後
に、４−クロロ−１−ナフトールと過酸化水素を基質と
して標識パーオキシダーゼ活性を検出する。
ヒトVNのインスリン結合活性部位は、VN分子をブロモ
シアンによって断片化した5kdのポリペプチドにあり、
このポリペプチドは逆相−ODSカラムHPLC（0.01％TFA、
アセトニトリル系）で精製され、Ｎ末端アミノ酸配列を
決定することができる。該ポリペプチドはそのＮ末端よ
りAla−Pro−Arg−Proのアミノ酸配列を有する。この配
列は既報のVNcDNA配列〔ジ エンボ ジャーナル、第４
巻、第3153〜3157（1986）〕においてAla341−Pro344に
相当する配列である。
シアンによって断片化した5kdのポリペプチドにあり、
このポリペプチドは逆相−ODSカラムHPLC（0.01％TFA、
アセトニトリル系）で精製され、Ｎ末端アミノ酸配列を
決定することができる。該ポリペプチドはそのＮ末端よ
りAla−Pro−Arg−Proのアミノ酸配列を有する。この配
列は既報のVNcDNA配列〔ジ エンボ ジャーナル、第４
巻、第3153〜3157（1986）〕においてAla341−Pro344に
相当する配列である。
ブロモシアン処理では、Met残基の後が切断されるの
で、該5kdポリペプチドはAla341−Met381に相当する。
そこで、この部位に対応するDNA断片をヒドジェノミッ
クDNAからPCR〔Polymerase Chain Reaction:サイキ（Sa
iki）ら、サイエンス（Science）、第230巻、第1350〜1
354頁（1986）〕により増幅し、次いで、増幅されたDNA
断片をNco I、EcoR Iで処理し、pTV118N〔フェブスレタ
ーズ（FEBS Letters）、第223巻、第174頁（1986）〕の
同サイトにライゲーションすることによりヒトVNインス
リン結合活性部位ポリペプチドと大腸菌由来のlacZ′
〔ジーン（Gene）第33巻、第103〜119頁（1986）〕の融
合タンパク質をコードする遺伝子を含有するプラスミド
pTV VN−In.を作製することができる。該プラスミドを
第３図に示す。該プラスミドで、微生物、例えば大腸菌
JM109株を形質転換し、該形質転換株を、培養すること
により、ヒトVNのインスリン結合活性部位ポリペプチド
を含有するlacZ′との融合ポリペプチド（以下、VN−I
n.と略称する）を発現させることができる。該VN−In.
のインスリン結合活性は前述の方法で確認されている。
で、該5kdポリペプチドはAla341−Met381に相当する。
そこで、この部位に対応するDNA断片をヒドジェノミッ
クDNAからPCR〔Polymerase Chain Reaction:サイキ（Sa
iki）ら、サイエンス（Science）、第230巻、第1350〜1
354頁（1986）〕により増幅し、次いで、増幅されたDNA
断片をNco I、EcoR Iで処理し、pTV118N〔フェブスレタ
ーズ（FEBS Letters）、第223巻、第174頁（1986）〕の
同サイトにライゲーションすることによりヒトVNインス
リン結合活性部位ポリペプチドと大腸菌由来のlacZ′
〔ジーン（Gene）第33巻、第103〜119頁（1986）〕の融
合タンパク質をコードする遺伝子を含有するプラスミド
pTV VN−In.を作製することができる。該プラスミドを
第３図に示す。該プラスミドで、微生物、例えば大腸菌
JM109株を形質転換し、該形質転換株を、培養すること
により、ヒトVNのインスリン結合活性部位ポリペプチド
を含有するlacZ′との融合ポリペプチド（以下、VN−I
n.と略称する）を発現させることができる。該VN−In.
のインスリン結合活性は前述の方法で確認されている。
今回本発明者らがヒトVNのインスリン結合活性部位と
して同定した領域は、従来からヒトVNのヘパリン結合部
位として報告されている領域とほぼ一致することから、
ヘパリンがVN・In.のインスリン結合性に与える影響を
検討した。その結果、VN−In.のインスリン結合性がヘ
パリンによって阻害されることが明らかになった。この
ことは本ポリペプチドのインスリン結合活性がヘパリン
によって制御可能であることを示している。
して同定した領域は、従来からヒトVNのヘパリン結合部
位として報告されている領域とほぼ一致することから、
ヘパリンがVN・In.のインスリン結合性に与える影響を
検討した。その結果、VN−In.のインスリン結合性がヘ
パリンによって阻害されることが明らかになった。この
ことは本ポリペプチドのインスリン結合活性がヘパリン
によって制御可能であることを示している。
次にヒトColXIのインスリン結合活性ポリペプチドと
は、第２図で示されるアミノ酸配列を少なくとも含むも
ので、遺伝子工学的に生産することができる。
は、第２図で示されるアミノ酸配列を少なくとも含むも
ので、遺伝子工学的に生産することができる。
特願昭63−273139号明細書記載のようにコラーゲンＶ
型（以下Col Vと略称する）におけるインスリン結合活
性部位ポリペプチドのアミノ酸配列の一部が決定され
た。一方、ヒトColXIは軟骨に多く存在し、Col Vの軟骨
型とされており、Col Vと高いホモロジーを有してい
る。そこで前出明細書記載のCol V由来のインスリン結
合活性部位ポリペプチドのアミノ酸配列と、Col Vと高
い相同性を有するColXIのアミノ酸配列、及びcDNA配列
〔ザ ジャーナル オブバイオロジカル ケミストリー
（The Journal of Biological Chemistry）第263巻、
第17159〜17166頁（1988）〕を比較する。Col V中のイ
ンスリン結合活性部位のアミノ酸配列は、ヒトColXIのG
ly268−Pro359の部位のアミノ酸配列にほぼ対応し、こ
の部分の両者のアミノ酸配列は約75％のホモロジーを示
す。そこで、この領域を含み、ヒトColXIのPro261−Gly
427に対応するポリペプチドをコードするcDNA断片をヒ
ト胎盤ｍ−RNAよりcDNA合成及びPCR法によって増幅す
る。
型（以下Col Vと略称する）におけるインスリン結合活
性部位ポリペプチドのアミノ酸配列の一部が決定され
た。一方、ヒトColXIは軟骨に多く存在し、Col Vの軟骨
型とされており、Col Vと高いホモロジーを有してい
る。そこで前出明細書記載のCol V由来のインスリン結
合活性部位ポリペプチドのアミノ酸配列と、Col Vと高
い相同性を有するColXIのアミノ酸配列、及びcDNA配列
〔ザ ジャーナル オブバイオロジカル ケミストリー
（The Journal of Biological Chemistry）第263巻、
第17159〜17166頁（1988）〕を比較する。Col V中のイ
ンスリン結合活性部位のアミノ酸配列は、ヒトColXIのG
ly268−Pro359の部位のアミノ酸配列にほぼ対応し、こ
の部分の両者のアミノ酸配列は約75％のホモロジーを示
す。そこで、この領域を含み、ヒトColXIのPro261−Gly
427に対応するポリペプチドをコードするcDNA断片をヒ
ト胎盤ｍ−RNAよりcDNA合成及びPCR法によって増幅す
る。
増幅されたDNA断片をNco I、EcoR Iで処理し、前出プ
ラスミドpTV118Nの同サイトにライゲーションすること
によりヒトColXIのインスリン結合活性部位ポリペプチ
ドをコードする遺伝子を含有するプラスミドpTV ColXI
を作成する。該プラスミドを第４図に示す。目的ポリペ
プチドの高発現性プラスミドを得るために、pTV ColXI
より、目的ポリペプチドをコードするDNAをNco I、BamH
Iで切り出し、次いで、高発現性プラスミド、例えばpE
T8cの同サイトに導入し、プラスミドpET ColXIを作成す
る。該プラスミドを第５図に示す。
ラスミドpTV118Nの同サイトにライゲーションすること
によりヒトColXIのインスリン結合活性部位ポリペプチ
ドをコードする遺伝子を含有するプラスミドpTV ColXI
を作成する。該プラスミドを第４図に示す。目的ポリペ
プチドの高発現性プラスミドを得るために、pTV ColXI
より、目的ポリペプチドをコードするDNAをNco I、BamH
Iで切り出し、次いで、高発現性プラスミド、例えばpE
T8cの同サイトに導入し、プラスミドpET ColXIを作成す
る。該プラスミドを第５図に示す。
pET系プラスミドはスタディー（Studie）らが作成し
たT7RNAポリメラーゼ プロモーターを有するプラスミ
ドで、これをT7RNAポリメラーゼを発現する大腸菌BL−2
1株に導入することで効果的にタンパク質を発現するこ
とができる。pET ColXIで大腸菌BL−21株を形質転換
し、該形質転換株を培養することにより、目的ポリペプ
チドを発現させることができ、培養菌体のSDS−PAGEに
より、分子量約20kdのポリペプチドにインスリン結合活
性が確認される。
たT7RNAポリメラーゼ プロモーターを有するプラスミ
ドで、これをT7RNAポリメラーゼを発現する大腸菌BL−2
1株に導入することで効果的にタンパク質を発現するこ
とができる。pET ColXIで大腸菌BL−21株を形質転換
し、該形質転換株を培養することにより、目的ポリペプ
チドを発現させることができ、培養菌体のSDS−PAGEに
より、分子量約20kdのポリペプチドにインスリン結合活
性が確認される。
次に、前述のVN−In.発現プラスミドpTV VN−In.のSm
a Iサイトに終止コドンを含むユニバーサル ストップ
コドン（ファルマシア社）を導入し、プラスミドpTV
VN−In.TAAを作成する。該プラスミドを第６図に示す。
このプラスミドよりNco I、BamH Iを用いてヒトVNイン
スリン結合活性部位をコードするDNA断片を切り出し、
前記pTF7021から誘導されたプラスミドpTF7520の翻訳領
域の３′末端Nco I、BamH Iサイトに接続することによ
り、ヒトFNの細胞接着ドメインと、ヒトVNのインスリン
結合活性部位ポリペプチドとが連結したポリペプチドを
発現する組換え体プラスミド・pTF7520＋VN−In.TAAが
得られる。該プラスミドを第７図に示す。
a Iサイトに終止コドンを含むユニバーサル ストップ
コドン（ファルマシア社）を導入し、プラスミドpTV
VN−In.TAAを作成する。該プラスミドを第６図に示す。
このプラスミドよりNco I、BamH Iを用いてヒトVNイン
スリン結合活性部位をコードするDNA断片を切り出し、
前記pTF7021から誘導されたプラスミドpTF7520の翻訳領
域の３′末端Nco I、BamH Iサイトに接続することによ
り、ヒトFNの細胞接着ドメインと、ヒトVNのインスリン
結合活性部位ポリペプチドとが連結したポリペプチドを
発現する組換え体プラスミド・pTF7520＋VN−In.TAAが
得られる。該プラスミドを第７図に示す。
一方、前述のColXIのインスリン結合活性部位ポリペ
プチドを発現するプラスミド・pET ColXIも同様にNco
I、BamH Iで処理し、ColXI由来のインスリン結合活性部
位ポリペプチドをコードするDHA断片を得る。これを前
述のpTF7520のNco I、BamH Iサイトに接続することによ
り、ヒトFNの細胞接着ドメインと、ヒトColXIのインス
リン結合活性部位ポリペプチドが連結したポリペプチド
を発現する組換え体プラスミド・pTF7520＋ColXIが得ら
れる。該プラスミドを第８図に示す。
プチドを発現するプラスミド・pET ColXIも同様にNco
I、BamH Iで処理し、ColXI由来のインスリン結合活性部
位ポリペプチドをコードするDHA断片を得る。これを前
述のpTF7520のNco I、BamH Iサイトに接続することによ
り、ヒトFNの細胞接着ドメインと、ヒトColXIのインス
リン結合活性部位ポリペプチドが連結したポリペプチド
を発現する組換え体プラスミド・pTF7520＋ColXIが得ら
れる。該プラスミドを第８図に示す。
pTF7520＋VN−In.TAAにおける連結部にはMet−Glyを
コードするDNAが、pTF7520＋ColXIにおける連結部にはM
et−ValをコードするDNAがリンカーとして含まれる。リ
ンカーの有無は、本発明の効果を左右するものではない
が、必要とあれば部位特異的変異の手法により、容易に
除去することができる。
コードするDNAが、pTF7520＋ColXIにおける連結部にはM
et−ValをコードするDNAがリンカーとして含まれる。リ
ンカーの有無は、本発明の効果を左右するものではない
が、必要とあれば部位特異的変異の手法により、容易に
除去することができる。
得られたプラスミドをそれぞれ大腸菌に導入し、適当
な条件下に培養することにより、目的ポリペプチドが大
腸菌内に蓄積される。発現の確認にはイムノブロッティ
ングが用いられる。組換え大腸菌の全菌体タンパク質を
SDS−PAGEで分離した後、泳動パターンをニトロセルロ
ース膜に移し取る。ヒトFNの細胞接着ドメインを認識す
るモノクローナル抗体（FN−10、宝酒造）及び前出イン
スリン結合活性測定方法で検出されるバンドが目的のポ
リペプチドである。
な条件下に培養することにより、目的ポリペプチドが大
腸菌内に蓄積される。発現の確認にはイムノブロッティ
ングが用いられる。組換え大腸菌の全菌体タンパク質を
SDS−PAGEで分離した後、泳動パターンをニトロセルロ
ース膜に移し取る。ヒトFNの細胞接着ドメインを認識す
るモノクローナル抗体（FN−10、宝酒造）及び前出イン
スリン結合活性測定方法で検出されるバンドが目的のポ
リペプチドである。
目的ポリペプチドの精製は、例えば次のように行う。
組換え大腸菌をＬ−ブロス等の培地に培養し、集菌した
後、超音波処理により、菌体破砕液を得、これを遠心分
離して上清を得る。上清を透析後、DEAEイオン交換体の
カラムを通過させ、次いでCMイオン交換体及び／又はヘ
パリン−アガロース等のアフィニティクロマトを行う。
以上の操作により、目的のポリペプチドを精製すること
ができる。
組換え大腸菌をＬ−ブロス等の培地に培養し、集菌した
後、超音波処理により、菌体破砕液を得、これを遠心分
離して上清を得る。上清を透析後、DEAEイオン交換体の
カラムを通過させ、次いでCMイオン交換体及び／又はヘ
パリン−アガロース等のアフィニティクロマトを行う。
以上の操作により、目的のポリペプチドを精製すること
ができる。
得られたポリペプチドは、BHKやNRK細胞に対する細胞
接着活性の測定に用いられる。細胞接着活性の測定は、
例えばルオスラティ（Ruoslahti）等の方法（メソッズ
イン エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y）、第82巻、第803〜831頁（1981）〕に準じて行う。
すなわち、試料をコートした後、BSAでブロッキングし
たマイクロタイタープレートに、BHK又はNRK細胞の懸濁
液を添加し、37℃で約１時間インキュベートした後、未
吸着の細胞を洗浄した後、ホルマリン固定し、伸展した
細胞の割合を顕微鏡下に測定することにより、細胞接着
の強さを測定することができる。
接着活性の測定に用いられる。細胞接着活性の測定は、
例えばルオスラティ（Ruoslahti）等の方法（メソッズ
イン エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y）、第82巻、第803〜831頁（1981）〕に準じて行う。
すなわち、試料をコートした後、BSAでブロッキングし
たマイクロタイタープレートに、BHK又はNRK細胞の懸濁
液を添加し、37℃で約１時間インキュベートした後、未
吸着の細胞を洗浄した後、ホルマリン固定し、伸展した
細胞の割合を顕微鏡下に測定することにより、細胞接着
の強さを測定することができる。
以上のように、細胞接着活性とインスリン結合活性を
有する、新規な人工機能性ポリペプチドが提供され、該
新規ポリペプチドは、インスリンの多様な効果を細胞へ
効果的に作用させることができ、局所へのドラグデリバ
リーシステムの構築や、徐放性薬剤の開発等、インスリ
ンの利用・作用制御等に有用である。
有する、新規な人工機能性ポリペプチドが提供され、該
新規ポリペプチドは、インスリンの多様な効果を細胞へ
効果的に作用させることができ、局所へのドラグデリバ
リーシステムの構築や、徐放性薬剤の開発等、インスリ
ンの利用・作用制御等に有用である。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されない。
発明はこれら実施例に限定されない。
実施例１ ヒトVNのインスリン結合活性部位ポリペプチドのクロ
ーニング （１−１）インスリン結合活性部位の同定 ヒトVN（宝酒造社製）を、20mg/mlブロモシアンを含
む70％ギ酸溶液に5mg/mlとなる様に溶解し、N2ガスを吹
き込み、溶液中のO2を除去した後、室温で24時間反応さ
せて断片化した。これに10倍量の水を加え、凍結乾燥を
行った。サンプルをPBS（−）に1mg/mlとなる様に溶解
し、この溶液10μをSDS−PAGEにより分離し、ウェス
タンブロット法によりニトロセルロース膜に転写した
後、５μg/mlパーオキシダーゼ標識インスリン（シグマ
社製）を添加した0.05％ツイーン（Tween）20−PBS溶液
中で室温、２時間反応させた。
ーニング （１−１）インスリン結合活性部位の同定 ヒトVN（宝酒造社製）を、20mg/mlブロモシアンを含
む70％ギ酸溶液に5mg/mlとなる様に溶解し、N2ガスを吹
き込み、溶液中のO2を除去した後、室温で24時間反応さ
せて断片化した。これに10倍量の水を加え、凍結乾燥を
行った。サンプルをPBS（−）に1mg/mlとなる様に溶解
し、この溶液10μをSDS−PAGEにより分離し、ウェス
タンブロット法によりニトロセルロース膜に転写した
後、５μg/mlパーオキシダーゼ標識インスリン（シグマ
社製）を添加した0.05％ツイーン（Tween）20−PBS溶液
中で室温、２時間反応させた。
このニトロセルロース膜を0.05％ツイーン20−PBSで
７回、PBSで３回洗浄した後に、ニトロセルロース膜に
結合したパーオキシダーゼ活性を0.5mg/mlでPBS（−）
に溶解した４−クロロ−１−ナフトールと0.01％過酸化
水素を基質として検出した。
７回、PBSで３回洗浄した後に、ニトロセルロース膜に
結合したパーオキシダーゼ活性を0.5mg/mlでPBS（−）
に溶解した４−クロロ−１−ナフトールと0.01％過酸化
水素を基質として検出した。
この結果、パーオキシダーゼ標識インスリンはヒトVN
断片の内、分子量約5kdのポリペプチドに結合した。
断片の内、分子量約5kdのポリペプチドに結合した。
次に逆相−CDSカラム（東京化成）HPLCによってこの5
kdポリペプチドを以下の条件で精製した。
kdポリペプチドを以下の条件で精製した。
すなむち、0.1％TFA存在下、アセトニトリル０％→60
％のグラジエントを用い、UV220nmの吸収を示すピーク
をSDS−PAGEで分析し、分子量5kdポリペプチドを得た。
％のグラジエントを用い、UV220nmの吸収を示すピーク
をSDS−PAGEで分析し、分子量5kdポリペプチドを得た。
次にこのポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列を決定し
たところ、そのＮ端アミノ酸配列はAla−Pro−Arg−Pro
であった。このアミノ酸配列と既報のヒトVN cDNA（前
述）配列を比較すると、Ala341−Pro344と一致する。ま
た、ブロモシアンで切断されるアミノ酸残基はMetであ
り、このことから、5kdポリペプチドをAla341−Met381
に対応するポリペプチドと同定した。
たところ、そのＮ端アミノ酸配列はAla−Pro−Arg−Pro
であった。このアミノ酸配列と既報のヒトVN cDNA（前
述）配列を比較すると、Ala341−Pro344と一致する。ま
た、ブロモシアンで切断されるアミノ酸残基はMetであ
り、このことから、5kdポリペプチドをAla341−Met381
に対応するポリペプチドと同定した。
（１−２）インスリン結合活性部位ポリペプチドをコー
ドするDNAのクローニング及び発現（１−１）のポリペ
プチドに対応するヒトVN DNA断片を以下のようにクローニングし、次に大腸菌l
acZ′ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現さ
せた。
ドするDNAのクローニング及び発現（１−１）のポリペ
プチドに対応するヒトVN DNA断片を以下のようにクローニングし、次に大腸菌l
acZ′ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現さ
せた。
すなわち、ヒト肺ジェノミックDNAをテンプレートと
して下記に示すプライマーをDNA合成機で合成、精製
し、これを用いて、PCRを行った。
して下記に示すプライマーをDNA合成機で合成、精製
し、これを用いて、PCRを行った。
アンダーラインはヒトVNのDNA配列、 は対応するアミノ酸番号、 はクローニング用に末端に導入した制限酵素サイトを示
す。
す。
PCRは宝酒造社ジーン アンプ（Gene Amp）キットを
用い、テンプレートDNAは１μｇ、温度サイクル94℃、
１分→55℃、２分→72℃、１分で30サイクル行った。反
応液の1/10量を４％アガロースゲル電気泳動にかけ、そ
の結果189bpの目的DNA断片の増幅を確認した。
用い、テンプレートDNAは１μｇ、温度サイクル94℃、
１分→55℃、２分→72℃、１分で30サイクル行った。反
応液の1/10量を４％アガロースゲル電気泳動にかけ、そ
の結果189bpの目的DNA断片の増幅を確認した。
この産物をNco I、EcoR Iで処理し、プラスミドpTV11
8Nの同サイトに16℃、30分ライゲーションした（宝酒造
社製ライゲーションキットを使用）。これにより構築さ
れたプラスミドをpTV VN−In.と命名し、これで大腸菌J
M109を形質転換した（宝酒造社コンピテントセルJM109
使用）。次に、得られた形質転換体中18クローンについ
てプラスミドの分析を行った。すなわち、ラピッド法で
調製したプラスミドをEcoR I及びNco Iで分解し、アガ
ロースゲル電気泳動にかけ、予想されるNco I−EcoR I
断片（0.18kb）のバンドの生成を調べた。その結果、１
クローンに目的のバンドが認められた。また、ダイデオ
キシ法により塩基配列を決定し、目的の配列を含むこと
を確認した。このプラスミドを保持する大腸菌JM109をE
scherichia coli JM109/pTV VN−In.と命名した。
8Nの同サイトに16℃、30分ライゲーションした（宝酒造
社製ライゲーションキットを使用）。これにより構築さ
れたプラスミドをpTV VN−In.と命名し、これで大腸菌J
M109を形質転換した（宝酒造社コンピテントセルJM109
使用）。次に、得られた形質転換体中18クローンについ
てプラスミドの分析を行った。すなわち、ラピッド法で
調製したプラスミドをEcoR I及びNco Iで分解し、アガ
ロースゲル電気泳動にかけ、予想されるNco I−EcoR I
断片（0.18kb）のバンドの生成を調べた。その結果、１
クローンに目的のバンドが認められた。また、ダイデオ
キシ法により塩基配列を決定し、目的の配列を含むこと
を確認した。このプラスミドを保持する大腸菌JM109をE
scherichia coli JM109/pTV VN−In.と命名した。
本菌株を150μg/mlアンピシリン1mM IPTG（イソ プ
ロピル チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）存在下Ｌ−培地
中で培養し、菌体を12.5％SDS−PAGEによって分析し
た。その結果、分子量約18kdにヒトVNポリペプチドと大
腸菌由来lacZ′が下記のように融合したポリペプチドを
得た。
ロピル チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）存在下Ｌ−培地
中で培養し、菌体を12.5％SDS−PAGEによって分析し
た。その結果、分子量約18kdにヒトVNポリペプチドと大
腸菌由来lacZ′が下記のように融合したポリペプチドを
得た。
次に前述のウエスタンブロットを用いた方法で本融合
ポリペプチドのインスリン結合性をチェックした結果、
強いインスリン結合活性が確認された。
ポリペプチドのインスリン結合性をチェックした結果、
強いインスリン結合活性が確認された。
（１−３）発現ポリペプチドへのヘパリンの作用 今回、本発明者らがヒトVN由来インスリン結合ポリペ
プチドとして同定した部分は、従来ヘパリン結合ドメイ
ンと呼ばれたサイトでもあることから、（１−２）で発
現させた本ポリペプチドに対するヘパリンとインスリン
の結合性について検討した。
プチドとして同定した部分は、従来ヘパリン結合ドメイ
ンと呼ばれたサイトでもあることから、（１−２）で発
現させた本ポリペプチドに対するヘパリンとインスリン
の結合性について検討した。
すなわち、前述のウエスタンブロット法において、ブ
ロッティングの後、0.5μg/mlのパーオキシダーゼ標識
インスリンを反応させる際に0.1μｇ、1.0μｇ、10μ
ｇ、100μｇ、1mg、及び10mgのヘパリンを共存させパー
オキシダーゼ発色の変化をみた。その結果、本ポリペプ
チドのインスリン結合性は加えるヘパリンによって強く
阻害されることが示された（表１）。
ロッティングの後、0.5μg/mlのパーオキシダーゼ標識
インスリンを反応させる際に0.1μｇ、1.0μｇ、10μ
ｇ、100μｇ、1mg、及び10mgのヘパリンを共存させパー
オキシダーゼ発色の変化をみた。その結果、本ポリペプ
チドのインスリン結合性は加えるヘパリンによって強く
阻害されることが示された（表１）。
実施例２ ヒトColXIのインスリン結合活性部位ポリペプチドの
クローニング （２−１）インスリン結合活性部位の同定 特願昭63−273139号によって明らかにされたCol Vに
おけるインスリン結合ポリペプチドのアミノ酸配列は、
ColXIのGly268−Pro359に対応している。そこでこれを
含むPro261−Gly427をインスリン結合ポリペプチドと同
定した。
クローニング （２−１）インスリン結合活性部位の同定 特願昭63−273139号によって明らかにされたCol Vに
おけるインスリン結合ポリペプチドのアミノ酸配列は、
ColXIのGly268−Pro359に対応している。そこでこれを
含むPro261−Gly427をインスリン結合ポリペプチドと同
定した。
（２−２）インスリン結合部位をコードするDNAのクロ
ーニング及び発現 ヒト胎盤ｍ−RNA（クローンテック社）よりオリゴdT
プライマーを用いて１本鎖cDNAを合成した〔メソッズ
イン エンザイモロジー（Methods in Enzymology）第1
52巻、第316〜324頁（1987）〕。すなわち、反応液25mM
トリス（Tris）−HCl、pH8.3、100mM KCl、10mM MgC
l2、500μM dNTP（dATP、dCTP、dGTP、TTP）オリゴｄ
（Ｔ）12-180.5μｇ（計20μ）を95℃、５分間加熱
し、その後、0.5μgm−RNAを加えた。更に95℃、３分間
加熱し、氷中で急冷した。これに終濃度5.76μＭのβ−
メルカプトエタノールを加え、更に25ユニットの逆転写
酵素（宝酒造社製:RAV−２）を加え（計25μ）42℃、
60分反応させた。
ーニング及び発現 ヒト胎盤ｍ−RNA（クローンテック社）よりオリゴdT
プライマーを用いて１本鎖cDNAを合成した〔メソッズ
イン エンザイモロジー（Methods in Enzymology）第1
52巻、第316〜324頁（1987）〕。すなわち、反応液25mM
トリス（Tris）−HCl、pH8.3、100mM KCl、10mM MgC
l2、500μM dNTP（dATP、dCTP、dGTP、TTP）オリゴｄ
（Ｔ）12-180.5μｇ（計20μ）を95℃、５分間加熱
し、その後、0.5μgm−RNAを加えた。更に95℃、３分間
加熱し、氷中で急冷した。これに終濃度5.76μＭのβ−
メルカプトエタノールを加え、更に25ユニットの逆転写
酵素（宝酒造社製:RAV−２）を加え（計25μ）42℃、
60分反応させた。
この産物を以下の条件でPCRにかけた。すなわち、下
記プライマーをDNA合成機で合成し、精製し用いた。
記プライマーをDNA合成機で合成し、精製し用いた。
アンダーラインはColXIのDNA配列、 は対応するアミノ酸番号、 はクローニング用に末端に導入した制限酵素サイト、 は新たに導入したストップコドンを示す。
PCRは宝酒造社製 ジーンアンプキットを用い、テン
プレートは前述のcDNA産物0.1μ、温度サイクル94
℃、１分→58℃、２分→72℃、１分で30サイクル行っ
た。反応液の1/10量を４％アガロースゲル電気泳動にか
け、その結果501bpの目的DNA断片の増幅を確認した。
プレートは前述のcDNA産物0.1μ、温度サイクル94
℃、１分→58℃、２分→72℃、１分で30サイクル行っ
た。反応液の1/10量を４％アガロースゲル電気泳動にか
け、その結果501bpの目的DNA断片の増幅を確認した。
この産物をNco I、EcoR Iで処理し、プラスミドpTV11
8Nの同サイトに前述の条件でライゲーションした。これ
によって構築されたプラスミドをpTV ColXIと命名し、
これを更にNco I、BamH I処理し、約500bpのDNA断片を
アガロースゲル電気泳動を用いて回収した。
8Nの同サイトに前述の条件でライゲーションした。これ
によって構築されたプラスミドをpTV ColXIと命名し、
これを更にNco I、BamH I処理し、約500bpのDNA断片を
アガロースゲル電気泳動を用いて回収した。
次に本DNA断片を前述のプラスミドpET8cの同サイトに
前述の条件でライゲーションした。
前述の条件でライゲーションした。
これによって構築されたプラスミドをpET ColXIと命
名して、前述の大腸菌BL−21株へ導入し形質転換体を得
た。
名して、前述の大腸菌BL−21株へ導入し形質転換体を得
た。
次に、得られた形質転換体中18クローンについてプラ
スミドの分析を行った。すなわち、ラピッド法で調製し
たプラスミドをNco I及びEcoR Iで分解し、アガロース
ゲル電気泳動にかけ、予想されるNco I−EcoR I断片
（0.5kb）のバンドの生成を調べた。その結果、１クロ
ーンに目的のバンドが認められた。また、ダイデオキシ
法により塩基配列を決定し、目的の配列を含むことを確
認した。このプラスミドを保持する大腸菌BL−21をEsch
erichia coli BL−21/pET ColXIと命名した。
スミドの分析を行った。すなわち、ラピッド法で調製し
たプラスミドをNco I及びEcoR Iで分解し、アガロース
ゲル電気泳動にかけ、予想されるNco I−EcoR I断片
（0.5kb）のバンドの生成を調べた。その結果、１クロ
ーンに目的のバンドが認められた。また、ダイデオキシ
法により塩基配列を決定し、目的の配列を含むことを確
認した。このプラスミドを保持する大腸菌BL−21をEsch
erichia coli BL−21/pET ColXIと命名した。
本菌株を100μg/mlアンピシリンを含むＬ−培地中でO
D600≒0.5まで培養し、更にアンピシリン100μg/ml及び
1mM IPTGを加え２時間培養した。
D600≒0.5まで培養し、更にアンピシリン100μg/ml及び
1mM IPTGを加え２時間培養した。
培養菌体を12.5％SDS−PAGEによって分析したとこ
ろ、分子量約20kdにポリペプチドの発現を確認した。
ろ、分子量約20kdにポリペプチドの発現を確認した。
更に前述のウエスタンブロット法でインスリン結合性
をチェックしたところ、本ポリペプチドにインスリン結
合活性を認めた。
をチェックしたところ、本ポリペプチドにインスリン結
合活性を認めた。
実施例３ ヒトFN細胞接着ドメインポリペプチドとヒトVNのイン
スリン結合活性部位ポリペプチドの融合ポリペプチドの
クローニング （３−１）プラスミドpTV VN−In.の改変 ヒトVN由来インスリン結合活性部位ポリペプチドをコ
ードするpTV VN−In.のインサート３′側のマルチクロ
ーニングサイト内のSma Iサイトに、ストップコドン（T
AA）を導入した。すなわちSma I処理し、脱リン酸化し
たpTV VN−In.にユニバーサル ストップ コドン（フ
ァルマシア社）をライゲーションし、前述の大腸菌JM10
9株へ導入した。これを40μg/mlのＸ−Gal（５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド）、200μg/mlのIPTG及び150μg/mlのアンピシリ
ンを含むＬ−プレート上にまき白色コロニーを選んだ。
これによって構築されたプラスミドをpTV VN−In.TAAと
命名した。
スリン結合活性部位ポリペプチドの融合ポリペプチドの
クローニング （３−１）プラスミドpTV VN−In.の改変 ヒトVN由来インスリン結合活性部位ポリペプチドをコ
ードするpTV VN−In.のインサート３′側のマルチクロ
ーニングサイト内のSma Iサイトに、ストップコドン（T
AA）を導入した。すなわちSma I処理し、脱リン酸化し
たpTV VN−In.にユニバーサル ストップ コドン（フ
ァルマシア社）をライゲーションし、前述の大腸菌JM10
9株へ導入した。これを40μg/mlのＸ−Gal（５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド）、200μg/mlのIPTG及び150μg/mlのアンピシリ
ンを含むＬ−プレート上にまき白色コロニーを選んだ。
これによって構築されたプラスミドをpTV VN−In.TAAと
命名した。
（３−２）融合ポリペプチドをコードするDNAのクロー
ニング （３−１）のpTV VN−In.TAAをNco I、BamH Iで処理
し、これを前述pTF7520のNco I、BamH Iサイトに前述の
条件でライゲーションした。これによって構築されたプ
ラスミドをpTF7520＋pTV VN−In.TAAと命名した。次い
で該プラスミドを用い、大腸菌JM109を形質転換した。
得られた形質転換体中18クローンについてプラスミドの
分析を行った。すなわち、ラピッド法で調製したプラス
ミドをBamH I及びNco Iで分解し、アガロースゲル電気
泳動にかけ、予想されるNco I−BamH I断片（0.18kb）
のバンドの生成を調べた。その結果、１クローンに目的
のバンドが認められた。また、ダイデオキシ法により塩
基配列を決定し、目的の配列を含むことを確認した。こ
のプラスミドを保持する大腸菌JM109をEscherichia col
i JM109/pTF7520＋VN−In.TAAと命名、表示して、工業
技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第11526号（F
ERM P−11526）として寄託した。上記菌株を100μg/ml
アンピシリン、1mM IPTGを含むＬ−培地中で培養し、
菌体タンパク質を12.5％SDS−PAGEで分析したところ、
分子量約45kdにポリペプチドの発現を確認した。
ニング （３−１）のpTV VN−In.TAAをNco I、BamH Iで処理
し、これを前述pTF7520のNco I、BamH Iサイトに前述の
条件でライゲーションした。これによって構築されたプ
ラスミドをpTF7520＋pTV VN−In.TAAと命名した。次い
で該プラスミドを用い、大腸菌JM109を形質転換した。
得られた形質転換体中18クローンについてプラスミドの
分析を行った。すなわち、ラピッド法で調製したプラス
ミドをBamH I及びNco Iで分解し、アガロースゲル電気
泳動にかけ、予想されるNco I−BamH I断片（0.18kb）
のバンドの生成を調べた。その結果、１クローンに目的
のバンドが認められた。また、ダイデオキシ法により塩
基配列を決定し、目的の配列を含むことを確認した。こ
のプラスミドを保持する大腸菌JM109をEscherichia col
i JM109/pTF7520＋VN−In.TAAと命名、表示して、工業
技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第11526号（F
ERM P−11526）として寄託した。上記菌株を100μg/ml
アンピシリン、1mM IPTGを含むＬ−培地中で培養し、
菌体タンパク質を12.5％SDS−PAGEで分析したところ、
分子量約45kdにポリペプチドの発現を確認した。
更に前述のウエスタンブロット法でインスリン結合性
を確認した。
を確認した。
また、泳動パターンをニトロセルロースメンブランに
転写した後、ヒトFNの細胞接着ドメインを特異的に認識
するモノクローナル抗体・FN−10を作用させ、FN−10の
前記45kdポリペプチドへの結合を確認した。
転写した後、ヒトFNの細胞接着ドメインを特異的に認識
するモノクローナル抗体・FN−10を作用させ、FN−10の
前記45kdポリペプチドへの結合を確認した。
（３−３）pTF7520＋VN In−TAAからの介在配列の除去 （３−２）で得たプラスミドpTF7520＋VN In−TAAに
よって発現される融合ポリペプチドの細胞接着ドメイン
Pro1239−Ser1515（277アミノ酸残基）とヒトVNのイン
スリン結合活性部位Ile335−Ser388（54アミノ酸残基）
の間にはMet−Glyが付加されており、更にSer388の次に
はＺが付加されている。
よって発現される融合ポリペプチドの細胞接着ドメイン
Pro1239−Ser1515（277アミノ酸残基）とヒトVNのイン
スリン結合活性部位Ile335−Ser388（54アミノ酸残基）
の間にはMet−Glyが付加されており、更にSer388の次に
はＺが付加されている。
このペプチドスペーサーに対応するDNA配列を部位特
異的変異の手法により除去し、Pro1239−Ser1515とIle
335−Ser388が直接結合し、Ｚが付加された融合ポリペ
プチドを発現するプラスミドを得、pTF7520/VN In.TAA
と命名した。更にヒトVNのインスリン結合活性部位ポリ
ペプチドの後に付加されている前述のＺのポリペプチド
をコードするDNAを上記の手法で除去し、Pro1239−Ser
1515とIle335−Ser388が直接結合し、かつポリペプチド
・Ｚを含まない融合ポリペプチドを発現するプラスミド
を得、本プラスミドをpTF7520VN In.TAA命名した。
異的変異の手法により除去し、Pro1239−Ser1515とIle
335−Ser388が直接結合し、Ｚが付加された融合ポリペ
プチドを発現するプラスミドを得、pTF7520/VN In.TAA
と命名した。更にヒトVNのインスリン結合活性部位ポリ
ペプチドの後に付加されている前述のＺのポリペプチド
をコードするDNAを上記の手法で除去し、Pro1239−Ser
1515とIle335−Ser388が直接結合し、かつポリペプチド
・Ｚを含まない融合ポリペプチドを発現するプラスミド
を得、本プラスミドをpTF7520VN In.TAA命名した。
実施例４ ヒトFN細胞接着ドメインポリペプチドとヒトColXIの
インスリン結合活性部位ポリペプチドの融合ポリペプチ
ドのクローニング （４−１）融合ポリペプチドをコードするDNAのクロー
ニング （２−２）のpTV ColXIをNco I、BamH Iで処理し、こ
れを前述pTF7520のNco I、BamH Iサイトに前述の条件で
ライゲーションした。これによって構築されたプラスミ
ドをpTF7520＋ColXIと命名し、次いで該プラスミドを用
い、大腸菌JM109を形質転換した。得られた形質転換体
中18クローンについてプラスミドの分析を行った。すな
わち、ラピッド法で調製したプラスミドをBamH I及びよ
ひNco Iで分解し、アガロースゲル電気泳動にかけ、予
想されるNco I−BamH I断片（0.5kb）のバンドの生成を
調べた。その結果、１クローンに目的のバンドが認めら
れた。また、ダイデオキシ法により塩基配列を決定し、
目的の配列を含むことを確認した。このプラスミドを保
持する大腸菌JM109をEscherichia coli JM109/pTF7520
＋ColXIと命名、表示して、工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第11527号（FERM P−11527）として
寄託した。
インスリン結合活性部位ポリペプチドの融合ポリペプチ
ドのクローニング （４−１）融合ポリペプチドをコードするDNAのクロー
ニング （２−２）のpTV ColXIをNco I、BamH Iで処理し、こ
れを前述pTF7520のNco I、BamH Iサイトに前述の条件で
ライゲーションした。これによって構築されたプラスミ
ドをpTF7520＋ColXIと命名し、次いで該プラスミドを用
い、大腸菌JM109を形質転換した。得られた形質転換体
中18クローンについてプラスミドの分析を行った。すな
わち、ラピッド法で調製したプラスミドをBamH I及びよ
ひNco Iで分解し、アガロースゲル電気泳動にかけ、予
想されるNco I−BamH I断片（0.5kb）のバンドの生成を
調べた。その結果、１クローンに目的のバンドが認めら
れた。また、ダイデオキシ法により塩基配列を決定し、
目的の配列を含むことを確認した。このプラスミドを保
持する大腸菌JM109をEscherichia coli JM109/pTF7520
＋ColXIと命名、表示して、工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第11527号（FERM P−11527）として
寄託した。
上記菌株を100μg/mlアンピシリン、1mMのIPTGを含む
Ｌ−培地中で培養し、次いで培養菌体タンパク質を12.5
％SDS−PAGEで分析したところ、分子量58kdにポリペプ
チドの発現を確認した。
Ｌ−培地中で培養し、次いで培養菌体タンパク質を12.5
％SDS−PAGEで分析したところ、分子量58kdにポリペプ
チドの発現を確認した。
更に、このポリペプチドのインスリン及びFN−10への
結合性を確認した。
結合性を確認した。
（４−２）pTF7520＋ColXIからの介在配列の除去 （４−１）で得たプラスミドによって発現される融合
ポリペプチドの細胞接着ドメインPro1239−Ser1515（27
7アミノ酸残基）とヒトColXIのインスリン結合活性部位
Pro261−Gly427（167アミノ酸残基）との間にはMet−Va
lが付加されている。このペプチドスペーサーに対応す
るDNA配列を部位特異的変異の手法により除去し、Pro
1239−Ser1515とPro261−Gly427が直接結合した融合ポ
リペプチドを発現するプラスミドを得、pTF7520/ColXI
と命名した。
ポリペプチドの細胞接着ドメインPro1239−Ser1515（27
7アミノ酸残基）とヒトColXIのインスリン結合活性部位
Pro261−Gly427（167アミノ酸残基）との間にはMet−Va
lが付加されている。このペプチドスペーサーに対応す
るDNA配列を部位特異的変異の手法により除去し、Pro
1239−Ser1515とPro261−Gly427が直接結合した融合ポ
リペプチドを発現するプラスミドを得、pTF7520/ColXI
と命名した。
以上、述べたごとく、本発明により、細胞接着活性と
インスリン結合活性を合せ持つ新規ポリペプチドが提供
される。このポリペプチドはインスリンと細胞との親和
性を高めることができ、インスリンを用いることに生化
学的ないし医学的意義が見出せる分野に有用な作用、効
果を示すものであり、特にインスリンの新しい製剤及び
ドラグデリバリーシステムに応用されるものである。
インスリン結合活性を合せ持つ新規ポリペプチドが提供
される。このポリペプチドはインスリンと細胞との親和
性を高めることができ、インスリンを用いることに生化
学的ないし医学的意義が見出せる分野に有用な作用、効
果を示すものであり、特にインスリンの新しい製剤及び
ドラグデリバリーシステムに応用されるものである。
第１図はヒトVNのインスリン結合活性部位ポリペプチド
のアミノ酸配列及び遺伝子配列を示す図、第２図はヒト
ColXIのインスリン結合活性部位ポリペプチドのアミノ
酸配列及び遺伝子配列を示す図、第３図はプラスミドpT
V VN−In.を示す図、第４図はプラスミドpTV ColXIを示
す図、第５図はプラスミドpET ColXIを示す図、第６図
はプラスミドpTV VN−In.TAAを示す図、第７図はプラス
ミドpTF7520＋VN−In.TAAを示す図、第８図はプラスミ
ドpTF7520＋ColXIを示す図である。
のアミノ酸配列及び遺伝子配列を示す図、第２図はヒト
ColXIのインスリン結合活性部位ポリペプチドのアミノ
酸配列及び遺伝子配列を示す図、第３図はプラスミドpT
V VN−In.を示す図、第４図はプラスミドpTV ColXIを示
す図、第５図はプラスミドpET ColXIを示す図、第６図
はプラスミドpTV VN−In.TAAを示す図、第７図はプラス
ミドpTF7520＋VN−In.TAAを示す図、第８図はプラスミ
ドpTF7520＋ColXIを示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 矢追 義人 神奈川県横浜市港北区箕輪町170―１― 212 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 19/00 C07K 14/78 C12N 15/00 - 15/90 C12P 21/00 - 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ
Claims (6)
- 【請求項１】ヒトフィブロネクチンの細胞接着ドメイン
ポリペプチドと、下記式〔IV〕で表される配列を少なく
とも含むヒトビトロネクチンのインスリン結合活性部位
ポリペプチド若しくは下記式〔Ｖ〕で表される配列を少
なくとも含むヒトコラーゲンXI型のインスリン結合活性
部位ポリペプチドが、直接又は間接に結合していること
を特徴とする人工の機能性ポリペプチド。 - 【請求項２】下記一般式I: C277−（Ｘ）ｍ−Ｙ−（Ｚ）ｎ ・・・〔Ｉ〕 〔式中、C277は、ヒトフィブロネクチンの細胞接着ドメ
インのPro1239−Ser1515に相当する下記式〔II〕の配列
で表される277アミノ酸ポリペプチド残基を示し、Ｘは
スペーサーを示し、Ｙは式〔IV〕で示されるヒトビトロ
ネクチンのインスリン結合活性部位ポリペプチド若しく
は式〔Ｖ〕で示されるヒトコラーゲンXI型のインスリン
結合活性部位ポリペプチドを示し、Ｚは下記式〔III〕
のポリペプチドを示し、ｍ及びｎは１又は零の数を示
す〕で表されることを特徴とする請求項１記載の概能性
ポリペプチド。 - 【請求項３】請求項１又は２記載の機能性ポリペプチド
をコードする遺伝子。 - 【請求項４】請求項３記載の機能性ポリペプチドをコー
ドする遺伝子を組込んだプラミド。 - 【請求項５】請求項４記載のプラスミドが導入された形
質転換体。 - 【請求項６】請求項５記載の形質転換体を培養し、該培
養物より請求項１又は２記載の機能性ポリペプチドを採
取することを特徴とする請求項１又は２記載の機能性ポ
リペプチドの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2159624A JP2864152B2 (ja) | 1990-06-20 | 1990-06-20 | 機能性ポリペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2159624A JP2864152B2 (ja) | 1990-06-20 | 1990-06-20 | 機能性ポリペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0454199A JPH0454199A (ja) | 1992-02-21 |
| JP2864152B2 true JP2864152B2 (ja) | 1999-03-03 |
Family
ID=15697789
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2159624A Expired - Fee Related JP2864152B2 (ja) | 1990-06-20 | 1990-06-20 | 機能性ポリペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2864152B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5491129A (en) * | 1992-07-30 | 1996-02-13 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Synthetic peptides derived from vitronectin and pharmaceutical compositions comprising them |
| CN1301723A (zh) * | 1999-12-27 | 2001-07-04 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——纤维结合蛋白类型ii10和编码这种多肽的多核苷酸 |
-
1990
- 1990-06-20 JP JP2159624A patent/JP2864152B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0454199A (ja) | 1992-02-21 |
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