JPH0432838B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、〔21−ロイシン〕ヒトウロガストロ
ン(以下〔21−L〕hUGと略称することがあ
る。)および遺伝子工学的方法による〔21−L〕
hUGの製造に関する。さらに具体的には、本発
明は、化学的に合成した〔21−L〕hUG構造遺
伝子、対応プラスミド組換体および形質転換した
細胞をも包含するものである。 ヒトウロガストロン(hUG)は1975年グレゴ
リー(Gregory)らが人尿中より発見した、胃酸
分泌抑制作用をもつ、アミノ酸53残基よりなるペ
プチドである(Nature,257、325(1975)。 hUGは下記の構造を有するポリペプチドであ
り、分子内に3つのジスルフイド結合を有する。 Asn−Ser−Asp−Ser−Glu−Cys−Pro−
Leu−Ser−His−Asp−Gly−Tyr−Cys−Leu
−His−Asp−Gly−Val−Cys−Met−Tyr−
Ile−Glu−Ala−Leu−Asp−Lys−Tyr−Ala
−Cys−Asn−Cys−Val−Val−Gly−Tyr−
Lle−Gly−Glu−Arg−Cys−Glu−Tyr−Arg
−Asp−Leu−Lys−Trp−Trp−Glu−Leu−
Arg 一方、同年コーエン(Cohen)らは人尿中よ
り、上皮組織の増殖角化を促す成長因子であるヒ
ト上皮細胞因子(hEGF)を発見、単離精製した
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,72、1317(1975))。
hEGFの全アミノ酸構造はなお解明されていない
が、その後の研究により、そのゲル電気泳動パタ
ーン、免疫交差反応などから現在ではhEGFは
hUGと同一の構造を有するとされている。 現在ではhUGとhEGFとは互いに共通するさま
ざまな生理作用が確認されており(Ann.Rev.Bio
−chem.,48,193(1979))、またhUGとは53個の
アミノ酸残基のうち37個が同一でかつ3個のS−
S結合が同じ部位にあるマウス上皮細胞成長因子
(mEGF)との生理作用の比較によつて、hUG/
hEGFあるいは、mEGFの活性は種を越えて見出
されていることから、これらの作用は、その特有
の安定な三次元構造に由来するものと考えられて
いる。 しかしながら、このhUG(hEGF)はヒト尿中
から微量しか単離することができず、したがつて
量産化が望まれていることは言うまでもない。一
方近年の遺伝子工学の進歩は大腸菌等に異種タン
パクの産生を行なわせるという点で多くの成果を
あげており、したがつてhUGの量産化を目的と
してこの技術を用いることは当然考えられるとこ
ろであり、提案も既に行なわれている(特開昭57
−122096号公報)。 ところで、遺伝子工学的手法をもつてペプチド
の合成を行なう場合の最も有力な手段の一つとし
て、宿主由来の他のタンパクの構造遺伝子(例え
ば大腸菌にけるβ−ガラクトシダーゼ、TrpEな
ど)にAUG(メチオチンに対するコドン)を介し
て目的ペプチドをコードする遺伝子を結合させて
宿主内でクローン化し、生合成されるいわゆる融
合タンパクを臭化シアンで処理して目的ペプチド
を取り出す方法(特開昭56−84603号、同56−
14221号など)があるが、この方法を用いる場合、
Metを含むペプチドの合成はできないことにな
る。hUGにおけるこの問題について言えば、
hUGはそのアミノ酸残基のN端より数えて21番
目にMetを有するので、この方法をそのまま用い
ることはできない。したがつて、例えば、上記の
公報(特開昭57−122096号)においては、hUG
のトリプシン不感性を利用して目的ペプチドをN
端の上流にLys−Lysをつけた融合タンパクとし
て産生させて、トリプシン処理によつて目的ペプ
チドを回収することが開示されている。しかしな
がら、別の報告(日本医師会雑誌、85、833
(1981))によれば、hUGはトリプシンによりC
端から数えて5つのアミノ酸が切断されて活性が
なくなるということもあり、特異的に切断できる
かどうか疑問の余地が残るなどの問題点があつ
て、これも必ずしも好便な方法とは言えない。 そこで本発明者はhUGのN端から21番目のア
ミノ酸残基MetはhUGの生理活性に関与してい
ないとの推定をもとに、Metを構造類似のLeu
(ロイシン)に替え、従来の融合タンパクからの
臭化シアン処理を可能にし、そして回収した〔21
−L〕hUGがhUG(hEGF)と同等の活性を有す
ることを確認して本発明を完成するに到つた。 hUG(hEGF)の活性が3つのジスルフイド結
合を有するその三次元構造に関係していることは
明らかにされているけれども、具体的な活性部位
およびメカニズムが明らかにされていない現状で
は、上記の工夫は当業者にとつて容易なことでは
ないと言えよう。 発明の概要 要 旨 本発明は、N端より数えて21番目のアミノ酸残
基がMetでないLeuからなるhUG誘導体、すなわ
ち〔21−L〕hUG、を表現する構造遺伝子が化
学合成可能であること、この遺伝子が適当プラス
ミドに組込み可能であること、このプラスミド組
換体による適当宿主細胞の形質転換および形質転
換体の培養による〔21−L〕hUGの産生および
回収が可能であること、ならびに生成〔21−L〕
hUGがhUG(hEGF)と同様の活性を有すること、
を確認してなされたものである。 従つて、本発明による〔21−L〕hUGは、下
記のアミノ酸配列式で表わされるポリペプチドか
らなること、を特徴とするものである。 Asn−Ser−Asp−Ser−Glu−Cys−Pro−
Leu−Ser−His−Asp−Gly−Tyr−Cys−Leu
−His−Asp−Gly−Val−Cys−Leu−Tyr−
Ile−Glu−Ala−Leu−Asp−Lys−Tyr−Ala
−Cys−Asn−Cys−Val−Val−Gly−Tyr−
Ile−Gly−Glu−Arg−Cys−Gln−Tyr−Arg
−Asp−Leu−Lys−Trp−Trp−Glu−Leu−
Arg (ただし、この構造は一次構造の形式で便宜上
表現したものである。) また、本発明による〔21〕hUGの製造法は、
下記の工程からなること、を特徴とするものであ
る。 (1) ヒトウロガストロンの21番目のアミノ酸がロ
イシンであるポリペプチドに相当する〔21−ロ
イシン〕ヒトウロガストロンの構造遺伝子を化
学的に合成すること。 (2) 予定した宿主細胞内で増殖可能なプラスミド
にこの遺伝子を組み込んで、この細胞内で増殖
可能なプラスミド組換体をつくること。 (3) このプラスミドによつて、宿主細胞を形質転
換させること。 (4) 得られる形質転換体を培養し、産生された
〔21−ロイシン〕ヒトウロガストロンを回収す
ること。 上記において、予定した宿主細胞内で増殖可能
なプラスミドはラクトースオペロンの発現系を利
用できるものが代表的であり、ラクトースオペロ
ンの発現系の由来および形質転換法において使用
する宿主細胞の代表的なものは、Escherichia属
に属する大腸菌である。 さらに、本発明は、〔21−L〕hUGを表現する
構造遺伝子を含む二本鎖ポリデオキシリボヌクレ
オチド、その構造遺伝子を含むプラスミド組換体
およびそのプラスミド組換体によつて形質転換さ
れたことを特徴とするエシエリキア・コリ
(Esche−richia coli)をも包含するものである。 効 果 天然hUG(hEGF)の抽出の場合に認められた
抽出および精製の際の問題は、本発明による遺伝
子組換体の抽出物を出発原料とした場合はこれを
回避することができる。 また、本発明による方法は、遺伝子工学的手法
をもつて生合成したいわゆる融合タンパクからの
臭化シアンによる目的ペプチドの回収という最も
有力な手段の一つの方法の応用範囲を拡大できる
ことを示唆するものに他ならない。 発明の具体的説明 1 〔21−ロイシン〕ヒトウロガストロン 本発明による〔21−L〕hUGは、下記のアミ
ノ酸配列式で示されるポリペプチドである。 Asn−Ser−Asp−Ser−Glu−Cys−Pro−
Leu−Ser−His−Asp−Gly−Tyr−Cys−Leu
−His−Asp−Gly−Val−Cys−Leu−Tyr−
Ile−Glu−Ala−Leu−Asp−Lys−Tyr−Ala
−Cys−Asn−Cys−Val−Val−Gly−Tyr−
Ile−Gly−Glu−Arg−Cys−Glu−Tyr−Arg
−Asp−Leu−Lys−Trp−Trp−Glu−Leu−
Arg 上式中のAsn等は、いうまでもなく、アスパラ
ギン等のアミノ酸を示す、当業界で承認されてい
る記号である。 このポリペプチドは、N端から数えて21番目の
アミノ酸がMetではなくてLeuであるという点で
hUGと相違している。 なお、上式は本発明の〔21−L〕hUGを便宜
上一次構造としての表現方法を用いたものであ
り、厳密な意味での本発明による〔21−L〕
hUGは上記式中N端より数えて6番目のCysと20
番目のCys、14番目のCysと31番目のCysおよび
33番目のCysと42番目のCysそれぞれがジスルフ
イド結合したものである。 〔21−L〕hUGは、hUG(hEGF)と同様、同
等の生理活性、たとえば潰瘍抑制作用、細胞増殖
促進作用を有するから、それ自身でhUG様生理
活性ポリペプチドとして使用することができる。 〔21−ロイシン〕ヒトウロガストロンの製造 1 構造遺伝子 (1) 遺伝子の設計 hUGの構造遺伝子がどのような塩基配列の
DNAからなつているは不明である。 従つて、このペプチドを構成するアミノ酸を指
定するいくつかのコドンのうちから、下記の条件
を満たすものを選んでDNAを合成する。 (i) G−C塩基対に富む領域に続いてA−T
塩基対に富む領域が続かないようにする。 () 後記する各々の合成フラグメントが分子
内あるいは分子間で望まない相補正塩基配列を
持たないようにする。 また、この構造遺伝子内には、形質転換株の検
索を容易にするため、あるいは将来のペプチド変
換修飾による構造活性相関の研究のため必要な一
つまたは二つ以上の制限酵素認識塩基配列を含む
ように、かつ望まない制限酵素認識塩基配列は含
まないように設計することが望ましい。〔21−L〕
hUGでは、制限酵素EcoRI,HinfI,AluI,RsaI
およびBglの認識塩基配列を設けることが望ま
しい。そして、コドンの選択は、宿主においてよ
く使われているものをできるだけ使用することが
好ましい。 従つて、本発明で使用する〔21−L〕hUGの
構造遺伝子の好ましい具体例は、後記の実験例お
よび遺伝子設計図に示した塩基配列のものである
(図中、この構造遺伝子は、Asnに対応するAAT
からArgに対応するCGTまでの部分であること
は言うまでもない)。 この構造遺伝子を発現させる方法はたとえば特
開昭54−92696号公報に詳記されているが、この
遺伝子を発現させるために大腸菌由来のラクトー
スオペロンを利用する場合は、ラクトースオペロ
ンのz遺伝子内にある制限酵素EcoRIの認識部位
にこの遺伝子を挿入してβ−ガラクトシダーゼと
融合したタンパクの形で発現させることが望まし
い。すなわち、まず構造遺伝子の5′−末端側には
臭化シアンの攻撃部位となるMetのコドンATG
を、3′−末端には一つまたは二つ以上の停止コド
ンを設ける。続いて、必要ならばβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子の開始コドンで始まるフレームと同
調させるためにAGTの5′−側に適当な任意の種
類、数の塩基配列を付加し、さらに上流側および
停止コドンの下流側には上記EcoRI認識部位に挿
入させるための塩基配列(この場合後記実験例の
ようにいわゆるリンカーが介在してもよい)をそ
れぞれ付加する。一般には、両粘着末端を露出さ
せたまま構造遺伝子を設計および合成しているが
(Science、198,1056(1977)など)、希望すれば
両末端を鈍感末端としてもよい。 なお、ATGの5′側に設けるべき任意の塩基対
は、一般的にいえば3m対、(3m+1)対または
(3m+2)対(mは0または1以上の整数)とな
る。 これらの考慮を払つた、本発明で使用するのに
適した〔21−L〕hUG用遺伝子の好ましい具体
例は、後記実験例に示したものである。 (2) 合成 上記のように設計した遺伝子を合成するには、
+−両鎖のそれぞれについて、これをいくつかの
フラグメントに分けてこれらを化学的に合成し、
各々のフラグメントを結合する方法によればよ
い。各鎖は、10〜17塩基からなり、各々が7〜10
塩基ずつ重なるように、26〜30個程度のフラグメ
ントに分けるのが好ましい。 各フラグメントの合成法としては、ジエステル
法(Science、203,614(1979))、トリエステル法
(Science、198,1056(1977))、あるいは固相法
(Nucleic Acids Research、8,5491(1980))、
液相法、あるいは酵素を用いる方法(J.Biol.
Chem.241,2014(1966))がある。合成時間、収
率、精製などの点からは、固相法でトリエステル
法によるものが最も適当である。 合成の具体的な事項に関しては、上記文献およ
び後記実験例を参照されたい。 (3) 精製 オリゴヌクレオチドを化学合成した場合、一般
に鎖長が長くなるにしたがつて最終成績体の分離
精製がしだいに困難となつてくる。特に、固相合
成法においては適当に保護されたオリゴヌクレオ
チドブロツクを段階的に縮合させていくため、従
来技術たとえばゲル過、ゲル電気泳動、イオン
交換カラム、高速液体クロマトグラフイーなどで
は、精製は容易でない。 ところで、逆相カラムでは、オリゴヌクレオチ
ドに親油性の保護基が一つあるなしでその保持時
間が大きくずれる。そこで、他の保護基をはずす
条件下で安定な別の保護基を持つオリゴヌクレオ
チドブロツクを最終の縮合段階に用い、ついで適
当な脱保護の操作を行なえば、目的の最終産物に
のみその保護基のついたオリゴヌクレオチドの混
合物が得られる。この保護基の親油性を利用して
逆相カラムで目的とする最終産物を他の未反応混
合物から分離し、ついでこの保護基をはずせば、
目的とするオリゴヌクレオチドを得ることができ
る。 この方法により、合成したオリゴヌクレオチド
を未反応混合物の中から効率よく分離精製するこ
とが可能である。 (4) リン酸化および結合 こうして得た合成フラグメントをDNAリガー
ゼを用いて順次結合していくのであるが、合成フ
ラグメントをこの酵素の基質とするためには、フ
ラグメントの5′−水酸基をリン酸化しておく必要
がある。 この目的のためにはポリヌクレオチドキナーゼ
を用いるのが一般的であるが、化学的なリン酸化
も可能である(Nucleic Acids Research、8,
5753(1980))。また、フラグメントの結合には
DNAリガーゼを用いるのが一般的であるが、
5′−末端のリン酸基を適当な方法(例えばイミダ
ゾール化)で活性化し、対する側の鎖を鋳型とし
て化学的に結合する方法も可能である(Chem.
Pharm.Bull.、26,2396(1978))。 2 ラクトースオペロンをもつベクターの調整 本発明においては、大腸菌染色体DNA由来の
ラクトースオペロンの全部または一部を含みかつ
大腸菌内で増殖可能なさまざまなプラスミドを用
いることが可能であり、それらのプラスミドを調
製するにあたつては、分子生物学の分野で公知の
常法に従つて行なうことができる。ラクトースオ
ペロンを含むDNAは大腸菌染色体から直接得る
ことも可能であるが、すでにラクトースオペロン
の全部または一部を含む形質導入フアージ(例え
ば、Pldl,F′−lac,φ80dplac,λh80dlac,
λdlacなど)が種々得られているので、これらの
フアージからラクトースオペロンの必要な部分を
とり出すのが好都合である。また、大腸菌内で増
殖可能なプラスミドとするために、本発明におい
ては上記のラクトースオペロンの必要な部分と大
腸菌由来の別のプラスミド(例えば、pBR322、
pSC101,λdV1など)とを結合させて単一のプラ
スミドベクターとする必要がある。 本発明の一具体例では、ラクトースオペロンを
含むDNAとして形質導入フアージλplac5
(Nature、224,768(1969))を用いている。な
お、λplac5DNAは、例えば、λplac5溶原菌であ
るところのE.coli PK1512から公知の方法(別冊
蛋白質核酸酵素、核酸実験法、下、p.19(1973))
により得ることができる。このλplac5はラクト
ースオペロンのi遺伝子の途中からy遺伝子の途
中までの領域を持つており、ラクトースオペロン
以外の大腸菌遺伝子をもつていないという利点を
有しているので本発明において好ましい。また、
大腸菌由来のプラスミドとしてはpBR322を用い
ているが、これを選んだ理由は最も入手しやすい
プラスミドの一つであること、全塩基配列が決定
されていること、アンピシリン抵抗性およびテト
ラサイクリン抵抗性の標識遺伝子を持つているこ
と、等の理由によるものである。そして、これら
の遺伝子を結合させるにあたりそれぞれ
(λplac5およびpBR322)を制限酵素Eco RIおよ
びHind IIIで処理して、λplac5については3.8Md
のフラグメントを、pBR322については大きい方
のフラグメントをそれぞれ取り出し、これらを緊
ぎ合わせて目的とするプラスミドベクターをつく
る(pREと命名)。 ところで、目的とする〔21−L〕hUGを発現
させるために大腸菌染色体由来のラクトースオペ
ロンを選んだのは、ラクトースオペロン中のz遺
伝子内にある制限酵素Eco RIの認識部位に外来
遺伝子を挿入してβ−ガラクトシダーゼと融合し
たタンパクの形で発現させることができるという
こと(Science、198,1056(1977))、タンパク質
を多量に産生させ得ること、適当な宿主菌を用い
れば誘導産生を行なわせることができるというこ
と、融合タンパクとして安定にまたほぼ純粋に回
収することが容易であること、等の理由によるも
のである。 したがつて、本発明においては調製したベクタ
ーがただ1か所だけ制限酵素EcoRIの認識部位を
有していることが望ましく、その目的に合わせる
ために上記のようにλplac5およびpBR322をそれ
ぞれEcoRIおよびHindIIIで切断したDNA断片を
用い、それぞれを繋げている。 3 プラスミド組換体 (1) 造成 上記のように外来遺伝子が発現するようにしく
まれたベクターの適当な位置に前述の〔21−L〕
hUG構造遺伝子を含む遺伝子を組込む。組込操
作そのものは、分子生物学の分野で公知の常法に
従つて行なうことができる。具体的な方法につい
ては、後記の実験例を参照されたい。 本発明の一具体例では、ベクタープラスミドと
してpRE1を使用しており、そのEco RI認識部位
に〔21−L〕hUG構造遺伝子を含む遺伝子を組
み込んでプラスミド組換体としている。本発明で
はこのプラスミド組換体をpLEと命名した。 (2) リンカー このプラスミド組換体を造成するにあたっては
〔21−L〕hUG構造遺伝子を含む遺伝子の両端を
EcoRI認識部位を含む粘着末端としてもよいが、
将来のEcoRI認識部位外の認識部位への挿入すな
わち別の融合タンパクとして目的ペプチドを産生
させる目的、あるいは別のプラスミドへの組換、
その他の目的のためには、鈍感末端としておくこ
とも有利なことであり、その一具体例が本発明に
おける後記実験例である。したがつてこの場合
は、構造遺伝子を含む遺伝子とpRE1との緊ぎ手
となる二本鎖DNAが必要である。すなわち、こ
の二本鎖DNAはEcoRIおよびSma Iの二つの制
限酵素の認識部位を有し、且つ最終的にβ−ガラ
クトシダーゼの開始コドンで始まるフレームと
〔21−L〕hUG構造遺伝子の読み取りフレームと
が一致するように設定すればよい。しかしなが
ら、この緊ぎ手となる部分は最終的に上記の機能
を有すればよいのであり、例えば上記の構造遺伝
子を合成した方法を用いて合成して得ることが可
能である。本発明の一具体例では、このような合
成法の一例として以下に述べる工夫を施してこの
緊ぎ手を得た。 まず、制限酵素EcoRIおよびSmaIの認識部位
を有する下記の一本鎖DNAを設計する。 5′AATTCCCGGG3′ この一本鎖DNAはそれ自体の相補正のために、
多くのニツク(DNAの二本鎖の一方に生じたす
き間のない切断点)を有する長鎖の二本鎖DNA
構造をとる。したがつて、DNAリガーゼにより、
すき間のない二本鎖DNAとすることができるの
である。そしてこのようにして得られた二本鎖
DNAは制限酵素EcoRIおよびSmaIの認識部位を
交互に有する二本鎖ポリDNAである。 (3) 方向性の判定 プラスミドに組込まれた〔21−L〕hUG遺伝
子の方向性の判定は、構造遺伝子内に含まれる特
定の部位を認識する酵素(Bgl)でその部位を
切断し、構造遺伝子外の特定の位置に別の酵素で
切断を入れ、得られた断片のサイズを分析するこ
とにより行なうことができる。 4 形質転換 (1) 宿主菌 前記のような〔21−L〕hUG構造遺伝子を組
込んだプラスミド組換体pLE、たとえば
pLE6527、を用いて形質転換させる宿主細胞の一
具体例は、エシリキア・コリに属する大腸菌株
XA35である。大腸菌株XA35は、公知株である
ところの大腸菌K12株(Microbiological
Reviews、44,1〜56(1980))の誘導体であり、
下記に示す性質を有し、他の性質についてはK12
株のそれと異なるところのない菌株である。 〔Smr,Lac-(i3 -,z)〕 本発明による〔21−L〕hUG構造遺伝子を組
込んだプラスミドによる形質転換は、あらゆる大
腸菌株において可能である。しかしながら、〔21
−L〕hUGをβ−ガラクトシダーゼとの融合タ
ンパクとして回収するためには正常なβ−ガラク
トシダーゼの混在をふせぐために宿主菌としてβ
−ガラクトシダーゼの遺伝子を欠失している株を
用いるのが好ましい。また、一般的には、ラクト
ースオペロンのリプレツサー遺伝子(i遺伝子)
によつてタンパクの産生が制御されているのであ
るが、野生型の大腸菌を用いる場合にはインデユ
ーサー(例えばIPTG)によつて融合タンパクを
誘導産生させることができ、i遺伝子の高温感受
性株を用いる場合には温度を上昇させることによ
り融合タンパクを誘導させることができ、i遺伝
子の欠損株を用いる場合には常に融合タンパクを
産生させることができる(The operon、31
(1980))。 本発明による一具体例では、β−ガラクトシダ
ーゼの遺伝子を欠失しかつi遺伝子の欠損株であ
るところの大腸菌株XA35を用いた。 (2) 形質転換 形質転換操作そのものは、分子生物学の分野で
公知の常法に従つて行なうことができる具体的な
方法については、後記の実験例を参照されたい。 (3) 形質転換体 形質転換体の一具体例は、大腸菌株XA35を
pLE6527によつて形質転換させて得た形質転換体
であつて、本発明ではこれを大腸菌株XA35
(pLE6527)と命名している。 この形質転換体大腸菌XA35(pLE6527)は後
記に述べる実験例によつて明らかなように前記大
腸菌株XA35とは下記の性質において異なる菌株
である。 〔Smr,Lac+〕 5 〔21−L〕hUGの産生 このように形質転換した菌を常法に従つて培養
すれば、〔21−L〕hUGが産生される。具体的な
方法については、後記の実験例を参照されたい。 実験例 〔21−L〕hUG遺伝子の設計 添付の遺伝子設計図に示すように設計した遺伝
子は鎖長10〜17の長さのフラグメントに分け、そ
れぞれES1〜5、E1〜E21とした。 設計の手順は、下記の通りである。 (1) コドンの選定 図面に示した通りにコドンを選ぶ。 (2) N末端にメチオニンのコドンATGを付加し、
合成されたポリペプチドがこの場所で化学的処
理(+CN Br)により切断されるようにする。 (3) C末端には、余計なペプチドが産生されない
ように1個の翻訳終了コドン(TAGまたは
TGA)を付加する。 (4) 21番目のアミノ酸(メチオニン)をロイシン
に換える。というのは、メチオニンが存在する
とCNBr処理で切断され、完全な形で〔21−
L〕hUGが得られないからである。 (5) ペプチドの変換修飾のため適当な場所に制限
酵素認識部位EcoRI,HinfI,AluI,RsaIおよ
びBglを1ケ所ずつ有するような塩基配列と
した。 (6) この遺伝子のコドンは、大腸菌でよく使われ
るものをできるだけ使用した。 フラグメントの化学合成 1 合成 フラグメントの合成は文献記載の方法に従つて
固相法によつて行なつた。しかし、合成フラグメ
ントの単離精製は以下に示す改良法で行なつた。 各フラグメントの合成収率は、20〜60%であつ
た。 【表】 【表】 2 精製 合成終了後の樹脂20mgに対し、0.5Mαピコリン
アルドキシムテトラメチルグアニジン、およびジ
オキサン:水(1:1)混合物200μlを加え、室
温一夜放置し、ついで濃アンモニア水20mlを加
え、密栓して一夜55℃で放置する。これを過し
て樹脂を分離し、液を濃縮しゲル過を行な
う。50mMTEAB緩衝液PH7.5で溶出し、ボイド
ボリユームに溶出してくるものを集める。これを
濃縮し、逆相カラムC−18(ウオータース「ラジ
アルパツクA」径8cm×10cm)のHPLCにアプラ
イし、0.01MエチレンジアミンジアセテートPH
7.8の緩衝液中、アセトニトリルの10%から32%
までの濃度勾配を2ml/minの流速で16分かけて
溶出させる。11〜12分で溶出されるものを集め
る。このとき、トリチル基のないオリゴヌクレオ
チドはインジエクシヨンピークとして溶出され
る。溶出液を濃縮し、80%酢酸1mlを加え、室温
で15分間放置する。トリメタノールを抽出除去
し、水層を濃縮し、再び逆相カラムにかける。先
と同じ条件下にアセトニトリルの0%から20%ま
での濃度勾配で溶出を行ない、12〜13分で溶出さ
れるもの(すなわちフラグメント)を集める。次
にこのフラグメント10pmol(0.001A260)を20mM
トリス塩酸緩衝液(PH7.5)、10mM MgCl2、
10mM DTT、0.5mM ATPの混合物に溶解し、
〔γ32P〕ATP10μci(3.3pmol)およびT4ポリヌク
レオチドキナーゼ1μl(4.5単位)を加え、全量を
20μlとし、37℃で20分加温した後、100℃で2分
加熱して反応を止める。 以上のようにして精製された各フラグメント
は,20%ゲル電気泳動及び2次元ホモクロマトグ
ラフイー塩基配列決定法(Nucl.Acids Res.,
1、331(1974)、Nucl.AcidsRes.,6,2069
(1979))により確認した。 フラグメントの結合反応 合成したフラグメントは、下記のように4つの
ブロツクに分けて結合反応を行なつた。ブロツク フラグメント A Es−1、Es−2、Es−3、Es−4、Es−
5、E−1 B E−2、E−3、E−4、E−5、E−6、
E−7、E−8 C E−9、E−10、E−11、E−12、E−13、
E−14、E−15 D E−16、E−17、E−18、E−19、E−20、
E−21 ブロツクAの場合は、Es−1、Es−2、Es−
3、Es−4、Es−5およびE−1各100pmol
(0.01A260を20mMトリス塩酸緩衝液(PH7.5)、
10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM ATPの
混合液に溶解し全量を50μlとしT4−ポリヌクレ
オチドキナーゼ(8単位)を加えて37℃で1時間
反応を行なつた後、リン酸化を行ない、次いで
T4−DNAリガーゼ(900単位)を加え14℃で一
夜(結合)反応を行なつてブロツクAの2量体を
得た。ブロツクDについてもブロツクAと同様の
方法で合成を行ない、同様に2量体を得た。ブロ
ツクB,Cについては、同様な方法でそれぞれ単
量体を得た。 次いでブロツクAの2量体およびブロツクBの
反応液を混合し、0.5mM ATPを1/10容、T4
−DNAリガーゼ(900単位)を加え、14℃で一夜
反応を行つた。反応終了後3M酢酸ナトリウム
(PH5.5)を1/10容加え、3倍容のエタノールを
加え、−70℃で15分間冷却した後、12000rpmで遠
心を行ない沈殿を得た。この沈殿について10%ポ
リアクリルアミド電気泳動を行ないフラグメント
〔A+B〕の2量体を分離し、フラグメント〔A
+B〕の2量体に相当するバンドを切り出した後
さらに1.5%低融点アガロースゲルを用いてフラ
グメント〔A+B〕を回収した。ブロツクCおよ
びブロツクDについても同様の操作を行ないフラ
グメント〔C+D〕の2量体を回収した。以上の
ようにし得られたフラグメント〔A+B〕および
フラグメント〔C+D〕を1:1の割合で混合し
上記と同様の方法で両フラグメントの結合反応を
行なつた。この反応混合液についてエタノール沈
殿を行ない高度に重合した遺伝子DNAを得た。
沈殿物を10mMトリス塩酸緩衝液(PH8.0)、
7mM MgCl2および20mM KClの混合液に溶解
し、SmaI(5単位)で37℃、1時間反応を行な
い、さらにこの反応混合液に1/10容の100mM
トリス塩酸緩衝液(PH8.0)、70mM MgCl2,
600mM NaClの混合液を加え、Hinc(50単
位)で37℃、1時間処理を行なう。これにより目
的の長さの遺伝子の両端がSma、Hincから
なる鎖長198の遺伝子が得られる。これについて
8%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない上
記と同様の方法で回収した。 pRE1の調製 λplac5DNA(特願57−16734参照)10μgを
100mMトリス塩酸緩衝液PH7.5,7mM MgCl2お
よび50mM NaClの混合物(全量20μl)に加え、
制限酵素EcoRI10単位および制限酵素Hind10
単位を用いて37℃で2時間反応させた。ついで1
%アガロースゲル電気泳動で3.8メガダルトンの
DANA断片を精製した。 pBR322DNA1μgを上記と同様の混合物(全両
10μl)に加え、制限酵素EcoRI1単位および制限
酵素Hind1単位を用いて37℃で2時間反応さ
せた。ついで1%アガロースゲル電気泳動で2.6
メガダルトンのDNA断片を精製した。 得られたそれぞれの断片を50mMトリス塩酸緩
衝液PH7.8,10mM MgCl2,20mM DTT、およ
びlmM ATPの混合物(全量10μl)に加え、
T4DNAリガーゼ30単位を用いて14℃,24時間反
応させた。 この反応混合液を用いて大腸菌株XA35の形質
転換を行なつた。形質転換はクシユナーの方法
(Genetic Engineering、1978,17(1978))にし
たがい、実験はP−1物理的封じ込め設備内で行
なつた(組み換えDNA実験指針)。 形質転換株を、Ap(20μg/ml)を含有するL
−プレート(1%バクトトリプトン、0.5%バク
トイースト抽出物、0.5%Nacl、1.5%バクトアガ
ー)上で選択し、得られた形質転換株をEMB−
lacのプレート(2.25%バクトEMBブロース、1.5
%バクトアガー)にレプリカし、Lac+(赤色のコ
ロニー)となつた株をさらに選択した。これらの
株のうち任意に5株を選びプラスミドを調製し、
数種の制限酵素で解析したところ、4株のプラス
ミドがλplac5DNAの3.8メガダルトン断片と
pBR322DNAのEcoRI−Hind断片が結合して
いるものであることが確かめられた。これらのう
ち1株を大腸菌XA35(pRE1)と命名した。即
ち、この形質転換体大腸菌XA35(pRE1)は前述
の大腸菌株XA35とは下記の性質において異る菌
株である。 〔Amr,Lac+〕 pRS23の調整 pRE1(30μg)を100mlトリス塩酸緩衝液(PH
7.5)、7mM MgCl2,50mM NaClの混合溶液中
で制限酵素EcoRI(4単位)を用い37℃、1時間
反応を行つた後、さらにバクテリアルアルカライ
ンホスフアターゼ(bacterial alkaline phos−
phatase)5単位を用いて37℃で30分反応を行な
う。反応終了後、等量のフエノール(これは
10mMトリス塩酸、1mM EDTA(PH8.0)の混合
溶液で飽和させたもの)で2回抽出を行ない、さ
らにエタノール沈殿を行なう。このとき得られた
沈殿を20mMトリス塩酸緩衝液(PH7.5)、10mM
MgCl2,0.5mM DTT、0.5mM ATPの混合物液
に溶解し、2等量のEcoRI−Smaリンカー
(AATTCCCGGG)を加え、T4−DNAリガーゼ
(300単位)を用いて14℃で一夜反応を行なう。こ
の反応混液を用いて大腸菌XA35の形質転換をク
シユナーの方法(Genentic Enginerring1978,
17(1978))に従つて行ない、アンピシリン
(20μg/ml)を含有するL−プレート上で形質転
換株を選択した。ここで得られた形質転換株を
EMB−lacのプレートにレプリカし、Lac+,
Amp+の株をさらに選択した。これらの株からプ
ラスミドDNAを調製し、制限酵素Smaおよび
Eco RIで切断されるプラスミドDNAを得た。 pRE6527の調製およびクローニング pRS23(6.8μg)10mMトリス塩酸緩衝液(PH
8.0)、7mM MgCI2,20mM KClの混合液中で制
限酵素SmaI(50単位)を37℃1時間作用させた。 その後さらにバクテリアルアルカラインホスフ
アターゼ(5単位)を加え42℃で30分反応を行な
う。反応終了後、フエノール(上記)で抽出を行
ない、さらにエタノール沈殿を行なつた。沈殿を
20mMトリス塩酸緩衝液(PH7.5)、10mM
MgCl2,5mM DTT、0.5mM ATP混合液に溶
解し、この溶液に〔21−L〕hUGフラグメント
(6pmol)を加えた後、T4−DNAリガーゼ
(1800単位)を用いて14℃で一夜反応を行なつた。
この反応混合液を用いて上記と同様に大腸菌
XA35の形質転換(上記クシユナー法)を行な
い、次いで形質転換株(アンピシリン耐性のも
の)を選択した。この株からプラスミドDNAを
調製し制限酵素Bglにより切断される株を選択
した(プラスミド中にEGFの構造遺伝子が入つ
ていればこの制限酵素認識部位を有するので目的
とするプラスミドを選択する場合の指標となる)。
次に組み込んだ遺伝子の方向性を確認する為、
Hind−Pst処理を行ない正しい方向性をもつ
と思われる株を選択した。 次いでこの株からプラスミドDNAを調製し、
制限酵素Hind−Hinc消化により141塩基対
のフラグメントを生じていることを確認した。こ
のフラグメント(Hind−Hincにより生じた
141塩基対のもの)をフアージM−13mp8のHind
−Hinc部位にクローニングし、dideoxy
sequencing method(Sanger法;Proc.Natl.
Acad.Sci.USA74,5463(1977)により配列を調
べ正しい方向に入つていることを再確認した。 菌の培養 〔21−L〕hUG遺伝子を挿入したプラスミド
組換体pLE6527を含む大腸菌XA35(pLE6527)を
0.4%グリセロール、20μg/mlアンピシリンを添
加した16リツトルのルリア(Luria)培地(1%
バクトートリプトン、0.5%バクトーイーストエ
クストラクト、0.5%NaCl)中で37℃4.5時間通気
下に培養し、対数期後期あるいは定常期初期
(A600=1.4)まで成育させる。その後遠心により
菌体を集め170mlの10mMトリス塩酸緩衝液(PH
8)/10mM MgCl2/5mMβ−メルカプトエタ
ノールで2回洗浄する。以上の操作により、最終
的に湿重量32.6gの菌株が得られた。 〔21−L〕hUGの部分精製 32.6gの菌体を140mlの10mMトリス塩酸緩衝液
(PH8)/1mM MgC2/1mM PMSF(フエニ
ルメチルスルホニルフルオライド)/5mMβ−メ
ルカプトエタノールに懸濁し、インソネーター
200M(久保田)を用い氷冷下に超音波処理を行な
うことにより菌体を破砕した。得られた溶菌液を
27000gで30分遠心し、ペレツトを集め、120mlの
10mMトリス塩酸緩衝液(PH8)/10mM
MgCl2/1mM PMSF/5mMβ−メルカプトエタ
ノールで2回洗浄する。ペレツトを150mlの8M
グアニジンを含む50mMトリス塩酸緩衝液/
1mM EDTA/5mMβ−メルカプトエタノール
中、4℃で一夜攪拌することにより懸濁後、水に
対して透析する。65000g、30分の遠心により透
析によつて生じたペレツトを集め、100mMの7M
尿素を含む20mMトリス塩酸緩衝液(PH8)/
1mM MgCl2/5mMβ−メルカプトエタノールに
懸濁し、再び27000gでで30分遠心を行ない上清
を得る。β−ガラクトシダーゼと〔21−L〕
hUGの融合蛋白質はこの上清部分に含まれてい
ることがSDSゲル電気泳動で確認され、蛋白質定
量の結果2.66gの蛋白が存在すると見積もられた。 〔21−L〕hUG融合蛋白質を含む上清(1g蛋
白相当量)を20mMトリス塩酸緩衝液(PH8)/
1mM MgCl2/5mMβ−メルカプトエタノール/
50mM NaClで平衡化したDEAE−セルロースカ
ラムに添加し、60mlの上記緩衝液で洗浄し非吸
着蛋白質を溶出させた後、食塩濃度を50mMから
300mMに直接的に上昇(各々500mlの緩衝液を
用いた直線的濃度勾配)させることにより〔21−
L〕hUG融合蛋白質を溶出させた。融合蛋白質
を含む画分を集め、透析を行ない尿素を除くこと
により融合蛋白を不溶化し、遠心により
(6500g、30分)集めた。得られた143mgの部分精
製融合蛋白質を70mlの70%ギ酸に溶解後1.8gの
臭化シアンを加え、室温で20時間振とうしながら
反応させた。反応液をエバポレーターを用いて濃
縮後50mlの蒸留水を加え冷結乾燥を行なつて、
ギ酸、未反応の臭化シアンおよび副生成物のシア
ン化メチル、臭化水素などを完全に除去した。臭
化シアン処理により得られた残渣を水で抽出後透
析を行ない最終的に14.1mgのペプチドを得た。 〔21−L〕hUGの同定および生物検定 角膜細胞、ヒト繊維芽細胞、ヒト類表皮癌細
胞、マウス3T3細胞、ヒト絨毛細胞ではじめ多く
の細胞膜表面にはマウスEGF(mEGF)および
hEGF/hUGと特異的に結合するリセプターが存
在することが明らかにされている。EGFは膜表
面上のリセプターと結合した後、エンンドサイト
ーシスにより細胞内にリセプターとの複合体の形
で取り込まれ、上皮細胞、繊維芽細胞の増殖、分
化の促進、マウスの目瞼開裂・切歯出現の促進、
胃酸分泌抑制、DNA・蛋白合成促進、カリウム
イオン・デオキシグルコースなどのイオン輸送、
低分子物質輸送の促進などの種々の生理作用を示
すことが報告されている。(Ann.Rev.Biochem.、
48,193(1979))これらの知見に基づいて〔21−
L〕hUGの同定および生物検定を行なつた。 (1) ラジオリセプターアツセイ(RRA) 〔21−L〕hUGのRRAはヒト鼻咽腔上皮癌細
胞由来のKB細胞(ATCC No.CCL17)を用い、
A.キング(King)らの方法(J.B.C.、257,3053
(1982))を参考にして行なつた。すなわち、
800mlのフラスコを用いDME倍地中で単層培養
する。倍地を除き0.05%のEDTAを含むリン酸平
衡化塩溶液(PBS)を用いて細胞をはがし細胞
懸濁液をつくる。その後20mM Hepes(PH7.4)
を含むHanks平衡塩類溶液(HBSS)で2回細胞
を洗浄する。細胞をBinding solution(DME倍
地・20mM Hepes(PH7.4)・0.35g/1NaHCO3・
100μG/mlストレプトマイシン)に懸濁後、細
胞数を計算して30万〜40万/0.2ml Binding
solutionとなる用調製し、チユーブに0.2mlずつ
分注する。種々の濃度の〔21−L〕hUGおよび
125I−mEGF(マウスEGF)を含む試料液0.2mlを
チユーブに加え37℃で1時間インキユベートす
る。細胞を氷冷したHBSSで3回洗浄後10%の
TCAに懸濁し、グラスフイルターを用いて細胞
を固定する。アセトンでTCAを除いた後、液体
シンチレーシヨンカウンターを用いて計数する。 比較のため、mEGF(東洋紡)およびβ−ガラ
クトシダーゼを臭化シアン処理して得られたペプ
チド画分についても同様な実験を行なつた。第2
図にその結果を示す。図から明らかなように〔21
−L〕hUGを含むペプチド画分125I−mEGFと
KB細胞EGFリセプターとの結合を拮抗的に阻害
し、その用量−反応曲線はmEGFのそれとよく一
致している。 マウス3T3細胞を用いたRRAについてもC.サ
ベージ(Savage)らの方法(Anal.Biochem.、
111,195(1981))に基づいて行ない、KB細胞を
用いたRRAを同様の結果を得た。 (2) マウス3T3細胞を用いた増殖促進活性を指標
とした生物検定 細胞増殖促進活性の測定は以下の操作によつて
行なつた。すなわち、マウス3T3細胞を25cm2フラ
スコに単層倍養後0.02%EDTA・0.05%トリプシ
ンを含むカルシウム、マグネシウムフリー−
HBSS(CMF−HBSS)で処理し細胞浮遊液を作
る。細胞をCMF−HBSSで戦浄した後、0.5%牛
胎仔血清(FBS)を含むDME倍地に懸濁し生細
胞数を測定する。細胞浮遊液2×104細胞数/ml
となる様0.5%FBS−DME倍地で希釈後1mlの細
胞浮遊液を直径35mmのデイシユにまき一夜炭酸ガ
スインキユベーター中でインキユベートする。
種々の濃度の〔21−L〕hUGを含むペプチド画
分あるいは標品のmEGFを0.5%FBS−DME倍地
に溶かし、ミリポアフイルター(type GV,
wpo2500)を用いて過し、1mlずつ上記細胞浮
遊液中に加える。炭酸ガスインキユベーター中
(5%CO2−95%空気、37℃)で4日間インキユ
ベートした後、トリパンブルーで生細胞を染色し
血球計算板を用いて生細胞数を計数する。得られ
た結果を第3図に示す。図から明らかな様に、そ
の用量−反応曲線はmEGFのそれとよく一致して
いる。なお対照として行なつたβ−ガラクトシダ
ーゼの臭化シアンペプチド画分は増殖促進活性を
全く示さなかつた。 (3) チミジンの取り込みを指標とした生物検定 チミジンの取り込みはAharon Aharonovらの
方法(J.B.C.、253,3970(1978))、Jimenez de
Asuaらの方法(PNAS、72,2724(1975))など
を改変して行なつた。すなわち、0.5mlの5%
FBS−DME倍地をいれた24マルチウエルデイシ
ユに6×103個のマウス3T3細胞をまき5日間培
養し、コンフルーエントモノレノアー細胞を作成
する。倍地を捨てPBSで洗浄後0.5mlの0.5%FBS
−DME倍地を加え一夜インキユベートする。
種々の濃度の〔21−L〕hUGあるいはmEGFを
含む0.5mlの0.5%FBS−DME倍地を加え18時間
インキユベートする。200nciの〔3H〕−チミジン
を加え、55℃で30分インキユベートした後、細胞
を20mM Hepes(PH7.4)を含む冷HBSSで2回洗
浄し、5%TCAで更に2回洗浄する。200μlの
1NNaOHを加え、55℃で30分インキユベートす
ることによりDNAを溶解させる。そのDNA溶液
50μlをとり25μlの2N HClを加え中和後とり込ま
れたチミジンの放射活性を液体シンチレーシヨン
カウンターで測定する。 得られた結果を次表に示す。 【表】 この表から明らかなように、〔21−L〕hUGペ
プチド画分はチミジンの取り込みを著しく促進し
た。 (4) 高速液体クロマトグラフイー(HPLC)を用
いた〔21−L〕hUGの精製および同定 〔21−L〕hUGを含むペプチド画分および
〔21−L〕hUG遺伝子の挿入のないベクタープラ
スミドのみを含む大腸菌XA35(pREl)から同様
な処理により得られたペプチド画分をマイクロボ
ンダパツクC−18カラム(0.4×30cm、ウオータ
ーズ)を用いたHPLGにより分析した。クロマト
グラフイーは50℃で0.1%トリフルオロ酢酸
(TFA)中でアセトニトリル濃度を20%から50%
に毎分0.75%2ml/分の流速で上昇させることに
より行なつた。 得られた溶出曲線は第4図に示す。図から明ら
かなように大腸菌XA35(pREl)から得られたペ
プチド画分には存在せず、〔21−L〕hUGを含む
ペプチド画分のみに認められる2本のピーク(保
持時間18.4分、19.3分)が検出された。この画分
を分取し、RRAおよび3T3細胞増殖促進活性を
指標として生物検定を行なつたところ、両方の画
分に活性が認められた、この2本のピークはその
保持時間の差から完全な構造を持つ〔21−L〕
hUGおよびC末端のArg,Leuの欠損した〔21−
L〕hUG1-51あるいは末端の5つのアミノ酸の欠
けた〔21−L〕hUG1-48ではないかと推定される
(Anal.Biochem.、111,195(1981))、J.B.C.247,
7609(1972))。 また、以上のことから逆相HPLCを用いること
により、〔21−L〕hUGの精製が可能であること
が示されたことになる。 さらに具体的に示せば、第4図で得られた〔21
−L〕hUGを再度逆相HPLCにかけて分取し、
(単一ピーク)、6N塩酸で加水分解し、アミノ酸
分析を行なつてアミノ酸組成を確認した(次表)。
なお被分析試料は電気泳動でも単一バンドを与え
た。 【表】 【表】 また、C末端部のアミノ酸配列をカルボキシペ
プチダーゼW(生化学工業製)により分析したと
ころ(次表) −48 Lys−Trp−Trp−Glu−Leu−53 Arg/OHで
あることを確認した。 【表】 さらに、気相プロテインシークエンサー(アプ
ライド バイオシステムズ470Aプロテイン シ
ークエンサー)によりN端部の配列は下記の通り
であることが確認された。 H−1 Asn( )−Asp( )−5 Glu−( )−Pro−
Leu−( )−10 His−Asp−Gly−Tyr−( )−15 Leu
−His−Asp−Gly−Val−20 ( )−21 Leu− なお2,4および9位はセリンに相当、また
6,14および20位はシステインに相当するので検
出不能であつたと考えられる。 したがつて、以上の結果より〔21−L〕hUG
は同定され、確かに本物質が産生されたことを確
認した。 幽門結紮潰瘍に対する〔21−L〕hUGの効果 EGFの抗ガストリン胃酸分泌抑制作用(Gut、
16,887(1975)に基づき〔21−L〕hUGの潰瘍
に対する効果を検討した。 7週令のウイスター系雄性ラツト(体重230g
前後)を予備飼育し、幽門結紮前24時間絶食した
後、17時間幽門結紮し絶食絶水することにより潰
瘍を生じさせる。幽門結紮処置の30分前に〔21−
L〕hUGを含むペプチド画分(500μg蛋白相当
量)及び対照として生理食塩水を皮下注射により
投与した。1群5匹で実験を行ない、抗潰瘍作用
の評価は潰瘍係数を算出して行なつた。すなわ
ち、幽門結紮によつて生じた潰瘍性のエロジオン
の長径と短径を解剖顕微鏡下で測定し、各々乗じ
たものの総和を1匹のラツトあたりの係数とす
る。 得られた結果を次表に示す。 潰瘍係数(mm2) 〔21−L〕hUG 44.5±18.0 対照(生理食塩水) 79.5±15.1 表から明らかなように、〔21−L〕hUG画分は
潰瘍を抑制する傾向が認められた。 以上の結果から〔21−L〕hUGの活性が確認
された訳であるが、同時に本発明によつて回収さ
れた〔21−L〕hUGが天然のhUGあるいは
mEGFと同様の位置に三つのジスルフイド結合を
有することも実質的に確認されたことになる。と
いうのは、三つのジスルフイド結合は生理活性に
必須のものであり、すなわち文献(Ann.Rev.
Biochem.、48,193−216(1979)およびJ.Biol.
Chem.、247,5928(1972))からも明らかなよう
に、mEGFにおいてジスルフイド結合を還元する
と活性が全く消失し、ひき続き再酸化するとその
酸化の程度に応じて活性が回復することが知られ
ているからである。 遺伝子設計図 第5図は、〔21−L〕hUGのアミノ酸配列およ
びその構造遺伝子を含む遺伝子の塩基配列をブロ
ツクA,B,CおよびDに分けて示すものであ
る。 a:Hind部位、b:Tag部位、c:
EcoRI部位、d:HinfI部位、e:Alu部位、
G:Rsa部位、g:Bgl部位、h:Hinc部
位 【表】 【表】
ン(以下〔21−L〕hUGと略称することがあ
る。)および遺伝子工学的方法による〔21−L〕
hUGの製造に関する。さらに具体的には、本発
明は、化学的に合成した〔21−L〕hUG構造遺
伝子、対応プラスミド組換体および形質転換した
細胞をも包含するものである。 ヒトウロガストロン(hUG)は1975年グレゴ
リー(Gregory)らが人尿中より発見した、胃酸
分泌抑制作用をもつ、アミノ酸53残基よりなるペ
プチドである(Nature,257、325(1975)。 hUGは下記の構造を有するポリペプチドであ
り、分子内に3つのジスルフイド結合を有する。 Asn−Ser−Asp−Ser−Glu−Cys−Pro−
Leu−Ser−His−Asp−Gly−Tyr−Cys−Leu
−His−Asp−Gly−Val−Cys−Met−Tyr−
Ile−Glu−Ala−Leu−Asp−Lys−Tyr−Ala
−Cys−Asn−Cys−Val−Val−Gly−Tyr−
Lle−Gly−Glu−Arg−Cys−Glu−Tyr−Arg
−Asp−Leu−Lys−Trp−Trp−Glu−Leu−
Arg 一方、同年コーエン(Cohen)らは人尿中よ
り、上皮組織の増殖角化を促す成長因子であるヒ
ト上皮細胞因子(hEGF)を発見、単離精製した
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,72、1317(1975))。
hEGFの全アミノ酸構造はなお解明されていない
が、その後の研究により、そのゲル電気泳動パタ
ーン、免疫交差反応などから現在ではhEGFは
hUGと同一の構造を有するとされている。 現在ではhUGとhEGFとは互いに共通するさま
ざまな生理作用が確認されており(Ann.Rev.Bio
−chem.,48,193(1979))、またhUGとは53個の
アミノ酸残基のうち37個が同一でかつ3個のS−
S結合が同じ部位にあるマウス上皮細胞成長因子
(mEGF)との生理作用の比較によつて、hUG/
hEGFあるいは、mEGFの活性は種を越えて見出
されていることから、これらの作用は、その特有
の安定な三次元構造に由来するものと考えられて
いる。 しかしながら、このhUG(hEGF)はヒト尿中
から微量しか単離することができず、したがつて
量産化が望まれていることは言うまでもない。一
方近年の遺伝子工学の進歩は大腸菌等に異種タン
パクの産生を行なわせるという点で多くの成果を
あげており、したがつてhUGの量産化を目的と
してこの技術を用いることは当然考えられるとこ
ろであり、提案も既に行なわれている(特開昭57
−122096号公報)。 ところで、遺伝子工学的手法をもつてペプチド
の合成を行なう場合の最も有力な手段の一つとし
て、宿主由来の他のタンパクの構造遺伝子(例え
ば大腸菌にけるβ−ガラクトシダーゼ、TrpEな
ど)にAUG(メチオチンに対するコドン)を介し
て目的ペプチドをコードする遺伝子を結合させて
宿主内でクローン化し、生合成されるいわゆる融
合タンパクを臭化シアンで処理して目的ペプチド
を取り出す方法(特開昭56−84603号、同56−
14221号など)があるが、この方法を用いる場合、
Metを含むペプチドの合成はできないことにな
る。hUGにおけるこの問題について言えば、
hUGはそのアミノ酸残基のN端より数えて21番
目にMetを有するので、この方法をそのまま用い
ることはできない。したがつて、例えば、上記の
公報(特開昭57−122096号)においては、hUG
のトリプシン不感性を利用して目的ペプチドをN
端の上流にLys−Lysをつけた融合タンパクとし
て産生させて、トリプシン処理によつて目的ペプ
チドを回収することが開示されている。しかしな
がら、別の報告(日本医師会雑誌、85、833
(1981))によれば、hUGはトリプシンによりC
端から数えて5つのアミノ酸が切断されて活性が
なくなるということもあり、特異的に切断できる
かどうか疑問の余地が残るなどの問題点があつ
て、これも必ずしも好便な方法とは言えない。 そこで本発明者はhUGのN端から21番目のア
ミノ酸残基MetはhUGの生理活性に関与してい
ないとの推定をもとに、Metを構造類似のLeu
(ロイシン)に替え、従来の融合タンパクからの
臭化シアン処理を可能にし、そして回収した〔21
−L〕hUGがhUG(hEGF)と同等の活性を有す
ることを確認して本発明を完成するに到つた。 hUG(hEGF)の活性が3つのジスルフイド結
合を有するその三次元構造に関係していることは
明らかにされているけれども、具体的な活性部位
およびメカニズムが明らかにされていない現状で
は、上記の工夫は当業者にとつて容易なことでは
ないと言えよう。 発明の概要 要 旨 本発明は、N端より数えて21番目のアミノ酸残
基がMetでないLeuからなるhUG誘導体、すなわ
ち〔21−L〕hUG、を表現する構造遺伝子が化
学合成可能であること、この遺伝子が適当プラス
ミドに組込み可能であること、このプラスミド組
換体による適当宿主細胞の形質転換および形質転
換体の培養による〔21−L〕hUGの産生および
回収が可能であること、ならびに生成〔21−L〕
hUGがhUG(hEGF)と同様の活性を有すること、
を確認してなされたものである。 従つて、本発明による〔21−L〕hUGは、下
記のアミノ酸配列式で表わされるポリペプチドか
らなること、を特徴とするものである。 Asn−Ser−Asp−Ser−Glu−Cys−Pro−
Leu−Ser−His−Asp−Gly−Tyr−Cys−Leu
−His−Asp−Gly−Val−Cys−Leu−Tyr−
Ile−Glu−Ala−Leu−Asp−Lys−Tyr−Ala
−Cys−Asn−Cys−Val−Val−Gly−Tyr−
Ile−Gly−Glu−Arg−Cys−Gln−Tyr−Arg
−Asp−Leu−Lys−Trp−Trp−Glu−Leu−
Arg (ただし、この構造は一次構造の形式で便宜上
表現したものである。) また、本発明による〔21〕hUGの製造法は、
下記の工程からなること、を特徴とするものであ
る。 (1) ヒトウロガストロンの21番目のアミノ酸がロ
イシンであるポリペプチドに相当する〔21−ロ
イシン〕ヒトウロガストロンの構造遺伝子を化
学的に合成すること。 (2) 予定した宿主細胞内で増殖可能なプラスミド
にこの遺伝子を組み込んで、この細胞内で増殖
可能なプラスミド組換体をつくること。 (3) このプラスミドによつて、宿主細胞を形質転
換させること。 (4) 得られる形質転換体を培養し、産生された
〔21−ロイシン〕ヒトウロガストロンを回収す
ること。 上記において、予定した宿主細胞内で増殖可能
なプラスミドはラクトースオペロンの発現系を利
用できるものが代表的であり、ラクトースオペロ
ンの発現系の由来および形質転換法において使用
する宿主細胞の代表的なものは、Escherichia属
に属する大腸菌である。 さらに、本発明は、〔21−L〕hUGを表現する
構造遺伝子を含む二本鎖ポリデオキシリボヌクレ
オチド、その構造遺伝子を含むプラスミド組換体
およびそのプラスミド組換体によつて形質転換さ
れたことを特徴とするエシエリキア・コリ
(Esche−richia coli)をも包含するものである。 効 果 天然hUG(hEGF)の抽出の場合に認められた
抽出および精製の際の問題は、本発明による遺伝
子組換体の抽出物を出発原料とした場合はこれを
回避することができる。 また、本発明による方法は、遺伝子工学的手法
をもつて生合成したいわゆる融合タンパクからの
臭化シアンによる目的ペプチドの回収という最も
有力な手段の一つの方法の応用範囲を拡大できる
ことを示唆するものに他ならない。 発明の具体的説明 1 〔21−ロイシン〕ヒトウロガストロン 本発明による〔21−L〕hUGは、下記のアミ
ノ酸配列式で示されるポリペプチドである。 Asn−Ser−Asp−Ser−Glu−Cys−Pro−
Leu−Ser−His−Asp−Gly−Tyr−Cys−Leu
−His−Asp−Gly−Val−Cys−Leu−Tyr−
Ile−Glu−Ala−Leu−Asp−Lys−Tyr−Ala
−Cys−Asn−Cys−Val−Val−Gly−Tyr−
Ile−Gly−Glu−Arg−Cys−Glu−Tyr−Arg
−Asp−Leu−Lys−Trp−Trp−Glu−Leu−
Arg 上式中のAsn等は、いうまでもなく、アスパラ
ギン等のアミノ酸を示す、当業界で承認されてい
る記号である。 このポリペプチドは、N端から数えて21番目の
アミノ酸がMetではなくてLeuであるという点で
hUGと相違している。 なお、上式は本発明の〔21−L〕hUGを便宜
上一次構造としての表現方法を用いたものであ
り、厳密な意味での本発明による〔21−L〕
hUGは上記式中N端より数えて6番目のCysと20
番目のCys、14番目のCysと31番目のCysおよび
33番目のCysと42番目のCysそれぞれがジスルフ
イド結合したものである。 〔21−L〕hUGは、hUG(hEGF)と同様、同
等の生理活性、たとえば潰瘍抑制作用、細胞増殖
促進作用を有するから、それ自身でhUG様生理
活性ポリペプチドとして使用することができる。 〔21−ロイシン〕ヒトウロガストロンの製造 1 構造遺伝子 (1) 遺伝子の設計 hUGの構造遺伝子がどのような塩基配列の
DNAからなつているは不明である。 従つて、このペプチドを構成するアミノ酸を指
定するいくつかのコドンのうちから、下記の条件
を満たすものを選んでDNAを合成する。 (i) G−C塩基対に富む領域に続いてA−T
塩基対に富む領域が続かないようにする。 () 後記する各々の合成フラグメントが分子
内あるいは分子間で望まない相補正塩基配列を
持たないようにする。 また、この構造遺伝子内には、形質転換株の検
索を容易にするため、あるいは将来のペプチド変
換修飾による構造活性相関の研究のため必要な一
つまたは二つ以上の制限酵素認識塩基配列を含む
ように、かつ望まない制限酵素認識塩基配列は含
まないように設計することが望ましい。〔21−L〕
hUGでは、制限酵素EcoRI,HinfI,AluI,RsaI
およびBglの認識塩基配列を設けることが望ま
しい。そして、コドンの選択は、宿主においてよ
く使われているものをできるだけ使用することが
好ましい。 従つて、本発明で使用する〔21−L〕hUGの
構造遺伝子の好ましい具体例は、後記の実験例お
よび遺伝子設計図に示した塩基配列のものである
(図中、この構造遺伝子は、Asnに対応するAAT
からArgに対応するCGTまでの部分であること
は言うまでもない)。 この構造遺伝子を発現させる方法はたとえば特
開昭54−92696号公報に詳記されているが、この
遺伝子を発現させるために大腸菌由来のラクトー
スオペロンを利用する場合は、ラクトースオペロ
ンのz遺伝子内にある制限酵素EcoRIの認識部位
にこの遺伝子を挿入してβ−ガラクトシダーゼと
融合したタンパクの形で発現させることが望まし
い。すなわち、まず構造遺伝子の5′−末端側には
臭化シアンの攻撃部位となるMetのコドンATG
を、3′−末端には一つまたは二つ以上の停止コド
ンを設ける。続いて、必要ならばβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子の開始コドンで始まるフレームと同
調させるためにAGTの5′−側に適当な任意の種
類、数の塩基配列を付加し、さらに上流側および
停止コドンの下流側には上記EcoRI認識部位に挿
入させるための塩基配列(この場合後記実験例の
ようにいわゆるリンカーが介在してもよい)をそ
れぞれ付加する。一般には、両粘着末端を露出さ
せたまま構造遺伝子を設計および合成しているが
(Science、198,1056(1977)など)、希望すれば
両末端を鈍感末端としてもよい。 なお、ATGの5′側に設けるべき任意の塩基対
は、一般的にいえば3m対、(3m+1)対または
(3m+2)対(mは0または1以上の整数)とな
る。 これらの考慮を払つた、本発明で使用するのに
適した〔21−L〕hUG用遺伝子の好ましい具体
例は、後記実験例に示したものである。 (2) 合成 上記のように設計した遺伝子を合成するには、
+−両鎖のそれぞれについて、これをいくつかの
フラグメントに分けてこれらを化学的に合成し、
各々のフラグメントを結合する方法によればよ
い。各鎖は、10〜17塩基からなり、各々が7〜10
塩基ずつ重なるように、26〜30個程度のフラグメ
ントに分けるのが好ましい。 各フラグメントの合成法としては、ジエステル
法(Science、203,614(1979))、トリエステル法
(Science、198,1056(1977))、あるいは固相法
(Nucleic Acids Research、8,5491(1980))、
液相法、あるいは酵素を用いる方法(J.Biol.
Chem.241,2014(1966))がある。合成時間、収
率、精製などの点からは、固相法でトリエステル
法によるものが最も適当である。 合成の具体的な事項に関しては、上記文献およ
び後記実験例を参照されたい。 (3) 精製 オリゴヌクレオチドを化学合成した場合、一般
に鎖長が長くなるにしたがつて最終成績体の分離
精製がしだいに困難となつてくる。特に、固相合
成法においては適当に保護されたオリゴヌクレオ
チドブロツクを段階的に縮合させていくため、従
来技術たとえばゲル過、ゲル電気泳動、イオン
交換カラム、高速液体クロマトグラフイーなどで
は、精製は容易でない。 ところで、逆相カラムでは、オリゴヌクレオチ
ドに親油性の保護基が一つあるなしでその保持時
間が大きくずれる。そこで、他の保護基をはずす
条件下で安定な別の保護基を持つオリゴヌクレオ
チドブロツクを最終の縮合段階に用い、ついで適
当な脱保護の操作を行なえば、目的の最終産物に
のみその保護基のついたオリゴヌクレオチドの混
合物が得られる。この保護基の親油性を利用して
逆相カラムで目的とする最終産物を他の未反応混
合物から分離し、ついでこの保護基をはずせば、
目的とするオリゴヌクレオチドを得ることができ
る。 この方法により、合成したオリゴヌクレオチド
を未反応混合物の中から効率よく分離精製するこ
とが可能である。 (4) リン酸化および結合 こうして得た合成フラグメントをDNAリガー
ゼを用いて順次結合していくのであるが、合成フ
ラグメントをこの酵素の基質とするためには、フ
ラグメントの5′−水酸基をリン酸化しておく必要
がある。 この目的のためにはポリヌクレオチドキナーゼ
を用いるのが一般的であるが、化学的なリン酸化
も可能である(Nucleic Acids Research、8,
5753(1980))。また、フラグメントの結合には
DNAリガーゼを用いるのが一般的であるが、
5′−末端のリン酸基を適当な方法(例えばイミダ
ゾール化)で活性化し、対する側の鎖を鋳型とし
て化学的に結合する方法も可能である(Chem.
Pharm.Bull.、26,2396(1978))。 2 ラクトースオペロンをもつベクターの調整 本発明においては、大腸菌染色体DNA由来の
ラクトースオペロンの全部または一部を含みかつ
大腸菌内で増殖可能なさまざまなプラスミドを用
いることが可能であり、それらのプラスミドを調
製するにあたつては、分子生物学の分野で公知の
常法に従つて行なうことができる。ラクトースオ
ペロンを含むDNAは大腸菌染色体から直接得る
ことも可能であるが、すでにラクトースオペロン
の全部または一部を含む形質導入フアージ(例え
ば、Pldl,F′−lac,φ80dplac,λh80dlac,
λdlacなど)が種々得られているので、これらの
フアージからラクトースオペロンの必要な部分を
とり出すのが好都合である。また、大腸菌内で増
殖可能なプラスミドとするために、本発明におい
ては上記のラクトースオペロンの必要な部分と大
腸菌由来の別のプラスミド(例えば、pBR322、
pSC101,λdV1など)とを結合させて単一のプラ
スミドベクターとする必要がある。 本発明の一具体例では、ラクトースオペロンを
含むDNAとして形質導入フアージλplac5
(Nature、224,768(1969))を用いている。な
お、λplac5DNAは、例えば、λplac5溶原菌であ
るところのE.coli PK1512から公知の方法(別冊
蛋白質核酸酵素、核酸実験法、下、p.19(1973))
により得ることができる。このλplac5はラクト
ースオペロンのi遺伝子の途中からy遺伝子の途
中までの領域を持つており、ラクトースオペロン
以外の大腸菌遺伝子をもつていないという利点を
有しているので本発明において好ましい。また、
大腸菌由来のプラスミドとしてはpBR322を用い
ているが、これを選んだ理由は最も入手しやすい
プラスミドの一つであること、全塩基配列が決定
されていること、アンピシリン抵抗性およびテト
ラサイクリン抵抗性の標識遺伝子を持つているこ
と、等の理由によるものである。そして、これら
の遺伝子を結合させるにあたりそれぞれ
(λplac5およびpBR322)を制限酵素Eco RIおよ
びHind IIIで処理して、λplac5については3.8Md
のフラグメントを、pBR322については大きい方
のフラグメントをそれぞれ取り出し、これらを緊
ぎ合わせて目的とするプラスミドベクターをつく
る(pREと命名)。 ところで、目的とする〔21−L〕hUGを発現
させるために大腸菌染色体由来のラクトースオペ
ロンを選んだのは、ラクトースオペロン中のz遺
伝子内にある制限酵素Eco RIの認識部位に外来
遺伝子を挿入してβ−ガラクトシダーゼと融合し
たタンパクの形で発現させることができるという
こと(Science、198,1056(1977))、タンパク質
を多量に産生させ得ること、適当な宿主菌を用い
れば誘導産生を行なわせることができるというこ
と、融合タンパクとして安定にまたほぼ純粋に回
収することが容易であること、等の理由によるも
のである。 したがつて、本発明においては調製したベクタ
ーがただ1か所だけ制限酵素EcoRIの認識部位を
有していることが望ましく、その目的に合わせる
ために上記のようにλplac5およびpBR322をそれ
ぞれEcoRIおよびHindIIIで切断したDNA断片を
用い、それぞれを繋げている。 3 プラスミド組換体 (1) 造成 上記のように外来遺伝子が発現するようにしく
まれたベクターの適当な位置に前述の〔21−L〕
hUG構造遺伝子を含む遺伝子を組込む。組込操
作そのものは、分子生物学の分野で公知の常法に
従つて行なうことができる。具体的な方法につい
ては、後記の実験例を参照されたい。 本発明の一具体例では、ベクタープラスミドと
してpRE1を使用しており、そのEco RI認識部位
に〔21−L〕hUG構造遺伝子を含む遺伝子を組
み込んでプラスミド組換体としている。本発明で
はこのプラスミド組換体をpLEと命名した。 (2) リンカー このプラスミド組換体を造成するにあたっては
〔21−L〕hUG構造遺伝子を含む遺伝子の両端を
EcoRI認識部位を含む粘着末端としてもよいが、
将来のEcoRI認識部位外の認識部位への挿入すな
わち別の融合タンパクとして目的ペプチドを産生
させる目的、あるいは別のプラスミドへの組換、
その他の目的のためには、鈍感末端としておくこ
とも有利なことであり、その一具体例が本発明に
おける後記実験例である。したがつてこの場合
は、構造遺伝子を含む遺伝子とpRE1との緊ぎ手
となる二本鎖DNAが必要である。すなわち、こ
の二本鎖DNAはEcoRIおよびSma Iの二つの制
限酵素の認識部位を有し、且つ最終的にβ−ガラ
クトシダーゼの開始コドンで始まるフレームと
〔21−L〕hUG構造遺伝子の読み取りフレームと
が一致するように設定すればよい。しかしなが
ら、この緊ぎ手となる部分は最終的に上記の機能
を有すればよいのであり、例えば上記の構造遺伝
子を合成した方法を用いて合成して得ることが可
能である。本発明の一具体例では、このような合
成法の一例として以下に述べる工夫を施してこの
緊ぎ手を得た。 まず、制限酵素EcoRIおよびSmaIの認識部位
を有する下記の一本鎖DNAを設計する。 5′AATTCCCGGG3′ この一本鎖DNAはそれ自体の相補正のために、
多くのニツク(DNAの二本鎖の一方に生じたす
き間のない切断点)を有する長鎖の二本鎖DNA
構造をとる。したがつて、DNAリガーゼにより、
すき間のない二本鎖DNAとすることができるの
である。そしてこのようにして得られた二本鎖
DNAは制限酵素EcoRIおよびSmaIの認識部位を
交互に有する二本鎖ポリDNAである。 (3) 方向性の判定 プラスミドに組込まれた〔21−L〕hUG遺伝
子の方向性の判定は、構造遺伝子内に含まれる特
定の部位を認識する酵素(Bgl)でその部位を
切断し、構造遺伝子外の特定の位置に別の酵素で
切断を入れ、得られた断片のサイズを分析するこ
とにより行なうことができる。 4 形質転換 (1) 宿主菌 前記のような〔21−L〕hUG構造遺伝子を組
込んだプラスミド組換体pLE、たとえば
pLE6527、を用いて形質転換させる宿主細胞の一
具体例は、エシリキア・コリに属する大腸菌株
XA35である。大腸菌株XA35は、公知株である
ところの大腸菌K12株(Microbiological
Reviews、44,1〜56(1980))の誘導体であり、
下記に示す性質を有し、他の性質についてはK12
株のそれと異なるところのない菌株である。 〔Smr,Lac-(i3 -,z)〕 本発明による〔21−L〕hUG構造遺伝子を組
込んだプラスミドによる形質転換は、あらゆる大
腸菌株において可能である。しかしながら、〔21
−L〕hUGをβ−ガラクトシダーゼとの融合タ
ンパクとして回収するためには正常なβ−ガラク
トシダーゼの混在をふせぐために宿主菌としてβ
−ガラクトシダーゼの遺伝子を欠失している株を
用いるのが好ましい。また、一般的には、ラクト
ースオペロンのリプレツサー遺伝子(i遺伝子)
によつてタンパクの産生が制御されているのであ
るが、野生型の大腸菌を用いる場合にはインデユ
ーサー(例えばIPTG)によつて融合タンパクを
誘導産生させることができ、i遺伝子の高温感受
性株を用いる場合には温度を上昇させることによ
り融合タンパクを誘導させることができ、i遺伝
子の欠損株を用いる場合には常に融合タンパクを
産生させることができる(The operon、31
(1980))。 本発明による一具体例では、β−ガラクトシダ
ーゼの遺伝子を欠失しかつi遺伝子の欠損株であ
るところの大腸菌株XA35を用いた。 (2) 形質転換 形質転換操作そのものは、分子生物学の分野で
公知の常法に従つて行なうことができる具体的な
方法については、後記の実験例を参照されたい。 (3) 形質転換体 形質転換体の一具体例は、大腸菌株XA35を
pLE6527によつて形質転換させて得た形質転換体
であつて、本発明ではこれを大腸菌株XA35
(pLE6527)と命名している。 この形質転換体大腸菌XA35(pLE6527)は後
記に述べる実験例によつて明らかなように前記大
腸菌株XA35とは下記の性質において異なる菌株
である。 〔Smr,Lac+〕 5 〔21−L〕hUGの産生 このように形質転換した菌を常法に従つて培養
すれば、〔21−L〕hUGが産生される。具体的な
方法については、後記の実験例を参照されたい。 実験例 〔21−L〕hUG遺伝子の設計 添付の遺伝子設計図に示すように設計した遺伝
子は鎖長10〜17の長さのフラグメントに分け、そ
れぞれES1〜5、E1〜E21とした。 設計の手順は、下記の通りである。 (1) コドンの選定 図面に示した通りにコドンを選ぶ。 (2) N末端にメチオニンのコドンATGを付加し、
合成されたポリペプチドがこの場所で化学的処
理(+CN Br)により切断されるようにする。 (3) C末端には、余計なペプチドが産生されない
ように1個の翻訳終了コドン(TAGまたは
TGA)を付加する。 (4) 21番目のアミノ酸(メチオニン)をロイシン
に換える。というのは、メチオニンが存在する
とCNBr処理で切断され、完全な形で〔21−
L〕hUGが得られないからである。 (5) ペプチドの変換修飾のため適当な場所に制限
酵素認識部位EcoRI,HinfI,AluI,RsaIおよ
びBglを1ケ所ずつ有するような塩基配列と
した。 (6) この遺伝子のコドンは、大腸菌でよく使われ
るものをできるだけ使用した。 フラグメントの化学合成 1 合成 フラグメントの合成は文献記載の方法に従つて
固相法によつて行なつた。しかし、合成フラグメ
ントの単離精製は以下に示す改良法で行なつた。 各フラグメントの合成収率は、20〜60%であつ
た。 【表】 【表】 2 精製 合成終了後の樹脂20mgに対し、0.5Mαピコリン
アルドキシムテトラメチルグアニジン、およびジ
オキサン:水(1:1)混合物200μlを加え、室
温一夜放置し、ついで濃アンモニア水20mlを加
え、密栓して一夜55℃で放置する。これを過し
て樹脂を分離し、液を濃縮しゲル過を行な
う。50mMTEAB緩衝液PH7.5で溶出し、ボイド
ボリユームに溶出してくるものを集める。これを
濃縮し、逆相カラムC−18(ウオータース「ラジ
アルパツクA」径8cm×10cm)のHPLCにアプラ
イし、0.01MエチレンジアミンジアセテートPH
7.8の緩衝液中、アセトニトリルの10%から32%
までの濃度勾配を2ml/minの流速で16分かけて
溶出させる。11〜12分で溶出されるものを集め
る。このとき、トリチル基のないオリゴヌクレオ
チドはインジエクシヨンピークとして溶出され
る。溶出液を濃縮し、80%酢酸1mlを加え、室温
で15分間放置する。トリメタノールを抽出除去
し、水層を濃縮し、再び逆相カラムにかける。先
と同じ条件下にアセトニトリルの0%から20%ま
での濃度勾配で溶出を行ない、12〜13分で溶出さ
れるもの(すなわちフラグメント)を集める。次
にこのフラグメント10pmol(0.001A260)を20mM
トリス塩酸緩衝液(PH7.5)、10mM MgCl2、
10mM DTT、0.5mM ATPの混合物に溶解し、
〔γ32P〕ATP10μci(3.3pmol)およびT4ポリヌク
レオチドキナーゼ1μl(4.5単位)を加え、全量を
20μlとし、37℃で20分加温した後、100℃で2分
加熱して反応を止める。 以上のようにして精製された各フラグメント
は,20%ゲル電気泳動及び2次元ホモクロマトグ
ラフイー塩基配列決定法(Nucl.Acids Res.,
1、331(1974)、Nucl.AcidsRes.,6,2069
(1979))により確認した。 フラグメントの結合反応 合成したフラグメントは、下記のように4つの
ブロツクに分けて結合反応を行なつた。ブロツク フラグメント A Es−1、Es−2、Es−3、Es−4、Es−
5、E−1 B E−2、E−3、E−4、E−5、E−6、
E−7、E−8 C E−9、E−10、E−11、E−12、E−13、
E−14、E−15 D E−16、E−17、E−18、E−19、E−20、
E−21 ブロツクAの場合は、Es−1、Es−2、Es−
3、Es−4、Es−5およびE−1各100pmol
(0.01A260を20mMトリス塩酸緩衝液(PH7.5)、
10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM ATPの
混合液に溶解し全量を50μlとしT4−ポリヌクレ
オチドキナーゼ(8単位)を加えて37℃で1時間
反応を行なつた後、リン酸化を行ない、次いで
T4−DNAリガーゼ(900単位)を加え14℃で一
夜(結合)反応を行なつてブロツクAの2量体を
得た。ブロツクDについてもブロツクAと同様の
方法で合成を行ない、同様に2量体を得た。ブロ
ツクB,Cについては、同様な方法でそれぞれ単
量体を得た。 次いでブロツクAの2量体およびブロツクBの
反応液を混合し、0.5mM ATPを1/10容、T4
−DNAリガーゼ(900単位)を加え、14℃で一夜
反応を行つた。反応終了後3M酢酸ナトリウム
(PH5.5)を1/10容加え、3倍容のエタノールを
加え、−70℃で15分間冷却した後、12000rpmで遠
心を行ない沈殿を得た。この沈殿について10%ポ
リアクリルアミド電気泳動を行ないフラグメント
〔A+B〕の2量体を分離し、フラグメント〔A
+B〕の2量体に相当するバンドを切り出した後
さらに1.5%低融点アガロースゲルを用いてフラ
グメント〔A+B〕を回収した。ブロツクCおよ
びブロツクDについても同様の操作を行ないフラ
グメント〔C+D〕の2量体を回収した。以上の
ようにし得られたフラグメント〔A+B〕および
フラグメント〔C+D〕を1:1の割合で混合し
上記と同様の方法で両フラグメントの結合反応を
行なつた。この反応混合液についてエタノール沈
殿を行ない高度に重合した遺伝子DNAを得た。
沈殿物を10mMトリス塩酸緩衝液(PH8.0)、
7mM MgCl2および20mM KClの混合液に溶解
し、SmaI(5単位)で37℃、1時間反応を行な
い、さらにこの反応混合液に1/10容の100mM
トリス塩酸緩衝液(PH8.0)、70mM MgCl2,
600mM NaClの混合液を加え、Hinc(50単
位)で37℃、1時間処理を行なう。これにより目
的の長さの遺伝子の両端がSma、Hincから
なる鎖長198の遺伝子が得られる。これについて
8%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない上
記と同様の方法で回収した。 pRE1の調製 λplac5DNA(特願57−16734参照)10μgを
100mMトリス塩酸緩衝液PH7.5,7mM MgCl2お
よび50mM NaClの混合物(全量20μl)に加え、
制限酵素EcoRI10単位および制限酵素Hind10
単位を用いて37℃で2時間反応させた。ついで1
%アガロースゲル電気泳動で3.8メガダルトンの
DANA断片を精製した。 pBR322DNA1μgを上記と同様の混合物(全両
10μl)に加え、制限酵素EcoRI1単位および制限
酵素Hind1単位を用いて37℃で2時間反応さ
せた。ついで1%アガロースゲル電気泳動で2.6
メガダルトンのDNA断片を精製した。 得られたそれぞれの断片を50mMトリス塩酸緩
衝液PH7.8,10mM MgCl2,20mM DTT、およ
びlmM ATPの混合物(全量10μl)に加え、
T4DNAリガーゼ30単位を用いて14℃,24時間反
応させた。 この反応混合液を用いて大腸菌株XA35の形質
転換を行なつた。形質転換はクシユナーの方法
(Genetic Engineering、1978,17(1978))にし
たがい、実験はP−1物理的封じ込め設備内で行
なつた(組み換えDNA実験指針)。 形質転換株を、Ap(20μg/ml)を含有するL
−プレート(1%バクトトリプトン、0.5%バク
トイースト抽出物、0.5%Nacl、1.5%バクトアガ
ー)上で選択し、得られた形質転換株をEMB−
lacのプレート(2.25%バクトEMBブロース、1.5
%バクトアガー)にレプリカし、Lac+(赤色のコ
ロニー)となつた株をさらに選択した。これらの
株のうち任意に5株を選びプラスミドを調製し、
数種の制限酵素で解析したところ、4株のプラス
ミドがλplac5DNAの3.8メガダルトン断片と
pBR322DNAのEcoRI−Hind断片が結合して
いるものであることが確かめられた。これらのう
ち1株を大腸菌XA35(pRE1)と命名した。即
ち、この形質転換体大腸菌XA35(pRE1)は前述
の大腸菌株XA35とは下記の性質において異る菌
株である。 〔Amr,Lac+〕 pRS23の調整 pRE1(30μg)を100mlトリス塩酸緩衝液(PH
7.5)、7mM MgCl2,50mM NaClの混合溶液中
で制限酵素EcoRI(4単位)を用い37℃、1時間
反応を行つた後、さらにバクテリアルアルカライ
ンホスフアターゼ(bacterial alkaline phos−
phatase)5単位を用いて37℃で30分反応を行な
う。反応終了後、等量のフエノール(これは
10mMトリス塩酸、1mM EDTA(PH8.0)の混合
溶液で飽和させたもの)で2回抽出を行ない、さ
らにエタノール沈殿を行なう。このとき得られた
沈殿を20mMトリス塩酸緩衝液(PH7.5)、10mM
MgCl2,0.5mM DTT、0.5mM ATPの混合物液
に溶解し、2等量のEcoRI−Smaリンカー
(AATTCCCGGG)を加え、T4−DNAリガーゼ
(300単位)を用いて14℃で一夜反応を行なう。こ
の反応混液を用いて大腸菌XA35の形質転換をク
シユナーの方法(Genentic Enginerring1978,
17(1978))に従つて行ない、アンピシリン
(20μg/ml)を含有するL−プレート上で形質転
換株を選択した。ここで得られた形質転換株を
EMB−lacのプレートにレプリカし、Lac+,
Amp+の株をさらに選択した。これらの株からプ
ラスミドDNAを調製し、制限酵素Smaおよび
Eco RIで切断されるプラスミドDNAを得た。 pRE6527の調製およびクローニング pRS23(6.8μg)10mMトリス塩酸緩衝液(PH
8.0)、7mM MgCI2,20mM KClの混合液中で制
限酵素SmaI(50単位)を37℃1時間作用させた。 その後さらにバクテリアルアルカラインホスフ
アターゼ(5単位)を加え42℃で30分反応を行な
う。反応終了後、フエノール(上記)で抽出を行
ない、さらにエタノール沈殿を行なつた。沈殿を
20mMトリス塩酸緩衝液(PH7.5)、10mM
MgCl2,5mM DTT、0.5mM ATP混合液に溶
解し、この溶液に〔21−L〕hUGフラグメント
(6pmol)を加えた後、T4−DNAリガーゼ
(1800単位)を用いて14℃で一夜反応を行なつた。
この反応混合液を用いて上記と同様に大腸菌
XA35の形質転換(上記クシユナー法)を行な
い、次いで形質転換株(アンピシリン耐性のも
の)を選択した。この株からプラスミドDNAを
調製し制限酵素Bglにより切断される株を選択
した(プラスミド中にEGFの構造遺伝子が入つ
ていればこの制限酵素認識部位を有するので目的
とするプラスミドを選択する場合の指標となる)。
次に組み込んだ遺伝子の方向性を確認する為、
Hind−Pst処理を行ない正しい方向性をもつ
と思われる株を選択した。 次いでこの株からプラスミドDNAを調製し、
制限酵素Hind−Hinc消化により141塩基対
のフラグメントを生じていることを確認した。こ
のフラグメント(Hind−Hincにより生じた
141塩基対のもの)をフアージM−13mp8のHind
−Hinc部位にクローニングし、dideoxy
sequencing method(Sanger法;Proc.Natl.
Acad.Sci.USA74,5463(1977)により配列を調
べ正しい方向に入つていることを再確認した。 菌の培養 〔21−L〕hUG遺伝子を挿入したプラスミド
組換体pLE6527を含む大腸菌XA35(pLE6527)を
0.4%グリセロール、20μg/mlアンピシリンを添
加した16リツトルのルリア(Luria)培地(1%
バクトートリプトン、0.5%バクトーイーストエ
クストラクト、0.5%NaCl)中で37℃4.5時間通気
下に培養し、対数期後期あるいは定常期初期
(A600=1.4)まで成育させる。その後遠心により
菌体を集め170mlの10mMトリス塩酸緩衝液(PH
8)/10mM MgCl2/5mMβ−メルカプトエタ
ノールで2回洗浄する。以上の操作により、最終
的に湿重量32.6gの菌株が得られた。 〔21−L〕hUGの部分精製 32.6gの菌体を140mlの10mMトリス塩酸緩衝液
(PH8)/1mM MgC2/1mM PMSF(フエニ
ルメチルスルホニルフルオライド)/5mMβ−メ
ルカプトエタノールに懸濁し、インソネーター
200M(久保田)を用い氷冷下に超音波処理を行な
うことにより菌体を破砕した。得られた溶菌液を
27000gで30分遠心し、ペレツトを集め、120mlの
10mMトリス塩酸緩衝液(PH8)/10mM
MgCl2/1mM PMSF/5mMβ−メルカプトエタ
ノールで2回洗浄する。ペレツトを150mlの8M
グアニジンを含む50mMトリス塩酸緩衝液/
1mM EDTA/5mMβ−メルカプトエタノール
中、4℃で一夜攪拌することにより懸濁後、水に
対して透析する。65000g、30分の遠心により透
析によつて生じたペレツトを集め、100mMの7M
尿素を含む20mMトリス塩酸緩衝液(PH8)/
1mM MgCl2/5mMβ−メルカプトエタノールに
懸濁し、再び27000gでで30分遠心を行ない上清
を得る。β−ガラクトシダーゼと〔21−L〕
hUGの融合蛋白質はこの上清部分に含まれてい
ることがSDSゲル電気泳動で確認され、蛋白質定
量の結果2.66gの蛋白が存在すると見積もられた。 〔21−L〕hUG融合蛋白質を含む上清(1g蛋
白相当量)を20mMトリス塩酸緩衝液(PH8)/
1mM MgCl2/5mMβ−メルカプトエタノール/
50mM NaClで平衡化したDEAE−セルロースカ
ラムに添加し、60mlの上記緩衝液で洗浄し非吸
着蛋白質を溶出させた後、食塩濃度を50mMから
300mMに直接的に上昇(各々500mlの緩衝液を
用いた直線的濃度勾配)させることにより〔21−
L〕hUG融合蛋白質を溶出させた。融合蛋白質
を含む画分を集め、透析を行ない尿素を除くこと
により融合蛋白を不溶化し、遠心により
(6500g、30分)集めた。得られた143mgの部分精
製融合蛋白質を70mlの70%ギ酸に溶解後1.8gの
臭化シアンを加え、室温で20時間振とうしながら
反応させた。反応液をエバポレーターを用いて濃
縮後50mlの蒸留水を加え冷結乾燥を行なつて、
ギ酸、未反応の臭化シアンおよび副生成物のシア
ン化メチル、臭化水素などを完全に除去した。臭
化シアン処理により得られた残渣を水で抽出後透
析を行ない最終的に14.1mgのペプチドを得た。 〔21−L〕hUGの同定および生物検定 角膜細胞、ヒト繊維芽細胞、ヒト類表皮癌細
胞、マウス3T3細胞、ヒト絨毛細胞ではじめ多く
の細胞膜表面にはマウスEGF(mEGF)および
hEGF/hUGと特異的に結合するリセプターが存
在することが明らかにされている。EGFは膜表
面上のリセプターと結合した後、エンンドサイト
ーシスにより細胞内にリセプターとの複合体の形
で取り込まれ、上皮細胞、繊維芽細胞の増殖、分
化の促進、マウスの目瞼開裂・切歯出現の促進、
胃酸分泌抑制、DNA・蛋白合成促進、カリウム
イオン・デオキシグルコースなどのイオン輸送、
低分子物質輸送の促進などの種々の生理作用を示
すことが報告されている。(Ann.Rev.Biochem.、
48,193(1979))これらの知見に基づいて〔21−
L〕hUGの同定および生物検定を行なつた。 (1) ラジオリセプターアツセイ(RRA) 〔21−L〕hUGのRRAはヒト鼻咽腔上皮癌細
胞由来のKB細胞(ATCC No.CCL17)を用い、
A.キング(King)らの方法(J.B.C.、257,3053
(1982))を参考にして行なつた。すなわち、
800mlのフラスコを用いDME倍地中で単層培養
する。倍地を除き0.05%のEDTAを含むリン酸平
衡化塩溶液(PBS)を用いて細胞をはがし細胞
懸濁液をつくる。その後20mM Hepes(PH7.4)
を含むHanks平衡塩類溶液(HBSS)で2回細胞
を洗浄する。細胞をBinding solution(DME倍
地・20mM Hepes(PH7.4)・0.35g/1NaHCO3・
100μG/mlストレプトマイシン)に懸濁後、細
胞数を計算して30万〜40万/0.2ml Binding
solutionとなる用調製し、チユーブに0.2mlずつ
分注する。種々の濃度の〔21−L〕hUGおよび
125I−mEGF(マウスEGF)を含む試料液0.2mlを
チユーブに加え37℃で1時間インキユベートす
る。細胞を氷冷したHBSSで3回洗浄後10%の
TCAに懸濁し、グラスフイルターを用いて細胞
を固定する。アセトンでTCAを除いた後、液体
シンチレーシヨンカウンターを用いて計数する。 比較のため、mEGF(東洋紡)およびβ−ガラ
クトシダーゼを臭化シアン処理して得られたペプ
チド画分についても同様な実験を行なつた。第2
図にその結果を示す。図から明らかなように〔21
−L〕hUGを含むペプチド画分125I−mEGFと
KB細胞EGFリセプターとの結合を拮抗的に阻害
し、その用量−反応曲線はmEGFのそれとよく一
致している。 マウス3T3細胞を用いたRRAについてもC.サ
ベージ(Savage)らの方法(Anal.Biochem.、
111,195(1981))に基づいて行ない、KB細胞を
用いたRRAを同様の結果を得た。 (2) マウス3T3細胞を用いた増殖促進活性を指標
とした生物検定 細胞増殖促進活性の測定は以下の操作によつて
行なつた。すなわち、マウス3T3細胞を25cm2フラ
スコに単層倍養後0.02%EDTA・0.05%トリプシ
ンを含むカルシウム、マグネシウムフリー−
HBSS(CMF−HBSS)で処理し細胞浮遊液を作
る。細胞をCMF−HBSSで戦浄した後、0.5%牛
胎仔血清(FBS)を含むDME倍地に懸濁し生細
胞数を測定する。細胞浮遊液2×104細胞数/ml
となる様0.5%FBS−DME倍地で希釈後1mlの細
胞浮遊液を直径35mmのデイシユにまき一夜炭酸ガ
スインキユベーター中でインキユベートする。
種々の濃度の〔21−L〕hUGを含むペプチド画
分あるいは標品のmEGFを0.5%FBS−DME倍地
に溶かし、ミリポアフイルター(type GV,
wpo2500)を用いて過し、1mlずつ上記細胞浮
遊液中に加える。炭酸ガスインキユベーター中
(5%CO2−95%空気、37℃)で4日間インキユ
ベートした後、トリパンブルーで生細胞を染色し
血球計算板を用いて生細胞数を計数する。得られ
た結果を第3図に示す。図から明らかな様に、そ
の用量−反応曲線はmEGFのそれとよく一致して
いる。なお対照として行なつたβ−ガラクトシダ
ーゼの臭化シアンペプチド画分は増殖促進活性を
全く示さなかつた。 (3) チミジンの取り込みを指標とした生物検定 チミジンの取り込みはAharon Aharonovらの
方法(J.B.C.、253,3970(1978))、Jimenez de
Asuaらの方法(PNAS、72,2724(1975))など
を改変して行なつた。すなわち、0.5mlの5%
FBS−DME倍地をいれた24マルチウエルデイシ
ユに6×103個のマウス3T3細胞をまき5日間培
養し、コンフルーエントモノレノアー細胞を作成
する。倍地を捨てPBSで洗浄後0.5mlの0.5%FBS
−DME倍地を加え一夜インキユベートする。
種々の濃度の〔21−L〕hUGあるいはmEGFを
含む0.5mlの0.5%FBS−DME倍地を加え18時間
インキユベートする。200nciの〔3H〕−チミジン
を加え、55℃で30分インキユベートした後、細胞
を20mM Hepes(PH7.4)を含む冷HBSSで2回洗
浄し、5%TCAで更に2回洗浄する。200μlの
1NNaOHを加え、55℃で30分インキユベートす
ることによりDNAを溶解させる。そのDNA溶液
50μlをとり25μlの2N HClを加え中和後とり込ま
れたチミジンの放射活性を液体シンチレーシヨン
カウンターで測定する。 得られた結果を次表に示す。 【表】 この表から明らかなように、〔21−L〕hUGペ
プチド画分はチミジンの取り込みを著しく促進し
た。 (4) 高速液体クロマトグラフイー(HPLC)を用
いた〔21−L〕hUGの精製および同定 〔21−L〕hUGを含むペプチド画分および
〔21−L〕hUG遺伝子の挿入のないベクタープラ
スミドのみを含む大腸菌XA35(pREl)から同様
な処理により得られたペプチド画分をマイクロボ
ンダパツクC−18カラム(0.4×30cm、ウオータ
ーズ)を用いたHPLGにより分析した。クロマト
グラフイーは50℃で0.1%トリフルオロ酢酸
(TFA)中でアセトニトリル濃度を20%から50%
に毎分0.75%2ml/分の流速で上昇させることに
より行なつた。 得られた溶出曲線は第4図に示す。図から明ら
かなように大腸菌XA35(pREl)から得られたペ
プチド画分には存在せず、〔21−L〕hUGを含む
ペプチド画分のみに認められる2本のピーク(保
持時間18.4分、19.3分)が検出された。この画分
を分取し、RRAおよび3T3細胞増殖促進活性を
指標として生物検定を行なつたところ、両方の画
分に活性が認められた、この2本のピークはその
保持時間の差から完全な構造を持つ〔21−L〕
hUGおよびC末端のArg,Leuの欠損した〔21−
L〕hUG1-51あるいは末端の5つのアミノ酸の欠
けた〔21−L〕hUG1-48ではないかと推定される
(Anal.Biochem.、111,195(1981))、J.B.C.247,
7609(1972))。 また、以上のことから逆相HPLCを用いること
により、〔21−L〕hUGの精製が可能であること
が示されたことになる。 さらに具体的に示せば、第4図で得られた〔21
−L〕hUGを再度逆相HPLCにかけて分取し、
(単一ピーク)、6N塩酸で加水分解し、アミノ酸
分析を行なつてアミノ酸組成を確認した(次表)。
なお被分析試料は電気泳動でも単一バンドを与え
た。 【表】 【表】 また、C末端部のアミノ酸配列をカルボキシペ
プチダーゼW(生化学工業製)により分析したと
ころ(次表) −48 Lys−Trp−Trp−Glu−Leu−53 Arg/OHで
あることを確認した。 【表】 さらに、気相プロテインシークエンサー(アプ
ライド バイオシステムズ470Aプロテイン シ
ークエンサー)によりN端部の配列は下記の通り
であることが確認された。 H−1 Asn( )−Asp( )−5 Glu−( )−Pro−
Leu−( )−10 His−Asp−Gly−Tyr−( )−15 Leu
−His−Asp−Gly−Val−20 ( )−21 Leu− なお2,4および9位はセリンに相当、また
6,14および20位はシステインに相当するので検
出不能であつたと考えられる。 したがつて、以上の結果より〔21−L〕hUG
は同定され、確かに本物質が産生されたことを確
認した。 幽門結紮潰瘍に対する〔21−L〕hUGの効果 EGFの抗ガストリン胃酸分泌抑制作用(Gut、
16,887(1975)に基づき〔21−L〕hUGの潰瘍
に対する効果を検討した。 7週令のウイスター系雄性ラツト(体重230g
前後)を予備飼育し、幽門結紮前24時間絶食した
後、17時間幽門結紮し絶食絶水することにより潰
瘍を生じさせる。幽門結紮処置の30分前に〔21−
L〕hUGを含むペプチド画分(500μg蛋白相当
量)及び対照として生理食塩水を皮下注射により
投与した。1群5匹で実験を行ない、抗潰瘍作用
の評価は潰瘍係数を算出して行なつた。すなわ
ち、幽門結紮によつて生じた潰瘍性のエロジオン
の長径と短径を解剖顕微鏡下で測定し、各々乗じ
たものの総和を1匹のラツトあたりの係数とす
る。 得られた結果を次表に示す。 潰瘍係数(mm2) 〔21−L〕hUG 44.5±18.0 対照(生理食塩水) 79.5±15.1 表から明らかなように、〔21−L〕hUG画分は
潰瘍を抑制する傾向が認められた。 以上の結果から〔21−L〕hUGの活性が確認
された訳であるが、同時に本発明によつて回収さ
れた〔21−L〕hUGが天然のhUGあるいは
mEGFと同様の位置に三つのジスルフイド結合を
有することも実質的に確認されたことになる。と
いうのは、三つのジスルフイド結合は生理活性に
必須のものであり、すなわち文献(Ann.Rev.
Biochem.、48,193−216(1979)およびJ.Biol.
Chem.、247,5928(1972))からも明らかなよう
に、mEGFにおいてジスルフイド結合を還元する
と活性が全く消失し、ひき続き再酸化するとその
酸化の程度に応じて活性が回復することが知られ
ているからである。 遺伝子設計図 第5図は、〔21−L〕hUGのアミノ酸配列およ
びその構造遺伝子を含む遺伝子の塩基配列をブロ
ツクA,B,CおよびDに分けて示すものであ
る。 a:Hind部位、b:Tag部位、c:
EcoRI部位、d:HinfI部位、e:Alu部位、
G:Rsa部位、g:Bgl部位、h:Hinc部
位 【表】 【表】
第1図は、〔21−L〕hUG構造遺伝子を含むプ
ラスミド組換体の構築を示す図である。第2図
は、RRAの結果を示す図である。第3図は、細
胞増殖活性を示す図である。第4図は、〔21−L〕
hUG画分の逆相HPLCの溶出曲線を示す図であ
る。第5図は、遺伝子設計図である。
ラスミド組換体の構築を示す図である。第2図
は、RRAの結果を示す図である。第3図は、細
胞増殖活性を示す図である。第4図は、〔21−L〕
hUG画分の逆相HPLCの溶出曲線を示す図であ
る。第5図は、遺伝子設計図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 下記のアミノ酸配列式で表わされるポリペプ
チドからなることを特徴とする、〔21−ロイシン〕
ヒトウロガストロン Asn−Ser−Asp−Ser−Glu−Cys−Pro−
Leu−Ser−His−Asp−Gly−Tyr−Cys−Leu
−His−Asp−Gly−Val−Cys−Leu−Tyr−
Ile−Glu−Ala−Leu−Asp−Lys−Tyr−Ala
−Cys−Asn−Cys−Val−Val−Gly−Tyr−
Ile−Gly−Glu−Arg−Cys−Glu−Tyr−Arg
−Asp−Leu−Lys−Trp−Trp−Glu−Leu−
Arg
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58123520A JPS6028994A (ja) | 1983-07-08 | 1983-07-08 | 〔21―ロイシン〕ヒトウロガストロン |
US06/627,533 US4760023A (en) | 1983-07-08 | 1984-07-03 | [21-leucine] human urogastrone, corresponding gene, corresponding recombinant plasmid, transformed cell and process for production thereof |
EP84107921A EP0131868B1 (en) | 1983-07-08 | 1984-07-06 | (21-leucine) human urogastrone, corresponding gene, corresponding recombinant plasmid, transformed cell and process for production thereof |
DE8484107921T DE3463510D1 (en) | 1983-07-08 | 1984-07-06 | (21-leucine) human urogastrone, corresponding gene, corresponding recombinant plasmid, transformed cell and process for production thereof |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP58123520A JPS6028994A (ja) | 1983-07-08 | 1983-07-08 | 〔21―ロイシン〕ヒトウロガストロン |
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JPS6028994A JPS6028994A (ja) | 1985-02-14 |
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Family Applications (1)
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---|---|---|---|
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JP (1) | JPS6028994A (ja) |
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