JP2780159B2 - 機能性ポリペプチド遺伝子 - Google Patents
機能性ポリペプチド遺伝子Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規ポリペプチド
遺伝子に関し、更に詳しくヒトフィブロネクチンのヘパ
リン結合ドメインペプチドをコードする遺伝子に関す
る。
遺伝子に関し、更に詳しくヒトフィブロネクチンのヘパ
リン結合ドメインペプチドをコードする遺伝子に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】フィブロネクチン（以下ＦＮと表示す
る）は、血漿や細胞外マトリックスに存在する糖タンパ
ク質で、多彩な機能を持つことが知られている〔アニュ
アル レビュー オブ バイオケミストリー（ Annual
Review of Biochemistry) 、第57巻、第 375〜413 頁(1
988)〕。天然のＦＮを創傷治癒、点眼薬等の医薬品や化
粧品に利用する試みがなされているが、血液から採取す
るために、供給に制限があること、コスト高であるこ
と、また、病原性の細菌やウイルス等による汚染の可能
性があること等の理由により、実用化されていない。ま
た、ＦＮの機能ドメインを取出して利用することも同様
の理由から実用化されていない。
る）は、血漿や細胞外マトリックスに存在する糖タンパ
ク質で、多彩な機能を持つことが知られている〔アニュ
アル レビュー オブ バイオケミストリー（ Annual
Review of Biochemistry) 、第57巻、第 375〜413 頁(1
988)〕。天然のＦＮを創傷治癒、点眼薬等の医薬品や化
粧品に利用する試みがなされているが、血液から採取す
るために、供給に制限があること、コスト高であるこ
と、また、病原性の細菌やウイルス等による汚染の可能
性があること等の理由により、実用化されていない。ま
た、ＦＮの機能ドメインを取出して利用することも同様
の理由から実用化されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ＦＮにはヘパリンに結
合する領域（ヘパリン結合ドメイン）が２ヶ所存在し、
１ヶ所はＮ末端付近にあり、結合にCaイオンが必要であ
ることが知られている。もう一方の領域はＣ末端付近に
あり、この領域のヘパリンに対する結合活性は、前述の
領域よりも強く、しかもCaイオンに影響されない。最近
の研究からＦＮのヘパリン結合ドメインが、細胞接着ド
メインと同様に線維芽細胞、内皮細胞、ある種のガン細
胞等の接着、伸展、移動に重要な役割を果していること
が次第に明らかとなってきた。ＦＮのヘパリン結合ドメ
インは細胞の表層にあるプロテオグリカンに結合して、
細胞と細胞外マトリックスとの相互作用を引起すことに
より、細胞の接着、伸展、移動等に寄与すると考えられ
る。したがって、細胞接着活性とペパリン結合活性の両
機能を持つポリペプチドは、細胞と細胞外マトリックス
の両方に結合して創傷部の組織の修復や、恒常性の維持
に寄与し、医薬品としての用途が期待できる。本発明の
目的は、ＦＮのヘパリン結合活性を持つ、新規な機能性
ポリペプチドをコードする遺伝子、それを用いた該機能
性ポリペプチドの遺伝子工学的な製造方法を提供するこ
とにある。
合する領域（ヘパリン結合ドメイン）が２ヶ所存在し、
１ヶ所はＮ末端付近にあり、結合にCaイオンが必要であ
ることが知られている。もう一方の領域はＣ末端付近に
あり、この領域のヘパリンに対する結合活性は、前述の
領域よりも強く、しかもCaイオンに影響されない。最近
の研究からＦＮのヘパリン結合ドメインが、細胞接着ド
メインと同様に線維芽細胞、内皮細胞、ある種のガン細
胞等の接着、伸展、移動に重要な役割を果していること
が次第に明らかとなってきた。ＦＮのヘパリン結合ドメ
インは細胞の表層にあるプロテオグリカンに結合して、
細胞と細胞外マトリックスとの相互作用を引起すことに
より、細胞の接着、伸展、移動等に寄与すると考えられ
る。したがって、細胞接着活性とペパリン結合活性の両
機能を持つポリペプチドは、細胞と細胞外マトリックス
の両方に結合して創傷部の組織の修復や、恒常性の維持
に寄与し、医薬品としての用途が期待できる。本発明の
目的は、ＦＮのヘパリン結合活性を持つ、新規な機能性
ポリペプチドをコードする遺伝子、それを用いた該機能
性ポリペプチドの遺伝子工学的な製造方法を提供するこ
とにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、下記式（化１）で示されるアミノ
酸配列で表される機能性ポリペプチドをコードする遺伝
子に関する。
発明の第１の発明は、下記式（化１）で示されるアミノ
酸配列で表される機能性ポリペプチドをコードする遺伝
子に関する。
【０００５】
【化１】 Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Lys Phe Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr IIe Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr
【０００６】第２の発明は、前記ポリペプチドをコード
する遺伝子を含有せしめた組換体プラスミドに関する。
する遺伝子を含有せしめた組換体プラスミドに関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】以下、本発明を具体的に説明す
る。ヒトＦＮの遺伝子構造についてはジ エンボ ジャ
ーナル（ The EMBO Journal ) 、第４巻、第1755〜1759
頁(1985)に記載されている。また、その細胞接着ドメイ
ン及びヘパリン結合ドメインをコードするcDNAクローン
（pLF2、pLF3、pLF4及びpLF5）についてはバイオケミス
トリー（ Biochemistry ) 、第25巻、第4936〜4941頁(1
986)に記載されている。本発明者らは、pLF5から、細胞
接着ドメインに対するcDNA断片を取出し、これを発現ベ
クターに接続して大腸菌に導入することにより、細胞接
着活性ポリペプチド及びその製造方法を開発し特許出願
した〔特願昭63−31820 号（特開平１−206998号）〕。
本発明で必要とされる細胞接着ドメインのcDNAは、特開
平１−206998号公報に記載されている組換体プラスミド
pTF7021 を用いることができる。pTF7021 はＦＮのPro
1239-Met1517 （ 279アミノ酸残基）を発現するプラス
ミドである。pTF7021 の翻訳領域のＣ末端の終止コドン
の直前にクローニングサイト、例えば NcoＩサイトを導
入することにより、細胞接着ドメインのcDNAと他のドメ
インのcDNAを連結させることができる。
る。ヒトＦＮの遺伝子構造についてはジ エンボ ジャ
ーナル（ The EMBO Journal ) 、第４巻、第1755〜1759
頁(1985)に記載されている。また、その細胞接着ドメイ
ン及びヘパリン結合ドメインをコードするcDNAクローン
（pLF2、pLF3、pLF4及びpLF5）についてはバイオケミス
トリー（ Biochemistry ) 、第25巻、第4936〜4941頁(1
986)に記載されている。本発明者らは、pLF5から、細胞
接着ドメインに対するcDNA断片を取出し、これを発現ベ
クターに接続して大腸菌に導入することにより、細胞接
着活性ポリペプチド及びその製造方法を開発し特許出願
した〔特願昭63−31820 号（特開平１−206998号）〕。
本発明で必要とされる細胞接着ドメインのcDNAは、特開
平１−206998号公報に記載されている組換体プラスミド
pTF7021 を用いることができる。pTF7021 はＦＮのPro
1239-Met1517 （ 279アミノ酸残基）を発現するプラス
ミドである。pTF7021 の翻訳領域のＣ末端の終止コドン
の直前にクローニングサイト、例えば NcoＩサイトを導
入することにより、細胞接着ドメインのcDNAと他のドメ
インのcDNAを連結させることができる。
【０００８】本発明による新規な機能性ポリペプチドの
具体例の１つとしては、一般式C277-(Met)n -H271-X
〔式中C277は、ヒト ＦＮの細胞接着ドメインのPro
1239-Ser1515 に相当する277 アミノ酸ペプチド残基を
示し、下記式（化２）：
具体例の１つとしては、一般式C277-(Met)n -H271-X
〔式中C277は、ヒト ＦＮの細胞接着ドメインのPro
1239-Ser1515 に相当する277 アミノ酸ペプチド残基を
示し、下記式（化２）：
【０００９】
【化２】1239 Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg 1515 Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser
【００１０】で表される配列を有し、H271はヒト ＦＮ
のヘパリン結合ドメインのAla1690-Thr1960 に相当する
271アミノ酸ペプチド残基を示し、前記式（化１）で表
される。Ｘは下記式（化３）：
のヘパリン結合ドメインのAla1690-Thr1960 に相当する
271アミノ酸ペプチド残基を示し、前記式（化１）で表
される。Ｘは下記式（化３）：
【００１１】
【化３】Asp-Glu-Leu-Pro-Gln-Leu-Val-Thr-Leu-Pro-Hi
s-Pro-Asn-Leu-His-Gly-Pro-Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-
Ser-Thr
s-Pro-Asn-Leu-His-Gly-Pro-Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-
Ser-Thr
【００１２】で表されるペプチド残基、あるいはその一
部又は全部が欠失した基を示し、 Metはメチオニン残基
を示し、ｎは１又は零の数を示す〕で表されることを特
徴とする機能性ポリペプチドが挙げられる。
部又は全部が欠失した基を示し、 Metはメチオニン残基
を示し、ｎは１又は零の数を示す〕で表されることを特
徴とする機能性ポリペプチドが挙げられる。
【００１３】ヘパリン結合ドメインについてはトリプシ
ン、サーモライシン、カテプシンＤ等によって分解され
て得られた断片が報告されており、その大きさは、29kD
から38kDに及んでいる。ドメインの詳しい特定はなされ
ていないが、一般的には約90アミノ酸から成る III型類
似配列を３個と、それに続く IIIcs型配列の一部を含む
断片が知られている。本発明の前記一般式に記載されて
いるＸはIIIcs 型配列の一部に相当する。ヘパリン結合
活性にはIIIcs を必要としないが、ある種のリンパ系の
細胞の接着には、IIIcs 配列が必要とする考え方もあ
る。本発明者らはヘパリン結合ドメインのIII 型類似配
列を３個含む断片（本発明の前記一般式に記載されてい
るH271に相当）と、更にIIIcs の一部を含む断片（一般
式のH271-X）を大腸菌で発現させ、ヘパリン結合活性及
び細胞接着活性を測定した結果、両者共、ヘパリン結合
活性を有すると共に、ＢＨＫ細胞に対する接着活性を有
しており、更にH271-Xでは、接着と伸展活性が増強され
ていることを見出した。
ン、サーモライシン、カテプシンＤ等によって分解され
て得られた断片が報告されており、その大きさは、29kD
から38kDに及んでいる。ドメインの詳しい特定はなされ
ていないが、一般的には約90アミノ酸から成る III型類
似配列を３個と、それに続く IIIcs型配列の一部を含む
断片が知られている。本発明の前記一般式に記載されて
いるＸはIIIcs 型配列の一部に相当する。ヘパリン結合
活性にはIIIcs を必要としないが、ある種のリンパ系の
細胞の接着には、IIIcs 配列が必要とする考え方もあ
る。本発明者らはヘパリン結合ドメインのIII 型類似配
列を３個含む断片（本発明の前記一般式に記載されてい
るH271に相当）と、更にIIIcs の一部を含む断片（一般
式のH271-X）を大腸菌で発現させ、ヘパリン結合活性及
び細胞接着活性を測定した結果、両者共、ヘパリン結合
活性を有すると共に、ＢＨＫ細胞に対する接着活性を有
しており、更にH271-Xでは、接着と伸展活性が増強され
ていることを見出した。
【００１４】ヘパリン結合ドメインをコードするcDNA
は、pLF2435 から取出すことができる。pLF2435 は、前
記pLF2、pLF3、pLF4及びpLF5から再構築されたプラスミ
ドで、ＦＮのヘパリン結合ドメインをコードするcDNAを
含んでいる。但し、IIIcs 部分に相当するcDNAは含んで
いないので、Ｘに対応するＤＮＡ配列は化学合成によっ
て構築する必要がある。pLF2435 から必要なcDNA断片を
制限酵素で切出し、５′側に開始コドンを含む合成ＤＮ
Ａを、また、３′側には、終止コドンを含む合成ＤＮＡ
をＤＮＡリガーゼで連結した後、適当な発現ベクターに
接続することにより、 III型類似配列が３個つらなった
配列を有するペプチドを発現するプラスミドを得ること
ができる（図１参照）。すなわち図１は、H271を発現す
るプラスミドpHD101を構築するための工程図である。こ
のプラスミドと、IIIcs の一部（Ｘ）に対応する化学合
成ＤＮＡを組合せることにより、更にIIIcs を含むペプ
チドを発現するプラスミドが得られる（図２参照）。す
なわち図２は、H296を発現するプラスミドpHD102を構築
するための工程図である。
は、pLF2435 から取出すことができる。pLF2435 は、前
記pLF2、pLF3、pLF4及びpLF5から再構築されたプラスミ
ドで、ＦＮのヘパリン結合ドメインをコードするcDNAを
含んでいる。但し、IIIcs 部分に相当するcDNAは含んで
いないので、Ｘに対応するＤＮＡ配列は化学合成によっ
て構築する必要がある。pLF2435 から必要なcDNA断片を
制限酵素で切出し、５′側に開始コドンを含む合成ＤＮ
Ａを、また、３′側には、終止コドンを含む合成ＤＮＡ
をＤＮＡリガーゼで連結した後、適当な発現ベクターに
接続することにより、 III型類似配列が３個つらなった
配列を有するペプチドを発現するプラスミドを得ること
ができる（図１参照）。すなわち図１は、H271を発現す
るプラスミドpHD101を構築するための工程図である。こ
のプラスミドと、IIIcs の一部（Ｘ）に対応する化学合
成ＤＮＡを組合せることにより、更にIIIcs を含むペプ
チドを発現するプラスミドが得られる（図２参照）。す
なわち図２は、H296を発現するプラスミドpHD102を構築
するための工程図である。
【００１５】発現ベクターとしては、既存のものはすべ
て利用することができるが、例えばpUC118N/pUC 119N
〔フェブス レターズ（ FEBS Letters ) 、第223 巻、
第 174〜180 頁(1987)、及びその誘導体を用いることに
より好結果を得ることができる。これらのプラスミドを
大腸菌に導入することにより、ヘパリン結合ドメインポ
リペプチドを発現させ、その性質を調べることができ
る。次いで、これらのプラスミドからcDNA断片を取出
し、前記pTF7021 から誘導されたプラスミド（ pTF7520
)の翻訳領域の３′末端 NcoＩサイトに接続することに
より、ＦＮの細胞接着ドメインとヘパリン結合ドメイン
とが連結したポリペプチドを発現する組換体プラスミド
が得られる（図３及び図４参照）。すなわち図３は、C
277-Met-H271 を発現するプラスミドpCH101を構築する
ための工程図であり、図４は、C277-Met-H296 を発現す
るプラスミドpCH 102 を構築するための工程図である。
前記プラスミドにおける連結部には、 NcoＩサイトに由
来するメチオニン残基がリンカーとして含まれる。リン
カーの有無は、本発明の効果を左右するものではない
が、必要とあれば部位特異的変異の手法により、容易に
除去することができる。
て利用することができるが、例えばpUC118N/pUC 119N
〔フェブス レターズ（ FEBS Letters ) 、第223 巻、
第 174〜180 頁(1987)、及びその誘導体を用いることに
より好結果を得ることができる。これらのプラスミドを
大腸菌に導入することにより、ヘパリン結合ドメインポ
リペプチドを発現させ、その性質を調べることができ
る。次いで、これらのプラスミドからcDNA断片を取出
し、前記pTF7021 から誘導されたプラスミド（ pTF7520
)の翻訳領域の３′末端 NcoＩサイトに接続することに
より、ＦＮの細胞接着ドメインとヘパリン結合ドメイン
とが連結したポリペプチドを発現する組換体プラスミド
が得られる（図３及び図４参照）。すなわち図３は、C
277-Met-H271 を発現するプラスミドpCH101を構築する
ための工程図であり、図４は、C277-Met-H296 を発現す
るプラスミドpCH 102 を構築するための工程図である。
前記プラスミドにおける連結部には、 NcoＩサイトに由
来するメチオニン残基がリンカーとして含まれる。リン
カーの有無は、本発明の効果を左右するものではない
が、必要とあれば部位特異的変異の手法により、容易に
除去することができる。
【００１６】得られたプラスミドを大腸菌に導入し、適
当な条件下に培養することにより、目的ペプチドが大腸
菌内に蓄積される。発現の確認にはイムノブロッティン
グが用いられる。組換え大腸菌の全菌体タンパク質を S
DS−ポリアクリルアミド電気泳動で分離した後、泳動パ
ターンをニトロセルロース膜に移し取る。ＦＮの細胞接
着ドメインを認識するモノクローナル抗体（FN-10 、宝
酒造）、及びＦＮのヘパリンドメインを認識するモノク
ローナル抗体〔 IST-1又は IST-2、セラ−ラブ（Sera-L
ab）社販売〕の両方で検出されるバンドが目的のポリペ
プチドである。目的ポリペプチドの精製は、例えば次の
ように行う。組換え大腸菌をＬ−ブロス等の培地に培養
し、集菌した後、超音波処理により、菌体破砕液を得、
これを遠心分離して上清を得る。上清を透析後、DEAEイ
オン交換体のカラムを通過させ、次いでＣＭイオン交換
体及び／又はヘパリン−アガロース等のアフィニティク
ロマトを行う。以上の操作により、目的のポリペプチド
を精製することができる。
当な条件下に培養することにより、目的ペプチドが大腸
菌内に蓄積される。発現の確認にはイムノブロッティン
グが用いられる。組換え大腸菌の全菌体タンパク質を S
DS−ポリアクリルアミド電気泳動で分離した後、泳動パ
ターンをニトロセルロース膜に移し取る。ＦＮの細胞接
着ドメインを認識するモノクローナル抗体（FN-10 、宝
酒造）、及びＦＮのヘパリンドメインを認識するモノク
ローナル抗体〔 IST-1又は IST-2、セラ−ラブ（Sera-L
ab）社販売〕の両方で検出されるバンドが目的のポリペ
プチドである。目的ポリペプチドの精製は、例えば次の
ように行う。組換え大腸菌をＬ−ブロス等の培地に培養
し、集菌した後、超音波処理により、菌体破砕液を得、
これを遠心分離して上清を得る。上清を透析後、DEAEイ
オン交換体のカラムを通過させ、次いでＣＭイオン交換
体及び／又はヘパリン−アガロース等のアフィニティク
ロマトを行う。以上の操作により、目的のポリペプチド
を精製することができる。
【００１７】得られたポリペプチドは、ＢＨＫやＮＲＫ
細胞に対する細胞伸展活性の測定及びヘパリン結合活性
の測定に用いられる。細胞伸展活性の測定は、例えばル
オスラティ（ Ruoslahti )らの方法〔メソッズ イン
エンザイモロジー( Methodsin Enzymology ) 、第82
巻、第 803〜831 頁（1981) 〕に準じて行う。すなわ
ち、試料をコートした後、ＢＳＡでブロッキングしたマ
イクロタイタープレートに、ＢＨＫ又はＮＲＫ細胞の懸
濁液を添加し、37℃で約１時間インキュベートした後、
未吸着の細胞を洗浄した後、ホルマリン固定して、伸展
した細胞の割合を顕微鏡下に測定することにより、細胞
伸展の強さを測定することができる。一方、ヘパリン結
合活性は、ヘパリンを結合した担体、例えばＡＦ−ヘパ
リントヨパール（東ソー）のカラムに試料を吸着させ、
NaClの塩濃度を上昇させて溶出させ、溶出された塩濃度
により、ヘパリンへの結合能力を示すことができる。以
上の測定により、得られたポリペプチドが、ＢＨＫやＮ
ＲＫ細胞に対して強い細胞伸展活性を示すと共に、ヘパ
リンに対しても強い親和性を示すことが証明される。
細胞に対する細胞伸展活性の測定及びヘパリン結合活性
の測定に用いられる。細胞伸展活性の測定は、例えばル
オスラティ（ Ruoslahti )らの方法〔メソッズ イン
エンザイモロジー( Methodsin Enzymology ) 、第82
巻、第 803〜831 頁（1981) 〕に準じて行う。すなわ
ち、試料をコートした後、ＢＳＡでブロッキングしたマ
イクロタイタープレートに、ＢＨＫ又はＮＲＫ細胞の懸
濁液を添加し、37℃で約１時間インキュベートした後、
未吸着の細胞を洗浄した後、ホルマリン固定して、伸展
した細胞の割合を顕微鏡下に測定することにより、細胞
伸展の強さを測定することができる。一方、ヘパリン結
合活性は、ヘパリンを結合した担体、例えばＡＦ−ヘパ
リントヨパール（東ソー）のカラムに試料を吸着させ、
NaClの塩濃度を上昇させて溶出させ、溶出された塩濃度
により、ヘパリンへの結合能力を示すことができる。以
上の測定により、得られたポリペプチドが、ＢＨＫやＮ
ＲＫ細胞に対して強い細胞伸展活性を示すと共に、ヘパ
リンに対しても強い親和性を示すことが証明される。
【００１８】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
【００１９】実施例１ ＦＮのヘパリン結合ドメインAla1690-Thr1960 （ 271ア
ミノ酸残基、以下H-271 と略称する）をコードするcDNA
断片のクローニング（図１参照） (1-1) 合成 DNAアダプターの調製 ヘパリン結合ドメインのcDNA断片をベクターに接続する
ための５′側（鎖長63及び55、図１参照）及び３′側
（鎖長25及び33、図１参照）のアダプターをアプライド
バイオシステムズ社の DNA合成機を用いて合成した。各
々２μg の５′末端をリン酸化した後、アニーリング操
作により、２重鎖とした。 (1-2) NcoＩ-SacＩ断片の調製 ＦＮのH-271 をコードするcDNA断片を含む 5.9kbのプラ
スミドpLF2435 〔バイオケミストリー第25巻、第4936〜
4941頁(1986)〕100 μg をBamHＩ及び SacＩで分解し、
アガロースゲル電気泳動にかけ、1.2 kbの断片を回収し
た。この断片を更に Hae II で分解し、アガロースゲル
電気泳動にかけ、0.46kbの Hae II-SacＩ断片を回収し
た。この断片700 ngと(1-1) で得た５′側アダプター 1
20ngをT4DNAリガーゼ用バッファー、0.5mM ATP 、10mMD
TT 及び 2.8ユニットのT4 DNAリガーゼを含む20μl の
反応液中、16℃、一夜インキュベートした。反応液を65
℃、10分処理した後、Nco Ｉ及び SacＩで分解し、アガ
ロースゲル電気泳動にかけ、0.52 kb の NcoＩ-SacＩ断
片約 120ngを回収した。 (1-3) SacＩ- BamHＩ断片の調製 上記プラスミドpLF2435 の100 μg をEcoO 109Ｉ及び S
acＩで分解し、アガロースゲル電気泳動にかけ、0.52kb
の断片を回収した。この断片を、更に Ban II で分解
し、アガロースゲル電気泳動にかけ、0.27kbの SacＩ-B
an II 断片を回収した。この断片 400ngと(1-1) で得た
３′側アダプター80ngをT4 DNAリガーゼ用バッファー、
0.5 mM ATP、10 mM DTT 及び2.8 ユニットのT4 DNAリガ
ーゼを含む20μl の反応液中、16℃、一夜インキュベー
トした。反応液を65℃、10分処理した後、BamHＩ及び S
acＩで分解し、アガロースゲル電気泳動にかけ、0.30kb
の SacＩ- BamHＩ断片約65ngを回収した。 (1-4) NcoＩ- BamHＩ断片の調製 (1-2) で得た NcoＩ-SacＩ断片 120ngと(1-3) で得た S
acＩ- BamHＩ断片65ngをT4 DNA リガーゼ用バッファ
ー、0.5mM ATP 、10mM DTT及び 2.8ユニットのT4DNAリ
ガーゼを含む20μl の反応液中、16℃、一夜インキュベ
ートした。反応液を65℃、10分処理した後、BamHＩ及び
NcoＩで分解し、アガロースゲル電気泳動にかけ、0.82
kbの NcoＩ- BamHＩ断片約28ngを回収した。
ミノ酸残基、以下H-271 と略称する）をコードするcDNA
断片のクローニング（図１参照） (1-1) 合成 DNAアダプターの調製 ヘパリン結合ドメインのcDNA断片をベクターに接続する
ための５′側（鎖長63及び55、図１参照）及び３′側
（鎖長25及び33、図１参照）のアダプターをアプライド
バイオシステムズ社の DNA合成機を用いて合成した。各
々２μg の５′末端をリン酸化した後、アニーリング操
作により、２重鎖とした。 (1-2) NcoＩ-SacＩ断片の調製 ＦＮのH-271 をコードするcDNA断片を含む 5.9kbのプラ
スミドpLF2435 〔バイオケミストリー第25巻、第4936〜
4941頁(1986)〕100 μg をBamHＩ及び SacＩで分解し、
アガロースゲル電気泳動にかけ、1.2 kbの断片を回収し
た。この断片を更に Hae II で分解し、アガロースゲル
電気泳動にかけ、0.46kbの Hae II-SacＩ断片を回収し
た。この断片700 ngと(1-1) で得た５′側アダプター 1
20ngをT4DNAリガーゼ用バッファー、0.5mM ATP 、10mMD
TT 及び 2.8ユニットのT4 DNAリガーゼを含む20μl の
反応液中、16℃、一夜インキュベートした。反応液を65
℃、10分処理した後、Nco Ｉ及び SacＩで分解し、アガ
ロースゲル電気泳動にかけ、0.52 kb の NcoＩ-SacＩ断
片約 120ngを回収した。 (1-3) SacＩ- BamHＩ断片の調製 上記プラスミドpLF2435 の100 μg をEcoO 109Ｉ及び S
acＩで分解し、アガロースゲル電気泳動にかけ、0.52kb
の断片を回収した。この断片を、更に Ban II で分解
し、アガロースゲル電気泳動にかけ、0.27kbの SacＩ-B
an II 断片を回収した。この断片 400ngと(1-1) で得た
３′側アダプター80ngをT4 DNAリガーゼ用バッファー、
0.5 mM ATP、10 mM DTT 及び2.8 ユニットのT4 DNAリガ
ーゼを含む20μl の反応液中、16℃、一夜インキュベー
トした。反応液を65℃、10分処理した後、BamHＩ及び S
acＩで分解し、アガロースゲル電気泳動にかけ、0.30kb
の SacＩ- BamHＩ断片約65ngを回収した。 (1-4) NcoＩ- BamHＩ断片の調製 (1-2) で得た NcoＩ-SacＩ断片 120ngと(1-3) で得た S
acＩ- BamHＩ断片65ngをT4 DNA リガーゼ用バッファ
ー、0.5mM ATP 、10mM DTT及び 2.8ユニットのT4DNAリ
ガーゼを含む20μl の反応液中、16℃、一夜インキュベ
ートした。反応液を65℃、10分処理した後、BamHＩ及び
NcoＩで分解し、アガロースゲル電気泳動にかけ、0.82
kbの NcoＩ- BamHＩ断片約28ngを回収した。
【００２０】(1-5) pUC118NTの構築 分泌型発現ベクター pIN III-ompA1〔ジ エンボ ジャ
ーナル、第３巻、第2437〜2442頁(1984)〕１μg をBamH
Ｉ及び SalＩで分解し、アガロースゲル電気泳動にか
け、lpp ターミネーター配列を含む0.95kbのBamHＩ-Sal
Ｉ断片を回収した。この断片30ngをあらかじめBamHＩ及
び SalＩで分解して脱リン酸したプラスミドpUC118N 30
ngと共にT4 DNAリガーゼ用バッファー、0.5 mM ATP、10
mM DTT 及び 2.8ユニットのT4 DNAリガーゼを含む20μ
l の反応液中、16℃、一夜インキュベートした。反応液
10μl を用いて大腸菌 HB101を形質転換し、lpp ターミ
ネーター配列をもつプラスミドを得、pUC118NTと命名し
た。なお、pUC118N は、市販のpUC118ベクター〔宝酒造
（株）販売〕の翻訳開始コドン部位に NcoＩサイトを導
入し、更にリボソーム結合部位と開始コドンの距離を８
塩基にしたものである。
ーナル、第３巻、第2437〜2442頁(1984)〕１μg をBamH
Ｉ及び SalＩで分解し、アガロースゲル電気泳動にか
け、lpp ターミネーター配列を含む0.95kbのBamHＩ-Sal
Ｉ断片を回収した。この断片30ngをあらかじめBamHＩ及
び SalＩで分解して脱リン酸したプラスミドpUC118N 30
ngと共にT4 DNAリガーゼ用バッファー、0.5 mM ATP、10
mM DTT 及び 2.8ユニットのT4 DNAリガーゼを含む20μ
l の反応液中、16℃、一夜インキュベートした。反応液
10μl を用いて大腸菌 HB101を形質転換し、lpp ターミ
ネーター配列をもつプラスミドを得、pUC118NTと命名し
た。なお、pUC118N は、市販のpUC118ベクター〔宝酒造
（株）販売〕の翻訳開始コドン部位に NcoＩサイトを導
入し、更にリボソーム結合部位と開始コドンの距離を８
塩基にしたものである。
【００２１】(1-6) NcoＩ- BamHＩ断片のpUC118NTへの
クローニング (1-5) で得たプラスミドpUC118NT 0.1μg を NcoＩ及び
BamHＩで分解後、脱リン酸した。このプラスミド20ngを
(1-4) で得た NcoＩ- BamHＩ断片 20ng と共にT4 DNAリ
ガーゼ用バッファー、0.5mM ATP 、10 mM DTT 及び2.8
ユニットのT4 DNAリガーゼを含む20μl の反応液中、16
℃、一夜インキュベートした。この反応液10μlを大腸
菌 HB101の形質転換に使用した。
クローニング (1-5) で得たプラスミドpUC118NT 0.1μg を NcoＩ及び
BamHＩで分解後、脱リン酸した。このプラスミド20ngを
(1-4) で得た NcoＩ- BamHＩ断片 20ng と共にT4 DNAリ
ガーゼ用バッファー、0.5mM ATP 、10 mM DTT 及び2.8
ユニットのT4 DNAリガーゼを含む20μl の反応液中、16
℃、一夜インキュベートした。この反応液10μlを大腸
菌 HB101の形質転換に使用した。
【００２２】(1-7) 大腸菌の形質転換とプラスミドの確
認 (1-6) で得た反応液10μl を用いて、大腸菌 HB101を形
質転換した。得られた形質転換体中18クローンについて
プラスミドの分析を行った。すなわち、ラピッド法で調
製したプラスミドをBamHＩ及び NcoＩで分解し、アガロ
ースゲル電気泳動にかけ、予想される NcoＩ- BamHＩ断
片（0.82kb) のバンドの生成を調べた。その結果、１ク
ローンに目的のバンドが認められた。また、ダイデオキ
シ法により塩基配列を決定し、目的の配列を含むことを
確認した。この組換体プラスミドをpHD 101 と命名し
た。また、このプラスミドを保持する大腸菌HB101 をEs
cherichia coli HB101／pHD101と表示し、通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託した〔微工研条寄
第2264号（ FERM BP-2264)〕。
認 (1-6) で得た反応液10μl を用いて、大腸菌 HB101を形
質転換した。得られた形質転換体中18クローンについて
プラスミドの分析を行った。すなわち、ラピッド法で調
製したプラスミドをBamHＩ及び NcoＩで分解し、アガロ
ースゲル電気泳動にかけ、予想される NcoＩ- BamHＩ断
片（0.82kb) のバンドの生成を調べた。その結果、１ク
ローンに目的のバンドが認められた。また、ダイデオキ
シ法により塩基配列を決定し、目的の配列を含むことを
確認した。この組換体プラスミドをpHD 101 と命名し
た。また、このプラスミドを保持する大腸菌HB101 をEs
cherichia coli HB101／pHD101と表示し、通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託した〔微工研条寄
第2264号（ FERM BP-2264)〕。
【００２３】(1-8) 組換体からのペプチドの精製 (1-7) で得たEscherichia coli HB101／ pHD101を50μ
g/mlのアンピシリンを添加した５mlのＬ−ブロスを含む
試験管で37℃、一夜振とう培養した。これを 500mlの同
培地を含む２リットルの三角フラスコに接種し、100rpm
で培養を続けた。660nm の吸光度が 0.3の時点で２mMの
IPTG（イソプロピル−β−チオガラクシド）を添加し、
20時間後に集菌した。菌体の一部を用いてイムノブロッ
ティングを行った。すなわち、全菌体タンパク質をSDS-
PAGEで分離し、泳動パターンをニトロセルロースメンブ
ランに転写した後、ＦＮのヘパリン結合ドメインを特異
的に認識するモノクローナル抗体（ IST-1、セラーラブ
社販売）を作用させ、次いでパーオキシダーゼ標識第２
抗体を作用させた。結合した第２抗体のパーオキシダー
ゼ活性を４−クロロ−１−ナフトールと過酸化水素の存
在下で発色させ、29kD付近に目的のペプチドが生産され
ていることを確認した。次に、全菌体ペレットを20mM K
2HPO4 (pH 7.0)、１mM EDTA 、５mMメルトカプトエタノ
ール、３μMパラアミジノフェニルメタンスルホニルフ
ルオライド（p-APMSF)を含む溶液に懸濁して、超音波処
理を行った。12000 rpm で20分遠心して、上清25mlを得
た。これを、20mM K2HPO4 (pH 7.0)バッファーで平衡化
したＣＭ−トヨパール 650Ｍのカラム（15ml）に通し
た。同一バッファーで非吸着画分を除いた後、0.15Ｍ N
aCl を含む20mM K2HPO4 (pH 7.0)バッファーで溶出し、
分画した。溶出液のイムノブロッティングを行い、目的
画分を集めた。次にこの画分を0.15Ｍ NaCl を含む20mM
K2HPO4 ( pH 7.0)バッファーで平衡化したヘパリン−
トヨパール 650Ｍのカラム（80ml）に通した。カラムを
0.2Ｍ NaCl を含む20 mM K2HPO4 (pH 7.0)バッファー
で洗浄後、20 mM K2HPO4 (pH 7.0) バッファー中、0.2
Ｍ NaCl から0.45Ｍ NaCl の直線濃度勾配による溶出を
行い、分画した。イムノブロッティングにより目的画分
を集め、脱塩、凍結乾燥して、電気泳動的にほぼ単一な
ペプチド約20mgを得た。ＡＢＩ社のペプチドシーケンサ
ー477A／120Aを用いて、本ペプチドのＮ末端からのアミ
ノ酸配列を調べたところ、Ala -Ile-Pro-Ala-Pro-Thr-A
sp-Leuの配列が認められ、目的のペプチドのＮ末端配列
と一致した。また、カルボキシペプチダーゼＰ（宝酒
造）消化法により、Ｃ末端はThr であることが確認され
た。
g/mlのアンピシリンを添加した５mlのＬ−ブロスを含む
試験管で37℃、一夜振とう培養した。これを 500mlの同
培地を含む２リットルの三角フラスコに接種し、100rpm
で培養を続けた。660nm の吸光度が 0.3の時点で２mMの
IPTG（イソプロピル−β−チオガラクシド）を添加し、
20時間後に集菌した。菌体の一部を用いてイムノブロッ
ティングを行った。すなわち、全菌体タンパク質をSDS-
PAGEで分離し、泳動パターンをニトロセルロースメンブ
ランに転写した後、ＦＮのヘパリン結合ドメインを特異
的に認識するモノクローナル抗体（ IST-1、セラーラブ
社販売）を作用させ、次いでパーオキシダーゼ標識第２
抗体を作用させた。結合した第２抗体のパーオキシダー
ゼ活性を４−クロロ−１−ナフトールと過酸化水素の存
在下で発色させ、29kD付近に目的のペプチドが生産され
ていることを確認した。次に、全菌体ペレットを20mM K
2HPO4 (pH 7.0)、１mM EDTA 、５mMメルトカプトエタノ
ール、３μMパラアミジノフェニルメタンスルホニルフ
ルオライド（p-APMSF)を含む溶液に懸濁して、超音波処
理を行った。12000 rpm で20分遠心して、上清25mlを得
た。これを、20mM K2HPO4 (pH 7.0)バッファーで平衡化
したＣＭ−トヨパール 650Ｍのカラム（15ml）に通し
た。同一バッファーで非吸着画分を除いた後、0.15Ｍ N
aCl を含む20mM K2HPO4 (pH 7.0)バッファーで溶出し、
分画した。溶出液のイムノブロッティングを行い、目的
画分を集めた。次にこの画分を0.15Ｍ NaCl を含む20mM
K2HPO4 ( pH 7.0)バッファーで平衡化したヘパリン−
トヨパール 650Ｍのカラム（80ml）に通した。カラムを
0.2Ｍ NaCl を含む20 mM K2HPO4 (pH 7.0)バッファー
で洗浄後、20 mM K2HPO4 (pH 7.0) バッファー中、0.2
Ｍ NaCl から0.45Ｍ NaCl の直線濃度勾配による溶出を
行い、分画した。イムノブロッティングにより目的画分
を集め、脱塩、凍結乾燥して、電気泳動的にほぼ単一な
ペプチド約20mgを得た。ＡＢＩ社のペプチドシーケンサ
ー477A／120Aを用いて、本ペプチドのＮ末端からのアミ
ノ酸配列を調べたところ、Ala -Ile-Pro-Ala-Pro-Thr-A
sp-Leuの配列が認められ、目的のペプチドのＮ末端配列
と一致した。また、カルボキシペプチダーゼＰ（宝酒
造）消化法により、Ｃ末端はThr であることが確認され
た。
【００２４】実施例２ ＦＮのIIIcs 領域の一部(Asp1961-Thr1985、25アミノ酸
残基）を含むヘパリン結合ドメイン（Ala1690-Th
r1985 、296 アミノ残基、以下H-296 と略称する）をコ
ードするcDNA断片のクローニング（図２参照） (2-1) Ban II −BamHＩ断片の調製 ＦＮのIIIcs の CS1領域〔ジャーナル オブセル バイ
オロジー（ J. Cell Bio.)第103 巻、第2637〜2647頁(1
986)〕をコードするDNA 断片を含む合成 DNA（鎖長77及
び78、図２参照）をアプライドバイオシステムズ社のDN
A 合成機を用いて合成した。各々２μg の５′末端をリ
ン酸化した後、アニーリング操作により、相補的な配列
部分を２重鎖とした。このDNA を７mMトリス(Tris)-HCl
( pH 7.5 ）、0.1mM EDTA、20mM NaCl 、７mM MgCl
2 、0.1mM dATP、dGTP、dCTP、dTTP及び2 ユニットのク
レノウ酵素を含む 100μl の反応液中、37℃、30分イン
キュベートした。70℃、５分で反応を停止した後、BamH
Ｉ及び Ban II で分解し、アガロースゲル電気泳動にか
け、0.11kbの Ban II −BamHＩ断片約 400ngを回収し
た。 (2-2) SacＩ- BamHＩ断片の調製 (2-1) で得た Ban II- BamH Ｉ断片 200ngと、(1-3) で
得た0.27kbの SacＩ-Ban II断片490 ngをT4 DNA リガ
ーゼ用バッファー、0.5mM ATP 、10mM DTT及び2.8ユニ
ットのT4 DNA リガーゼを含む20μl の反応液中、16
℃、一夜インキュベートした。反応液を65℃、10分処理
した後、BamHＩ及び SacＩで分解し、アガロースゲル電
気泳動にかけ、0.38kbのSac Ｉ-BamH Ｉ断片約 100ngを
回収した。 (2-3) pHD101の SacＩ-BamH Ｉ断片（ベクター断片）の
調製 H-271 をコードするプラスミドpHD101の１μg を SacＩ
及びBamHＩで分解し、脱リン酸した後、アガロースゲル
電気泳動にかけ、4.6kb の SacＩ- BamHＩベクター断片
約280 ngを回収した。
残基）を含むヘパリン結合ドメイン（Ala1690-Th
r1985 、296 アミノ残基、以下H-296 と略称する）をコ
ードするcDNA断片のクローニング（図２参照） (2-1) Ban II −BamHＩ断片の調製 ＦＮのIIIcs の CS1領域〔ジャーナル オブセル バイ
オロジー（ J. Cell Bio.)第103 巻、第2637〜2647頁(1
986)〕をコードするDNA 断片を含む合成 DNA（鎖長77及
び78、図２参照）をアプライドバイオシステムズ社のDN
A 合成機を用いて合成した。各々２μg の５′末端をリ
ン酸化した後、アニーリング操作により、相補的な配列
部分を２重鎖とした。このDNA を７mMトリス(Tris)-HCl
( pH 7.5 ）、0.1mM EDTA、20mM NaCl 、７mM MgCl
2 、0.1mM dATP、dGTP、dCTP、dTTP及び2 ユニットのク
レノウ酵素を含む 100μl の反応液中、37℃、30分イン
キュベートした。70℃、５分で反応を停止した後、BamH
Ｉ及び Ban II で分解し、アガロースゲル電気泳動にか
け、0.11kbの Ban II −BamHＩ断片約 400ngを回収し
た。 (2-2) SacＩ- BamHＩ断片の調製 (2-1) で得た Ban II- BamH Ｉ断片 200ngと、(1-3) で
得た0.27kbの SacＩ-Ban II断片490 ngをT4 DNA リガ
ーゼ用バッファー、0.5mM ATP 、10mM DTT及び2.8ユニ
ットのT4 DNA リガーゼを含む20μl の反応液中、16
℃、一夜インキュベートした。反応液を65℃、10分処理
した後、BamHＩ及び SacＩで分解し、アガロースゲル電
気泳動にかけ、0.38kbのSac Ｉ-BamH Ｉ断片約 100ngを
回収した。 (2-3) pHD101の SacＩ-BamH Ｉ断片（ベクター断片）の
調製 H-271 をコードするプラスミドpHD101の１μg を SacＩ
及びBamHＩで分解し、脱リン酸した後、アガロースゲル
電気泳動にかけ、4.6kb の SacＩ- BamHＩベクター断片
約280 ngを回収した。
【００２５】(2-4) SacＩ- BamHＩ断片とベクターの結
合 (2-2)で得た0.38kbの SacＩ- BamHＩ断片50ngと、(2-3)
で得た4.6 kbの SacＩ- BamHＩベクター断片20ngをT4
DNAリガーゼ用バッファー、0.5mM ATP 、10mM DTT及び
2.8ユニットのT4 DNAリガーゼを含む20μl の反応液
中、16℃、一夜インキュベートした。この反応液10μl
を大腸菌HB101 の形質転換に使用した。 (2-5) 大腸菌の形質転換とプラスミドの確認 (2-4) で得た反応液10μl を用いて大腸菌HB101 を形質
転換した。得られた形質転換体中12クローンについてプ
ラスミドの分析を行った。すなわち、ラピット法で調製
したプラスミドをBamHＩ及び NcoＩで分解し、アガロー
スゲル電気泳動にかけ、予想される NcoＩ−BamHＩ断片
(0.9kb）のバンドの生成を調べた。その結果、１クロー
ンに目的のバンドが認められた。また、ダイデオキシ法
により塩基配列を決定し、目的の配列を含むことを確認
した。この組換体プラスミドをpHD102と命名した。ま
た、このプラスミドを保持する大腸菌HB101 をEscheric
hia coli HB101 ／pHD102と表示し、工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託した〔微工研菌寄第 10721号(FER
M P-10721)〕。
合 (2-2)で得た0.38kbの SacＩ- BamHＩ断片50ngと、(2-3)
で得た4.6 kbの SacＩ- BamHＩベクター断片20ngをT4
DNAリガーゼ用バッファー、0.5mM ATP 、10mM DTT及び
2.8ユニットのT4 DNAリガーゼを含む20μl の反応液
中、16℃、一夜インキュベートした。この反応液10μl
を大腸菌HB101 の形質転換に使用した。 (2-5) 大腸菌の形質転換とプラスミドの確認 (2-4) で得た反応液10μl を用いて大腸菌HB101 を形質
転換した。得られた形質転換体中12クローンについてプ
ラスミドの分析を行った。すなわち、ラピット法で調製
したプラスミドをBamHＩ及び NcoＩで分解し、アガロー
スゲル電気泳動にかけ、予想される NcoＩ−BamHＩ断片
(0.9kb）のバンドの生成を調べた。その結果、１クロー
ンに目的のバンドが認められた。また、ダイデオキシ法
により塩基配列を決定し、目的の配列を含むことを確認
した。この組換体プラスミドをpHD102と命名した。ま
た、このプラスミドを保持する大腸菌HB101 をEscheric
hia coli HB101 ／pHD102と表示し、工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託した〔微工研菌寄第 10721号(FER
M P-10721)〕。
【００２６】(2-6) 組換体からのペプチドの精製 (2-5)で得たEscherichia coli HB101/pHD 102 を、(1-
8) と同様の方法で培養、精製し、500 mlの培養液から
電気泳動的にほぼ単一なペプチド約５mgを得た。ＡＢＩ
社のペプチドシーケンサー477A／120Aを用いて、本ペプ
チドのＮ末端からのアミノ酸配列を調べたところ、目的
のペプチドのＮ末端配列と一致した。また、カルボキシ
ペプチダーゼＰ消化法により、Ｃ末端はThr であること
が確認された。
8) と同様の方法で培養、精製し、500 mlの培養液から
電気泳動的にほぼ単一なペプチド約５mgを得た。ＡＢＩ
社のペプチドシーケンサー477A／120Aを用いて、本ペプ
チドのＮ末端からのアミノ酸配列を調べたところ、目的
のペプチドのＮ末端配列と一致した。また、カルボキシ
ペプチダーゼＰ消化法により、Ｃ末端はThr であること
が確認された。
【００２７】実施例３ ＦＮの細胞接着ドメインPro1239-Ser1515 （ 277アミノ
酸残基）とH-271 との融合タンパク質をコードするcDNA
断片のクローニング（図３参照） (3-1) 細胞接着ドメインPro1239-Ser1515 (277アミノ酸
残基）をコードするプラスミドの構築 特開平１−206998号公報に記載されている組換体プラス
ミドpTF7021 の翻訳領域の終止コドンの直前に部位特異
的変異の手法により、 NcoＩサイトを導入したプラスミ
ドを構築した。pTF7021 への NcoＩサイトの導入は、オ
リゴヌクレオチドｄ〔pCTATTACACCATGGATGGTTTG 〕を合
成し、サイト−ダイレクテッド ミュータジェネシス
システム ミュータン−Ｋ（ Site-directed mutagenes
issystemMutan−Ｋ）〔宝酒造（株）販売〕を用いて行
った。この NcoＩサイトの導入に伴い細胞接着ドメイン
のＣ末端のGln1516-Met1517 は Met1516-Val1517に置き
換わっている（図３参照）。得られたプラスミドをpTF7
520 と命名した。 (3-2) pHD101の NcoＩ-Hinc II断片の調製 (1-7) で得た組換体プラスミド pHD101 の１μg を Nco
Ｉ及びHinc II で分解し、アガロースゲル電気泳動にか
け、1.77kbの NcoＩ- Hinc II 断片約100ng を回収し
た。
酸残基）とH-271 との融合タンパク質をコードするcDNA
断片のクローニング（図３参照） (3-1) 細胞接着ドメインPro1239-Ser1515 (277アミノ酸
残基）をコードするプラスミドの構築 特開平１−206998号公報に記載されている組換体プラス
ミドpTF7021 の翻訳領域の終止コドンの直前に部位特異
的変異の手法により、 NcoＩサイトを導入したプラスミ
ドを構築した。pTF7021 への NcoＩサイトの導入は、オ
リゴヌクレオチドｄ〔pCTATTACACCATGGATGGTTTG 〕を合
成し、サイト−ダイレクテッド ミュータジェネシス
システム ミュータン−Ｋ（ Site-directed mutagenes
issystemMutan−Ｋ）〔宝酒造（株）販売〕を用いて行
った。この NcoＩサイトの導入に伴い細胞接着ドメイン
のＣ末端のGln1516-Met1517 は Met1516-Val1517に置き
換わっている（図３参照）。得られたプラスミドをpTF7
520 と命名した。 (3-2) pHD101の NcoＩ-Hinc II断片の調製 (1-7) で得た組換体プラスミド pHD101 の１μg を Nco
Ｉ及びHinc II で分解し、アガロースゲル電気泳動にか
け、1.77kbの NcoＩ- Hinc II 断片約100ng を回収し
た。
【００２８】(3-3) pHD101の NcoＩ- Hinc II 断片のpT
F7520 へのクローニング (3-1) で得たプラスミドpTF7520 を NcoＩ及びHinc II
で分解後、脱リン酸した。このプラスミド50ngを(1-2)
で得た NcoＩ- Hinc II 断片50ngと共にT4 DNAリガーゼ
用バッファー、0.5mM ATP 、10mM DTT及び 2.8ユニット
のT4DNA リガーゼを含む20μl の反応液中、16℃、一夜
インキュベートした。この反応液10μlを用いて大腸菌
HB101を形質転換し、ＦＮの細胞接着ドメインPro1239-S
er1515(277アミノ酸残基）とH-271 が Metを介して結合
した融合タンパク質( C277-Met-H271)を発現するプラス
ミドを得、pCH101と命名した。また、このプラスミドを
保持する大腸菌HB101 を Escherichia coli HB101/pCH
101と表示し、通商産業省工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託した〔微工研条寄第2799号(FERM BP-279
9)〕。
F7520 へのクローニング (3-1) で得たプラスミドpTF7520 を NcoＩ及びHinc II
で分解後、脱リン酸した。このプラスミド50ngを(1-2)
で得た NcoＩ- Hinc II 断片50ngと共にT4 DNAリガーゼ
用バッファー、0.5mM ATP 、10mM DTT及び 2.8ユニット
のT4DNA リガーゼを含む20μl の反応液中、16℃、一夜
インキュベートした。この反応液10μlを用いて大腸菌
HB101を形質転換し、ＦＮの細胞接着ドメインPro1239-S
er1515(277アミノ酸残基）とH-271 が Metを介して結合
した融合タンパク質( C277-Met-H271)を発現するプラス
ミドを得、pCH101と命名した。また、このプラスミドを
保持する大腸菌HB101 を Escherichia coli HB101/pCH
101と表示し、通商産業省工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託した〔微工研条寄第2799号(FERM BP-279
9)〕。
【００２９】(3-4) pCH101からの介在配列(ATG) の除去 (3−3)で得たプラスミドpCH101によって発現される融合
タンパク質（ C277-Met-H271) の細胞接着ドメインPro
1239-Ser1515( 277アミノ酸残基）とH-271 の間には Me
tが付加されている。この Metに対応する配列(ATG) を
部位特異的変異の手法により除去した。pCH 101 からの
介在配列(ATG) の除去は、オリゴヌクレオチドd〔pAGGA
ATAGCGGATGGTTT 〕を合成し、サイト−ダイレクテッド
ミュータジェネシスシステム ミュータン−Ｋ〔宝酒
造（株）販売〕を用いて行った。その結果、細胞接着ド
メインPro1239-Ser1515( 277アミノ酸残基）とH-271 が
直接結合した融合タンパク質（ C277-H271) を発現する
プラスミドを得、pCH201と命名した。 (3-5) 組換体からのペプチドの精製 (3-3) で得た Escherichia coli HB101/pCH 101 を(1-
8) と同様の方法で培養し、500 mlの培養菌体から抽出
液を得た。ＦＮの細胞接着ドメインを認識するモノクロ
ーナル抗体（FN-10 、宝酒造) 及び前記モノクローナル
抗体IST-1 の両方に反応する画分を(1-8) と同様の方法
で精製して15mgの精製品を得た。本ペプチドのＮ末端配
列は目的ペプチドの配列と一致した。また、カルボキシ
ペプチダーゼＰ消化法により、Ｃ末端はThr であること
を確認した。
タンパク質（ C277-Met-H271) の細胞接着ドメインPro
1239-Ser1515( 277アミノ酸残基）とH-271 の間には Me
tが付加されている。この Metに対応する配列(ATG) を
部位特異的変異の手法により除去した。pCH 101 からの
介在配列(ATG) の除去は、オリゴヌクレオチドd〔pAGGA
ATAGCGGATGGTTT 〕を合成し、サイト−ダイレクテッド
ミュータジェネシスシステム ミュータン−Ｋ〔宝酒
造（株）販売〕を用いて行った。その結果、細胞接着ド
メインPro1239-Ser1515( 277アミノ酸残基）とH-271 が
直接結合した融合タンパク質（ C277-H271) を発現する
プラスミドを得、pCH201と命名した。 (3-5) 組換体からのペプチドの精製 (3-3) で得た Escherichia coli HB101/pCH 101 を(1-
8) と同様の方法で培養し、500 mlの培養菌体から抽出
液を得た。ＦＮの細胞接着ドメインを認識するモノクロ
ーナル抗体（FN-10 、宝酒造) 及び前記モノクローナル
抗体IST-1 の両方に反応する画分を(1-8) と同様の方法
で精製して15mgの精製品を得た。本ペプチドのＮ末端配
列は目的ペプチドの配列と一致した。また、カルボキシ
ペプチダーゼＰ消化法により、Ｃ末端はThr であること
を確認した。
【００３０】実施例４ ＦＮの細胞接着ドメインPro1239-Ser1515 (277アミノ酸
残基）とH-296 との融合タンパク質をコードするcDNA断
片のクローニング（図４参照） (4-1) pHD102の NcoＩ- Hinc II 断片の調製 (2-5) で得られた組換体プラスミドpHD 102 の１μg を
NcoＩ及びHinc II で分解し、アガロースゲル電気泳動
にかけ、1.84kbの NcoＩ- Hinc II 断片約100ng を回収
した。 (4-2) pHD102の NcoＩ- Hinc II 断片のpTF7520 へのク
ローニング (3-1) で得たプラスミドpTF7520 を NcoＩ及びHinc II
で分解後、脱リン酸した。このプラスミド50ngを(4-1)
で得た NcoＩ- Hinc II 断片50ngと共にT4 DNAリガーゼ
用バッファー、0.5mM ATP 、10mM DTT及び28ユニットの
T4 DNA リガーゼを含む20μl の反応液中、16℃、一夜
インキュベートした。この反応液10μlを用いて大腸菌H
B101 を形質転換し、ＦＮの細胞接着ドメインPro1239-S
er1515(277アミノ酸残基）とH-296 が Metを介して結合
した融合タンパク質（ C277-Met-H296) を発現するプラ
スミドを得、pCH102と命名した。また、このプラスミド
を保持する大腸菌HB101 をEscherichia coli HB101/pCH
102 と表示し、通商産業省工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託した〔微工研条寄第2800号(FERM BP-2800
）〕。
残基）とH-296 との融合タンパク質をコードするcDNA断
片のクローニング（図４参照） (4-1) pHD102の NcoＩ- Hinc II 断片の調製 (2-5) で得られた組換体プラスミドpHD 102 の１μg を
NcoＩ及びHinc II で分解し、アガロースゲル電気泳動
にかけ、1.84kbの NcoＩ- Hinc II 断片約100ng を回収
した。 (4-2) pHD102の NcoＩ- Hinc II 断片のpTF7520 へのク
ローニング (3-1) で得たプラスミドpTF7520 を NcoＩ及びHinc II
で分解後、脱リン酸した。このプラスミド50ngを(4-1)
で得た NcoＩ- Hinc II 断片50ngと共にT4 DNAリガーゼ
用バッファー、0.5mM ATP 、10mM DTT及び28ユニットの
T4 DNA リガーゼを含む20μl の反応液中、16℃、一夜
インキュベートした。この反応液10μlを用いて大腸菌H
B101 を形質転換し、ＦＮの細胞接着ドメインPro1239-S
er1515(277アミノ酸残基）とH-296 が Metを介して結合
した融合タンパク質（ C277-Met-H296) を発現するプラ
スミドを得、pCH102と命名した。また、このプラスミド
を保持する大腸菌HB101 をEscherichia coli HB101/pCH
102 と表示し、通商産業省工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託した〔微工研条寄第2800号(FERM BP-2800
）〕。
【００３１】(4-3) pCH102からの介在配列(ATG) の除去 (4-2) で得たプラスミドpCH102によって発現される融合
タンパク質（ C277-Met-H296) の細胞接着ドメインPro
1239-Ser1515 (277アミノ酸残基）とH-296 の間には Me
tが付加されている。この Metに対応する配列(ATG) の
除去を(3-4) と同様の方法で行った。その結果、細胞接
着ドメインPro1239-Ser1515 (277アミノ酸残基）とH-29
6 が直接結合した融合タンパク質（ C277-H296) を発現
するプラスミドを得、pCH202と命名した。 (4-4) 組換体からのペプチドの精製 (4-2) で得たEscherichia coli HB101/pCH102 を(3-5)
と同様の方法で培養、精製し、500 mlの培養液から、電
気泳動的にほぼ単一なペプチド約６mgを得た。Ｎ末端配
列分析及びＣ末端分析の結果は目的ペプチドのものと一
致した。
タンパク質（ C277-Met-H296) の細胞接着ドメインPro
1239-Ser1515 (277アミノ酸残基）とH-296 の間には Me
tが付加されている。この Metに対応する配列(ATG) の
除去を(3-4) と同様の方法で行った。その結果、細胞接
着ドメインPro1239-Ser1515 (277アミノ酸残基）とH-29
6 が直接結合した融合タンパク質（ C277-H296) を発現
するプラスミドを得、pCH202と命名した。 (4-4) 組換体からのペプチドの精製 (4-2) で得たEscherichia coli HB101/pCH102 を(3-5)
と同様の方法で培養、精製し、500 mlの培養液から、電
気泳動的にほぼ単一なペプチド約６mgを得た。Ｎ末端配
列分析及びＣ末端分析の結果は目的ペプチドのものと一
致した。
【００３２】実施例５ 生物活性の測定 前記実施例１〜４で得られた各ポリペプチドを用いて細
胞接着活性及びヘパリン結合活性を測定した。細胞接着
活性は、ルオスラティらの方法〔メソッズ イン エン
ザイモロジー、第82巻、第803 〜831 頁(1981)〕に準じ
て測定した。試料を蒸留水、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理
食塩水）等に溶かし、96穴マイクロプレート上で階段的
に希釈した。4 ℃、2 時間インキュベートして、試料を
プレート上に吸着させた（50μl ／ウエル）。３％ＢＳ
Ａ（牛血清アルブミン）を含むＰＢＳ溶液を 100μl ／
ウエル加え、37℃、１時間インキュベートしてプレート
をブロックした。ＰＢＳでプレートを洗浄後、あらかじ
めダルベッコ（Dulbecoo's) イーグル最小栄養培地(DME
M)に５×105 細胞／mlとなるように懸濁させたベビーハ
ムスター腎細胞（BHK-21) を100 μl ／ウエル分注し、
37℃、1 時間インキュベートした。なお使用したBHK-21
細胞は、凍結保存した株を継代培養後、トリプシン処理
（37℃、５分) したものを用いた。ＰＢＳでプレートを
洗浄後、３％ホルマリン溶液で細胞をプレート上に固定
した。顕微鏡下でBHK-21細胞の伸展を観察し、伸展細胞
数が、n-FNの高濃度における伸展細胞数の50％となる試
料の濃度（ ED50)を求め細胞接着活性の指標とした。ヘ
パリン結合活性の測定は以下のようにした。20 mM リン
酸バッファー（pH 7.0) で平衡化したＡＦヘパリン−ト
ヨパール 650Ｍのカラム(1.5ml) に試料を乗せ、バッフ
ァー中のNaCl濃度を段階的に上昇させ、溶出される塩濃
度によりヘパリンへの結合力を表した。以上の方法で各
試料の生物活性を測定した結果を表１に示す。
胞接着活性及びヘパリン結合活性を測定した。細胞接着
活性は、ルオスラティらの方法〔メソッズ イン エン
ザイモロジー、第82巻、第803 〜831 頁(1981)〕に準じ
て測定した。試料を蒸留水、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理
食塩水）等に溶かし、96穴マイクロプレート上で階段的
に希釈した。4 ℃、2 時間インキュベートして、試料を
プレート上に吸着させた（50μl ／ウエル）。３％ＢＳ
Ａ（牛血清アルブミン）を含むＰＢＳ溶液を 100μl ／
ウエル加え、37℃、１時間インキュベートしてプレート
をブロックした。ＰＢＳでプレートを洗浄後、あらかじ
めダルベッコ（Dulbecoo's) イーグル最小栄養培地(DME
M)に５×105 細胞／mlとなるように懸濁させたベビーハ
ムスター腎細胞（BHK-21) を100 μl ／ウエル分注し、
37℃、1 時間インキュベートした。なお使用したBHK-21
細胞は、凍結保存した株を継代培養後、トリプシン処理
（37℃、５分) したものを用いた。ＰＢＳでプレートを
洗浄後、３％ホルマリン溶液で細胞をプレート上に固定
した。顕微鏡下でBHK-21細胞の伸展を観察し、伸展細胞
数が、n-FNの高濃度における伸展細胞数の50％となる試
料の濃度（ ED50)を求め細胞接着活性の指標とした。ヘ
パリン結合活性の測定は以下のようにした。20 mM リン
酸バッファー（pH 7.0) で平衡化したＡＦヘパリン−ト
ヨパール 650Ｍのカラム(1.5ml) に試料を乗せ、バッフ
ァー中のNaCl濃度を段階的に上昇させ、溶出される塩濃
度によりヘパリンへの結合力を表した。以上の方法で各
試料の生物活性を測定した結果を表１に示す。
【００３３】
【表１】 表 １ ─────────────────────────── 試 料 細胞伸展活性 ヘパリン結合活性 ED50(nmol/ml） （溶出塩濃度、mM) ─────────────────────────── H-271 なし 300 H-296 41 300 C277-Met-H271 0.176 300 C277-Met-H296 0.084 300 ───────────────────────────
【００３４】
【発明の効果】以上述べてきたごとく、本発明により、
ヘパリン結合活性を持つ新規ポリペプチドをコードする
遺伝子が提供される。このポリペプチドは細胞とヘパラ
ン硫酸などの細胞外マトリックスとの結合の仲立ちを
し、創傷治癒等に役立つ有用なタンパク質である。
ヘパリン結合活性を持つ新規ポリペプチドをコードする
遺伝子が提供される。このポリペプチドは細胞とヘパラ
ン硫酸などの細胞外マトリックスとの結合の仲立ちを
し、創傷治癒等に役立つ有用なタンパク質である。
【図１】H-271 を発現するプラスミドpHD101を構築する
ための工程図である。
ための工程図である。
【図２】H-296 を発現するプラスミドpHD102を構築する
ための工程図である。
ための工程図である。
【図３】C277-Met-H271 を発現するプラスミドpCH101を
構築するための工程図である。
構築するための工程図である。
【図４】C277-Met-H296 を発現するプラスミドpCH102を
構築するための工程図である。
構築するための工程図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 後藤 晶一 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 君塚 房夫 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (56)参考文献 特開 昭62−89699（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−272975（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−282593（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−236485（ＪＰ，Ａ) 特表 昭59−501548（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07H 21/04 C07K 14/78 C12P 21/02 A61K 37/02
Claims (2)
- 【請求項１】 下記式（化１）で示されるアミノ酸配列
で表されることを特徴とする機能性ポリペプチドをコー
ドする遺伝子。 【化１】 - 【請求項２】 請求項１記載の遺伝子を含有する組換体
プラスミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8122805A JP2780159B2 (ja) | 1996-04-22 | 1996-04-22 | 機能性ポリペプチド遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8122805A JP2780159B2 (ja) | 1996-04-22 | 1996-04-22 | 機能性ポリペプチド遺伝子 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1131453A Division JP2561149B2 (ja) | 1989-05-26 | 1989-05-26 | 機能性ポリペプチド |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9094423A Division JPH1052279A (ja) | 1997-03-31 | 1997-03-31 | 機能性ポリペプチドの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08275787A JPH08275787A (ja) | 1996-10-22 |
| JP2780159B2 true JP2780159B2 (ja) | 1998-07-30 |
Family
ID=14845080
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8122805A Expired - Fee Related JP2780159B2 (ja) | 1996-04-22 | 1996-04-22 | 機能性ポリペプチド遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2780159B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8516421D0 (en) * | 1985-06-28 | 1985-07-31 | Biotechnology Interface Ltd | Fibronectins |
-
1996
- 1996-04-22 JP JP8122805A patent/JP2780159B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08275787A (ja) | 1996-10-22 |
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