JPH05227961A

JPH05227961A - インターロイキン１β前駆体変換酵素をコードするＤＮＡ

Info

Publication number: JPH05227961A
Application number: JP21803992A
Authority: JP
Inventors: Andrew D Howard; アンドリユー・デイー・ハワード; Susan M Molineaux; スーザン・エム・モリノー; Michael J Tocci; マイケル・ジエイ・トツチ; Jimmy R Calaycay; ジミー・アール・キヤレイカイ; Douglas K Miller; ダグラス・ケイ・ミラー
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1991-08-16
Filing date: 1992-08-17
Publication date: 1993-09-07
Anticipated expiration: 2016-02-19
Also published as: DE69229252D1; EP0533350A1; EP0533350B1; DE69229252T2; JPH1169972A; JP3136551B2

Abstract

(57)【要約】【構成】前駆インターロイキン−１β（プレＩＬ−１
β）変換酵素（ＩＣＥ）をコードする相補的ＤＮＡ（ｃ
ＤＮＡ）をｃＤＮＡライブラリーから単離する。新生Ｉ
ＣＥに対する全長読み取り枠（ＯＲＦ）をコードするｃ
ＤＮＡ並びにＩＣＥのそれぞれ２０ｋＤａサブユニット
及び１０ｋＤａサブユニットをコードするｃＤＮＡを同
定し、配列決定する。ＩＣＥは、プレＩＬ−１βを成熟
ＩＬ−１βに変換するのに有効である。【効果】それぞれ２０ｋＤａ及び１０ｋＤａのサブユニ
ットを含む組換え生産されたＩＣＥは、炎症疾患の診
断、組換えＩＬ−１βの製造、及びＩＣＥ活性の阻害物
質の同定に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、１９９１年８月１６日出願の出
願第７４６，４５４号の一部継続出願である。

【０００２】

【従来の技術】哺乳動物インターロイキン−１（ＩＬ−
１）は、一般炎症応答の一部として所定の細胞タイプに
よって分泌される免疫調節タンパク質である。ＩＬ−１
産生を担う主要な細胞タイプは末梢血単球である。しか
しながら他の非形質転換細胞タイプも、ＩＬ−１または
ＩＬ−１様分子を解放または含有すると記載されてい
る。かかる例としては、上皮細胞〔Ｌｕｇｅｒｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：１４９３−１４
９８（１９８１），Ｌｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１３８：２５２０−２５２６（１９８７）及び
ＬｏｖｅｔｔａｎｄＬａｒｓｅｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ．８２：１１５−１２２（１９８８）〕、
結合組織細胞〔Ｏｌｌｉｖｉｅｒｒｅｅｔａｌ．，
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．
１４１：９０４−９１１（１４８６），Ｌｅｅｔａ
ｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：２５２０−２５２
６（１９８７）〕、神経系細胞（ｃｅｌｌｓｏｆｎ
ｅｕｒｏｎａｌｏｒｉｇｉｎ）〔Ｇｉｕｌｉａｎｅ
ｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：５９４−６
０４（１９８６）〕、及び白血球〔Ｐｉｓｔｏｉａｅ
ｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３６：１６８８−
１６９２（１９８６）、Ａｃｒｅｓｅｔａｌ．，Ｍ
ｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：４７９−４８５（１９８
７）、Ａｃｒｅｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１３８：２１３２−２１３６（１９８７）及びＬｉｎｄ
ｅｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４
０：８３７−８３９（１９８８）〕を挙げることができ
る。形質転換細胞系もまたＩＬ−１を産生することが示
されている。かかる例としては、単球性白血病系Ｐ３８
８Ｄ、Ｊ７７４、ＴＨＰ．１、Ｕ−９３７〔Ｋｒａｋａ
ｕｅｒａｎｄＯｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ，Ｃｅｌｌ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．８０：２２３−２２９（１９８３）及
びＭａｔｓｕｓｈｉｍａｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．２５：３２４２−３４２９（１９８６）〕、ＥＢＶ
形質転換ヒトＢリンパ芽球症系（ＥＶＢ−ｔｒａｎｓｆ
ｏｒｍｅｄｈｕｍａｎＢｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔ
ｏｉｄｌｉｎｅｓ）〔Ａｃｒｅｓｅｔａｌ．，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：２１３２−２１３６（１
９８７）〕、及び形質転換ネズミケラチノサイト〔Ｌｕ
ｇｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：２
１４７−２１５２（１９８２）〕を挙げることができ
る。

【０００３】生物学的に活性なＩＬ−１は、いずれも約
１７，５００の分子量を有する形態であるが、約５．２
の等電点を有するＩＬ−１αと約７．０の等電点を有す
るＩＬ−１βとの２種の別個の形態で存在する〔Ｂａｙ
ｎｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３：１
２６７−１２８０（１９８６）及びＳｃｈｍｉｄｔ，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：７７２（１９８４）〕。
ポリペプチドは進化的に保存されていると見られ、アミ
ノ酸レベルで約２７〜３３％の相同性を示す〔Ｃｌａｒ
ｋｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．１４：７８９７−７９１４（１９８６）〕。

【０００４】哺乳動物ＩＬ−１βは、約３１．５ｋＤａ
の細胞関連ポリペプチド前駆体として合成される〔Ｌｉ
ｍｊｕｃｏｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：３９７２−３９７６（１
９８６）〕。ＩＬ−１β前駆体はＩＬ−１レセプターに
結合することはできず、生物学的に不活性である〔Ｍｏ
ｓｌｅｙｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６２：２９４１−２９４４（１９８７）〕。生物学的活
性は、３１．５ｋＤａの前駆形態を１７．５ｋＤａの成
熟形態に変換する結果となる所定の形態のタンパク質加
水分解プロセッシングに従って現れる。

【０００５】最近の研究では、ＩＬ−１βのプロセッシ
ング及び分泌は単球及び単球細胞系に特異的であること
が示されている〔Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａｅｔａ
ｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１１３２（１９８
５）〕。例えば、線維芽細胞及びケラチノサイトはＩＬ
−１β前駆体を合成するが、前駆体を積極的にプロセッ
シングすることも成熟ＩＬ−１βを分泌することもない
ことが判っている〔Ｙｏｕｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０７：４４７（１９８８）及びＣ
ｏｒｂｏｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１６９：６６９（１９８７）〕。

【０００６】ＩＬ−１βのプロセッシング及び分泌が、
古典的に分泌されるタンパク質とは異なる独特の経路で
起こるという仮説を支持する観察も幾つかある。５つの
異なる種由来のＩＬ−１βは疎水性シグナル配列を含ま
ない〔Ｌｏｍｅｄｉｃｏｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
３１２：４５８（１９８４）、Ａｕｒｏｎｅｔａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８１；７９０７（１９８４），Ｇｒａｙｅｔａ
ｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６４４（１９８
６），Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉｅｔａｌ．，Ｍｏ
ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：４２９（１９８８），Ｍｏ
ｒｉｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５０：１２３７（１９８
８），及びＦｕｒｕｔａｎｉｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１３：５８６９（１９８
５）〕。更に、ヒト及びネズミのＩＬ−１β前駆体はい
ずれも、ｉｎｖｉｔｒｏで合成したときに、コンピテ
ントミクロソーム膜を越えて転位せず、Ｎ結合炭水化物
付加部位が存在するにも拘わらず、Ｎ結合炭水化物を含
まない。最後に、光学及び電子顕微鏡調査ではＩＬ−１
βは細胞質に免疫局在しており、古典的分泌に関与する
オルガネラ内にＩＬ−１βは見い出されなかった〔Ｂａ
ｙｎｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３：
１２６７−１２８０（１９８６）及びＳｉｎｇｅｒｅ
ｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：３８９（１
９８８）〕。

【０００７】活性化された単球におけるパルス−チェイ
ス実験は、ＩＬ−１βの分泌がプロセッシングに関係し
得ることを示している。かかる実験では、細胞内に蓄積
しているプロセッシングされていない前駆体が細胞外の
成熟ＩＬ−１βに変化するのが追跡される〔Ｈａｚｕｄ
ａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：
８４７３（１９８９）〕。ＩＬ−１β前駆体は時として
細胞外に認められることがあるが、過剰のトリプシン、
キモトリプシンまたはコラゲナーゼの存在下に高濃度で
インキュベートしない限り、１７ｋＤａのＩＬ−１βの
形成に寄与するとは考えられない〔Ｈａｚｕｄａｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６８９
（１９８９），Ｂｌａｃｋｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：９４３７（１９８８）及びＨａ
ｚｕｄａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６５：６３１８（１９９０）〕。しかしながら、これら
のプロテイナーゼはいずれも、Ａｌａ１１７を端部に持
つ成熟ＩＬ−１βを生成し得るとは考えられない。

【０００８】ＩＬ−１β前駆体を１７ｋＤａの成熟ＩＬ
−１βに変えるタンパク質加水分解成熟は、Ａｓｐ１１
６とＡｌａ１１７の間の切断から生じることは明らかで
ある。ＩＬ−１β前駆体をＡｓｐ１１６−Ａｌａ１１７
及び相同部位のＡｓｐ２７−Ｇｌｙ２８で切断し、Ａｌ
ａ１１７に適当なアミノ末端を有する成熟ＩＬ−１βを
生成し得る、インターロイキン−１変換酵素（Ｉｎｔｅ
ｒｌｅｕｋｉｎ−１ＣｏｎｖｅｒｔｉｎｇＥｎｚｙｍ
ｅ，ＩＣＥ）と称されるエンドプロテイナーゼが同定さ
れている。位置１１６にあるＡｓｐは、ＡｓｐをＡｌａ
〔Ｋｏｓｔｕｒａｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：５２２７−５２３１（１
９８９）〕または他のアミノ酸〔Ｈｏｗａｒｄｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７，２９６４−９
（１９９１）〕で置換するとこの切断が阻害されること
から、切断に必須であることが判っている。

【０００９】ＩＣＥ活性は、該酵素を天然に産生する細
胞からのみ入手可能である。ＩＣＥ活性を有する粗細胞
溶解物は上記細胞から入手可能である〔Ｂｌａｃｋ，
Ｒ．Ａ．ｅｔａｌ．，１９８９，ＦＥＢＳＬｅｔ
ｔ．，２４７，ｐｐ３８６−９０；及びＫｏｓｔｕｒ
ａ．Ｍ．Ｊ．ｅｔａｌ．，１９８９，Ｐ．Ｎ．Ａ．
Ｓ．ＵＳＡ，８６，ｐｐ５２２７−３１，Ｈｏｗａｒ
ｄ，Ａ．ｅｔａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，印刷中〕。しかしながら、天然資源からＩＣＥを
精製しても、該酵素の広範な研究または実用に必要とさ
れる量を得ることはできない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、プレ
ＩＬ−１βを、アミノ末端のアミノ酸としてＡｌａ¹¹⁷
を有する生物学的に活性な成熟ＩＬ−１βに変換し得
る、組換え生産されたＩＣＥをコードするｃＤＮＡを提
供することである。本発明の別の目的は、全長ＩＣＥま
たは酵素のそれぞれ２０ｋＤａ及び１０ｋＤａのサブユ
ニットをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを提供
することである。本発明の別の目的は、全長プレＩＬ−
１β、ＩＣＥ及び／または酵素のそれぞれ２０ｋＤａ及
び１０ｋＤａのサブユニットをコードするｃＤＮＡを含
む組換え宿主細胞を提供することである。更に別の目的
は、組換え宿主細胞中でＩＣＥ及びＩＬ−１βを同時発
現させて、生物学的に活性のＩＬ−１βを生産する方法
を提供することである。本発明の更に別の目的は、２０
ｋＤａのＩＣＥサブユニット単離体及び１０ｋＤａのＩ
ＣＥサブユニット単離体を提供することである。本発明
の更に別の目的は、全長ＩＣＥを提供することである。
更に別の目的は、２０ｋＤａまたは１０ｋＤａのＩＣＥ
サブユニットのいずれかに結合する単一特異性抗体を提
供すること、及びかかる抗体を診断試薬として使用する
ことである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】単球細胞系ｃＤＮＡライ
ブラリーから、全長形態をコードする相補的ＤＮＡ（ｃ
ＤＮＡ）を同定し、それらから、それぞれ２０ｋＤａ及
び１０ｋＤａのＩＣＥサブユニットを誘導する。ｃＤＮ
Ａを完全に配列決定し、組換え宿主中で発現させるため
に発現ベクター中にクローニングする。ｃＤＮＡは、組
換え全長ＩＣＥ並びに酵素のそれぞれ２０ｋＤａ及び１
０ｋＤａのサブユニットを生産するのに有効である。

【００１２】本発明は、ＩＬ−１産生細胞から単離され
るプレＩＬ−１β変換酵素（ＩＣＥ）をコードするｃＤ
ＮＡに係わる。本明細書中でＩＣＥとは、ＩＬ−１β前
駆体の位置１１６にあるアルパラギン酸（Ａｓｐ¹¹⁶）
と位置１１７にあるアラニン（Ａｌａ¹¹⁷）の間のペプ
チド結合、及び位置２７にあるアルパラギン酸（Ａｓｐ
²⁷）と位置２８にあるグリシン（Ｇｌｙ²⁸）の間のペプ
チド結合を特異的に切断し得る酵素を指す。

【００１３】ヒトＩＬ−１βのアミノ酸配列は既知であ
る〔Ｍａｒｃｈｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３１
５：６４１−６４７（１９８５）〕。ＩＬ−１βを産生
し得る哺乳動物細胞としては、限定的ではないが、ケラ
チノサイト、内皮細胞、糸球体間質細胞、胸腺上皮細
胞、皮膚線維芽細胞、軟骨細胞、星状神経膠細胞、グリ
オーム細胞、単核食細胞、顆粒球、Ｔ及びＢリンパ球、
並びにＮＫ細胞を挙げることができる。ＩＬ−１βを産
生する形質転換哺乳動物細胞としては、限定的ではない
が、Ｐ３８８Ｄ１、Ｊ７７４、ＴＨＰ．１、Ｍｏｎｏ
Ｍａｃ６及びＵ−９３７のような単球白血病系、ＥＢ
Ｖ形質転換ヒトＢリンパ芽球症系及び形質転換ネズミケ
ラチノサイトを挙げることができる。本発明に好ましい
細胞系としては、正常ヒト末梢血単球及びＴＨＰ．１細
胞を挙げることができるが、最も好ましい細胞はＴＨ
Ｐ．１細胞である。

【００１４】他の細胞及び細胞系も、ＩＣＥｃＤＮＡ
を単離するのに使用が適し得る。適当な細胞系の選択
は、細胞抽出物またはならし培地においてＩＣＥ活性を
スクリーニングすることにより行ない得る。ＩＣＥ活性
を検出する方法は当分野において良く知られており〔Ｋ
ｏｓｔｕｒａ，Ｍ．Ｊ．ｅｔａｌ．，１９８９，Ｐ．
Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，８６，ｐｐ．５２２７−５２３
１〕、ＩＬ−１β前駆体の成熟ＩＬ−１βへの変換を測
定するものである。このアッセイにおいてＩＣＥ活性を
有する細胞は，ＩＣＥｃＤＮＡの単離に適していると
言える。

【００１５】ヒト末梢血単球はロイコフォレーシス（ｌ
ｅｕｋｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって健康なドナーから
入手し、まずリンパ球分離培地（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ
ＳｅｐａｒａｔｉｏｎＭｅｄｉａ，Ｏｒｇａｎｏｎ
Ｔｅｋｎｉｋａ）により沈降し、次いでＷｉｃｋｅｒ
ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０６：
３１８−３２９（１９７８）に記載のごとくベックマン
向流遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎｃｏｕｎｔｅｒｆｌｏｗ
ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）において分粒（ｅｌｕｔｒｉ
ａｔｉｏｎ）することにより精製される。単球は、まず
抗ＭＡＣｌ抗体で標識し、次いで当分野においては公知
の標準方法を使用してＦＡＣＳ分析することにより同定
する。

【００１６】本発明は、ＩＬ−１産生細胞から単離され
る、プレＩＬ−１βコンバーターゼ（ｃｏｎｖｅｒｔａ
ｓｅ）とも記載されている独特のプレＩＬ−１β変換酵
素（ＩＣＥ）に係わる。プレＩＬ−１β変換酵素または
コンバーターゼとは、本明細書においては、プレＩＬ−
１β分子の位置１１６にあるアスパラギン酸（Ａｓｐ１
１６）と位置１１７にあるアラニン（Ａｌａ１１７）の
間のペプチド結合を特異的に切断し得る酵素を指す。ヒ
トＩＬ−１βのアミノ酸配列は既知である〔Ｍａｒｃｈ
ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３１５：６４１−６４
７（１９８５）〕。ＩＬ−１βを産生し得る哺乳動物細
胞としては、限定的ではないが、ケラチノサイト、内皮
細胞、糸球体間質細胞、胸腺上皮細胞、皮膚線維芽細
胞、軟骨細胞、星状神経膠細胞、グリオーム細胞、単核
食細胞、顆粒球、Ｔ及びＢリンパ球、並びにＮＫ細胞を
挙げることができる。ＩＬ−１βを産生する形質転換哺
乳動物細胞としては、限定的ではないが、Ｐ３８８Ｄ
１、Ｊ７７４、ＴＨＰ−１、Ｕ−９３７及びＭｏｎｏ
Ｍａｃ６のような単球性白血病系；ＥＢＶ形質転換ヒ
トＢリンパ芽球症系及び形質転換ネズミケラチノサイト
を挙げることができる。本発明に好ましい細胞として
は、正常ヒト末梢血単球、ＭｏｎｏＭａｃ６細胞及び
ＴＨＰ−１細胞を挙げることができるが、最も好ましい
細胞はＴＨＰ−１細胞である。

【００１７】Ｔｓｕｃｈｉｙａｅｔａｌ．，Ｉｎ
ｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ２６：１７１−１７６（１９８
０）に記載されているヒトＴＨＰ−１細胞（Ａｍｅｒｉ
ｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ，ＡＴＣＣＴＩＢ２０２）のようなインターロイ
キン−１β産生細胞は、例えば約１０％ウシ胎児血清
（ＨｙＣｌｏｎｅ；検出可能な内毒素を含まない既定血
清）を含むダルベッコ改良最小必須培地（Ｈａｚｅｌｔ
ｏｎＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ）または約
９％ウマ血清を含むＩｓｃｏｖｅ改良ダルベッコ培地
（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において約３７℃
で浮遊培養する。細胞は、回転壜、Ｗｈｅａｔｏｎター
ボリフト４６ルットル浮遊フラスコ（Ｗｈｅａｔｏ
ｎ）、または、７５、２００もしくは３００リットル発
酵器内で増殖させ、約１〜２×１０６細胞／ｍｌ（３〜
４倍増／週）を毎週回収する。浮遊フラスコまたは発酵
器内に使用する培地は、細胞にかかる剪断力を小さくす
るために約０．１〜０．３％のＦ６ｐｌｕｒｏｎｉｃを
含んでもよい。細胞は、一次培養のあと、典型的には３
〜４カ月以上増殖させる。

【００１８】細胞を窒素キャビテーション、低張溶解な
どによって破壊することにより、ヒト末梢血単球または
ＴＨＰ−１から無細胞抽出物を調製する。遠心分離によ
って細胞を回収し、ｐＨ約７．４のリン酸緩衝溶液のよ
うな等張緩衝液中で洗浄することができる。低張溶解
は、細胞を約１０倍容の等張緩衝液（約１０ｍＭＫＣ
ｌ，約２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ約７．４，約１．５
ｍＭＭｇＣｌ₂、約０．１ｍＭＥＤＴＡ）または
（約２５ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ約７．５，約５ｍＭ
ＭｇＣｌ₂及び１ｍＭＥＧＴＡ）中で洗浄し、遠心分
離によって回収することで行なう。溶解緩衝液は、ジチ
オトレイトール（ＤＴＴ）のような還元剤を含むことも
できる。低張緩衝液は通常、ＰＭＳＦ、ロイペプチン及
びペプスタチンのようなプロテアーゼ阻害剤を含む。細
胞を約３培容の低張緩衝液中に懸濁させ、氷上に約２０
分間置き、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー中で約２０スト
ロークで溶解する。１００または３００ｍｌのＤｏｕｎ
ｃｅホモジナイザーを一杯に満たして、それぞれ約２５
または約１５ストロークで約９０〜９５％の細胞が破壊
される。窒素加圧破壊もまた低張緩衝液中で行なう。再
懸濁させた細胞を、窒素圧４００ｐｓｉの窒素加圧セル
中に入れ、約４℃で約３０分間振盪する。圧力を解放
し、加圧セルから細胞を取り出すことにより破壊が行わ
れる。細胞溶解物は、約４００〜約１０００×ｇ（上清
Ｓ１）、約３０，０００×ｇ（上清Ｓ２）及び約３０
０，０００×ｇ（上清Ｓ３）の連続遠心ステップによっ
て清澄化する。細胞溶解物は以下の手順で清澄化するこ
ともできる。ベックマンＧＰＲ遠心機において約３００
０ｒｐｍ、約５℃で、約１０分間遠心することにより、
未破壊の細胞及び核を除去する。核を除いた上清液を、
ＳＳ３４ロータを備えたＳｏｒｖａｌ遠心機において約
１６，０００ｒｐｍで約２０分間遠心する。更に、上清
液を、ベックマン遠心機（５０．２Ｔｉロータ）におい
て約５０，０００ｒｐｍまたは４５，０００ｒｐｍ（４
５Ｔｉロータ）で約６０分間遠心することにより清澄化
する。得られた上清液は、約２ｍＭＤＴＴと０．１％
ＣＨＡＰＳを加えて約−８０℃で保存する。

【００１９】ＩＣＥの精製は、放射性標識プレＩＬ−１
βを基質として使用するｉｎｖｉｔｒｏ切断アッセイ
によってモニターする。プレＩＬ−１βの全コーディン
グ配列を含む約１．５キロベース（ｋｂ）のｃＤＮＡク
ローンをＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩで切断したｐＧＥＭ−３
プラスミドＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ−Ｂｉｏｔｅｃ）中
に挿入し、標準方法に従ってＥ．ｃｏｌｉ中で増殖させ
る〔Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａ
ｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８
２）〕。精製プラスミドをＰｓｔＩを用いて直線化し、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼｉｎｖｉｔｒｏ転写系（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ−Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して転写させ、次
いで製造業者の指示通りにｍＲＮＡをプロセッシングす
る。翻訳は、製造業者の指示通りに２５μＣｉの３５Ｓ
−Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の存在下
に、ミクロコッカスヌクレアーゼ（ｍｉｃｒｏｃｏｃｃ
ａｌｎｕｃｌｅａｓｅ）で処理したウサギ網状赤血球
抽出物（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃ）をｉｎｖｉ
ｔｒｏ合成ｍＲＮＡを用いてプログラミングすることに
より行われる。これで、ナトリウムドデシルスルフェー
トポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）において、見掛けの分子量が約３４及び約３１キロ
ダルトン（ｋＤａ）の二重鎖として移動した標識プレＩ
Ｌ−１βが与えられた。プレＩＬ−１βの切断は、放射
性標識前駆体を含むウサギ網状赤血球抽出物１μｌを、
ＩＬ−１β変換酵素を含む試料約１０〜約２０μｌと一
緒にインキュベートすることにより行なう。プレＩＬ−
１βを切断すると１７．５ｋＤａの成熟ＩＬ−１βが得
られることは、Ｌａｅｍｍｌｉの方法〔Ｎａｔｕｒｅ
２２７：６８０−６８５（１９７０）〕に従うＳＤＳ−
ＰＡＧＥ、次いで当分野においては公知の手順に従うフ
ルオログラフィーによって分析することができる。酵素
切断の特異性及び切断産物の特性は、天然プレＩＬ−１
β及び突然変異プレＩＬ−１βを用いて決定される。突
然変異プレＩＬ−１βの構築は、当分野においては公知
の特定部位オリゴヌクレオチド突然変異誘発によって行
われる。アミノ酸１１５〜１２６に対応しＡｐａＬＩ−
ＨｐａＩＩ末端を有する、ヌクレオチド２７個の長さ
（２７ｍｅｒ）の合成二重鎖長鎖オリゴデオキシリボヌ
クレオチドは、確立された製造業者のプロトコルに従っ
てＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＤＮＡ３
８０Ａ合成装置において合成される。２７ｍｅｒは、プ
レＩＬ−１βのプロセッシング部位の隣りの位置−１
に、Ａｓｐ１１６−−＞Ａｌａ１１６のアミノ酸置換を
コードする。オリゴヌクレオチドは当分野において公知
の方法で、全長プレＩＬ−１β ｃＤＮＡを切断して得
られるＥｃｏＲＩ−ＡｐａＬＩ及びＨｐａＩＩ−Ｐｓｔ
Ｉフラグメントに連結される。プレＩＬ−１β翻訳産物
のヒトヌクレオチド及び推定アミノ酸配列はＭａｒｃｈ
ｅｔａｌ．，によってＮａｔｕｒｅ３１５：６４
１−６４７（１９８５）に記載されている。連結フラグ
メントは、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ切断ｐＧＥＭ−３を含
む連結反応に加えられる。ｐＧＥＭ／ＩＬ−１β突然変
異体を含むクローンは、突然変異オリゴヌクレオチド配
列とハイブリダイズすることにより同定される。クロー
ンは、制限エンドヌクレアーゼ切断によってマップ作成
し、ＤＮＡ配列を決定して突然変異の信頼性を検証す
る。突然変異構築物または天然構築物を担うベクターの
転写から１．５キロベース（ｋｂ）のｍＲＮＡが生成さ
れ、翻訳されると、３４及び３１ｋＤａの二重鎖タンパ
ク質を生じる。

【００２０】ＴＨＰ−１精製プレＩＬ−１β変換酵素
を、Ａｓｐ１１６がＡｌａ１１６に突然変異したプレＩ
Ｌ−１βと組み合わせても、突然変異前駆体の切断はわ
ずかしか、または全く見られなかった。プレＩＬ−１β
とプレＩＬ−１β変換酵素の相互作用から生じる正常切
断産物は、成熟ＩＬ−１βのＮ末端アミノ酸配列を有す
る１７．５ｋＤポリペプチドである。即ちプレＩＬ−１
βのＡｓｐ１１６残基は、ＩＬ−１β変換酵素による成
熟ＩＬ−１βのプロセッシングに重要である。

【００２１】切断産物のバイオ活性は、ＩＬ−１膜レセ
プターに結合する、放射性標識及びプロセッシングされ
たＩＬ−１βの量を測定することにより定量化される。
このアッセイはＣｈｉｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．１６５：７０−８６（１９８７）及びＴｏｃｃ
ｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：１１
０９−１１１４（１９８７）の技術を使用する。プレＩ
Ｌ−１β変換酵素によって野生または天然プレＩＬ−１
βから生成される切断産物は、上述のごときレセプター
結合競合アッセイにおいてＩＬ−１βレセプターに結合
する能力によって決定されたところでは、生物学的に活
性である。

【００２２】上記精製方法によって、実質的に純粋な生
物学的活性ＩＣＥが与えられる。

【００２３】プレＩＬ−１β変換酵素活性の細胞内位置
を理解するために、パーコール勾配分画法によって調製
した単核細胞フラクションを使用し、切断を調査する。
第１の清澄化ステップから得た細胞ホモジネートを、約
０．２５Ｍスクロース、約１０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐ
Ｈ７．４，１０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣ１₂
及び０．１ｍＭＥＤＴＡを用いて調製した０−１００
％プレフォームパーコール勾配（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
上に層状に重ねる。試料負荷勾配を約４８，０００×ｇ
で約２５分間遠心し、１．０ｍｌのフラクションを頂部
から回収する。種々の細胞内小器官（ｓｕｂｃｅｌｌｕ
ｌａｒｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ）に関係する酵素マ
ーカーアッセイを実施する：細胞質ゾル、乳酸デヒドロ
ゲナーゼ〔Ｍｏｒｇｏｒｓｔｅｒｎｅｔａｌ．，Ａ
ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：１４９−１６１（１９
６５）〕；リソソーム，Ｎ−アセチルβ−Ｄ−グルコサ
ミニダーゼ〔Ｗｏｌｌｅｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．７８：１１１−１２１（１９６１）〕；形質膜，
５’−ヌクレオチダーゼ〔Ｒｏｍｅｅｔａｌ．，Ｃ
ｅｌｌ１７：１４３−１５３（１９７９）〕；及びミ
クロソーム，スルファターゼＣ〔Ｃａｎｏｎｉｃｏｅ
ｔａｌ．，Ｊ．Ｒｅｔｉｃｕｌｏ．Ｓｏｃ．２４：１
１５−１３５（１９７８）〕。細胞質ゾルフラクソン
は、プレＩＬ−１βを、成熟ＩＬ−１βと大きさが同様
の産物に切断し得る唯一のフラクションであった。

【００２４】変換酵素活性は細胞質ゾルフラクション中
に存在したため、上清Ｓ３に更なる精製ステップを実施
し、実質的に純粋なＩＬ−１β変換酵素を得た。粒状硫
酸アンモニウムを約４℃で約４５％飽和となるまで加え
て、上清を沈澱させる。沈澱したタンパク質を約３０，
０００×ｇでペレット化し、硫酸アンモニウムを約７５
〜約８０％飽和とした。この沈澱物をペレット化し、緩
衝液Ａ（約２０ｍＭＫＣｌ，約２５ｍＭＨＥＰＥＳ，
ｐＨ約７．４，約５．０ｍＭＥＤＴＡ，約２ｍＭＤ
ＴＴ，約１ｍＭＰＭＳＦ，約０．０１％ＮＰ−４０
及び約１０％グリセロール）中に再懸濁し、約１６時間
透析する。透析溶液を約３０，０００×ｇで遠心し、粒
状物質を除去する。

【００２５】硫酸アンモニウム沈澱材料の試料を、緩衝
液Ａで平衡化しておいたジエチルアミノエチル（ＤＥＡ
Ｅ）アニオン交換カラムに添加する。フラクションを通
る流れを保持し、同じ緩衝液で平衡化しておいたスルフ
ィルプロピル（ＳＰ）カチオン交換カラム上に負荷す
る。プレＩＬ−１β変換酵素を、緩衝液Ａ中の約３０〜
５００ｍＭＫＣｌの直線濃度勾配で溶出させる。活性
フラクションを緩衝液Ａで約１６時間透析する。プレＩ
Ｌ−１β変換酵素は、活性回収率５０％の別個のピーク
として溶出した（表１）。

【００２６】生物学的に活性なＩＣＥのタンパク質成分
を分析するために、上記の分画化ステップから得た試料
に、Ｌａｅｍｍｌｉの方法〔Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕ
ｒｅ２２７：６８０−６８５（１９７０）〕に実質的に
従ってナトリウムドデシルスルフェートポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を実施した。電気泳動後、単離したタ
ンパク質を、Ｏａｋｌｅｙｅｔａｌ．〔Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０５：３６
１−３６３（１９８０）〕によって開発された方法の改
変法を使用して銀で染色すことにより可視化する。ＩＣ
Ｅの段階的精製から得られる電気泳動パターン（図１）
は、最後のＴＳＫ及びＨＡＰステップにおいてＩＣＥ活
性に相関する２２ｋＤａ及び１０ｋＤａのタンパク質の
出現を示している。更に、高度に精製されたＩＣＥのカ
ラムフラクション中には２４ｋＤａタンパク質の存在も
幾分認められる。

【００２７】２２ｋＤａ及び１０ｋＤａのタンパク質
は、口径の小さい（ｎａｒｒｏｗｂｏｒｅ）Ｃ４逆相
ＨＰＬＣを使用して個々に単離することができる。ＳＰ
精製ＩＣＥの２００ｍｌアリコートを、脱イオン水中の
０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で平衡化しておい
たＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＣ４（２．
１ｍｍ×１００ｍｍ，３００Ａ孔径）逆相カラムに添加
する。０．１％ＴＦＡ水溶液中の１５〜９０％アセトニ
トリル直線濃度勾配を使用してタンパク質を２６分間溶
出させる。２２ｋＤａ及び１０ｋＤａの成分は、カラム
から純粋な形態で単離することができる（図２）。

【００２８】２２ｋＤａ及び１０ｋＤａのＩＣＥサブユ
ニットの分子量を極めて正確に測定するために、各々５
ピコモルのタンパク質を上記方法によって均一になるま
で精製し、ＦｉｎｎｉｇａｎＴｒｉｐｌｅ−Ｓｅｃｔ
ｏｒＱｕａｄｒｏｐｏｌｅＭｏｄｅｌ７００エレク
トロスプレー（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）質量分析計
にオンライン接続された毛管液体クロマトグラフィーを
実施した。装置の精度を測定するために基準タンパク質
としてウシシトクロムｃを使用し、質量測定の標準誤差
は０．０１〜０．０２％であることが判明した。エレク
トロスプレーイオン化一次スペクトルのバイオマスデコ
ンボリューション（ｂｉｏｍａｓｓｄｅｃｏｎｖｏｌｕ
ｔｉｏｎ）の後に、単離した“１０ｋＤａ”成分は１
０，２４８原子質量単位（図４）の平均質量を有し、
“２２ｋＤａ”成分は１９，８６６原子質量単位（図
３）の平均質量を有することが判った。本明細書中、
“２２ｋＤａ”のＩＣＥサブユニットは２０ｋＤａＩ
ＣＥサブユニットと表記し、“１０ｋＤａ”のＩＣＥサ
ブユニットは１０ｋＤａＩＣＥサブユニットと表記す
る。これら２種のタンパク質は、完全活性形態のＩＣＥ
に関係している。２０及び１０ｋＤａのＩＣＥサブユニ
ットと場合によっては同時精製される“２４ｋＤａ”タ
ンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析すると、２
０ｋＤａＩＣＥサブユニットより約２０００ダルトン
大きいので、２２ｋＤａタンパク質と表記する。

【００２９】種々の方法のうち任意のものを使用して、
ＩＣＥｃＤＮＡを分子レベルでクローニングすること
ができる。かかる方法としては、限定的ではないが、Ｉ
ＣＥ遺伝子を直接に機能的発現させ、適当な発現ベクタ
ー系においてＩＣＥを含むｃＤＮＡライブラリーを構築
することを挙げることができる。別の方法は、バクテオ
リオファージまたはプラスミドシャトルベクターにおい
て構築されたＩＣＥを含むｃＤＮＡライブラリーを、Ｉ
ＣＥサブユニットのアミノ酸配列から設計された標識オ
リゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングする
ことからなる。好ましい方法は、バクテオリオファージ
またはプラスミドシャトルベクターにおいて構築された
ＩＣＥを含むｃＤＮＡライブラリーを、ＩＣＥサブユニ
ットをコードする部分ｃＤＮＡでスクリーニングするこ
とからなる。この部分ｃＤＮＡは、精製ＩＣＥサブユニ
ットのアミノ酸配列から縮重オリゴヌクレオチドプライ
マーを設計して、ＩＣＥＤＮＡフラグメントを特異的
ＰＣＲ増幅することにより得られる。

【００３０】他のタイプのライブラリー及び他の細胞ま
たは細胞系から構築されたライブラリーも、ＩＣＥをコ
ードするＤＮＡを単離するのに有効となり得ることは当
業者には容易に明らかである。他のタイプのライブラリ
ーとしては、限定的ではないが、ＴＨＰ．１細胞以外の
他の細胞または細胞系から誘導されるｃＤＮＡライブラ
リーや、ゲノムＤＮＡライブラリーを挙げることができ
る。

【００３１】適当なｃＤＮＡライブラリーは、ＩＣＥ活
性を有する細胞または細胞系から調製し得ることは当業
者には容易に明らかである。ＩＣＥｃＤＮＡを単離す
るためのｃＤＮＡライブラリーを作製するのに使用する
細胞または細胞系の選択は、まず前述したＩＬ−１β前
駆体切断アッセイを使用して細胞に伴なうＩＣＥ活性を
測定することにより行ない得る。

【００３２】ｃＤＮＡライブラリーの作製は、当分野に
おいて良く知られている標準的な技術によって行なうこ
とができる。良く知られたｃＤＮＡライブラリー構築技
術は、例えばＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭ
ａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８２）に記載されて
いる。

【００３３】ＩＣＥをコードするＤＮＡは、適当なゲノ
ムＤＮＡライブラリーから単離し得ることも当業者には
容易に明らかである。

【００３４】ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当分
野において良く知られた標準的な技術によって行なうこ
とができる。良く知られたゲノムＤＮＡライブラリー構
築技術は、例えばＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓ
ｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８２）に記載さ
れている。

【００３５】好ましい方法によってＩＣＥ遺伝子をクロ
ーニングするためには、ＩＣＥのアミノ酸配列決定が必
要である。これを行なうために、ＩＣＥタンパク質を精
製し、自動シークエネーターによって部分アミノ酸の配
列を決定することができる。全アミノ酸配列を決定する
必要はないが、部分ＩＣＥＤＮＡフラグメントをＰＣ
Ｒ増幅するために、２０ｋＤａ及び１０ｋＤａサブユニ
ットの両方からアミノ酸６〜８個の２つの領域の一次配
列を決定する。

【００３６】一旦適当なアミノ酸配列が同定されたな
ら、それらをコードし得るＤＮＡ配列を合成する。遺伝
コードは縮重しているため、特定のアミノ酸をコードす
るのに１つ以上のコドンを使用することができ、従って
１組の類縁ＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによっ
てアミノ酸配列をコードすることができる。組内のただ
１つのメンバーのみがＩＣＥ配列と同一であるが、不一
致を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドが存在してもＩＣＥ
ＤＮＡにハイブリダイズし得る。不一致のＤＮＡオリ
ゴヌクレオチドでもＩＣＥＤＮＡに実質的にハイブリ
ダイズし、ＩＣＥをコードするＤＮＡの同定及び単離す
ることができる。

【００３７】好ましい方法を使用し、ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）に基づく技術とｃＤＮＡライブラリース
クリーニングとを使用する２段階方法においてＩＣＥを
コードするｃＤＮＡクローンを単離する。第１段階で
は、２０ｋＤａ及び１０ｋＤａの精製ＩＣＥサブユニッ
トから得たＮＨ₂末端及び内側アミノ酸配列情報を使用
して、ＩＣＥ特異的ＤＮＡフラグメントの増幅のための
縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。第２段
階では、上記フラグメントをクローニングして、ＴＨ
Ｐ．１細胞（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ２０２）から誘導され
た市販のλｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ）から全長ｃＤＮＡを単離するためのプローブと
して作用させる。

【００３８】２０ｋＤａ及び１０ｋＤａの精製ＩＣＥサ
ブユニット由来のアミノ酸配列情報は、無傷の２０ｋＤ
ａ及び１０ｋＤａサブユニットと、特定のタンパク質加
水分解切断によって作製した２０ｋＤａ及び１０ｋＤａ
サブユニットのペプチドフラグメントとの両方のアミノ
酸配列を、エドマン化学法を使用して自動的に決定する
ことにより得る。２０ｋＤａ及び１０ｋＤａのＩＣＥサ
ブユニットの酵素によるフラグメント化は、トリプシン
（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはエンドプロテイナーゼＡｓ
ｐ．Ｎ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）の
いずれかを使用して行った。消化する前に、個々のＩＣ
Ｅサブユニットをシステイン残基のところで、４−ビニ
ルピリジンによって還元的アルキル化した。４０〜５０
ｐｍｏｌの２０ｋＤａまたは１０ｋＤａＩＣＥサブユ
ニットを、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ，１ｍＭＥＤＴ
Ａ，０．２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５を含む
溶液５０μｌ中に溶解する。２．５μｌの７１ｍＭ β
−メルカプトエタノールを加え、次いで溶液を暗所でア
ルゴン下に室温で２時間インキュベートする。３７０ｍ
Ｍ４−ビニルピリジン溶液２μｌを加え、得られた溶
液を暗所でアルゴン下に室温で更に２時間インキュベー
トする。次いでアルキル化ＩＣＥサブユニットを、１５
％から９０％のＢの直線濃度勾配を使用するＣ−４逆相
クロマトグラフィー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｂｕｔｙｌ，７ミクロンカラム）によって２６分
間で脱塩した（緩衝液Ａ＝０．０６％ＴＦＡ水溶液；緩
衝液Ｂ＝８９．９９％アセトニトリル，１０％Ｈ₂Ｏ，
０．０５５％ＴＦＡ）。トリプシン対ＩＣＥサブユニッ
トの比（ｗ／ｗ）を１：１００（１０ｎｇのトリプシン
に対して１０００ｎｇ（５０ｐｍｏｌ）の２０ｋＤａサ
ブユニット；５ｎｇのトリプシンに対して５００ｎｇ
（５０ｐｍｏｌ）の１０ｋＤａサブユニット）として、
５０μｌの５０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液，ｐＨ
９．０中で３７℃で１６時間、トリプシン消化を行なっ
た。また、エンドプロテイナーゼＡｓｐ．Ｎ対ＩＣＥ
サブユニットの比（ｗ／ｗ）を１：２０（４０ｎｇのＡ
ｓｐ．Ｎに対して８００ｎｇ（４０ｐｍｏｌ）の２０ｋ
Ｄａサブユニット；２０ｎｇのＡｓｐ．Ｎに対して４０
０ｎｇ（４０ｐｍｏｌ）の１０ｋＤａサブユニット）と
して、５０μｌの５０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液，
ｐＨ９．０中で２５℃で３６時間、エンドプロテイナー
ゼＡｓｐ．Ｎ消化を行なった。

【００３９】規定の時間インキュベートした後、５μｌ
の１０％ＴＦＡを加えることにより消化を停止し、得ら
れたペプチドフラグメントを、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ１３０ＡＳｅｐａｒａｔｉｏｎＳ
ｙｓｔｅｍにおけるＣ−１８逆相ＨＰＬＣによって分画
化する。逆相クロマトグラフィー条件としては、流量２
００μｌ／分及び温度５２℃で動作するＶｙｄａｃＣ
−１８カラム（２．１×１００ｍｍ）の使用を含む。緩
衝液Ａは０．０６％ＴＦＡ水溶液であり、一方、緩衝液
Ｂは８９．９９％アセトニトリル／１０％Ｈ₂Ｏ／０．
０５５％ＴＦＡである。ペプチドは、２％Ｂから７５％
Ｂの濃度勾配を用いて６０分間、次いで７５％Ｂから９
５％Ｂの濃度勾配を用いて１０分間溶出させ、２１４ｎ
ｍ（０．２５ＡＵＦＳ）において検出する。

【００４０】エドマン化学法による自動アミノ酸配列決
定は、オンラインＰＴＨ−アミノ酸同定のために１２０
Ａアナライザーに接続されたＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ４７７Ａ装置において実施した。無傷の
２０ｋＤａ及び１０ｋＤａサブユニットの配列を決定す
るために、１５ｐｍｏｌのタンパク質を定期的にシーク
エネーターに与え、また、酵素処理により誘導されたペ
プチドフラグメントについては５〜２０ｐｍｏｌを使用
した。

【００４１】表３は、無傷のＩＣＥサブユニットの配列
分析から決定された、２０ｋＤａ及び１０ｋＤａのＩＣ
Ｅサブユニットから得られたアミノ酸配列の詳細を示
す。無傷の１０ｋＤａタンパク質の配列決定を行なった
とき、相同タンパク質の単一遊離アミノ末端と一致する
単一の配列が常に認められた。無傷の２０ｋＤａタンパ
ク質の配列を決定したときには、ほとんどの部分におい
て単一遊離アミノ末端が認められた。しかしながら場合
によっては、無傷の２０ｋＤａタンパク質を含む高度に
精製された調製物において、二次配列が検出された。二
次配列が認められたことは、２４ｋＤａタンパク質が２
０ｋＤａＩＣＥサブユニットと同時精製されることに一
致する（図１１）。二次配列が得られたタンパク質は、
一次配列が得られた２０ｋＤａタンパク質よりも混合物
中で劣勢であり、二次配列を２２ｋＤａタンパク質に割
当てることができる（図３）。２２ｋＤａタンパク質と
２０ｋＤａＩＣＥサブユニットのアミノ末端配列を比
較すると、２２ｋＤａタンパク質は、２０ｋＤａＩＣ
ＥサブユニットのＮＨ₂末端に直接対応するアミノ酸配
列と、アミノ酸１６個のＮＨ₂末端伸長部とを含むこと
が判明した（図１６）。２４ｋＤａタンパク質と２０ｋ
Ｄａタンパク質の重複配列の唯一の相違は、２４ｋＤａ
タンパク質において＋１位置にあるＡｓｐがＡｓｎで置
換されていることである。

【００４２】縮重オリゴヌクレオチドは、２０ｋＤａ及
び１０ｋＤａの両タンパク質のアミノ末端及び内側領域
由来のアミノ酸配列に基づいて設計した（実施例２
３）。２０ｋＤａタンパク質においては、アミノ末端プ
ライマーＧＡＹＣＣＮＧＣＮＡＴＧＣＣＮＡＣ（ＳＥ
Ｑ．ＩＤ．ＮＯ．：３）は１２８倍通りの縮重があり、
一方、内側プライマー３’−ＡＴＲＧＧＮＴＡＤＴＡＣ
ＣＴＲＴＴ−５’（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．：４）は４８
通りの縮重があった（図１７）。１０ｋＤａタンパク質
においては、アミノ末端プライマーＧＣＮＡＴＨＡＡＲ
ＡＡＲＧＣＮＣＡ（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．：５）は１９
２通りの縮重があり、一方、内側プライマーＧＴＹＴＡ
ＣＧＧＮＴＧＮＴＧＮＣＴ（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．：
６）は１２８通りの縮重があった（図１８）。

【００４３】ＴＨＰ．１細胞ポリＡ＋ｍＲＮＡから一重
鎖ＴＨＰ．１ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ鋳型として使
用した。ＰＣＲは実質的に、ＭＯＰＡＣ法の改変法〔Ｌ
ｅｅｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９，１２８８
（１９８８）〕に記載されているように実施した。各Ｐ
ＣＲにおいて、１０ｐｍｏｌの各プライマーを、５０ｍ
ＭＫＣｌ、１０ｍＭＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０１％ｖ／ｖゼラ
チン、及び２０ｕＭの各ｄＮＴＰからなる終容積１０μ
ｌの緩衝液中で、０．４μｇのポリＡ＋ｍＲＮＡに対し
て合成された量のｃＤＮＡに加えた。ＰＣＲプログラム
は、１００℃で１０分間変性し、２単位のＴａｑポリメ
ラーゼを加えた後、９５℃で３０秒間のステップ、４８
℃で３０秒間のステップ及び７０℃で１分間のステップ
からなるサイクルを３０回繰り返すことからなった。２
０ｋＤａのタンパク質に対しては１１６ｂｐのＰＣＲ産
物が合成され、そのアイデンティティを、内側イノシン
置換オリゴヌクレオチド［ＡＴＩＧＧＲＴＡＩＡＴＹＴ
ＣＩＧＣＲ］（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．：７）とハイブリ
ダイズすることにより検証し、１０ｋＤａのタンパク質
に対しては２２１ｂｐのＰＣＲ産物が合成され、同様の
タイプのプローブ［ＡＴＩＧＡＲＡＡＲＧＡＹＴＴＹＡ
ＴＩＧＣ］（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．：８）を用いて検証
した。両ＰＣＲ産物をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にサブクローニングし、チ
ェーンターミネーション法〔Ｓａｎｇｅｒｅｔａ
ｌ．，ＰＮＡＳ７４，５４６３（１９７７）〕によっ
て配列決定した。

【００４４】２０ｋＤａ及び１０ｋＤａのＩＣＥサブユ
ニット由来のＰＣＲ産物の推定核酸配列（それぞれ図１
９及び２０，実施例２３）は、ＰＣＲ増幅のためのプラ
イマーまたはプローブの設計において使用しなかった既
に配列決定されているトリプシンペプチド（図１９及び
図２０）の幾つかと完全な一致を見せる。

【００４５】実施例２３のＰＣＲ誘導産物を、ＴＨＰ．
１細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のλｇｔ１０ｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングするためのハイブリダイ
ゼーションプローブとして使用した。ライブラリーの平
板培養及びプラークリフト（ｐｌａｑｕｅｌｉｆｔ
ｓ）は標準方法で行った〔Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．
Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙＭａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８２）〕。プ
ローブは、ランダムプライマー処理し、³²Ｐ−ｄＣＴＰ
で標識して高比活性にし、各プローブを用いてライブラ
リーを別個にスクリーニングした（６００，０００プラ
ーク／スクリーン）。プローブはハイブリダイゼーショ
ン緩衝液（５０％ホルムアミド、５ＸＤｅｎｈａｒｄ
ｔｓ、６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣ＝０．１５Ｍ）、
０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）に
１×１０⁶ｃｐｍ／ｍｌで加えた。

【００４６】１０ｋＤａ特異的プローブを使用して１１
個のハイブリダイズ陽性ファージを検出し、また、２０
ｋＤａプローブを使用して７個のハイブリダイズ陽性フ
ァージを認めた。

【００４７】長さが１．０ｋｂ〜１．６ｋｂであって、
アミノ酸４０４個の単一読取り枠を含む幾つかのｃＤＮ
ＡクローンをｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に
サブクローニングし、チェーンターミネーション法〔Ｓ
ａｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，
７４，ｐｐ５４６３，１９７７〕によって全体を双方向
から配列決定した。

【００４８】ＩＣＥをコードする全長ｃＤＮＡの配列を
表５に示し、これをクローンＯＣＰ９と称する。クロー
ン化ｃＤＮＡ由来のＩＣＥの推定アミノ酸配列を表６に
示す。推定アミノ酸配列の調査から、アミノ酸４０４個
の大きな単一読取り枠の存在が明らかとなった。天然Ｉ
ＣＥの精製２０ｋＤａ及び１０ｋＤａサブユニットから
誘導されるアミノ酸配列と比較すると、読取り枠コーデ
ィング配列内のアミノ酸１１９個の付加物が、２０ｋＤ
ａサブユニットのアミノ末端に位置している。２０ｋＤ
ａ及び１０ｋＤａのＩＣＥサブユニットの配列に加え
て、２４ｋＤａのタンパク質のＮＨ₂末端全体がこの読
取り枠においてコードされる。

【００４９】質量分析計で測定した分子量と、推定アミ
ノ酸配列によって計算した分子量とを比較すると、２０
ｋＤａ及び１０ｋＤａのＩＣＥサブユニットの両方にお
いて分子量に正確な相関がある。１０ｋＤａサブユニッ
トでは、推定配列から決定された分子量は１０，２４２
（アミノ酸３１７〜４０４）であり、これは質量分析計
による測定値と全く一致した。２０ｋＤａサブユニット
では、推定配列（１９，８４４、アミノ酸１２０〜２９
７）と質量分析計による測定値とで２０原子質量単位未
満の差が認められる。

【００５０】個々のＩＣＥサブユニットを直接エドマン
配列決定することにより決定されたアミノ酸配列と、ｃ
ＤＮＡ由来の推定アミノ酸配列とでは、全長新生ＩＣＥ
タンパク質の１２０番目にある１つのアミノ酸を除き、
完全な配列一致が認められる。ｃＤＮＡ配列によれば、
全長タンパク質の１２０番目にはＡｓｎがコードされて
いる。このアミノ酸位置は、２０ｋＤａサブユニットの
ＮＨ₂末端に対応している。精製天然２０ｋＤａサブユ
ニット由来のアミノ酸配列では、ＮＨ₂末端アミノ酸は
Ａｓｐであることが判った。推定アミノ酸配列と既知の
アミノ酸配列とに唯一認められたこの相違は、２０ｋＤ
ａのＮＨ₂末端のＡｓｎが脱アミド化されてＡｓｐを形
成したことに起因し得る。

【００５１】２０ｋＤａサブユニットのＮＨ₂末端にＡ
ｓｎまたはＡｓｐが認められるか、またはＩＣＥポリペ
プチドにおいて全長タンパク質の１２０番目またはポリ
ペプチドフラグメント内にＡｓｎまたはＡｓｐが認めら
れるかは、ＩＣＥ活性に、あるとしても有意には影響し
ないと推定される。

【００５２】ＩＣＥ推定アミノ酸配列を更に調査する
と、アミノ酸位置１０３−１０４、１１９−１２０、２
９７−２９８及び３１６−３１７の各間でＩＣＥ様切断
部位が明らかとなった。かかる機構は、放射性標識した
ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳ｐ４５を、アフィニティ精製ＩＣ
Ｅの存在下にインキュベートすると、既知の精製ＩＣＴ
形態またはｐ４５の単一切断から生じ得る推定中間体と
大きさが等しい標識切断産物を精製するという知見によ
り立証される。テトラペプチドアルデヒドＩＣＥ阻害物
質はｐ４５の切断を特異的にブロックしたため、プロセ
ッシングは夾雑プロテアーゼによるものではなかった。
上記各部位におけるＡｓｐのＡｌａへの突然変異によっ
て、その特定部位におけるプロセッシングから予想され
る切断産物の形成は妨げられる。上記潜在的切断部位の
各々は、全長ＩＣＥタンパク質から２０ｋＤａ及び１０
ｋＤａのサブユニットを生成するよう作用し得、ＩＣＥ
の活性化及びプロセッシングのための自己触媒機構に関
与し得る。

【００５３】生物学的に活性な精製ＩＣＥは幾つかの異
なる物理的形態を有し得る。ＩＣＥは、全長新生もしく
は未プロセッシングポリペプチドとして、または一部プ
ロセッシングされたポリペプチドもしくはプロセッシン
グされたポリペプチドの混合体として存在し得るが、こ
のことは、全長ｃＤＮＡ（図２３）に対応するｉｎｖｉ
ｔｒｏ転写ｍＲＮＡを用いて無細胞ｉｎｖｉｔｒｏ翻
訳系をプログラミングすることで４５ｋＤａポリペプチ
ドを合成することにより立証される。認められるＩＣＥ
翻訳産物は、ＩＣＥｃＤＮＡの４０４個のアミノ酸を
コードする読取り枠の推定サイズと一致する。全長新生
ＩＣＥポリペプチドは特異的タンパク質加水分解切断作
用によって翻訳後修飾され、結果的に全長新生ポリペプ
チドのフラグメントを形成する。フラグメントまたはフ
ラグメントの物理的結合体は、ＩＣＥに伴なう全生物学
的活性（ＩＬ−１β前駆体を切断して成熟ＩＬ−１βと
する活性）を有し得るが、ＩＣＥ活性の程度は、個々の
ＩＣＥフラグメントと物理的に結合しているＩＣＥポリ
ペプチドフラグメントとで変わり得る。

【００５４】本明細書に記載の精製方法に従って天然資
源から誘導された実質的に純粋形態のＩＣＥは、単一ｍ
ＲＮＡによってコードされる２つのＩＣＥポリペプチド
フラグメントの結合体であることが判る。２つのＩＣＥ
ポリペプチドフラグメントは、２０ｋＤａ及び１０ｋＤ
ａの見掛けの分子量を有することが判っている。

【００５５】上述の方法によって得られたクローン化Ｉ
ＣＥｃＤＮＡは、適正なプロモーター及び他の適当な
転写調節エレメントを含む発現ベクター中に分子クロー
ニングすることにより組換え発現させ、原核または真核
宿主細胞中に移入して組換えＩＣＥを生産することがで
きる。かかる操作のための技術はＭａｎｉａｔｉｓ，
Ｔ，ｅｔａｌ．（上掲）に十分に記載されており、当
分野において公知である。

【００５６】本明細書において発現ベクターとは、遺伝
子のクローン化コピーの転写及び適当な宿主内でのそれ
らのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列と定義される。
このようなベクターを使用して、細菌、ラン藻、植物細
胞、昆虫細胞及び動物細胞のような種々の宿主中で真核
性遺伝子を発現させることができる。

【００５７】特別に設計されたベクターによって、細菌
−酵母または細菌−動物細胞のような宿主間のＤＮＡの
シャトルが可能となる。適正に構築された発現ベクター
は、宿主細胞中で自律複製するための複製開始部、選択
的マーカー、限定数の有効制限酵素部位、高コピー数の
可能性及び活性プロモーターを含むべきである。プロモ
ーターは、ＤＮＡに結合してＲＮＡ合成を開始するよう
にＲＮＡポリメラーゼに働きかけるＤＮＡ配列と定義さ
れる。強力なプロモーターは、ｍＲＮＡを高頻度で始動
させるものである。発現ベクターとしては、限定的では
ないが、クローニングベクター、修飾クローニングベク
ター、特に設定されたプラスミドまたはウイルスを挙げ
ることができる。

【００５８】種々の哺乳動物ベクターを使用して、哺乳
動物細胞中で組換えＩＣＥを発現させることができる。
組換えＩＣＥ発現に適当となり得る市販の哺乳動物発現
ベクターとしては、限定的ではないが、ｐＭＣｌｎｅｏ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ
−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰ
Ｖ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰ
Ｖ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２
４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲ
ＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈ
ｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣ
Ｃ３７４６０）及びλＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６
５）を挙げることができる。

【００５９】ＩＣＥをコードするＤＮＡは、組換え宿主
細胞中で発現させるために発現ベクター中にクローニン
グすることもできる。組換え宿主細胞は原核性でも真核
性でもよく、その例としては、限定的ではないが、細
菌、酵母、哺乳動物（非限定的には例えばヒト、ウシ、
ブタ、サル及び齧歯動物由来の細胞系）、昆虫細胞（非
限定的には例えばショウジョウバエ由来の細胞系）を挙
げることができる。市販されている適当な哺乳動物種由
来の細胞系としては、限定的ではないが、ＣＶ−１（Ａ
ＴＣＣＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣＣＲ
Ｌ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６
５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、３Ｔ
３（ＡＴＣＣＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴ
ＣＣＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣ
Ｌ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）、
ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ２６）及びＭＲＣ−
５（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）を挙げることができ
る。

【００６０】発現ベクターは、限定的ではないが、形質
転換、トランスフェクション、原形質体融合及びエレク
トロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）
を含む多数の技術の任意のものによって宿主細胞中に導
入することができる。発現ベクターを含む細胞をクロー
ン増殖させ、個々に分析してＩＣＥタンパク質を産生す
るか判定する。ＩＣＥ発現宿主細胞クローンの同定は、
限定的ではないが、抗ＩＣＥ抗体との免疫学的反応性、
及び宿主細胞に伴なうＩＣＥ活性の存在を含む幾つかの
手段によって行なうことができる。

【００６１】ＩＣＥＤＮＡの発現は、ｉｎｖｉｔｒ
ｏ生産した合成ｍＲＮＡを使用して行なうこともでき
る。合成ｍＲＮＡは、限定的ではないが、コムギ胚抽出
物及び網状赤血球抽出物を含む種々の無細胞系中で効率
的に翻訳することもできるし、限定的ではないが、カエ
ル卵母細胞中にマイクロインジェクションすることを含
む細胞ベースの系において効率的に翻訳することもでき
るが、カエル卵母細胞へのマイクロインジェクションが
好ましい。

【００６２】最適レベルの酵素活性及び／またはＩＣＥ
タンパク質を与えるＩＣＥｃＤＮＡ配列を決定するた
めに、限定的ではないが、ＩＣＥｃＤＮＡの全長読取
り枠（４５ｋＤａ＝塩基４〜塩基１２１５）及び、２０
ｋＤａ及び１０ｋＤａサブユニットの両方をコードする
ｃＤＮＡ部分を含む幾つかの構築物を含むＩＣＥｃＤ
ＮＡ分子を構築することができる。全ての構築物は、Ｉ
ＣＥｃＤＮＡの３’未翻訳領域（塩基１２１６〜１４
８８）を全く含めずにまたは全部もしくは一部を含むよ
うに設計することができる。ＩＣＥ活性及びタンパク質
発現レベルは、上記構築物を適当な宿主細胞中に単独で
または組合せて導入することで測定することができる。
トランジェントアッセイ（ｔｒａｎｓｉｅｎｔａｓｓ
ａｙ）において最適発現を与えるＩＣＥｃＤＮＡカセ
ットを決定したら、このＩＣＥｃＤＮＡ構築物を、限定
的ではないが、哺乳動物細胞、バキュロウイルス感染昆
虫細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ及び酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅを含む種々の発現ベクターに移入する。

【００６３】トランスフェクトした哺乳動物細胞及びマ
イロクインジェクションした卵母細胞のＩＣＥ酵素活性
レベル及びＩＣＥタンパク質レベルは以下の方法によっ
て評価する。ＩＣＥ酵素活性を評価する第１の方法は、
ＩＣＥに対する天然基質である３１．５ＫＩＬ−１β
前駆体をＩＣＥと同時に直接導入することを含む。発現
したＩＣＥの基質特異性を評価するために、ＩＣＥ切断
部位のアミノ酸が置換されているＩＬ−１β前駆体基質
を試験する。哺乳動物細胞の場合には、これは、一方が
ＩＣＥｃＤＮＡを含み、他方がプレＩＬ−１β ｃＤ
ＮＡを含む２つのプラスミドを同時トランスフェクショ
ンすることを含む。卵母細胞の場合には、これは、ＩＣ
Ｅに対する合成ｍＲＮＡ及びＩＬ−１β前駆体に対する
合成ｍＲＮＡの両方を同時インジェクションすることを
含む。発現するのに適当な時間を経た後、細胞タンパク
質を³⁵Ｓ−メチオニンで２４時間かけて代謝標識し、そ
の後、細胞溶解物及び細胞培養上清を回収し、ＩＬ−１
βタンパク質に対するポリクローナル抗体を用いて免疫
沈降を実施する。野生型前駆体の２８Ｋ及び１７Ｋ形態
への切断、及び（Ａｓｐ１１６からＡｌａ１１６への）
変性下流プロセッシング部位を含む前駆体の２８Ｋ形態
への切断を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに基づくアッセイに
よって評価する。

【００６４】ＩＣＥ活性を検出する第２の方法は、ＩＣ
ＥｃＤＮＡを用いてトランスフェクトした哺乳動物細
胞またはＩＣＥｍＲＮＡを注入した卵母細胞から調製
した細胞溶解物においてＩＣＥ活性を直接測定すること
を含む。このアッセイは、ＩＬ−１β切断部位にまたが
るＩＬ−１β前駆体タンパク質または合成ペプチドを使
用して行なうことができる。前駆体の切断産物はゲルベ
ースの標準アッセイによって分析し、ペプチドの切断産
物はＨＰＬＣによって分析する。

【００６５】宿主細胞中のＩＣＥタンパク質のレベル
は、イムノアフィニティ及び／またはリガンドアフィニ
ティ技術によって定量化される。ＩＣＥ特異的アフィニ
ティビーズまたはＩＣＥ特異的抗体を使用して、³⁵Ｓ−
メチオニン標識または非標識ＩＣＥタンパク質を単離す
る。標識ＩＣＥタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって
分析する。非標識ＩＣＥタンパク質は、ウェスタンブロ
ット法、ＥＬＩＳＡ、またはＩＣＥ特異的抗体を使用す
るＲＩＡアッセイによって検出する。

【００６６】組換え宿主細胞中でＩＣＥを発現させた
後、ＩＣＥタンパク質を回収すると、ＩＬ−１β前駆体
を成熟ＩＬ−１βに切断し得る活性形態のＩＣＥを与え
ることができる。幾つかのＩＣＥ精製方法の使用可能で
あり、適している。天然資源由来のＩＣＥの精製につい
て上記したように、組換えＩＣＥは細胞溶解物及び抽出
物からまたはならし培地から、例えば塩析（ｓａｌｔ
ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、イオン交換クロマトグ
ラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシ
ルアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性相互作
用クロマトグラフィーといった方法を種々に組合せてま
たは個々に適用して精製することができる。

【００６７】更に、組換えＩＣＥは、全長新生ＩＣＥ、
ＩＣＥのポリペプチドフラグメントまたは２０ｋＤａ及
び１０ｋＤａのＩＣＥサブユニットに特異的なモノクロ
ーナルまたはポリクローナル抗体を用いて構成したイム
ノアフィニティーカラムを使用することにより他の細胞
タンパク質から単離することができる。

【００６８】ＩＣＥに対する単一特異性抗体は、ＩＣＥ
に対して反応性を示す抗体を含む哺乳動物抗血清から精
製するか、または、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉ
ｎ，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７（１９７
５）の技術を使用して、ＩＣＥに対して反応性を示すモ
ノクローナル抗体として調製する。本明細書において単
一特異性抗体とは、ＩＣＥに対して同種結合特性を有す
る単一抗体種または複数抗体種と定義される。本明細書
において同種結合（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓｂｉｎｄｉ
ｎｇ）とは、上述のごときＩＣＥに伴なうような特定の
抗原またはエピトープに結合する抗体種の能力を指す。
酵素特異的抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサ
ギ、ヤギ、ウマなどの哺乳動物、好ましくはウサギを、
免疫アジュバントを含むまたは含まない適当な濃度のＩ
ＣＥで免疫することにより産生される。

【００６９】前免疫血清を回収してから初回免疫を行な
う。各動物は、容認可能な免疫アジュバントを伴って約
０．１μｇ〜約１０００μｇのＩＣＥを受取る。かかる
容認可能なアジュバントとしては、限定的ではないが、
完全フロイント、不完全フロイン、ミョウバン沈降物、
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒｖｕｍ及びｔ
ＲＮＡを含む油中水型エマルジョンを挙げることができ
る。初回免疫は、好ましくは完全フロイントアジュバン
ト中の酵素を、皮下（ＳＣ）もしくは腹腔内（ＩＰ）ま
たは両方で複数部位に投与することからなる。抗体力価
を測定するために、各被検動物から定期的に、好ましく
は毎週採血する。被検動物は、初回免疫の後に二次免疫
注射を受けても受けなくてもよい。二次免疫注射を受け
る被検動物には、不完全フロイントアジュバント中の同
量の酵素を同じ経路で与える。二次免疫注射は、約３週
間の間隔で、最大力価が得られるまで与える。各二次免
疫の約７日後または単回免疫のあとおおよそ毎週、被検
動物から採血し、血清を回収し、アリコートを約−２０
℃で保管する。

【００７０】ＩＣＥに反応性を示すモノクローナル抗体
（ｍＡｂ）を、近交系マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃ
をＩＣＥで免疫することにより作製する。マウスは、上
述のごとき同量の容認可能なアジュバント中に配合され
た０．５ｍｌの緩衝液または生理食塩水中、約０．１μ
ｇ〜約１０μｇ、好ましくは約１μｇのＩＣＥを用い
て、ＩＰまたはＳＣ経路で免疫する。完全フロイントア
ジュバントが好ましい。マウスは０日目に初回免疫を受
け、約３〜約３０週間安静にする。免疫マウスに、リン
酸緩衝溶液のような緩衝液中の約０．１〜約１０μｇの
ＩＣＥの二次免を静脈内（ＩＶ）経路で１回以上与え
る。抗体陽性マウス由来のリンパ球、好ましくは脾臓リ
ンパ球を、当分野においては公知の標準方法によって免
疫マウスから脾臓を取り出すことにより入手する。脾臓
リンパ球を適当な融合相手、好ましくは骨髄腫細胞と、
安定ハイブリドーマを形成し得る条件下に混合すること
により、ハイブリドーマ細胞を作製する。融合相手とし
ては、限定的ではないが、マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／
Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４；及びＳｐ２
／０を挙げることができるが、好ましいのはＳｐ２／
０である。抗体産生細胞と骨髄腫細胞は、ポリエチレン
グリコール約１０００ｍｏｌ．ｗｔ．中で濃度約３０％
〜約５０％で融合する。融合ハイブリドーマ細胞を、ヒ
ポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを補充した
ダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で当分野に
おいて公知の方法によって増殖させることで選択する。
約１４、１８及び２１日目に増殖陽性ウェルから上清液
を回収し、抗原としてＩＣＥを使用する固相イムノラジ
オアッセイ（ＳＰＩＲＡ）のようなイムノアッセイによ
って、抗体産生についてスクリーニングする。更にｍＡ
ｂのイソタイプを判定するために、オクテルロニー沈降
アッセイにおいて培養液を試験した。抗体陽性ウェル由
来のハイブリドーマ細胞を、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｓ
ｏｆｔＡｇａｒＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｉｎＴｉｓ
ｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＫｒｕｓｅａｎｄＰａｔｅ
ｒｓｏｎ，Ｅｄｓ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，
１９７３の軟質寒天法のような技術によってクローニン
グする。

【００７１】約０．５ｍｌ／マウスのプリスタンで初回
免疫したＢａｌｂ／ｃマウスに、初回免疫の約４日後に
約２×１０⁶〜約６×１０⁶のハイブリドーマ細胞を注射
することにより、モノクローナル抗体をｉｎｖｉｖｏ
で産生させる。細胞移入の約８〜１２日後に腹水を採取
し、当分野においては公知の方法によりモノクローナル
抗体を精製する。

【００７２】約２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中でハ
イブリドーマを増殖させて、十分な量の特異的ｍＡｂを
得ることにより、抗プレＩＬ−１βｍＡｂをｉｎｖｉ
ｔｒｏで生産する。当分野においては公知の方法でｍＡ
ｂを精製する。

【００７３】腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体力
価を、限定的ではないが、沈降、受身凝集、酵素結合イ
ムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法及びラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）法を含む種々の血清学的及び免
疫学的アッセイによって測定する。同様のアッセイを使
用して、体液または組織及び細胞抽出物中のＩＣＥの存
在を検出する。

【００７４】単一特異性抗体を生産する上述の方法を使
用して、ＩＣＥポリペプチドフラグメント、または全長
新生ＩＣＥポリペプチドまたは個々の２０ｋＤａ及び１
０ｋＤａのサブユニットに特異的な抗体を生産し得るこ
とは当業者には容易に明らかである。特に、２０ｋＤａ
のＩＣＥサブユニットにのみ、１０ｋＤａのＩＣＥサブ
ユニットにのみ、または全長新生ＩＣＥ分子にのみ特異
的な単一特異性抗体を生産し得ることも当業者には容易
に明らかである。

【００７５】ＩＣＥ抗体アフィニティーカラムは、抗体
を、ゲル支持体であるＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒ
ａｄ）に加えることにより作製される。Ａｆｆｉｇｅｌ
−１０は、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結
合を形成するように、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを
用いて予め活性化する。次いで、スペーサアームを介す
るアミド結合によって抗体をゲルに結合させる。次いで
１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）を用いて、
残りの活性化エステルの反応を停止させる。カラムをま
ず水で、次いで０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ
２．６）で洗浄して、全ての未結合抗体または外来タン
パク質を除去する。次いでカラムをリン酸緩衝溶液（ｐ
Ｈ７．３）で平衡化し、ＩＣＥまたはＩＣＥサブユニッ
トを含む細胞培養液上清または細胞抽出物をゆっくりカ
ラムに通す。次いでカラムをリン酸緩衝溶液で、光学密
度（Ａ₂₈₀）がバックグラウンドに達するまで洗浄し、
タンパク質を０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．
６）を用いて溶出させる。次いで、精製ＩＣＥタンパク
質をリン酸緩衝溶液に対して透析する。

【００７６】全長ＩＣＥをコードするｃＤＮＡを含むプ
ラスミドｐＧＥＭ−Ｚｆ（−）をｐＯＣＰ９と称した。
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＨＢ１０１中のｐＯＣＰ９試料を、ブタ
ペスト条約のもとに、１９９１年８月１５日以前（１９
９１年７月３１日）に、１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ
Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ．，２０８５
２のＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎの永久培養体コレクションに寄託
し、寄託番号ＡＴＣＣ６８６５５が割り当てられてい
る。

【００７７】以下、非限定的な実施例により本発明を説
明する。

【００７８】実施例１無細胞抽出物の調製白血球泳動法（ｌｅｕｋｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって
健康な供血者からヒト末梢血液単球を採取し、Ｌｙｍｐ
ｈｏｃｙｔｅＳｅｐａｒａｔｉｏｎＭｅｄｉａ（Ｏ
ｒｇａｎｏｎＴｅｋｎｉｋａ）による沈殿及びＢｅｃ
ｋｍａｎ向流遠心機による分粒をＷｉｃｋｅｒ他、Ｃｅ
ｌｌ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.１０６：３１８〜３２９（１９８
７）に記載のごとく順次行なって精製した。抗ＭＡＣ１
抗体による標識及びＦＡＣＳ分析を順次行なって単球を
同定した。１０％ウシ胎仔血清（ＨｙｃｌｏｎｅＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、検出可能な内毒素を含まない既
定血清）を添加したダルベッコの改質最小必須培地（Ｈ
ａｚｅｌｔｏｎ）中、３７℃で、ヒトＴＨＰ−１細胞
（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ）を濃度１×１０⁶細胞／ｍｌまで浮
遊増殖させた。ＴＨＰ−１細胞をまた、７５または２０
０リットルの発酵槽で、内毒素をわずかに含有する１０
％ウマ血清を加えたＩｓｃｏｖｅｓ培地中で、ｐＨ７.
２、溶存酸素２０〜５０％、溶存炭酸ガス２〜５％、温
度３７℃に調節した条件下で、水中プロペラ翼で速度９
０ｒｐｍで攪拌しながら増殖させた。０.６ｕＭの膜の
５０平方フィートあたりに２ｐｓｉ未満の圧力を作用さ
せたＭｉｌｌｉｐｏｒｅＰｒｏｓｔａｋ交差流膜濾過
系を用いて細胞を採取した。採取した細胞を遠心してペ
レットにし、ダルベッコのＰＢＳで洗浄し、２５ｍＭの
ＨＥＰＥＳｐＨ７.５と５ｍＭのＭｇＣｌ₂と１ｍＭの
ＥＧＴＡを含み、更に１ｍＭのＰＭＳＦと１０μｇ／ｍ
ｌのロイペプチンと１０μｇ／ｍｌのペプスタチンＡと
を含むプロテアーゼインヒビターを含む低張バッファに
よって溶解した。Ｓ−３の調製後に、ＤＴＴ及びＣＨＡ
ＰＳを夫々最終濃度２ｍｍ及び０.１％まで添加した。
懸濁フラスコまたは発酵槽中で使用した培地はまた、細
胞に対する剪断力を抑制するために０.１〜０.３％のＦ
６８ｐｌｕｒｏｎｉｃを含有していた。典型的には、
保存細胞サンプルの再培養開始から３〜４箇月以内の期
間細胞を増殖させた。

【００７９】低張溶解バッファ中の窒素キャビテーショ
ンまたはホモジナイゼーションによってヒト末梢血液単
球とＴＨＰ−１細胞とから無細胞抽出物を調製した。
１,０００×ｇで遠心して細胞（例えば１５リットルの
ＴＨＰ−１細胞）を収集し、塩化マグネシウムまたは塩
化カルシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝塩類溶
液で３回洗浄し、１,０００×ｇで１０分間ペレット化
した。得られた細胞ペレットを、３倍容の低張バッファ
（２０ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７.
４、１.５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０.１ｍＭのＥＤＴＡ、１
ｍＭのＤＴＴ）に再度浮遊させ、氷浴上に２０分間維持
した。細胞をＤｏｕｎｃｅホモジナイザーで溶解し、２
０ストロークでホモジナイズした。より穏やかに溶解す
るために、細胞ペレットを低張バッファに再度浮遊さ
せ、ステンレススチール窒素圧力槽に入れ、窒素ガスで
００ｐｓｉに加圧し、攪拌しながら４℃に３０分間維持
した。圧力の解除と容器からの細胞の排出とを同時に行
なうことによって細胞を溶解した。このときに、細胞膜
は。高速の圧力解除及び剪断流によって有効にに破壊さ
れた。４００または１,０００×ｇで２０分間遠心する
ことによって細胞性ホモジネートを清澄化し、Ｓ−１と
命名した上清流体を−８０℃で保存した。調製直後のＳ
−１上清流体を更に３０,０００×ｇで１０分間遠心
し、Ｓ−２と命名した。Ｓ−２上清流体を更に３００,
０００×ｇで１.５時間遠心し、上清流体を収集してＳ
−３と命名した。

【００８０】また、ＴＨＰ−１細胞の無細胞抽出物は以
下の手法でも調製できた。細胞をＰＢＳ中で３回洗浄
し、２５ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７.５と５ｍＭのＭｇ
Ｃｌ₂と１ｍＭのＥＧＴＡとを含む低張バッファ中で１
０⁸細胞／ｍｌの濃度で０℃で２０分間浮遊させた。プ
ロテアーゼインヒビター（１ｍＭのＰＭＳＦと１０ｍｇ
／ｍｌのペプスタチン及びロイペプチン）を添加し、１
００または３００ｍｌの緊密に充填できるＤｏｕｎｃｅ
ホモジナイザーで夫々９０〜９５％破壊されるまで２５
または１５ストロークを用いて細胞を破壊した。破壊し
た細胞をＢｅｃｋｍａｎＧＰＲ遠心機中で５℃で３０
００ｒｐｍで１０分間遠心し、核及び未破壊の細胞を除
去した。核除去後の上清を、ＳＳ３４ロータを備えたＳ
ｏｒｖａｌ遠心機中で１６,０００ｒｐｍで２０分間遠
心し、次いでＢｅｃｋｍａｎ遠心機で５０,０００ｒｐ
ｍ（５０.２Ｔｉロータ）または４５,０００ｒｐｍ（４
５Ｔｉロータ）で６０分間遠心した。２ｍＭのＤＴＴと
０.１％のＣＨＡＰＳとを添加した後に、得られた上清
を−８０℃で保存した。

【００８１】実施例２塩分画化プレ−ＩＬ−１β変換酵素活性を濃縮し且つ部分的に精
製するために、実施例１で得られたＳ−３上清流体を硫
酸アンモニウムの添加によって順次沈殿させた。粒状硫
酸アンモニウムを５０ｍｌのＳ−３上清流体に４℃で４
５％飽和になるまで添加した。流体を氷上で攪拌しなが
ら１５分間平衡させた。１０,０００×ｇで遠心するこ
とによって濁った沈殿物を清澄化し、得られたペレット
を廃棄した。次いで、上記手順を用い、上清流体を硫酸
アンモニウムで８０％飽和させた。次に、沈殿物をペレ
ット化し、バッファＡ（２０ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭの
ＨＥＰＥＳｐＨ７.４、５.０ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭ
のＤＴＴ、１ｍＭのＰＭＳＦ、０.１％のＮＰ−４０
（Ｎｏｎｉｄｅｎｔ界面活性剤Ｐ−４０）、１０％グリ
セロール）に再浮遊させ、同じバッファに一夜透析し
た。透析した沈殿物を３０,０００×ｇで遠心し、粒状
物質を除去し、−８０℃で保存した。

【００８２】実施例３イオン交換クロマトグラフィー実施例２で得られた１０ｍｌの硫酸アンモニウム沈殿タ
ンパク質、即ち１１０ｍｇの総タンパク質を、バッファ
Ａで平衡させたＢｉｏ−ＲａｄＤＥＡＥ−５−ＰＷ
ＨＰＬＣアニオン交換カラムで処理した。タンパク質を
含有する分画を２８０ｎｍの吸光度によって検出した。
通過分画を保存し、次いでバッファＡで緩衝したＢｉｏ
−ＲａｄＳＰ−５ＰＷスルホプロリルカチオン交換カ
ラムに充填した。次に、バッファＡの３０〜５００ｍＭ
の直線勾配を使用して変換酵素活性を溶出させた。溶出
後、２８０ｎｍの吸光度によって決定したタンパク質含
有カラム分画を、バッファＡに１６時間透析した（Ｓｐ
ｅｃｔｒｕｍＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｏｄｕｃｔ
ｓ、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ膜、排除限界分子量８,０
００）。実施例４の手順を用い、個々の分画の変換酵素
活性を検定した。ＩＣＥ活性はプレ−ＩＬ−１βを開裂
し、生物学的活性リンフォカインである１７.５ｋＤａ
の物質を生成する。これらの塩及びｐＨ条件を用いた酵
素活性は、ＤＥＡＥアニオン交換樹脂には結合しない
が、スルホプロリルカチオン交換樹脂には結合するであ
ろう。ＩＣＥは不連続ピークとして溶出し、初期活性の
少なくとも５０％が回収された。

【００８３】実施例４ＩＣＥ活性のｉｎｖｉｔｒｏ検出アッセイ実施例１〜３及び５〜７で得られた分画によってプレ−
ＩＬ−１βを開裂するために、放射性標識した前駆物質
を含む１μｌのウサギ網状赤血球抽出物を１０〜２０μ
ｌの特異的分画と共にインキュベートした。放射性標識
したプレ−ＩＬ−１βを以下の手順で調製した。プレ−
ＩＬ−１βの完全コード配列を含む１.５キロ塩基（ｋ
ｂ）のｃＤＮＡクローンを、ＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔ■開裂
したｐＧＥＭ−３プラスミドＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｂｉｏｔｅｃ）に挿入し、当業界で公知の標準法によっ
て大腸菌中で増殖させた。標準法に概略に関しては、例
えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ他、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａ
ｂ.、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ、
（１９８２）を参照するとよい。精製したプラスミドを
ＰｓｔＩで直鎖化し、次いで、Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼｉｎｖｉｔｒｏ転写系（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔ
ｅｃ）を用いて転写し、次に、製造業者の指示に従って
ｍＲＮＡを処理した。ミクロコッカスヌクレアーゼ処理
したウサギ網状赤血球抽出物（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏ
ｔｅｃ）を、ｉｎｖｉｔｒｏ合成したｍＲＮＡと共
に、２５ｕＣｉの〔３５Ｓ〕メチオニン（１Ｃｉ＝３７
ＧＢｑ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）の存在下で、製造業者の指
示通りにプログラミングすることによって翻訳を行なわ
せた。この結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でダブレットとし
て泳動した見掛け分子量３４及び３１ｋＤａの標識プレ
−ＩＬ−１βが得られた。双方のバンドはＩＬ−１βの
カルボキシ末端に特異的な抗血清と免疫沈降し得る。イ
ンターロイキン−１β変換酵素活性、１７.５ｋＤａの
成熟ＩＬ−１βを産生させる標識プレ−ＩＬ−１βの開
裂をＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニタした。

【００８４】実施例１２で得られたペプチド基質のタン
パク質分解開裂を以下の手順で行なった。ジメチルスル
ホキシド中で濃度１０ｍＭのペプチドサンプルを調製し
た。これらの研究で使用した酵素をスルホプロリルカチ
オン交換クロマトグラフィーで精製した。反応混合物
は、約０.２ｍｇ／ｍｌの酵素と、０.２ｍＭのペプチド
と、１０％のショ糖と、０.１％のＣＨＡＰＳ（３−
〔（３−コラミドプロリル）ジメチル−アンモニオ〕−
１−プロパンスルホナト）と、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ
（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エ
タンスルホン酸）ｐＨ７.５とを５０μｌの反応容量
中に含んでいた。２５℃で種々の時間のインキュベーシ
ョン後に、４５０μｌの０.１％トリフルオロ酢酸を添
加して反応を停止させた。流速１ｍｌ／分の５％アセト
ニトリル、０.１％トリフルオロ酢酸で平衡させたＶｙ
ｄａｃＣ−１８カラム（４.６ｍｍ×２５ｃｍ、粒度
５μｍ、ポアサイズ３００）を使用してサンプルを逆相
高性能液体クロマトグラフィーによって分析した。５〜
３０％のアセトニトリル直線勾配を１０分間使用してペ
プチドを溶出させ、２８０ｎｍのカラム溶出液をモニタ
することによってペプチドを定量した。これらの条件下
に、どの場合にも基質及びチロシン含有物質をベースラ
イン法（ｂａｓｅｌｉｎｅｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）で
分離した。ペプチド標準を用いて開裂産物を同定した。

【００８５】実施例５サイズ排除クロマトグラフィー実施例３で得られたＩＣＥをサイズ排除クロマトグラフ
ィーによって更に精製した。バッファＡで平衡させた
７.５×６００ｍｍのＴＳＫＧ３０００ＳＷゲル排除
カラムに０.５ｍｌのタンパク質を充填した。カラムを
同じバッファで溶出させ、２８０ｎｍの吸光度によって
モニタした夫々の分画の変換酵素活性を検定した。イン
ターロイキン−１β変換酵素活性はカラムから見掛け分
子量３０,０００で溶出した。ＴＳＫＧ２０００カラ
ムを用いた同様の実験では、見掛け分子量２３,０００
が得られた。従って、天然型活性ＩＣＥの見掛け分子量
は２３,０００〜３０,０００である。

【００８６】上記のごとき独特の分離及び精製プロセス
を以下の第１表にまとめる。

【００８７】

【表１】

【００８８】実施例６疎水性相互作用クロマトグラフィー実施例３、５または６で得られたＩＣＥを疎水性相互作
用クロマトグラフィーによって更に精製した。固体硫酸
アンモニウムを最終濃度１.５Ｍまで添加後、２０ｍＭ
のＨＥＰＥＳｐＨ７.４と１.５Ｍの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄
と１０％のグリセロールと５ｍＭのＥＤＴＡと１ｍＭの
ＰＭＳＦと２ｍＭのＤＤＴとを含むバッファ中で平衡さ
せたシリカベースの疎水性相互作用カラム（Ｓｙｎｃｈ
ｒｏｍＳｙｎｃｈｒｏｐａｋｐｒｏｐｙｌ、４.６×
２５０ｍｍ）にタンパク質（１.５ｍｌ）を充填した。
１.５Ｍから０.０Ｍまで減少する（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄の連
続的直線勾配でカラムを溶出させた。カラム分画をバッ
ファＢに透析し、添加酵素活性を検定した。

【００８９】上記の独特の分離及び精製プロセスを以下
の第２表にまとめる。

【００９０】

【表２】

【００９１】実施例７ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィー実施例５及び６のＩＣＥをＢｉｏ−ＲａｄＨＰＨＴ分
析カートリッジを用いたヒドロキシルアパタイト吸着ク
ロマトグラフィーによって更に精製した。サンプルはＥ
ＤＴＡを含有してはならないので、通常は透析によって
ＥＤＴＡを除去する。カラムをバッファＢ（２０ｍＭの
ＨＥＰＥＳｐＨ７.４、５％のグリセロール、２ｍＭ
のＤＴＴ）中で平衡させた。１.５ｍｌのＩＣＥを添加
した後で、室温のバッファＢ中で０〜５００ｍＭのリン
酸カリウムの連続的直線勾配でカラムを溶出させた。分
画を収集し、直ちに氷に載せ、各分画のサンプルをバッ
ファＢに透析し、ＩＣＥ活性を測定した。

【００９２】実施例８インターロイキン−１β変換酵素のアミノ酸配列を決定
するための質量分析用精製プロセス実施例１の上清流体Ｓ−３を０.２２ｍの中空繊維フィ
ルターで清澄化し、ＡｍｉｃｏｎＹＭ３スパイラルカ
ートリッジで１０〜２０倍に濃縮し、２０ｍＭのトリス
ｐＨ７.８と１０％ショ糖と０.１％ＣＨＡＰＳと２ｍ
ＭのＤＴＴから成るバッファに対して一夜透析した（透
析膜の排除限界分子量８０００）。透析した上清（１０
００ｍｌのシトソール抽出物に対応する約３〜５ｇの総
タンパク質）を水で５００ミクロ未満のＳｉｅｍａｎｓ
導電率に調整し、４７５ｍｌのベッドボリュームのＤＥ
ＡＥ−５ＰＷＨＰＬＣ（Ｂｉｏｒａｄ）カラムに流し
た。同じバッファと０.５Ｍまで増加するＮａＣｌ勾配
と２２０ｍＭのトリスＨＣｌとを用いると、約４０ｍＭ
ＮａＣｌにＩＣＥ活性（実施例４）が溶出した。

【００９３】ＤＥＡＥカラムから溶出したＩＣＥ活性分
画をプールし、同量の７５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０％
（ｖ／ｖ）のショ糖、０.１％（ｖ／ｖ）のＣＨＡＰ
Ｓ、２ｍＭのＤＴＴバッファで希釈し、ｐＨ７.０に調
整した１５０ｍｌのベッドボリュームのＳＰ−５ＰＷ
ＨＰＬＣ（Ｂｉｏｒａｄ）カラムに流し、同じバッファ
中のＫＣｌ勾配（０〜０.５Ｍ）で溶出させた。ＩＣＥ
活性分画（約７５ｍＭ塩）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０〜
２０％、１７〜２７％、１６％または１８％ゲル）によ
ってクロマトグラフィー処理し、活性が検出されたバン
ドを決定するために銀染色した。実施例９参照。これら
のＳＰ−ＨＰＬＣ分画を更に、口径の小さいＣ４（ＡＢ
Ｉ）ＨＰＬＣカラムでクロマトグラフィー処理し、０.
１％ＴＦＡ中のアセトニトリル勾配で溶出させた。種々
のピーク（２１４ｎｍ）を乾燥させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
でクロマトグラフィー処理し、銀染色して、図１（実施
例８）に示すような２０〜２２及び１０ｋＤａタンパク
質の相対移動速度を確認した。

【００９４】２０ｋＤＡサブユニット及び１０ｋＤａサ
ブユニットのＮＨ₂末端アミノ酸配列を第３表に示す。

【００９５】

【表３】

【００９６】実施例９インターロイキン−１β変換酵素のドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動及び染色実施例２、３、５、６、７、８、１０で得られた精製Ｉ
ＣＥのドデシル硫酸ナトリウムポアクリルアミドゲル電
気泳動を、Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ２２７：６
８０〜６８５（１９７０）の方法にほぼ従って実施し
た。０.１５ｃｍ×１０ｃｍ×１０ｃｍのＢｉｏ−Ｒａ
ｄミニゲルを使用し、１５％アクリルアミド−０.４％
ビス−アクリルアミドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分解ゲルを流
込んだ。次いで、分解ゲルの上に、５％アクリルアミド
−０.１４％ビス−アクリルアミドから成る不連続な第
２の層を流込みによって形成した。重合後に、追跡染料
としてブロモフェノールブルーを含むＬａｅｍｍｌｉｓ
バッファに溶解した５０μｇ以下のタンパク質をゲルに
充填した。次いで、ゲルを５０Ｖで１／２〜１時間電気
泳動させ、次いで１５０Ｖでブロモフェノールブルー染
料がゲルから溶出し始めるまで電気泳動させた。ここで
電気泳動を停止させ、ゲルを銀染色用に処理する。

【００９７】電気泳動後に、Ｏａｋｌｅｙ他（Ａｎａｌ
ｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１０５：３
６１〜３６３、１９８０）によって開発された方法の修
正方法を行なうようにＤａｉｉｃｈｉから販売されてい
るキットを用いた銀染色によって分離タンパク質を可視
化し得る。簡単に説明すると、ゲルをまず２００ｍｌの
５０％メタノール：水混合物に３０分間浸漬させ、次い
で各２００ｍｌの脱イオン水で１０分間ずつ３回洗浄す
る。これらの初期洗浄後のゲルを、４０％メタノール；
１０％エタノール；０.５％グルタルアルデヒド；４９.
５％水の溶液に１５分間浸漬させ、次いで、各２００ｍ
ｌの脱イオン水を４回交換して１０分間ずつ完全に洗浄
する。最後に、Ｏａｋｌｅｙの手順でタンパク質の染色
及び可視化を行なう。

【００９８】ＩＣＥの段階的精製で得られた電気泳動パ
ターンを図１に示す。銀染色をパネルＡに示し、パネル
Ｂのプレ−ＩＬ−１β開裂活性と比較し得る。上記変換
酵素精製手順の途中で各２００ｎｇのアリコートを分離
した。各精製段階を以下の略号で示す：Ａ.Ｓ；硫酸ア
ンモニウム分画、ＤＥ−ＦＴ；ＤＥＡＥ通過物、Ｓ.
Ｐ.；ＳＰカチオン交換段階、ＨＩＣ；プロピル疎水性
相互作用クロマトグラフィー、ＴＳＫ；ＴＳＫ−１２５
サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＡＰ；ヒドロキシア
パタイトカラムクロマトグラフィー。最後のＴＳＫ及び
ＨＡＰ段階の２２及び１０ｋＤのタンパク質の出現は、
ＩＣＥ活性と相関関係を有することに注目されたい。代
替精製スキーム（Ａ.Ｓ.、ＤＥＡＥ、ＳＰ、ＨＡＰ、Ｔ
ＳＫ）によって精製されたＩＣＥ活性を、実施例７に記
載のごとくプロピル疎水性相互作用カラムで処理した。
タンパク質は実施例７の方法で記載したように逆塩勾配
で溶出した。溶出したタンパク質を透析し、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ及び銀染色（パネルＡ）によって分析しＩＣＥ活
性（パネルＢ）を測定した。２２及び１０ｋＤのタンパ
ク質（矢印）の溶出とＩＣＥ活性との間の相関関係に注
目されたい。

【００９９】実施例１１ＩＣＥのプロテアーゼインヒビター感受性ＴＨＰ.１Ｓ−３００にインヒビターを添加し実施例
４に記載のごとくＩＬ−β開裂を測定することによって
種々のインヒビターによるＩＣＥ変換酵素活性の阻害能
を測定した。第４表は試験インヒビターの一覧及びその
阻害活性の有無を示す。

【０１００】

【表４】

【０１０１】

【表５】

【０１０２】スルフヒドリルアルキル化試薬だけがＩＣ
Ｅ活性を阻害した。阻害がＩＣＥ活性に機械論的関係を
有するか否かは判明していない。もっと後の精製段階で
更に試験すると、すべての場合に同様の結果が得られ
た。どの場合にも、完全阻害（＋）または観察可能な阻
害無し（−）のいずれかによって阻害結果を判定した。

【０１０３】実施例１２ペプチド基質の合成フェニルアセトアミドメチル樹脂及びｔＢｏｃアミノ酸
を使用しＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相法によってペプチド
を合成した。ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
４３０Ａペプチドシンセサイザーを製造業者の指示手順
通りに用いて合成を実施した。９０％無水ＨＦ、１０％
アニソールで０℃で１時間処理して樹脂からペプチドの
脱保護及び開裂を同時に生じさせ、次いで１０％酢酸で
樹脂からペプチドを抽出し凍結乾燥した。得られた粗ペ
プチドを、ＷａｔｅｒｓＣ１８ＤｅｌｔａＰａｋカラ
ムの逆相ＨＰＬＣを用い、水性０.２％トリフルオロ酢
酸（ＴＦＡ）中の５〜７０％のアセトニトリル勾配で精
製した。精製したペプチドの構造を質量分析によって確
認した。

【０１０４】また、ＩＣＥのキャラクタリゼーションの
ためには、全体配列：Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ
−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−
Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（以後Ｐ１４ｍｅｒと
呼ぶ）を有するペプチドを使用した。このペプチドを上
記と同様に合成し、精製し、特性決定した。ペプチド配
列Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−７−アミノ
クマリン（Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−ＡＬａ−Ａｓｐ−Ａ
ＭＣ）,Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニル−
アラニニル）−アスパラギン酸ａ−７−アミノ−４メ
チルクマリンアミドを以下のプロセスで合成した。

【０１０５】ステップＡ：Ｎ−アリルオキシカルボニル
アスパラギン酸ｂ−ｔ−ブチルエステルａ−７−アミノ
−４−メチルクマリンアミド

【０１０６】

【化２９】

【０１０７】１５ｍＬの無水ジオキサン中のＮ−アリル
オキシカルボニルアスパラギン酸ｂ−ｔ−ブチルエステ
ル（３.４４ｇ、１２.６ｍｍｏｌ）及び７−アミノ−４
−メチルクマリン（２.００ｇ、１１.４２ｍｍｏｌ）の
溶液に、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド
（２.６６ｇ、１３.８６ｍｍｏｌ）を添加した。７５分
間還流後に、混合物を酢酸エチルで希釈し、１Ｎ塩酸で
３回及び飽和炭酸水素ナトリウムで３回洗浄した。溶液
を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下に濃縮した。混合物
をシリカ−ゲルを用いたＨＰＬＣ（３５×３００ｍｍカ
ラム、溶出剤としてジクロロメタン中の１０％酢酸エチ
ル）によって精製し、無色泡状の標題化合物を得た：１
ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）ｄ７.７７
（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２.３９Ｈｚ）、７.６８（ｄ、１Ｈ、
Ｊ＝９.０６Ｈｚ）、７.４９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝２.３
６、９.１０Ｈｚ）、６.２１（ｑ、１Ｈ、Ｊ＝１.３０
Ｈｚ）、５.９５（ｍ、１Ｈ）、５.４〜５.１５（ｍ、
２Ｈ）、４.７２〜４.５８（ｍ、３Ｈ）、２.８５（ｄ
ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６.１７、１５.７３Ｈｚ）、２.６５
（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝７.６２、１６.３７Ｈｚ）、２.４
３（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝１.４４Ｈｚ）、１.４３（ｓ、９
Ｈ）。

【０１０８】ステップＢ；アスパラギン酸ｂ−ｔ−ブチ
ルエステルａ−７−アミノ−４−メチルクマリンアミド

【０１０９】

【化３０】

【０１１０】１０ｍＬの無水テトラヒドロフラン中のＮ
−アリルオキシカルボニルアスパラギン酸ｂ−ｔ−ブチ
ルエステルａ−７−アミノ−４−メチルクマリンアミド
（４３５ｍｇ、１.０１ｍｍｏｌ）及びＤｉｍｅｄｏｎ
ｅ（１.１３ｇ、８.０８ｍｍｏｌ）の溶液に、テトラキ
ストリフェニルホスフィンパラジウム（１１７ｍｇ、
０.１ｍｍｏｌ）を添加した。４５分後に、混合物を酢
酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムで５回洗浄
し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下に濃縮した。混合
物を１％アンモニア及び１０％メタノールを含む少量の
ジクロロメタン溶液に溶解させ、０.２２ｍｍフィルタ
ーで濾過した。次に混合物をシリカーゲルを用いたＨＰ
ＬＣ（２２×３００ｍｍカラム、ジクロロメタン中の
０.２５％アンモニア及び２.５％メタノールまでのジク
ロロメタン勾配で溶出）によって精製し、無色泡状の標
題化合物を得た：１ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤ３
ＯＤ）ｄ７.９３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１.７６Ｈｚ）、
７.８２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８.５０Ｈｚ）、７.６３（ｄ
ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２.４０、９.１０Ｈｚ）、６.３４
（ｑ、１Ｈ、Ｊ＝１.３１Ｈｚ）、３.８９（ｔ、１Ｈ、
Ｊ＝６.３５Ｈｚ）、２.８８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝６.０
３、１６.７２Ｈｚ）、２.７５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝６.
７７、１６.７２Ｈｚ）、２.５６（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝１.
３７Ｈｚ）、１.５４（ｓ、９Ｈ）。

【０１１１】ステップＣ：Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシ
ニル−バリニル−アラニニル）−アスパラギン酸ｂ−ｔ
−ブチルエステル−ａ−７−アミノ−４−メチルクマリ
ン

【０１１２】

【化３１】

【０１１３】２ｍＬのジメチルホルムアミド中のＮ−
（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニル−アラニン（２
８８ｍｇ、０.７３３ｍｍｏｌ）、アスパラギン酸ｂ−
ｔ−ブチルエステル−ａ−７−アミノ−４−メチルクマ
リン（２４２ｍｇ、０.６９８ｍｍｏｌ）及びヒドロキ
シベンゾトリアゾール（１４９ｍｇ、１.１０ｍｍｏ
ｌ）の溶液に、０℃で、ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド（１５１ｍｇ、０.７３３）を添加した。周囲温度で
１６時間維持後に、混合物を濾過し、Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ″ＬＨ−２０クロマトグラフィー（１Ｍ×５０ｍｍカ
ラム、溶出剤メタノール）によって精製した。得られた
生成物をメタノールと混和（ｔｒｉｔｕｒａｔｅ）し、
無色固体状の標題化合物を得た：１ＨＮＭＲ（２００
ＭＨｚ、ＤＭＦ−ｄ７）ｄ８.３〜７.５（ｍ、７
Ｈ）、７.０９（ｂｒ、ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８.６１Ｈｚ）、
６.７２（ｂｒ、ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８.６４Ｈｚ）、６.２
７（ｑ、１Ｈ、Ｊ＝１.３１Ｈｚ）、４.８４（ｍ、１
Ｈ）、４.６２（ｍ、１Ｈ）、４.４４−４.１４（ｍ、
２Ｈ）、３.１５−２.７（ｍ、４Ｈ）、２.４５（ｄ、
３Ｈ、Ｊ＝１.３７Ｈｚ）、２.１３（ｍ、１Ｈ）、１.
８７（ｓ、３Ｈ）、１.４１（ｓ、９Ｈ）、１.３７
（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝７.３８Ｈｚ）、０.９４（ｄ、３Ｈ、
Ｊ＝７.１２Ｈｚ）、０.９３（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝７.１２
Ｈｚ）。

【０１１４】ステップＤ：Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシ
ニル−バリニル−アラニニル）−アスパラギン酸ａ−７
−アミノ−４−メチルクマリンアミド

【０１１５】

【化３２】

【０１１６】Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−アラニニル）−アスパラギン酸ｂ−ｔ−ブチルエス
テル−ａ−７−アミノ−４−メチルクマリンアミドをト
リフルオロ酢酸に溶解させた。１５分後に混合物を減圧
下に濃縮して無色固体状の標題化合物を得た：１ＨＮ
ＭＲ（２００ＭＨｚ、ＤＭＦ−ｄ７）ｄ８.３−７.５
（ｍ、７Ｈ）、７.０９（ｂｒ、ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８.６１
Ｈｚ）、６.７２（ｂｒ、ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８.６４Ｈ
ｚ）、６.２７（ｑ、１Ｈ、Ｊ＝１.３１Ｈｚ）、４.８
４（ｍ、１Ｈ）、４.６２（ｍ、１Ｈ）、４.４４−４.
１４（ｍ、２Ｈ）、３.１５−２.７（ｍ、４Ｈ）、２.
４５（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝１.３７Ｈｚ）、２.１３（ｍ、１
Ｈ）、１.８７（ｓ、３Ｈ）、１.４１（ｓ、９Ｈ）、
１.３７（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝７.３８Ｈｚ）、０.９４
（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝７.１２Ｈｚ）、０.９３（ｄ、３Ｈ、
Ｊ＝７.１２Ｈｚ）。

【０１１７】Ｃ₃₃Ｈ₃₉Ｎ₅Ｏ₁₀？₁.₆₅Ｈ₂Ｏのマイクロ分析：計算値：Ｃ５７.００；Ｈ６.１３；Ｎ１０.０７測定値：Ｃ５６.９７；Ｈ５.８４；Ｎ１０.１６。

【０１１８】実施例１３インターロイキン−１β変換酵素の塩及び最適ｐＨＴＨＰ−１Ｓ−３（実施例１）変換酵素活性の最適ｐ
Ｈを測定した。Ｓ−３抽出物のサンプルを５〜９の範囲
のｐＨ値を有する一連のバッファに透析した。

【０１１９】透析サンプルからアリコートを採取し、残
りをｐＨ７.４のＨＥＰＥＳバッファに再度透析した。
次に、透析サンプルの変換酵素活性を再度試験した。プ
レ−ＩＬ−１β変換酵素はｐＨ７.０〜８.０の範囲の狭
い最適ｐＨを有し、酸性ｐＨに耐性でない。プレ−ＩＬ
−１β変換酵素のイオン要件を塩滴定によって測定し
た。プレ−ＩＬ−１β変換酵素（ＴＨＰ−１由来）を反
応液中の増加する種々の濃度のＫＣｌと共にインキュベ
ートした。結果は、ＫＣｌが低濃度（＜５０ｍＭ）のと
きに変換酵素活性が最適であることを示した。Ｌａｅｍ
ｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０〜６８５（１９
７０）によるＳＤＳ／ＰＡＧＥ（実施例９参照）及びフ
ルオログラフィーを順次行なって開裂の程度を検定し
た。

【０１２０】粗ＴＨＰ−１Ｓ−３または部分精製酵素
をＩＣＥ活性のソースとして使用し、上記のごときゲル
ベースの開裂アッセイまたはＰ１４ｍｅｒ開裂アッセイ
によって測定される最適アッセイ条件を決定するため
に、塩及びｐＨ滴定を実施した。粗ＴＨＰ−１Ｓ−３
を使用した実施例では、塩及びｐＨ滴定の双方が含まれ
る。データ（図３Ａ）は、ゲルベースの開裂アッセイで
はＩＣＥ活性がＫＣｌの含有によって用量依存的に阻害
されることを示す。ゲルベースの開裂アッセイにおける
ＩＣＥの最適ｐＨは約７.４である。同じ実験は、ＩＣ
Ｅ活性が酸性ｐＨに不安定であるが、塩基性ｐＨ環境で
は安定であることを示す。Ｐ１４ｍｅｒ及びＡｃ−ＹＶ
ＡＤ−ＡＭＣ開裂アッセイは、最適ｐＨ及び安定性に関
して同様のプロフィルを示す。

【０１２１】しかしながら、Ｐ１４ｍｅｒアッセイはゲ
ルベースアッセイと同様の感度を示すが、Ａｃ−ＹＶＡ
Ｄ−ＡＭＣアッセイは本質的に塩に感受性でないため、
塩の影響が多少異なる。データは、ＩＣＥが中性プロテ
イナーゼであり、一価イオンを要求しないことを示す。

【０１２２】図３Ａは、ＴＨＰ−１Ｓ−３変換酵素活
性の最適ｐＨの測定結果を示す。Ｓ−３抽出物を５〜９
の範囲のｐＨ値を有する種々のバッファに透析した。透
析物からアリコートを採取し、残りをｐＨ７.４のＨＥ
ＰＥＳバッファに再透析した。次に、全部の透析物の変
換酵素活性を試験した：（−）；前記ｐＨのＳ−３０
０、（＋）；ｐＨ７.４のＨＥＰＥＳバッファに再透析
したＳ−３００。結果は、ＩＣＥがｐＨ７.０〜８.０の
狭い最適ｐＨを有し、酸性ｐＨに耐性でないことを示
す。

【０１２３】図３Ｂは変換酵素活性の塩滴定の結果を示
す。ゲルベースの開裂アッセイでＴＨＰ−１Ｓ−３０
０抽出物を増加する種々の濃度のＫＣｌと共にインキュ
ベートした。結果は、ＫＣｌが低濃度（＜５０ｍＭ）の
ときにＩＣＥ活性が最適であることを示す。

【０１２４】実施例１４チオールプロテアーゼとしてのインターロイキン−１β
のキャラクタリゼーション実施例１１の表４に示すように、チオール残基を修飾し
得る試薬だけがＩＣＥを阻害し得る。表４のデータは、
部分精製酵素即ちＴＨＰ−１Ｓ−３をＩＣＥ活性の指
標としたゲルベースの開裂アッセイによって得られたも
のである。Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａ
ＭＣを基質としたＰ１４ｍｅｒアッセイではこのデータ
が確認されその範囲が拡張された。この表の結果に対す
る唯一の例外は、１,１０フェナントロリン（ＯＰ）を
インヒビターとして試験したときに生じた。元来、この
化合物はゲルベースの開裂アッセイでＩＣＥ活性を阻害
しなかった。Ｐ１４ｍｅｒを基質（実施例１２）とした
不連続な反応動力学的アッセイ（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕ
ｏｕｓｋｉｎｅｔｉｃａｓｓａｙ）において、ＯＰ
が時間及び濃度依存的にＩＣＥ活性を阻害し得ることが
判明した。失活の速度定数（８×１０^-2ｓ^-1Ｍ^-1）は小
さく、ＺｎＣｌ₂を添加し次いでキレート剤で処理する
ことによってＩＣＥ活性を回復させることができない。
追加の試験によれば、ＯＰはフェナントロリン−金属錯
体を介してＩＣＥを酸化することによってインヒビター
として機能することが実際に証明された。これは、以下
のいくつかの現象によって確認された：（１）高濃度
（１０ｍＭ）の還元剤の存在がＩＣＥをＯＰの作用から
保護することが判明した。これは、ＯＰによるＩＣＥ失
活の主な原因が必要な成分の酸化にあることを示唆す
る；（２）２種類の金属キレート剤ＥＤＴＡ及びＯＰに
よって同時にＩＣＥを処理するとＩＣＥが阻害されな
い。これは、観察されたＯＰによるＩＣＥの活性阻害の
主因がタンパク質結合金属のキレート化にあるという仮
説と矛盾する；（３）１.０ｍＭのＯＰを含むＩＣＥア
ッセイに１０ｍＭのＣｕＳＯ₄を添加すると、化合物に
よるＩＣＥ阻害速度が１７倍に増加する。これは、金属
−フェナントロリン錯体がＯＰによるＩＣＥ阻害の主因
であることを示唆する。これらのデータは、ＩＣＥがそ
の構造中に還元チオール残基を含有し、この残基が種々
の手段によって酸化またはアルキル化されると、酵素が
失活するという仮説と一致する。データはＩＣＥがメタ
ロプロテアーゼであるという仮説とは矛盾する。

【０１２５】実施例１５ＩＣＥ成分である２２ｋＤタンパク質の活性部位標識に
よる同定チオールアルキル化試薬及び金属−フェナントロリン錯
体はＩＣＥを阻害できるので、必要なチオール基が活性
部位またはその近傍に存在することは予想される。しか
し、（例えば、遠隔チオールを介したアロステリック効
果のような）別の理論でその効果を説明することも考え
られる。次に必要な実験は、チオール基がＩＣＥ基質と
競合し得る位置に存在することを実証することである。
この結果を得るための１つの方法として、チオール基の
共有結合修飾を介してＩＣＥを阻害して酵素を失活させ
る試薬を用い、この試薬が飽和レベルの基質の存在によ
ってブロックされ得ることを証明するとよい。モデル試
薬としてヨードアセテートを選択した。その理由は、こ
の試薬によるＩＣＥの失活速度定数（２４Ｍ^-1ｓ^-1）が
単なるシステイン残基のカルボキシメチル化よりもはる
かに大きいからである。１００ｍＭ（１*Ｋｍ）のヨー
ドアセテートは９.１３分の半阻害時間を与えることが
測定されている。反応液中に飽和レベルの基質Ａｃ−Ｔ
ｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＡＭＣ（２００*Ｋｍ
または２.８ｍＭ）が含まれると、その結果として、酵
素の失活が理論的に防御される。アルキル化試薬として
１４Ｃ−ヨードアセテートを使用し同様の手順を使用し
て２００×Ｋｍ基質の存在下または不在下に標識された
タンパク質を同定した。１００ｍＭの放射性標識ヨード
アセテートの濃度で、反応進行中に有意数のタンパク質
が標識された。反応液中に２.８ｍＭのＡｃ−Ｔｙｒ−
Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＡＭＣが含まれるとき、２％
未満のＩＣＥ失活が生じたが、これは予想値に近い値で
あった。標識タンパク質の数及び程度をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ及びフルオログラフィーによって評価すると、分子量
２２ｋＤａのタンパク質の標識だけが有意に減少してい
ることが判明した（図４）。混合物中のその他のタンパ
ク質の標識は変化していなかった。これは、２２ｋＤａ
タンパク質がヨードアセテートでアルキル化され得るチ
オール基を含み、このチオール基がＩＣＥ基質と競合し
得る位置に存在することを示唆する。このチオールのア
ルキル化はＩＣＥ活性の有無と相関関係を有するので、
２２ｋＤａタンパク質がＩＣＥ酵素の少なくとも一部を
含むと判断できる。ＩＣＥ及び１００ｍＭの１４Ｃ−ヨ
ードアセテートを２.８ｍＭのＡｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−
Ａｌａ−Ａｓｐ−ＡＭＣの存在（＋Ｓ）または不在（−
Ｓ）下に１時間インキュベートした。１時間後に、１０
ｍＭの非標識ヨードアセテートと１０ｍＭのＤＴＴとを
添加して反応を停止させた。反応液のアリコートをＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー染色またはオートラ
ジオグラフィーを順次用いて分析した。クーマシーブル
ー染色に基づくデータは、反応の進行中にタンパク質組
成の観察可能な変化が生じなかったことを示す。しかし
ながら、オートラジオグラフィーでは、２２ｋＤａタン
パク質はＩＣＥ基質が存在しないときは標識されるが存
在するときは標識されないことを示す。

【０１２６】実施例１６チオールプロテアーゼとしてのＩＣＥのキャラクタリゼ
ーション最後に、プロテアーゼクラスに関するＩＣＥのキャラク
タリゼーションを完結するために、Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｖａ
ｌ−Ａｌａ−Ａｓｐペプチドから双方が構築された２種
類のメカニズムベースのチオールプロテアーゼインヒビ
ター、即ちジアゾメチルケトン及びペプチドアルデヒド
を合成した。ペプチジルジアゾメチルケトン（Ａｃ−Ｔ
ｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＣＨＮ₂）とペプチド
アルデヒド（Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−
ＣＨＯ）との双方を併願特許に記載の方法で合成した。
Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＣＨＮ₂は時
間及び用量依存的にＩＣＥ活性を不可逆的に阻害するこ
とを示し、これは活性部位チオールの不可逆的アルキル
化と一致する。過剰量の基質の添加はこの失活に有効に
競合し、これもまた活性部位チオールが修飾されること
を示す。

【０１２７】Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−
ＣＨＯは用量依存的に且つ基質と競合的にＩＣＥを可逆
的に阻害する。しかしながら、化学的に同様のペプチド
アルデヒドＡｃ−Ｔｙｒ（ｄＡｌａ）−Ｖａｌ−Ａｌａ
−Ａｓｐ−ＣＨＯを合成することによって、該ベプチド
アルデヒドのＩＣＥに対する作用の特異性は決定されて
おり、競合的及び可逆的なそのＩＣＥ阻害能も試験され
ていた。この化合物のＩＣＥ阻害活性能は１／３００で
ある。このことは、阻害がＡｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌ
ａ−Ａｓｐ−ＣＨＯによって示される特定のペプチド構
造の認識に依存するものであって、単にペプチドのＣ末
端にアルデヒド基が存在するからではないことを示す。

【０１２８】実施例１７インターロイキン−１β変換酵素の分子量決定実施例８の方法で均質になるまで精製した２２及び１０
ｋＤのタンパク質各５ピコモルを毛管液体クロマトグラ
フィー、エレクトロスプレーイオン化、質量分析によっ
て処理した。ＦｉｎｎｉｇａｎＴｒｉｐｌｅ−Ｓｅｃ
ｔｏｒＱｕａｄｒｏｐｏｌｅＭｏｄｅｌ７００質
量分析計で質量を決定した。機械の精度を決定するため
に標準タンパク質、ウシシトクロムｃを使用すると、質
量決定の標準誤差が０.０１〜０.０２％であることが判
明した。エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルの
バイオマスデコンボリュージョン後に、単離「１０ｋＤ
ａ」成分の分子量は、１０,２４８原子質量単位の平均
質量を有し、「２２ｋＤａ」タンパク質は１９,８６６
原子質量単位の平均質量を有していることが判明した。

【０１２９】実施例１８インターロイキン−１β変換酵素の等電点電気泳動Ｂｉｏ−ＲａｄＲｏｔｏｆｏｒ溶液相等電点電気泳動
装置を使用してＩＣＥの等電点を評価した。約１,２６
０単位のＩＣＥ（１単位は、１０％のショ糖、０.１％
のＣＨＡＰＳ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７.４を含
むバッファ中で、２００ｍＭのＰ１４ｍｅｒ基質を２５
℃で２時間インキュベートしたときに毎分４０ピコモル
のＰ１４ｍｅｒ基質を開裂するために必要な酵素の量と
定義される）を含む１０ｍｌの部分精製ＩＣＥ酵素を、
４０ｍｌの１０％ショ糖、０.１％のＣＨＡＰＳ、０.２
％の両性電解質（Ｂｉｏ−ＬｙｔｅｐＨ５〜８）バッ
ファに希釈し、次いで、Ｂｉｏ−ＲａｄＲｏｔｏｆｏ
ｒ等電点電気泳動装置を使用して等電点電気泳動処理し
た。製造業者の指示通りに電気泳動を実施した。等電点
電気泳動勾配を溶出させ、Ｐ１４ｍｅｒペプチドベース
のアッセイ、及び、基質として真正プレ−ＩＬ−１βを
用いたゲルベースの開裂アッセイで前記と同様にして分
画のＩＣＥ活性を試験した。双方のアッセイで、ＩＣＥ
活性のピークは、測定ｐＨ６.３の単位の勾配の一部分
に集中していた。図５参照。

【０１３０】実施例１９インターロイキン−１β変換酵素のオリゴマー構造の反
応動力学的証明部分精製ＩＣＥに関する初期滴定試験は、低酵素レベル
ではＩＣＥ開裂活性が酵素濃度の厳密な直線状関数では
ないことを示唆した。この知見はオリゴマー酵素構造と
一致する。同様に、ＩＣＥ活性はバッファに希釈した後
で時間依存的に減少することが知られており、最終的に
安定な定常状態酵素速度に達するであろう。この定常状
態が得られた後は、酵素を初期容量に再濃縮でき、２４
時間のインキュベーション後に、同様の初期酵素活性を
有することを証明し得る（図６）。この曲線は、部分精
製ＩＣＥの標準原液（４単位／μｌ）を標準アッセイ混
合物（５０ｕＭ（１*Ｋｍ）の基質、１００ｍＭのＨＥ
ＰＥＳ、１０％ショ糖、０.１％ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ
のＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）で１０００倍に希釈
することによって得られた。実線は、反応動力学モデル
で、２５℃の半減期２.８時間のに対応する速度定数ｋ
ｏｂｓ＝０.００４ｍｉｎ^-1の酵素活性の一次損失を示
す理論的グラフである。モデルはまた、初期反応速度の
値（ｖｏ＝０.００６８ｕＭＡＭＣ／分）及び無限時
間で得られた速度の値（ｖｓ＝０.０００４８ｕＭＡ
ＭＣ／分）を決定する。これらのパラメータはまた、図
６の挿入部の棒グラフによって示される。飽和レベルの
基質（１ｍＭ、２０*Ｋｍ）を使用して実験を繰り返す
と、時間依存性失活は全く観察されない。これは、酵素
−基質複合体が反応動力学的に安定していることを示
す。この解離は１００％可逆性であり、希釈酵素を１０
００倍希釈から初期容量まで再濃縮すると複合体の完全
な再結合が得られる。これらのデータは、ＩＣＥ活性の
喪失が完全に可逆的であり、希釈に対するＩＣＥの感受
性は、解離可能な２つの種の間に新しい平衡が成立する
ためであり、この結合が飽和レベルの基質によって安定
することを示唆する。

【０１３１】実施例２０混合ジスルフィドによる処理後のインターロイキン−１
β変換酵素オリゴマーの安定化または不安定化酵素の精製及びキャラクタリゼーションを容易にする可
逆的活性部位修飾試薬を生成するために、種々の混合ジ
スルフィドについて、活性部位チオールを介して混合ジ
スルフィドを形成することによってＩＣＥ活性を可逆的
に阻害する能力を試験した。試験した２種類はＤＴＴ可
逆的にＩＣＥを阻害する能力の顕著な違いを示した。酸
化グルタチオン（ＧＳＳＳ）及びシスタミン（２−アミ
ノエタンジチオール）のＩＣＥ阻害能力を連続蛍光定量
アッセイで試験した。１ｍＭのＧＳＳＳで処理したＩＣ
Ｅを８分間の半阻害時間で阻害した。酵素がその失活域
に達した後で１０ｍＭのＤＴＴを変換すると、酵素が直
ちに再活性化されて初期活性の９８％を回復した。これ
は、プロセスが完全に可逆的であることを示す（図
７）。希釈の際に観察されるＩＣＥ解離に対するＧＳＳ
Ｓ処理の効果を試験するために、濃縮ＩＣＥをＧＳＳＳ
で処理し、次いで基質を含まないＩＣＥアッセイバッフ
ァに希釈した。処理した酵素を室温で平衡させ、残留Ｉ
ＣＥ活性を検定した。意外にも、ＧＳＳＳはＩＣＥ活性
を安定化し、半解離時間を９０分から２８００分に延長
した。これは未処理酵素に比べて３０倍以上の延長であ
る（図８）。ＧＳＳＳと比較すると、シスタミンはＩＣ
Ｅ活性を安定化しないと考えられた。これは、シスタミ
ン処理の可逆性の程度を評価するように設計された実験
によって証明された。シスタミンで処理後のＩＣＥは、
５ｍＭのシスタミンで半減期１９分の時間依存性活性減
少を示した。失活域に達した後でＤＴＴを添加しても酵
素活性は２３％しか回復しなかった。これは、不可逆的
に失活した酵素が形成されたことを示唆する。高度に濃
縮されたＩＣＥ（３単位／ｍｌ）を５ｍＭのシスタミン
で処理し、次いで４℃で３日間平衡させることによっ
て、見掛けは「不可逆的に」失活した酵素が実際は解離
したモノマーであることが証明された。濃縮酵素にＤＴ
Ｔを添加後、アリコートを採取し、ＩＣＥアッセイバッ
ファに希釈し、反応の初期速度を測定することによって
活性の回収をモニタした。活性の完全な回収が観察さ
れ、半減期３６分間であった（図９）。これは、シスタ
ミンがＩＣＥをモノマー成分に解離させ、これらのモノ
マー成分は適宜濃縮されＤＴＴによって処理された後に
可逆的に結合し得ることを示唆する。

【０１３２】実施例２１酸化グルタチオンまたはシスタミン修飾インターロイキ
ン−１βのサイズ排除クロマトグラフィー実施例２０のデータは、ＩＣＥオリゴマーの結合がＧＳ
ＳＳまたはシスタミンによる前処理の影響を受け得るこ
とを示唆するので、安定化された酵素と不安定化された
酵素との分子量を見分ける実験を行なった。実施例５で
説明したように、ＩＣＥは、ＤＴＴの存在下に、ＴＳＫ
Ｇ２０００カラムでは見掛け分子量２３,０００で溶
出し、ＴＳＫＧ３０００カラムでは見掛け分子量３
０,０００で溶出する。濃縮ＩＣＥをまずＧＳＳＳまた
はシスタミンで２４時間前処理し、次いでＴＳＫＧ２
０００サイズ排除カラムに移すと、酵素活性が分離可能
２つの異なる分子量でカラムから溶出する。ＧＳＳＳ処
理した酵素は見掛け分子量３９,０００でカラムから溶
出するが、シスタミン処理した酵素は見掛け分子量２
２,０００であった（図１０）。カラム分画のＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲルのタンパク質含量を銀染色によって分析す
ると、ＩＣＥ活性を有する２２及び１０ｋＤのタンパク
質が同時に溶出し、これらの２つのタンパク質の溶出位
置は、ＧＳＳＳまたはシスタミン処理後に観察された分
子量変化に伴って変化する。このデータは、２２及び１
０ｋＤのタンパク質がＩＣＥ分子の２つのサブユニット
を含み、これらのタンパク質の可逆的に見える結合が溶
解ＩＣＥのオリゴマー性挙動の原因であることを示す。

【０１３３】実施例２２インターロイキン−１β変換酵素のアフィニティクロマ
トグラフィー化合物Ａからのクロマトグラフィーマトリックスの調製１２原子のビス−オキシランスペーサーを介してＳＥＰ
ＨＡＲＯＳＥＣＬ−４Ｂにリシン残基によって結合さ
れた有力なペプチドアルデヒド型インヒビターであるア
セチル−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−ＣＨＯ（化
合物Ａ）から、インターロイキン−１β変換酵素用のア
フィニティカラムを調製した。

【０１３４】

【化３３】

【０１３５】アフィニティマトリックスの合成ステップＡ：エポキシで活性化されたＳＥＰＨＡＲＯＳ
ＥＣＬ−４Ｂ：文献（Ｓｕｎｄｂｅｒｇ、Ｌ．＆Ｐｏｒａｔｈ、Ｊ.
（１９７４）Ｊ.Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ.９０、８７〜９
８）に記載の方法を用い、エポキシで活性化されたＳＥ
ＰＨＡＲＯＳＥＣＬ−４Ｂを調製した。詳細には、１
０ｇｍの吸引乾燥ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＣＬ−４Ｂと１
００ｍｌの１、４−ブタンジオールジグリシジルエーテ
ル（公称７０％溶液）と２ｍｇ／ｍｌのＮａＢＨ₄を含
む１００ｍｌの０.６ＭのＮａＯＨとから成るスラリー
をオーバーヘッド攪拌機で室温で１６時間攪拌した。得
られたエポキシで活性化されたＳＥＰＨＡＲＯＳＥＣ
Ｌ−４Ｂを目の荒い焼結ガラス漏斗を用いて１０リット
ルの水で十分に洗浄し、４℃の水中に保存した。

【０１３６】ステップＢ：ペプチドアルデヒドジメチル
アセタールの結合：

【０１３７】

【化３４】

【０１３８】活性アルデヒドである化合物Ａのブロック
されたアスパルチル−ｔ−ブチルエステル、ジメチルア
セタール（化合物Ａ′）をメタノールに１０ｍＭ溶液と
して溶解し、新しいメタノールと水とＨＣｌでｐＨ１
１.００に調整した４００ｍＭの炭酸ナトリウム溶液と
合わせて、２ｍＭのインヒビターと２００ｍＭの炭酸塩
バッファとを含む５０％メタノール溶液とした。この溶
液（１０ｍｌ）をエポキシで活性化したＳＥＰＨＡＲＯ
ＳＥＣＬ−４Ｂの吸引乾燥ケーキ（１０ｇｍ）と混合
し、得られたスラリーを回転によって３７℃で３日間攪
拌した。得られたアフィニティマトリックスを１ＭのＫ
Ｃｌ及び水で完全に洗浄し、スラリーの状態で４℃で保
存した。〔１４−Ｃ〕−リシノプリル（Ｂｕｌｌ、Ｈ.
Ｇ.、Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ、Ｎ.Ａ.＆Ｃｏｒｄｅ
ｓ、Ｅ.Ｈ.（１９８５）Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６
０、２９６３〜２９７２）による結果に基づいて、取込
み量は充填アフィニティカラム１ｍｌあたり１ｕｍｏｌ
／ｍｌであると評価される。

【０１３９】ステップＣ：アルデヒドの活性化上記手順でスペーサーアームに結合したアセチル−Ｔｙ
ｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−ＣＨＯのジメチルアセタ
ールが得られた。アスパルテート残基のｔ−ブチル保護
基は結合条件で消失する。アフィニティカラムにおいて
このマトリックスをアルデヒドに対して活性化するため
に、使用直前にマトリックスを０.０１ＮのＨＣｌで平
衡させ、２５℃で２時間静置した。トレーサーとして使
用した〔１４−Ｃ〕グリシンを含む対照マトリックスは
これらの条件下にリガンドの損失を全く示さなかった
（＜１％）。

【０１４０】

【化３５】

【０１４１】Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−リシニル）−３−アミノ−４−オキソブタン酸ジメ
チルアセタールｂ−ｔ−ブチルエステルの合成ステップＡ：Ｎ−アリルオキシカルボニル−３−アミノ
−４−ヒドロキシブタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル

【０１４２】

【化３６】

【０１４３】０℃の５０ｍＬのテトラヒドロフラン（Ｔ
ＨＦ）中のＮ−アリルオキシカルボニル（Ｓ）−アスバ
ラギン酸ｂ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２.００ｇ、
７.３２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−メチルモルフォリン
（ＮＭＭ、８８５ｍＬ、８.０５ｍｍｏｌ）、イソブチ
ルクロロホーメート（ＩＢＣＦ、９９７ｍＬ、７.６８
ｍｍｏｌ）を順次添加した。１５分後にこの混合物を、
−４５℃で、５０ｍＬのＴＨＦと１２.５ｍＬのメタノ
ール中のホウ水素化ナトリウム（５５０ｍｇ、１４.５
５ｍｍｏｌ）の懸濁液に添加した。−４５℃に３０分間
維持した後、混合物を０℃に温め、この温度で３０分間
維持した。酢酸を加えて反応を停止させ、１：１酢酸エ
チル：ヘキサンに希釈し、希炭酸水素ナトリウムで３回
洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、
濃縮した。残渣をシリカ−ゲルを用いたＭＰＬＣ（３５
×３５０ｍｍカラム、３０％酢酸エチル／ヘキサン）で
精製し、所望の生成物を得た：１ＨＮＭＲ（２００Ｍ
Ｈｚ、ＣＤ３ＯＤ）ｄ５９（ｍ、１Ｈ）、５.２８
（ｂｒｄ、１Ｈ、Ｊ＝１７Ｈｚ）、５.１５（ｂｒ
ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、４.５２（ｂｒｄ、２Ｈ、
Ｊ＝６Ｈｚ）、３.９８（ｍ、１Ｈ）、３.４８（ＡＢ
Ｘ、２Ｈ、Ｊ＝５、６、１１Ｈｚ）、２.５３（ｄｄ、
１Ｈ、Ｊ＝５.１６Ｈｚ）、２.３２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝
９.１６Ｈｚ）、１.４３（ｓ、９Ｈ）。

【０１４４】ステップＢ：Ｎ−アリルオキシカルボニル
−３−アミノ−４−オキソブタン酸ｂ−ｔｅｒｔ−ブチ
ルエステルジメチルアセタール

【０１４５】

【化３７】

【０１４６】−４５℃で、１０ｍＬのジクロロメタン中
のジメチルスルホキシド（７５７ｍＬ、１０.６７ｍｍ
ｏｌ）の溶液に、オキサリルクロリド（５０８ｍＬ、
５.８２ｍｍｏｌ）を添加した。５分後に、１０ｍＬの
ジクロロメタン中のＮ−アリルオキシカルボニル−３−
アミノ−４−ヒドロキシブタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエス
テル（１.２５ｇ、４.８５ｍｍｏｌ）の溶液を添加し
た。１５分後に、トリエチルアミン（２.０３ｍＬ、１
４.５５ｍｍｏｌ）を添加した。３０分後に、混合物を
−２３℃に温め、３０分間攪拌した。混合物を１：１酢
酸エチル／ヘキサンで希釈し、水及び１Ｎの硫酸水素ナ
トリウムで洗浄し、水で２回洗浄した。有機物を硫酸ナ
トリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。得られた油状物
質を２００ｍＬのメタノールと２０ｍＬのトリメチルオ
ルトホーメートに溶解し、１００ｍｇのｐ−トルエンス
ルホン酸を添加した。１６時間後に、飽和炭酸水素ナト
リウムで反応を停止させ、減圧下に濃縮した。混合物を
エーテルで希釈し、希炭酸水素ナトリウム溶液で５回洗
浄した。エーテル層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過
し、濃縮して無色油状の標題化合物を得た：１ＨＮＭ
Ｒ（２００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）ｄ５.９（ｍ、１
Ｈ）、５.２６（ｂｒｄ、１Ｈ、Ｊ＝１７Ｈｚ）、５.
１４（ｂｒｄ、１Ｈ、Ｊ＝１０Ｈｚ）、４.５１（ｂ
ｒｄ、２Ｈ、Ｊ＝５.３３Ｈｚ）、４.２５（ｄ、１
Ｈ、Ｊ＝４.７９Ｈｚ）、４.１１（ｍ、１Ｈ）、３.４
０（ｓ、３Ｈ）、３.３９（ｓ、３Ｈ）、２.５２（ｄ
ｄ、１Ｈ、Ｊ＝４.８６、１５.２７Ｈｚ）、２.３０
（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９.００、１５.２８Ｈｚ）、１.４
３（ｓ、９Ｈ）。

【０１４７】ステップＣ：３−アミノ−４−オキソブタ
ン酸ｂ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルジメチルアセタール

【０１４８】

【化３８】

【０１４９】１０ｍＬのＴＨＦ中のＮ−アリルオキシカ
ルボニル−３−アミノ−４−ヒドロキシブタン酸ｂ−ｔ
ｅｒｔ−ブチルエステルジメチルアセタール（３１２ｍ
ｇ、１.０３ｍｍｏｌ）の溶液に、モルフォリン（８９
７ｍＬ、１０.３ｍｍｏｌ）とテトラキストリフェニル
ホスフィンパラジウム（１００ｍｇ）とを添加した。３
時間後、混合物を１：１酢酸エチル／ヘキサンで希釈
し、希炭酸水素ナトリウムで５回洗浄した。有機物を硫
酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。得られた油
状物をシリカ−ゲルを用いたＭＰＬＣ（２２×３００ｍ
ｍカラム、ジクロロメタン中の１％アンモニア及び１０
％メタノールまでのジクロロメタンの直線勾配）によっ
て精製し、淡黄色油状の標題化合物を得た：１ＨＮＭ
Ｒ（２００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）ｄ４.１５（ｄ、１
Ｈ、Ｊ＝５.６７Ｈｚ）、３.４１（ｓ、３Ｈ）、３.４
０（ｓ、３Ｈ）、３.１９（ｍ、１Ｈ）、２.４７（ｄ
ｄ、１Ｈ、Ｊ＝４.８８、１６.０６Ｈｚ）、２.２２
（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝７.８６、１６.１６Ｈｚ）、１.４
５（ｓ、９Ｈ）。

【０１５０】ステップＤ：Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシ
ニル−バリニル−（ｅ−ＣＢＺ−リシニル））−３−ア
ミノ−４−オキソブタン酸ｂ−ｔｅｒｔ−ブチルエステ
ルジメチルアセタール

【０１５１】

【化３９】

【０１５２】０℃で、５ｍＬのＤＭＦ中の３−アミノ−
４−オキソブタン酸ｂ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルジメ
チルアセタール（２３８ｍｇ、１.０９ｍｍｏｌ）の溶
液に、Ｎ−メチルモルフォリン（５９９ｍＬ、５.４５
ｍｍｏｌ）を添加し、次いで、Ｎ−アセチル−チロシニ
ル−バリニル−ｅ−ＣＢＺ−リシン（７３５ｍｇ、１.
０９ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンズトリアゾール（２２
１ｍｇ、１.６４ｍｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカル
ボジイミド（２２５ｍｇ、１.０９ｍｍｏｌ）を順次添
加した。室温で１６時間維持後に、混合物を濾過し、Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ″ＬＨ−２０クロマトグラフィー（１Ｍ
×５０ｍｍカラム、メタノール溶出剤）によって精製し
た。得られた生成物をシリカ−ゲルを用いたＭＰＬＣ
（２２×３００ｍｍカラム、ジクロロメタン中の１％ア
ンモニア及び１０％メタノールまでのジクロロメタンの
直線勾配で溶出）によって更に精製して無色固体状の標
題化合物を得た：１ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤ３
ＯＤ）ｄ７.３１（ｂｒｓ、５Ｈ）、７.０４（ｂｒ
ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８.３５Ｈｚ）、６.６７（ｂｒ、ｄ、
２Ｈ、Ｊ＝８.４５Ｈｚ）、５.０４（ｓ、２Ｈ）、４.
６１（ｍ、１Ｈ）、４.４４−４.２５（ｍ、３Ｈ）、
４.１７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７.２７Ｈｚ）、３.３９
（ｓ、３Ｈ）、３.１−２.９（ｍ、３Ｈ）、２.７５
（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９.２８、１４.１２Ｈｚ）、２.５
３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝５.４７、１５.５８Ｈｚ）、２.
３３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝７.９６、１５.５３Ｈｚ）、
２.０４（ｍ、１Ｈ）、１.８８（ｓ、３Ｈ）、１.８−
１.２（ｍ、６Ｈ）、１.４１（ｓ、９Ｈ）、０.９４
（ｄ、６Ｈ、Ｊ＝６.７４Ｈｚ）。

【０１５３】ステップＥ：Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシ
ニル−バリニル−リシニル）−３−アミノ−４−オキソ
ブタン酸ジメチルアセタールｂ−ｔ−ブチルエステル

【０１５４】

【化４０】

【０１５５】Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−ｅ−ＣＥＺ−リシニル）−３−アミノ−４−オキソ
ブタン酸ｂ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルジメチルアセタ
ール（１５.６ｍｇ）の溶液を２ｍＬのメタノールに溶
解し、１０ｍｇのＰｅａｒｌｍａｎ触媒（カーボンに付
けたＰｄ（ＯＨ）₂）を添加した。水素下に３０分維持
後に、混合物を濾過し、濃縮して標題化合物を得た：１
ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）ｄ７.０４
（ｂｒｄ、２Ｈ、Ｊ＝８.４４Ｈｚ）、６.６７（ｂｒ
ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８.５４Ｈｚ）、４.５７（ｄｄ、１
Ｈ、Ｊ＝５.２３、９.０４Ｈｚ）、４.５−４.０（ｍ、
４Ｈ）、３.３８（ｓ、３Ｈ）、３.３４（ｓ、３Ｈ）、
３.０２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝５.１７、１３.８１Ｈ
ｚ）、２.７５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９.２３、１４.０６
Ｈｚ）、２.６６（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７.０８Ｈｚ）、２.
５３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝５.４７、１５.５８Ｈｚ）、
２.３４（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝７.９１、１５.５７Ｈ
ｚ）、２.０３（ｍ、１Ｈ）、１.８８（ｓ、３Ｈ）、
１.９−１.２（ｍ、６Ｈ）、１.４１（ｓ、９Ｈ）、０.
９４（ｄ、６Ｈ、Ｊ＝６.６９Ｈｚ）、０.９３（ｄ、３
Ｈ、Ｊ＝６.６４Ｈｚ）。

【０１５６】アフィニティクロマトグラフィー手順実施例２、３、５〜８及び／または１０に記載のごとき
アニオン交換クロマトグラフィーによって、出発酵素調
製物をＴＨＰ−１細胞溶解液から約１００倍に精製し
た。

【０１５７】ステップＡ：ＩＣＥの結合等しい寸法の活性化アフィニティカラム（５ｍｌ、１ｃ
ｍ×６.５ｃｍ）及び基本型（ｎａｔｉｖｅ）ＳＥＰＨ
ＡＲＯＳＥＣＬ−４Ｂのガードカラムを、１ｍＭのジ
チオトレイトールを加えた１０カラム容量のクロマトグ
ラフィーバッファ（１００ｍＭＨＥＰＥＳ、１０％ショ
糖、０.１％の３−〔（３−コラミドプロピル）−ジメ
チルアンモニオ〕−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡ
ＰＳ）ｐＨ７.５０）で平衡させた。酵素溶液（１５ｍ
ｌ、１５０,０００単位、１５０ｍｇタンパク質）を、
４℃で０.０２２ｍｌ／分の流速でガードカラムを介し
てアフィニティカラムに流し、次いで同じ流速の追加量
の１０ｍｌのクロマトグラフィーバッファで洗浄した。
充填中に、８％の酵素活性が維持されなかった。その理
由は、結合速度定数が小さいためであろうと推測され
る。充填後に、ガードカラムを除去し、２５カラム容量
のバッファを用い４℃で流速を０.５ｍｌ／分に増加し
てアフィニティカラムを洗浄した。洗浄分画中に酵素活
性は全く検出されなかった。

【０１５８】ステップＢ：結合ＩＣＥの溶出酵素を溶出させるために、次に、２００ｍＭのアセチル
−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ）ＣＢＺ）−Ａｓｐ−ＣＨＯ
（化合物Ｂ）を含む１カラム容量のバッファでカラムを
洗い、マトリックス結合酵素を解離させるために室温で
２４時間維持した。流速０.０２２ｍｌ／分の２カラム
容量のバッファでカラムを洗浄することによって、遊離
酵素−インヒビター複合体をカラムから回収した。新し
いインヒビターで交換を繰り返したとき、新しく回収さ
れた酵素は５％未満であった。これは最初の交換が適切
であったことを示す。

【０１５９】ステップＣ：ＩＣＥの再活性化２つの相乗的化学的手法によって溶出ＩＣＥを再活性化
した。インヒビターをそのオキシムに変換し、チオール
−ジスルフィド互換によって活性部位チオールをグルタ
チオンとの混合ジスルフィドに酸化する。

【０１６０】再活性化のために、アフィニティカラムか
ら回収した酵素−インヒビター溶液を、１００ｍＭの中
性ヒドロキシルアミン及び１０ｍＭのグルタチオンジス
ルフィドを含むように調整した。これらの条件下に、余
剰の遊離インヒビターの消費に要する半減期１００秒の
多少の遅延の後で、Ｅ−Ｉ複合体の解離が完全に速度決
定的に生じ、２５℃の半減期は約１００分である。１０
半減期の時間交換を維持した後で、インヒビターオキシ
ム及び余剰の試薬を、ＡＭＩＢＯＮＣＥＮＴＲＩＣＯ
Ｎ−１０限外濾過セル中で４℃のクロマトグラフィーバ
ッファを用いた完全脱塩によって除去した。所望の場
合、酵素−グルタチオン結合体を１０ｍＭのジチオトレ
イトール（半減期＜１分）で還元して活性酵素を与え
た。精製した酵素は−８０℃で無期限に安定である。ア
フィニティクロマトグラフィーによる酵素活性の回収率
は＞９０％であり、得られた最終純度はＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動で測定して約７５,０００倍
であった。結果を第５表にまとめる。

【０１６１】

【表６】

【０１６２】純度４７００倍でＩＣＥの回収率は９３％
であった。

【０１６３】Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−ｅ−ＣＢＺ−リシニル）−３−アミノ−４−オキソ
ブタン酸の合成ステップＡ

【０１６４】

【化４１】

【０１６５】Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−（ｅ−ＣＢＺ−リシニル））−３−アミノ−４−オ
キソブタン酸β−ｔｅｒｔ−ブチルエステルジメチルア
セタール０℃で、５ｍＬのＤＭＦ中の３−アミノ−４−オキソブ
タン酸β−ｔｅｒｔ−ブチルエステルジメチルアセター
ル（２３８ｍｇ、１.０９ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−メ
チルモルフォリン（５９９ｍＬ、５.４５ｍｍｏｌ）、
Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニル−ｅ−ＣＢＺ−リ
シン（７３５ｍｇ、１.０９ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベ
ンズトリアゾール（２２１ｍｇ、１.６４ｍｍｏｌ）、
ジシクロヘキシルカルボジイミド（２２５ｍｇ、１.０
９ｍｍｏｌ）を順次添加した。室温で１６時間維持後
に、混合物を濾過し、ＳＥＰＨＡＤＥＸＬＨ−２０ク
ロマトグラフィー（１Ｍ×５０ｍｍカラム、溶出剤メタ
ノール）によって精製した。得られた生成物をシリカ−
ゲルを用いたＭＰＬＣ（２２×３００ｍｍカラム、ジク
ロロメタン中の１％アンモニア及び１０％メタノールま
でのジクロロメタンの直線勾配で溶出）で更に精製し、
無色固体状の標題化合物を得た：１ＨＮＭＲ（２００
ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）ｄ７.３１（ｂｒ、ｓ、５
Ｈ）、７.０４（ｂｒｄ、２Ｈ、Ｊ＝８.３５Ｈｚ）、
６.６７（ｂｒｄ、２Ｈ、Ｊ＝８.４５Ｈｚ）、５.０
４（ｓ、２Ｈ）、４.６１（ｍ、１Ｈ）、４.４４−４.
２５（ｍ、３Ｈ）、４.１７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７.２７Ｈ
ｚ）、３.３９（ｓ、３Ｈ）、３.３８（ｓ、３Ｈ）、
３.１−２.９（ｍ、３Ｈ）、２.７５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ
＝９.２８、１４.１２Ｈｚ）、２.５３（ｄｄ、１Ｈ、
Ｊ＝５.４７、１５.５８Ｈｚ）、２.３３（ｄｄ、１
Ｈ、Ｊ＝７.９６、１５.５３Ｈｚ）、２.０４（ｍ、１
Ｈ）、１.８８（ｓ、３Ｈ）、１.８−１.２（ｍ、６
Ｈ）、１.４１（ｓ、９Ｈ）、０.９４（ｄ、６Ｈ、Ｊ＝
６.７４Ｈｚ）。

【０１６６】ステップＢ

【０１６７】

【化４２】

【０１６８】Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−ｅ−ＣＢＺ−リシニル）−３−アミノ−４−オキソ
ブタン酸Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニル−ｅ−ＣＢ
Ｚ−リシニル）−３−アミノ−４−オキソブタン酸β−
ｔｅｒｔ−ブチルエステルジメチルアセタール（１４.
９ｍｇ）の溶液を、１ｍＬのトリフルオロ酢酸で処理
し、１５分間熟成し、減圧下に濃縮した。残渣を１.０
ｍＬのメタノールに溶解させ、２０μｌのチオニルクロ
リドを含む１.０ｍＬの水を添加した。１時間後、酢酸
ナトリウムで溶液のｐＨを約５に調整すると標題化合物
の溶液が得られた：１ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤ
３ＯＤ）ｄ７.３３（ｂｒｓ、５Ｈ）、７.０５
（ｂｒｄ、２Ｈ、Ｊ＝８.３５Ｈｚ）、６.７４（ｂｒ
ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８.３５Ｈｚ）、４.６−３.９（ｍ、５
Ｈ）、３.１−２.３（ｍ、６Ｈ）、１.９８（ｍ、１
Ｈ）、１.９２（ｓ、３Ｈ）、１.８−１.２（ｍ、６
Ｈ）、０.８９（ｄ、６Ｈ、Ｊ＝６.６０Ｈｚ）。

【０１６９】実施例２３ＰＣＲによるＩＣＥ特異的ＤＮＡ産生物の生成２０ｋＤａ及び１０ｋＤａの双方のタンパク質（図１７
及び図１８）のアミノ末端及び内部領域に由来のアミノ
酸配列に基づいて縮重オリゴヌクレオチドを設計した。
２０ｋＤａのタンパク質の場合には、アミノ末端プライ
マーＧＡＹＣＣＮＧＣＮＡＴＧＣＣＮＡＣ（ＳＥＱ.Ｉ
Ｄ.ＮＯ.：３）は１２８通りに縮重し、内部プライマー
３’ＡＴＲＧＧＮＴＡＤＴＡＣＣＴＲＴＴ５’（ＳＥ
Ｑ.ＩＤ.ＮＯ.：４）は４８通りに縮重した。１０ｋＤ
ａのタンパク質の場合は、アミノ末端プライマーＧＣＮ
ＡＴＨＡＡＲＡＡＲＧＣＮＣＡ（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.：
５）は１９２通りに縮重し、内部プライマーＧＴＹＴＡ
ＣＧＧＮＴＧＮＴＧＮＣＴ（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.：６）
は１２８通りに縮重した。

【０１７０】一本鎖ＴＨＰ.１ｃＤＮＡをＴＨＰ.１細
胞性ポリＡ＋ｍＲＮＡから合成しＰＣＲ鋳型として使用
した。ＭＯＰＡＣ手順（Ｌｅｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２
３９、１２８８（１９８８））の修正法に基づいてＰＣ
Ｒを実施した。各ＰＣＲ毎に、反応バッファ中で、１０
ｐｍｏｌの各プライマーを０.４μｇのポリＡ＋ｍＲＮ
Ａを合成できる量のｃＤＮＡに添加した。反応バッファ
は、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８.３）、１.５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０.０１％ｗ／
ｖのゼラチン、２００ｕＭの各ｄＮＴＰを最終容量１０
μｌに含んでいた。

【０１７１】ＰＣＲプログラムでは、１００℃で１０分
間の変性と２単位のＴａｑポリメラーゼの添加とから成
る１サイクルの処理後に、９５℃で３０秒間、４８℃で
３０秒間、７０℃で１分間から成るサイクルを３０回繰
返す。２０ｋＤａのタンパク質の場合には、１１６ｂｐ
のＰＣＲ産生物が合成され、内部イノシン置換オリゴヌ
クレオチド〔ＡＴＩＧＧＲＴＡＩＡＴＹＴＣＩＧＣＲ〕
（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.：７）とのハイブリダイゼーショ
ンによって同定した。１０ｋＤａのタンパク質の場合に
は、２２１ｂｐのＰＣＲ産生物が合成され、同様のタイ
プのプローブ〔ＡＴＩＧＡＲＡＡＲＧＡＹＴＴＹＡＴＩ
ＧＣ〕（ＳＥＱ.ＩＤ.ＮＯ.：８）によって同定した。
双方のＰＣＲ産生物をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングし、チェーン
ターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ他、ＰＮＡＳ７
４、５４６３（１９７７）によって配列決定した。

【０１７２】２０ｋＤａ及び１０ｋＤａのサブユニット
の推定アミノ酸配列を第６表のパネルＡ及びパネルＢに
夫々示す。

【０１７３】

【表７】

【０１７４】実施例２４ λ ｃＤＮＡライブラリイに由来のＩＣＥｃＤＮＡク
ローンの単離ＰＣＲ由来の１０ｋＤａ及び２０ｋＤａのＩＣＥサブユ
ニットの産生物を、λｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリイ
をＴＨＰ.１細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からスクリーニ
ングするためのハイブリダイゼーションプローブとして
使用した。標準法（Ｔ.Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ.Ｆ.Ｆｉ
ｒｔｓｃｈ、Ｊ.Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａ
ｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８２）によってライブラ
リイのプレーティング及びプラークリフトを実施した。
プローブをランダムプライマー化し、³²Ｐ−ｄＣＴＰで
高比活性に標識し、各プローブで別々にライブラリイの
スクリーニングを実施した（スクリーンあたり６００,
０００プラーク）。プローブをハイブリダイゼーション
バッファ（５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ
ｓ、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０.１５Ｍ）、０.５％Ｓ
ＤＳ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ）に１×１０
⁶ｃｐｍ／ｍｌで添加した。１０ｋＤａの特異的プロー
ブを用いたときには陽性にハイブリダイズした１１のフ
ァージを検出し、２０ｋＤａのプローブを用いたときに
は陽性にハイブリダイズした７つのファージを観察し
た。

【０１７５】実施例２５ＩＣＥｃＤＮＡクローンのサブクローニング及び配列
決定長さ１.０ｋｂ〜１.６ｋｂのサイズを有し４０４個のア
ミノ酸から成る１つの読取枠を含むいくつかのｃＤＮＡ
クローンをｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブ
クローニングし、Ｓａｎｇｅｒの方法で全体を両方向に
配列決定した。第７表は、ＩＣＥをコードする全長ｃＤ
ＮＡ配列（Ａ）を、２４ｋＤａ（Ｂ）、２０ｋＤａ
（Ｃ）及び１０ｋＤａ（Ｄ）コード領域と共に示す。第
８表は、全長クローンをクローンＯＣＰ９と命名した。
クローンｃＤＮＡに由来の全長ＩＣＥの推定されたアミ
ノ酸配列（Ａ）を、２４ｋＤａ（Ｂ）、２０ｋＤａ
（Ｃ）及び１０ｋＤａ（Ｄ）のサブユニットの推定アミ
ノ酸配列と共に示す。

【０１７６】推定アミノ酸配列を検討し精製された天然
型ＩＣＥ２０ｋＤａ及び１０ｋＤａサブユニットに由
来のアミノ酸配列（図１９及び図２０）と比較すると、
発生した全長ＩＣＥタンパク質の１２０位に検出される
１つのアミノ酸以外はアミノ酸配列の相同が判明した。
ｃＤＮＡ配列によれば、全長タンパク質の１２０位にＡ
ｓｎがコードされている。このアミノ酸位置は２０ｋＤ
ａサブユニットのＮＨ₂末端に対応する。精製された天
然型２０ｋＤａサブユニットに由来のアミノ酸配列で
は、ＮＨ₂末端アミノ酸がＡｓｐであることが決定され
た。推定されたアミノ酸配列と既知のアミノ酸配列との
間で観察された唯一のこの違いが生じた理由は、２０ｋ
ＤａサブユニットのＮＨ₂末端Ａｓｎの脱アミド化によ
ってＡｓｐが形成されるためであろう。ＡｓｎがＮＨ₂
末端に存在するときにこの種の脱アミド化が生じること
はよく知られている。２０ｋＤａサブユニットのＮＨ₂
末端にＡｓｎまたはＡｓｐのいずれが検出されるか、あ
るいはＩＣＥポリペプチド内部の全長タンパク質または
ポリペプチドフラグメントの１２０位にＡｓｎまたはＡ
ｓｐのいずれが検出されるかは、ＩＣＥ活性に全くでは
ないにしても有意な影響は与えないと予測される。

【０１７７】第７表

【０１７８】

【表８】

【０１７９】

【表９】

【０１８０】

【表１０】

【０１８１】

【表１１】

【０１８２】第８表

【０１８３】

【表１２】

【０１８４】

【表１３】

【０１８５】

【表１４】

【０１８６】実施例２６大腸菌発現ベクター中のＩＣＥｃＤＮＡのクローニン
グ例えばｐＥＧシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のような大腸
菌発現ベクターにＩＣＥ発現カセットを転移させた後、
組換えＩＣＥを大腸菌中で産生させた。ｐＥＴベクター
はＩＣＥ発現を厳密に調節されたバクテリオファージＴ
７プロモーターのコントロール下に維持する。この構築
物を、誘発性ｌａｃプロモーターによって推進されるＴ
７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含む大
腸菌宿主に転移させた後、適当なｌａｃ基質（ＩＰＴ
Ｇ）を培養物に添加すると、ＩＣＥの発現が誘発され
る。発現されたＩＣＥのレベルを上記アッセイによって
測定した。

【０１８７】ｐ４５の完全読取枠をコードするｃＤＮＡ
をｐＥＴ１１ａのＮｄｅＩ部位に挿入した。正の配向
の構築物を配列解析によって同定し、発現宿主菌株ＢＬ
２１の形質転換に使用した。次いで形質転換体をＩＣＥ
タンパク質産生用培養物に接種した。当業界でよく知ら
れた配合組成のＭ９またはＺＢ培地中で培養物を増殖さ
せ得る。ＯＤ₆₀₀＝１.５まで増殖させた後、１ｍＭのＩ
ＰＴＧによってＩＣＥの発現を３７℃で３時間誘発し
た。これらの細胞に由来の不溶封入体分画中で真正ＩＣ
Ｅ酵素活性が検出された。５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８）と１０ｍＭのジチオトレイトールを含むバッ
ファ中で５Ｍのグアニジン−ＨＣｌによって封入体分画
から可溶性ＩＣＥを抽出した。１００倍容量の２５ｍＭ
のＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.５）、５ｍＭのジチオトレイト
ール、１０％ショ糖に対して透析することによってこの
抽出物から活性ＩＣＥを回収した。

【０１８８】実施例２７アフリカツメガエル卵母細胞マイクロインジェクション
ベクターによるＩＣＥｍＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ翻訳
及び哺乳類細胞中での発現合成ｍＲＮＡ産生用のｉｎｖｉｔｒｏ転写ベクター
（ｐＧＥＭシリーズ、Ｐｒｏｍｅｇａ）にＩＣＥｃＤ
ＮＡを結合した。

【０１８９】バクテリオファージプロモーターを含むプ
ラスミドベクターにＩＣＥｍＲＮＡをコードする二重
鎖ＤＮＡをクローニングし、クローンＩＣＥ−コードＤ
ＮＡを含むベクターを直鎖化し、プラスミドベクターの
バクテリオファージプロモーターを特異的に認識するバ
クテリオファージに由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ
ーゼを使用してクローンＤＮＡをｉｎｖｉｔｒｏ転写
することによって、十分な量の合成ｍＲＮＡをｉｎｖ
ｉｔｒｏで産生する。

【０１９０】バクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポ
リメラーゼによって認識されるバクテリオファージプロ
モーターを含む種々のプラスミドベクターが入手可能で
ある。これらの非限定例として、プラスミドｐＳＰ６
４、ｐＳＰ６５、ｐＳＰ７０、ｐＳＰ７１、ｐＳＰ７
２、ｐＳＰ７３、ｐＧＥＭ−３Ｚ、ｐＧＥＭ−４Ｚ、ｐ
ＧＥＭ−３Ｚｆ、ｐＧＥＭ−５Ｚｆ、ｐＧＥＭ−９Ｚｆ
及びｐＧＥＭ−１１Ｚｆがある。プラスミドの全シリー
ズがＰｒｏｍｅｇａから市販されている。

【０１９１】ＩＣＥＤＮＡクローニングに有利な適当
なベクター上の１つまたは複数の有効な制限エンドヌク
レアーゼクローニング部位を利用し、バクテリオファー
ジプロモーターを含むベクターに二重鎖ＩＣＥ−コード
ＤＮＡを適正配向でクローニングする。ＩＣＥＤＮＡ
が結合したベクターで細菌を形質転換させ、クローナル
単離物中で、適正配向のＩＣＥＤＮＡを含むベクター
の存在を分析する。

【０１９２】適正配向のＩＣＥコードＤＮＡを含むベク
ターを同定し単離した後で、ＩＣＥ転写ユニットを破壊
しないように該ユニットよりも下流の部位を制限エンド
ヌクレアーゼで開裂することによってこのベクターを直
鎖化する。直鎖化したプラスミドを単離して精製し、Ｉ
ＣＥｍＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ転写用鋳型として使
用する。

【０１９３】次に、ＩＣＥｍＲＮＡを形成するＤＮＡ
鋳型の転写を許容する反応混合物中で、鋳型ＤＮＡをバ
クテリオファージ特異的ＤＮＡ依存性ポリメラーゼと混
合する。数種のバクテリオファージ特異的ＤＮＡ依存性
ＲＮＡポリメラーゼが入手可能である。その非限定例と
して、Ｔ３、Ｔ７及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼがあ
る。次に合成ＩＣＥｍＲＮＡを単離して精製する。

【０１９４】ｍＲＮＡの安定性を改善するために、５′
末端キャップ構造と３′ポリＡテイルとを含むｍＲＮＡ
を合成するのが有利であろう。キャップ構造または７−
メチルグアノシンは、ＤＮＡ鋳型との反応混合物に７−
メチルグアノシンを添加するだけでｍＲＮＡの５′末端
に組込まれる。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、ｍ
ＲＮＡを合成するときに５′末端にキャップ構造を取込
む。ポリＡテイルは多くのｃＤＮＡでは天然に発生する
ことが知見されたが、ＤＮＡ鋳型の３′末端にポリＡテ
イルコードＤＮＡを挿入するだけでｍＲＮＡの３′末端
に付加し得る。

【０１９５】単離及び精製されたＩＣＥｍＲＮＡを無
細胞系または細胞ベース系を用いて翻訳し得る。無細胞
系の非限定例としては、ウサギ網状赤血球溶解液及び小
麦酵母抽出物（双方ともＰｒｏｍｅｇａ＆Ｎｅｗ
ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒによって市販されてい
る）があり、細胞ベース系の非限定例としては、アフリ
カツメガエル卵母細胞へのマイクロインジェクションが
ある。アフリカツメガエル卵母細胞へのマイクロインジ
ェクションのほうが好ましい。

【０１９６】ＩＣＥタンパク質を産生する十分な量の合
成ＩＣＥｍＲＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に微
量注射し得る。微量注射された卵母細胞をインキュベー
トしてＩＣＥｍＲＮＡを翻訳させ、ＩＣＥタンパク質
を形成させる。

【０１９７】これらの合成ｍＲＮＡを、標準手順〔Ｇｕ
ｒｄｏｎ、Ｊ.Ｂ．＆Ｗｉｃｋｅｎｓ、Ｍ.Ｄ.、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ.１０１：３７０〜
３８６（１９８３）〕によってアフリカツメガエル卵母
細胞に注射する。後述するごとく卵母細胞を採取しＩＣ
Ｅ発現を分析する。

【０１９８】実施例２８哺乳類発現ベクター中のＩＣＥｃＤＮＡのクローニン
グ強力な汎用哺乳類プロモーターを含む以下のベクター：
ｐＢＣ１２ＢＩ〔Ｃｕｌｌｅｎ、Ｂ.Ｒ.、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ.１５２：６８４〜７０４
１９８８〕及びｐＥＥ１２（ＣｅｌｌＴｅｃｈＥＰ０
３３８,８４１）並びにその誘導体ｐＡＺ９０１６−
１及びｐ９０１９に、ＩＣＥｃＤＮＡ発現カセットを
適当な制限エンドヌクレアーゼ部位で結合する。ｐ９０
１９は、ＳＶ４０早期プロモーターによって推進される
デヒドロ葉酸レダクターゼ（ｍＤＨＦＲ）（Ｓｉｍｏｎ
ｓｅｎ、Ｃ.Ｃ. ＆Ｌｅｖｉｎｓｏｎ、Ａ.Ｄ.、Ｐｒ
ｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.ＳｃｉＵＳＡ８０：２４
９５〜２４９９（１９８３））の突然変異遺伝子から成
る選択可能マーカー／増幅系によるｈＣＭＶＩＥｐｒ
ｍ、ポリリンカー及びＳＶ４０ポリＡエレメントを含
む哺乳類発現ベクターの構築を代表する。鋳型としてｐ
Ｄ５（Ｂｅｒｋｅｒ＆Ｓｈａｒｐ、Ｎｕｃｌ.Ａｃ
ｉｄＲｅｓ.１３：８４１〜８５７（１９８５））を
使用し、プライマー１３９７８−１２０及び１３９７７
８−１２１によって規定されたＰＣＲ反応によってＳＶ
４０ポリアデニル化配列を生成した。得られた０.２５
ＫｂＰＣＲ産生物をＣｌａＩ及びＳｐｅＩによって消
化し、同様に消化しておいたｐＥＥ１２の６.７Ｋｂフ
ラグメントに結合した。得られたプラスミドをｐ９０１
８と命名した。ｐ９０１８をＢｇｌII及びＳｆｉＩで消
化するとＳＶ４０早期プロモーターの３′部分とベクタ
ーに由来のＧＳｃＤＮＡとが遊離した。プラスミドｐＦ
Ｅ４００（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ、Ｃ.Ｃ. ＆Ｌｅｖｉｎ
ｓｏｎ、Ａ.Ｄ、Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ
ＵＳＡ８０：２４９５〜２４９９（１９８３））から
単離した７３ＫｂのＳｆｉＩ−ＸｈｏIIフラグメントを
前記の５.６Ｋｂベクターに結合し、ＳＶ４０早期プロ
モーターを再構築してｍｄＨＦＲ遺伝子を挿入した。こ
のプラスミドをｐ９０１９と命名する。ｐＳＺ９０１６
−１は、ＨＩＶＬＴＲがｈｕＣＭＶＩＥプロモーター
に置換している以外はｐ９０１９に等しい。このベクタ
ーは、ｐ９０１９をＸｂａＩ及びＭｌｕＩで消化してｈ
ｕＣＭＶＩＥプロモーターを除去することによって構築
した。ＨＩＶ−１ＬＴＲの部分（Ｃｕｌｌｅｎ、Ｃｅ
ｌｌ４６：９７３（１９８６））を含むベクターｐＣ
Ｄ２３中で検出されるような残基−１１７〜＋８０のＨ
ＩＶＬＴＲプロモーターを、プラスミドｐＣＤ２３か
らＰＣＲ増幅した。このために、産生物の５′側末端に
ＭｕｌＩ及びＳｐｅＩ制限部位を付加するオリゴヌクレ
オチドプライマーを用いた。３′側にはＨｉｎｄIII及
びＸｂａＩ部位が付加されていた。得られた０.２ｋｂ
のＰＣＲ産生物を酵素ＭｌｕＩ及びＸｂａＩで消化後
に、フラグメントをアガロースゲルで精製し、４.３ｋ
ｂのプロモーターのないＤＮＡフラグメントに結合し
て、ベクターｐＳＺ９０１６−１を形成した。

【０１９９】プロモーターに対して正の配向でＩＣＥ
ｃＤＮＡを含むカセットを、プロモーターの３′の適当
な制限部位に結合し、制限部位マッピング及び／または
配列決定によって同定する。これらのｃＤＮＡ発現ベク
ターを、種々の線維芽宿主細胞、例えば〔ＣＯＳ−７
（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６５１）、ＣＶ−１ｔａｔ
〔Ｓａｃｋｅｖｉｔｚ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：１
５７５（１９８７）〕、２９３、Ｌ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ
６３６２）〕に、標準法によって挿入する。標準法の非
限定例としては、エレクトロポレーション、または化学
的手順（カチオン性リポソーム、ＤＥＡＥデキストラ
ン、リン酸カルシウム）がある。トランスフェクトした
細胞及び細胞培養上清を採取し、後述のごとくＩＣＥ発
現を分析し得る。

【０２００】哺乳類過渡発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に使用した全部のベクターを、Ｉ
ＣＥを発現する安定な細胞系の樹立に使用し得る。発現
ベクター中でクローニングされた不変化のＩＣＥｃＤ
ＮＡ構築物は、細胞内ＩＣＥタンパク質を産生させるプ
ログラムを宿主細胞に組込むと予想される。更に、ヒト
成長ホルモンまたはヒトリゾチームのような分泌タンパ
ク質のシグナル配列をコードするＤＮＡにＩＣＥｃＤ
ＮＡ構築物を結合することによって、ＩＣＥが分泌タン
パク質として細胞外で発現され得る。トランスフェクシ
ョン宿主細胞の非限定例は、ＣＶ−１−Ｐ〔Ｓａｃｋｅ
ｖｉｔｚ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：１５７５（１９
８７）〕、ｔｋ−Ｌ〔Ｗｉｇｌｅｒ他、Ｃｅｌｌ１
１：２２３（１９７７）〕、ＮＳ／Ｏ及びｄＨＦｒ−Ｃ
ＨＯ〔Ｋａｕｆｍａｎ＆Ｓｈａｒｐ、Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂ
ｉｏｌ.１５９：６０１（１９３２）〕である。

【０２０１】ＩＣＥｃＤＮＡを含むベクターのいずれ
かと薬剤選択プラスミド（非限定例は、Ｇ４１８、アミ
ノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ｐＬＮＣＸ
〔Ｍｉｌｌｅｒ、Ａ.Ｄ.＆ＲｏｓｍａｎＧ.Ｊ. Ｂ
ｉｏｔｅｃｈＮｅｗｓ７：９８０〜９９０（１９８
９）〕；ヒグロマイシン、ヒグロマイシン−Ｂホスホト
ランスフェラーゼ、ｐＬＧ９０〔Ｇｒｉｔｚ、Ｌ. ＆
Ｄａｖｉｅｓ、Ｊ.、ＧＥＮＥ２５：１７９（１９
８３）〕；ＡＰＲＴ、キサンチン−グアニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ、ｐＭＡＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ）〔Ｍｕｒｒａｙ他、Ｇｅｎｅ３１：２３３（１９
８４）〕、とのコトランスフェクションによって、安定
にトランスフェクトされたクローンの選択を可能にす
る。ＩＣＥレベルを前述のアッセイで定量する。

【０２０２】可能最大レベルのＩＣＥを合成する哺乳類
細胞クローンを産生させるために、ＩＣＥｃＤＮＡ構
築物を、増幅可能な薬剤耐性マーカーを含むベクターに
結合する。これらの構築物を細胞に導入した後で、適当
な薬品によってプラスミド含有クローンを選択し、薬剤
用量を増加させながら選択することによってプラスミド
コピー数の多い超発現クローン（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎｃｌｏｎｅ）を単離する。以下の系を使用す
る：ｄＨＦＲ−ＣＨＯ細胞にトランスフェクトされメト
トレキセート中で選択された突然変異ＤＨＦＲ遺伝子を
含むプラスミド９０１６または９０１９〔Ｓｉｍｏｎｓ
ｏｎ、Ｃ. ＆Ｌｅｖｉｎｓｏｎ、Ａ.、Ｐｒｏｃ.Ｎ
ａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ８０：２４９５（１
９８３）〕；ＮＳ／Ｏ細胞にトランスフェクトされメチ
オニンスルホキシイミン中で選択されたグルタミンシン
セターゼ遺伝子を含むプラスミドｐＥＥ１２（Ｃｅｌｌ
Ｔｅｃｈ国際特許出願２０８９／１０４０４）；及びＡ
ＰＲＴ及びＴＫ欠失Ｌ細胞中にチミジンキナーゼ遺伝子
〔Ｃｏｌｂｅｒｅ＆Ｇａｒｏｐｉｎ、Ｆ.Ｐｒｏｃ.
Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.７６：３７５５（１９７
９）〕を含むｐＤＬＡＴ−３とコトランスフェクトさ
れ、ＡＰＲＴ（０.０５ｍＭのアザセリン、０.１ｍＭの
アデニン、４μｇ／ｍｌのアデノシン）中で選択されＨ
ＡＴ（１００μＭのヒポキサンチン、０.４μＭのアミ
ノプテリン、１６μＭのチミジン）で増幅された９０１
６またはその他のＣＭＶｐｒｍベクター。

【０２０３】４５ｋＤａのＩＣＥプレタンパク質（図２
３）の完全ＯＲＦを含む全長ＩＣＥｃＤＮＡを哺乳類宿
主細胞にトランスフェクトすることによって組換えＩＣ
Ｅを発現させた。全長ＩＣＥｃＤＮＡを含む１.６ｋ
ｂのＥｃｏＲＩフラグメントをベクターｐＳＺ−９０１
６にクローニングした。６μｇのこのＤＮＡを、ＨＩＶ
のトランス活性化タンパク質（ＴＡＴ）をＳＶ４０早期
プロモーターのコントロール下に維持する哺乳類発現ベ
クターである０.６μｇのｐＸ８ＴＡＴと共に、カチオ
ン性リポソーム法でＣＯＳ−７細胞にトランスフェクト
した。４８時間後に細胞を採取し、界面活性バッファ
（２５ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７、１％のＴｒｉｔｏｎ
−Ｘ−１００、２ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＤＴＴ、１
０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイレ
プチン、１０μｇ／ｍｌのペプスタチン及び２ｍＭのＰ
ＭＳＦ）に溶解させた。ＩＣＥ活性を測定するために、
細胞溶解液を、放射性標識したＩＬ−１β前駆体と共に
インキュベートした。ＩＬ−１βの開裂産物をＩＬ−１
β抗体による免疫沈降及びＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル上の分画化によって分析した。ＩＬ−１β前駆体は、
ＩＣＥｃＤＮＡがトランスフェクトされた細胞によっ
て成熟１７ｋＤａ形態に開裂されたが、発現プラスミド
だけがトランスフェクトされた細胞によって開裂されな
かった。開裂産物は、アフィニティ精製ＩＣＥと共に基
質をインキュベートすることによって産生した成熟ＩＬ
−１βと同時泳動し、特異的ＩＣＥインヒビター（Ｌ−
７０９,０４９）によって完全に阻害された。発現した
ＩＣＥ活性の基質特異性は、溶解液を、ＩＣＥによって
開裂できないＩＬ−１β前駆体開裂部位突然変異体（Ａ
ｌａ¹¹⁶）と共にインキュベートすることによって検証
された。天然型ＩＣＥと同様に、トランスフェクタント
に由来の活性は、突然変異タンパク質を２８ｋＤａの産
生物に開裂するが１７ｋＤａ形態には開裂しない（図２
５）。

【０２０４】ｐ２０またはｐ１０サブユニットを別々に
または一緒に発現する個々の構築物の過渡トランスフェ
クション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｔｒａｎｓｆｅｃｔｉ
ｏｎ）では、組換えＩＣＥ活性が観察されなかった。こ
れらの結果から、ｐ２０及びｐ１０はこのようにして発
現されたときに適正に折り畳まれていないのでＩＣＥの
活性コンホーメーションがｐ４５プロ酵素のタンパク質
分解のときにのみ生成すると推測される。更に、触媒Ｃ
ｙｓ（残基２８５）からＡｌａへの突然変異はＩＣＥ活
性を喪失させるが、プレドメイン（ｐ１４）の欠失は、
該プレドメインがＩＣＥ活性に不要であることを示す。

【０２０５】実施例２９昆虫細胞中で発現するためのバキュロウイルス発現ベク
ター中のＩＣＥｃＤＮＡのクローニングＡｃＮＰＶウイルスのゲノムに由来のバキュロウイルス
ベクターを、昆虫細胞のＳｆ９系（ＡＴＣＣＣＲＬ＃
１７１１）中でｃＤＮＡの高レベル発現を与えるように
設計する。ＩＣＥｃＤＮＡを発現する組換えバキュロ
ウイルスを以下の標準法で産生する（ＩｎＶｉｔｒｏｇ
ｅｎＭａｘｂａｃＭａｎｕａｌ）：ＩＣＥｃＤＮ
Ａ構築物をｐＡＶ３６０及びＢｌｕｅＢａｃベクター
（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）のような種々のバキュロウイ
ルス転移ベクター中の多面体遺伝子に結合する。Ｓｆ９
細胞中のバキュロウイルス転移ベクターと直鎖化したＡ
ｃＮＰＶゲノムＤＮＡ〔Ｋｉｔｔｓ、Ｐ.Ａ,、Ｎｕｃ.
Ａｃｉｄ.Ｒｅｓ.１８：５６６７（１９９０）〕とのコ
トランスフェクション後の相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇ
ｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によって組換え
バキュロウイルスを生成する。組換えｐＡＣ３６０ウイ
ルスを、感染細胞中の封入体の不在によって同定し、組
換えｐＢＬｕｅＢａｃウイルスをβ−ガラクトシダーゼ
発現に基づいて同定する（Ｓｕｍｍｅｒｓ、Ｍ.Ｄ. ＆
Ｓｍｉｔｈ、Ｇ.Ｅ.、ＴｅｘａｓＡｇｒｉｃｕｌｔ
ｕｒｅＥｘｐ.ＳｔａｔｉｏｎＢｕｌｌｅｔｉｎ
Ｎｏ.１５５５））。プラーク精製後に、前記アッセイ
によってＩＣＥ発現を測定する。

【０２０６】ｐ４５の完全読取枠をコードするｃＤＮＡ
をｐＢｌｕｅＢａｃＩＩのＢａｍＨＩ部位に挿入した。
正の配向の構築物を配列解析によって同定し、直鎖状Ａ
ｃＮＰＶ野性型ＤＮＡの存在下にＳｆ９細胞を転写する
ために使用した。

【０２０７】真正の酵素活性ＩＣＥを感染細胞の細胞質
中で検出した。低張液または界面活性剤で溶菌させるこ
とによって生体条件下に感染細胞から活性ＩＣＥを抽出
した。

【０２０８】実施例３０酵母発現ベクター中のＩＣＥｃＤＮＡのクローニング異種タンパク質の細胞内または細胞外発現を導くように
設計された発現ベクターに最適ＩＣＥｃＤＮＡシスト
ロンを挿入した後で、酵母Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中
で組換えＩＣＥを発現させた。細胞内発現の場合には、
ＥｍＢＬｙｅｘ４のようなベクターをＩＣＥシストロン
に結合させる〔Ｒｉｎａｓ、Ｕ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ８：５４３〜５４５（１９９０）：Ｈｏｒｏ
ｗｉｔｚＢ.他、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６５：４１８
９〜４１９２（１９８９）〕。細胞外発現のためには、
ＩＣＥタンパク質のＮＨ₂末端に分泌シグナル（酵母ま
たは哺乳類ペプチド）を融合させる酵母発現ベクターに
ＩＣＥシストロンを結合させる〔Ｊａｃｏｂｓｏｎ、
Ｍ.Ａ.、Ｇｅｎｅ８５：５１１〜５１６（１９８
９）；ＲｉｅｔｔＬ. ＆ＢｅｌｌｏｎＮ.、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ.２８：２９４１〜２９４９（１９８
９）〕。

【０２０９】これらのベクターの非限定例としては、発
現されたｃＤＮＡにヒト血清アルブミンシグナルを融合
させるｐＡＶＥ１＞６〔ＳｔｅｅｐＯ、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ８：４２〜４６（１９９０）〕、発現
されたｃＤＮＡにヒトリゾチームシグナルを融合させる
ベクターｐＬ８ＰＬ〔Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｙ.、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ.２８：２７２８〜２７３２）〕がある。更
に、ＩＣＥは、ベクターｐＶＥＰ〔Ｅｃｋｅｒ、Ｄ.
Ｊ.、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６４：７７１５〜７７１
９（１９８９）、Ｓａｂｉｎ、Ｅ.Ａ.、Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ７：７０５〜７０９（１９８９）、Ｍｃ
Ｄｏｎｎｅｌｌ、Ｄ.Ｐ.、Ｍｏｌ.ＣｅｌｌＢｉｏｌ.
９：５５１７〜５５２３（１９８９）〕を利用するユビ
キチンに結合した融合タンパク質として酵素中で発現す
る。発現したＩＣＥのレベルは前記アッセイによって測
定される。

【０２１０】実施例３１組換えＩＣＥの精製実施例１〜３、５〜７の精製手順の１つまたは組合せを
用い、組換えによって産生されたＩＣＥを精製し得る。
更に、組換えによって産生された適当な単一特異的抗体
を用い、組換えによって産生された２０ｋＤａのサブユ
ニット、１０ｋＤａのサブユニット及び新生全長ＩＣＥ
ポリペプチドを個々に精製し得る。

【０２１１】配列リスト（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１に関する情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１４アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖種：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の種類：ペプチド（xi）配列記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：１： Asp Pro Ala Met Pro Tyr Ser Ser Gly Ser Glu Gly Asn Val 1 5 10 （２）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に関する情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１７アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖種：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の種類：ペプチド（xi）配列記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：２： Ala Ile Lys Lys Ala His Ile Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys Ser S er 1 5 10 15 （２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３に関する情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１７塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖種：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：３：ＧＡＹＣＣＮＧＣＮＡＴＧＣＣＮＡＣ（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：４に関する情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１７塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖種：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：４：ＡＴＲＧＧＮＴＡＤＴＡＣＣＴＲＴＴ（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：５に関する情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１７塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖種：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：５：ＧＣＮＡＴＨＡＡＲＡＡＲＧＣＮＣＡ（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：６に関する情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１７塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖種：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：６：ＧＴＹＴＡＣＧＧＮＴＧＮＴＧＮＣＴ（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：７に関する情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１８塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖種：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：７：ＡＴＩＧＧＲＴＡＩＡＴＹＴＣＩＧＣＲ（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：８に関する情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：２０塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖種：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：８：ＡＴＮＧＡＲＡＡＲＧＡＹＴＴＹＡＴＮＧＣ（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：９に関する情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１４９０塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖種：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：９：

【０２１２】

【化４３】

【０２１３】

【化４４】

【０２１４】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に関する
情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：４０４アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖種：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の種類：タンパク質（xi）配列記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：１０：

【０２１５】

【化４５】

【０２１６】

【化４６】

【０２１７】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１１に関する
情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：３９アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖種：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の種類：ペプチド（xi）配列記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：１１：

【０２１８】

【化４７】

【０２１９】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に関する
情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：７４アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖種：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の種類：ペプチド（xi）配列記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：１２：

【０２２０】

【化４８】

【０２２１】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に関する
情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：５８２塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖種：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３：

【０２２２】

【化４９】

【０２２３】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に関する
情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：５３４塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖種：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：１４：

【０２２４】

【化５０】

【０２２５】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に関する
情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：２６４塩基対（Ｂ）種類：核酸（Ｃ）鎖種：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の種類：ｃＤＮＡ（xi）配列記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：１５：

【０２２６】

【化５１】

【０２２７】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１６に関する
情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１９５アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖種：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の種類：ペプチド（xi）配列記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：１６：

【０２２８】

【化５２】

【０２２９】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１７に関する
情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：１７８アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖種：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の種類：ペプチド（xi）配列記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：１７：

【０２３０】

【化５３】

【０２３１】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１８に関する
情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：８８アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖種：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の種類：ペプチド（xi）配列記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：１８：

【０２３２】

【化５４】

【０２３３】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１９に関する
情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）長さ：２１アミノ酸（Ｂ）種類：アミノ酸（Ｃ）鎖種：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子の種類：ペプチド（xi）配列記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：１９：ＳｅｒＧｌｎＧｌｙＶａｌＬｅｕＳｅｒＸａａＰ
ｈｅＰｒｏＡｌａＰｒｏＧｌｎＡｌａＧｌｎ１ＡｓｐＡｓｎＰｒｏＡｌａＭｅｔＰｒｏＴｈｒ１５

【図面の簡単な説明】

【図１】精製ＩＣＥ（パネルＡ）及び関係プレＩＬ−１
β切断（酵素）活性（パネルＢ）のナトリウムドデシル
スルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動図であ
る：Ａ．Ｓ．＝硫酸アンモニウム；ＤＥ−Ｆ．Ｔ．＝Ｄ
ＥＡＥ流；Ｓ．Ｐ．＝スルホプロピルカチオン交換；Ｈ
ＩＣ＝プロピル疎水性相互作用クロマトグラフィー；Ｔ
ＳＫ＝ＴＳＫ−１２５サイズ排除クロマトグラフィー；
ＨＡＰ＝ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィ
ー。

【図２】別の精製スキーム（Ａ．Ｓ．，ＤＥＡＥ，Ｓ
Ｐ，ＨＡＰ，ＴＳＫ）によって精製したＩＣＥ活性をプ
ロピル疎水性相互作用カラムに適用した。逆塩濃度勾配
を用いてタンパク質を溶出した。溶出タンパク質を透析
し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色によって分析し（パネ
ルＡ）、同様に、変換酵素活性も分析した（パネル
Ｂ）。２２及び１０ｋＤａのタンパク質の溶出液の様相
とＩＣＥ活性との相関に留意されたい。

【図３】図３のＡはＴＨＰ−１Ｓ−３００インターロ
イキン−１β変換酵素活性のｐＨ最適値を示しており、
図３のＢはインターロイキン−１β変換酵素活性の塩滴
定を示している。

【図４】１４−Ｃ−ヨードアセテートによるＩＣＥの活
性部位標識を示す。

【図５】天然ＩＣＥの等電点を示すグラフである。

【図６】インターロイキン−１β変換酵素平衡特性を示
すグラフである。

【図７】インターロイキン−１β変換酵素ｓｓ−グルタ
チオン再活性化を示すグラフである。

【図８】インターロイキン−１β変換酵素ｓｓ−グルタ
チオン安定性を示すグラフである。

【図９】ＩＣＥ結合の速度定数を示すグラフである。

【図１０】ＧＳＳＧ処理またはシスタミン処理した酵素
のサイズ排除クロマトグラフィーによるＩＣＥの分子量
推定のグラフである。

【図１１】パネルＡは、２２ｋＤａ及び１０ｋＤａのＩ
ＣＥサブユニットのＣ−４逆相ＨＰＬＣのクロマトグラ
ムであり、パネルＢは、逆相ＨＰＬＣのあとの、２２ｋ
Ｄａ及び１０ｋＤａＩＣＥサブユニットのＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ分画化を示す。

【図１２】２０ｋＤａＩＣＥサブユニットの毛管ＬＣ
エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルである。

【図１３】１０ｋＤａＩＣＥサブユニットの毛管ＬＣ
エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルである。

【図１４】２０ｋＤａＩＣＥサブユニットのトリプシ
ン及びＡｓｐ．Ｎの比較マップである。

【図１５】１０ｋＤａＩＣＥサブユニットのトリプシ
ン及びＡｓｐ．Ｎの比較マップである。

【図１６】２０ｋＤａＩＣＥサブユニットと２４ｋＤ
ａタンパク質のアミノ末端配列の比較である。

【図１７】２０ｋＤａＩＣＥサブユニットのＤＮＡフ
ラグメントのＰＣＲのための縮重オリゴヌクレオチドの
態様を示す。

【図１８】１０ｋＤａＩＣＥサブユニットのＤＮＡフ
ラグメントのＰＣＲのための縮重オリゴヌクレオチドの
態様を示す。

【図１９】２０ｋＤａＩＣＥサブユニットに対するＰ
ＣＲ産物の配列を示す。

【図２０】１０ｋＤａＩＣＥサブユニットに対するＰ
ＣＲ産物の配列を示す。

【図２１】ヒトＩＣＥｃＤＮＡの構造的編成を示す。

【図２２】ヒトＩＣＥ前駆タンパク質の構造的編成を示
す。

【図２３】ウサギ網状赤血球溶解物におけるＩＣＥｃ
ＤＮＡのＩｎｖｉｔｒｏ翻訳を示す。

【図２４】２４ｋＤａタンパク質並びに２０ｋＤａ及び
１０ｋＤａのＩＣＥサブユニットのＩＣＥ前駆体におけ
る位置を示す。

【図２５】トランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞におけ
るＩＣＥｃＤＮＡの機能的発現を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者スーザン・エム・モリノーアメリカ合衆国、ニユー・ヨーク・10003、ニユー・ヨーク、イースト・ナインス・ストリート・115、アパートメント・８・エイ (72)発明者マイケル・ジエイ・トツチアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 08807、ブリツジウオーター、ボニー・コート・102 (72)発明者ジミー・アール・キヤレイカイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07066、クラーク、シエフイールド・ウエイ・２ (72)発明者ダグラス・ケイ・ミラーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07090、ウエストフイールド、カールトン・ロード・619

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヌクレオチド配列：【化１】【化２】を有する、完全未修飾形態のインターロイキン１β前駆
体変換酵素をコードするＤＮＡ分子。
【請求項２】ヌクレオチド配列：【化３】を有する、インターロイキン１β前駆体変換酵素の２２
ｋＤａタンパク質をコードするＤＮＡ分子。
【請求項３】ヌクレオチド配列：【化４】を有する、インターロイキン１β前駆体変換酵素の２０
ｋＤａのサブユニットをコードするＤＮＡ分子。
【請求項４】ヌクレオチド配列：【化５】を有する、インターロイキン１β前駆体変換酵素の１０
ｋＤａのサブユニットをコードするＤＮＡ分子。
【請求項５】ヌクレオチド配列：【化６】【化７】または【化８】または【化９】または【化１０】からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する１
種以上のクローン遺伝子を含む、組換え宿主中でクロー
ン遺伝子を発現するための発現ベクター。
【請求項６】ヌクレオチド配列：【化１１】【化１２】または【化１３】または【化１４】または【化１５】からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する１
種以上の組換えクローン遺伝子を含む組換え宿主細胞。
【請求項７】ヌクレオチド配列：【化１６】【化１７】または【化１８】または【化１９】または【化２０】からなる群から選択される１種以上の組換え遺伝子を含
む、組換えインターロイキン１βを発現する組換え宿主
細胞。
【請求項８】アミノ酸配列：【化２１】を有する、ＩＬ−１β前駆体を特異的に切断して成熟Ｉ
Ｌ−１βを形成し得る実質的に純粋形態のタンパク質。
【請求項９】アミノ酸配列：【化２２】を有する、インターロイキン１β前駆体変換酵素の２２
ｋＤａのサブユニットに対応する実質的に純粋形態のタ
ンパク質。
【請求項１０】アミノ酸配列：【化２３】〔ここでＲはＡｓｐまたはＡｓｎである〕を有する、イ
ンターロイキン１β前駆体変換酵素の２０ｋＤａのサブ
ユニットに対応する実質的に純粋形態のタンパク質。
【請求項１１】アミノ酸配列：【化２４】を有する、インターロイキン１β前駆体変換酵素の１０
ｋＤａのサブユニットに対応する実質的に純粋形態のタ
ンパク質。
【請求項１２】（ａ）アミノ酸配列：【化２５】〔ここでＲはＡｓｐまたはＡｓｎである〕を有するポリ
ペプチド、及び（ｂ）アミノ酸配列：【化２６】を有するポリペプチドを含む、インターロイキン１β前
駆体を特異的に切断して成熟インターロイキン１βを形
成し得る実質的に純粋形態の複合タンパク質分子。
【請求項１３】（ａ）アミノ酸配列：【化２７】を有するポリペプチド、及び（ｂ）アミノ酸配列：【化２８】を有するポリペプチドを含む、インターロイキン１β前
駆体を特異的に切断して成熟インターロイキン１βを形
成し得る実質的に純粋形態の複合タンパク質分子。
【請求項１４】モノマー性インターロイキン１β前駆
体変換酵素に免疫学的反応性を示す単一特異性抗体。
【請求項１５】前記抗体が、インターロイキン１β前
駆体変換酵素の活性をブロックし、且つ前記抗体がモノ
クローナル抗体である請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】インターロイキン１β前駆体変換酵素
の２０ｋＤａのサブユニットに免疫学的反応性を示す単
一特異性抗体。
【請求項１７】前記抗体が、インターロイキン１β前
駆体変換酵素の活性をブロックし、且つ前記抗体がモノ
クローナル抗体である請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】インターロイキン１β前駆体変換酵素
の１０ｋＤａのサブユニットに免疫学的反応性を示す単
一特異性抗体。
【請求項１９】前記抗体が、インターロイキン１β前
駆体変換酵素の活性をブロックし、且つ前記抗体がモノ
クローナル抗体である請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】ＡＴＣＣ６８６５５と称された組換え
微生物。