JPH1080270A

JPH1080270A - ポリペプチドをプロセッシングする酵素

Info

Publication number: JPH1080270A
Application number: JP9156062A
Authority: JP
Inventors: Tadao Tanimoto; 忠雄谷本; Masashi Kurimoto; 雅司栗本
Original assignee: Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1996-07-19
Filing date: 1997-05-30
Publication date: 1998-03-31
Also published as: DE69739280D1; KR970065710A; KR100682713B1; EP0819757B1; TW480285B; US5879942A; EP0819757A3; EP0819757A2

Abstract

(57)【要約】【課題】免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を
誘導するポリペプチドの前駆体に作用し、これを活性型
のポリペプチドに変換する手段を提供することを課題と
する。【解決手段】免疫担当細胞においてインターフェロン−
γの産生を誘導するポリペプチドの前駆体を活性型のポ
リペプチドに変換する酵素と、その酵素を産生し得る細
胞を増殖させる工程と、増殖細胞から酵素を採取する工
程を含んでなる酵素の製造方法と、免疫担当細胞におい
てインターフェロン−γの産生を誘導するポリペプチド
の前駆体に当該酵素を作用させて活性型のポリペプチド
に変換するポリペプチドの変換方法により解決する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明はポリペプチドをプ
ロセッシングする酵素に関するものであり、詳細には、
免疫担当細胞においてインターフェロン−γ（以下、
「ＩＦＮ−γ」と略記する。）の産生を誘導するポリペ
プチドの前駆体を活性型のポリペプチドに変換する酵素
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】本発明者らは、免疫担当細胞においてＩ
ＦＮ−γの産生を誘導するポリペプチドの単離と、その
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのクローニングに成
功し、特願平６−２７１８９号明細書（特開平８−２７
１８９号）及び特願平７−２６２０６２号明細書（特開
平８−１９３０９８号）に開示した。このポリペプチド
は有用な生理活性蛋白質であるＩＦＮ−γの産生を誘導
する性質と、キラー細胞による細胞障害性を増強した
り、キラー細胞の生成を誘導する性質を兼備しているの
で、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗腫瘍剤、抗免疫疾患剤な
どとして広範な用途が期待されている。

【０００３】ところで、ヒト細胞においては、遺伝子の
発現により生成したポリペプチドは細胞内酵素によるプ
ロセッシングを受け、ポリペプチドの一部が切断された
り、糖鎖が付加したりすると言われている。医薬品に配
合するポリペプチドとしては、ヒト細胞におけると同様
のプロセッシングを受けたものが望ましいところ、特願
平８−２６９１０５号明細書に記載されているように、
ヒト細胞は一般に当該ポリペプチドの産生量が少ないと
いう問題がある。本発明者がその原因について鋭意研究
したところ、ヒト細胞において、当該ポリペプチドは、
通常、生理活性を有しない、分子量約２４，０００ダル
トンの前駆体として存在していることが判明した。当該
ポリペプチドにかぎらず、多くのサイトカインは、通
常、まず、生理活性を有しない前駆体として産生され、
その後、細胞内酵素によるプロセッシングを受けて活性
型のポリペプチドに変換されることが知られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】斯かる状況に鑑み、こ
の発明の第一の課題は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−
γの産生を誘導するポリペプチドの前駆体に作用し、こ
れを免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する
活性型のポリペプチドに変換する酵素を提供することに
ある。

【０００５】さらに、この発明の第二の課題は、斯かる
酵素を製造する方法を提供することにある。

【０００６】加えて、この発明の第三の課題は、斯かる
酵素を用いて当該ポリペプチドの前駆体を免疫担当細胞
においてＩＦＮ−γの産生を誘導する活性型のポリペプ
チドに変換する方法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者が上記諸課題を
解決すべく鋭意研究したところ、ある種のヒト細胞から
採取した酵素は当該ポリペプチドの前駆体に作用し、こ
れを免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する
活性型のポリペプチドに変換することを見出した。そし
て、この酵素は人為的に増殖させた種々の細胞、とりわ
け、ヒト造血系細胞を用いて製造し得ることを確認して
この発明を完成した。

【０００８】すなわち、この発明は前記第一の課題を、
免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリ
ペプチドの前駆体を活性型のポリペプチドに変換する酵
素により解決するものである。

【０００９】さらに、この発明は前記第二の課題を、斯
かる酵素を産生し得る細胞を培養する工程と、増殖細胞
から酵素を採取する工程を含んでなる酵素の製造方法に
より解決するものである。

【００１０】加えて、この発明は前記第三の課題を、免
疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペ
プチドの前駆体に斯かる酵素を作用させて活性型のポリ
ペプチドに変換するポリペプチドの変換方法により解決
するものである。

【００１１】

【発明の実施の形態】前述のとおり、この発明は、免疫
担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプ
チドの前駆体を活性型のポリペプチドに変換する酵素の
発見に基づくものである。この発明でいう前駆体は、通
常、還元剤存在下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動において分子量約２４，０００ダルトンを示し、
例えば、当該ポリペプチドを本来的に産生する細胞内、
あるいは、当該ポリペプチドをコードする領域を含むＤ
ＮＡ（例えば、配列表における配列番号７に示す塩基配
列のＤＮＡ）を導入することによって形質転換した哺乳
類由来の宿主細胞内に存在する。斯かる前駆体は、通
常、Ｎ末端には配列表における配列番号１に示すアミノ
酸配列の一部又は全部を、また、全体としては、配列表
における配列番号２に示すアミノ酸配列（ただし、符合
「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又
はトレオニンを表すものとする。）の全部、又はそのＮ
末端の一部が欠失したアミノ酸配列を含有し、そのまま
では免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導しな
い。

【００１２】しかしながら、この前駆体にこの発明の酵
素を作用させると、前駆体の配列番号１に示すアミノ酸
配列における第３６番目のアスパラギン酸と第３７番目
のチロシンの間のペプチド結合が切断され、Ｎ末端に配
列表における配列番号３に示すアミノ配列を有する活性
型のポリペプチドに変換され、この活性型のポリペプチ
ドは、単独又は適宜補因子を共存させると、免疫担当細
胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する。活性型のポリ
ペプチドは、通常、全体として、配列表における配列番
号６に示すアミノ酸配列（ただし、符合「Ｘａａ」を付
して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを
表すものとする。）を含有し、還元剤存在下のＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動において分子量１８，
０００乃至１９，５００ダルトンを示す。

【００１３】したがって、この発明でいう酵素とは、そ
れが上述のごときポリペプチドの前駆体に作用し、免疫
担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する活性型の
ポリペプチドを生成するかぎり、天然のものであっても
人工的に創成したものであってもよく、その構造や出所
・由来は問わない。なお、ヒト造血系細胞から得られる
この発明の酵素は、通常、下記の理化学的性質を有す
る。（１）分子量ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分
子量約２５，０００ダルトン及び約１０，０００ダルト
ンを示す。（２）部分アミノ酸配列部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号４
（ただし、符合「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、
アスパラギン又はアスパラギン酸を表すものとする。）
及び／又は配列番号５に示すアミノ酸配列を含有する。（３）活性阻害剤アセチル−Ｌ−チロシル−Ｌ−バリル−Ｌ−アラニル−
Ｌ−アスパルト−１−アール（以下、「Ａｃ−ＹＶＡＤ
−ＣＨＯ」と略記する。）及びヨードアセトアミドによ
り酵素活性が阻害される。

【００１４】斯かる酵素は、細胞を給源とするこの発明
の方法により製造することができる。給源として用いる
細胞に特に制限はなく、当該酵素の産生能と増殖能を有
するかぎり、天然の細胞であっても、天然の細胞をもと
に人工的に創製した細胞株や形質転換細胞であってもよ
い。この発明を実施するうえで特に有用なのは細胞株及
び形質転換細胞であり、前者の細胞株は、例えば、リン
パ芽球、リンパ球、単芽球、単球、骨髄芽球、骨髄球、
顆粒球及びマクロファージを始めとするヒト造血系細
胞、さらには、顎下腺類表皮癌、肺癌、大腸癌及び結腸
癌由来の腫瘍細胞を含む上皮系細胞、神経芽細胞並びに
間質系細胞を培養株化して得られる細胞株が挙げられ
る。個々の細胞株としては、例えば、ジュン・ミノワダ
『キャンサー・レビュー』、第１０巻、１乃至１８頁
（１９８８年）などに記載されている骨髄性白血病、前
骨髄性白血病、単球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、ヘア
リー細胞白血病を含む白血病及びリンパ腫由来のＨＢＬ
−３８細胞、ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−２４
０）、Ｋ−５６２細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−２４３）、
ＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−２４６）、Ｍｏ細胞
（ＡＴＣＣＣＲＬ−８０６６）、ＴＨＰ−１細胞（Ａ
ＴＣＣＴＩＢ−２０２）、Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−１５９３）などの白血病細胞株並びにそれら
の変異株が挙げられ、これらはいずれも増殖容易であ
り、しかも、当該酵素の産生能が高いので、この発明を
実施するうえで有用である。殊に、ＨＢＬ−３８細胞、
ＨＬ−６０細胞、ＫＧ−１細胞、ＴＨＰ−１細胞及びＵ
−９３７細胞を始めとするヒト骨髄単球系細胞株は当該
酵素の産生能が抜きん出て高く、この発明の製造方法を
実施するうえで極めて有用である。

【００１５】後者の形質転換細胞は、上記のごとき細胞
から採取される当該酵素をコードするＤＮＡを哺乳類由
来の適宜宿主細胞に導入することによって得ることがで
きる。宿主細胞としては、例えば、３Ｔ３細胞（ＡＴＣ
ＣＣＣＬ−９２）、Ｃ１２７Ｉ細胞（ＡＴＣＣＣＲ
Ｌ−１６１６）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ
−６１）、ＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−７０）、
ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５０）、Ｈｅ
Ｌａ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−２）、ＭＯＰ−８細胞
（ＡＴＣＣＣＲＬ−１７０９）及びそれらの変異株を
始めとする、斯界において宿主として慣用されるヒト、
サル、マウス及びハムスター由来の上皮系細胞株、間質
系細胞株、神経芽細胞株及び造血系細胞株が用いられ
る。斯かる宿主細胞に当該酵素をコードするＤＮＡを導
入するには、例えば、公知のＤＥＡＥ−デキストラン
法、燐酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リ
ポフェクション法、マイクロインジェクション法、さら
には、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイ
ルス、ワクシニアウイルスなどによるウイルス感染法な
どを用いればよい。形質転換細胞から当該酵素を産生す
るクローンを選択するには、コロニーハイブリダイゼー
ション法を適用するか、形質転換体を培養培地で培養
し、当該酵素の産生が観察されたクローンを選択すれば
よい。なお、哺乳類由来の宿主細胞を用いる組換えＤＮ
Ａ技術については、例えば、黒木登志夫、谷口克、押村
光雄編集、『実験医学別冊細胞工学ハンドブック』、１
９９２年、羊土社発行や横田崇、新井賢一編集、『実験
医学別冊バイオマニュアルシリーズ３遺伝子クローニン
グ実験法』、１９９３年、羊土社発行などにも詳述され
ている。

【００１６】この発明の製造方法は、上述のごとき細胞
を増殖させる工程と、得られる増殖細胞から目的とする
酵素を採取する工程を含んでなる。細胞を増殖させる工
程について言えば、そこで用いる方法に特に制限はな
く、通常一般の生体外又は生体内の方法を適用すればよ
い。生体外の方法とは培養培地を用いて増殖させる方法
をいい、培養培地としては、哺乳類由来の細胞を培養す
るための慣用の培養培地が用いられ、斯かる培養培地
は、通常、緩衝水を基材とし、これにナトリウムイオ
ン、カリウムイオン、カルシウムイオン、燐イオン、塩
素イオンなどの無機イオンと、細胞の代謝能力に応じた
微量元素、炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミンなどを
加え、必要に応じて、さらに血清、ホルモン、細胞成長
因子、細胞接着因子などを含有せしめて構成される。個
々の培養培地としては、例えば、１９９培地、ＤＭＥＭ
培地、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地、ＩＭＤＭ培地、ＭＣＤ
Ｂ１０４培地、ＭＣＤＢ１５３培地、ＭＥＭ培地、ＲＤ
培地、ＲＩＴＣ８０−７培地、ＲＰＭＩ−１６３０培
地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＷＡＪＣ４０４培地など
が挙げられる。斯かる培養培地に細胞を約１×１０⁴ 乃
至１×１０⁷ 個／ｍｌ、望ましくは、約１×１０⁵ 乃至
１×１０⁶ 個／ｍｌ接種し、必要に応じて新鮮な培養培
地と取換えながら、温度３７℃前後で１日乃至１週間、
望ましくは、２乃至４日間浮遊培養又は単層培養する。

【００１７】一方、ヒト以外の温血動物を利用する生体
内の方法により増殖させるには、通常、マウス、ヌード
マウス、ラット、ヌードラット、モルモット、ハムスタ
ーなどの齧歯類の新生児にウサギ由来の抗胸腺抗体など
を注射して免疫反応を減弱させた後、当該酵素の産生能
を有する細胞を動物１匹当り約１×１０⁵ 乃至１×１０
⁸ 個皮下又は腹腔内に注射移植するか、あるいは、これ
ら温血動物の成長個体の体外又は体内に設けられ、動物
の栄養体液が環流可能な拡散チェンバーなどの容器内に
細胞を収容し、その後、通常一般の方法により動物を約
２乃至１０週間飼育する。この飼育の間、移植した細胞
は温血動物の体液を利用しながら増殖する。増殖細胞は
細胞塊、腹水又は細胞浮遊液として採取され、必要に応
じて、これを適宜分散媒中で分散・洗浄した後、目的と
する酵素を採取する。生体内の増殖方法は、生体外の増
殖方法と比較して、より少ないコストと労力で短時間に
所望量の増殖細胞が得られる利点がある。なお、生体内
の増殖方法は、例えば、同じ特許出願人による特公昭５
６−５４１５８号公報などにも詳述されている。

【００１８】増殖細胞から酵素を採取するには、増殖細
胞を一旦分離するか培養上清とともに超音波を印加する
か、低張媒体中に浸漬するなどして破砕し、得られる破
砕物又は破砕物と培養上清との混合物に、例えば、塩
析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、イオン交換クロマト
グラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマ
トグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロ
マトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳
動などの酵素を精製するための斯界における慣用の方法
を適用すればよく、これらは必要に応じて適宜組合せて
適用される。特に、当該酵素に特異的なモノクローナル
抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィー
によるときには、高純度の当該酵素が最小のコストと労
力で得られる。なお、細胞の種類や培養条件によって
は、増殖中、産生した酵素が細胞外に放出されることが
あるが、この場合には、培養上清からも当該酵素を採取
できる。

【００１９】なお、この発明において、当該酵素の活性
は下記の方法により測定し、活性値（単位）で表示して
いる。すなわち、１０％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１
％（ｗ／ｖ）３−［（３−コラミドプロピル）ジメチル
アンモニオ］−１−プロパンスルホネート（以下、「Ｃ
ＨＡＰＳ」と略記する。）及び２ｍＭジチオトレイトー
ルをそれぞれ含む２５ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．５）
を３９５μｌとり、これにＮ−（Ｎ−アセチル−チロシ
ニル）−バリニル−アラニル−アスパラギン酸−７−ア
ミノ−４−メチルクマリンアミドの１０ｍＭジメチルス
ルホキシド溶液５μｌと被検酵素溶液１００μｌをそれ
ぞれ加え、３０℃で１時間反応させる。反応中、反応の
進行に伴って遊離する７−アミノ−４−メチルクマリン
の量を、蛍光光度計により、波長３５５ｎｍで励起して
放出される蛍光の波長４６０ｎｍにおける強度に基づき
経時的にモニターする。当該酵素の１単位とは、斯かる
条件で反応させたときに、１分間に７−アミノ−４−メ
チルクマリンを１ピコモル遊離する酵素の量と定義す
る。

【００２０】この発明は、当該ポリペプチドの前駆体に
斯かる酵素を作用させて活性型のポリペプチドに変換す
る方法を提供するものでもある。その実施態様として
は、例えば、上記の方法により一旦分離した酵素を、当
該ポリペプチドの前駆体に接触させるか、あるいは、当
該酵素をコードするＤＮＡと当該ポリペプチドの前駆体
をコードする領域を含むＤＮＡとを哺乳類由来の適宜宿
主細胞に導入し、そこで両ＤＮＡを共発現させればよ
い。前者の場合には、当該ポリペプチドの前駆体の産生
能を有する細胞、もしくは、形質転換によって、当該ポ
リペプチドの前駆体の産生能を有するに至った細胞を培
養し、その培養物に上記の方法により採取した酵素を共
存せしめるか、あるいは、培養物から細胞を分離するか
分離することなく、必要に応じて、細胞を破砕した後、
培養物又は細胞破砕物に当該酵素を添加すればよい。共
存又は添加する酵素の量としては、通常、前駆体と当モ
ル以下で事足り、また、温度及びｐＨとしては、酵素が
作用し得るレベル、詳細には、温度約４乃至４０℃、望
ましくは、３７℃前後、ｐＨ約６乃至９、望ましくは、
ｐＨ約７乃至８に設定すればよく、原料の前駆体から活
性型のポリペプチドが所望量生成するまで反応させる。
なお、当該酵素をコードするＤＮＡと当該ポリペプチド
の前駆体をコードするＤＮＡとを哺乳類由来の適宜宿主
細胞に導入して得られる形質転換体のように、同一の細
胞が当該ポリペプチドの前駆体と酵素をそれぞれ産生す
る場合には、当然のことながら、必ずしも酵素を添加す
る必要はなく、必要に応じて細胞を破砕した後、酵素が
前駆体に作用して活性型のポリペプチドを生成し得る温
度で細胞又は細胞破砕物を含む培養物をインキュベート
すればよい。

【００２１】斯くして得られた活性型のポリペプチドを
含む培養物はＩＦＮ−γ誘導剤としてそのまま用いられ
ることもあるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、
超音波、細胞溶解酵素及び／又は界面活性剤により細胞
を破砕した後、濾過、遠心分離などにより当該ポリペプ
チドを細胞又は細胞破砕物から分離し、精製する。精製
には細胞又は細胞破砕物を除去した培養物に、例えば、
塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、イオン交換クロマ
トグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロ
マトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性ク
ロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気
泳動などの生理活性ポリペプチドを精製するための斯界
における慣用の方法が用いられ、必要に応じて、これら
は適宜組合せて適用される。そして、最終使用形態に応
じて、精製ポリペプチドを濃縮・凍結乾燥して液状又は
固状にすればよい。なお、同じ特許出願人による特願平
７−５８２４０号明細書（特開平８−２３１５９８号）
に開示されたモノクローナル抗体は当該ポリペプチドの
精製に極めて有用であり、このモノクローナル抗体を用
いるイムノアフィニティークロマトグラフィーによると
きには、高純度の当該ポリペプチドを最小のコストと労
力で得ることができる。

【００２２】前述のとおり、この発明の方法により得ら
れる活性型のポリペプチドは、有用な生理活性蛋白質で
あるＩＦＮ−γの産生を誘導する性質と、キラー細胞の
細胞障害性を増強したり、キラー細胞の生成を誘導する
性質を兼備するので、ＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞
に感受性を有する各種疾患の治療・予防に著効を発揮す
る。さらに、この発明の方法により得られる活性型のポ
リペプチドは強力なＩＦＮ−γ誘導能を有することか
ら、一般に少量で所期のＩＦＮ−γを産生でき、また、
毒性が極めて低いことから、多量投与しても重篤な副作
用を惹起することがない。したがって、この発明の方法
により得られる活性型のポリペプチドは、使用に際して
用量を厳密に管理しなくても、所望のＩＦＮ−γ産生を
迅速に誘導できる利点がある。なお、斯かるポリペプチ
ドの感受性疾患剤としての用途は、同じ特許出願人によ
る特願平８−２８７２２号明細書に詳述されている。

【００２３】以下、実施例に基づきこの発明を説明す
る。

【００２４】

【実施例１】〈酵素の製造〉常法により、生後間もないハムスターの
新生児にウサギ由来の抗胸腺抗血清を腹腔内注射して免
疫反応を減弱させた後、その背部皮下にヒト急性単球性
白血病由来の骨髄単球系細胞株の一種であるＴＨＰ−１
細胞（ＡＴＣＣＴＩＢ−２０２）を約５×１０⁵ 個／
匹注射移植し、通常一般の方法で３週間飼育した。皮下
に生じた腫瘍塊（約１５ｇ／匹）を摘出し、常法により
血清無含有のＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．４）に
より分散させ、洗浄して増殖細胞を得た。

【００２５】この増殖細胞を１０ｍＭ塩化カリウム、
１．５ｍＭ塩化マグネシウム及び０．１ｍＭエチレンジ
アミン四酢酸二ナトリウムをそれぞれ含む１０倍容の氷
冷した２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）により洗浄
し、３倍容の新鮮な同一緩衝液中、氷冷下で２０分間静
置した後、−２０℃で凍結した。凍結物を解凍し、プロ
テアーゼ阻害剤として１ｍＭフェニルメチルスルホニル
フルオライド、１μｇ／ｍｌロイペプチン及び１０μｇ
／ｍｌペプスタチンＡをそれぞれ加えた後、テフロンホ
モジナイザーにより破砕し、破砕物を２，０００×ｇで
１０分間遠心分離し、上清を採取する一方、沈澱部を上
記と同様に再度処理し、遠心分離して新たに得られた上
清を上記上清と合一した。この上清にエチレンジアミン
四酢酸二ナトリウムを６ｍＭになるように加え、２４，
０００×ｇで２０分間遠心分離して細胞膜片を除去した
後、１００，０００×ｇでさらに６０分間遠心分離して
ミクロソーム画分とサイトゾル画分に分離し、サイトゾ
ル画分を採取した。

【００２６】このサイトゾル画分に氷冷下で硫酸アンモ
ニウムを４０％飽和になるように加え、撹拌した後、遠
心分離して上清を採取した。この上清に硫酸アンモニウ
ムを８０％飽和になるようにさらに加え、撹拌した後、
遠心分離して沈澱部を採取した。この沈澱を５％（ｖ／
ｖ）グリセロール、０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ及び
２ｍＭジチオトレイトールをそれぞれ含む２０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解し、新鮮な同一緩
衝液に対して４℃で１６時間透析し、透析内液を遠心分
離して上清を採取し、膜濾過した後、新鮮な同一緩衝液
により平衡化しておいた東ソー製イオン交換クロマトグ
ラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ５ＰＷ』のカラムに負荷し
た。そして、０Ｍから０．５Ｍまで上昇する塩化ナトリ
ウムの濃度勾配下、カラムに新鮮な同一緩衝液を通液
し、塩化ナトリウム濃度が４０乃至９０ｍＭで溶出した
画分を採取し、合一した。

【００２７】この画分を５％（ｖ／ｖ）グリセロール、
０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ及び２ｍＭジチオトレイ
トールをそれぞれ含む２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．
４）により１．５倍に希釈した後、希塩酸によりｐＨ
７．４に調整した。次いで、新鮮な同一緩衝液により平
衡化しておいたファルマシア製イオン交換クロマトグラ
フィー用ゲル『Ｓ−セファロース』のカラムに負荷し、
カラムを新鮮な同一緩衝液により洗浄した後、０Ｍから
０．５Ｍまで上昇する塩化カリウムの濃度勾配下、カラ
ムに新鮮な同一の緩衝液を通液し、塩化カリウム濃度が
１０乃至１００ｍＭ付近で溶出した画分を採取した。

【００２８】採取した画分を合一し、５％（ｖ／ｖ）グ
リセロール、０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ及び２ｍＭ
ジチオトレイトールをそれぞれ含む２０ｍＭヘペス緩衝
液（ｐＨ７．４）に対して１６時間透析した後、新鮮な
同一緩衝液により平衡化しておいたファルマシア製イオ
ン交換クロマトグラフィー用カラム『モノＳ』に負荷
し、０．５Ｍ塩化カリウムを含む新鮮な同一緩衝液を通
液した。

【００２９】『モノＳ』カラムからの溶出画分から酵素
活性ある画分を採取し、合一し、濃縮した後、５％（ｖ
／ｖ）グリセロール、０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ及
び２ｍＭジチオトレイトールをそれぞれ含む２０ｍＭヘ
ペス緩衝液（ｐＨ７．４）により平衡化しておいたファ
ルマシア製ゲル濾過クロマトグラフィー用カラム『スー
パーデックス２００』に負荷し、新鮮な同一緩衝液を通
液し、溶出画分から酵素活性ある画分を採取し、合一
し、濃縮したところ、当該酵素を約９，０００単位／ｍ
ｌ含む溶液が約１ｍｌ得られた。収量は、ハムスター１
匹当り約４５単位であった。

【００３０】

【実施例２】〈酵素の分子量〉ファルマシア製ゲル濾過クロマトグラ
フィーカラム『スーパーデックス７５ＨＲ』（ゲル用量
２４ｍｌ）を燐酸緩衝食塩水（以下、「ＰＢＳ」と略記
する。）により平衡化した後、実施例１の方法により得
た酵素溶液を２００μｌ負荷し、溶出液の酵素活性をモ
ニターしながら、カラムに新鮮なＰＢＳを０．５ｍｌ／
分の流速で通液した。つぎに、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー用分子量マーカーとして、ウシ血清アルブミン（６
７，０００ダルトン）、オボアルブミン（４３，０００
ダルトン）、キモトリプシノーゲンＡ（２５，０００ダ
ルトン）及びリボヌクレアーゼＡ（１３，７００ダルト
ン）の適量をそれぞれＰＢＳに溶解した後、酵素活性の
測定に代えて、溶出液の蛋白質濃度を波長２８０ｎｍに
おける吸光度によりモニターした以外は、酵素溶液の場
合と同様に処置した。得られたクロマトグラムにおける
酵素及び各分子量マーカーの溶出位置に基づき計算した
ところ、ゲル濾過クロマトグラフィーによるこの発明の
酵素の分子量は約３０，０００ダルトンであった。

【００３１】さらに、上記で得られたこの発明の酵素を
含む『スーパーデックス７５ＨＲ』の溶出画分を濃縮
した後、ユー・ケー・レムリが『ネイチャー』、第２２
７巻、６８０乃至６８５頁（１９７０年）に報告してい
る方法に準じ、還元剤としての２％（ｗ／ｖ）ジチオト
レイトール存在下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動した。サンタ・クルーズ製抗ヒトＩＣＥ−ｐ２０
抗体及び抗ヒトＩＣＥ−ｐ１０抗体を用い、常法にした
がってゲルを免疫染色した後、アマシャム製発色キット
『ＥＣＬｋｉｔ』により発色させたところ、分子量約
２５，０００ダルトン及び約１０，０００ダルトンに相
当する位置に蛋白質の単一バンドがそれぞれ観察され
た。なお、このとき用いた分子量マーカーは、ウシ血清
アルブミン（６７，０００ダルトン）、オボアルブミン
（４５，０００ダルトン）、カーボニックアンヒドロラ
ーゼ（３０，０００ダルトン）、大豆トリプシンインヒ
ビター（２０，１００ダルトン）及びα−ラクトアルブ
ミン（１４，４００ダルトン）であった。

【００３２】

【実施例３】〈酵素の部分アミノ酸配列〉実施例１の方法により得た
この発明の酵素を含む溶液を５％（ｖ／ｖ）グリセロー
ル及び２ｍＭジチオトレイトールをそれぞれ含む２０ｍ
Ｍヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析した後、遠
心濃縮機により濃縮した。常法にしたがって、濃縮物を
還元剤としての２％（ｗ／ｖ）ジチオトレイトール存在
下、ゲル濃度１５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により分離し、二弗化ポリビニル膜
に転写し、クーマシーブリリアントブルーにより染色し
た後、分子量約２５，０００ダルトン及び約１０，００
０ダルトンに相当するバンドを切出した。

【００３３】常法にしたがって、切出したゲルから蛋白
質成分をそれぞれ抽出し、パーキン・エルマー製プロテ
イン・シーケンサー『４７３Ａ型』を用いてＮ末端付近
のアミノ酸配列を調べたところ、分子量約２５，０００
ダルトンのバンドから抽出した成分は、部分アミノ酸配
列として、Ｎ末端に配列表における配列番号４（ただ
し、符合「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、アスパ
ラギン又はアスパラギン酸を表すものとする。）に示す
アミノ酸配列を、一方、分子量約１０，０００ダルトン
のバンドから抽出した成分は、Ｎ末端に配列表における
配列番号５に示すアミノ酸配列を含有することが判明し
た。このことは、この発明の酵素が、分子量の相違する
２種類のサブユニットを含んでなることを示している。

【００３４】

【実施例４】〈酵素作用〉

【００３５】

【実施例４−１】〈前駆体の調製〉０．５ｍｌ容反応管に１０×ＰＣＲ緩
衝液を１０μｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰを１μｌ、５単
位／μｌＴａｑＤＮＡポリメラーゼを０．５μｌ、
そして、同じ特許出願人が特願平７−２６２０６２号明
細書（特開平８−１９３０９８号）に開示した組換えＤ
ＮＡ『ｐＨＩＧＩＦ』を１ｎｇとり、センスプライマー
及びアンチセンスプライマーとして、配列表における配
列番号７に示した当該ポリペプチドをコードする領域を
含むｃＤＮＡの塩基配列に基づき化学合成した５´−Ａ
ＡＧＧＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧ
ＴＣＡＧＣＡＡＧＧ−３´及び５´−ＡＣＡＧＣＣＡＧ
ＴＧＴＧＡＴＧＧＣＴＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＴＧＡＡ
ＣＡＧ−３´で表される塩基配列のオリゴヌクレオチド
をそれぞれ２０ピコモル加え、滅菌蒸留水で１００μｌ
とした。常法により、この混液を９４℃で１分間、６０
℃で１分間、７２℃で１分間反応させるサイクルを３０
回繰返してＰＣＲ反応させた。なお、ＰＣＲ反応試薬と
しては、宝酒造製『タカラＰＣＲアンプリフィケーショ
ンキット』を用いた。

【００３６】得られた反応物を常法にしたがって制限酵
素ＢｓｔＸＩにより切断し、得られた約８００塩基対
のＤＮＡ断片を０．１μｇとり、これを適量の滅菌蒸留
水に溶解し、あらかじめ制限酵素ＢｓｔＸＩにより切
断しておいたインビトロジェン製プラスミドベクター
『ｐＲｃ／ＣＭＶ』を１０ｎｇと適量の１０×ライゲー
ション緩衝液及びＴ４ＤＮＡリガーゼをそれぞれ加
え、さらに１０ｍＭＡＴＰを最終濃度１ｍＭまで加え
た後、１６℃で１８時間反応させてＤＮＡ断片をプラス
ミドベクター『ｐＲｃ／ＣＭＶ』に挿入した。得られた
組換えＤＮＡをコンピテントセル法により大腸菌ＪＭ１
０９株に導入して形質転換体とし、これをアンピシリン
を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に
接種し、３７℃で１８時間培養した後、培養物から菌体
を採取し、アルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽
出した。この組換えＤＮＡを『ｐＲＣＨｕＧＦ』と命名
する一方、その塩基配列をジデオキシ法により調べたと
ころ、図１に示す構造を有していた。図１に見られるよ
うに、この組換えＤＮＡ『ｐＲＣＨｕＧＦ』において
は、当該ポリペプチドの前駆体をコードする、配列表に
おける配列番号７に示す塩基配列を含有するｃＤＮＡ
『ＨｕＩＧＩＦ』が、サイトメガロウイルス・プロモー
ター『ＰＣＭＶ』の下流に連結されていた。

【００３７】別途、常法にしたがって、チャイニーズハ
ムスター卵巣由来のＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣＣＣ
Ｌ−６１）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足した
Ｈａｍ’ｓＦ１２培地（ｐＨ７．２）に接種し、増殖
させた。増殖細胞を採取し、ＰＢＳにより洗浄した後、
細胞密度１×１０⁷ 個／ｍｌになるようにＰＢＳに浮遊
させ、その浮遊液の０．８ｍｌを組換えＤＮＡ『ｐＲＣ
ＨｕＧＦ』１０μｇとともにキュベットにとり、１０分
間氷冷した後、バイオラッド製エレクトロポレーション
装置『ジーンパルサー』に装着し、放電パルスを１回印
加した後、直ちにキュベットを取外し、１０分間氷冷し
た。次いで、細胞浮遊液をキュベットから取出し、１０
％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＨａｍ’ｓＦ１
２培地（ｐＨ７．２）に接種し、５％ＣＯ₂ インキュベ
ーター中、３７℃で３日間培養した後、培養培地にＧ４
１８を最終濃度４００μｇ／ｍｌになるように加え、同
じ条件でさらに３日間培養した。斯くして得られた１０
０個余りのコロニーから４８個を選別し、その一部をＧ
４１８を４００μｇ／ｍｌ含み、１０％（ｖ／ｖ）ウシ
胎児血清を補足したＨａｍ’ｓＦ１２培地（ｐＨ７．
２）を分注した培養プレートに接種し、上記と同様にし
て１週間培養した。その後、培養プレートの各ウェルに
５．１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５％（ｗ／ｖ）デオ
キシコール酸、１％（ｗ／ｖ）ノニデットＰ−４０、１
０μｇ／ｍｌアプロチニン及び０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤ
Ｓをそれぞれ含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．５）を適量加えて細胞を溶解した。

【００３８】細胞溶解物をそれぞれ５０μｌとり、グリ
セロール５０μｌとジチオトレイトールを最終濃度２％
（ｗ／ｖ）になるようにそれぞれ加え、３７℃で１時間
静置した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法により、細胞溶解物中のポリペプチドを分離した。次
いで、常法にしたがって、ゲル内で分離されたポリペプ
チドをニトロセルロース膜に転写し、別途調製しておい
た、同じ特許出願人が特願平７−５８２４０号明細書
（特開平８−２３１５９８号）に開示した当該ポリペプ
チドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマＨ−１株の培養上清に１時間浸漬した後、０．０
５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む２０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄して過剰のモノクローナ
ル抗体を除去した。その後、ニトロセルロース膜を西洋
ワサビ由来のパーオキシダーゼで標識したウサギ由来の
抗マウスイムノグロブリン抗体を含むＰＢＳに１時間浸
漬し、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含む５０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）により洗浄し、
０．００５％（ｖ／ｖ）過酸化水素及び０．３ｍｇ／ｍ
ｌジアミノベンジジンをそれぞれ含む５０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に浸漬して発色させた。その
発色度に基づき、当該ポリペプチドの前駆体の産生能が
高い形質転換体のクローンを選別し、これを『ＲＣＨｕ
ＧＦ』と命名した。

【００３９】この形質転換体『ＲＣＨｕＧＦ』を４００
μｇ／ｍｌＧ４１８を含み、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎
児血清を補足したＨａｍ’ｓＦ１２培地（ｐＨ７．
２）を分注した角形培養瓶に接種し、培養培地を適宜新
鮮なものと取換えながら、５％ＣＯ₂ インキュベーター
中、３７℃で１週間培養した。その後、培養瓶にギブコ
製トリプシン剤『トリプシン−ＥＤＴＡ』を適量加えて
培養瓶内壁に付着した細胞を剥離し、ＰＢＳで洗浄した
後、さらに１０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグ
ネシウム及び０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナト
リウム塩をそれぞれ含む氷冷した２０ｍＭヘペス緩衝液
（ｐＨ７．４）により洗浄し、３倍容の新鮮な同一緩衝
液中、氷冷下で２０分間静置した。その後、常法にした
がって細胞を破砕し、１０，０００×ｇで３０分間遠心
分離し、当該ポリペプチドの前駆体を含む上清部を採取
した。この前駆体は、還元剤存在下のＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動において分子量約２４，０００
ダルトンを示し、Ｎ末端に配列表における配列番号１に
示すアミノ酸配列を有している。

【００４０】

【実施例４−２】〈前駆体の変換〉１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．
１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ及び２ｍＭジチオトレイトー
ルをそれぞれ含む１００ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．
４）に実施例４−１の方法により得た当該ポリペプチド
の前駆体を５００ｎＭになるように溶解して基質溶液と
した。この基質溶液に実施例１の方法により得た酵素を
３５０単位／ｍｌ加え、３７℃でインキュベートした。
インキュベート開始から０分後、１０分後、３０分後、
１時間後、３時間後、６時間後及び１８時間後に反応物
の一部をそれぞれ採取し、ヨードアセトアミドを最終濃
度２００μｇ／ｍｌになるように加えて反応を停止させ
た。採取した反応物に同じ特許出願人が特願平７−５８
２４０号明細書（特開平８−２３１５９８号）に開示し
たモノクローナル抗体を用いるウェスタン・ブロッティ
ング法を適用し、当該ポリペプチドの前駆体が活性型の
ポリペプチドに変換される経時変化を調べた。

【００４１】同時に、ヒト急性骨髄性白血病由来の骨髄
単球系細胞株の一種であるＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣＣ
ＣＬ−２４６）を用いるバイオアッセイ法により、経時
的に採取した反応物における活性型のポリペプチドの含
有量を推定した。すなわち、ＫＧ−１細胞を１０％（ｖ
／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地
（ｐＨ７．４）に細胞密度１．５×１０⁶ 個／ｍｌにな
るように浮遊させ、９６ウェルマイクロプレートに０．
１ｍｌ／ウェルずつ分注した。採取した反応物を１０％
（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０
培地（ｐＨ７．４）により適宜希釈した後、これを上記
マイクロプレートに０．１ｍｌ／ウェルずつ分注し、５
％ＣＯ₂ インキュベーター中、３７℃で２４時間培養し
た。培養後、各ウェルから培養上清を０．１ｍｌずつ採
取し、通常の酵素免疫測定法によりＩＦＮ−γ含量を測
定した。結果を表１に示す。なお、表１に示すＩＦＮ−
γ含量は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から入手した
ＩＦＮ−γ標準品（Ｇｇ２３−９０１−５３０）に基づ
き国際単位（ＩＵ）に換算している。

【００４２】

【表１】

【００４３】図２のウェスタン・ブロッティングに見ら
れるように、本例の反応条件下においては、前駆体に相
当する分子量約２４，０００ダルトンのバンドが反応開
始から３時間までに漸次消滅し、それに伴って、活性型
のポリペプチドに相当する分子量１８，２００ダルトン
のバンドが出現した。表１のＩＦＮ−γ含量もこの結果
とよく符合しており、分子量１８，２００ダルトンのバ
ンドの出現に伴って反応物のＩＦＮ−γ誘導能が漸次上
昇した。これらの結果は、この発明の酵素が当該ポリペ
プチドの前駆体に作用し、免疫担当細胞においてＩＦＮ
−γの産生を誘導する活性型のポリペプチドに変換した
ことを示している。

【００４４】

【実施例４−３】〈活性型ポリペプチドの理化学的性質〉

【００４５】

【実施例４−３（ａ）】〈活性型ポリペプチドの精製〉実施例４−２の方法によ
り１８時間反応させて得た反応物を１０ｍＭ燐酸緩衝液
（ｐＨ６．８）に対して透析した後、１０ｍＭ燐酸緩衝
液（ｐＨ６．８）で平衡化しておいた東ソー製イオン交
換クロマトグラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ５ＰＷ』のカ
ラムに負荷し、０Ｍから０．５Ｍまで直線的に上昇する
塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩
衝液（ｐＨ６．８）を通液し、塩化ナトリウム濃度が
０．２乃至０．３Ｍ付近で溶出した画分を採取した。

【００４６】この新たに得られた画分を合一し、ＰＢＳ
に対して透析する一方、同じ特許出願人による特願平７
−５８２４０号明細書（特開平８−２３１５９８号）に
記載された方法にしたがってモノクローナル抗体を用い
るイムノアフィニティークロマトグラフィー用ゲルを調
製し、これをプラスチック製円筒管内部にカラム状に充
填し、ＰＢＳで洗浄した後、上記透析内液をカラムに負
荷した。カラムに１００ｍＭグリシン−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ２．５）を通液し、得られる溶出画分から免疫担当細
胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する活性型のポリペ
プチドを含む画分を採取し、滅菌蒸留水に対して透析
し、膜濾過により濃縮した後、凍結乾燥して精製された
活性型ポリペプチドの固状物を得た。

【００４７】

【実施例４−３（ｂ）】〈ポリペプチドの分子量〉実施例４−３（ａ）の方法に
より得た精製ポリペプチドをユー・ケー・レムリが『ネ
イチャー』、第２２７巻、６８０乃至６８５頁（１９７
０年）に報告している方法に準じ、還元剤としての２％
（ｗ／ｖ）ジチオトレイトール存在下でＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動したところ、分子量約１８，
０００乃至１９，５００ダルトンに相当する位置にＩＦ
Ｎ−γ誘導能あるポリペプチドの主バンドが観察され
た。このことは、この発明の酵素が分子量約２４，００
０ダルトンの当該ポリペプチドの前駆体に作用し、これ
をより低分子量の活性型のポリペプチドに変換したこと
を示している。なお、このときの分子量マーカーは、ウ
シ血清アルブミン（６７，０００ダルトン）、オボアル
ブミン（４５，０００ダルトン）、カーボニックアンヒ
ドロラーゼ（３０，０００ダルトン）、大豆トリプシン
インヒビター（２０，１００ダルトン）及びα−ラクト
アルブミン（１４，４００ダルトン）であった。

【００４８】

【実施例４−３（ｃ）】〈ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列〉パーキン・エル
マー製プロテイン・シーケンサー『４７３Ａ型』を使用
し、常法にしたがって分析したところ、実施例４−３
（ａ）の方法により得た活性型のポリペプチドはＮ末端
に配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を含有
していた。このことは、この発明の酵素が当該ポリペプ
チドの前駆体に作用し、そのＮ末端アミノ酸配列である
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列における第３６
番目のアスパラギン酸と第３７番目のチロシンの間のペ
プチド結合を切断したことを示している。

【００４９】

【実施例５】〈酵素に対する活性阻害剤〉実施例４−２に記載した前
駆体の変換方法において、実施例１の方法により得たこ
の発明の酵素とともに５μＭＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ
及び６５０μＭヨードアセトアミドのいずれかを加え、
３７℃で３時間反応させた。各反応物を還元剤としての
２％（ｗ／ｖ）ジチオトレイトールの存在下、ゲル濃度
１５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分離した後、同じ特許出願人が特願平７−
５８２４０号明細書（特開平８−２３１５９８号）に開
示したモノクローナル抗体を用いるウェスタン・ブロッ
ティング法を適用したところ、いずれの反応物において
も、活性型のポリペプチドに相当するバンドがゲル上に
観察されなかった。このことは、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨ
Ｏ及びヨードアセトアミドがこの発明の酵素に対する活
性阻害剤として作用することを示している。

【００５０】

【実施例６】〈酵素の製造〉孔径０．５ミクロンのメンブランフィル
ターを取付けた内容量約１０ｍｌのプラスチック製円筒
型拡散チェンバー内にＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ
７．４）によりヒト組織球性リンパ腫由来の骨髄単球系
細胞株の一種であるＵ−９３７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ
−１５９３）を浮遊させ、成長ラットの腹腔内に埋設し
た。この状態でラットを通常一般の方法で４週間飼育し
た後、拡散チェンバーを取出した。拡散チェンバーから
増殖細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、実施例１と同
様にして破砕し、破砕物を精製したところ、当該酵素が
ラット１匹当り約５単位の収量で得られた。

【００５１】斯くして得られた酵素の理化学的性質を実
施例２乃至５の方法により調べたところ、実施例１の酵
素と同様の酵素作用、分子量及び部分アミノ酸配列をそ
れぞれ有し、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ及びヨードアセト
アミドにより酵素活性が阻害された。

【００５２】

【実施例７】〈酵素の製造〉ヒト急性前骨髄性白血病由来の骨髄単球
系細胞の一種であるＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ
−２４０）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足した
ＲＰＭＩ−１６４０培地（ｐＨ７．２）に細胞密度約３
×１０⁵ 個／ｍｌになるように浮遊させ、培養培地を新
鮮なものと取換えながら、５％ＣＯ₂ インキュベーター
中、３７℃で３週間培養した。培養物から増殖細胞を分
離し、ＰＢＳで洗浄した後、実施例１と同様にして破砕
し、破砕物を精製したところ、当該酵素が培養物１ｌ当
り約３０単位の収量で得られた。

【００５３】斯くして得られた酵素の理化学的性質を実
施例２乃至５の方法により調べたところ、実施例１の酵
素と同様の酵素作用、分子量及び部分アミノ酸配列をそ
れぞれ有し、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ及びヨードアセト
アミドにより酵素活性が阻害された。

【００５４】

【発明の効果】以上説明したごとく、この発明は、免疫
担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導するポリペプ
チドの前駆体を活性型のポリペプチドに変換する酵素の
発見に基づくものである。この発明の酵素は斯かる作用
を具備するので、これを当該ポリペプチドを本来産生す
る細胞や当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを導入す
ることによって形質転換した哺乳類由来の宿主細胞が産
生する当該ポリペプチドの前駆体に作用させるか、当該
酵素をコードするＤＮＡを当該ポリペプチドをコードす
るＤＮＡとともに哺乳類由来の宿主細胞に導入し、両Ｄ
ＮＡを同一の細胞内で共発現させることにより、ヒト細
胞におけると同様のプロセッシングを受けた活性型のポ
リペプチドが得られることとなる。斯かる酵素は、給源
として細胞を用いるこの発明の方法により、所望量製造
することができる。

【００５５】この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する
発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な、意義のあ
る発明であると言える。

【００５６】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：41 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：N末端フラグメント配列 Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met Lys 1 5 10 15 Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn Leu Glu 20 25 30 Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu 35 40

【００５７】配列番号：2 配列の長さ：193 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチド配列 Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met -35 -30 -25 Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn -20 -15 -10 -5 Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile 1 5 10 Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro 15 20 25 Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg 30 35 40 Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met 45 50 55 60 Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Xaa Leu Ser Cys 65 70 75 Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile 80 85 90 Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly 95 100 105 His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe 110 115 120 Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys 125 130 135 140 Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu 145 150 155 Asp

【００５８】配列番号：3 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：N末端フラグメント

【００５９】配列番号：4 配列の長さ：19 トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：N末端フラグメント配列 Xaa Pro Ala Met Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Gly Asn Val Lys Leu 1 5 10 15 Cys Ser Leu

【００６０】配列番号：5 配列の長さ：14 トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：N末端フラグメント配列 Ala Ile Lys Lys Ala His Ile Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe 1 5 10

【００６１】配列番号：6 配列の長さ：157 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチド配列 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Xaa Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155

【００６２】配列番号：7 配列の長さ：579 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列の特徴特徴を表す記号：leader peptide 存在位置：1..108 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：109..579 特徴を決定した方法：S 配列 ATG GCT GCT GAA CCA GTA GAA GAC AAT TGC ATC AAC TTT GTG GCA ATG 48 Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met -35 -30 -25 AAA TTT ATT GAC AAT ACG CTT TAC TTT ATA GCT GAA GAT GAT GAA AAC 96 Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn -20 -15 -10 -5 CTG GAA TCA GAT TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA 144 Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile 1 5 10 AGA AAT TTG AAT GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGG CCT 192 Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro 15 20 25 CTA TTT GAA GAT ATG ACT GAT TCT GAC TGT AGA GAT AAT GCA CCC CGG 240 Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg 30 35 40 ACC ATA TTT ATT ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGC CAG CCT AGA GGT ATG 288 Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met 45 50 55 60 GCT GTA ACT ATC TCT GTG AAG TGT GAG AAA ATT TCA AYT CTC TCC TGT 336 Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Xaa Leu Ser Cys 65 70 75 GAG AAC AAA ATT ATT TCC TTT AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC 384 Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile 80 85 90 AAG GAT ACA AAA AGT GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA 432 Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly 95 100 105 CAT GAT AAT AAG ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT 480 His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe 110 115 120 CTA GCT TGT GAA AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAA AAA 528 Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys 125 130 135 140 GAG GAT GAA TTG GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTT CAA AAC GAA 576 Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu 145 150 155 GAC 579 Asp

【図面の簡単な説明】

【図１】当該ポリペプチドの前駆体をコードするｃＤＮ
Ａを含む組換えＤＮＡ『ｐＲＣＨｕＧＦ』の構造を示す
図である。

【図２】ウェスタン・ブロッティング法により可視化し
た、当該ポリペプチドの前駆体から活性型のポリペプチ
ドが生成する経時変化を示すゲル電気泳動像をディスプ
レー上に表示した中間調画像である。

【符合の説明】

ＰＣＭＶサイトメガロウイルス・プロモーターＨｕＩＧＩＦ当該ポリペプチドの前駆体をコードす
るｃＤＮＡ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】免疫担当細胞においてインターフェロン
−γの産生を誘導するポリペプチドの前駆体を活性型の
ポリペプチドに変換する酵素。
【請求項２】Ｎ末端に配列表における配列番号１に示
すアミノ酸配列の一部又は全部を含有する前駆体の、配
列番号１に示すアミノ酸配列における第３６番目のアス
パラギン酸と第３７番目のチロシンの間のペプチド結合
を切断する請求項１に記載の酵素。
【請求項３】配列表における配列番号２に示すアミノ
酸配列（ただし、符合「Ｘａａ」を付して示したアミノ
酸は、イソロイシン又はトレオニンを表すものとす
る。）を含有する前駆体に作用して、その前駆体をＮ末
端に配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を含
有する活性型のポリペプチドに変換する請求項１又は２
に記載の酵素。
【請求項４】下記の理化学的性質を性質を有する請求
項１、２又は３に記載の酵素。（１）分子量ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分
子量約２５，０００ダルトン及び約１０，０００ダルト
ンを示す。（２）部分アミノ酸配列部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号４
（ただし、符合「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、
アスパラギン又はアスパラギン酸を表すものとする。）
及び／又は配列番号５に示すアミノ酸配列を含有する。（３）活性阻害剤アセチル−Ｌ−チロシル−Ｌ−バリル−Ｌ−アラニル−
Ｌ−アスパルト−１−アール及びヨードアセトアミドに
より酵素活性が阻害される。
【請求項５】ヒト造血系細胞から得ることのできる請
求項１、２、３又は４に記載の酵素。
【請求項６】免疫担当細胞においてインターフェロン
−γの産生を誘導するポリペプチドの前駆体を活性型の
ポリペプチドに変換する酵素としての下記の理化学的性
質を有する蛋白質。（１）作用Ｎ末端に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列
の一部又は全部を含有する前駆体の、配列番号１に示す
アミノ酸配列における第３６番目のアスパラギン酸と第
３７番目のチロシンの間のペプチド結合を切断する。（２）分子量ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において、分
子量約２５，０００ダルトン及び約１０，０００ダルト
ンを示す。（３）部分アミノ酸配列部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号４
（ただし、符合「Ｘａａ」を付して示したアミノ酸は、
アスパラギン又はアスパラギン酸を表すものとする。）
及び／又は配列番号５に示すアミノ酸配列を含有する。（４）活性阻害剤アセチル−Ｌ−チロシル−Ｌ−バリル−Ｌ−アラニル−
Ｌ−アスパルト−１−アール及びヨードアセトアミドに
より酵素活性が阻害される。（５）産生細胞ヒト造血系細胞から得ることができる。
【請求項７】請求項１乃至６に記載の酵素又は蛋白質
を産生し得る細胞を増殖させる工程と、増殖細胞から酵
素を採取する工程を含んでなる請求項１乃至６に記載の
酵素又は蛋白質の製造方法。
【請求項８】細胞がヒト造血系細胞である請求項７に
記載の酵素又は蛋白質の製造方法。
【請求項９】細胞をヒト以外の温血動物に移植し、そ
の温血動物の体液を利用しながら増殖させる請求項７又
は８に記載の酵素又は蛋白質の製造方法。
【請求項１０】温血動物が齧歯類である請求項９に記載
の酵素又は蛋白質の製造方法。
【請求項１１】酵素又は蛋白質を塩析、透析、濾過、濃
縮、分別沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾
過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電
点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆
相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、ゲル電気泳動及び／又は等電点電気泳動により採
取する請求項７、８、９又は１０に記載の酵素又は蛋白
質の製造方法。
【請求項１２】免疫担当細胞においてインターフェロン
−γの産生を誘導するポリペプチドの前駆体に請求項１
乃至６に記載の酵素又は蛋白質を作用させて活性型のポ
リペプチドに変換するポリペプチドの変換方法。
【請求項１３】前駆体がＮ末端に配列表における配列番
号１に示すアミノ酸配列の一部又は全部を含有し、酵素
又は蛋白質がそのアミノ酸配列における第３６番目のア
スパラギン酸と第３７番目のチロシンの間のペプチド結
合を切断する請求項１２に記載のポリペプチドの変換方
法。
【請求項１４】前駆体が配列表における配列番号２に示
すアミノ酸配列（ただし、符合「Ｘａａ」を付して示し
たアミノ酸は、イソロイシン又はトレオニンを表すもの
とする。）を含有する請求項１２又は１３に記載のポリ
ペプチドの変換方法。
【請求項１５】活性型のポリペプチドがＮ末端に配列表
における配列番号３に示すアミノ酸配列を含有する請求
項１２、１３又は１４に記載のポリペプチドの変換方
法。
【請求項１６】活性型のポリペプチドが配列表における
配列番号６に示すアミノ酸配列（ただし、符合「Ｘａ
ａ」を付して示したアミノ酸は、イソロイシン又はトレ
オニンを表すものとする。）を含有する請求項１２、１
３、１４又は１５に記載のポリペプチドの変換方法。