JP2004523204A - 生理的に活性なｉｌ−１８ポリペプチドの調製方法 - Google Patents

Abstract

生理的に活性なポリペプチドを製造するための、ポリペプチド前駆体を活性化酵素と接触させること、またはポリペプチドを活性化プロテアーゼと共発現させることを含む方法。

Description

【０００１】
（発明の背景）
本発明は、生理的に活性なポリペプチドを製造するための方法、より詳細には、活性ヒトＩＬ−１８を製造するための方法に関する。
インターフェロン−γ−誘導因子としても知られるＩＬ−１８は、近年見出された新規なサイトカインである。活性ＩＬ−１８は１５７のアミノ酸残基を含む。これは、Ｔ細胞および脾臓細胞によるインターフェロン−γ−産生の誘導、ＮＫ細胞の殺滅活性の増大、および未熟型ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１細胞への分化の促進を含む強い生物活性を有する。加えて、ヒトＩＬ−１８はＧＭ−ＣＳＦの産生を増し、そしてＩＬ−１０の産生を減らす。ＩＬＬ−１８はＩＬ−１２よりも大きなインターフェロン−γ誘導能力を有することが示されており、そして異なるレセプター経由でシグナル伝達し、および別個のシグナル伝達経路を利用する。
【０００２】
ＩＬ−１８、コードしているヌクレオチド配列、および精製タンパク質の一定の物理化学化学特性が公知である（Ｕｓｈｉｏ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １５６， ４２７４−４２７９； Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ， Ｃ．Ａ．， ｅｔ ａｌ． １９９８， Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９８， ６３， ６５８−６６４）。
株式会社ハヤシバラ生物化薬研究所の（「ハヤシバラ」）、１９９６年１月１７日に公開された、欧州特許第０６９２５３６号に対応する米国特許第５，１９２，３２４号は、免疫反応細胞によるＩＦＮ−ガンマの産生を誘導するマウスタンパク質、このタンパク質は一定の物理化学的特性および限定された部分アミノ酸配列を有するとしてさらに特徴づけられている、を開示する。さらに、１５７のアミノ酸配列、その２つのフラグメント、該タンパク質をコードしているＤＮＡ（４７１ｂｐ）、ハイブリドーマ、タンパク質精製法および該タンパク質を検出する方法も開示されている。
【０００３】
１９９６年５月２２日に公開された、欧州特許第０７１２９３１号に対応するハヤシバラの米国特許第６，２１４，５８４号は、１５７アミノ酸のヒトタンパク質およびその相同物、該タンパク質をコードしているＤＮＡ、形質転換体、該タンパク質の調製法、該タンパク質に対するモノクローナル抗体、ハイブリドーマ、タンパク質精製法、該タンパク質を検出する方法、および悪性腫瘍、ウィルス性疾患、細菌感染症、および免疫疾患の治療および／または予防法を開示する。
【０００４】
１９９７年７月１０日に公開されたＩｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．の国際公開第９７／２４４４１号パンフレットは、ＩＬ−１８前駆体に対応する１９３アミノ酸のタンパク質およびコードしているＤＮＡを開示する。
ヒトの細胞では、遺伝子の発現により形成されたポリペプチドは、細胞内酵素により処理されて、部分消化され、および糖鎖を付加され得る。医薬に満足に組み込まれるポリペプチドは、ヒトの細胞中同様に加工されたものであってよい。ほとんどのサイトカインは、通常、生物活性のない前駆体として製造され、次いで細胞内酵素により加工されて活性ポリペプチドに変換されることが知られている。
【０００５】
ＩＬ−１８ポリペプチドは通常、ヒトの細胞中に、１９３のアミノ酸の前駆体の形態で、および生物活性のない形態で存在する。ＩＬ−１８前駆体はプロ−ＩＬ−１８とも呼ばれる。その前駆体から活性ＩＬ−１８を製造する一つの方法が、１９９８年１月２１日に公開された、欧州特許第０８１９７５７号に対応するハヤシバラの米国特許第５，８７９，９４２号により教示されている。該特許は、ＩＬ−１８の前駆体を活性ＩＬ−１８に変換する酵素またはタンパク質を開示する。
【０００６】
活性ＩＬ−１８をその前駆体から製造する他の方法は、１９９８年１月２８日に公開されたハヤシバラの、欧州特許第０８２１００５号に対応する米国特許第５，８９１，６６３号により教示されている。該特許は、ＩＬ−１８前駆体をインターロイキン−１β−変換酵素（「ＩＣＥ」）と接触させることを開示する。該特許および引用文献の教示を、引用により組み込む。
【０００７】
アポトーシスおよび炎症の媒介物質としてのＩＣＥの役割が、文献に広く研究されている。ＩＣＥがインターロイキン−１およびインターロイキン−１８両方の前駆体を活性形態に加工することができることも知られている（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ， ＮＡ， ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５６， ７６８−７７４； Ｇｈａｙｕｒ， Ｔ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ ３８６， ６１９−６２３）。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、活性化酵素を用いてヒトＩＬ−１８の前駆体（プロ−ＩＬ−１８としても知られる）をインビトロで活性化するための方法であって、ヒトＩＬ−１８前駆体を活性化酵素、例えばカスパーゼ４およびカスパーゼ５などと接触させることを含む方法を提供する。より詳細には、本発明は、カスパーゼ４およびカスパーゼ５がＩＬ−１８の前駆体に作用して、特異的部位を切断し、免疫反応細胞中でのＩＦＮ−ガンマの産生を誘導する活性ポリペプチドを産生する方法を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、該タンパク質を活性化プロテアーゼと共発現させることを含む、ヒトＩＬ−１８の前駆体のインビボでの活性化のための方法を提供する。より詳細には、本発明は、ＩＣＥ_ＲＥＬＩＩとしても知られるカスパーゼ４、ＩＣＥ_ＲＥＬＩＩＩとしても知られるカスパーゼ５、およびＩＬ−１ポリペプチドの前駆体に作用してそれをＩＦＮ−γの産生を誘導する活性ポリペプチドへと変換するユビキチン特異的プロテアーゼなどのプロテアーゼを用いて、ＩＬ−１８をインビボで活性化する方法を提供する。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
カスパーゼ４および５は、インターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）、これはアミノ酸配列ＸＥＹＤ（配列中、ＸはＷ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｉ、Ｖ、ＤまたはＥから成る群から選択され、Ｅはグルタミン酸であり、ＹはＨ、Ｉ、Ａ、Ｔ、Ｓ、ＰまたはＥから成るアミノ酸の群から選択され、およびＤはアスパラギン酸である）を含むプロテアーゼ活性化モチーフを含む基質を選択的に分解する、を含むシステインプロテアーゼのファミリーのメンバーである（Ｍｕｎｄａｙ， Ｎ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２７０， １５８７０−１５８７６； Ｔａｌａｎｉａｎ， Ｒ．Ｖ． ｅｔ ａｌ， １９９７， Ｊ． ＢＩｏｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７２， ９６７７−８２； Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ， Ｎ．Ａ． ｅｔ ａｌ． １９９７ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７２， １７９０７−１１）。カスパーゼ−５の基質認識は、ＩＣＥおよびカスパーゼ−４と本質的に同一であり、カスパーゼの他のメンバーとは異なると考えられている（Ｔａｌａｎｉａｎ， Ｒ．Ｖ． ｅｔ ａｌ， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７２， ９６７７−８２； Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ， Ｎ．Ａ． ｅｔ ａｌ． １９９７ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７２， １７９０７−１１）。カスパーゼ４は、ＥＰ−Ｂ−０７５４２３４号に開示されている。カスパーゼ５は、米国特許第５，５５２，５３６号および米国特許第５，７６０，１８０号に開示されている。
【００１１】
ユビキチン特異的プロテアーゼは、進化の過程で保存されている７６アミノ酸のユビキチンペプチドを、それに融合しているタンパク質のＮ末端から正確に切断することができるＡＴＰ非依存性酵素のファミリーである。これらのプロテアーゼは、ユビキチンタンパク質のカルボキシ末端のアミノ酸残基とユビキチンが結合しているいずれかの非ユビキチンタンパク質のα−アミノ基の間のペプチド結合を特異的に切断する。サッカロマイセス セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のユビキチン特異的プロテアーゼ、例えばＵｂｐ１、Ｕｂｐ−２およびＵｂｐ−３が公知であり、組換え発現されてユビキチン融合タンパク質をインビボおよびインビトロの両方で標的する脱ユビキチン化反応を触媒することができる（Ｂａｋｅｒ， ＲＴ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： ２３３６４−２３３７５； Ｂａｋｅｒ， ＲＴ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９： ２５３８１−２５３８６）。サッカロマイセス セレビジエ ユビキチン特異的プロテアーゼの特異性により、プロリンから始まるものを除き、あらゆるペプチドからユビキチンを正確に除去することが可能である。マウスのＵｎｐなどの他の種由来のユビキチン特異的プロテアーゼおよびそのヒト相同物Ｕｎｐｈは、プロリンの前でも有効に切断することができる（Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ ＣＡ ｅｔ ａｌ． １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： ３２２８０−３２２８５）。つまり、インビトロで組み合わせた場合、またはユビキチン特異的プロテアーゼと共発現させた場合に、正確には融合ユビキチンペプチドの除去により、実質上あらゆる所望のＮ末端を作成することができる。ユビキチン特異的プロテアーゼは、米国特許第５，２１２，０５８号；米国特許第５，６８３，９０４号； 米国特許第５，３９１，４９０号；および米国特許第５，４９４，８１８号に開示されている。
【００１２】
免疫反応細胞中で、その構造、源、および起源とは無関係にＩＦＮ−γの産生を誘導する活性ポリペプチドを産生する限りあらゆる天然および人工のカスパーゼ４、カスパーゼ５またはユビキチンプロテアーゼを、本発明に用いることができる。
ヒト細胞においては、遺伝子の発現により形成されたポリペプチドは、細胞内酵素により加工され得る。細胞内酵素はプロ−ＩＬ−１８などの前駆体タンパク質をその活性形態に切断する。医薬に満足に組み込まれるポリペプチドは、ポリペプチドがヒト細胞において受けるプロセシングと同様のプロセシングを受けるべきである。ポリペプチドは通常ヒト細胞中では前駆体の形態で、および生物活性のない形態で存在する。ＩＬ−１８ポリペプチドを含むほとんどのサイトカインは、生物活性のない前駆体として通常産生され、次いで細胞内酵素により加工されて活性ポリペプチドに変換されることが公知である。
【００１３】
本発明中において言及するＩＬ−１８の前駆体は、例えば、ポリペプチドをコードする領域を含んでいるＤＮＡ、例えば、配列番号２のヌクレオチド配列を有するＤＮＡを導入することにより形質転換された、ポリペプチドを固有に産生する細胞、哺乳動物の宿主細胞、および細菌系、例えばイー．コリ中に存在する。そのような哺乳動物および細菌宿主細胞を用いて、前駆体ＩＬ−１８を、活性ＩＬ−１８を生成するためのプロテアーゼと共発現させることができる。
【００１４】
インビトロでの切断
本発明は、ポリペプチド前駆体を活性化酵素と接触させることを含む、ポリペプチド前駆体、例えばＩＬ−１８の前駆体などのインビトロでの活性化のための方法を提供する。
好ましい具体例において、本発明は、ヒトＩＬ−１８前駆体をカスパーゼ４またはカスパーゼ５と接触させることを含む、ヒトＩＬ−１８前駆体のインビトロでの活性化のための方法を提供する。
好ましい具体例において、ＩＬ−１８前駆体は、アミノ酸配列ＸＥＹＤ、ここでＸは、Ｗ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｉ、Ｖ、ＤまたはＥから成るアミノ酸の群から選択され、およびＹはＨ、Ｉ、Ａ、Ｔ、Ｓ、ＰまたはＥから成るアミノ酸の群から選択される、を含む特異的プロテアーゼ活性化モチーフを認識する活性化酵素で切断することによりインビトロで活性化される。
【００１５】
さらに好ましい具体例では、ＩＬ−１８前駆体は、配列番号１中のアスパラギン酸３６およびチロシン３７の間のペプチド結合をカスパーゼ４またはカスパーゼ５で切断することによりインビトロで活性化され、免疫反応細胞中でＩＦＮ−γの産生を誘導する活性ポリペプチドを生ずる。
【００１６】
一般に、カスパーゼ４またはカスパーゼ５は、それを固有に産生する細胞および組換えＤＮＡ技術を適用することにより得られた形質転換体から得ることができる。そのような細胞の例は、哺乳動物およびヒトの細胞、例えば上皮細胞、内皮細胞、間質細胞、軟骨細胞、単核細胞、顆粒球、リンパ球、およびその確立された細胞系統などから確立されたものである。形質転換体の例には、カスパーゼ５をコードしているＤＮＡを微生物および動物細胞に導入することにより得られる形質転換微生物および動物細胞が含まれる。カスパーゼ４またはカスパーゼ５は、当該分野で用いられる常套の培養媒地中でこれらの形質転換体を培養し、次いでそれらを未処置の培養物の形態で、または培養物から分離した後に超音波で処理するか、または低張溶媒にこれらの形質転換体を浸すことにより、生じた細胞残さ、または培養上清と細胞残さを含む混合物に、当該分野において酵素を精製するために用いられる以下の常套法、塩析、透析、濾過、濃縮、沈降分離、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および等電点電気泳動を用いることにより調製される。これらの精製法の２またはそれ以上を組み合わせて用いることができる。カスパーゼ４（図５）（配列番号５）およびカスパーゼ５（図７）（配列番号７）をコードしているＤＮＡ、およびカスパーゼ４およびカスパーゼ５を産生する形質転換体は当該分野で公知である。例えば、酵素は、開示されているように（Ｍｕｎｄａｙ ＮＡ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２６：１５８７０−７６）、プロ領域を欠いているＮ末端切断ペプチドの発現によりイー．コリ中で活性形態で産生されてよい。
【００１７】
ポリペプチド前駆体、例えばプロ−ＩＬ−１８を固有に産生する細胞または前駆体を産生するために形質転換された細胞は、普通培養培地中で培養する。好ましい培養培地には、当該分野で周知の培養培地、例えばＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地、またはトリプトンおよび酵母抽出物を含む、イー．コリを培養するための他の栄養培地が含まれる。
【００１８】
前記の方法を用いて得られるカスパーゼ４またはカスパーゼ５は生じた培養物中に共存させてよく、または培養物から分離した、もしくは分離していない増殖細胞を粉砕した後に生じる混合物または細胞残さに添加する。所望されるカスパーゼ４またはカスパーゼ５の量は、前駆体の等モル未満である。カスパーゼ４またはカスパーゼ５は前駆体と、カスパーゼ４またはカスパーゼ５が前駆体に作用するのを許容する温度およびｐＨで反応させるが、通常は、カスパーゼ４またはカスパーゼ５は前駆体と、所望の量の活性ポリペプチドが原料である前駆体から形成されるまで、約４℃〜４０℃の温度および約６−９のｐＨにて反応させる。好ましい温度は約２５℃であり、および好ましいｐＨは約７．２である。こうして、活性ポリペプチドを含む反応混合物を得ることができる。
【００１９】
カスパーゼ４またはカスパーゼ５の活性は、１μｇのカスパーゼ４またはカスパーゼ５当たり、１分当たりに産生される加工ポリペプチドのμｇにより、活性に関するユニットにより測定および表してよい。
【００２０】
インビボでの共発現
本発明は、ポリペプチド前駆体、ＩＬ−１８の前駆体などのインビボでの活性化のための、タンパク質を活性化プロテアーゼと共発現させることを含む方法を提供する。より詳細には、本発明は、ＩＬ−１８のインビボでの活性化のための、ポリペプチド、例えばＩＬ−１８などのプロテアーゼ、例えばＩＣＥ_ＲＥＬＩＩとしても知られるカスパーゼ４、ＩＣＥ_ＲＥＬＩＩＩとしても知られるカスパーゼ５、およびユビキチンとの二シストロン的共発現（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を含む、ＩＬ−１８のインビボでの活性化のための方法を提供する。
【００２１】
好ましい具体例では、ＩＣＥ_ＲＥＬＩＩとしても知られるヒトのカスパーゼ４が、ヒトのプロ−ＩＬ−１８と二シストロン的に共発現して、インビボでプロ−ＩＬ−１８が活性ＩＬ−１８にプロセシングされる。
他の好ましい具体例では、切断されたヒトカスパーゼ４（配列番号４）がヒトプロ−ＩＬ−１８と二シストロン的に共発現して、プロ−ＩＬ−１８（配列番号１）が活性ＩＬ−１８（配列番号３）へとインビボでプロセシングされる。
他の好ましい具体例では、ＩＣＥ_ＲＥＬＩＩＩとしても知られるヒトカスパーゼ５がヒトプロ−ＩＬ−１８と二シストロン的に共発現して、プロ−ＩＬ−１８が活性ＩＬ−１８（配列番号３）へとインビボでプロセシングされる。
【００２２】
さらに他の好ましい具体例では、ユビキチンプロテアーゼ１（Ｕｂｐ−１）がＵｂ−ＩＬ−１８の活性ＩＬ−１８へのインビボでのプロセシングのために、ユビキチン−ＩＬ−１８（Ｕｂｐ−ＩＬ−１８）と二シストロン的に共発現される。
さらに他の好ましい具体例では、ユビキチンプロテアーゼ１（Ｕｂｐ−１）が、ＵＢ−ＩＬ−１８（配列番号９）の活性ＩＬ−１８（配列番号３）へのインビボプロセシングのためにユビキチン−ＩＬ−１８（Ｕｂｐ−ＩＬ−１８）と二シストロン的に共発現する。
最も好ましい具体例では、切断されたヒトカスパーゼ５（配列番号５）がヒトプロ−ＩＬ−１８と二シストロン的に共発現して、プロ−ＩＬ−１８（配列番号１）が活性ＩＬ−１８（配列番号３）へとインビボでプロセシングされる。
【００２３】
カスパーゼ４またはカスパーゼ５をコードしているＤＮＡおよびポリペプチドの前駆体をコードしているＤＮＡを共に適当な細菌または哺乳動物宿主細胞中に導入して、それを形質転換する。この場合、ＤＮＡの発現により形成されたカスパーゼ４またはカスパーゼ５が、同じ形質転換体中でのＤＮＡの発現により形成されたポリペプチド前駆体に作用して、活性ポリペプチドを形成する（図１１および１５）。好ましい宿主細胞は、ヒト、サル、マウスおよびハムスター由来の、通常宿主として用いられる表皮細胞系統、間細胞、神経芽細胞系統、造血細胞系統、例えば３Ｔ３−スイスアルビノ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）を含む３Ｔ３細胞、Ｃ１２７１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を含むＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、ＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１細胞を含むＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６５０）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、ＭＯＰ−８細胞を含むＭＯＰ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７０９）およびその変異体である。最も好ましい宿主細胞はイー．コリ．である。カスパーゼ４または５をコードしているＤＮＡおよびポリペプチドの前駆体をコードしているＤＮＡをイー．コリに導入するのに最も好ましい方法は、当該分野で周知の、ルビジウムクロライドを用いるケミカルトランスフォーメーションである。カスパーゼ４またはカスパーゼ５をコードしているＤＮＡおよび該ポリペプチドの前駆体をコードしているＤＮＡを哺乳動物宿主細胞へ導入する方法には、常套のＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸−カルシウム法、エレクトロポーレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびレトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアウイルスを用いるウイルス感染法が含まれる。この場合、適当なプロモーター、エンハンサー、複製起点、末端部位、スプライシング配列、ポリアデニル化配列および／または選択マーカーを含むｐＣＤ、ｐｃＤＬ−ＳＲα、ｐＫＹ４、ｐＣＤＭ８、ｐＣＥＶ４、ｐＭＥ１８ＳおよびｐＳＶ２−ｇｐｔを、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅに記載される常套法に従い用いることができる。活性ポリペプチドを製造するために、免疫検出により観察されたクローンを、普通培養培地中で培養後に形質転換体から所望のクローンを選択することにより選択する。活性ポリペプチドを含む培養物は、クローン化された形質転換体を当該分野で用いられる通常の普通培養を用いて培養することにより得ることができる。ポリペプチドの前駆体を固有に産生する細胞およびポリペプチドを産生するために形質転換された他の細胞に関しては、それらは、ポリペプチドを活性化する活性化酵素、例えばカスパーゼ４、カスパーゼ５およびユビキチンと共に前駆体を産生し得る。哺乳動物宿主細胞を用いる組換えＤＮＡ技術は、Ｇｌｕｔｚｍａｎ， Ｃｅｌｌ， ２３： １７５ （１９８１） Ｍｕｌｌｉｎｇａｎ， ＰＮＡＳ７８：２０７２（１９８１）に詳細に開示されている。細菌宿主細胞を用いる組換えＤＮＡ技術は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ｅｄｓ． １９９９， Ｎｅｓ Ｙｏｒｋ， Ｏｘｐｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓに開示されている。
【００２４】
好ましい具体例では、活性ＩＬ−１８ポリペプチドを含む生じた反応混合物および培養物をそのままＩＦＮ−γインデューサーとして用いることができる一方で、培養物中の細胞を超音波、細胞溶解酵素および／または界面活性剤により粉砕した後、濾過、遠心分離等、タンパク質精製に関して記載されている以下の常套の工業的方法：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｃａｎｔｏｒ， Ｃ．Ｒ． ｅｄ． １９９３， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｓｐｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを行ない、生じた細胞および細胞残さからポリペプチドを分離する。細胞および細胞残さを含まないポリペプチドは、生物活性物質を精製するために当該分野で用いられる常套の精製法、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、沈降分離、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル電気泳動および等電点電気泳動により精製してよい。所望の場合、これらの精製法の２またはそれ以上を組み合わせて用いることができる。生じる精製ポリペプチドは、その最終用途に沿うように、液体または固体精製物へと濃縮および凍結乾燥することができる。
【００２５】
本発明の二シストロン的発現カセットは、既に開示されているような（Ｔｏｂｉａｓ， Ｊ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９１． ２６６（１８）： ｐ．１２０２１．１２０２８）適当なカスパーゼ４／カスパーゼ５またはユビキチナーゼ切断認識部位を含む実質上あらゆるペプチドをインビボでプロセシングするために用いることができる多用途のベクターである。二シストロン的発現は、両遺伝子が同じ転写ユニットに結合して両遺伝子の少しずつの持続的な発現を確実にするので、他の共発現法に勝る利点を提供する。これは、一のプラスミドが徐々に失われる可能性のあるデュアルプラスミド系、または実験間で各プロモーターからの発現が変動する可能性のある単一プラスミドデュアルプロモーター系と対照的である。特に、ここに記載する二シストロン的発現系は、酵素、サイトカイン、成長因子および他のタンパク質分解を活性化することのできるタンパク質のインビボでの活性化に理想的であり、それゆえ単一のステップで細胞からそのようなタンパク質を大規模で産生すること、および別のインビトロでの活性化ステップの必要性を除去することができる。
【００２６】
活性化プロテアーゼ、カスパーゼ４（Ａｌａ１０５からＡｓｎ３７７）またはカスパーゼ５（Ｉｌｅ１４６からＡｓｎ４１８）を、２つの遺伝子の転写融合物を作成するために、プロ−ＩＬ−１８配列の直後にＮ−末端−６−Ｈｉｓ融合物としてサブクローニングした。Ｔ７ターミネーター配列は、二シストロン的転写ユニットの転写終結のために、カスパーゼ４配列の下流に配置する。不完全なＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含む小さな遺伝子間領域も、カスパーゼ４配列から最小限の翻訳の開始のみを可能とするように付加した（図１０および１４）。他の調節領域には、１７塩基対のプロモーター領域のすぐ下流に位置する２５塩基対のｌａｃオペレーター配列が含まれるが、１７塩基対のプロモーター領域には、プラスミド上に位置するｌａｃ−Ｉ遺伝子のコピーによりコードされ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼがない場合に基本的転写を抑制するｌａｃリプレッサーが結合する。プロＩＬ１８／Ｃａｓｐ４およびプロＩＬ１８／Ｃａｓｐ５と名付けた合成プラスミドは、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子の誘導性染色体コピーを含むイー．コリＢＬ２１（ＤＥ３）株に次いで別々に感染させた。
【００２７】
二シントロンカセットの転写は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の溶原性のコピーからコードされるファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼタンパク質により制御される、Ｔ７プロモーターの管理下にある。Ｔ７ポリメラーゼのこの染色体コピーそれ自体は、イソプロピル−１−チオ−ｂ−Ｄガラクトピラノシドの添加により誘導されるｌａｃＵＶ５プロモーターのコントロール下にある。誘導によりプロ−ＩＬ−１８およびＨｉｓ−カスパーゼ−４またはＨｉｓ−カスパーゼ−５が協調して転写および翻訳される。発生期に翻訳されたカスパーゼ−４またはカスパーゼ−５は、プロＩＬ−１８のタンパク質分解の活性化を起こす活性体に自己プロセスされる。翻訳された両ＩＬ−１８前駆体ならびに転写後に活性化されたＩＬ−１８はイー．コリ中において大概は溶性である。Ｎ−末端チロシンを含む成熟活性ＩＬ−１８は、常套のクロマトグラフィー法による誘導後に細菌細胞溶解物から直接精製する。カスパーゼ−４での成熟ＩＬ−１８への切断は、４時間３７℃または１８時間２９℃により完了し（図１１）、カスパーゼ５での成熟ＩＬ−１８への切断は、１８時間２９℃にて完了する（図１５）。
【００２８】
最も好ましい具体例では、本発明は図４（配列番号４および配列番号５）に示す切断カスパーゼ４または図５（配列番号６および配列番号７）に示す切断カスパーゼ５を用いる。カスパーゼ４およびカスパーゼ５の切断は、Ｍｕｎｄａｙ， Ｎ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２７０， １５８７０−１５８７６に開示されている。
【００２９】
本発明により、ユビキチンｃ−末端ヒドロラーゼの活性により活性ＩＬ−１８へと変換されるＮ−末端ユビキチンＩＬ−１８融合物（前駆体）とのユビキチン特異的プロテアーゼの共発現により活性ポリペプチドを作成する方法が提供される。オーセンティックなＮ末端チロシンを含む７６のアミノ酸のユビキチンタンパク質をヒトＩＬ−１８の成熟Ｎ末端に融合し、そして例えば配列番号１０および配列番号１１に示すように、イー．コリ中でユビキチン特異的プロテアーゼと共発現する。ユビキチンは分解に備えてタンパク質をマークする機能を持つ、真核細胞中に見出される高度に保存された７６残基のタンパク質である（Ｂａｋｅｒ， Ｒ．Ｔ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９６． ７（５）： ｐ．５４１−６）。ユビキチンは、真核細胞中では内部発現されるが細菌中には存在しないユビキチン特異的プロテアーゼの活性によりタンパク質から特異的に切断される。ユビキチン融合タンパク質とユビキチン特異的プロテアーゼのイー．コリ中での共発現によっても、ユビキチンが効果的に除去される（Ｂａｋｅｒ， Ｒ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９２． ２６７（３２）： ｐ．２３３６４−７５）（図２０）。加えて、これらの脱ユビキチン化酵素のほとんどは、プロリンを除く事実上あらゆるアミノ酸の前で切断することができる。つまり、成熟ＩＬ−１８からのユビキチンの切断が、Ｐ１’位での大きな芳香族チロシン残基の存在にも関わらず、可能である。
【００３０】
ユビキチン−ＩＬ−１８（Ｕｂ−ＩＬ−１８）およびユビキチンプロテアーゼ−１（Ｕｂｐ−１）の共発現（Ｔｏｂｉａｓ， Ｊ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９１， ２６６（１８）： ｐ．１２０２１．１２０２８）は、誘導性Ｔ７プロモーターのコントロール下の２つの遺伝子の二シストロン的発現によりなされる。成熟ＩＬ−１８は、進化上保存された７６アミノ酸のユビキチンペプチドとのＮ末端融合物として発現される。Ｕｂ−ＩＬ−１８ｃＤＮＡを、ｐＥＴ２８ａベクター内に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのコントロール下にサブクローニングする。その結果、全長のユビキチン特異的プロテアーゼをコードしているｃＤＮＡがＴ７終結配列の下流にサブクローニングされる（図１９）。両Ｕｂ−ＩＬ−１８およびユビキチン特異的プロテアーゼｃＤＮＡは、Ｕｂ−ＩＬ−１８およびユビキチン特異的プロテアーゼタンパク質が別個に翻訳される単一のｍＲＮＡ転写産物へと転写される。
【００３１】
前記のように、本発明により得られる活性ヒトＩＬ−１８ポリペプチドは、有用な生物活性物質としてのＩＦＮ−γの産生を誘導する活性を有し、ＫＧ−１（ヒトｍｙｅｌｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃ１細胞系統）細胞（図２１）および精製されたヒトＰＢＭＣｓ（図２２）からのＩＦＮｇの産生を刺激する。
全公開文献および特許文献はここに、引用により組み込む。以下の実施例により本発明をさらに説明するが、本発明を制限するものではない。
【００３２】
実施例１−ＩＬ−１８前駆体（プロ−ＩＬ−１８）の調製
ヒト−ＩＬ−１８前駆体を、イー．コリ中で、Ｎ−末端ヘキサ−ヒスチジンタグ標識融合物として発現させた。発現プラスミド、プロＥｘ−ｈＩＬ１８は、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いる誘導性発現のためのＴｒｃプロモーターおよびＩａｃＩｑを含むベクター、ｐＰＲＯＥＸ−１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から得た。組換え発現ベクターを構築するために、完全なカスパーゼ５−前駆体遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを、５’にＮｄｅＩを、そして３’にＢａｍ ＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位をテイリングしたｃＤＮＡクローンからＰＣＲ増幅した。増幅産物をｐＰＲＯＥＸ−中のこれら２つの制限部位の間にサブクローニングし、こうしてベクター中に存在するヘキサヒスチジンコーディング配列とのインフレームのＮ末端融合物を作成した。
結果として生じるプラスミドを、１ｍＭのＩＰＴＧを５時間３７℃にて用いる誘導の後、ＤＨ１０Ｂ宿主細胞中で発現させた。組換えタンパク質を、誘導した培養物の遠心分離後に得られた細胞ペレットから回収した。
【００３３】
実施例２−プロ−ＩＬ−１８の精製
実施例１記載のごとくプロ−ＩＬ−１８を発現しているイー．コリ細胞１．５ｋｇを、３．６Ｌの溶解バッファーＣ（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、１０ｍＭのＢＭＥ、０．５ＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、１μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、１μｇ／ｍｌのロイペプシン、０．４ｍＭのＡＥＢＳＦ）中に懸濁し、マイクロフルーイディックス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を１２，０００ｐｓｉにて通す２回のパスにより溶解し、２８，０００×ｇにて遠心分離し、次いで３．７Ｌの上清を回収した。５ｍＭのイミダゾールを含有するバッファーＣ（バッファーＤ）で前平衡した６００ｍｌのＮｉＮＴＡアガロースを上清に添加し、スラリーを１時間インキュベートし、プロ−ＩＬ−１８を捕獲した。スラリーを低速（３，０００ｒｐｍ）で遠心分離し、上清をデカントし、次いでスラリーをカラムにつめた。カラムをバッファーＤで洗浄し、次いでプロ−ＩＬ−１８をバッファーＣ中３００ｍＭのイミダゾールで溶離した。プールをバッファーＥ（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＢＭＥ、ｐＨ８．０）にて透析し、次いで同じバッファーで平衡化したＤＥＡＥ ＴｏｙｏＰｅａｒｌ６５０ｍＭカラムにのせた。カラムをバッファーＥ中０〜０．５ＭのＮａＣｌの線形勾配で溶離した。プールは、６５０ｍｇの＞９０％の純粋なプロ−ＩＬ−１８を含んだ。
【００３４】
実施例３−カスパーゼ４の調製
ヒトのカスパーゼ４をＮ末端ヘキサ−ヒスチジンタグ標識融合物としてイー．コリ中で発現させた。発現プラスミド、ｐＥＴ１６ｂ−カスパーゼ４は、ファージＴ７プロモーターを含むベクターＰｅＴ１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）から得た。組換えベクターを、Ｎ末端にヘキサ−ヒスチジンコーディング配列を組込み、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位をテイリングしているカスパーゼ−４活性ドメイン（アミノ酸Ｉｌｅ１４６からＡｓｎ４１８）のＰＣＲ増幅により構築した。生じたＰＣＲ産物を次いでこれら２つの制限部位の間にサブクローニングし、Ｎ末端ヘキサヒスチジンカスパーゼ４融合ベクターを作成した。
【００３５】
生じたプラスミドを、１ｍＭのＩＰＴＧを用いる誘導後にカスパーゼ４の誘導性の発現を可能とするｌａｃＵＶ５プロモーターコントロール下にＴ７ＲＮＡポリメラーゼの染色体コピーを含む、溶原性のＢＬ２１ＤＥ３イー．コリ株に形質転換した。活性タンパク質を、３７℃にて３時間誘導後に単離した細胞ペレットから精製した。
【００３６】
実施例４−カスパーゼ４の精製
実施例２記載のＮ−末端ヘキサ‐Ｈｉｓタグ標識ヒトカスパーゼ４を発現しているイー．コリ細胞を溶解した場合、カスパーゼ４の活性は、溶解物上清中にて検出することができる。タンパク質を上清からＮｉＮＴＡアガロースビーズ上に捕獲した場合、ｐ１０およびｐ２０の両方が回収される。これは、カスパーゼ４プロテアーゼドメインが、細胞培養の間に、ｐ１０とｐ２０の連結部分での自己切断により活性化され、溶解性の非共有へテロダイマーとして残っていることを示す。この情報を用いて、ヘキサ−Ｈｉｓタグ標識ｐ２０／ｐ１０ヘテロダイマーを精製することができる。全プロセスは、分子のあらゆる更なる崩壊を回避するために、４℃にて行う。
【００３７】
約４００ｇの湿ったイー．コリ細胞ペレットを、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％のＣＨＡＰＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４の１０ｍＭのベータメルカプトエタノール（ＢＭＥ）、および１０％のグリセロール（バッファーＡ）を含む１．６Ｌの溶解バッファーに懸濁し、次いでマイクロフルーイディックスを１２，０００ｐｓｉにて通す２回のパスにより溶解した。溶解物を３０，０００×ｇで１時間遠心分離し、次いで１．７Ｌの溶解上清を回収した。５ｍＭのイミダゾールを含む溶解バッファーで前平衡した１５０ｍｌのＮｉＮＴＡアガロースを溶解上清に添加し、懸濁液をｐＨ８．０へと２ＮのＮａＯＨで調整し、次いでカスパーゼ４を１時間バッチ式吸着した。ＮｉＮＴＡアガロースをカラムにつめ、バッファーＡ中５ｍＭおよび２５ｍＭのイミダゾールで続けて洗浄して不純物を除去し、次いでカスパーゼ５を、バッファーＡ中３００ｍＭのイミダゾールで溶離した。タンパク質をバッファーＢ（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％のＣＨＡＰＳ、１０％のグリセロール、１０ｍＭのＢＭＥ、ｐＨ８．０）に対して透析し、次いで同じバッファーで前平衡したＤＥＡＥ ＴｏｙｏＰｅａｒｌ６５０Ｍカラムにのせた。カスパーゼ４を同じバッファー中１００ｍＭのＮａＣｌを含むカラムから溶離した。蛍光ペプチド基質、ＬＥＥＤ−ＡＭＣを用いてカスパーゼ４の最高の特異活性を示しているフラクションをプールした。
【００３８】
実施例５−ポリペプチドのインビトロでの活性化および精製
実施例２記載のごとく精製したプロ‐ＩＬ−１８をカスパーゼ４と共に１：５００ｗ／ｗ比で３時間室温にてインキュベートした。プロドメインの切断反応は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により＞９０％で完了した。反応混合液に、バッファーＤ中１４０ｍｌのＮｉＮＴＡアガロースを添加し、１時間インキュベートし、焼結ガラス漏斗に注ぎ、主として成熟ＩＬ−１８を含む非結合物質を回収した。少量の残るプロ‐ＩＬ−１８、プロドメイン、カスパーゼ４、および他の不純物がＮＩＮＴＡアガロースに結合した。非結合溶液を２５ｍＭのＤＴＴへ調整し、１時間インキュベートして還元反応を完了させ、溶液のｐＨを２Ｍのリン酸を添加することにより６．０へと調整し、次いでＹＭ１０膜を用いて８６ｍｌへと濃縮した。濃縮したサンプルを０．１ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＮａＰｈｏｓｐｈａｔｅ ｐＨ６．０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムにのせた。プールしたフラクションは、５６０ｍｇの成熟ＩＬ−１８を含んだ。
【００３９】
実施例６−ポリペプチドのインビボでの活性化および調製
ＩＬ−１８の活性化は、ヒトＩＬ−１８前駆体およびカスパーゼ‐４の同時発現によりインビボで達成することもできる。プロ‐ＩＬ−１８は、発現プラスミド、ｐＥＴ２８−プロ−ＩＬ−１８／Ｃａｓｐ４内のヒトカスパーゼ‐４と共に単一の転写物から、イー．コリ中で二シストロン的に共発現される。ヒトのプロ‐ＩＬ−１８遺伝子は、Ｔ７プロモーターのコントロール下、プロ−ＩＬ−１８配列からの最適の翻訳開始のための有効なＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含んでいるｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした（図８）。カスパーゼ４遺伝子（Ｉｌｅ１４６からＡｓｎ４１８）は、カスパーゼ４配列からの最小限の翻訳の開始を可能とする不完全なＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含んでいるプロ‐ＩＬ−１８配列直後にサブクローニングした。Ｔ７終結配列を、二シストロン的転写ユニットの後に翻訳終結のために含めた。生じた構築物を次いで、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子の誘導性染色体コピーを含むＢＬ２１（ＤＥ３）宿主へトランスフェクトした。この宿主中での、１ｍＭのＩＰＴＧを用いたこの構築物の誘導により、プロ‐ＩＬ−１８およびプロカスパーゼ４が協調転写および協調翻訳された。発生期に翻訳されたプロ‐カスパーゼ４は、プロ‐ＩＬ−１８のタンパク質分解の活性化を起こす活性体に自己プロセスされる。図８は、１ｍＭのＩＰＴＧによる誘導後の、１８時間に渡るＩＬ−１８の活性化のタイムコースを示す（０−１８時間）。
【００４０】
実施例７−カスパーゼ４のインビボでの活性化
カスパーゼ４のインビボでの活性化は、Ｍｕｎｄａｙ， Ｎ．Ａ．， ｅｔ ａｌ， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２７０，１５８７０−１５８７６に開示されている。Ａｌａ５９に始まる、プロ領域を欠いているカスパーゼ‐４の切断形態のイー．コリ中での発現により、活性酵素ヘテロダイマーへと会合するＰ１０およびＰ２０サブユニットへの切断による自己活性化が導かれる。カスパーゼ４の活性化の遅延は、切断およびプロ−ＩＬ−１８の成熟ＩＬ−１８への活性化の遅延と言い換えられる（図９）。これより、細胞中で安定性の低い成熟ＩＬ−１８へそれが切断されるより前に、より安定なプロ‐ＩＬ−１８が蓄積される。
【００４１】
実施例８−カスパーゼ４と共発現したヒトＩＬ−１８の精製
実施例６記載のごとくＩＬ−１８を発現しているイー．コリ細胞６６ｇを、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ＭのＤＴＴを含む１３０ｍｌの０．１ＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．５中に懸濁し（全プロセスは、遊離ＳＨを保護するための最終段階以外は、４℃にて１０ｍＭのＤＤＴの存在下に行った。）、マイクロフルーイディックスを１２，０００ｐｓｉにて通す２回のパスにより溶解した。溶解物（２３０ｍｌ）を３４，０００×ｇにて３０分間遠心分離した。上清（２００ｍｌ）を１Ｌへと、２５ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．０を用いて希釈した後、タンデムに２つのカラム、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ ＳＰ ６５０ＭおよびＴｏｙｏＰｅａｒｌ ＤＥＡＥ ６５０Ｍに流した。イー．コリ細胞から誘導した不純物の多くがカラムに結合した。流出した物質をｐＨ９．５へと、２５ｍＭのビストリスプロパンを用いて調整し、２Ｌへと希釈し、次いで２５ｍＭのビストリスプロパンＨＣｌｐＨ９．５で平衡化したＳｏｕｒｃｅ１５Ｑカラムにのせた。カラムを同じバッファー中１〜０．５ＭのＮａＣｌの線形勾配を用いて溶離した。ＩＬ−１８を含んでいるフラクションを、Ｖｙｄａｃ Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて同定し、次いでプールした（２５０ｍｌ）。プールをＹＭ１０膜を用いて５０ｍｌへと濃縮し、１ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１５ＭのＮａＣｌを含む（インビボ使用のためにはＤＴＴは含まず）１０ｍＭのＮａＰＯ_４、ｐＨ６．０で前平衡したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムにのせた。
【００４２】
実施例９−切断カスパーゼ５の調製
ヒト切断カスパーゼ５も、イー．コリ中で、Ｎ−末端ヘキサ‐ヒスチジンタグ標識融合物として発現させた。発現プラスミド、ｐＥＴ１６ｂ−切断カスパーゼ５を、ファージＴ７プロモーターを含んでいるベクターｐＥＴ１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）から誘導した。組換えベクターは、Ｎ末端にヘキサ‐ヒスチジンコーディング配列を組み込み、かつＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位をテイリングしている切断カスパーゼ５活性ドメイン（アミノ酸Ｉｌｅ１４６からＡｓｎ４１８）のＰＣＲ増幅により構築した。生じたＰＣＲ産物を次いで、これら２つの制限部位の間にサブクローニングし、Ｎ‐末端ヘキサ‐ヒスチジン‐切断カスパーゼ５融合ベクターを作成した。
【００４３】
合成プラスミドを、１ｍＭのＩＰＴＧでの誘導後に切断カスパーゼ５の誘導性の発現を可能とするｌａｃＵＶ５プロモーターコントロール下にＴ７ＲＮＡポリメラーゼの染色体コピーを含んでいる溶原性のＢＬ２１ＤＥ３イー．コリ株に形質転換した。活性タンパク質を、３７℃にて３時間誘導した後に単離した細胞ペレットから精製した。
【００４４】
実施例１０−カスパーゼ５の精製
実施例９に記載のＮ末端ヘキサ‐Ｈｉｓタグ標識ヒト切断カスパーゼ５を発現しているイー．コリ細胞を溶解した場合、切断されたカスパーゼ５の活性は、溶解上清中で検出することができる。タンパク質をＮｉＮＴＡアガロースビーズ上に捕獲する場合、ｐ１０およびｐ２０の両方が回収される。これは、切断されたカスパーゼ５プロテアーゼドメインが、ｐ１０およびｐ２０の接合部分で自己切断により細胞培養の間に活性化され、溶解性の非共有ヘテロダイマーとして残っていることを示す。この情報を用いて、ヘキサ−Ｈｉｓタグ標識ｐ２０／ｐ１０ヘテロダイマーを精製することができる。全プロセスは、分子のあらゆるさらなる崩壊を回避するために４℃で行う。
【００４５】
およそ４００ｇの湿ったイー．コリ細胞ペレットを、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％のＣＨＡＰＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４の１０ｍＭのベータメルカプトエタノール（ＢＭＥ）、および１０％のグリセロール（バッファーＡ）を含む１．６Ｌの溶解バッファー中に懸濁し、マイクロフルーイディックスを１２，０００ｐｓｉにて通す２回のパスにより溶解した。溶解物を３０，０００×ｇで１時間遠心分離し、次いで溶解上清１．７Ｌを回収した。５ｍＭのイミダゾールを含む溶解バッファーで前平衡した１５０ｍｌのＮｉＮＴＡアガロースを溶解上清に添加し、懸濁液を２ＮのＮａＯＨでｐＨ８．０へと調整し、次いでカスパーゼ５を１時間バッチ式吸収した。ＮｉＮＴＡアガロースをカラムにつめ、バッファーＡ中５ｍＭおよび２５ｍＭのイミダゾールで続けて洗浄して不純物を除き、次いでカスパーゼ５をバッファーＡ中３００ｍＭのイミダゾールで溶離した。タンパク質をバッファーＢ（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％のＣＨＡＰＳ、１０％のグリセロール、１０ｍＭのＢＭＥ、ｐＨ８．０）に対して透析し、次いで同じバッファーで前平衡したＤＥＡＥ ＴｏｙｏＰｅａｒｌ６５０Ｍカラムにのせた。切断されたカスパーゼ５を同じバッファー中１００ｍＭのＮａＣｌを用いてカラムから溶離した。蛍光ペプチド基質ＬＥＥＤ−ＡＭＣを用いて切断カスパーゼ５の最高の特異活性を示しているフラクションをプールした。
【００４６】
実施例１１−ポリペプチドのインビボでの活性化および調製
実施例１および２記載のごとく調製および精製したプロ−ＩＬ−１８を、切断されたカスパーゼ５と１：５００ｗ／ｗ比で３時間室温にてインキュベートした。プロドメインの切断反応は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により＞９０％にて完了した。反応混合物に、バッファーＤ中１４０ｍｌのＮｉＮＴＡアガロースを添加し、１時間インキュベートし、次いで焼結ガラス漏斗に注ぎ、主として成熟ＩＬ−１８を含む非結合物質を回収した。残っている少量のプロ‐ＩＬ−１８、プロドメイン、切断カスパーゼ５、および他の不純物がＮＩＮＴＡアガロースに結合した。非結合溶液を２５ｍＭのＤＴＴに対して調整し、１時間インキュベートして還元反応を完了させ、２Ｍのリン酸を添加することにより溶液のｐＨを６．０へと調整し、ＹＭ１０膜を用いて８６ｍｌへと濃縮した。濃縮したサンプルを、０．１ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＮａＰｈｏｓｐｈａｔｅ ｐＨ６．０で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムにのせた。プールしたフラクションは、５６０ｍｇの成熟ＩＬ−１８を含んだ。
【００４７】
実施例１２−ポリペプチドのインビボでの活性化および調製
ＩＬ−１８の活性化は、ヒトのＩＬ−１８前駆体および切断カスパーゼ５の同時発現によりインビボで活性化することもできる。プロ‐ＩＬ−１８が、発現プラスミド、ｐＥＴ２８‐プロＩＬ１８／Ｃａｓｐ５内のヒト切断カスパーゼ５と共に単一の転写産物からイー．コリ中で二シストロン的に共発現した（図９）。ヒトのプロ‐ＩＬ−１８遺伝子を、Ｔ７プロモーターのコントロール下にプロ‐ＩＬ−１８配列からの最適の翻訳の開始のための有効なＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含んでいるｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした（図１０）。切断カスパーゼ５遺伝子（Ｉｌｅ１４６〜Ａｓｎ４１８）を、不完全なＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含んでいるプロ‐ＩＬ−１８配列直後にサブクローニングし、切断カスパーゼ５配列から最小限の翻訳開始を可能とした。Ｔ７終結配列を、二シストロン的転写ユニットの後に、翻訳の終結のために含めた。生じた構築物を、Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子の誘導性染色体コピーを含むＢＬ２１（ＤＥ３）宿主に次いでトランスフェクトした。この構築物のこの宿主中での１ｍＭのＩＰＴＧを用いた誘導により、プロ‐ＩＬ−１８およびプロ‐カスパーゼ５が協調転写および協調翻訳された。発生期に翻訳されたプロ‐カスパーゼ５は、プロ‐ＩＬ−１８のタンパク質分解活性を開始する活性種に自己プロセスする。
【００４８】
実施例１３−切断カスパーゼ５と共発現したヒトＩＬ−１８の精製
実施例１２記載のごとくＩＬ−１８を発現しているイー．コリ細胞６６ｇを、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭのＤＴＴを含む１３０ｍｌの０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ Ｈ７．５に懸濁し（全プロセスは、遊離ＳＨを保護するための最終段階以外は、４℃にて１０ｍＭのＤＴＴの存在下で行った。）、次いでマイクロフルーイディックスを１２，０００ｐｓｉにて通す２回のパスにより溶解した。溶解物（２３０ｍｌ）を３４，０００×ｇにて３０分間遠心分離した。上清（２００ｍｌ）を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０を用いて１Ｌへと希釈し、次いでＴｏｙｏＰｅａｒｌＳＰ６５０ＭおよびＴｏｙｏＰｅａｒｌＤＥＡＥ６５０Ｍの２つのカラムにタンデムに流した。イー．コリ細胞由来の不純物の多くがカラムに結合した。流出した物質を２５ｍＭのビストリスプロパンを用いてｐＨ９．５へと調整し、２Ｌへと希釈し、次いで２５ｍＭのビストリスプロパンＨＣｌ ｐＨ９．５にて平衡化したＳｏｕｒｃｅ１５Ｑカラムにのせた。カラムを同じバッファー中０〜０．５ＭのＮａＣｌの線形勾配を用いて溶離した。ＩＬ−１８を含むフラクションを、Ｖｙｄａｃ Ｃ４ ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて同定し、次いでプールした（２５０ｍｌ）。プールをＹＭ１０膜を用いて５０ｍｌに濃縮し、１ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１５ＭのＮａＣｌを含む（インビボ使用のためにはＤＴＴを含まない）１０ｍＭのＮａＰＯ_４にて前平衡したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムにのせた。
【００４９】
実施例１４−ユビキチン／プロ−ＩＬ−１８／Ｕｂｐ１の調製
７６アミノ酸のユビキチンコーディング配列を、成熟ＩＬ−１８の最初のチロシンコドンがユビキチンのグリシン７６コドンの直後にくるように、ブラントエンドライゲーションにより、成熟ヒトＩＬ−１８のスタートコドンとインフレーム融合させた。遺伝子融合物を次いで、Ｔ７プロモーターのコントロール下にユビキチン‐ＩＬ−１８遺伝子配列からの最適の翻訳開始のための有効なＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含んでいるｐＥＴベクター中にサブクローニングした。全長のＵｂｐ−１遺伝子を、Ｕｂｐ−１の最小限の翻訳のための不完全なＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含んでいるＩＬ−１８の直後に次いでサブクローニングした。図１１は、ｐＥＴ２８内のＵｂＩＬ−１８／Ｕｂｐ−１発現カセットの配列を示す。図１３は、ｐＥＴ２８内のＵｂＩＬ−１８／Ｕｂｐ−１の注釈をつけた配列を示す。番号はｐＥＴ２８内の位置に対応する。
【００５０】
実施例１５−ＩＬ−１８のインビボでの活性化および調製
実施例１４の構築物を次いでＢＬ２１（ＤＥ３）宿主にトランスフェクトした。１ｍＭのＩＰＴＧを用いた誘導により、ユビキチン−ＩＬ−１８とＵｂｐ−１が協調転写および協調翻訳された。Ｕｂｐ−１の酵素活性により、Ｕｂ−ＩＬ−１８は、次いで常套法によりイー．コリ溶解物から直接精製することができる成熟活性ＩＬ−１８へと効率よくプロセシングされる。図１６はＩＬ−１８の発現、および１ｍＭのＩＰＴＧで誘導後の３０℃および３７℃でのＩＬ−１８の発現およびプロセシングのタイムコースを示す。上の矢印はレーン１におけるプロセシングされていないＵＢ−ＩＬ−１８の部分を示す。下の矢印は、レーン３におけるプロセシングされたＩＬ−１８の部分を示す。（抗−ＩＬ−１８抗血清を用いるウェスタンブロット検出）。
【００５１】
実施例１６−ユビキチンと共発現されたヒトＩＬ−１８の精製
実施例１５記載のごとくＩＬ−１８を発現しているイー．コリ細胞６６ｇを、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭのＤＴＴを含む１３０ｍｌの０．１ＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５中に懸濁し（全プロセスは、遊離のＳＨを保護する最終段階以外は、４℃にて、および１０ｍＭのＤＴＴの存在下で行った）、次いでマイクロフルーイディックスを１２，０００ｐｓｉにて通す２回のパスにより溶解した。溶解物（２３０ｍｌ）を３４，０００×ｇにて３０分間遠心分離した。上清（２００ｍｌ）を２５ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ７．０を用いて１Ｌへと希釈し、次いでＴｏｙｏＰｅａｒｌ ＳＰ ６５０ＭおよびＴｏｙｏＰｅａｒｌの２つのカラムにタンデムに流した。イー．コリ細胞由来の不純物の多くがカラムに結合した。流通物質を、２５ｍＭのビストリスプロパンｐＨ９．５を用いて平衡化したＳｏｕｒｃｅ１５Ｑカラムにのせた。カラムを同じバッファー中０〜０．５のＮａＣｌの線形勾配で溶離した。ＩＬ−１８を含んでいるフラクションを、ＶｙｄａｃＣ４ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて同定し、次いでプールした（２５０ｍｌ）。プールをＹＭ１０膜を用いて５０ｍｌへと濃縮し、１ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１５ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＮａＰＯ_４ｐＨ６．０（インビボ使用のためにはＤＴＴは含まない）で前平衡した。
【００５２】
現在発明の好ましい具体例であると考えられているものを記載したが、種々の変更をなしてよく、および本発明の精神および範囲内にある全てのそのような変更を添付の請求の範囲内に含むことを意図していることが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒトＩＬ−１８前駆体のアミノ酸配列を示す（配列番号１）。
【図２】図２は、全長のヒトＩＬ−１８をコードしている核酸配列を示す（配列番号２）。
【図３】図３は、活性ヒトＩＬ−１８のアミノ酸配列を示す（配列番号３）。
【図４】図４は、６−ｈｉｓタグ付Ｎ末端切断カスパーゼ４のアミノ酸配列を示す（配列番号４）。
【図５】図５は、６−ｈｉｓタグ付Ｎ末端切断カスパーゼ４のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を示す（配列番号５）。
【図６】図６は、６−ｈｉｓタグ付Ｎ末端切断カスパーゼ５のアミノ酸配列を示す（配列番号６）。
【図７】図７は、６−ｈｉｓタグ付Ｎ末端切断カスパーゼ５のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を示す（配列番号７）。
【図８】図８は、プロ−ＩＬ−１８および切断カスパーゼ４のイー．コリ．中での共発現のためのｐＥＴ２８−プロＩＬ−１８／Ｃａｓｐ４内に含まれる二シストロン的発現カセットの概略図である。
【図９】図９は、ｐＥＴ２８内のプロＩＬ−１８／カスパーゼ４発現カセットの配列を示す（配列番号８）。
【図１０】図１０は、プロＩＬ−１８／カスパーゼ４発現カセットの注釈を付した配列を示す。番号は、ｐＥＴ２８ａベクター内での位置に対応する。
【図１１】図１１は、プロＩＬ−１８／カスパーゼ４の誘導を示す。
【図１２】図１２は、イー．コリ．中でのプロ−ＩＬ８とカスパーゼ５の共発現のためのｐＥＴ２８−プロ−ＩＬ１８／切断カスパーゼ５内に含まれる二シストロン的発現カセットの概略図である。
【図１３】図１３は、ｐＥＴ２８内のプロ−ＩＬ１８／カスパーゼ５発現カセットの配列を示す（配列番号９）。
【図１４】図１４は、調節配列の特徴およびプロ−ＩＬ−１８および切断カスパーゼ−５の翻訳を示している、プロ−ＩＬ−１８／切断カスパーゼ−５発現カセットの注釈を付した配列図を示す。番号は、ｐＥＴ２８ａベクター内での位置に対応する。
【図１５】図１５は、プロ−ＩＬ−１８／カスパーゼ５の誘導を示す。
【図１６】図１６は、Ｕｂ−ＩＬ−１８のアミノ酸配列を示す（配列番号１０）。
【図１７】図１７は、Ｕｂ−ＩＬ−１８のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を示す（配列番号１１）。
【図１８】図１８は、ｐＥＴ２８ベクター内のＵｂ−ＩＬ−１８／Ｕｂｐ−１発現カセットの核酸配列を示す（配列番号１２）。
【図１９】図１９は、ｐＥＴ２８ベクター内のＵｂ−ＩＬ−１８／Ｕｂｐ−１の注釈を付した配列を示す。番号はｐＥＴ２８内の位置に対応する。
【図２０】図２０は、Ｕｂ−ＩＬ−１８の発現およびＵｂｐ−１によるプロセシングを示す。
【図２１】図２１は、ＫＧ−１（ヒト骨髄単核細胞系統）細胞を用いた、ＩＦＮ−γの産生を測定するためのＩＬ−１８活性のアッセイを示す（ＩＬ−１８は表記のごとく、種々の方法で発現させた）。
【図２２】図２２は、精製ヒトＰＢＭＣを用いた、ＩＦＮ−γの産生を測定するためのＩＬ−１８活性のアッセイを示す（ＩＬ−１８は表記のごとく、種々の方法で発現させた）。

Claims (24)

1. アミノ酸配列ＸＥＹＤ（配列中、ＸはＷ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｉ、Ｖ、Ｄ、またはＥから成るアミノ酸の群から選択され、およびＹはＨ、Ｉ、Ａ、Ｔ、Ｓ、ＰまたはＥから成るアミノ酸の群から選択される）を含むプロテアーゼ活性化モチーフを有するポリペプチドであるポリペプチド前駆体から活性ポリペプチドを製造するための方法であって、
   （ｉ）カスパーゼ４を該ポリペプチド前駆体と接触させること、および
   （ｉｉ）活性ポリペプチドを精製すること
   を含む方法。
2. アミノ酸配列ＸＥＹＤ（配列中、ＸはＷ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｉ、Ｖ、Ｄ、またはＥから成るアミノ酸の群から選択され、およびＹはＨ、Ｉ、Ａ、Ｔ、Ｓ、ＰまたはＥから成るアミノ酸の群から選択される）を含むプロテアーゼ活性化モチーフを有するポリペプチドであるポリペプチド前駆体から活性ポリペプチドを製造するための方法であって、
   （ｉ）カスパーゼ５を該ポリペプチド前駆体と接触させること、および
   （ｉｉ）活性ポリペプチドを精製すること
   を含む方法。
3. ＩＬ−１８ポリペプチド前駆体から活性ＩＬ−１８ポリペプチドを製造するための方法であって、
   （ｉ）カスパーゼ４をＩＬ−１８ポリペプチド前駆体と接触させること、および
   （ｉｉ）活性ＩＬ−１８ポリペプチドを精製すること
   を含む方法。
4. ＩＬ−１８ポリペプチド前駆体から活性ＩＬ−１８ポリペプチドを製造するための方法であって、
   （ｉ）カスパーゼ５をＩＬ−１８ポリペプチド前駆体と接触させること、および
   （ｉｉ）活性ＩＬ−１８ポリペプチドを精製すること
   を含む方法。
5. ＩＬ−１８ポリペプチド前駆体がヒトのＩＬ−１８ポリペプチドである、請求項３記載の方法。
6. ＩＬ−１８ポリペプチド前駆体がヒトのＩＬ−１８ポリペプチドである、請求項４記載の方法。
7. 活性ヒトＩＬ−１８ポリペプチドを製造するための方法であって、
   （ｉ）カスパーゼ４をヒトのＩＬ−１８ポリペプチド前駆体と接触させて、該ポリペプチド前駆体を活性ヒトＩＬ−１８ポリペプチドに変換すること、ここで、該ＩＬ−１８ポリペプチド前駆体は配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列中のアスパラギン酸３６およびチロシン３７残基をＮ末端配列として保持するその部分を含む、および、
   （ｉｉ）活性ヒトＩＬ−１８ポリペプチドを精製すること、
   を含む方法。
8. 活性ヒトＩＬ−１８ポリペプチドを製造するための方法であって、
   （ｉ）カスパーゼ５をヒトのＩＬ−１８ポリペプチド前駆体と接触させて、該ポリペプチド前駆体を活性ヒトＩＬ−１８ポリペプチドに変換すること、ここで、該ＩＬ−１８ポリペプチド前駆体は配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列中のアスパラギン酸３６およびチロシン３７残基をＮ末端配列として保持するその部分を含む、および、
   （ｉｉ）活性ヒトＩＬ−１８ポリペプチドを精製すること、
   を含む方法。
9. 活性ヒトＩＬ−１８ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項７記載の活性ヒトＩＬ−１８ポリペプチドを製造するための方法。
10. 活性ヒトＩＬ−１８ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項８記載の活性ヒトＩＬ−１８ポリペプチドを製造するための方法。
11. ポリペプチド前駆体から活性ポリペプチドを製造するための方法であって、
    （ｉ）カスパーゼ４をポリペプチド前駆体と二シストロン的に共発現させること；および、
    （ｉｉ）活性ポリペプチドを精製すること
    を含む方法。
12. ポリペプチド前駆体から活性ポリペプチドを製造するための方法であって、
    （ｉ）カスパーゼ５をポリペプチド前駆体と二シストロン的に共発現させること；および、
    （ｉｉ）活性ポリペプチドを精製すること
    を含む方法。
13. ＩＬ−１８ポリペプチド前駆体から活性ＩＬ−１８ポリペプチドを製造するための方法であって、
    （ｉ）ユビキチナーゼをユビキチン／ＩＬ−１８融合物と二シストロン的に共発現させること；および、
    （ｉｉ）活性ＩＬ−１８ポリペプチドを精製すること
    を含む方法。
14. ポリペプチド前駆体から活性ＩＬ−１８ポリペプチドを製造するための方法であって、
    （ｉ）カスパーゼ４をＩＬ−１８ポリペプチド前駆体と二シストロン的に共発現させること；および、
    （ｉｉ）活性ＩＬ−１８ポリペプチドを精製すること
    を含む方法。
15. ＩＬ−１８ポリペプチド前駆体から活性ＩＬ−１８ポリペプチドを製造するための方法であって、
    （ｉ）カスパーゼ５をＩＬ−１８ポリペプチド前駆体と二シストロン的に共発現させること；および、
    （ｉｉ）活性ＩＬ−１８ポリペプチドを精製すること
    を含む方法。
16. ＩＬ−１８ポリペプチド前駆体がヒトのＩＬ−１８ポリペプチド前駆体である、請求項１３記載の方法。
17. ＩＬ−１８ポリペプチド前駆体がヒトのＩＬ−１８ポリペプチド前駆体である、請求項１４記載の方法。
18. ＩＬ−１８ポリペプチド前駆体がヒトのＩＬ−１８ポリペプチド前駆体である、請求項１５記載の方法。
19. 活性ヒトＩＬ−１８ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１６記載の方法。
20. 活性ヒトＩＬ−１８ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１７記載の方法。
21. 活性ヒトＩＬ−１８ポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１８記載の方法。
22. ヒトＩＬ−１８ポリペプチド前駆体から活性ヒトＩＬ−１８ポリペプチドを製造するための方法であって、
    （ｉ）ユビキチンを、配列番号１０のアミノ酸配列を有するユビキチン／ＩＬ−１８と二シストロン的に共発現させること；および、
    （ｉｉ）活性ヒトＩＬ−１８ポリペプチドを精製すること
    を含む方法。
23. ヒトのＩＬ−１８ポリペプチド前駆体から活性ヒトＩＬ−１８ポリペプチドを製造するための方法であって、
    （ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するカスパーゼ４を、ヒトのＩＬ−１８ポリペプチド前駆体と二シストロン的に共発現させること；および、
    （ｉｉ）活性ＩＬ−１８ポリペプチドを精製すること
    を含む方法。
24. ヒトのＩＬ−１８ポリペプチド前駆体から活性ヒトＩＬ−１８ポリペプチドを製造するための方法であって、
    （ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を有するカスパーゼ５を、ヒトのＩＬ−１８ポリペプチド前駆体と二シストロン的に共発現させること；および、
    （ｉｉ）活性ＩＬ−１８ポリペプチドを精製すること
    を含む方法。

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