CN115960244A - 重组α-1,3-半乳糖基转移酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种重组α‑1,3‑半乳糖基转移酶及其制备方法和应用。所述重组蛋白，为重组α‑1,3‑半乳糖基转移酶，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的α‑GT基因的序列，实现工程菌中表达后的蛋白质在细胞内实现较高浓度的聚集，但同时不发生与细胞膜的结合，这一特性有助于提高目标蛋白质在工程菌发酵过程中的产量，降低纯化过程中的操作难度，提高蛋白质纯度和活性。

Description

重组α-1,3-半乳糖基转移酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种重组α-1,3-半乳糖基转移酶及其制备方法和应用。

背景技术

动物细胞膜表面的蛋白质的免疫原性，除了受蛋白质本身的序列及空间结构的影响外，多种修饰蛋白质糖链也是引起蛋白质免疫原性的明显变化重要原因。根据前期研究证明，蛋白质经修饰α–gal表位(α-gal epitopes)后，该蛋白质被人体免疫细胞吞噬，抗原提呈及免疫应答的效率较未修饰状态的蛋白质有明显提高，该技术已经被用于利用自体肿瘤细胞制作治疗性疫苗的临床应用研究中。

正常人体细胞表面蛋白质不含α–gal表位修饰基团，利用α-1,3-半乳糖基转移酶即可在体外将细胞膜表面的蛋白质修饰形成α–gal表位修饰基团，用这种方法修饰肿瘤细胞，并制成治疗性疫苗，可以诱导机体免疫系统杀伤体内残存的远处转移的肿瘤细胞。该修饰反应需要使用α-1,3-半乳糖基转移酶，因此需要大量α-1,3-半乳糖基转移酶，利用基因工程构建α-GT高效表达菌株是最简单高效的解决办法。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种重组α-1,3-半乳糖基转移酶及其制备方法和应用。

本发明的第一方面提供一种重组蛋白，为重组α-1,3-半乳糖基转移酶，所述重组蛋白的的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二方面提供一种多核苷酸，其编码前述重组蛋白。

本发明第三方面提供一种表达载体，其含有前述多核苷酸。

本发明第四方面提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有前述表达载体或基因组中整合有外源的前述的多核苷酸。

本发明第五方面提供前述重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：

在合适的条件下培养前述宿主细胞，使之表达所述重组蛋白，而后分离及纯化获得所述重组蛋白。

本发明第六方面提供前述重组蛋白在制备肿瘤治疗产品中的用途。

本发明第七方面提供一种提高α-1,3-半乳糖基转移酶产量的方法，包括如下步骤：

1)对含有野生α-GT蛋白的基因组进行扩增，获得重组蛋白，所述重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)将6个组氨酸连接到所述重组蛋白的N端；

3)将步骤2)获得的产物插入到表达载体框架中；获得α-1,3-半乳糖基转移酶表达载体；

4)将α-1,3-半乳糖基转移酶表达载体导入到工程菌中进行表达。

本发明的有益效果为：本发明的α-GT基因的序列，实现工程菌中表达后的蛋白质在细胞内实现较高浓度的聚集，但同时不发生与细胞膜的结合，这一特性有助于提高目标蛋白质在工程菌发酵过程中的产量，降低纯化过程中的操作难度，提高蛋白质纯度和活性。本发明的重组蛋白为α-GT基因剪切特定部位后获得，既能消除目标蛋白质跨膜段，将原先的膜结合蛋白变成可溶性蛋白，但同时又不影响该酶的空间结构和催化活性。构建酵母表达系统，采用含有“醛氧化酶加压表达系统”的表达元件，在蛋白质表达完成时在特定的位点剪切氨基酸链，在细胞内形成可溶性的表达产物，可明显提高目标蛋白质的表达量。采用特定蛋白纯化工艺，提高蛋白质纯化回收效率。

本发明通过比较不同基因位点剪切α-GT基因序列后构建的表达系统对目标目标蛋白的表达效率，确定最终表达的目标蛋白的基因序列。1、通过对比全基因序列的GT蛋白表达效率和本方法切除蛋白质跨膜段序列，可知，本申请的序列可以有效提高蛋白质的表达量，但同时不影响该酶的空间结构和生物学活性。2、以该基因序列构建的表达系统，最终的蛋白质以可溶的形式积聚在酵母细胞内(部分蛋白质以可溶形式分泌如培养上清)，在纯化过程中可以不需要将蛋白质进行变性和复性，简化蛋白纯化操作，最大程度保留酶的生物活性；3、结合表达系统构建和扩增、纯化工艺的改进，可明显提高目标蛋白质的产量，由通常每升培养物微克(ug)级的产品提高为毫克(mg)级的产量。酶的活性也得到最大程度的保留，达到SIGMA产品同类催化糖酐转移的酶(如β-1,4-半乳糖基转移酶)一致的活性。

附图说明

图1为离子交换层析Hitrap Q纯化图谱。

图2为对分子筛纯化后蛋白样品进行SDS-PAGE检测的结果(其中，1为离子交换Q2；2为离子交换Q3；3为离子交换Q4,；4为离子交换Q5；M为Marker)。

图3为将带有6XHIS序列的α-GT基因序列加入酵母pPIC-Z-Aα载体后获得的表达载体。

图4不同方法诱导的CIK细胞杀伤A549细胞的效率。

图5alpha-gal修饰的肿瘤细胞疫苗诱导特异性杀伤作用。

具体实施方式

鉴于对α-1,3-半乳糖基转移酶表达和纯化过程中上述情况的考虑，根据毕赤酵母对外源性蛋白的表达系统的特性，对大鼠血细胞来源的α-GT基因序列进行优化，筛选到确保最高表达、纯化效率以及酶活性的最合适的基因序列，通过大肠杆菌质粒扩增，连接纯化所需的特殊亲和吸附的氨基酸序列基因，再进一步构建可以在毕赤酵母中表达目标蛋白质的载体，实现在酵母细胞中高表达和高效纯化。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

本发明一实施例提供一种重组蛋白，为重组α-1,3-半乳糖基转移酶，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。具体的，为：

MASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWIHNYQQEEEDTDKEKGREEEQRKEDDTTELRLWDWFNPKKRPEVVTVTKWKAPVVWEGTYNKAILEHYYAKQKITVGLTVFAIGRYIEHYLEEFVTSANRYFMVGHKVIFYVMVDDVSKVPFIELGPLRSFKVFEVKPEKRWQDISMMRMKTIGEHILAHIQHEVDFLFCMDVDQVFQDHFGVETLGQSVAQLQAWWYKADPDDFTYERRKESAAYIPFGQGDFYYHAAIFGGTPIQVLNITQECFKGILLDKKNDIEAEWHDESHLNKYFLLNKPSKILSPEYCWDYHIGLPSDIKTVKLSWQTKEYNLVRKNV*

核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。具体的，为：

ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCTGTACGACGATGACGATAAGGATCGATGGATCCACAATTATCAACAAGAGGAAGAAGACACAGACAAAGAAAAAGGAAGAGAGGAGGAACAAAGAAAGGAAGATGACACAACAGAGCTTCGGCTATGGGACTGGTTTAATCCAAAGAAACGCCCAGAGGTTGTGACAGTGACCAAATGGAAGGCGCCGGTTGTGTGGGAAGGCACTTACAACAAAGCCATCCTAGAACATTATTATGCCAAACAGAAAATTACCGTGGGGTTGACGGTTTTTGCTATTGGAAGATATATTGAGCATTACTTGGAGGAGTTCGTAACATCTGCTAATAGGTACTTCATGGTTGGCCACAAAGTCATATTTTATGTCATGGTGGATGATGTCTCCAAGGTGCCATTTATAGAGCTGGGTCCTCTGCGTTCCTTCAAAGTGTTTGAGGTCAAGCCAGAGAAGAGGTGGCAAGACATCAGCATGATGCGTATGAAGACCATCGGGGAGCACATCTTGGCCCACATCCAACACGAGGTTGACTTCCTCTTCTGCATGGATGTGGACCAGGTCTTCCAAGACCATTTTGGGGTGGAGACCCTGGGCCAGTCGGTGGCTCAGCTACAGGCCTGGTGGTACAAGGCAGATCCTGATGACTTTACTTATGAGAGGCGAAAAGAGTCGGCAGCATATATTCCATTTGGCCAGGGGGATTTTTATTACCATGCAGCCATTTTTGGAGGAACACCCATTCAGGTTCTCAACATCACCCAGGAGTGCTTTAAGGGAATCCTCCTGGACAAGAAAAATGACATAGAAGCTGAGTGGCATGATGAAAGCCACCTAAACAAGTATTTCCTTCTCAACAAACCCTCTAAAATCTTATCTCCAGAATACTGCTGGGATTATCATATAGGCCTGCCTTCAGATATTAAAACTGTCAAGCTATCATGGCAAACAAAAGAGTATAATTTGGTTAGAAAGAATGTCTGAT。

正常情况下，α-GT广泛存在于进化中位于猿以前的哺乳动物细胞膜上，人体细胞并不含有α-GT及其基因。另外，α-GT本身是一个膜蛋白，正常细胞中该酶的一段氨基酸序列插入细胞膜中，起到将该酶固定于膜上的作用，并不参与酶催化半乳糖基团转移的化学反应。因此，可以将部分在实际催化反应中该酶的活性部位以基因工程方法表达纯化，以提高蛋白表达和催化反应的效率。

本发明通过剪辑α-GT基因的序列，实现工程菌中表达后的蛋白质在细胞内实现较高浓度的聚集，但同时不发生与细胞膜的结合，这一特性有助于提高目标蛋白质在工程菌发酵过程中的产量，降低纯化过程中的操作难度，提高蛋白质纯度和活性。

具体的，

哺乳动物细胞中α-GT全基因序列(野生α-GT序列)(SEQ ID NO：3)：

ATGAATGTCAAAGGAAAAGTAATTCTGTCGATGCTGGTTGTCTCAACTGTGATTGTTGTGTTTTGGGAATATATCAACAGCCCAGAAGGCTCTTTCTTGTGGATATATCACTCAAAGAACCCAGAAGTTGATGACAGCAGTGCTCAGAAGGACTGGTGGTTTCCTGGCTGGTTTAACAATGGGATCCACAATTATCAACAAGAGGAAGAAGACACAGACAAAGAAAAAGGAAGAGAGGAGGAACAAAAAAAGGAAGATGACACAACAGAGCTTCGGCTATGGGACTGGTTTAATCCAAAGAAACGCCCAGAGGTTATGACAGTGACCCAATGGAAGGCGCCGGTTGTGTGGGAAGGCACTTACAACAAAGCCATCCTAGAAAATTATTATGCCAAACAGAAAATTACCGTGGGGTTGACGGTTTTTGCTATTGGAAGATATATTGAGCATTACTTGGAGGAGTTCGTAACATCTGCTAATAGGTACTTCATGGTCGGCCACAAAGTCATATTTTATGTCATGGTGGATGATGTCTCCAAGGCGCCGTTTATAGAGCTGGGTCCTCTGCGTTCCTTCAAAGTGTTTGAGGTCAAGCCAGAGAAGAGGTGGCAAGACATCAGCATGATGCGTATGAAGACCATCGGGGAGCACATCTTGGCCCACATCCAACACGAGGTTGACTTCCTCTTCTGCATGGATGTGGACCAGGTCTTCCAAGACCATTTTGGGGTAGAGACCCTGGGCCAGTCGGTGGCTCAGCTACAGGCCTGGTGGTACAAGGCAGATCCTGATGACTTTACCTATGAGAGGCGGAAAGAGTCGGCAGCATATATTCCATTTGGCCAGGGGGATTTTTATTACCATGCAGCCATTTTTGGAGGAACACCGATTCAGGTTCTCAACATCACCCAGGAGTGCTTTAAGGGAATCCTCCTGGACAAGAAAAATGACATAGAAGCCGAGTGGCATGATGAAAGCCACCTAAACAAGTATTTCCTTCTCAACAAACCCTCTAAAATCTTATCTCCAGAATACTGCTGGGATTATCATATAGGCCTGCCTTCAGATATTAAAACTGTCAAGCTATCATGGCAAACAAAAGAGTATAATTTGGTTAGAAAGAATGTCTGA。(画线部分为跨膜区域序列)。

进一步的，所述重组蛋白N端还连接有组氨酸。

进一步的，所述重组蛋白N端组氨酸的数量为6个。

进一步的，所述所述重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。具体为：

CATCATCATCATCATCATATGAATGTCAAAGGAAAAGAATATATCAACAGCCCAGAAGGCTCTTTCTTGTGGATATATCACTCAAAGAACCCAGAAGTTGATGACAGCAGTGCTCAGAAGGACTGGTGGTTTCCTGGCTGGTTTAACAATGGGATCCACAATTATCAACAAGAGGAAGAAGACACAGACAAAGAAAAAGGAAGAGAGGAGGAACAAAAAAAGGAAGATGACACAACAGAGCTTCGGCTATGGGACTGGTTTAATCCAAAGAAACGCCCAGAGGTTATGACAGTGACCCAATGGAAGGCGCCGGTTGTGTGGGAAGGCACTTACAACAAAGCCATCCTAGAAAATTATTATGCCAAACAGAAAATTACCGTGGGGTTGACGGTTTTTGCTATTGGAAGATATATTGAGCATTACTTGGAGGAGTTCGTAACATCTGCTAATAGGTACTTCATGGTCGGCCACAAAGTCATATTTTATGTCATGGTGGATGATGTCTCCAAGGCGCCGTTTATAGAGCTGGGTCCTCTGCGTTCCTTCAAAGTGTTTGAGGTCAAGCCAGAGAAGAGGTGGCAAGACATCAGCATGATGCGTATGAAGACCATCGGGGAGCACATCTTGGCCCACATCCAACACGAGGTTGACTTCCTCTTCTGCATGGATGTGGACCAGGTCTTCCAAGACCATTTTGGGGTAGAGACCCTGGGCCAGTCGGTGGCTCAGCTACAGGCCTGGTGGTACAAGGCAGATCCTGATGACTTTACCTATGAGAGGCGGAAAGAGTCGGCAGCATATATTCCATTTGGCCAGGGGGATTTTTATTACCATGCAGCCATTTTTGGAGGAACACCGATTCAGGTTCTCAACATCACCCAGGAGTGCTTTAAGGGAATCCTCCTGGACAAGAAAAATGACATAGAAGCCGAGTGGCATGATGAAAGCCACCTAAACAAGTATTTCCTTCTCAACAAACCCTCTAAAATCTTATCTCCAGAATACTGCTGGGATTATCATATAGGCCTGCCTTCAGATATTAAAACTGTCAAGCTATCATGGCAAACAAAAGAGTATAATTTGGTTAGAAAGAATGTCTGA。

表达后的蛋白质需要有特殊的氨基酸序列作为纯化时是吸附的位点，本操作中将表达连续6个组氨酸序列(HIS-HIS-HIS-HIS-HIS-HIS-)的基因连入α-GT表达系统的序列中，表达的α-GT在N端出现6个连续的组氨酸，形成一个特殊的空间结构，可以被固定在树脂上的镍离子(Ni2+)所吸附，这样目标蛋白质就被固定在树脂上，其他不需要的蛋白质就被洗掉，待杂蛋白被清洗掉后，再用洗脱液将目标蛋白与镍离子分离，这样就达到纯化的目的。可以被含有镍离子的树脂吸附，以达到从工程菌菌体破碎蛋白粗品中分离纯化得到α-GT酶蛋白。

可选的，所述重组蛋白还包括酶切位点，如EcoR I酶切位点、XbaI酶切位点。

本发明一实施例提供一种多核苷酸，其编码前述重组蛋白。

本发明一实施例提供一种表达载体，其含有前述多核苷酸。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述表达载体。这些方法包括重组DNA技术、DNA合成技术等。可将编码所述重组蛋白的多核苷酸有效连接到载体中的多克隆位点上，以指导mRNA合成进而表达蛋白，或者用于同源重组。

优选的，所述表达载体包括起始信号元件AOX。

在一种实施方式中，所述表达载体包括前述多核苷酸和表达载体框架，所述表达载体框架选自酵母pPIC Z-Aα表达载体框架。

本发明一实施例提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有前述表达载体或基因组中整合有外源的前述的多核苷酸。

宿主细胞优选为酵母细胞。本方法采用的载体，只能适合在酵母中表达，可以有不同类型的酵母作为候选，但其他宿主如大肠杆菌、植物细胞、昆虫细胞等，不适合用于这一表达系统和工艺方法所规定的蛋白表达纯化流程。

在一种优选的实施方式中，所述宿主细胞为毕赤酵母X-33工程菌和/或毕赤酵母GS-115工程菌。

本发明一实施例提供前述重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：

在合适的条件下培养前述宿主细胞，使之表达所述重组蛋白，而后分离及纯化获得所述重组蛋白。

本发明一实施例提供前述的重组蛋白在制备肿瘤治疗产品中的用途。

本发明一实施例提供一种提高α-1,3-半乳糖基转移酶产量的方法，包括如下步骤：

1)对含有野生α-GT蛋白的基因组进行扩增，获得重组蛋白，所述重组蛋白的的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)将6个组氨酸连接到所述重组蛋白的N端；

3)将步骤2)获得的产物插入到表达载体框架中；获得α-1,3-半乳糖基转移酶表达载体；

4)将α-1,3-半乳糖基转移酶表达载体导入到工程菌中进行表达。

所述野生α-GT蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

步骤3)中，所述表达载体框架选自酵母pPIC Z-Aα表达载体框架。

步骤4)中，所述工程菌选自毕赤酵母X-33工程菌和/或毕赤酵母GS-115工程菌。

实施例1

1、获得重组α-1,3-半乳糖基转移酶序列：从猴肾上皮细胞NZP-60细胞中扩增，扩增引物为

GT-F:GATCCACAATTATCAACAAGAGGAAGAAGAC(SEQ ID NO：4)

GT-R:ATGCAAGCTTCTAGATCAGACATTCTTTCTAACCAAATTATACTCTTTTG(SEQ ID NO：5)。

放弃N端约50个核苷酸的序列，该部分序列为α-GT蛋白穿膜部分序列的基因，实际反应中主要起到将酶蛋白固定于细胞膜的作用，并不参与实际的半乳糖基转移和连接反应的催化活性，故在构建α-GT表达系统时放弃该部分序列。正常情况下，带有全长序列的α-1,3-半乳糖基转移酶正常表达后是一种膜蛋白，为一种类似蘑菇样的结构，部分(即蘑菇柄)插入细胞膜中，而蘑菇头部分是该蛋白具有催化活性的部分。要了解那些是属于插入细胞膜部分，可以通过分析表达后的蛋白质氨基酸序列亲水或疏水特性的区域来确定。本方法切除该酶插入细胞膜部分的序列主要为了达到两个目的，一是可以使得表达后的酶成为游离状态而不是与细胞膜结合，可以提高分离纯化的效率，二是切除这一序列不影响酶具有催化活性部分的空间结构，反而有利于提高反应中的催化效率。

2、在大肠杆菌中扩增及连接纯化所需氨基酸序列：表达后的蛋白质需要有特殊的氨基酸序列作为纯化是吸附的位点，本操作中将表达连续6个组氨酸序列(HIS-HIS-HIS-HIS-HIS-HIS-)的基因连入α-GT表达系统的序列中，表达的α-GT在N端出现6个连续的组氨酸，可以被含有镍离子的树脂吸附，以达到从工程菌菌体破碎蛋白粗品中分离纯化得到α-GT酶蛋白。

从NZP-60细胞中扩增出去除跨膜片段序列，插入大肠杆菌pRSET-C载体，在N端加上6XHIS序列(6XHIS序列来自pRSET-C载体)的α-GT序列(SEQ ID NO：6)：

(其中，加粗字体的序列为EcoR I，画直线部分为6XHIS，画曲线部分为

TGA是蛋白质表达基因序列中的终止信号，不代表任何一个氨基酸，核糖体翻译时达到这个终止信号的位置时，没有任何一个氨基酸可以连接到之前的氨基酸链上去，蛋白质合成的反应就自动终止，蛋白质氨基酸链停止延长，结束反应。)

3、在酵母中高效表达的表达系统：将连有6X组氨酸和α-GT基因的序列在大肠杆菌质粒中扩增，通过纯化、酶切、回收该部分序列，再连入酵母pPIC Z-Aα表达系统中。通过电击转染将pPIC Z-Aα质粒导入毕赤酵母X-33、GS-115等工程菌中。

4、pPIC Z-Aα表达系统中，醇氧化酶(AOX)与Zeocin抗性基因共同表达，因此Zeocin抗性表达高的菌株亦为AOX高表达菌株。每种菌株挑取52个以含不同浓度Zeocin的琼脂平板筛选到AOX高表达菌株。

5、酵母工程菌大规模扩增、加压表达外源性蛋白：筛选得到的α-GT高表达菌株，于BMMY培养基中扩增。培养24小时后，每隔8小时添加2％体积的甲醇。因α-GT酶表达元件与醇氧化酶(AOX)表达元件共用启动子，添加甲醇诱导AOX增加表达同时亦可带动α-GT表达量增加。

6、利用高压液压破碎系统粉碎胞体：酵母菌体培养扩增达到预定时间后，离心收获菌体，以纯水洗涤酵母菌体2次，以蛋白纯化吸附缓冲液重悬菌体，高压破碎器以1000-1200个大气压的压强反复对菌体悬液加压，破碎菌体后高速离心祛除沉淀，获得外源性重组蛋白粗品。

7、含有重组蛋白质的吸附缓冲液经过含Ni²⁺的树脂固相层析柱，含有6XHIS(HIS-HIS-HIS-HIS-HIS-HIS-)氨基酸序列的重组蛋白大部分被吸附在固相上。以洗涤缓冲液洗涤固相柱，清除大部分非特异性结合其他蛋白质，以洗脱缓冲液从固相树脂上洗脱重组蛋白质。洗脱蛋白再经过分子筛树脂柱，按照分子量大小分离洗脱液中的非特异性结合收获的蛋白质，获得纯度更高的重组蛋白。

8、采用本方法获取的重组蛋白的主要作用是催化一个半乳糖基基团连接到蛋白质糖链末端，形成α-Gal表位:

α1,3GT

UDP-Gal+Galβ-1,4-GlcNAc-R———————→Galα-1,3-Galβ-1,4-GlucNAc-R+UDP

该反应中每生成一分子α-Gal表位产物，即消耗一分子UDP-Gal分子。因此，通过检测单位时间内UDP-Gal的消耗量，结合酶蛋白量，即可计算单位蛋白量的催化活性。准备上述含α-GT和UDP-Gal的反应体系，分成60管，每管50ul，在37C水浴中孵育，每隔60秒钟取2管至于65C金属浴中加热使α-GT失活以终止反应。所有样品终止反应后，以质谱仪检测各样品中UDP-Gal的浓度，以样品中UDP-Gal的减少量换算成单位时间内单位酶蛋白量催化生成的α-Gal表位的数量，计算酶活力单位。经上述方法实验后，计算得到α-GT酶活性约为4600units/mg protein，高于类似产品β-GT(MERCK SAE0093)的活性(2000units/mgprotein)。

经上述处理后，结果如图1和图2所示，最终测定蛋白纯化达到每升菌液收获目标蛋白4.7mg，经电泳纯度检验确定纯度达到96％，催化活性达到4600IU/mg。本方法表达系统及纯化工艺下，α-GT蛋白产量达到每升菌液最终收获纯化蛋白4.7mg，实验中实际表达量最高可达到每升培养物含粗品可大于10mg。上述数据明显高于一般酵母重组蛋白表达纯化的效率和同类商品化糖苷转移酶的催化活性。提示上述蛋白质表达和纯化过程对蛋白质的提高表达、收获效率和催化活性的保留与确切的效果。

实施例2以α–gal修饰的肿瘤细胞疫苗诱导DC-CIK杀伤体内残余肿瘤细胞的体外实验研究

实验方法：

1、不同肿瘤细胞(黑色素细胞瘤A375细胞株、肺癌细胞株A549)以α–GT和UDP-gal反应，在肿瘤细胞表面的抗原蛋白修饰上SEQ NO:1所述的α–gal侧链

2、将修饰后的肿瘤细胞和未修饰的肿瘤细胞以超声粉碎仪器破碎制成细胞裂解物，分别获得修饰的黑色素细胞瘤A375细胞疫苗裂解物、修饰的肺癌细胞A549疫苗裂解物、未修饰的黑色素细胞瘤A375细胞疫苗裂解物、未修饰的肺癌细胞A549疫苗裂解物

3、抽取健康人外周静脉血，密度离心分离法获取其中的单个核细胞(PBMC)

4、PBMC在6孔培养板+完全培养液(RPMD1640+10％胎牛血清+白介素-2)中静置6小时，将悬浮部分细胞(CIK)和贴壁部分细胞(DC)在不同容器中继续培养

5、修饰的黑色素细胞瘤A375细胞疫苗裂解物、修饰的肺癌细胞A549疫苗裂解物、未修饰的黑色素细胞瘤A375细胞疫苗裂解物、未修饰的肺癌细胞A549疫苗裂解物加入不同的DC培养孔中，混合培养2天

6、将步骤5中经不同疫苗裂解物刺激的DC加入CIK中，继续培养1周

7、不同组CIK做杀伤肿瘤细胞的杀伤实验(利用BioLegend公司生产的LDH-CytoxAssay Kit，Biolegend Cat No 426401，进行实验，实验方法参照试剂盒说明书；两种细胞混合在一起，计数目标就可以计算出杀伤效率。在单位时间内够有多少比例的目标细胞被杀死，就可以计算出要检测的细胞的杀伤效率。阳性对照是就是指目标细胞全部被杀死时结果数值，最大值是4，其他细胞的杀伤效率可以通过跟阳性细胞比较得到结果)，对比修饰和未修饰肿瘤疫苗诱导DC后刺激CIK对同种肿瘤细胞和不同肿瘤细胞的杀伤作用。实验结果：

1、如图4所示，实验室数据提示：同一种肿瘤细胞疫苗，与未修饰肿瘤细胞疫苗修饰刺激DC后诱导产生的CIK相比，经α–gal修饰后的肿瘤细胞疫苗能够诱导的CIK对肿瘤细胞的杀伤效率有所增强，效率提高约40％左右。即：经α–gal修饰的A549细胞制成的肿瘤细胞疫苗裂解物，诱导DC后产生的CIK，杀伤未经修饰的A549细胞的效率，比同样方法用未经修饰的肿瘤细胞疫苗诱导DC后刺激的CIK杀伤A549细胞的效率提高约40％。

2、如图5所示，以某一种肿瘤细胞株修饰后的疫苗诱导DC刺激CIK，其杀伤同种肿瘤细胞的效率，比杀伤不同种类肿瘤细胞的效率提高约30％。即：经α–gal修饰的A549细胞制成的肿瘤细胞疫苗裂解物，诱导DC后产生的CIK，杀伤未经修饰的A549细胞的效率，比杀伤未经修饰的A375细胞的效率高约30％。同理，经α–gal修饰的A375细胞制成的肿瘤细胞疫苗裂解物，诱导DC后产生的CIK，杀伤未经修饰的A375细胞的效率，比同样方法制备的CIK杀伤A549细胞的效率高约30％左右。

实验结论：

1、同种肿瘤细胞株，经α–gal修饰后的细胞制成的疫苗，诱导DC所产生的CIK，对同种肿瘤细胞的杀伤效率有所增强，提示α–gal修饰可以实现增强肿瘤细胞表面肿瘤特异性抗原免疫原性的作用

2、以α–gal修饰的肿瘤细胞制成疫苗，诱导DC-CIK系统对肿瘤细胞的杀伤左右具有肿瘤类型特异性，即：修饰后的黑色素瘤疫苗诱导产生的CIK，对黑色素瘤细胞的杀伤作用，明显高于对其他类型肿瘤细胞的杀伤效率。这一实验结果是用自体肿瘤组织制成α–gal修饰后的全细胞疫苗，作为治疗体内残余肿瘤的手段的理论基础，是使用自体肿瘤组织具有采用其他肿瘤细胞株作为疫苗更高效率的实验依据。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 上海鸣大生物科技有限公司

<120> 重组α-1,3-半乳糖基转移酶及其制备方法和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 338

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp

1               5                   10                  15

Asp Asp Asp Lys Asp Arg Trp Ile His Asn Tyr Gln Gln Glu Glu Glu

            20                  25                  30

Asp Thr Asp Lys Glu Lys Gly Arg Glu Glu Glu Gln Arg Lys Glu Asp

        35                  40                  45

Asp Thr Thr Glu Leu Arg Leu Trp Asp Trp Phe Asn Pro Lys Lys Arg

    50                  55                  60

Pro Glu Val Val Thr Val Thr Lys Trp Lys Ala Pro Val Val Trp Glu

65                  70                  75                  80

Gly Thr Tyr Asn Lys Ala Ile Leu Glu His Tyr Tyr Ala Lys Gln Lys

                85                  90                  95

Ile Thr Val Gly Leu Thr Val Phe Ala Ile Gly Arg Tyr Ile Glu His

            100                 105                 110

Tyr Leu Glu Glu Phe Val Thr Ser Ala Asn Arg Tyr Phe Met Val Gly

        115                 120                 125

His Lys Val Ile Phe Tyr Val Met Val Asp Asp Val Ser Lys Val Pro

    130                 135                 140

Phe Ile Glu Leu Gly Pro Leu Arg Ser Phe Lys Val Phe Glu Val Lys

145                 150                 155                 160

Pro Glu Lys Arg Trp Gln Asp Ile Ser Met Met Arg Met Lys Thr Ile

                165                 170                 175

Gly Glu His Ile Leu Ala His Ile Gln His Glu Val Asp Phe Leu Phe

            180                 185                 190

Cys Met Asp Val Asp Gln Val Phe Gln Asp His Phe Gly Val Glu Thr

        195                 200                 205

Leu Gly Gln Ser Val Ala Gln Leu Gln Ala Trp Trp Tyr Lys Ala Asp

    210                 215                 220

Pro Asp Asp Phe Thr Tyr Glu Arg Arg Lys Glu Ser Ala Ala Tyr Ile

225                 230                 235                 240

Pro Phe Gly Gln Gly Asp Phe Tyr Tyr His Ala Ala Ile Phe Gly Gly

                245                 250                 255

Thr Pro Ile Gln Val Leu Asn Ile Thr Gln Glu Cys Phe Lys Gly Ile

            260                 265                 270

Leu Leu Asp Lys Lys Asn Asp Ile Glu Ala Glu Trp His Asp Glu Ser

        275                 280                 285

His Leu Asn Lys Tyr Phe Leu Leu Asn Lys Pro Ser Lys Ile Leu Ser

    290                 295                 300

Pro Glu Tyr Cys Trp Asp Tyr His Ile Gly Leu Pro Ser Asp Ile Lys

305                 310                 315                 320

Thr Val Lys Leu Ser Trp Gln Thr Lys Glu Tyr Asn Leu Val Arg Lys

                325                 330                 335

Asn Val

<210> 2

<211> 1101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catcatcatc atcatcatat gaatgtcaaa ggaaaagaat atatcaacag cccagaaggc 60

tctttcttgt ggatatatca ctcaaagaac ccagaagttg atgacagcag tgctcagaag 120

gactggtggt ttcctggctg gtttaacaat gggatccaca attatcaaca agaggaagaa 180

gacacagaca aagaaaaagg aagagaggag gaacaaaaaa aggaagatga cacaacagag 240

cttcggctat gggactggtt taatccaaag aaacgcccag aggttatgac agtgacccaa 300

tggaaggcgc cggttgtgtg ggaaggcact tacaacaaag ccatcctaga aaattattat 360

gccaaacaga aaattaccgt ggggttgacg gtttttgcta ttggaagata tattgagcat 420

tacttggagg agttcgtaac atctgctaat aggtacttca tggtcggcca caaagtcata 480

ttttatgtca tggtggatga tgtctccaag gcgccgttta tagagctggg tcctctgcgt 540

tccttcaaag tgtttgaggt caagccagag aagaggtggc aagacatcag catgatgcgt 600

atgaagacca tcggggagca catcttggcc cacatccaac acgaggttga cttcctcttc 660

tgcatggatg tggaccaggt cttccaagac cattttgggg tagagaccct gggccagtcg 720

gtggctcagc tacaggcctg gtggtacaag gcagatcctg atgactttac ctatgagagg 780

cggaaagagt cggcagcata tattccattt ggccaggggg atttttatta ccatgcagcc 840

atttttggag gaacaccgat tcaggttctc aacatcaccc aggagtgctt taagggaatc 900

ctcctggaca agaaaaatga catagaagcc gagtggcatg atgaaagcca cctaaacaag 960

tatttccttc tcaacaaacc ctctaaaatc ttatctccag aatactgctg ggattatcat 1020

ataggcctgc cttcagatat taaaactgtc aagctatcat ggcaaacaaa agagtataat 1080

ttggttagaa agaatgtctg a 1101

<210> 3

<211> 1131

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaatgtca aaggaaaagt aattctgtcg atgctggttg tctcaactgt gattgttgtg 60

ttttgggaat atatcaacag cccagaaggc tctttcttgt ggatatatca ctcaaagaac 120

ccagaagttg atgacagcag tgctcagaag gactggtggt ttcctggctg gtttaacaat 180

gggatccaca attatcaaca agaggaagaa gacacagaca aagaaaaagg aagagaggag 240

gaacaaaaaa aggaagatga cacaacagag cttcggctat gggactggtt taatccaaag 300

aaacgcccag aggttatgac agtgacccaa tggaaggcgc cggttgtgtg ggaaggcact 360

tacaacaaag ccatcctaga aaattattat gccaaacaga aaattaccgt ggggttgacg 420

gtttttgcta ttggaagata tattgagcat tacttggagg agttcgtaac atctgctaat 480

aggtacttca tggtcggcca caaagtcata ttttatgtca tggtggatga tgtctccaag 540

gcgccgttta tagagctggg tcctctgcgt tccttcaaag tgtttgaggt caagccagag 600

aagaggtggc aagacatcag catgatgcgt atgaagacca tcggggagca catcttggcc 660

cacatccaac acgaggttga cttcctcttc tgcatggatg tggaccaggt cttccaagac 720

cattttgggg tagagaccct gggccagtcg gtggctcagc tacaggcctg gtggtacaag 780

gcagatcctg atgactttac ctatgagagg cggaaagagt cggcagcata tattccattt 840

ggccaggggg atttttatta ccatgcagcc atttttggag gaacaccgat tcaggttctc 900

aacatcaccc aggagtgctt taagggaatc ctcctggaca agaaaaatga catagaagcc 960

gagtggcatg atgaaagcca cctaaacaag tatttccttc tcaacaaacc ctctaaaatc 1020

ttatctccag aatactgctg ggattatcat ataggcctgc cttcagatat taaaactgtc 1080

aagctatcat ggcaaacaaa agagtataat ttggttagaa agaatgtctg a 1131

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatccacaat tatcaacaag aggaagaaga c 31

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgcaagctt ctagatcaga cattctttct aaccaaatta tactcttttg 50

<210> 6

<211> 1057

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aattgaattc catcatcatc atcatcatgg tatggctagc atgactggtg gacagcaaat 60

gggtcgggat ctgtacgacg atgacgataa ggatcgatgg atccacaatt atcaacaaga 120

ggaagaagac acagacaaag aaaaaggaag agaggaggaa caaagaaagg aagatgacac 180

aacagagctt cggctatggg actggtttaa tccaaagaaa cgcccagagg ttgtgacagt 240

gaccaaatgg aaggcgccgg ttgtgtggga aggcacttac aacaaagcca tcctagaaca 300

ttattatgcc aaacagaaaa ttaccgtggg gttgacggtt tttgctattg gaagatatat 360

tgagcattac ttggaggagt tcgtaacatc tgctaatagg tacttcatgg ttggccacaa 420

agtcatattt tatgtcatgg tggatgatgt ctccaaggtg ccatttatag agctgggtcc 480

tctgcgttcc ttcaaagtgt ttgaggtcaa gccagagaag aggtggcaag acatcagcat 540

gatgcgtatg aagaccatcg gggagcacat cttggcccac atccaacacg aggttgactt 600

cctcttctgc atggatgtgg accaggtctt ccaagaccat tttggggtgg agaccctggg 660

ccagtcggtg gctcagctac aggcctggtg gtacaaggca gatcctgatg actttactta 720

tgagaggcga aaagagtcgg cagcatatat tccatttggc cagggggatt tttattacca 780

tgcagccatt tttggaggaa cacccattca ggttctcaac atcacccagg agtgctttaa 840

gggaatcctc ctggacaaga aaaatgacat agaagctgag tggcatgatg aaagccacct 900

aaacaagtat ttccttctca acaaaccctc taaaatctta tctccagaat actgctggga 960

ttatcatata ggcctgcctt cagatattaa aactgtcaag ctatcatggc aaacaaaaga 1020

gtataatttg gttagaaaga atgtctgatc tagaaca 1057

<210> 7

<211> 1018

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgggatc tgtacgacga tgacgataag 60

gatcgatgga tccacaatta tcaacaagag gaagaagaca cagacaaaga aaaaggaaga 120

gaggaggaac aaagaaagga agatgacaca acagagcttc ggctatggga ctggtttaat 180

ccaaagaaac gcccagaggt tgtgacagtg accaaatgga aggcgccggt tgtgtgggaa 240

ggcacttaca acaaagccat cctagaacat tattatgcca aacagaaaat taccgtgggg 300

ttgacggttt ttgctattgg aagatatatt gagcattact tggaggagtt cgtaacatct 360

gctaataggt acttcatggt tggccacaaa gtcatatttt atgtcatggt ggatgatgtc 420

tccaaggtgc catttataga gctgggtcct ctgcgttcct tcaaagtgtt tgaggtcaag 480

ccagagaaga ggtggcaaga catcagcatg atgcgtatga agaccatcgg ggagcacatc 540

ttggcccaca tccaacacga ggttgacttc ctcttctgca tggatgtgga ccaggtcttc 600

caagaccatt ttggggtgga gaccctgggc cagtcggtgg ctcagctaca ggcctggtgg 660

tacaaggcag atcctgatga ctttacttat gagaggcgaa aagagtcggc agcatatatt 720

ccatttggcc agggggattt ttattaccat gcagccattt ttggaggaac acccattcag 780

gttctcaaca tcacccagga gtgctttaag ggaatcctcc tggacaagaa aaatgacata 840

gaagctgagt ggcatgatga aagccaccta aacaagtatt tccttctcaa caaaccctct 900

aaaatcttat ctccagaata ctgctgggat tatcatatag gcctgccttc agatattaaa 960

actgtcaagc tatcatggca aacaaaagag tataatttgg ttagaaagaa tgtctgat 1018

Claims (12)

1.一种重组蛋白，为重组α-1,3-半乳糖基转移酶，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白N端还连接有组氨酸。

3.如权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白N端组氨酸的数量为6个。

4.如权利要求3所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

5.一种多核苷酸，其编码权利要求1-4任一权利要求所述重组蛋白。

6.一种表达载体，其含有权利要求5所述多核苷酸。

7.如权利要求6所述的表达载体，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

1)所述表达载体包括起始信号元件AOX；

2)所述表达载体包括权利要求5所述多核苷酸和表达载体框架，所述表达载体框架选自酵母pPIC Z-Aα表达载体框架。

8.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如权利要求6-7任一所述表达载体或基因组中整合有外源的如权利要求5所述的多核苷酸。

9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母X-33工程菌和/或毕赤酵母GS-115工程菌。

10.如权利要求1-4任一所述重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

在合适的条件下培养如权利要求8所述宿主细胞，使之表达所述重组蛋白，而后分离及纯化获得所述重组蛋白。

11.权利要求1-4任一所述的重组蛋白在制备肿瘤治疗产品中的用途。

12.一种提高α-1,3-半乳糖基转移酶产量的方法，包括如下步骤：

1)对含有野生α-GT蛋白的基因组进行扩增，获得重组蛋白，所述重组蛋白的的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)将6个组氨酸连接到所述重组蛋白的N端；

3)将步骤2)获得的产物插入到表达载体框架中；获得α-1,3-半乳糖基转移酶表达载体；

4)将α-1,3-半乳糖基转移酶表达载体导入到工程菌中进行表达。

Images