CN108265042A

CN108265042A - 一种重组肠激酶的制备方法

Info

Publication number: CN108265042A
Application number: CN201611258115.6A
Authority: CN
Inventors: 文良柱; 赵珊珊; 胡婷; 刘慧萍
Original assignee: Jiangsu Wan Biochemical Pharmaceutical Refco Group Ltd; Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Wan Biochemical Pharmaceutical Refco Group Ltd; Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2016-12-30
Publication date: 2018-07-10

Abstract

本发明提供了一种制备重组肠激酶的方法，该方法包括：（1）重组表达融合蛋白，所述融合蛋白序列从N端到C端依次包括：100‑250个氨基酸序列、肠激酶序列；（2）切除融合蛋白N端所述的100‑250个氨基酸序列获得重组肠激酶，所述重组肠激酶的氨基酸序列为Seq ID No.1，核苷酸序列为Seq ID No.4。本发明所述方法制备工艺简单、成本低，无需经过变性和复性，并且纯化步骤简单方便制备的重组肠激酶活性高。

Description

一种重组肠激酶的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组肠激酶的制备方法。

背景技术

肠激酶( Enterokinase，EK，EC3.4.21.9) 是一种异源二聚体形式存在于哺乳动物十二指肠内的丝氨酸蛋白酶。它能高效专一性的水解工程菌表达的融合蛋白（识别位点是Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）释放出目的蛋白，被广泛用于生物工程制药的开发。牛肠激酶由一条结构亚基（重链）和一条催化亚基（轻链）构成，二者以二硫键结合。据Vozza等报道，重组肠激酶轻链体外具有全酶的酶切特异性，同时对基因工程融合蛋白底物的酶切活性较提纯的牛肠激酶明显增强。天然肠激酶来源有限，且从动物组织提取的肠激酶易污染其他蛋白，给实际应用带来了困难。这就要求用基因工程方法生产高纯度的肠激酶。

目前基因工程生产的肠激酶（轻链）已经开始商业化，大多数是在大肠杆菌中通过基因重组的方法而制备。但该方法往往表达得到不具活性的胰蛋白酶原包涵体，需要使胰蛋白酶原包涵体经过变性、复性过程，然后再经过酶切切去酶原的前体部分才能得到有活性的酶。而在所述变性、复性过程中，复性率不可能达到100%，因此该方法费时费力，产率不高。

发明内容

本发明的目的之一是提供制备重组肠激酶的方法，该方法避免了形成包涵体，解决了因分子量大而难分泌表达的难题。

本发明的目的之二是提供一种在大肠杆菌中可溶性表达肠激酶的方法，该方法制备得到的包含肠激酶的融合蛋白直接酶切去除融合蛋白N端100-250个氨基酸后即可得到有活性的重组肠激酶，并且后续的纯化步骤也简单方便。

本发明的第一方面，提供一种制备重组肠激酶的方法，该方法包括：

（1）重组表达融合蛋白，所述融合蛋白序列从N端到C端依次包括：100-250个氨基酸序列、肠激酶序列；

（2）切除融合蛋白N端所述的100-250个氨基酸序列获得重组肠激酶，所述重组肠激酶的氨基酸序列为Seq ID No.1，核苷酸序列为Seq ID No.4。

在一个优选实例中，步骤（1）中，融合蛋白N端所述的100-250个氨基酸序列包含除半胱氨酸以外的其他19种标准氨基酸；具体地，其氨基酸序列和核苷酸序列分别为Seq IDNo.2和Seq ID No.5。

在另一个优选实例中，步骤（1）中，融合蛋白N端所述的100-250个氨基酸序列包含20种标准氨基酸；具体地，其氨基酸序列和核苷酸序列分别为Seq ID No.3和Seq ID No.6。

本发明第二方面，提供一类冷诱导表达载体，包含编码所述的融合蛋白核苷酸序列。具体的，该表达载体属于pCOLD系列，如：pCOLDI (含TEE序列，His tag序列、Factor Xa切断序列)、pCOLDII (含TEE序列，His tag序列)、pCOLDIII (含TEE序列)、pCOLDIV。为于便于纯化，本发明优选pCOLDI。

在一个优选实例中，为插入pCOLDI中，在融合蛋白的核苷酸序列时，两端分别添加了NdeI/XhoI酶切位点；作为一种优选方案，融合蛋白的核苷酸序列并进行优化，优化后的核苷酸序列为Seq ID No.7或Seq ID No.8，再于两端引入NdeI/XhoI酶切位点，然后插入质粒pCOLDI的NdeI/XhoI酶切位点；所述NdeI/XhoI酶切位点的核苷酸序列为：NdeI:CATATG ，XhoI:CTCGAG。

本发明第三方面，提供一种在大肠杆菌中可溶性表达肠激酶的方法，该方法包括如下步骤：

(1)培养包含肠激酶的融合蛋白基因的工程菌并诱导融合蛋白的表达；

(2)收集菌体；

(3)破碎菌体；

(4)收集上清；

(5)纯化上清中的融合蛋白；

(6)酶切上述纯化后的融合蛋白，产生有活性的重组肠激酶；

(7)纯化上述重组肠激酶。

步骤的(1)中的工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)，本发明的方法对大肠杆菌宿主的种类没有任何限制。优选那些能够直接表达构象正确的目的蛋白的宿主。将前述表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)的转化方法在本领域是公知的，例如电穿孔法、CaCl₂转化法等。

步骤的(1)中的诱导宿主表达蛋白的方法可采用本领域技术人员所公知的技术。在本发明优选的实施方式中，是在诱导表达过程中，使用浓度为0.1mM至10mM的诱导剂IPTG，在10-15℃下进行冷诱导，使得目的蛋白更高效的表达。更优选的具体方案为：接种重组工程菌阳性克隆100ul到20ml的LB培养基中，于30-37℃下摇床振荡培养过夜，按4%接种量接过夜菌于500ml的LB培养基，30-37℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度30-37℃，搅拌速度200-300rpm，通气量15L/min，pH为6.5-7.5，控制搅拌转速与通气量以维持溶氧始终在30%以上，培养基配方如下：发酵培养基：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L；补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L；50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中pH调控；当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，控制补料速度、转速、通气保证控制溶氧在30%以上；补料5hr-8hr后，降温至10-15℃，调节pH至6.5-7.5，加入终浓度0.1 -1mmol/L的IPTG进行有氧诱导，溶氧不低于20%，继续培养10h后出罐，收集菌体。

步骤(3)破碎菌体的方法可以为高压匀浆、渗透压冲击、冻融或超声波破碎。

步骤(5)纯化上清中的融合蛋白，优选采用疏水填料Phenly 6FF进行纯化，平衡液为20-50mM Tris-HCL+0.5-1M (NH₄)₂SO₄硫酸铵，pH8.0；洗脱液为20-50mM Tris-HCL，pH8.0。

步骤(6)优选的具体方案为融合蛋白经肠激酶在室温下酶解8-16小时后即可得到具有活性的重组肠激酶；其中肠激酶和融合蛋白的重量比优选为1:200~1:1000。

步骤(7)活性重组肠激酶的纯化步骤优选为离子交换层析。

与现有技术相比，本发明所提供的制备重组肠激酶的方法具有以下优点：

1）通过加入融合蛋白N端100-250个氨基酸，提高了融合蛋白的可溶性；

2）通入将融合蛋白基因序列连入冷诱导表达载体pCOLD，进一步提高了融合蛋白的可溶性；

3）在可溶性表达系统中进行冷诱导表达时，温度控制在10-15℃，使得目的蛋白更高效的表达；

4）无需经过变性、复性的过程，且后续纯化方法简单；制备重组肠激酶活性高，且制备工艺简单、成本低。

附图说明

图1是融合蛋白1重组质粒构建与酶切验证图。

图2是融合蛋白2重组质粒构建与酶切验证图。

图3是融合蛋白1和融合蛋白2工程菌表达与破碎后上清电泳图。

图4是融合蛋白1疏水柱层析纯化峰电泳分析图。

图5是融合蛋白2疏水柱层析纯化峰电泳分析图。

图6是融合蛋白1活化后的肠激酶阴离子层析纯化峰电泳分析图。

图7是融合蛋白2活化后的肠激酶阴离子层析纯化峰电泳分析图。

图8是重组肠激酶酶切反应图。

具体实施方式

以下结合具体实施例详细说明本发明，这些具体实施例均为说明性的，不以任何方式限制本发明的保护范围。

材料说明：

菌株和质粒：表达菌株BL21 (DE3)，质粒pCOLDI购自TakaRa。

酶和试剂：实施例中涉及分子生物学操作所用的酶均购于购自TakaRa，相应的操作步骤完全按照相关的产品说明书进行。

实施例中所涉及的编码包含肠激酶的融合蛋白的核苷酸序列的合成和DNA的测序工作由南京金斯瑞有限公司完成。

其他未标明来源的原、辅料均为市售产品。

实施例1 融合蛋白1（N端124个氨基酸+牛肠激酶轻链）

1.融合蛋白1表达载体和工程菌的构建

1）构建融合蛋白1基因序列：在牛肠激酶（Seq ID No.1）的N端加由124个氨基酸组成的多肽（Seq ID No.2）：

MSDKI IHLTDDSFDT DVLKADGAIL VDFWAEWCGP CKMIAPILDE IADEYQGKLT VAKLNIDQNPGTAPKYGIRG IPTLLLFKNG EVAATKVGAL SKGQLKEFLD ANLA GSGSGSGSGSDDDDK

按照大肠杆菌密码子偏好性对融合蛋白1的核苷酸进行优化，得到最终的核苷酸序列为Seq ID No.7。在融合蛋白1基因序列两端引入NdeI/XhoI酶切位点，具体核苷酸序列为NdeI:CATATG，XhoI:CTCGAG。

2）人工合成上述基因序列，通过NdeI/XhoI酶切位点插入到质粒pCOLDI相应酶切位点中，构建成的重组质粒；

3）构建融合蛋白1工程菌：将步骤2）构建成的重组质粒通过CaCl₂转化的方法导入到BL21(DE3)中，构建融合蛋白1工程菌。经测序，工程菌中的序列与设计一致。

2.工程菌的高密度发酵

工艺1：接种融合蛋白1工程菌阳性克隆100ul到20ml的LB培养基中，于37℃下摇床振荡培养过夜，按4%接种量接过夜菌于500ml的LB培养基，37℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度37℃，搅拌速度300rpm，通气量15L/min，pH为6.8，不断提高搅拌转速与通气量，转速最大1000rpm，通气量最大30L/min，以维持溶氧始终在30%以上，培养基配方如下：发酵培养基：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L；补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L；50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中pH调控。

当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，控制补料速度、转速、通气保证控制溶氧在30%以上；补料6hr后，降温至15℃，调节pH至7.2，加入终浓度0.Immol/L的IPTG进行有氧诱导，溶氧不低于20%，继续培养10h后出罐，收集菌体。

出罐后离心得菌体湿重95g/L，发酵过程中菌体取样点电泳，表达量达全菌蛋白的60%以上。

发酵结束离心收集的菌体按重量体积比1:10加入破碎缓冲液(含250mM Nacl,50mMNaH₂PO₄，Ph8.0)，高压均质机850bar破碎后，40min，8500rpm离心收集上清。

工艺2：接种融合蛋白1工程菌阳性克隆100ul到20ml的LB培养基中，于30℃下摇床振荡培养过夜，按4%接种量接过夜菌于500ml的LB培养基，30℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度30℃，搅拌速度300rpm，通气量15L/min，pH为7.5，不断提高搅拌转速与通气量，转速最大1000rpm，通气量最大30L/min，以维持溶氧始终在30%以上，培养基配方如下：发酵培养基：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L；补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L；50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中pH调控。

当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，控制补料速度、转速、通气保证控制溶氧在30%以上；补料8hr后，降温至10℃，调节pH至6.8，加入终浓度0.Immol/L的IPTG进行有氧诱导，溶氧不低于20%，继续培养24h后出罐，收集菌体。

工艺3：接种融合蛋白1工程菌阳性克隆100ul到20ml的LB培养基中，于35℃下摇床振荡培养过夜，按4%接种量接过夜菌于500ml的LB培养基，35℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度35℃，搅拌速度300rpm，通气量15L/min，pH为6.5，不断提高搅拌转速与通气量，转速最大1000rpm，通气量最大30L/min，以维持溶氧始终在30%以上，培养基配方如下：发酵培养基：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L；补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L；50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中pH调控。

当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，控制补料速度、转速、通气保证控制溶氧在30%以上；补料5hr后，降温至13℃，调节pH至6.5，加入终浓度0.Immol/L的IPTG进行有氧诱导，溶氧不低于20%，继续培养15h后出罐，收集菌体。

3.融合蛋白1纯化

将破碎离心上清用0.45um滤膜过滤，用Phenly 6FF预装柱(上海博格隆)进行纯化，平衡液为20-50mMTris-HCL+0.5-1M (NH4)₂SO₄硫酸铵，pH8.0，洗脱液20-50mMTris-HCL，pH8.0。0-100%洗脱液线性梯度洗脱10个CV，收集组分峰，得到含有融合蛋白1的溶液。

将上述溶液用超滤柱(GE Healthcare)去除咪唑，洗脱液为20-50mMTris-HCL，pH8.0溶液，收集组分峰。

融合蛋白1的氨基酸序列为：

MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGSGSGSDDDDKIVGGSDSREGAWPWVVALYFDDQQVCGASLVSRDWLVSAAHCVYGRNMEPSKWKAVLGLHMASNLTSPQIETRLIDQIVINPHYNKRRKNNDIAMMHLEMKVNYTDYIQPICLPEENQVFPPGRICSIAGWGALIYQGSTADVLQEADVPLLSNEKCQQQMPEYNITENMVCAGYEAGGVDSCQGDSGGPLMCQENNRWL LAGVTSFGYQ CALPNRPGVY ARVPRFTEWIQSFLH

融合蛋白1重组质粒构建与酶切验证如图1所示；融合蛋白1工程菌表达与破碎后上清电泳图如图3所示，其中：1为marker，2为融合蛋白1破碎后菌体悬液，3为融合蛋白1破碎后菌体离心上清；融合蛋白1疏水柱层析纯化峰电泳分析如图4所示，其中：1为marker，2为峰1（柱前），3为峰2（融合蛋白1），4为峰3（杂蛋白），5为峰4（杂蛋白）；融合蛋白1活化后的肠激酶阴离子层析纯化峰电泳分析如图6所示，其中:1为marker，2为肠激酶标准品，3为峰1（杂蛋白），4为峰2（试剂峰），5为峰3（重组肠激酶），6为峰4（杂蛋白），7为峰5（杂蛋白），8为峰6（杂蛋白）。

实施例2、制备重组肠激酶1

1.重组肠激酶的制备

将实施例1脱盐后的融合蛋白1经肠激酶(肠激酶与融合蛋白1重量比1:1000)在室温下过夜即可得到具有活性的肠激酶。

2.重组肠激酶的纯化

重组肠激酶溶液经阴离子交换进行纯化，阴离子交换条件：平衡液A-20mM Tris-HCI,pH8.0；洗脱液B-20mMTris-HCI+0.5MNaCI ,pH8.0；0-100%洗脱液线性梯度10个CV。纯化的胰蛋白酶经电泳分析，纯度达到95%以上。将所得的重组肠激酶经氨基酸测序分析，所得结构域预期一致。

实施例3、融合蛋白2（N端231个氨基酸+牛肠激酶轻链）

1.融合蛋白2表达载体和工程菌的构建

1）构建融合蛋白2基因序列：在牛肠激酶（Seq ID No.1）的N端加由231个氨基酸组成的多肽（Seq ID No.3）：

MPIDFYYLLI SPPCRAVMLT AEAVGVKLNM KELDIFKGEQ MKPEFVALNP QHCIPTLVDGDFVIWESRPT CSYLASKYGK DDSLFPNDPR ASAEVERLNY FDMGTLFHRF GEYVFPVMFS GEKEFNPDKLERLQEALGWL DGFLSGNKFA VGDNITIADH TLLATVSTMK EANVDLSKHA NILAWLEKCK AEVPGYETNQKGAEDWGKFF KSRCNL GSGSGSGSGS DDDDK

按照大肠杆菌密码子偏好性对融合蛋白2的核苷酸进行优化，得到最终的核苷酸序列为Seq ID No.8。在融合蛋白2基因序列两端引入NdeI/XhoI酶切位点，具体核苷酸序列如下NdeI:CATATG ，XhoI:CTCGAG。

2）人工合成上述基因序列，通过NdeI/XhoI酶切位点插入到质粒pCOLDI相应酶切位点中，构建成的重组质粒。

3）构建融合蛋白2工程菌：将上述重组质粒通过CaCl₂转化的方法导入到BL21(DE3)中，构建融合蛋白2工程菌。经测序，工程菌中的序列与设计一致。

2.工程菌的高密度发酵

工艺1：接种融合蛋白2工程菌阳性克隆100ul到20ml的LB培养基中，于37℃下摇床振荡培养过夜，按4%接种量接过夜菌于500ml的LB培养基，37℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度37℃，搅拌速度300rpm，通气量15L/min，pH为6.8，不断提高搅拌转速与通气量，转速最大1000rpm，通气量最大30L/min，以维持溶氧始终在30%以上，培养基配方如下：发酵培养基：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L；补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L；50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中pH调控。

出罐后离心得菌体湿重100g/L，发酵过程中菌体取样点电泳如4，表达量达全菌蛋白的65%以上。

发酵结束离心收集的菌体按重量体积比1:10加入破碎缓冲液(含250mM NaCl,50mMNaH₂PO₄,Ph8.0)，高压均质机850bar破碎后，40min，8500rpm离心收集上清。

工艺2：接种融合蛋白2工程菌阳性克隆100ul到20ml的LB培养基中，于30℃下摇床振荡培养过夜，按4%接种量接过夜菌于500ml的LB培养基，30℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度30℃，搅拌速度300rpm，通气量15L/min，pH为7.5，不断提高搅拌转速与通气量，转速最大1000rpm，通气量最大30L/min，以维持溶氧始终在30%以上，培养基配方如下：发酵培养基：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L；补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L；50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中pH调控。

当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，控制补料速度、转速、通气保证控制溶氧在30%以上；补料8hr后，降温至10℃，调节pH至6.8，加入终浓度0.ImM的IPTG进行有氧诱导，溶氧不低于20%，继续培养24h后出罐，收集菌体。

工艺3：接种融合蛋白2工程菌阳性克隆100ul到20ml的LB培养基中，于35℃下摇床振荡培养过夜，按4%接种量接过夜菌于500ml的LB培养基，35℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度35℃，搅拌速度300rpm，通气量15L/min，pH为6.5，不断提高搅拌转速与通气量，转速最大1000rpm，通气量最大30L/min，以维持溶氧始终在30%以上，培养基配方如下：发酵培养基：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L；补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L；50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中pH调控。

当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，控制补料速度、转速、通气保证控制溶氧在30%以上；补料5hr后，降温至13℃，调节pH至6.5，加入终浓度0.1mM的IPTG进行有氧诱导，溶氧不低于20%，继续培养15h后出罐，收集菌体。

3.融合蛋白2纯化

将破碎离心上清用0.45um滤膜过滤，用Phenly 6FF预装柱(上海博格隆)进行纯化，平衡液为20-50mMTris-HCL+0.5-1M (NH4)₂SO₄硫酸铵，pH8.0，洗脱液20-50mMTris-HCL，pH8.0。0-100%洗脱液线性梯度洗脱10个CV，收集组分峰，得到含有融合蛋白2的溶液。

将上述溶液用超滤柱(GE Healthcare)去除硫酸铵，洗脱液20-50mmTris-HCL，pH8.0溶液，收集组分峰。

融合蛋白2的氨基酸序列为：

MPIDFYYLLISPPCRAVMLTAEAVGVKLNMKELDIFKGEQMKPEFVALNPQHCIPTLVDGDFVIWESRPTCSYLASKYGKDDSLFPNDPRASAEVERLNYFDMGTLFHRFGEYVFPVMFSGEKEFNPDKLERLQEALGWLDGFLSGNKFAVGDNITIADHTLLATVSTMKEANVDLSKHANILAWLEKCKAEVPGYETNQKGAEDWGKFFKSRCNLGSGSGSGSGSDDDDKIVGGSDSREGAWPWVVALYFDDQQVCGASLVSRDWLVSAAHCVYGRNMEPSKWKAVLGLHMASNLTSPQIETRLIDQIVINPHYNKRRKNNDIAMMHLEMKVNYTDYIQPICLPEENQVFPPGRICSIAGWGALIYQGSTADVLQEADVPLLSNEKCQQQMPEYNITENMVCAGYEAGGVDSCQGDSGGPLMCQENNRWLLAGVTSFGYQCALPNRPGVYARVPRFTEWI QSFLH。

融合蛋白2重组质粒构建与酶切验证如图2所示；融合蛋白1工程菌表达与破碎后上清电泳图如图3所示，其中：4为marker，5为融合蛋白2破碎后菌体悬液，6为融合蛋白2破碎后菌体离心上清；融合蛋白2疏水柱层析纯化峰电泳分析如图5所示，其中：1为marker，2为峰1（柱前），3为峰2（融合蛋白1），4为峰3（杂蛋白），5为峰4（杂蛋白）；融合蛋白1活化后的肠激酶阴离子层析纯化峰电泳分析如图7所示，其中:1为marker，2为肠激酶标准品，3为峰1（杂蛋白），4为峰2（试剂峰），5为峰3（重组肠激酶），6为峰4（杂蛋白），7为峰5（杂蛋白），8为峰6（杂蛋白）。

实施例4、制备重组肠激酶2

1.重组肠激酶的纯化

将脱盐后的融合蛋白2经肠激酶(肠激酶与融合蛋白1重量比1:1000)在室温下过夜即可得到具有活性的肠激酶。

2.重组肠激酶的纯化

肠激酶溶液经阴离子交换进行纯化，阴离子交换条件：平衡液A-20mMTris-HCI,pH8.0；洗脱液B-20mMTris-HCI+0.5MNaCI ,pH8.0；0-100%洗脱液线性梯度10个CV。纯化的胰蛋白酶经电泳分析，纯度达到95%以上。将所得的重组肠激酶经氨基酸测序分析，所得结构域预期一致。

实施例5、重组肠激酶的活力测定方法

重组肠激酶的活力测定按每个反应含有0.5mg的融合蛋白和不同活力单位的肠激酶在25℃经过12-16小时的反应后用SDS-PAGE胶检测酶切效果，如图8所示，其中：1为marker，7为底物（酶切融合蛋白对照），2为0.03肠激酶标准品酶切底物，3和4为融合蛋白1活化后的肠激酶酶切底物，5和6为融合蛋白2活化后的肠激酶酶切底物。

活性单位定义：在25℃，12h~16h之内，将0.5mg保存于25mM Tris-HCl 8.0 缓冲液中的融合蛋白切割95%所需的酶量。

经测定，纯化后的重组肠激酶1活性为10单位/ul，纯化后的重组肠激酶2为5单位/ul。

序列表

<110> 江苏万邦生化医药股份有限公司，上海复星医药（集团）股份有限公司

<120>一种重组肠激酶的制备方法

<130>8

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>235

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val Ala Leu Tyr Phe

1 5 10 15 20

Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala

21 25 30 35 40

His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His

41 45 50 55 60

Met Ala Ser Asn Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile

61 65 70 75 80

Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met His Leu Glu Met

81 85 90 95 100

Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Cys Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe

101 105 110 115 120

Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr

121 125 130 135 140

Ala Asp Val Leu Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln

141 145 150 155 160

Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu Ala Gly Gly Val

161 165 170 175 180

Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu

181 185 190 195 200

Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr

201 205 210 215 220

Ala Arg Val Pro Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His

221 225 230 235

<210>2

<211>124

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala

1 5 10 15 20

Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala

21 25 30 35 40

Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn

41 45 50 55 60

Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

61 65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu

81 85 90 95 100

Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp

101 105 110 115 120

Asp Asp Asp Lys

121

<210>3

<211>231

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

Met Pro Ile Asp Phe Tyr Tyr Leu Leu Ile Ser Pro Pro Cys Arg Ala Val Met Leu Thr

1 5 10 15 20

Ala Glu Ala Val Gly Val Lys Leu Asn Met Lys Glu Leu Asp Ile Phe Lys Gly Glu Gln

21 25 30 35 40

Met Lys Pro Glu Phe Val Ala Leu Asn Pro Gln His Cys Ile Pro Thr Leu Val Asp Gly

41 45 50 55 60

Asp Phe Val Ile Trp Glu Ser Arg Pro Thr Cys Ser Tyr Leu Ala Ser Lys Tyr Gly Lys

61 65 70 75 80

Asp Asp Ser Leu Phe Pro Asn Asp Pro Arg Ala Arg Ala Glu Val Glu Arg Leu Asn Tyr

81 85 90 95 100

Phe Asp Met Gly Thr Leu Phe His Arg Phe Gly Glu Tyr Val Phe Pro Val Met Phe Arg

101 105 110 115 120

Gly Glu Lys Glu Phe Asn Pro Asp Lys Leu Glu Arg Leu Gln Glu Ala Leu Gly Trp Leu

121 125 130 135 140

Asp Gly Phe Leu Ser Gly Asn Lys His Ala Val Gly Asp Asn Ile Thr Ile Ala Asp His

141 145 150 155 160

Thr Leu Leu Ala Thr Val Ser Thr Ile Lys Glu Ala Asn Val Asp Leu Ser Lys His Ala

161 165 170 175 180

Asn Ile Leu Ala Trp Leu Glu Lys Cys Lys Ala Glu Val Pro Gly Tyr Glu Thr Asn Gln

181 185 190 195 200

Lys Gly Ala Glu Asp Trp Gly Lys Phe Phe Lys Ser Arg Cys Asn Leu Gly Ser Gly Ser

201 205 210 215 220

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys

221 225 230

<210>4

<211>708

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

atcgttggtg gttctgactc tcgtgaaggt gcttggccgt gggttgttgc 50

tctgtacttc gacgaccagc aggtttgcgg tgcttctctg gtttctcgtg 100

actggctggt ttctgctgct cactgcgttt acggtcgtaa catggaaccg 150

tctaaatgga aagctgttct gggtctgcac atggcttcta acctgacctc 200

tccgcagatc gaaacccgtc tgatcgacca gatcgttatc aacccgcact 250

acaacaaacg tcgtaaaaac aacgacatcg ctatgatgca cctggaaatg 300

aaagttaact acaccgacta catccagccg atctgcctgc cggaagaaaa 350

ccaggttttc ccgccgggtc gtatctgctc tatcgctggt tggggtgctc 400

tgatctacca gggttctacc gctgacgttc tgcaggaagc tgacgttccg 450

ctgctgtcta acgaaaaatg ccagcagcag atgccggaat acaacatcac 500

cgaaaacatg gtttgcgctg gttacgaagc tggtggtgtt gactcttgcc 550

agggtgactc tggtggtccg ctgatgtgcc aggaaaacaa ccgttggctg 600

ctggctggtg ttacctcttt cggttaccag tgcgctctgc cgaaccgtcc 650

gggtgtttac gctcgtgttc cgcgtttcac cgaatggatc cagtctttcc 700

tgcactaa 708

<210>5

<211>372

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

atgtctgaca aaatcatcca cctgaccgac gactctttcg acaccgacgt 50

tctgaaagct gacggtgcta tcctggttga cttctgggct gaatggtgcg 100

gtccgtgcaa aatgatcgct ccgatcctgg acgaaatcgc tgacgaatac 150

cagggtaaac tgaccgttgc taaactgaac atcgaccaga acccgggtac 200

cgctccgaaa tacggtatcc gtggtatccc gaccctgctg ctgttcaaaa 250

acggtgaagt tgctgctacc aaagttggtg ctctgtctaa aggtcagctg 300

aaagaattcc tggacgctaa cctggctggt agcggcagcg gtagcggcag 350

cggtagcgac gatgacgata ag 372

<210>6

<211>693

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

atgccgatcg acttctacta cctgctgatc tctccgccgt gccgtgctgt 50

tatgctgacc gctgaagctg ttggtgttaa actgaacatg aaagaactgg 100

acatcttcaa aggtgaacag atgaaaccgg aattcgttgc tctgaacccg 150

cagcactgca tcccgaccct ggttgacggt gacttcgtta tctgggaatc 200

tcgtccgacc tgctcttacc tggcttctaa atacggtaaa gacgactctc 250

tgttcccgaa cgacccgcgt gctcgtgctg aagttgaacg tctgaactac 300

ttcgacatgg gtaccctgtt ccaccgtttc ggtgaatacg ttttcccggt 350

tatgttccgt ggtgaaaaag aattcaaccc ggacaaactg gaacgtctgc 400

aggaagctct gggttggctg gacggtttcc tgtctggtaa caaattcgct 450

gttggtgaca acatcaccat cgctgaccac accctgctgg ctaccgtttc 500

taccatcaaa gaagctaacg ttgacctgtc taaacacgct aacatcctgg 550

cttggctgga aaaatgcaaa gctgaagttc cgggttacga aaccaaccag 600

aaaggtgctg aagactgggg taaattcttc aaatctcgtt gcaacctggg 650

tagcggcagc ggtagcggca gcggtagcga cgatgacgat aag 693

<210>7

<211>1141

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

gaactgatgt ctgacaaaat catccacctg accgacgact ctttcgacac 50

gacgttctga aagctgacgg tgctatcctg gttgacttct gggctgaatg 100

gtgcggtccg tgcaaaatga tcgctccgat cctggacgaa atcgctgacg 150

aataccaggg taaactgacc gttgctaaac tgaacatcga ccagaacccg 200

ggtaccgctc cgaaatacgg tatccgtggt atcccgaccc tgctgctgtt 250

caaaaacggt gaagttgctg ctaccaaagt tggtgctctg tctaaaggtc 300

agctgaaaga attcctggac gctaacctgg ctggtagcgg cagcggtagc 350

ggcagcggta gcgacgatga cgataagatc gttggtggtt ctgactctcg 400

tgaaggtgct tggccgtggg ttgttgctct gtacttcgac gaccagcagg 450

tttgcggtgc ttctctggtt tctcgtgact ggctggtttc tgctgctcac 500

tgcgtttacg gtcgtaacat ggaaccgtct aaatggaaag ctgttctggg 550

tctgcacatg gcttctaacc tgacctctcc gcagatcgaa acccgtctga 600

tcgaccagat cgttatcaac ccgcactaca acaaacgtcg taaaaacaac 650

gacatcgcta tgatgcacctg gaaatgaaag ttaactacacc gactacat 700

ccagccgatc tgcctgccgg aagaaaacca ggttttcccg ccgggtcgta 750

tctgctctat cgctggttgg ggtgctctga tctaccaggg ttctaccgct 800

gacgttctgc aggaagctga cgttccgctg ctgtctaacg aaaaatgcca 850

gcagcagatg ccggaataca acatcaccga aaacatggtt tgcgctggtt 900

acgaagctgg tggtgttgac tcttgccagg gtgactctgg tggtccgctg 950

atgtgccagg aaaacaaccg ttggctgctg gctggtgtta cctctttcgg 1050

ttaccagtgc gctctgccga accgtccggg tgtttacgct cgtgttccgc 1100

gtttcaccga atggatccag tctttcctgc actaaaaact g 1141

<210>8

<211>1413

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

gaactgatgc cgatcgactt ctactacctg ctgatctctc cgccgtgccg 50

tgctgttatg ctgaccgctg aagctgttgg tgttaaactg aacatgaaag 100

aactggacat cttcaaaggt gaacagatga aaccggaatt cgttgctctg 150

aacccgcagc actgcatccc gaccctggtt gacggtgact tcgttatctg 200

ggaatctcgt ccgacctgct cttacctggc ttctaaatac ggtaaagacg 250

actctctgtt cccgaacgac ccgcgtgctc gtgctgaagt tgaacgtctg 300

aactacttcg acatgggtac cctgttccac cgtttcggtg aatacgtttt 350

cccggttatg ttccgtggtg aaaaagaatt caacccggac aaactggaac 400

gtctgcagga agctctgggt tggctggacg gtttcctgtc tggtaacaaa 450

ttcgctgttg gtgacaacat caccatcgct gaccacaccc tgctggctac 500

cgtttctacc atcaaagaag ctaacgttga cctgtctaaa cacgctaaca 550

tcctggcttg gctggaaaaa tgcaaagctg aagttccggg ttacgaaacc 600

aaccagaaag gtgctgaaga ctggggtaaa ttcttcaaat ctcgttgcaa 650

cctgggtagc ggcagcggta gcggcagcgg tagcgacgat gacgataaga 700

tcgttggtgg ttctgactct cgtgaaggtg cttggccgtg ggttgttgct 750

ctgtacttcg acgaccagca ggtttgcggt gcttctctgg tttctcgtga 800

ctggctggtt tctgctgctc actgcgttta cggtcgtaac atggaaccgt 850

ctaaatggaa agctgttctg ggtctgcaca tggcttctaa cctgacctct 900

ccgcagatcg aaacccgtct gatcgaccag atcgttatca acccgcacta 950

caacaaacgt cgtaaaaaca acgacatcgc tatgatgcac ctggaaatga 1000

aagttaacta caccgactac atccagccga tctgcctgcc ggaagaaaac 1050

caggttttcc cgccgggtcg tatctgctct atcgctggtt ggggtgctct 1100

gatctaccag ggttctaccg ctgacgttct gcaggaagct gacgttccgc 1150

tgctgtctaa cgaaaaatgc cagcagcaga tgccggaata caacatcacc 1200

gaaaacatgg tttgcgctgg ttacgaagct ggtggtgttg actcttgcca 1250

gggtgactct ggtggtccgc tgatgtgcca ggaaaacaac cgttggctgc 1300

tggctggtgt tacctctttc ggttaccagt gcgctctgcc gaaccgtccg 1350

ggtgtttacg ctcgtgttcc gcgtttcacc gaatggatcc agtctttcct 1400

gcactaaaaa ctg 1413

Claims

1.一种重组肠激酶的制备方法，其特征在于，该方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的100-250个氨基酸序列为Seq ID No.2或Seq ID No.3。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中重组表达融合蛋白的优化的核苷酸序列为Seq ID No.7或Seq ID No.8。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述核苷酸序列两端分别添加了NdeI/XhoI酶切位点，插入带有NdeI/XhoI酶切位点的pCOLD系列的冷诱导表达载体中；所述NdeI/XhoI酶切位点的核苷酸序列为：NdeI:CATATG ，XhoI:CTCGAG。

5.一种在大肠杆菌中可溶性表达重组肠激酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)培养包含肠激酶的融合蛋白基因的工程菌并诱导融合蛋白的表达；所述融合蛋白的序列从N端到C端依次包括：100-250个氨基酸序列、肠激酶序列；

(2)收集菌体；

(3)破碎菌体；

(4)收集上清；

(5)纯化上清中的融合蛋白；

(6)酶切上述纯化后的融合蛋白，切除融合蛋白N端所述的100-250个氨基酸序列；产生有活性的重组肠激酶；

(7)纯化上述重组肠激酶，所述重组肠激酶的氨基酸序列为Seq ID No.1，核苷酸序列为Seq ID No.4。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤的(1)中的工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)；诱导融合蛋白的表达选用浓度为0.1mM至10mM的诱导剂IPTG，在10-15℃下进行冷诱导。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述诱导融合蛋白的表达的具体方法为：接种重组工程菌阳性克隆100ul到20ml的LB培养基中，于30-37℃下摇床振荡培养过夜，按4%接种量接过夜菌于500ml的LB培养基，30-37℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度30-37℃，搅拌速度200-300rpm，通气量15L/min，pH为6.5-7.5，控制搅拌转速与通气量以维持溶氧始终在30%以上，培养基配方如下：发酵培养基：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L；补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L；50%氨水和30%磷酸用于发酵过程中pH调控；当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，控制补料速度、转速、通气保证控制溶氧在30%以上；补料5hr-8hr后，降温至10-15℃，调节pH至6.5-7.5，加入终浓度0.1 -1mmol/L的IPTG进行有氧诱导，溶氧不低于20%，继续培养10h后出罐，收集菌体。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)破碎菌体的方法为高压匀浆、渗透压冲击、冻融或超声波破碎；步骤(5)纯化上清中的融合蛋白，采用疏水填料Phenly 6FF进行纯化，平衡液为20-50mM Tris-HCL+0.5-1M (NH₄)₂SO₄硫酸铵，pH8.0；洗脱液为20-50mMTris-HCL，pH8.0。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(6)的具体方案为融合蛋白经肠激酶在室温下酶解8-16小时后即可得到具有活性的重组肠激酶；其中肠激酶和融合蛋白的重量比优选为1:200~1:1000。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(7)活性重组肠激酶的纯化步骤优选为离子交换层析。