CN103184236A

CN103184236A - 一种重组胰蛋白酶的制备方法

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Publication number: CN103184236A
Application number: CN2011104534517A
Authority: CN
Inventors: 文良柱; 温传斌; 朱亮
Original assignee: Jiangsu Wanbang Biological Pharmaceutical Co Ltd; Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Wanbang Biological Pharmaceutical Co Ltd; Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2011-12-30
Publication date: 2013-07-03

Abstract

本发明一种重组胰蛋白酶的制备方法涉及基因工程领域。提供了包含胰蛋白酶原的表达载体和工程菌，本发明的方法包括将带有重组胰蛋白酶原基因序列的质粒导入大肠杆菌细胞中，构建重组工程菌，经发酵诱导表达重组胰蛋白酶原，经复性、肠激酶酶切转化和分离纯化后得到具有活性的胰蛋白酶。本发明的特点是重组胰蛋白酶制备工艺简单，成本低。

Description

一种重组胰蛋白酶的制备方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种重组胰蛋白酶的制备方法。

技术背景

胰蛋白酶Trypsin(Parenzyme)是一种丝氨酸蛋白酶(EC3.4.21.4)。在无脊椎和脊椎动物中作为消化酶而广泛存在。不同物种的胰蛋白酶分子大小有一定差异，牛胰蛋白酶由223个氨基酸残基组成，分子量为23300，等电点为10.1-10.5。胰蛋白酶在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的，通过胰液而分泌，在肠道中受肠激酶作用分解成为具有活性的胰蛋白酶。它是肽链内切酶，可从肽链中赖氨酸或精氨酸残基中的羧基侧切断肽链。因为胰蛋白酶是特异性最强的蛋白酶之一，在消化道内，它不仅起消化酶的作用，而且还能限制性分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，对这些酶原起活化作用；在蛋白质研究及工业上，它作为重要的工具酶，在蛋白质测序、动物细胞培养前对组织的处理、胰岛素等蛋白药物的生产、皮革与生丝处理以及食品工业上发挥广泛的作用；在临床上，还可用于清除脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。

目前胰蛋白酶主要从猪、牛的胰脏中提取，因其动物源性，存在未知病毒和外源因子污染的风险，在制药行业的应用受到很大的限制；另外通过动物脏器提取的胰蛋白酶，因分离纯化不彻底，存在一些杂质，如糜蛋白酶，对其特异性切割赖氨酸和精氨酸位点产生影响，在蛋白药物的生产和分析中的应用也受到较大的限制。通过重组工程菌表达胰蛋白酶原，可以生产高纯度与高活力的胰蛋白酶，可以满足蛋白质研究与药物蛋白生产的需要。

本领域需要提供新的胰蛋白酶的制备方法。

发明内容

本发明的发明人经过大量和富有创造性的工作，构建了包含胰蛋白酶原基因的重组细胞株并经优化表达条件、纯化最终获得了与胰蛋白酶序列一直的重组胰蛋白酶，从而完成了本发明。

本发明所要解决的技术问题之一是，提供一种包含胰蛋白酶原基因的表达载体。

本发明所要解决的技术问题之二是，提供一种包含胰蛋白酶原基因的工程菌。

本发明还要解决的技术问题之三是提供一种重组胰蛋白酶的制备方法。

本发明提供了一种包含牛胰蛋白酶原基因的表达载体，其特征在于牛胰蛋白酶原基因序列为Seq ID No.16-710。优选地，包含牛胰蛋白酶原基因的表达载体，其特征在于，牛胰蛋白酶原基因Seq ID No.16-710插入质粒pET-22b(+)的McsI/XhoI酶切位点。

牛胰蛋白酶原基因序列在本领域是已知的，公布在Genebank中，具体参见Seq.ID No.16-710，其编码Seq.ID No.2的牛胰蛋白酶原序列。获得该序列的方法在本领域也是已知的，例如可以采用人工合成的方法合成该序列。为插入质粒pET-22b(+)的McsI/XhoI酶切位点，在合成牛胰蛋白酶原cDNA时，两端分别添加了McsI/XhoI酶切位点，Seq.ID No.11-8和711-716，参见序列表。

本发明提供了一种包含牛胰蛋白酶原基因的工程菌，其包含前述的表达载体。优选地，包含牛胰蛋白酶原基因序列的工程菌，其特征在于，由将前述表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)而获得。转化方法在本领域是公知的，例如电穿孔法、CaCl₂转化法等。

本发明还提供了一种重组牛胰蛋白酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)培养包含牛胰蛋白酶原基因的工程菌并诱导牛胰蛋白酶原基因表达；

(2)收集菌体；

(3)破碎菌体；

(4)收集包涵体，洗涤包涵体；

(5)包涵体变性和复性；

(6)胰蛋白酶原活化；

(7)活化的胰蛋白酶纯化。

所述的“收集菌体”的方法包括但不限于离心包括连续离心、过滤等。

所述的“破碎菌体”的方法，包括但不限于高压匀浆、渗透压冲击、冻融、超声波破碎等。

所述的“收集包涵体”的方法，包括但不限于离心。

所述的“洗涤包涵体”的方法，包括但不限于包涵体用纯化用书或者合适的缓冲液重悬、离心、再重悬离心等2～3个循环操作。

包涵体变性和复性的方法可以按照本领域的技术人员公知的方法进行。

优选地，重组牛胰蛋白酶的制备方法，步骤(1)培养包含牛胰蛋白酶原基因的工程菌并诱导牛胰蛋白酶原基因表达，进一步具体为：接种重组工程菌阳性克隆200μl到20ml的LB培养基中，于30℃下摇床振荡培养过夜，按4％-10％接种量接过夜菌于500ml的LB培养基中，37℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度37℃，搅拌速度300rpm，通气量15L/min，pH为6.7，控制搅拌转速与通气量以维持溶氧始终在30％以上，培养基配方如下：

发酵培养基：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50％氨水和30％磷酸用于发酵过程中pH调控；

当培养基中养分耗尽、溶氧迅速上升时开始补料，控制补料速度、转速、通气保证控制溶氧在30％以上；补料4hr-6hr后，降温至20-30℃，调节pH至6.5-7.5，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG进行有氧诱导，溶氧不低于20％，继续培养4-10h后出罐，收集菌体。

更优选地，重组牛胰蛋白酶的制备方法，进一步，步骤(5)包涵体的变性和复性操作为：包涵体溶解缓冲液：8mol/L尿素+10mmol/L EDTA+25mmol/L Tris-HCl，PH7.5，按重量体积比1∶5～15溶解过夜；溶解后的包涵体经离心，稀释到蛋白浓度0.1～0.5mg/ml稀释到蛋白浓度0.2mg/ml，在复性缓冲液(0.2mol/L尿素+10mmol/L GaCl₂+50mmol/LTris-HCl，GSH∶GSSG＝1mmol/L∶0.3mmol/L，PH10)中，4℃复性过夜得复性的胰蛋白酶原。

所述的“胰蛋白酶原活化”包括前述复性的胰蛋白酶原经肠激酶(1∶200，肠激酶(g)∶胰蛋白酶原(g))在室温下酶解1-10小时后即可得到具有活性的粗胰蛋白酶酶液。

所述的“活性胰蛋白酶的纯化”包括疏水层析、离子交换步骤。

本发明的重组牛胰蛋白酶具有和牛胰蛋白酶相同的序列，可以安全的用于重组蛋白药物的生产，解决重组蛋白药物生产与研究中可能存在的外源因子等风险与非特异性切割问题。

附图说明

图1.牛胰蛋白酶原cDNA序列，1-8和711-716为McsI/XhoI酶切位点。

图2.牛胰蛋白酶原氨基酸序列，1-10为信号肽序列，11-234为成熟的牛胰蛋白酶。

图3重组质粒构建与酶切验证图。

图4.重组胰蛋白酶工程菌生长曲线图。

图5.重组胰蛋白酶工程菌表达，1为一级种子、2为二级种子，3为诱导前，4为出罐全菌。

图6.重组胰蛋白酶工程菌破碎后电泳图，1为破碎后上清、2和3为破碎后沉淀(包涵体)。

图7.重组胰蛋白酶离子交换层析纯化。

图8.重组胰蛋白酶疏水层析纯化。

图9.重组胰蛋白酶电泳分析，其中：1为包涵体溶解、2为重组胰蛋白酶酶切、3为重组胰蛋白酶复性超滤后、4为纯化重组胰蛋白酶。

图10.重组胰蛋白酶活性测定。

图11.胰蛋白酶原基因测序结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例详细说明本发明，这些具体实施例均为说明性的，不以任何方式限制本发明的保护范围。

在以下具体实施例中，除有特别说明的之外，按照本领域技术人员熟知的技术手册的教导或者试剂、设备提供商的说明书进行之。本领域的技术人员按照这些教导并结合本发明的公开的内容可以实现本发明。

实施例一重组牛胰蛋白酶的制备

一、工程菌的构建

人工合成牛胰蛋白酶原的cDNA序列，两端引入McsI/XhoI酶切位点，具体序列如下(参见附图1和许列表Seq.ID No.1。其中6-710编码图2(Seq.ID No.2和3)的牛胰蛋白酶原。

TGGCCATGGCGTTCCCGAGTGACGACGATGACAAAATTGTGGGCGGTTACACCTGTGCCGAAAATAGCGTGCCGTATCAAGTTAGCCTGAATGCGGGCTATCATTTTTGCGGCGGTTCACTGATTAACGATCAATGGGTGGTTTCGGCGGCCCATTGTTATCAGTACCACATTCAAGTTCGTCTGGGTGAATATAATATCGATGTCCTGGAAGGCGGTGAACAGTTCATCGACGCCTCAAAAATTATCCGCCACCCGAAATACAGCTCTTGGACCCTGGATAACGACATTCTGCTGATCAAACTGAGCACCCCGGCCGTCATTAATGCACGTGTGTCTACGCTGCTGCTGCCGTCAGCATGCGCTTCGGCAGGTACCGAATGTCTGATCTCCGGCTGGGGTAACACGCTGAGTTCCGGTGTGAATTATCCGGATCTGCTGCAGTGCCTGGTTGCTCCGCTGCTGAGTCATGCTGACTGTGAAGCGTCCTACCCGGGCCAAATTACGAACAATATGATCTGCGCGGGTTTTCTGGAAGGCGGTAAAGATAGCTGCCAGGGTGACTCTGGCGGTCCGGTCGCATGTAACGGCCAGCTGCAAGGTATTGTTAGCTGGGGCTACGGTTGTGCACAGAAAGGCAAACCGGGTGTCTATACGAAAGTGTGTAACTATGTGGACTGGATTCAGGAAACCATTGCGGCGAACTCATAACTCGAG

上述cDNA，通过McsI/XhoI酶切位点插入到质粒pET-22b(+)(购自invitrogen)相应酶切位点中，构建成的重组质粒。构建图与酶切后电泳图如图3所示。

插入胰蛋白酶原基因的重组质粒pET-proTYP通过化学转化法转化到宿主大肠杆菌BL21(DE3)中，构建重组胰蛋白酶工程菌。经测序，工程菌中的序列与设计一致，图11。

二、工程菌的高密度发酵

重组工程菌发酵，接种重组工程菌阳性克隆200μl到20ml的LB培养基中，于30℃下摇床振荡培养过夜，按4‰接种量接过夜菌于500ml的LB培养基中，37℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度37℃，搅拌速度300rpm，通气量15L/min，pH为6.7，不断提高搅拌转速与通气量(转速最大1000rpm，通气量最大30L/min)以维持溶氧始终在30％以上，培养基配方如下：

发酵培养基：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50％氨水和30％磷酸用于发酵过程中pH调控。

当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，通过控制泵的转速合理控制补料速度，同时在补料速度、转速、通气三者的合理控制下，保证控制溶氧在30％以上。补料4h后，降温至23℃，调节pH至7.1，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG进行有氧诱导(即保证溶氧不低于20％)8h后出罐。

出罐后离心得菌体湿重167g/L，发酵过程中菌体生长曲线及相关取样点电泳如4和5，表达量达全菌蛋白的60％以上。

发酵结束离心收集的菌体按重量体积比1∶10加入破碎缓冲液(25mmol/LTris-HCl+5mmol/LEDTA)，高压均质机700bar破碎后收集沉淀和上清电泳如6，包涵体纯度胰蛋白酶原超过85％。

三、胰蛋白酶原的纯化

发酵结束后，离心收集菌体，按重量体积比1∶10加入破碎缓冲液(25mmol/L Tis-HCl+5mmol/L EDTA，PH7.5)，高压均质机700bar条件下破碎两遍，离心收集包涵体沉淀，包涵体湿重为30g/L发酵液。将沉淀按重量体积比1∶10加入洗涤缓冲液(2mol/L尿素+1.5％Triton)，室温磁力搅拌1小时，离心收集的沉淀用洗涤缓冲液洗涤两次。再用包涵体溶解缓冲液(8mol/L尿素+10mmol/L EDTA+25mmol/L Tris-HCl，PH7.5)按重量体积比1∶10溶解过夜。溶解后的包涵体经离心、超滤去除杂质后(如图4所示)，稀释到蛋白浓度0.2mg/ml，在复性缓冲液(0.2mol/L尿素+10mmol/L GaCl₂+50mmol/L Tris-HCl，GSH∶GSSG＝1mmol/L∶0.3mmol/L，PH10)中，4℃复性过夜，复性后的胰蛋白酶原经肠激酶(1∶200)在室温下酶解5小时后即可得到具有活性的粗酶液。粗酶液经疏水层析(图8)，条件是：疏水层析条件：缓冲液A-20mMTris-HCl+1.5M(NH4)2SO4，pH8.0；缓冲液B-20mM Tris-HCl，pH8.0；0-100％B线性梯度50CV；离子交换(图7)，条件是：缓冲液A-20mM Tris-HCl，pH8.0；缓冲液B-20mM Tris-HCl+1M NaCl，pH8.0；0-100％B线性梯度30CV；即可得到具有高纯度和活性胰蛋白酶产品。

纯化的胰蛋白酶经电泳分析，纯度达到95％以上(图9)。

效果例重组牛胰蛋白酶的活性

以苯甲酰L-精氨酸乙酯(英文缩写为BAEE)为底物，用紫外吸收法进行测定。苯甲酰L-精氨酸乙酯在波长253nm下的紫外吸收远远弱于苯甲酰L-精氨酸(英文缩写为BA)。在胰蛋白酶的催化下，随着酯键的水解，苯甲酰L-精氨酸逐渐增多，反应体系的紫外吸收宜随之相应增加。

取2个光程为1厘米的带盖石英比色皿，分别加入25℃预热过的2.8ml底物溶液。向一只比色皿中加入0.2ml 0.001mol/LHCl，作为空白，校正仪器的253nm处光吸收零点。再在另一比色皿中加入0.2ml待测酶液，立即混匀并记时，每半分钟读数一次，共读3～4min。控制ΔA253/min在0.05～0.100左右为宜。

绘制酶促反应动力学曲线(图10)，从曲线上求出反应起始点吸光度随时间的变化率ΔA253/min。

胰蛋白酶活力单位的定义规定为：以BAEE为底物反应液pH8.0，25℃，反应体积3.0ml，光径1厘米的条件下，测定ΔA253/min，每分钟使ΔA253/min增加0.001，反应液中所加入的酶量为一个BAEE单位。

经测定，纯化后的重组胰蛋白酶的每毫克为10500BAEE单位活性。

Claims

1.一种包含牛胰蛋白酶原基因的表达载体，其特征在于牛胰蛋白酶原基因序列为Seq ID No.16-710。

2.根据权利要求1的表达载体，其特征在于，牛胰蛋白酶原基因Seq ID No.16-710插入质粒pET-22b(+)的McsI/XhoI酶切位点。

3.一种包含牛胰蛋白酶原基因的工程菌，其包含权利要求2所述的表达载体。

4.一种包含牛胰蛋白酶原基因的工程菌，其特征在于，由将权利要求2所述的表达载体转化大肠杆菌BL21DE3而获得。

5.一种重组牛胰蛋白酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)培养权利要求3或4任一所述的牛胰蛋白酶原基因的工程菌并诱导牛胰蛋白酶原基因表达；

(2)收集菌体；

(3)破碎菌体；

(4)收集包涵体，洗涤包涵体；

(5)包涵体变性和复性；

(6)胰蛋白酶原活化；

(7)活化的胰蛋白酶纯化。

6.根据权利要求5的制备方法，其特征在于：步骤(1)培养包含牛胰蛋白酶原基因的工程菌并诱导牛胰蛋白酶原基因表达具体为：接种重组工程菌阳性克隆200μl到20ml的LB培养基中，于30℃下摇床振荡培养过夜，按4％-10％接种量接过夜菌于500ml的LB培养基中，37℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度37℃，搅拌速度300rpm，通气量15L/min，pH为6.7，控制搅拌转速与通气量以维持溶氧始终在30％以上，培养基配方如下：发酵培养基：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50％氨水和30％磷酸用于发酵过程中pH调控；当培养基中养分耗尽、溶氧迅速上升时开始补料，控制补料速度、转速、通气保证控制溶氧在30％以上；补料4hr-6hr后，降温至20-30℃，调节pH至6.5-7.5，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG进行有氧诱导，溶氧不低于20％，继续培养4-10h后出罐，收集菌体。

7.根据权利要求5的制备方法，其特征在于，包涵体变性和复性的条件是：包涵体溶解缓冲液：0.2mol/L尿素+10mmol/LEDTA+25mmol/LTis-HCL，PH7.5，按重量体积比1∶5～15溶解过夜；溶解后的包涵体经离心，稀释到蛋白浓度0.1～0.5mg/ml，在复性缓冲液：0.2mol/L尿素+10mmol/LEDTA+25mmol/L Tis-HCL，GSH∶GSSG＝1mmol/L∶0.3mmol/L，PH10中，4℃复性过夜。