CN105368808A - 一种IdeS蛋白酶、其制备方法及应用 - Google Patents

一种IdeS蛋白酶、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物酶技术领域，具体涉及一种IdeS蛋白酶、其制备方法及应用，所述IdeS蛋白酶的氨基酸序列包含如SEQ？ID？NO.1所示的片段。本发明制备的IdeS蛋白酶可在大肠杆菌和/或毕赤酵母中可溶性高效表达，表达量高，仍具有IdeS蛋白酶的特异性酶活，可以特异性的酶切IgG抗体获得所要的抗体片段，且能进行固定化，以利于后期的工业化应用；且IdeS蛋白酶可通过工业化进行大规模生产，使得IdeS蛋白酶的大量生产成为可能，为IdeS的应用奠定了基础。

Description

一种IdeS蛋白酶、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物酶技术领域，具体涉及一种IdeS蛋白酶、其制备方法及应用。
背景技术
免疫球蛋白G降解酶IdeS(immunoglubulinG-degradingenzymeofStreptococcuspyogenes,IdeS)是由人类致病菌酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)产生并分泌至胞外的一种半胱氨酸水解酶。该蛋白酶具有极高的底物特异性，仅识别IgG，在抗体下铰链区的特定位点进行酶切，使IgG水解为完整的F(ab’)2片段和Fc片段。除了人源IgG，IdeS还可以切割多种动物来源的IgG，如小鼠、家兔、恒河猴、羊以及人动物嵌合IgG等。IdeS具有独特的酶活特异性，可以作为工具酶应用于IgG的Fab’和F(ab’)2亚单位制备、抗体药物或者抗体融合蛋白药物的结构表征分析。
到目前的研究发现，IdeS作用底物只有IgG类抗体，而且与胃蛋白酶和木瓜蛋白酶不同，IdeS切割位点专一性高，产物均一，酶切IgG后可以获得完整的F(ab’)2片段和Fc片段，其中，与抗原结合的F(ab’)2片段分子量大小约为100kDa，Fc片段的分子量大小为25kDa。随着抗体药物的发展及表征鉴定的常态化，蛋白酶IdeS的用量越来越大，原有的宿主菌提取纯化已经不能满足该酶的需求。
许静等人发表的“半胱氨酸蛋白酶IdeS的原核表达、纯化及活性鉴定”，中国生物工程杂志，2014,34(10)：8-14，利用原核表达载体Pgex-4T-2构建了一种新的双标签表达系统，对IdeS进行了高效重组表达。但是该酶的重组表达亦具有一定的局限，其表达量不高，较难大规模应用。
发明内容
本发明为了克服上述缺陷，本发明提供了一种IdeS蛋白酶、其制备方法及应用，该IdeS蛋白酶能够在大肠杆菌和/或毕赤酵母中可溶性高效表达，表达量高，仍具有IdeS蛋白酶的特性。
为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种IdeS蛋白酶，所述IdeS蛋白酶的氨基酸序列包含如SEQIDNO.1所示的片段，所述片段的序列如下：
DSFSANQEIRYSEVTPYHVTSVWTKGVTPPANFTQGEDVFHAPYVANQGWYDITKTFNGKDDLLCGAATAGNMLHWWFDQNKDQIKRYLEEHPEKQKINFNGEQMFDVKEAIDTKNHQLDSKLFEYFKEKAFPYLSTKHLGVFPDHVIDMFINGYRLSLTNHGPTPVKEGSKDPRGGIFDAVFTRGDQSKLLTSRHDFKEKNLKEISDLIKKELTEGKALGLSHTYANVRINHVINLWGADFDSNGNLKAIYVTDSDSNASIGMKKYFVGVNSAGKVAISAKEIKEDNIGAQVLGLFTLSTGQDSWNQTNHHHHHHSSG。
本发明中，通过酿脓链球菌现有基因数据库，通过基因工程手段将IdeS蛋白酶进行了改造，改造后的IdeS蛋白酶可在大肠杆菌和/或毕赤酵母中可溶性高效表达，仍具有IdeS蛋白酶的特异性酶活，可以特异性的酶切IgG抗体获得所要的抗体片段，IdeS作用底物只有IgG类抗体，而且与胃蛋白酶和木瓜蛋白酶不同，IdeS切割位点专一性高，产物均一，酶切IgG后可以获得完整的F(ab’)2片段和Fc/2片段，且纯化后的IdeS蛋白酶可进行固定，以利于工业生产上的固定化生产，使得IdeS蛋白酶作为一种特异、有效的酶制剂，可高效、反复使用。
优选地，所述IdeS蛋白酶含有319个氨基酸。
优选地，所述IdeS蛋白酶的核苷酸序列包含如SEQIDNO.2-3所示的片段，
所述SEQIDNO.2所述片段的序列如下：
GATAGCTTTAGCGCAAACCAGGAGATCCGCTATAGCGAGGTTACCCCGTATCACGTTACCAGCGTTTGGACCAAAGGCGTTACCCCGCCGGCCAACTTTACCCAGGGCGAAGACGTGTTTCATGCCCCGTATGTTGCCAATCAGGGCTGGTACGACATCACCAAAACCTTCAATGGCAAGGACGATCTGCTGTGCGGTGCCGCAACCGCCGGTAACATGCTGCACTGGTGGTTCGACCAGAATAAAGACCAGATCAAACGCTACCTGGAGGAACACCCGGAAAAACAGAAAATTAATTTCAACGGCGAACAGATGTTTGATGTGAAAGAAGCTATTGATACCAAGAACCACCAGCTGGACAGCAAGCTGTTCGAATATTTTAAGGAGAAAGCCTTCCCGTACCTGAGCACCAAACATCTGGGCGTGTTTCCGGACCATGTGATCGACATGTTCATCAACGGCTATCGCCTGAGCCTGACCAATCATGGTCCGACCCCGGTGAAAGAAGGTAGCAAAGATCCGCGCGGTGGTATCTTCGATGCCGTGTTTACACGTGGCGATCAGAGTAAGCTGCTGACCAGCCGCCATGATTTTAAAGAGAAAAATCTGAAAGAAATCAGCGATCTGATTAAGAAGGAGCTGACCGAGGGCAAAGCCCTGGGCCTGAGCCACACCTACGCCAATGTGCGCATCAACCACGTGATCAACCTGTGGGGTGCCGACTTTGATAGCAACGGCAACCTGAAGGCAATTTACGTGACCGACAGCGACAGCAATGCCAGTATTGGCATGAAAAAATACTTTGTTGGTGTGAACAGCGCCGGCAAAGTGGCAATCAGTGCCAAGGAGATCAAAGAAGATAACATCGGCGCCCAGGTTCTGGGTCTGTTTACCCTGAGCACAGGTCAGGATAGCTGGAATCAGACCAATCATCATCACCACCATCACAGTAGTGGT；
所述SEQIDNO.3所述片段的序列如下：
GATTCTTTCTCTGCCAATCAAGAGATACGTTATTCTGAGGTAACTCCTTACCATGTCACGTCCGTATGGACAAAGGGCGTTACCCCCCCAGCTAATTTTACACAAGGCGAGGATGTATTTCATGCTCCATACGTTGCTAACCAGGGATGGTATGATATTACTAAGACTTTTAATGGGAAAGACGACTTGCTGTGTGGTGCAGCTACCGCTGGAAATATGTTACACTGGTGGTTCGACCAGAACAAAGATCAAATCAAGCGTTATTTGGAAGAGCATCCCGAGAAACAAAAAATTAACTTCAACGGAGAACAAATGTTCGATGTAAAAGAGGCTATCGATACAAAGAATCATCAACTTGACTCCAAGTTGTTTGAGTACTTTAAGGAAAAGGCATTTCCTTACTTATCTACCAAGCATTTGGGAGTCTTCCCTGATCACGTGATTGACATGTTTATCAATGGCTACAGATTATCTTTGACTAATCACGGACCAACCCCAGTCAAGGAAGGAAGTAAGGACCCTCGAGGTGGGATCTTCGACGCTGTGTTCACTAGAGGAGATCAATCTAAGCTATTGACTTCCAGGCACGATTTCAAAGAAAAAAACTTAAAAGAGATCAGTGACCTGATTAAGAAGGAGCTAACCGAAGGCAAGGCTCTAGGATTGTCTCACACTTATGCAAACGTTAGGATAAATCATGTTATAAACTTATGGGGGGCTGATTTTGATAGTAATGGGAACCTGAAGGCCATCTACGTTACCGACTCCGACAGTAATGCCTCCATTGGCATGAAGAAGTACTTTGTTGGCGTTAACTCCGCCGGTAAAGTTGCCATTTCCGCTAAAGAAATCAAGGAAGATAACATCGGTGCCCAAGTGCTAGGCTTATTTACTCTAAGTACTGGACAAGACTCCTGGAACCAGACAAATCATCATCACCACCATCACTCATCAGGTTGT。
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的IdeS蛋白酶的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)通过基因合成技术获得所述IdeS蛋白酶的核苷酸序列，并将IdeS蛋白酶的核苷酸序列重组到表达载体中，构建重组载体；
(2)将重组载体转化到表达菌中，得到含有所述IdeS蛋白酶核苷酸序列的阳性表达菌，对所述阳性表达菌扩大发酵培养，诱导所述IdeS蛋白酶蛋白表达。
优选地，所述IdeS蛋白酶的核苷酸序列包含如SEQIDNO.2-3所示的片段。
优选地，步骤(2)所述的表达菌为大肠杆菌和/或毕赤酵母。
优选地，所述SEQIDNO.2所示的片段在大肠杆菌中可溶性表达。
优选地，所述SEQIDNO.3所示的片段在毕赤酵母中可溶性表达。
优选地，步骤(2)所述的发酵培养的培养温度为30-37℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃。
优选地，所述发酵培养的溶氧量为20-30％，例如可以是20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％。
优选地，所述发酵培养的pH为6.8-7.2，例如可以是6.8、6.9、7、7.1或7.2。
优选地，所述发酵培养中通过底物限制流加及好氧深层发酵培养12-72h，例如可以是12h、13h、14h、15h、18h、20h、22h、25h、26h、28h、30h、35h、38h、40h、42h、45h、48h、50h、55h、58h、60h、62h、65h、68h、70h或72h，优选为15-65h加入诱导剂诱导所述IdeS蛋白酶蛋白表达。
优选地，所述阳性表达菌经过验证正确后，进行扩大工业化生产IdeS蛋白酶。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的IdeS蛋白酶在免疫球蛋白G降解中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明制备的IdeS蛋白酶可在大肠杆菌和/或毕赤酵母中可溶性高效表达，表达量高，仍具有IdeS蛋白酶的特异性酶活，可以特异性的酶切IgG抗体获得所要的抗体片段，且能进行固定化，以利于后期的工业化应用；
(2)本发明制备的IdeS蛋白酶可通过工业化进行大规模生产，使得IdeS蛋白酶的大量生产成为可能，为IdeS的应用奠定了基础。
附图说明
图1为本发明构建的大肠杆菌表达载体-IdeS的质粒示意图；
图2为本发明构建的酵母表达载体-IdeS的质粒示意图；
图3为本发明表达载体-IdeS在大肠杆菌中的表达产物及其纯化产物，其中，1-蛋白marker，2-诱导前表达产物，3-诱导1h后表达产物，4-诱导2h后表达产物，5-诱导3h后表达产物；
图4为本发明制备的IdeS蛋白酶对免疫球蛋白G的酶切效果，其中，1-蛋白marker，2-完整的免疫球蛋白IgG，3-免疫球蛋白IgG使用IdeS蛋白酶酶切后产生F(ab’)2片段和Fc/2片段。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1：制备IdeS蛋白酶—大肠杆菌
通过基因合成技术获得所述IdeS蛋白酶的核苷酸序列，并将IdeS蛋白酶的核苷酸序列重组到表达载体pET32a中，构建重组表达载体。将所述测序证明正确的重组表达载体转化到表达菌BL21大肠杆菌中，得到含有所述IdeS蛋白基因序列的阳性表达菌。
具体地，挑取6个单菌落37℃过夜培养。将过夜培养的菌液以1:100的比例加入5mLAmp+LB培养基中，37℃220rpm培养2-3h。取出1mL菌液作为未诱导对照，其余按照体积加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃180rmp培养4h。取100uL菌液12000g离心10min，取上清，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，沸水浴5min，取上清用12％SDS-PAGE电泳检测。
结果如图3所示，采用大肠杆菌表达系统表达IdeS蛋白酶，诱导三小时后可获得超过20％菌体蛋白百分比的产物量。
实施例2：制备IdeS蛋白酶—毕赤酵母
通过基因合成技术获得所述IdeS蛋白酶的核苷酸序列，并将IdeS蛋白酶的核苷酸序列克隆到表达载体pPICα中，构建重组表达载体。将所述测序证明正确的重组表达载体采用电穿孔法转化到KM71H酵母菌中，得到含有所述IdeS蛋白基因序列的阳性表达菌。
具体地，挑取10个单菌落接种至含10mlBMGY培养基的125ml摇瓶中。30℃，250rpm培养2天。收集所有菌体离心，将离心所得菌体用1mLBMMY培养基重悬，30℃，300rpm培养过夜。第二天，取100μL菌液，加入100μL40％的甲醇进行诱导，30℃，300rpm培养过夜，制备得到毕氏酵母表达的IdeS蛋白酶。
实施例3：IdeS蛋白酶的工业化生产
采用大肠杆菌发酵培养获得Ides蛋白酶，经摇瓶培养逐步扩大到1000L发酵罐规模的发酵生产。大肠杆菌在碳源、氮源、无机盐、维生素及微量元素中生长，可加入消泡剂控制泡沫，如消泡剂Antifoam204。
以补料流加和深层通气培养方式生产，选择葡萄糖或甘油作为限制性碳源控制流加。发酵温度37℃，通过补加25％氨水控制pH7.0；发酵罐通气量选择为0.5-2.0vvm，通过控制补料速率、搅拌速率和通气量实现溶氧值在30％左右。在发酵培养过程中，定期取样，测定培养基的光密度OD600nm，当OD600nm达到一定值后，加入诱导剂IPTG诱导培养3-8小时后结束发酵，采用连续流离心机或碟式离心机分离菌体获得上清液，离心温度为4-10℃。
实施例4：IdeS蛋白酶酶切IgG抗体
取10mg纯化后的IdeS蛋白酶加入1g高纯度免疫球蛋白IgG中，37℃反应消化30分钟后，取消化前后的蛋白进行12％SDS-PAGE非还原电泳检测，检测结果如图4所示。
从图4可以看出，IdeS蛋白酶作用底物只有IgG类抗体，而且与胃蛋白酶和木瓜蛋白酶不同，IdeS切割位点专一性高，产物均一，酶切IgG后可以获得完整的F(ab’)2片段和Fc/2片段，其中，与抗原结合的F(ab’)2片段分子量大小约为100kDa，Fc/2片段的分子量大小为25kDa。
综上所述，本发明制备的IdeS蛋白酶可在大肠杆菌和/或毕赤酵母中可溶性高效表达，表达量高，仍具有IdeS蛋白酶的特异性酶活，可以特异性的酶切IgG抗体获得所要的抗体片段，且能进行固定化，以利于后期的工业化应用，且本发明制备的IdeS蛋白酶可通过工业化进行大规模生产，使得IdeS蛋白酶的大量生产成为可能，为IdeS的应用奠定了基础。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (9)

1.一种IdeS蛋白酶，其特征在于，所述IdeS蛋白酶的氨基酸序列包含如SEQIDNO.1所示的片段。
2.根据权利要求1所述的IdeS蛋白酶，其特征在于，所述IdeS蛋白酶的核苷酸序列包含如SEQIDNO.2-3所示的片段。
3.一种如根据权利要求1-2中任一项所述的IdeS蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)通过基因合成技术获得所述IdeS蛋白酶的核苷酸序列，并将IdeS蛋白酶的核苷酸序列重组到大肠杆菌的pET系列表达载体和/或毕氏酵母的pPICα系列表达载体，构建重组载体；
(2)将重组载体转化到表达菌中，得到含有所述IdeS蛋白酶核苷酸序列的阳性表达菌，对所述阳性表达菌扩大发酵培养，诱导所述IdeS蛋白酶蛋白表达。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述IdeS蛋白酶的核苷酸序列包含如SEQIDNO.2-3所示的片段。
5.根据权利要求3-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的表达菌为大肠杆菌和/或毕赤酵母；
优选地，所述SEQIDNO.2所示的片段在大肠杆菌中可溶性表达；
优选地，所述SEQIDNO.3所示的片段在毕赤酵母中可溶性表达。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的发酵培养的培养温度为30-37℃；
优选地，所述发酵培养的溶氧量为20-30％；
优选地，所述发酵培养的pH为6.8-7.2。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养中诱导剂加入的时间为发酵培养开始后12-72h，优选为15-65h。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述阳性表达菌经过验证正确后，进行扩大工业化生产IdeS蛋白酶。
9.一种如权利要求1-3中任一项所述的IdeS蛋白酶在免疫球蛋白G降解中的应用。
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