CN110950937B - 一种改造的艾克曼菌Amuc_1100蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种改造的艾克曼菌Amuc_1100蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种改造的艾克曼菌Amuc_1100蛋白及其制备方法和应用，属于蛋白质工程技术领域，通过对现有艾克曼菌Amuc_1100蛋白进行改造，包括全部或部分截去Amuc_1100蛋白N端前60‑90个氨基酸的改造、或对Amuc_1100蛋白N端60‑90氨基酸范围内的一些氨基酸进行突变，发现无论是截短改造，还是氨基酸突变，均可以改变Amuc_1100蛋白的聚集状态，同时还提高了Amuc_1100蛋白的生物活性，为开发具有更高效的药物提供了很好的应用前景。

Description

一种改造的艾克曼菌Amuc_1100蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及的是蛋白质工程技术领域，尤其涉及的是一种改造的艾克曼菌Amuc_1100蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
艾克曼菌Akkermansia muciniphila(A.muciniphilas)是在2004发现的定殖于人肠道粘液层的降解粘蛋白的肠道微生物1。近期的研究结果显示A.muciniphilas可缓解肥胖和代谢性疾病的症状2-4,使其逐渐成为一种新型的有益菌用于人类健康研究。在A.muciniphilas的研究逐渐深入的同时，其外膜蛋白也逐渐被关注。Amuc_1100蛋白是在2016年发现的一种A.muciniphilas的外膜蛋白5，研究结果显示该蛋白具有与A.muciniphilas相同的减轻小鼠体重，提高小鼠葡萄糖以及胰岛素的耐受性的效果6，此外Amuc_1100还可以作用于人Toll样受体2(TLR2)调节IL-10、TNF-α、IL-6、IL-8等炎症因子的表达，也可通过调节肠道紧密连接蛋白的表达增强肠道屏障功能从提高宿主的肠道屏障功能7，这些实验结果预示了Amuc_1100将有可能作为一种新型的蛋白药物用于治疗人类肥胖及肠道免疫相关疾病。
虽然目前的研究结果显示Amuc_1100蛋白具有抑制肥胖，二型糖尿病和提高人肠道免疫功能，但是其分子机制不清楚，因此不能研发出具有更加高效的蛋白药物。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种改造的艾克曼菌Amuc_1100蛋白及其制备方法和应用，以通过改造传统的艾克曼菌Amuc_1100蛋白，获得一种更加高效的蛋白药物。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种改造的艾克曼菌Amuc_1100蛋白，该蛋白的氨基酸序列为艾克曼菌Amuc_1100蛋白N端的前60-90个氨基酸全部或部分截短后的序列，或为艾克曼菌Amuc_1100蛋白N端的前90个氨基酸中，至少一个疏水性氨基酸发生突变的氨基酸序列。
作为本发明进一步的优化方案，所述蛋白为艾克曼菌Amuc_1100蛋白N端的前80-85个氨基酸全部或部分截短后的序列。
作为本发明进一步的优化方案，所述疏水性氨基酸包括L68、L72、Y75、A76、A78、V79、L217，进一步地，所述突变指L68R、L72E、Y75E、A76R、V79E和L217R的一个或多个突变。
作为本发明进一步的优化方案，所述艾克曼菌Amuc_1100蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
作为本发明进一步的优化方案，编码所述艾克曼菌Amuc_1100蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述改造的艾克曼菌Amuc_1100蛋白的制备方法，步骤包括：
步骤S1、利用基因合成技术获得改造的艾克曼菌Amuc_1100蛋白的基因，将该基因构建在pET-22b载体上，获得pET22b-Amuc_1100重组质粒；
步骤S2、以pET22b-Amuc_1100重组质粒作为模板，设计特异性扩增引物，并进行PCR扩增获得改造的Amuc_1100基因的目的片段，将目的片段构建在pET-22b载体上，获得改造的Amuc_1100重组质粒；
步骤S3、利用大肠杆菌原核表达系统表达改造的Amuc_1100重组质粒，并利用Ni-NTA柱纯化获得艾克曼菌Amuc_1100蛋白。
本发明还提供了上述改造的艾克曼菌Amuc_1100蛋白在作为抑制肥胖药物中的应用。
本发明还提供了上述改造的艾克曼菌Amuc_1100蛋白在作为治疗二型糖尿病药物中的应用。
本发明还提供了上述改造的艾克曼菌Amuc_1100蛋白在作为提高人肠道免疫功能药物中的应用。
本发明根据现有技术的研究结果，虽然Amuc_1100蛋白可能成为一种具有医用开发价值的药物，但是其发挥有益作用的机制不是非常明确，通过深入研究Amuc_1100蛋白的作用机制，发现Amuc_1100与TLR2的直接相互作用，从而揭示了其生物活性的产生机制，为Amuc_1100蛋白的药物开发提供了新的思路。
基于上述原理，本发明通过对现有艾克曼菌Amuc_1100蛋白进行改造，提供了一种改造的艾克曼菌Amuc_1100蛋白及其制备方法和应用，与现有技术相比，本发明通过截去Amuc_1100蛋白N端80个氨基酸的改造、通过对Amuc_1100蛋白N端60-90氨基酸范围内的一些氨基酸进行突变，发现无论是截短改造，还是氨基酸突变，均可以改变Amuc_1100蛋白的聚集状态，同时还提高了Amuc_1100蛋白的生物活性，为开发具有更高效的药物提供了很好的应用前景。
附图说明
图1为重组Amuc_1100蛋白Ni-NTA柱纯化结果；
图2为重组Amuc_1100Δ80Ni-NTA柱纯化图；
图3为重组Amuc_1100L72E/V79E双突变蛋白Ni-NTA柱纯化图；
图4为重组Amuc_1100和Amuc_1100Δ80蛋白凝胶过滤层析图；
图5为重组Amuc_1100，Amuc_1100L68R和Amuc_1100L72E蛋白凝胶过滤层析图；
图6为重组Amuc_1100与Amuc_1100L72E/V79E双突变蛋白凝胶过滤层析图；
图7为重组Amuc_1100与Amuc_1100-6M六突变蛋白凝胶过滤层析图；
图8为重组Amuc_1100蛋白与hTLR2相互作用；
图9为重组Amuc_1100和Amuc_1100Δ80蛋白与hTLR2相互作用；
图10为重组Amuc_1100和Amuc_1100-6M蛋白与hTLR2相互作用。
具体实施方式
实施例1
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1艾克曼菌Amuc_1100蛋白(Amuc_1100)构建表达及纯化
本发明用基因合成技术获得Amuc_1100蛋白的基因，将其基因构建在pET-22b载体上，利用大肠杆菌原核表达系统大量表达了Amuc_1100蛋白并利用Ni-NTA柱纯化获得了高纯度的重组蛋白，具体步骤包括：
2.1.1重组质粒的构建
(1)根据SEQ ID NO.2所示的野生型Amuc_1100蛋白编码基因的核苷酸序列，利用基因合成技术合成Amuc_1100蛋白的基因，将Amuc_1100蛋白的基因两端分别添加NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，合成后的基因构建在pUC57载体上，获得pUC57-Amuc_1100质粒，备用；
(2)利用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切pUC57-Amuc_1100质粒和pET-22b载体，酶切体系如下：
双酶切的反应在37℃恒温水浴锅内完成，具体操作是按照下列酶切体系加入相应体积的反应物至1.5ml EP管内，用封口膜封好EP管口后放置在37℃恒温水浴锅内，酶切3小时。酶切体系见表1-1。
表1-1 PCR产物和载体的双酶切体系
Figure BDA0002286802500000041
将双酶切后的PCR产物和载体分别进行胶回收，获得目的片段和载体片段，胶回收结束后，用0.8％的凝胶电泳检测是否回收成功。
(3)目的基因、载体连接反应
目的片段和载体片段的连接反应主要是利用T4 DNA连接酶完成，本实验中用到的连接酶为T4 DNA连接酶(Thermo)，连接反应的是在25℃连接3小时完成。连接体系见表1-2，获得pET22b-Amuc_1100重组质粒。
表1-2连接体系
Figure BDA0002286802500000042
Figure BDA0002286802500000051
(4)重组质粒转化DH5α感受态细胞
1)从-80℃冰箱中取出DH5α感受态菌株，迅速将感受态菌株放置在冰上解冻8min。
2)超净台内将融化的200μl的感受态细胞，用移液器转移至上述步骤(3)的连接体系中，轻轻混匀，冰上放置30min。
3)42℃水浴锅内热激80s，冰上放置8min。
4)超净台内取500μl的LB培养液加入热激后的细胞中，在摇床上37℃，140rpm，振荡孵育40min。
5)5000rpm，离心2min，弃400μl上清后，吹吸沉淀，将混匀的菌液用玻璃棒均匀的涂布在LB固体培养基上，将固体培养基放入37℃恒温培养箱中正置培养，30min后将平板倒置继续过夜培养。
6)挑取过夜培养平板上的单克隆菌株，放在4ml LB液体培养基的小试管中，37℃，220rpm，过夜培养。
(5)重组子的检测
经菌液PCR以及双酶切鉴定均为阳性的克隆送至公司进行测序，测序成功的单克隆转化BL21菌株进行试表达。
2.1.2pET22b-Amuc_1100重组质粒试表达
将转化BL21的单克隆菌转移至4ml LB培养基的小试管内加入相应抗性的抗生素，在小试管内接20μl甘油菌种在37℃恒温摇床内，220rpm培养至菌液OD600到达0.6～0.8之间。从培养基中吸取500μl菌液离心，去除上清，留沉淀加入100μl 2×上样缓冲液重悬菌体固定作为诱前样品。在剩下的菌液中加入终浓度为0.8mM的IPTG，37℃恒温摇床内，220rpm进行诱导培养5hr。
2.1.3pET22b-Amuc_1100重组质粒可溶性检测
(1)在试表达结果显示Amuc_1100蛋白表达后，将含pET22b-Amuc_1100重组质粒菌种转移至200ml LB培养液中进行培养，与试表达相同，在菌液OD600到达0.6～0.8之间时，加入0.4mM IPTG，16℃，诱导20小时。
(2)收集菌块进行超声破碎，破碎缓冲液为50mM Tris-HCl，pH7.5,300mM NaCl，将破碎后的溶液10000rpm，离心1小时。
(3)收集细胞上清进行Ni-NTA纯化，用含有不同梯度咪唑溶液的缓冲液洗脱蛋白，最终获得了纯度较高的Amuc_1100重组蛋白(图1)。
2.2Amuc_1100截短体蛋白构建表达及纯化
2.2.1Amuc_1100截短体蛋白的构建表达
用pET22b-Amuc_1100重组质粒作为模板，构建Amuc_1100蛋白N端60、80、85、90个氨基酸的截短体Amuc_1100Δ60、Amuc_1100Δ80、Amuc_1100Δ85、Amuc_1100Δ90。本实施例以Amuc_1100Δ80截短体蛋白构建过程为例，进行详细阐述。
设计编码Amuc_1100Δ80截短体蛋白的基因的特异性扩增引物：
上游引物：GAATTCCATATGAGCCTGGAAACCGCC
下游引物：CCGCTCGAGATCTTCAGACGGTTCCTG
以pET22b-Amuc_1100重组质粒为模板进行PCR扩增，获得81-317位氨基酸相对应的目的片段。将目的片段用NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切后连接在pET22b载体上，经测序鉴定成功后转化BL21菌株，用4ml LB培养基进行试表达，获得pET22b-Amuc_1100Δ80重组质粒。
2.2.2Amuc_1100截短体蛋白的Ni-NTA纯化
将含有pET22b-Amuc_1100Δ80重组质粒的BL21菌株在200ml LB培养基内进行扩大培养，待OD600达到0.6-0.8之间时用0.4mM IPTG，16℃诱导20小时，用裂解缓冲液(50mMTris-HCl，pH7.5,300mM NaCl)吹匀菌块后，利用超声破碎破碎细胞，10000rpm，离心1小时获得细胞上清，之后利用Ni-NTA纯化获得Amuc_1100Δ80重组蛋白(图2)。
2.3Amuc_1100系列突变体蛋白构建、表达及纯化
突变体的构建采用的是定点突变技术即利用PCR反应和错配引物将突变位点引入野生型基因，利用甲基化酶(DpnI)特异性的切除未突变的甲基化的模板，进而获得突变后的基因的方法，具体实验步骤如下：
2.3.1设计Amuc_1100第68位(L→R)突变体L68R，第72位(L→E)突变体L72E，第72位(L→E)和第79位(V→E)的L72E/V79E双突变体，以及L68R/L72E/Y75E/A76R/V79E/L217R的6M六突变体的引物，引物如下：
表3-1点突变PCR引物
Figure BDA0002286802500000061
Figure BDA0002286802500000071
2.3.2点突变PCR用的酶为PrimeStar酶，按照下列反应体系加入相应的组分。
表3-2点突变PCR反应体系
Figure BDA0002286802500000072
表3-3点突变PCR反应体参数
Figure BDA0002286802500000073
PCR产物进行胶回收，依照凝胶回收试剂盒说明书。
2.3.3将回收后的产物用DpnI酶，37℃，进行酶切3小时去除模板，酶切体系如下：
表3-4 DpnI酶切体系
Figure BDA0002286802500000081
2.3.4将DpnI酶切后产物转化DH5α菌株，挑取单克隆进行测序，最后将测序成功的单克隆转化BL21菌株进行表达。
2.3.5按照2.1.2、2.1.3中相同的方法表达Amuc_1100突变体蛋白，利用Ni-NTA柱纯化突变体蛋白，如图3所示为L72E/V79E双突变蛋白Ni-NTA柱纯化图。
2.4Amuc_1100、Amuc_1100Δ80、Amuc_1100系列突变体蛋白凝胶过滤层析收集Ni-NTA柱纯化后的Amuc_1100、Amuc_1100Δ80、Amuc_1100系列突变体蛋白，浓缩至2mL，之后将样品用HiLoad 16/60Superdex 200凝胶柱进行进一步纯化，结果如图4-7所示。
2.5Amuc_1100、Amuc_1100截短体以及Amuc_1100突变体蛋白与TLR2的体外实验
2.5.1纯化无标签的Amuc_1100、Amuc_1100截短体蛋白(以Amuc_1100Δ80为例)以及Amuc_1100突变体蛋白
(1)设计Amuc_1100，Amuc_1100Δ80以及Amuc_1100突变体蛋白编码基因的PCR扩增引物，上游N端带有NcoI酶切位点，下游C端带有XhoI酶切位点，相应的引物如下表5-1所示：
表5-1：引物列表
Figure BDA0002286802500000082
Figure BDA0002286802500000091
(2)根据2.1中的方法进行PCR目的片段的扩增，目的片段进行双酶切后，连接到插入有His-TEV标签的pET28a载体(pET28a-HISTEV载体)上，构建获得pET28a-HISTEV-Amuc_1100,pET28a-HISTEV-Amuc_1100Δ80,pET28a-HISTEV-Amuc_1100重组质粒；
(3)将构建的pET28a-HISTEV-Amuc_1100,pET28a-HISTEV-Amuc_1100Δ80,pET28a-HISTEV-Amuc_1100重组质粒转化DH5α菌株，经测序成功后转化BL21表达菌株；
(4)利用大肠杆菌BL21表达重组pET28a-HISTEV-Amuc_1100及其突变体后，用Ni-NTA纯化带有His-TEV标签的重组蛋白；
(5)用TEV酶按照酶：蛋白为1：:10的比例4℃过夜酶切去掉N端的His-TEV标签，重新用Ni-NTA纯化去掉His-TEV标签获得无标签蛋白；
2.5.2Amuc_1100、Amuc_1100截短体以及Amuc_1100突变体蛋白与TLR2的体外相互作用实验
Amuc_1100、Amuc_1100截短体以及Amuc_1100突变体蛋白与TLR2的体外相互作用是用ForteBio仪器完成。将人TLR2的胞外域(hTLR2，氨基酸残基1-587)用PBS稀释至50μg/mL将其用Ni-NTA探针表面流动120s进行固定。
将不带标签的Amuc_1100作为流动相，并用PBS稀释，重组蛋白浓度为150nM，hTLR2蛋白浓度为30ug/mL。结合时间为300s，解离时间为300s。实验结果显示Amuc_1100可以与hTLR2发生直接的相互作用(图8)。
将不带标签的Amuc_1100和Amuc_1100截短体(Amuc_1100Δ80)作为流动相，并用PBS稀释，重组蛋白浓度分别为150nM，300nM和600nM，hTLR2蛋白浓度为30ug/mL。结合时间为300s，解离时间为300s。实验完成后，减去空白对照响应值。实验结果显示Amuc_1100截短体的生物活性比Amuc_1100有明显提高(图9)。
将不带标签的Amuc_1100和Amuc_1100-6M突变蛋白作为流动相，并用PBS稀释，重组蛋白浓度为300nM，hTLR2蛋白浓度为30ug/mL。结合时间为300s，解离时间为300s。实验完成后，减去空白对照响应值。实验结果显示Amuc_1100突变体的生物活性比Amuc_1100有明显提高(图10)。
3、结论
Amuc_1100蛋白以单体形式存在，而Amuc_1100在其它物种的同源蛋白都以二聚体形式存在，其中，Amuc_1100蛋白N端的第一个α螺旋对于稳定蛋白的单体形式非常重要。为了提高Amuc_1100蛋白的生物活性，本发明通过截去Amuc_1100蛋白N端60-90个氨基酸，利用与表达Amuc_1100蛋白相同的方法在大肠杆菌原核表达系统中表达了Amuc_1100截短体蛋白，并通过Ni-NTA柱纯化获得了高纯度的重组Amuc_1100截短体蛋白。检测蛋白的聚集状态时发现截短体蛋白在SEC纯化柱上的出峰位置较野生型的蛋白发生了前移(图4)，说明蛋白发生了二聚化。
为了验证Amuc_1100截短体蛋白聚集状态的变化是否会影响其生物活性，本发明比较了Amuc_1100截短体蛋白与野生型Amuc_1100蛋白的生物活性，实验结果显示，Amuc_1100截短体蛋白的生物活性有显著的提高(图9)，提示Amuc_1100截短体相比较野生型Amuc_1100具有更高的应用价值。
截去N端的若干氨基酸改变了Amuc_1100蛋白的聚集状态并且会提高Amuc_1100的生物活性，因此本发明还在前60-90个氨基酸之间进行了一系列的突变，采用全质粒PCR方法构建了L68R，L72E两个突变体质粒，并且获得了高纯度的突变体蛋白。检测蛋白的聚集状态发现L68R和L72E两个突变体蛋白在SEC纯化柱上的出峰位置较野生型的蛋白发生了前移(图5)，提示着这些突变体蛋白同样可以改变蛋白聚集状态，可能同样具有更高的应用价值。
在单突变的基础上，本发明又进行双突变组合突变，通过构建L72E/V79E双突变蛋白并且获得了高纯度的突变体蛋白。检测蛋白的聚集状态发现L72E/V79E双突变蛋白在SEC纯化柱上的出峰位置较野生型的蛋白发生了前移(图6)，提示着该突变体蛋白可以改变蛋白聚集状态，具有更高的应用价值。
在单突变和双突变的基础上，本发明还发现Amuc_1100蛋白的60-90之间的疏水性氨基酸影响了蛋白的聚集状态，因此本发明将这些主要的疏水性氨基酸进行了全部突变，构建了L68R/L72E/Y75E/A76R/V79E/L217R六突变体蛋白(Amuc_1100-6M)并且获得了高纯度的突变体蛋白，检测聚集状态发现其出峰位置发现了明显的前移(图7)，为了验证其生物活性是否发生了改变，我们也比较了其与野生型Amuc_1100蛋白的生物活性，结果发现六突变体蛋白的生物活性比野生型Amuc_1100蛋白的生物活性也有明显提高(图10)。
以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。
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Claims (5)

1.一种改造的艾克曼菌Amuc_1100蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列为艾克曼菌Amuc_1100蛋白N端的前80个氨基酸全部截短后的序列，或为艾克曼菌Amuc_1100蛋白N端的前90个氨基酸中，存在L68R、L72E、V79E、Y75E、A76R和A85E的突变，所述艾克曼菌Amuc_1100蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种如权利要求1所述的改造的艾克曼菌Amuc_1100蛋白的制备方法，其特征在于，步骤包括：
步骤S1、利用基因合成技术获得所述改造的艾克曼菌Amuc_1100蛋白的基因，将该基因构建在pET-22b载体上，获得pET22b-Amuc_1100重组质粒；
步骤S2、以pET22b-Amuc_1100重组质粒作为模板，设计特异性扩增引物，并进行PCR扩增获得改造的Amuc_1100基因的目的片段，将目的片段构建在pET-22b载体上，获得改造的Amuc_1100重组质粒；
步骤S3、利用大肠杆菌原核表达系统表达改造的Amuc_1100重组质粒，并利用Ni-NTA柱纯化获得艾克曼菌Amuc_1100蛋白。
3.一种如权利要求1所述的艾克曼菌Amuc_1100蛋白在制备抑制肥胖药物中的应用。
4.一种如权利要求1所述的艾克曼菌Amuc_1100蛋白在制备治疗二型糖尿病药物中的应用。
5.一种如权利要求1所述的艾克曼菌Amuc_1100蛋白在制备提高人肠道免疫功能药物中的应用。
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