TW202328429A - 一種經遺傳修飾的微生物及其應用 - Google Patents

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向斌
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Abstract

本發明提供了一種經遺傳修飾的微生物及其應用。所述經遺傳修飾的微生物表現至少一種、兩種或三種外源基因(Amuc_1100多肽、IL-10和/或IL-22)。本發明的經遺傳修飾的微生物在整合了外源目標基因後仍然能夠穩定存活、在腸道內高效表現和分泌這些外源基因所編碼的蛋白質或多肽，並且所述表現分泌的外源基因編碼的蛋白質或多肽仍然能夠具有較好的活性，從而用於發炎性疾病或自體免疫類疾病的治療(例如，腸炎、關節炎)。

Description

一種經遺傳修飾的微生物及其應用
本申請主張申請日為2021/11/26的中國專利申請2021114207638的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
本發明屬於生物醫藥領域，具體地涉及一種經遺傳修飾的微生物及其應用。
發炎是身體清除體內致病源或受損細胞來幫助組織修復的正常反應。免疫系統紊亂常導致異常發炎，涉及免疫系統的發炎性疾病通常是一大類人類疾病的基礎。
自體免疫疾病是一種對正常身體部位有異常免疫反應的疾病。僅在美國就有至少80種自體免疫性疾病影響著2400萬人。目前的治療方法包括非甾體抗發炎藥(NSAIDs)和免疫抑制劑。然而，這些治療只能夠緩解症狀，而無法徹底治癒。而且，這些治療通常會引起嚴重的副作用。
自體免疫疾病是多個致病信號途徑導致的複雜疾病。目前，已經批准的針對單個信號途徑的藥物表現出有限的治療效果，這暗示調節多信號途徑應該能有更好的治療效果。然而，對於多信號途徑的調節的研究十分有限。首先，尚不知調節哪些多個信號途徑有效。其次，尚不知怎樣的藥物方法學能更有效地調節多個信號途徑。由於缺乏有效的治療方法，業界在發現和開發治療自體免疫疾病的新方法方面付出了巨大的努力，卻尚未獲得顯著進展。
因此，本領域迫切需要開發出一種更加高效的治療發炎或自體免疫性疾病的方法。
在一個方面，本發明提供一種經遺傳修飾的微生物，其包含至少兩種分別編碼選自下組的多肽的外源基因：a) Amuc_1100多肽；b) IL-10多肽；以及c) IL-22多肽。
在一些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物包含分別編碼下述多肽的外源基因：a) Amuc_1100多肽和IL-10多肽；b) IL-10多肽和IL-22多肽；或者c) Amuc_1100多肽和IL-22多肽。在一些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物包含分別編碼Amuc_1100多肽、IL-10多肽和IL-22多肽的外源基因。
在另一方面，本發明提供了經遺傳修飾的微生物組合，其中所述經遺傳修飾的微生物組合中包含至少兩種不同的經遺傳修飾的微生物，其中每種經遺傳修飾的微生物各自分別表現至少一種不同的外源基因；其中所述外源基因分別編碼選自下組的多肽：a) Amuc_1100多肽；b) IL-10多肽；以及c) IL-22多肽。
在一些實施方式中，其中所述外源基因編碼的多肽能夠被所述微生物表現和/或在表現後能夠被分泌到細胞外/微生物體外。
在一些實施方式中，所述微生物能夠在人或者動物的腸道中表現和/或分泌所述外源基因編碼的多肽。
在一些實施方式中，所述分泌是透過所述微生物的原生或非原生的分泌系統實現的。
在一些實施方式中，所述Amuc_1100多肽、IL-10多肽和/或IL-22多肽是去除了自體信號肽的多肽。
在一些實施方式中，所述去除了自體信號肽的Amuc_1100多肽、IL-10多肽和/或IL-22多肽還分別信號肽連接，例如Amuc_1100多肽、IL-10多肽和/或IL-22多肽分別與第一信號肽、第二信號肽或第三信號肽連接，並且所述第一信號肽、第二信號肽和第三信號肽能夠將所述多肽分泌到微生物體外。
在另一方面，本發明提供一種包含至少一個重組表現匣的核苷酸序列，其包含i) 至少一種或至少兩種分別編碼Amuc_1100多肽、IL-10多肽和/或IL-22多肽的外源基因，以及ii)可操作地連接所述至少一種或至少兩種外源基因的一個或多個調控元件。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列包含分別編碼Amuc_1100多肽和IL-10多肽的外源基因、分別編碼IL-10多肽和IL-22多肽的外源基因，或分別編碼Amuc_1100多肽和IL-22多肽的外源基因。
在一些實施方式中，所述核苷酸序列包含分別編碼Amuc_1100多肽、IL-10多肽和IL-22多肽的外源基因。
在另一方面，本發明提供一種組成物，其中所述組成物包含：(a)作為活性成分的本發明所述的經遺傳修飾的微生物；和(b)生理學上或藥理學上可接受的載劑。
在一些實施方式中，所述組成物是藥物組成物。
在一些實施方式中，所述組成物為口服製劑。
在另一方面，本發明提供一種本發明所述的經遺傳修飾的微生物或組成物在用於製備治療或預防發炎性疾病或自體免疫疾病的藥物中的用途。
在一些實施方式中，所述的自體免疫疾病選自下組：發炎性腸病、移植物抗宿主病(GvHD)、系統性紅斑狼瘡(SLE)、關節炎、哮喘，或其組合。
在另一方面，本發明提供一種本發明所述的經遺傳修飾的微生物或組成物在製備用於改善發炎性疾病或自體免疫疾病治療藥物的治療效果的藥物中的用途。
在另一方面，本發明提供一種本發明經遺傳修飾的微生物的製備方法，其中所述的製備方法包括步驟：向微生物中引入本發明所述的核苷酸序列，以使得所述核苷酸序列中的外源基因可以在所述微生物中表現。
在另一方面，本發明提供一種在有需要的個體中治療或預防發炎性疾病或自體免疫疾病的方法，其包括：向所述個體施用有效量的本發明所述的經遺傳修飾的微生物，或本發明所述的組成物。
在另一方面，本發明提供一種在正在接受藥物治療的個體中改善藥物治療效果的方法，所述藥物包括治療發炎性疾病或自體免疫疾病的藥物，所述方法包括：向所述個體施用有效量的本發明所述的經遺傳修飾的微生物，或本發明所述的組成物。
在另一方面，本發明提供一種經遺傳修飾的微生物在製備用於治療發炎性疾病或自體免疫疾病的藥物中的用途，其中所述的發炎性疾病或自體免疫疾病選自下組：發炎性腸病(IBD)、移植物抗宿主病(GvHD)、系統性紅斑狼瘡(SLE)、關節炎和哮喘；其中所述經遺傳修飾的微生物包含至少一種、至少兩種或至少三種分別編碼選自下組的多肽的外源基因：a) Amuc_1100多肽；b) IL-10多肽；和c) IL-22多肽。
具體實施方式
以下對本發明的描述僅打算說明本發明的各種實施方式。因此，所論述的具體修改不應被解釋為對本發明範圍的限制。所屬領域的技術人員將顯而易見，可在不脫離本發明的範圍的情況下得到各種等效物、進行改變和修改，且應理解所述等效實施例將包含在本文中。本文引用的所有參考文獻，包含出版物、專利和專利申請，均以全文引用的方式併入本文中。 I. 定義
如本文所用，“一”和“所述”在本文中用於指一個(種)或超過一個(種)(即，至少一個(種))所述冠詞的語法對象。舉例來說，“一蛋白”意指一種蛋白或多於一種蛋白。
術語“約”可以是指在本領域普通技術人員確定的特定值或組成的可接受誤差範圍內的值或組成，其將部分地取決於如何測量或測定值或組成。
如本文所用，術語“胺基酸”是指含有胺(-NH 2)和羧基(-COOH)官能團以及每種胺基酸特有的側鏈的有機化合物。胺基酸的名稱在本發明中也以標準的單字母或三字母代碼表示，其概述如表1所示。 表1 胺基酸名稱及代碼
名稱 三字母代碼 單字母代碼
丙胺酸 Ala A
精胺酸 Arg R
天冬醯胺 Asn N
天冬胺酸 Asp D
半胱胺酸 Cys C
麩胺酸 Glu E
穀胺醯胺 Gln Q
甘胺酸 Gly G
組胺酸 His H
異亮胺酸 Ile I
亮胺酸 Leu L
離胺酸 Lys K
甲硫胺酸 Met M
苯丙胺酸 Phe F
脯胺酸 Pro P
絲胺酸 Ser S
蘇胺酸 Thr T
色胺酸 Trp W
酪胺酸 Tyr Y
纈胺酸 Val V
術語“多肽”、“胜肽”和“蛋白質”在本文中可互換地用以指胺基酸殘基的聚合物。所述術語還適用於其中一個或多個胺基酸殘基是對應天然存在的胺基酸的人工化學模擬物的胺基酸聚合物，並且適用於天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。
與胺基酸序列有關的“保守取代”是指胺基酸殘基被含具有類似物理化學特性的側鏈的不同胺基酸殘基置換。舉例來說，可在具有疏水性側鏈的胺基酸殘基(例如Met、Ala、Val、Leu和Ile)間、具有中性親水性側鏈的胺基酸殘基(例如Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)間、具有酸性側鏈的胺基酸殘基(例如Asp、Glu)間、具有鹼性側鏈的胺基酸殘基(例如His、Lys和Arg)間、或具有芳香族側鏈的胺基酸殘基(例如Trp、Tyr和Phe)間進行保守取代。如所屬領域中已知，保守取代通常不會引起蛋白質構形結構的顯著變化，並且因此可保留蛋白質的生物活性。
如本文所用，術語“突變體”是指與親代序列具有至少70%序列一致性的多肽或多核苷酸。突變體可以與親代序列相差一個或多個胺基酸殘基或一個或多個核苷酸。舉例來說，突變體可具有親代序列的一個或多個胺基酸殘基或一個或多個核苷酸的取代(包含但不限於保守取代)、添加、缺失、插入或截短或其任何組合。例如，在某些實施方式中，突變Amuc_1100與天然存在的對應物具有至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列一致性。
如本文所用，術語“片段”是指任何長度的親代多肽或親代多核苷酸的部分序列。片段仍可以保持親代序列的至少部分功能。
當用於胺基酸序列(例如胜肽、多肽或蛋白質)時，術語“融合(fusion/fused)”是指例如透過化學鍵結或重組方式將兩個或更多個胺基酸序列組合成非天然存在的單一胺基酸序列。融合胺基酸序列可以透過兩個編碼多核苷酸序列的遺傳重組產生，並且可以透過將含有重組多核苷酸的建構體引入到微生物中的方法表現。
如本文中關於多肽或多核苷酸所用的術語“衍生物”是指化學修飾的多肽或多核苷酸，其中一個或多個明確定義數目的取代基已經共價連接於多肽的一個或多個特定胺基酸殘基或多核苷酸的一個或多個特定核苷酸。對多肽的示範性化學修飾可以是例如一個或多個胺基酸的烷基化、醯化、酯化、醯胺化、磷酸化、醣基化、標記、甲基化或與一個或多個部分結合。對多核苷酸的示範性化學修飾可以是(a)末端修飾，例如5'端修飾或3'端修飾，(b)核鹼基(或“鹼基”)修飾，包含鹼基的置換或去除，(c)醣修飾，包含在2'、3'和/或4'位置處的修飾，和(d)主鏈修飾，包含磷酸二酯鍵的修飾或置換。
根據本文的教導，這些片段、變異體、衍生物、突變體和類似物屬於本領域熟練技術人員公知的範圍。其中，所述的保守性取代的類似物優選根據表2進行胺基酸替換而產生。 表2 類似胺基酸總結表
最初的殘基 代表性的取代 優選的取代
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu Glu
Cys (C) Ser Ser
Gln (Q) Asn Asn
Glu (E) Asp Asp
Gly (G) Pro; Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe Leu
Leu (L) Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Leu
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala Leu
如本文所用，術語“同源”是指在最好比對時，與另一序列具有至少60%(例如至少65%、70%、75%、80%、85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)序列一致性的核酸序列(或其互補股）或胺基酸序列。
關於胺基酸序列(或核酸序列)的術語“%序列一致性”定義為在比對序列並在必要時引入空位以實現最大數目的相同胺基酸(或核酸)後，候選序列中與參考序列中的胺基酸(或核酸)殘基相同的胺基酸(或核酸)殘基的百分比。換句話說，胺基酸序列(或核酸序列)的序列一致性百分比(%)可以透過將相對於其比較的參考序列相同的胺基酸殘基(或鹼基)的數目除以候選序列或參考序列中胺基酸殘基(或鹼基)的總數(以較短者為準)來計算。胺基酸殘基的保守取代可視為或可不視為相同殘基。出於確定胺基酸(或核酸)序列一致性百分比的目的進行的比對可例如使用以下實現：可公開獲得的工具，如BLASTN、BLASTp(可見於美國國家生物技術資訊中心(U.S. National Center for Biotechnology Information；NCBI)的網站，另外參見Altschul S.F.等人，《分子生物學雜誌》, 215:403-410 (1990)；Stephen F.等人，《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》, 25:3389-3402 (1997))、ClustalW2(可見於歐洲生物資訊研究所(European Bioinformatics Institute)網站，另外參見Higgins D.G.等人，《酶學方法(Methods in Enzymology)》, 266:383-402 (1996)；Larkin M.A.等人，《生物資訊學(Bioinformatics)》(英格蘭牛津(Oxford, England)), 23(21): 2947-8 (2007))和ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。所屬領域的技術人員可使用所述工具所提供的默認參數，或可視需要例如透過選擇適合算法來自定義比對的參數。
如本文所用，術語“核苷酸序列”、“核酸”或“多核苷酸”包含寡核苷酸(即短多核苷酸)。其還指合成的和/或非天然存在的核酸分子(例如，包含核苷酸類似物或經修飾的主鏈殘基或鍵)。所述術語還指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。所述術語涵蓋含有天然核苷酸類似物的核酸。所述術語還涵蓋具有合成主鏈的核酸樣結構。除非另外指示，否則特定多核苷酸序列還隱含地涵蓋其保守修飾變異體(例如簡併密碼子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互補序列，以及明確指示的序列。具體來說，可以透過產生其中一個或多個選定(或所有)密碼子的第三位置被混合鹼基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列實現簡併密碼子取代（參見Batzer等人，《核酸研究(Nucleic Acid Res.)》 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人，《生物化學雜誌(J. Biol. Chem.)》 260:2605-2608 (1985)；和Rossolini等人，《分子細胞探針(Mol. Cell. Probes)》 8:91-98 (1994))。
如本文所用，術語“編碼(encoded/encoding)”是指能夠轉錄成mRNA和/或轉譯成胜肽或蛋白質。術語“編碼序列”或“基因”是指編碼胜肽或蛋白質的多核苷酸序列。這兩個術語可以在本發明中互換使用。在一些實施方式中，編碼序列是由信使RNA(mRNA)逆轉錄的互補DNA(cDNA)序列。在一些實施方式中，編碼序列是mRNA。
術語“可操作地連接”是指兩個或更多個所關注的生物序列在存在或不存在間隔子或連接子的情況下的並接，使得它們處於允許它們以預期方式起作用的關係中。當關於多肽使用時，其意指多肽序列以允許連接的產物具有預期的生物學功能的方式連接。例如，抗體可變區可以可操作地連接於恆定區，以提供具有抗原結合活性的穩定產物。所述術語還可以關於多核苷酸使用。舉例來說，當編碼多肽的多核苷酸可操作地連接於調節序列(例如啟動子、增強子、沉默子序列等)時，其意指多核苷酸序列以允許調節多肽由多核苷酸的表現的方式連接。
如本文所用，術語“載體”是指一種運載體，可將遺傳元件可操作地插入其中，以實現所述遺傳元件的表現，從而產生由所述遺傳元件編碼的蛋白質、RNA或DNA，或複製所述遺傳元件。載體可用於轉化、轉導或轉染宿主細胞(如，微生物)，以使其攜帶的遺傳元件在宿主細胞內表現。不同載體可適合於不同宿主細胞。載體的實例包含質體；噬菌粒；黏接質體；人工染色體，如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1衍生的人工染色體(PAC)；噬菌體，如λ噬菌體或M13噬菌體；和動物病毒。載體可以含有多種用於控制表現的元件，包含啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、可選元件和報導基因。另外，載體可以含有複製起點。載體還可以包含有助於其進入細胞的材料，包含但不限於病毒粒子、脂質體或蛋白質包衣。載體可以是表現載體或選殖載體。 II. 經遺傳修飾的微生物
在一方面，本申請提供了一種經遺傳修飾的微生物，其包含至少一種編碼選自下組的外源基因：編碼表現Amuc_1100多肽的基因、或編碼表現IL-10多肽的基因、或編碼表現IL-22多肽的基因、或以上任意組合。
在另一方面，本申請提供了一種包含至少兩種分別編碼選自下組多肽的外源基因的經遺傳修飾的微生物：(i) Amuc_1100多肽，(ii) IL-10多肽，和(iii) IL-22多肽。
在某些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物包含：a) 分別編碼Amuc_1100多肽和IL-10多肽的外源基因；b) 分別編碼IL-10多肽和IL-22多肽的外源基因；或者c) 分別編碼Amuc_1100多肽和IL-22多肽的外源基因。
在某些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物包含分別編碼Amuc_1100多肽、IL-10多肽和IL-22多肽的外源基因。
在某些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物包含編碼Amuc_1100多肽、IL-10多肽或者IL-22多肽的外源基因。
如本文所用，“外源基因”是在所述微生物中透過遺傳修飾引入的基因。外源基因可以包括在所述微生物中原本不表現的異源基因，也可以包括透過遺傳修飾引入的原本在所述微生物中也有表現的內源基因(例如為提高表現量的目的)。
在本申請中，所述外源基因在所述微生物中表現的多肽也稱為外源多肽。在一些實施方式中，所述外源多肽選自：Amuc_1100多肽、IL-10多肽，或IL-22多肽。在一些實施方式中，所述外源多肽是在所述微生物中原本不表現的異源多肽，例如，人IL-10多肽、人IL-22多肽等。當使用的微生物內源不表現Amuc_1100時，Amuc_1100也可以是異源多肽。
可用於本發明的微生物包含細菌、古細菌、真菌(例如酵母、絲狀真菌)和藻類。
在一些實施方式中，本申請提供的所述微生物包含益生微生物或非病原性微生物。
所本文所述，“非病原性微生物體”是指不能在宿主中引起疾病或有害反應的微生物體。在一些實施方式中，非病原性微生物體不含脂多糖(LPS)。在一些實施方式中，非病原性微生物體為共生細菌。在一些實施方式中，非病原性微生物體為減毒病原性細菌。
在一些實施方式中，本發明中使用的微生物是益生微生物體。所本文所述，“益生微生物體”是指當以有效量施用時，對個體的健康或康樂提供有益作用，包括例如與改善人類或動物微生物群的平衡相關的健康益處，和/或用於恢復正常的微生物群。按照定義，所有益生微生物體都具有經證實的非病原性特徵。一般來說，益生菌幫助腸道微生物群保持(或重新找到)其平衡、完整性和多樣性。益生菌的作用可以是菌株依賴性的。
在一些實施方式中，益生微生物體包括益生微生物細胞(例如活的微生物細胞)的製劑。
在一些實施方式中，益生微生物體為益生細菌或益生酵母。
在一些實施方式中，益生細菌選自由以下組成的群組：擬桿菌、雙歧桿菌(例如兩歧雙歧桿菌)、梭菌、埃希氏菌、乳桿菌(例如嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、副乾酪乳桿菌、胚芽乳桿菌)和乳球菌。在一些實施方式中，所述益生細菌屬於埃希氏菌屬。在一些實施方式中，所述益生細菌屬於物種大腸桿菌的菌株Nissle 1917(EcN)。在一些實施方式中，益生酵母選自由以下組成的群組：釀酒酵母、產朊假絲酵母、乳酸克魯維酵母和卡氏酵母。在一些實施例中，益生微生物體為大腸桿菌的菌株Nissle 1917(EcN)。
大腸桿菌Escherichia coli作為研究微生物遺傳、生理和代謝的模式菌株，由於遺傳操作工具多樣以及遺傳背景清晰等優勢成為重要的底盤細菌或宿主細菌之一。
在一些實施方式中，所述益生細菌是人類腸道正常存在的細菌。
在一些實施方式中，所述益生酵母選自由以下組成的群組：釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)、產朊假絲酵母( Candida utilis)、乳酸克魯維酵母( Kluyveromyces lactis)和卡氏酵母( Saccharomyces carlsbergensis)。
在本申請中，術語“遺傳修飾”是指透過人工干預的方式在細胞中(例如微生物體)引入在DNA和/或RNA中的修改或修飾或者引入外源的DNA或RNA。通常，所述修改或修飾可以透過重組核酸表現載體的方式引入，或者透過突變的方式引入，或者透過基因編輯的方式引入。
如本文所用，術語“經遺傳修飾的微生物”是指其中引入了外源基因或外源性表現匣(包含含有表現匣的載體)的微生物。“經遺傳修飾的微生物”也可以和“基因工程微生物”、“工程微生物”、“基因改造的微生物”或者“經基因工程改造的微生物”互換使用。在本申請中，所述外源性表現匣包含編碼目的多肽或目標蛋白的多核苷酸，並且可以允許其表現。將表現匣引入到微生物中可以透過磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖媒介的轉染或電穿孔實現(Davis, L.、Dibner, M.、Battey, I., 《基本分子生物學方法(Basic Methods in Molecular Biology)》(1986))，也可以透過基因編輯技術(例如，CRISPR技術)實現。
經遺傳修飾的微生物還涵蓋了本申請提供的微生物或其衍生物的任何後代。應理解，所有後代可能與母細胞不同，因為可能存在在複製期間發生的突變。
本申請還提供了一種包含至少一個重組表現匣的核苷酸序列，其包含i) 至少一種或至少兩種分別編碼Amuc_1100多肽、IL-10多肽和/或IL-22多肽的外源基因，以及ii)可操作地連接所述至少一種或至少兩種外源基因的一個或多個調控元件。
在一些實施方式中，本發明還提供了經遺傳修飾的微生物的組合，其包括本發明所述的包含至少一種(例如包含至少一種、至少兩種，或至少三種)外源基因的經遺傳修飾的微生物的組合。
在一些實施方式中，在所述的經遺傳修飾的微生物組合中，包含兩種不同的經遺傳修飾的微生物，其中每種經遺傳修飾的微生物各自分別表現一種不同的外源基因；其中，所述外源基因編碼的多肽分別為：a) Amuc_1100多肽和IL-10多肽；b) IL-10多肽和IL-22多肽；或者c) Amuc_1100多肽和IL-22多肽。
在一些實施方式中，在所述的經遺傳修飾的微生物組合中包含三種不同的經遺傳修飾的微生物，其中每種經遺傳修飾的微生物各自分別表現一種不同的外源基因；或所述經遺傳修飾的微生物組合包含兩種不同的經遺傳修飾的微生物，其中所述兩種經遺傳修飾的微生物分別表現一種外源基因和另外兩種外源基因；其中，所述外源基因編碼的多肽分別為：Amuc_1100多肽、IL-10多肽和IL-22多肽。 A. Amuc_1100
Amuc_1100已知為嗜粘蛋白阿克曼氏菌(“ A. muciniphila”)細菌種中存在的外膜蛋白。連同兩個其它成員Amuc_1099和Amuc_1101，Amuc_1100位於涉及IV型菌毛樣形成的基因簇內(Ottman等人，公共科學圖書館·綜合( PLoS One), 2017)。Amuc_1100的示範性胺基酸序列公開於GenBank：ACD04926.1中。在本發明中，術語“Amuc_1100”和“AMUC_1100”可互換地使用。
如本文所用，術語“Amuc_1100”廣泛涵蓋Amuc_1100多肽，以及Amuc_1100多核苷酸，例如編碼Amuc_1100多肽的DNA或RNA序列。如本文所用，術語“Amuc_1100”進一步涵蓋野生型Amuc_1100，以及與野生型Amuc_1100多肽在功能上等效的功能等效物。
在本申請中，當術語“野生型”用於描述多肽或多核苷酸時，是指所述多肽或多核苷酸的序列與自然界中發現的那些序列相同。野生型的多肽或多核苷酸可為原生或自然界中存在的多肽或多核苷酸序列，並且也廣泛地包括其片段，即使所述片段本身可能未於自然界中發現。
在本申請中，當術語“功能等效物”用於描述多肽或多核苷酸時，是儘管胺基酸序列或多核苷酸序列或化學結構與參考序列相比具有差異，但仍至少部分保留參考序列的一種或多種生物功能的任何變異體。
在本申請中，當術語“變異體”用於描述多肽或多核苷酸時，涵蓋所有種類的不同形式的所述多肽或多核苷酸，包含但不限於天然存在的多肽或多核苷酸的片段、突變體、融合物、衍生物、模擬物或其任何組合。
在本申請中，術語“野生型Amuc_1100”是指Amuc_1100多肽或多核苷酸的序列與自然界中發現的序列或那些序列相同。野生型的Amuc_1100可為原生或自然界中存在的Amuc_1100序列，及其片段，即使所述片段本身可能未於自然界中發現。野生型Amuc_1100還可包含天然存在的變異體，如在不同細菌菌株中發現的突變體或同功異構物或不同原生序列。野生型的全長Amuc_1100多肽具有317個胺基酸殘基的長度。野生型的Amuc_1100的示範性胺基酸序列包含但不限於胺基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的Amuc_1100(1-317)、如SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列中的第31-317位所示的Amuc_1100(31-317)和如SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列中的第81-317位所示的Amuc_1100(81-317)。
Amuc_1100(1-317)胺基酸序列(SEQ ID NO: 1)： MSNWITDNKPAAMVAGVGLLLFLGLSATGYIVNSKRSELDKKISIAAKEIKSANAAEITPSRSSNEELEKELNRYAKAVGSLETAYKPFLASSALVPTTPTAFQNELKTFRDSLISSCKKKNILITDTSSWLGFQVYSTQAPSVQAASTLGFELKAINSLVNKLAECGLSKFIKVYRPQLPIETPANNPEESDEADQAPWTPMPLEIAFQGDRESVLKAMNAITGMQDYLFTVNSIRIRNERMMPPPIANPAAAKPAAAQPATGAASLTPADEAAAPAAPAIQQVIKPYMGKEQVFVQVSLNLVHFNQPKAQEPSED
在一些實施方式中，Amuc_1100多肽包含野生型的Amuc_1100多肽的功能等效物。
在本申請中，野生型Amuc_1100的功能等效物是指，儘管胺基酸序列或多核苷酸序列或化學結構具有差異，但仍至少部分保留野生型Amuc_1100的一種或多種生物功能的任何Amuc_1100變異體。野生型Amuc_1100的生物功能包含但不限於a)調節和/或促進哺乳動物的腸道免疫系統功能，b)維持、恢復和/或增加哺乳動物的腸粘膜屏障的物理完整性，c)活化TLR2，d)提高哺乳動物中對癌症免疫療法(例如免疫檢查點調節劑)的免疫反應，和e)降低、延遲和/或預防哺乳動物中對一種或多種免疫檢查點調節劑的耐藥性。
在某些實施方式中，Amuc_1100的功能等效物保持親代分子的實質生物活性。在某些實施例中，本文所述的Amuc_1100的功能等效物仍保持與野生型Amuc_1100實質上類似的功能，例如，Amuc_1100的功能等效物可保持野生型Amuc_1100的至少部分(例如，至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)例如調節腸道免疫性和/或活化TLR2的活性。
Amuc_1100多肽的功能等效物可包含野生型的Amuc_1100的突變體、片段、融合物、衍生物或其任何組合。Amuc_1100的功能等效物可包含對野生型的Amuc_1100進行人工改造產生的變異體，如透過重組方法或化學合成獲得的人工多肽序列。Amuc_1100的功能等效物可在活性不受影響的前提下包含非天然存在的胺基酸殘基。適合的非天然胺基酸包含例如β-氟丙胺酸、1-甲基組胺酸、γ-亞甲基麩胺酸、α-甲基亮胺酸、4,5-脫氫離胺酸、羥基脯胺酸、3-氟苯丙胺酸、3-胺基酪胺酸、4-甲基色胺酸等。
在本申請中，Amuc_1100變異體可以涵蓋所有種類的不同形式的Amuc_1100，包含但不限於野生型Amuc_1100的片段、突變體、融合物、衍生物、模擬物或其任何組合。
儘管不希望受任何理論束縛，但某些野生型Amuc_1100片段(例如Amuc_1100(31-317))可以比全長對應物更高的親和力結合和活化TLR2。
在一些實施方式中，Amuc_1100片段具有如SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列。 AINSLVNKLAECGLSKFIKVYRPQL(SEQ ID NO: 2)
在一些實施方式中，Amuc_1100片段具有如SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列。 SLETAYKPFLASSALVPTTPTAFQNELKTFRDSLISSCKKKNILITDTSSWLGFQVYSTQAPSVQAASTLGFELKAINSLVNKLAECGLSKFIKVYRPQLPIETPANNPEESDEADQAPWTPMPLEIAFQGDRESVLKAMNAITGMQDYLFTVNSIRIRNERMMPPPIANPAAAKPAAAQPATGAASLTPADEAAAPAAPAIQQVIKPYMGKEQVFVQVSLNLVHFNQPKAQEPSED(SEQ ID NO: 3)
在一些實施方式中，所述Amuc_1100多肽包含如SEQ ID NO: 5所示的序列，或包含與SEQ ID NO: 5所示的序列具有至少80%序列一致性且仍保持調節腸道免疫和/或活化toll樣受體2(TLR2)的活性的胺基酸序列。在一些實施方式中，所述Amuc_1100多肽包含與如SEQ ID NO: 5所示序列具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性且仍保持調節腸道免疫和/或活化toll樣受體2(TLR2)的活性的胺基酸序列。在一些實施方式中，編碼SEQ ID NO: 5所示胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示。
在某些實施方式中，Amuc_1100多肽在第259位具有Y259A或Y259S突變，所述第259位的編號是基於如SEQ ID NO: 5所示序列的編號。在一些實施方式中，具有Y259A突變的Amuc_1100多肽具有如SEQ ID NO: 7所示的胺基酸序列。在一些實施方式中，編碼如SEQ ID NO: 7所示胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 6所示。在一些實施方式中，具有Y259S突變的Amuc_1100多肽具有如SEQ ID NO: 9所示的胺基酸序列。在一些實施方式中，編碼SEQ ID NO: 9所示胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 8所示。
在某些實施方式中，Amuc_1100多肽進一步在N端或C端處包含標籤或胺基酸延伸。標籤可用於Amuc_1100多肽的純化。胺基酸延伸可用於提高穩定性或減少清除率。可以使用任何適合的標籤或延伸，例如His-標籤(例如6×His標籤)、蛋白質A、lacZ(β-gal)、麥芽糖結合蛋白質(MBP)、鈣調蛋白結合肽(CBP)、內含胜肽-甲殼質結合結構域(內含胜肽-CBD)標籤、基於鏈黴親和素/生物素的標籤、串聯親和純化(TAP)標籤、表位標籤、報告基因標籤等。
在某些實施例中，Amuc_1100多肽進一步包含將標籤與Amuc_1100多肽的其餘部分分隔開的酶消化位址。酶消化位址可用於在需要時去除標籤。適合酶消化位址的實例包含腸激酶辨識位址(例如DDDDK)、因子Xa辨識位址、吉能酶(genenase)I辨識位址、弗林蛋白酶(furin)辨識位址等。
Amuc_1100 DNA序列(SEQ ID NO: 4) attgttaacagcaagcgtagcgagctggataagaaaatcagcattgcggcgaaagagatcaagagcgcgaacgcggcggaaattaccccgagccgtagcagcaacgaggaactggagaaagaactgaaccgttacgcgaaggcggttggtagcctggaaaccgcgtataaaccgtttctggcgagcagcgcgctggtgccgaccaccccgaccgcgttccaaaacgagctgaaaacctttcgtgacagcctgatcagcagctgcaagaaaaagaacatcctgattaccgataccagcagctggctgggcttccaggtttacagcacccaagcgccgagcgtgcaggcggcgagcaccctgggttttgagctgaaagcgattaacagcctggttaacaagctggcggaatgcggcctgagcaaattcatcaaggtgtatcgtccgcagctgccgattgaaaccccggcgaacaacccggaggaaagcgacgaagcggatcaggcgccgtggaccccgatgccgctggagatcgcgttccagggtgaccgtgaaagcgttctgaaagcgatgaacgcgattaccggcatgcaagattacctgtttaccgtgaacagcatccgtattcgtaacgaacgtatgatgccgccgccaatcgcgaacccggctgcggcgaagccggctgcggcgcagccggcgaccggtgcggcgagcctgaccccggcggacgaggctgcggcgccggctgcgccggcgatccagcaagttattaaaccgtatatgggcaaggaacaggtgttcgttcaagtgagcctgaacctggtgcactttaaccagccgaaagcgcaagagccgagcgaagattga
Amuc_1100胺基酸序列(SEQ ID NO: 5) IVNSKRSELDKKISIAAKEIKSANAAEITPSRSSNEELEKELNRYAKAVGSLETAYKPFLASSALVPTTPTAFQNELKTFRDSLISSCKKKNILITDTSSWLGFQVYSTQAPSVQAASTLGFELKAINSLVNKLAECGLSKFIKVYRPQLPIETPANNPEESDEADQAPWTPMPLEIAFQGDRESVLKAMNAITGMQDYLFTVNSIRIRNERMMPPPIANPAAAKPAAAQPATGAASLTPADEAAAPAAPAIQQVIKPYMGKEQVFVQVSLNLVHFNQPKAQEPSED*
Amuc_1100(Y259A)DNA序列(SEQ ID NO: 6) Attgttaacagcaagcgtagcgagctggataagaaaatcagcattgcggcgaaagagatcaagagcgcgaacgcggcggaaattaccccgagccgtagcagcaacgaggaactggagaaagaactgaaccgttacgcgaaggcggttggtagcctggaaaccgcgtataaaccgtttctggcgagcagcgcgctggtgccgaccaccccgaccgcgttccaaaacgagctgaaaacctttcgtgacagcctgatcagcagctgcaagaaaaagaacatcctgattaccgataccagcagctggctgggcttccaggtttacagcacccaagcgccgagcgtgcaggcggcgagcaccctgggttttgagctgaaagcgattaacagcctggttaacaagctggcggaatgcggcctgagcaaattcatcaaggtgtatcgtccgcagctgccgattgaaaccccggcgaacaacccggaggaaagcgacgaagcggatcaggcgccgtggaccccgatgccgctggagatcgcgttccagggtgaccgtgaaagcgttctgaaagcgatgaacgcgattaccggcatgcaagattacctgtttaccgtgaacagcatccgtattcgtaacgaacgtatgatgccgccgccaatcgcgaacccggctgcggcgaagccggctgcggcgcagccggcgaccggtgcggcgagcctgaccccggcggacgaggctgcggcgccggctgcgccggcgatccagcaagttattaaaccggctatgggcaaggaacaggtgttcgttcaagtgagcctgaacctggtgcactttaaccagccgaaagcgcaagagccgagcgaagat
Amuc_1100(Y259A)胺基酸序列(SEQ ID NO: 7) IVNSKRSELDKKISIAAKEIKSANAAEITPSRSSNEELEKELNRYAKAVGSLETAYKPFLASSALVPTTPTAFQNELKTFRDSLISSCKKKNILITDTSSWLGFQVYSTQAPSVQAASTLGFELKAINSLVNKLAECGLSKFIKVYRPQLPIETPANNPEESDEADQAPWTPMPLEIAFQGDRESVLKAMNAITGMQDYLFTVNSIRIRNERMMPPPIANPAAAKPAAAQPATGAASLTPADEAAAPAAPAIQQVIKP AMGKEQVFVQVSLNLVHFNQPKAQEPSED*
Amuc_1100(Y259S)DNA序列(SEQ ID NO: 8) attgttaacagcaagcgtagcgagctggataagaaaatcagcattgcggcgaaagagatcaagagcgcgaacgcggcggaaattaccccgagccgtagcagcaacgaggaactggagaaagaactgaaccgttacgcgaaggcggttggtagcctggaaaccgcgtataaaccgtttctggcgagcagcgcgctggtgccgaccaccccgaccgcgttccaaaacgagctgaaaacctttcgtgacagcctgatcagcagctgcaagaaaaagaacatcctgattaccgataccagcagctggctgggcttccaggtttacagcacccaagcgccgagcgtgcaggcggcgagcaccctgggttttgagctgaaagcgattaacagcctggttaacaagctggcggaatgcggcctgagcaaattcatcaaggtgtatcgtccgcagctgccgattgaaaccccggcgaacaacccggaggaaagcgacgaagcggatcaggcgccgtggaccccgatgccgctggagatcgcgttccagggtgaccgtgaaagcgttctgaaagcgatgaacgcgattaccggcatgcaagattacctgtttaccgtgaacagcatccgtattcgtaacgaacgtatgatgccgccgccaatcgcgaacccggctgcggcgaagccggctgcggcgcagccggcgaccggtgcggcgagcctgaccccggcggacgaggctgcggcgccggctgcgccggcgatccagcaagttattaaaccgagcatgggcaaggaacaggtgttcgttcaagtgagcctgaacctggtgcactttaaccagccgaaagcgcaagagccgagcgaagat
Amuc_1100(Y259S)胺基酸序列(SEQ ID NO: 9) IVNSKRSELDKKISIAAKEIKSANAAEITPSRSSNEELEKELNRYAKAVGSLETAYKPFLASSALVPTTPTAFQNELKTFRDSLISSCKKKNILITDTSSWLGFQVYSTQAPSVQAASTLGFELKAINSLVNKLAECGLSKFIKVYRPQLPIETPANNPEESDEADQAPWTPMPLEIAFQGDRESVLKAMNAITGMQDYLFTVNSIRIRNERMMPPPIANPAAAKPAAAQPATGAASLTPADEAAAPAAPAIQQVIKP SMGKEQVFVQVSLNLVHFNQPKAQEPSED*
此外，由於Amuc_1100是膜蛋白，其N端的信號肽序列將會促使Amuc_1100多肽進行膜定位，因而為了實現本發明的目的，即實現Amuc_1100多肽的分泌，需要將Amuc_1100的自體信號肽替換為本發明中能夠將Amuc_1100多肽分泌到微生物體外的其它信號肽，例如USP45信號肽。 B. 細胞激素
本發明所提供的經遺傳修飾的微生物還可以表現和分泌一種或多種細胞激素。
在一些實施方式中，所述細胞激素為IL-10和IL-22。
在一些實施方式中，所述細胞激素還可以是IL-17A、IL-19、IL-23、IL-35、IL-37或TGF-beta。 介白素 -10(IL-10)
IL-10是一種維持免疫反應平衡的抗發炎性細胞激素，由多種類型的細胞合成，包括B細胞、單核細胞、樹突細胞、自然殺手細胞和T細胞。IL-10由造血細胞表現的特異性受體辨識，屬於II類細胞激素。IL-10透過兩個受體IL-10R1和IL-10R2及其下游的JAK/STAT通路傳遞信號，最終活化抗發炎反應基因的表現。IL-10可抑制巨噬細胞和樹突細胞的活性，間接抑制T細胞的活化和效應物的功能。IL-10對發炎性腸病、過敏反應等有保護作用。IL-10和/或其受體的缺陷與IBD和腸敏感性相關(Nielsen, 2014)。
介白素-10(IL-10)是由幾類細胞產生的多效細胞激素(pleiotropiccytokine)，所述細胞類型如巨噬細胞、單核細胞、Th2型和調節性T細胞以及B細胞。IL-10是具有免疫抑制特性和抗發炎特性的細胞激素；其調節許多骨髓細胞和淋巴細胞的活性，並直接抑制T細胞和NK(自然殺手)細胞產生幾種發炎性細胞激素。
IL-10最初描述為Th2細胞所產生的細胞激素合成抑制因子(cytokine synthesis inhibitory factor，CSIF)，Th2細胞抑制Th1細胞產生促發炎細胞激素，如γ-干擾素(IFN-γ)、介白素-1-α(IL-1α)、介白素-1-β(IL-1β)、介白素-2(IL-2)以及腫瘤壞死因子α(TNF-α)。已經證明，除了抑制促發炎細胞激素產生之外，IL-10可以抑制抗原特異性Th1細胞增殖，由此透過使這些細胞中主要組織相容性複合體(majorhistocompatibility complex，MHC)-II的表現失調節來降低單核細胞抗原呈現能力。
IL-10對Th1細胞的活化以及對促發炎細胞激素的產生具有強烈的抑制作用這一發現，產生了IL-10是細胞媒介的免疫反應的強免疫抑制劑這一假說。其他的作者已經提議使用這種細胞激素治療急性和慢性發炎以及治療自體免疫病。基於這些原因，這種細胞激素已經用於幾種自體免疫病中，如牛皮癬、類風濕性關節炎和克隆氏病(Crohn′s disease)。然而，在其他疾病，如感染性過程或癌症中，因為其阻礙了益於治療的Th1反應的誘導，因而具有副作用。這些過程的實例包括，麻瘋病、肺結核、利什曼病和病毒感染。因此，IL-10在丙型肝炎病毒導致的慢性感染中大量表現，已有記載。作為用HCV抗原刺激的結果，這種細胞激素可以由Th2細胞產生。其也可以由抑制Th1型抗病毒效應細胞形成的調節性T細胞(D4和CD8)產生。最後，與HCV蛋白接觸的感染的樹突細胞(DC)或單核細胞，比非感染的細胞產生更大量的IL-10，這有利於Th2反應的發生，同時阻礙病毒的消除。
在一些實施方式中，本發明所提供的經遺傳修飾的微生物可以表現和分泌IL-10。
如本文所用，術語“IL-10”廣泛涵蓋IL-10，以及IL-10多核苷酸，例如編碼IL-10的DNA或RNA序列。如本文所用，術語“IL-10”進一步涵蓋野生型IL-10，以及與野生型的IL-10在功能上等效的功能等效物。在本申請中，野生型IL-10的功能等效物是指儘管胺基酸序列或多核苷酸序列或化學結構具有差異，但仍至少部分保留野生型IL-10的一種或多種生物功能的任何IL-10變異體。所述野生型IL-10的一種或多種生物功能包括但不限於，能夠結合IL-10R1/IL-10R2，並透過受體-JAK-STAT信號途徑發揮功能。
在一些實施方式中，所述IL-10包含SEQ ID NO: 11所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO: 11所示序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性且仍保持調節免疫細胞(例如，巨噬細胞、樹突細胞)的活性的胺基酸序列。在一些實施方式中，所述IL-10包含與SEQ ID NO: 11所示序列具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性且仍保持調節免疫細胞(例如，巨噬細胞、樹突細胞)的活性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，所述IL-10包含P2A的突變，其中編號相對於SEQ ID NO: 13；即，具有所述的SEQ ID NO: 13所示的胺基酸序列。
在本申請中，IL-10的變異體涵蓋所有種類的不同形式的IL-10，包含但不限於IL-10的片段、突變體、融合物、衍生物、模擬物或其任何組合。
在一些實施方式中，本發明所提供的經遺傳修飾的微生物可以包含編碼IL-10(例如，人類IL-10)的任何合適的基因。在一些實施方式中，編碼IL-10的基因包含SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列，或包含與SEQ ID NO: 10所示序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性且其編碼蛋白仍保持調節免疫細胞(例如，巨噬細胞、樹突細胞)的活性的核苷酸序列。在一些實施方式中，編碼IL-10的基因包含與SEQ ID NO: 10所示序列具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性且其編碼蛋白仍保持調節免疫細胞(例如，巨噬細胞、樹突細胞)的活性的核苷酸序列。
編碼IL-10的基因可以包括修飾和/或突變，例如，以在誘導條件下增強穩定性、增加IL-10的表現和/或增加抗發炎效力。在一些實施方式中，編碼IL-10的基因包含SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列。
在一些實施方式中，本發明所提供的經遺傳修飾的微生物能夠在誘導條件下(例如，在發炎組織中微環境因子誘導的條件下)產生IL-10。在一些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物能夠在低氧或厭氧條件下產生IL-l0。在一些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物能夠從1×10 9CFU的微生物中分泌至少300ng、至少350ng、至少400ng、至少450ng、至少500ng、至少550ng、至少600ng或至少650ng的IL-10。
IL-10 DNA序列(SEQ ID NO: 10) agcccgggtcagggtacccaaagcgaaaacagctgcacccacttcccgggcaacctgccgaacatgctgcgtgacctgcgtgatgcgttcagccgtgtgaaaaccttcttccagatgaaagaccaactggataacctgctgctgaaggagagcctgctggaggacttcaaaggttacctgggctgccaggcgctgagcgaaatgatccaattttatctggaggaagtgatgccgcaggcggagaaccaagacccggatattaaggcgcacgttaacagcctgggcgagaacctgaaaaccctgcgtctgcgtctgcgtcgttgccaccgtttcctgccgtgcgagaacaaaagcaaggcggtggaacaggttaagaacgcgtttaacaaactgcaagagaagggcatctataaagcgatgagcgaattcgatatctttattaactacatcgaggcgtatatgaccatgaaaattcgtaactag
IL-10 胺基酸序列(SEQ ID NO: 11) SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN*
IL-10(P2A)DNA序列(SEQ ID NO: 12) agcgcgggtcagggtacccaaagcgaaaacagctgcacccacttcccgggcaacctgccgaacatgctgcgtgacctgcgtgatgcgttcagccgtgtgaaaaccttcttccagatgaaagaccaactggataacctgctgctgaaggagagcctgctggaggacttcaaaggttacctgggctgccaggcgctgagcgaaatgatccaattttatctggaggaagtgatgccgcaggcggagaaccaagacccggatattaaggcgcacgttaacagcctgggcgagaacctgaaaaccctgcgtctgcgtctgcgtcgttgccaccgtttcctgccgtgcgagaacaaaagcaaggcggtggaacaggttaagaacgcgtttaacaaactgcaagagaagggcatctataaagcgatgagcgaattcgatatctttattaactacatcgaggcgtatatgaccatgaaaattcgtaact
IL-10(P2A)胺基酸序列(SEQ ID NO: 13) SAGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN* 介白素 -22(IL-22)
如本文所用，“介白素-22”或“IL-22”是一種T細胞分泌的醣蛋白，其在發現時被命名為IL-10相關的T細胞衍生的可誘導因子(IL-10-related T cell-derived inducible factor，IL-TIF)，由於其功能的獨特性現已成為研究最深入的IL-10家族成員之一。
IL-22主要由適應性免疫細胞(CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞等)和固有免疫細胞(LTi細胞、NK細胞等)分泌。已發現眾多轉錄因子如信號傳遞和轉錄活化3(STAT3)、維甲酸相關孤兒受體γτ(RORγτ)、芳香烴受體(AhR)等，以及細胞激素如IL-23、IL-6、IL-17、TNF-α、TNF-β等都能影響IL-22的表現。
IL-22透過結合IL-22R1受體和IL-10R2受體，發揮生物學功能。與其他免疫性細胞激素主要作用於造血源性細胞不同，IL-22主要在組織內的非血源性細胞如內皮細胞、基質細胞、成纖維細胞等發揮功能，並且IL-22廣泛分佈於很多組織中，如肺、肝臟、腎臟、胸腺、乳腺、腸、皮膚及滑膜等組織。
IL-22透過活化STAT信號傳遞通路引起下游的增值及抗凋亡效應參與的黏膜屏障維護和修復功能，儘管IL-22能增強上皮細胞的損傷後修復並透過抗凋亡促增值提高上皮細胞的存活，但IL-22的持續高表現在某些疾病如腫瘤、自體免疫性疾病等條件下反而引起組織損傷和慢性發炎等致病性效應。另外，IL-22也可以誘導產生抗菌肽從而行使抵抗微生物及寄生蟲侵襲的作用。正是由於IL-22如此廣泛複雜的保護性和致病性功能，近年來許多研究都證實IL-22在感染、自體免疫性疾病及腫瘤等疾病中發揮獨特的作用。
在一些實施方式中，本發明所提供的經遺傳修飾的微生物表現和分泌IL-22。
如本文所用，所述IL-22包括具有SEQ ID NO：15的多肽及其功能等效物。如本文所用，術語“IL-22”廣泛涵蓋IL-22，以及IL-22多核苷酸，例如編碼IL-22的DNA或RNA序列。如本文所用，術語“IL-22”進一步涵蓋野生型IL-22，以及與野生型IL-22在功能上等效的功能等效物。在本申請中，野生型IL-22的功能等效物是指，儘管胺基酸序列或多核苷酸序列或化學結構具有差異，但仍至少部分保留野生型IL-22的一種或多種生物功能的任何IL-22變異體。所述野生型IL-22的一種或多種生物功能包括但不限於，能夠結合IL-22R1/IL-10R2，透過Janus激酶(與IL-22R次單元相關)和STAT分子發出信號的實質的活性。
在一些實施方式中，其中所述IL-22包含SEQ ID NO: 15所示的序列，或包含與SEQ ID NO: 15所示序列具有至少80%序列一致性且仍保持結合IL-22受體並調節IL-22受體表現細胞的活性的胺基酸序列。在一些實施方式中，所述IL-22包含與SEQ ID NO: 15所示序列具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性且仍保持結合IL-22受體並調節IL-22受體表現細胞的活性的胺基酸序列。
在本申請中，IL-22的變異體涵蓋所有種類的不同形式的IL-22，包含但不限於IL-22的片段、突變體、融合物、衍生物、模擬物或其任何組合。
IL-22 DNA序列(SEQ ID NO: 14) gcgccgatcagcagccactgccgtctggacaaaagcaacttccagcaaccgtatattaccaaccgtacctttatgctggcgaaagaggcgagcctggcggacaacaacaccgatgtgcgtctgatcggcgagaaactgttccacggcgttagcatgagcgaacgttgctacctgatgaagcaggtgctgaactttaccctggaggaagttctgttcccgcaaagcgatcgttttcagccgtatatgcaagaggtggttccgttcctggcgcgtctgagcaaccgtctgagcacctgccacatcgaaggtgacgatctgcacattcagcgtaacgtgcaaaaactgaaggacaccgttaaaaagctgggcgagagcggcgaaatcaaagcgattggcgaactggatctgctgtttatgagcctgcgtaacgcgtgcatttag
IL-22胺基酸序列(SEQ ID NO: 15) APISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI* 介白素 -17A(IL-17A)
如本文所用，“介白素-17”或“IL-17A”由活化的T細胞產生，並與普遍表現於所有細胞類型的IL-17R結合媒介發炎反應。然而，IL-17A信號傳遞的確切機制仍未完全闡明。在包括RA的慢性發炎中，IL-17A可透過直接使基質降解，或間接使活化的發炎性細胞增多並誘導其它致炎細胞激素包括IL-1b和TNF-a進入發炎性組織，引起組織損害。IL-17A活化MAPKs(絲裂原活化蛋白激酶)所有的三個成員，即細胞外信號調節激酶(ERK1和ERK2)p44和p42、Jun蛋白N-端激酶(JNK)和p38。在人的纖維母細胞、腸上皮細胞和培養的軟骨細胞中可見IL-17A誘導NF-kb的活化，該作用可能與TNF受體相關激素(TRAF)-6有關。在人單核白血病細胞株U937中，IL -17A可誘導Janus激酶(JAN)以及信號傳遞和轉錄活化蛋白(STAT)途徑的某些成員發生酪胺酸磷酸化，其中包括Tyk2、JAK1，2和3、STAT1，2，3和4，暗示JAK/STAT途徑可能參與調節IL-17A的生物學效應。
IL-17A DNA序列(SEQ ID NO: 217) ggtattacaatcccgcgtaatccgggttgtccgaatagtgaagataaaaattttccgcgtacagttatggttaatctgaatattcataaccgtaacacaaacaccaatccgaaacgtagtagcgattattataatcgtagcacaagcccgtggaatctgcatcgtaacgaagatccggaacgttatccaagcgttatctgggaagcaaaatgccgccatctgggttgtatcaatgcagatggtaacgttgattatcatatgaatagcgtgccgattcagcaggaaattctggttctgcgtcgtgaaccgccgcattgtccgaatagctttcgtctggaaaaaattctggttagcgttggttgtacctgtgttaccccgattgttcatcatgttgca
IL-17A胺基酸序列(SEQ ID NO: 218) GITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVA 介白素 -19(IL-19)
如本文所用，“介白素-19”或“IL-19”主要是透過IL-20R1/R2這一對受體複合物傳遞生物信號而起生物學作用。IL19是細胞激素IL-10家族的成員，但IL-19的作用還不十分明確，對於IL-19是一個促發炎性或抗發炎性的細胞激素仍然存在爭議和不確定性。有研究認為IL-19可能和IL-10一樣具有抗發炎效應，並且可能存在誘導淋巴細胞從Th1向Th2轉變的表型。也有研究認為在單核細胞IL-19向上調控IL-6和TNF-α中產生，顯示IL-19有促發炎的特點。儘管沒有檢測到IL-20R1在免疫細胞群的表現，但還是有很多研究清楚地顯示出IL-19對這些細胞的效應。大多數的研究表明IL-19是Th2系統的一部分。有研究表明，IL-19在心肌炎中發揮抗發炎效應。在發炎性腸道中內源性IL-19呈現出保護性作用，有學者建立了IL-19小鼠DSS大腸炎模型，並且表明這些小鼠相比於那些免疫完整的小鼠更易感染大腸炎。活動性克隆氏病中，IL-19表現缺陷及對其反應的缺少有利於疾病發炎的發展。此外，腺病毒媒介的IL-19融合基因轉入大鼠後能有效減少損傷，並且活化MAPK；進一步發現一些細胞發炎性激素能誘導IL-19的產生。而IL-19能透過減低編碼發炎性蛋白的mRNA種屬的穩定性從而減少血管平滑肌的發炎反應。一些體外實驗的研究表明IL-19能誘導CD4+T細胞產生Th2細胞激素，在周圍血單核細胞IL-19增加IL-10的產生，長時間暴露於IL-19的T細胞會向下調控IFN-γ，向上調控IL-4和IL-13。但是也存在一些爭議的研究發現在單核細胞IL-19向上調控促發炎激素IL-6和TNF-α的產生，在銀屑病患者皮膚發現IL-19及其2條受體鏈IL-20R1/IL-20R2的表現，進一步研究發現減少IL-19位準的治療是有效的。
IL-19 DNA序列(SEQ ID NO: 219) ctgcgtcgttgtctgattagcaccgatatgcatcatattgaagaaagctttcaggaaattaaacgtgccattcaggcaaaagatacctttccgaatgttaccattctgagcaccctggaaaccctgcagattatcaaaccactggatgtttgttgtgttaccaaaaatctgctggccttttatgttgatcgtgtttttaaagatcatcaggaaccgaatccgaaaattctgcgtaaaattagtagcattgccaatagctttctgtatatgcagaaaaccctgcgccagtgtcaggaacagcgtcagtgtcattgtcgtcaggaagcaaccaatgcaacccgtgtgattcatgataactatgatcagctggaagttcatgcagcagcgattaaaagcctgggtgaactggatgtgtttctggcatggattaataaaaatcatgaagtgatgtttagcgca
IL-19胺基酸序列(SEQ ID NO: 220) LRRCLISTDMHHIEESFQEIKRAIQAKDTFPNVTILSTLETLQIIKPLDVCCVTKNLLAFYVDRVFKDHQEPNPKILRKISSIANSFLYMQKTLRQCQEQRQCHCRQEATNATRVIHDNYDQLEVHAAAIKSLGELDVFLAWINKNHEVMFSA 介白素 -23(IL-23)
如本文所用，“介白素-23”或“IL-23”是一種由IL-12p40次單元和IL-23p19次單元組成的異二聚體細胞激素，其中p40次單元是IL-23與IL-12共用的。IL-23的功能性受體已被鑒定，由IL-12R β1和IL-23R組成。IL-23在1型極化T細胞的免疫反應中起作用。雖然IL-12可強有力活化初始T細胞，但是最初的報導認為IL-23可優先作用於記憶T細胞，促進其分泌IFN-γ和增殖，這表明IL-23在控制細菌感染上有重要作用。IL-23被進一步描述為是一種控制周圍組織發炎的關鍵細胞激素。p19的過表現與多個器官以及包含皮膚在內的上皮組織的發炎有關。另外，IL-23還參與中樞神經系統和多種自體免疫性疾病的發炎。
IL-23(IL-12p40次單元)DNA序列(SEQ ID NO: 221) atctgggaactgaaaaaggatgtttatgtggttgaactggattggtatccggatgcaccgggcgaaatggtggttctgacgtgtgatacgccggaagaagatggtattacctggacactggatcagagcagcgaagttctgggcagtggtaaaaccctgacgattcaggttaaagaatttggtgatgcaggtcagtatacctgtcataaaggtggtgaagttctgagccattccctgctgctgctgcataaaaaggaagatggtatctggagcaccgatattctgaaagatcagaaagaaccgaaaaacaaaacctttctgcgttgcgaagcgaaaaattattcaggccgttttacctgttggtggctgacgaccattagcacagatctgacctttagcgtgaaaagcagccgtggtagcagcgatccgcagggtgttacttgtggtgcagcaacgctgtctgcagaacgtgttcgtggtgataataaagaatatgaatatagcgtggaatgccaggaagattcagcatgtccggcagcagaagaaagcctgccgattgaagtgatggttgatgcagttcataaactgaaatatgaaaactataccagcagcttttttatccgtgatattattaaaccggaccctccgaaaaatctgcagctgaaacctctgaaaaatagtcgtcaggtggaagtgtcctgggaatatccggatacctggagcaccccacatagctattttagtctgaccttttgtgttcaggttcagggcaaatcaaaacgcgaaaaaaaagatcgtgtttttaccgataaaaccagcgcaaccgttatttgtcgtaaaaatgcaagcattagcgttcgtgcacaggatcgttattatagcagcagctggagcgaatgggcaagcgttccgtgtagc
IL-23(IL-12p40次單元)胺基酸序列(SEQ ID NO: 222) IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
IL-23(IL-23p19次單元)DNA序列(SEQ ID NO: 223) cgtgcagttccgggtggtagcagcccggcatggacccagtgtcagcagctgagccagaaactgtgtaccctggcatggagcgcacatccgctggttggtcatatggatctgcgtgaagaaggtgatgaagaaaccaccaatgatgttccgcatattcagtgtggtgatggttgtgatccgcagggtctgcgtgataatagccagttttgtctgcagcgtattcatcagggtctgattttttatgaaaaactgctgggtagcgatatttttaccggtgaaccgagcctgctgccggatagcccggttggtcagctgcatgcaagcctgctgggtctgagccagctgctgcagccggaaggtcatcattgggaaacccagcagattccgagcctgagcccgagccagccgtggcagcgtctgctgctgcgttttaaaattctgcgtagcctgcaggcatttgttgcagttgcagcacgtgtttttgcacatggtgcagcaaccctgagcccg
IL-23(IL-23p19次單元)胺基酸序列(SEQ ID NO: 224) RAVPGGSSPAWTQCQQLSQKLCTLAWSAHPLVGHMDLREEGDEETTNDVPHIQCGDGCDPQGLRDNSQFCLQRIHQGLIFYEKLLGSDIFTGEPSLLPDSPVGQLHASLLGLSQLLQPEGHHWETQQIPSLSPSQPWQRLLLRFKILRSLQAFVAVAARVFAHGAATLSP 介白素 -35(IL-35)
如本文所用，“介白素-35”或“IL-35”是由EB病毒誘導基因3(Epstein-Barr virus-induced gene 3, EBI3)蛋白和IL-12p35(IL-12A)次單元組成的異源二聚體，與IL-12、IL-23和IL-27共同組成了IL-12細胞激素家族，在T細胞增殖活化和細胞激素產生方面發揮重要的調節作用。研究證實，IL-35主要由調節性T細胞(regulatory T cells, Treg)分泌，是Treg發揮免疫負調控的主要細胞激素之一，在多種疾病(如實驗性結腸炎、膠原誘導性關節炎、自體免疫性脫髓鞘炎、慢性肝炎、糖尿病、腫瘤等)中參與發炎的免疫調節，與疾病的發生、發展密切相關。
IL-35(EBI3蛋白)DNA序列(SEQ ID NO: 225) cgcaaaggtccgccggcagcactgaccctgccgcgtgttcagtgtcgtgcatcccgctatccgattgcagttgattgtagttggaccctgccgccggcaccgaattccacctcaccggttagctttattgctacctatcgtctgggtatggccgcacgtggtcattcatggccttgtctgcagcagaccccgaccagcacgagctgtaccatcaccgatgttcagctgttttctatggcaccgtatgttctgaatgttacggcagttcatccgtggggttcaagcagctcttttgttccatttattaccgaacatatcatcaaaccggaccctccggaaggtgttcgtctgagcccgctggcagaacgtcagctgcaggttcagtgggaaccgccaggttcatggccgtttcctgaaatttttagcctgaaatattggattcgttataaacgtcagggtgcggcccgttttcatcgtgttggtcctattgaagcaacctcatttattctgcgtgcggtccgtcctcgtgcccgttattatgttcaggtcgccgcacaggatctgaccgattatggtgaactgagcgattggtcactgccggcaaccgcgaccatgtccctgggtaaa
IL-35(EBI3蛋白)胺基酸序列(SEQ ID NO: 226) RKGPPAALTLPRVQCRASRYPIAVDCSWTLPPAPNSTSPVSFIATYRLGMAARGHSWPCLQQTPTSTSCTITDVQLFSMAPYVLNVTAVHPWGSSSSFVPFITEHIIKPDPPEGVRLSPLAERQLQVQWEPPGSWPFPEIFSLKYWIRYKRQGAARFHRVGPIEATSFILRAVRPRARYYVQVAAQDLTDYGELSDWSLPATATMSLGK
IL-3(IL-12p35次單元)DNA序列(SEQ ID NO: 227) cgtaacctgccggttgcgaccccggaccctggcatgtttccgtgtctgcatcattctcagaatctgctgcgtgcagtctctaatatgctgcagaaagcacgtcagaccctggaattttatccgtgtaccagtgaagaaatcgatcatgaagatattaccaaagataaaaccagcaccgtggaagcatgtctgccgctggaactgaccaaaaacgaaagctgtctgaacagccgcgaaaccagttttattacaaatggtagttgtctggcaagccgcaaaaccagctttatgatggcgctgtgtctgagctcaatttatgaagatctgaaaatgtatcaggtggaatttaaaaccatgaatgccaaactgctgatggaccctaaacgtcagatttttctggatcagaatatgctggcagttatcgatgaactgatgcaggcactgaactttaatagcgaaaccgttccgcagaaaagctccctggaagaaccggatttttataaaaccaaaatcaaactgtgcatcctgctgcatgcatttcgtattcgtgcagttaccattgatcgtgtgatgagctatctgaatgcaagc
IL-35(IL-12p35次單元)胺基酸序列(SEQ ID NO: 228) RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS 介白素 -37(IL-37)
如本文所用，“介白素-37”或“IL-37”共有五種不同亞型(IL-37a-e)，目前研究表明只有IL-37b具有生物學功能並在多種疾病中具有抗發炎作用。IL-37既可以分泌到細胞外作為細胞激素與受體結合調節細胞活性，也可以進入細胞核作為轉錄調節激素。IL-37與L-18具有較高的同源性，可以結合IL-18結合蛋白(IL-18BP)對IL-18信號途徑有一定的抑制作用。
IL-37 DNA序列(SEQ ID NO: 229) gttcataccagtccgaaagtgaaaaatctgaatccgaaaaagtttagcatccatgatcaggatcataaagttctggtactggatagcggtaatctgattgcagtgccggataaaaattatattcgtccggaaattttttttgccctggcaagcagcctgagttcagcctcagcggaaaaaggtagcccgattctgctgggtgttagtaaaggtgaattttgtctgtattgtgataaagataaaggccagagccatccgagtctgcagctgaaaaaggaaaaactgatgaaactggcagcacagaaagaaagcgctcgtcgtccgtttattttttatcgtgcacaggtgggtagctggaatatgctggaaagcgcagcccatccaggttggtttatttgcaccagctgcaattgtaatgaaccggtgggtgttaccgataaatttgaaaatcgtaaacatatcgaatttagctttcagccggtttgtaaagcagaaatgagcccgagcgaagttagtgat
IL-37胺基酸序列(SEQ ID NO: 230) VHTSPKVKNLNPKKFSIHDQDHKVLVLDSGNLIAVPDKNYIRPEIFFALASSLSSASAEKGSPILLGVSKGEFCLYCDKDKGQSHPSLQLKKEKLMKLAAQKESARRPFIFYRAQVGSWNMLESAAHPGWFICTSCNCNEPVGVTDKFENRKHIEFSFQPVCKAEMSPSEVSD TGF-β
如本文所用，“轉化生長激素β”或“TGF-β”是一種具有多功能的細胞激素，在人體內，眾多類型的細胞皆具有產生並分泌此種細胞激素的能力。TGF-β參與許多疾病的機制，扮演抑制或促進疾病的雙重角色，包括傷口癒合、組織纖維化、粥狀動脈硬化、癌症的發生與轉移、自體免疫疾病、糖尿病併發症，以及阿茲海默症造成的神經損傷等，皆和TGF-β息息相關。人體存在兩種免疫反應，第一型幫助型T細胞(TH1)媒介的正常免疫防禦反應：負責感染性微生物的免疫防禦機轉。若TH1細胞功能過度旺盛，引起發炎反應的細胞激素分泌，例如介白素-2(Interleukin-2, IL-2)和干擾素γ(Interferon-γ, IFN-γ)等，提升細胞性免疫反應，攻擊人體的特定組織或特殊細胞，造成該人體某些組織或器官的長期的傷害，尤其是自體免疫疾病及器官移植排斥。第二型幫助型T細胞(TH2)媒介的過敏免疫防禦反應：負責寄生蟲、叮咬蟲類、過敏原與刺激物對障壁層器官的免疫防禦機轉。若TH2細胞功能過度旺盛，導致TH2細胞激素分泌量過高，促使B細胞產生大量過敏抗體IgE，IgE會誘發肥大細胞或嗜鹼性白血球細胞釋出發炎物質，如組織胺、介白素、細胞激素、血小板活化因子等，作用在細胞或血管上，造成血管舒張及平滑肌收縮，導致過敏性氣喘、過敏性鼻炎、異位性皮膚炎等過敏症狀產生。此兩種免疫力在人體內是以天秤式的平衡來呈現，TH1及TH2兩者互相平衡，且共同受到調節型細胞(Treg)與免疫調節激素(TGF-β)的調控，讓身體免疫防禦系統TH1及TH2維持平衡，即可達到預防自體免疫疾病及過敏相關疾病的作用。常見的遺傳性過敏疾病，如：異位性皮膚炎、氣喘、過敏性鼻炎等，體內均缺少TGF-β免疫調節激素。有研究表明，長期補充TGF-β可增加體內濃度，改善體質、減少發炎、減緩過敏指數、修復組織、延長母乳對嬰幼童的保護力，提升身體對食物耐受性、維持消化道機能。
TGF-β DNA序列(SEQ ID NO: 231) gcactggataccaattattgtttttcaagcaccgaaaaaaattgttgtgttcgtcagctgtatattgattttcgtaaagatctgggttggaaatggattcatgaaccgaaaggttatcatgcaaatttttgtctgggtccgtgtccgtatatttggagcctggatacccagtatagcaaagttctggcactgtataatcagcataatccgggtgcaagcgcagcaccgtgttgtgttccgcaggcactggaaccgctgccgattgtttattatgttggtcgtaaaccgaaagttgaacagctgagcaatatgattgttcgtagctgtaaatgtagc
TGF-β 胺基酸序列(SEQ ID NO: 232) ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS C. 表現匣
如本文所用，術語“表現匣”是指能夠引導特定核苷酸序列在適當的微生物中表現的DNA序列，包含可操作地連接於所關注的核苷酸序列的啟動子，所述所關注的核苷酸序列可操作地連接於終止信號。其通常還包含核苷酸序列恰當轉譯所需的序列。編碼區通常編碼所關注的蛋白質，但也可以在反義方向的意義上編碼所關注的功能RNA，例如反義RNA或非轉譯RNA。包含所關注的核苷酸序列的表現匣可以是嵌合的，這意味著其組件中的至少一個相對於其其它組件中的至少一個是異源的。
如本文所用，術語“重組”是指在體外合成或以其它方式操縱的多核苷酸(例如，“重組表現匣”)，指使用重組多核苷酸或重組表現匣在細胞或其它生物系統中產生產物的方法，或指由重組多核苷酸編碼的多肽。“重組表現匣”涵蓋接合到表現匣或載體中的來自不同來源的核酸分子，以表現例如融合蛋白；或透過誘導型或組成型表現多肽產生的蛋白質。重組表現匣涵蓋可操作地連接於一個或多個調節元件的重組多核苷酸。
在一些實施方式中，在本申請所述的經遺傳修飾的微生物中，所述至少兩種外源基因包含在(至少一個)外源性表現匣中。
在一些實施方式中，本申請所述的經遺傳修飾的微生物中包含至少一種、至少兩種或者全部三種選自以下的外源性表現匣：第一外源性表現匣(在本發明中也可以被稱為“Amuc_1100表現匣”，“外源性表現匣A”或者“表現匣A”，上述名稱在本發明中可互換使用，具有相同含義)，包含編碼Amuc_1100多肽的核苷酸序列；第二外源性表現匣(在本發明中也可以被稱為“IL-10表現匣”，“外源性表現匣B”或者“表現匣B”，上述名稱在本發明中可互換使用，具有相同含義)，包含編碼IL-10的核苷酸序列；和第三外源性表現匣(在本發明中也可以被稱為“IL-22表現匣”，“外源性表現匣C”或者“表現匣C”，上述名稱在本發明中可互換使用，具有相同含義)，其包含編碼IL-22的核苷酸序列。
在一些實施方式中，所述至少一個外源性表現匣包含一個或多個調控元件(或者“表現調控元件”，二者在本文中具有相同含義)，其可操作地連接於所述外源基因。
在一些實施方式中，所述調節元件包含一個或多個選自由以下組成的群組的元件：啟動子、核糖體結合位址(RBS)、順反子、終止子和其任何組合。 i. 啟動子
如本文所用，術語“啟動子”是指含有RNA聚合酶的結合位址並且起始DNA轉錄的通常在編碼區上游的非轉譯DNA序列。啟動子區還可包含充當基因表現的調控激素的其它元件。在一些實施方式中，啟動子適合於起始經遺傳修飾的微生物中的編碼Amuc_1100多肽、IL-10和/或IL-22的多核苷酸。在一些實施方式中，啟動子為組成型啟動子或誘導型啟動子。
術語“組成型啟動子”是指能夠促進在其控制下和/或與其可操作地連接的編碼序列或基因的連續轉錄的啟動子。組成型啟動子和變異體是所屬領域中眾所周知的，並且包含但不限於BBa_J23119、BBa_J23101、BBa_J23102、BBa_J23103、BBa_ J23109、BBa_J23110、BBa_J23114、BBa_J23117、USP45_啟動子、Amuc_1102_啟動子、OmpA_啟動子、BBa_J23100、B Ba_J23104、BBa_J23105、BBa_I14018、BBa_J45992、BBa_ J23118、BBa_J23116、BBa_J23115、BBa_J23113、BBa_J23 112、BBa_J23111、BBa_J23108、BBa_J23107、BBa_J23106、BBa_I14033、BBa_K256002、BBa_K1330002、BBa_J44002、BBa_J23150、BBa_I14034、Oxb19、oxb20、BBa_K088007、Ptet、Ptrc、PlacUV5、BBa_K292001、BBa_K292000、BBa_K137 031和BBa_K137029。示範性組成型啟動子的核苷酸序列包含選自由以下組成的群組的核苷酸序列：如表3中所示的SEQ ID NO: 16-56，和其具有至少80%(例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)序列一致性的同源序列。在一些實施方式中，組成型啟動子包含SEQ ID NO: 16-56中任一所示的核苷酸序列。在一些實施方式中，所述啟動子在體外，例如在培養、擴增和/或製造條件下具有活性。在一些實施方式中，所述啟動子在體內，例如在體內環境，例如腸道和/或發炎微環境中存在的條件下具有活性。例示性的組成型啟動子的核苷酸序列如表3所示。 表3 組成型啟動子
組成型啟動子 序列 SEQ ID NO:
BBa_J23119 ttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagc 16
BBa_J23101 tttacagctagctcagtcctaggtattatgctagc 17
BBa_J23102 ttgacagctagctcagtcctaggtactgtgctagc 18
BBa_J23103 ctgatagctagctcagtcctagggattatgctagc 19
BBa_J23109 tttacagctagctcagtcctagggactgtgctagc 20
BBa_J23110 tttacggctagctcagtcctaggtacaatgctagc 21
BBa_J23114 tttatggctagctcagtcctaggtacaatgctagc 22
BBa_J23117 ttgacagctagctcagtcctagggattgtgctagc 23
USP45_promoter aaagtgttttgtaatcataaagaaatattaaggtggggtaggaatagtataatatgtttattcaaccgaacttaatg 24
Amuc_1102_promoter gggccgagcatgtggaaacacctctgccaggtcaagcccgcagccatgccgcatgtttttttcttgaccgcccgggcagaaccgtcgggcggagccgtgtcatgctccacacacgctacatggaaagaaacaagagatttttgctagccacagttcggtttttggtgtaactaatc 25
OmpA_promoter gtaaatttaggattaatcctggaactttttttgtcgcccagccaatgctttcagtcgtgactaattttccttgcggaggcttgtctgaagcggtttccgcgattttcttctgtaaattgtcgctgacaaaaaagattaaacgtaccttatacaagacttttttttcatatgcctgacggagttcacacttgtaagttttcaactacgttgtagactttacatcgccaggggtgctcggcataagccgaagatatcggtagagttaatattgagcagatccccggtgaaggatttaaccgtgttatctcgttggagatattcatggcgtattttggatga 26
BBa_J23100 ttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagc 27
BBa_J23104 ttgacagctagctcagtcctaggtattgtgctagc 28
BBa_J23105 tttacggctagctcagtcctaggtactatgctagc 29
BBa_J23106 tttacggctagctcagtcctaggtatagtgctagc 30
BBa_J23107 tttacggctagctcagccctaggtattatgctagc 31
BBa_J23108 ctgacagctagctcagtcctaggtataatgctagc 32
BBa_J23111 ttgacggctagctcagtcctaggtatagtgctagc 33
BBa_J23112 ctgatagctagctcagtcctagggattatgctagc 34
BBa_J23113 ctgatggctagctcagtcctagggattatgctagc 35
BBa_J23115 tttatagctagctcagcccttggtacaatgctagc 36
BBa_J23116 ttgacagctagctcagtcctagggactatgctagc 37
BBa_J23118 ttgacggctagctcagtcctaggtattgtgctagc 38
BBa_J45992 ggtttcaaaattgtgatctatatttaacaa 39
BBa_I14018 gtttatacataggcgagtactctgttatgg 40
BBa_I14033 agaggttccaactttcaccataatgaaaca 41
BBa_I14034 taaacaactaacggacaattctacctaaca 42
BBa_J23150 ggctagctcagtcctaggtattatgctagc 43
BBa_J44002 aaagtgtgacgccgtgcaaataatcaatgt 44
BBa_K1330002 ggctagctcagtcctaggtactatgctagc 45
BBa_K256002 caccttcgggtgggcctttctgcgtttata 46
Oxb19 aagctgttgtgaccgcttgctctagccagctatcgagttgtgaaccgatccatctagcaattggtctcgatctagcgataggcttcgatctagctatgtatcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtataatgtgtggtgctggttagcgcttgctat 47
oxb20 aagctgttgtgaccgcttgctctagccagctatcgagttgtgaaccgatccatctagcaattggtctcgatctagcgataggcttcgatctagctatgtagaaacgccgtgtgctcgatcgcttgataaggtccacgtagctgctataattgcttcaacagaacatattgactatccggtattacccggc     48
BBa_K088007 catacgccgttatacgttgtttacgctttg  49
BBa_K137029 atatatatatatatataatggaagcgtttt 50
BBa_K137031 ccccgaaagcttaagaatataattgtaagc 51
BBa_K292000 ggctagctcagtcctaggtacagtgctagc 52
BBa_K292001 tgctagctactagagattaaagaggagaaa 53
PlacUV5 cccaggctttacactttatgcttccggctcgtataatgtgtggaattgtgag 54
Ptrc ttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgag 55
Ptet taattcctaatttttgttgacactctatcgttgatagagttattttaccactccctatcagtgatagagaaaa 56
如本文所用，術語“誘導型啟動子”是指可以透過外部刺激，如化學、光、激素、壓力或病原體，在一種或多種細胞類型中啟用的受調控的啟動子。誘導型啟動子和變異體為所屬領域中眾所周知的，並且包含但不限於PLteto1、galP1、PLlacO1、Pfnrs、Psal、Pvan。在一些實施方式中，示範性誘導型啟動子的核苷酸序列包含選自由以下組成的群組的核苷酸序列：如表4中所示的SEQ ID NO: 57-61，和其具有至少80%(例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)序列一致性的同源序列。 表4 誘導型啟動子
誘導型啟動子 序列 SEQ ID NO:
PLteto1 tccctatcagtgatagagattgacatccctatcagtgatagagatactgagcacatcagcaggacgcactgacc 57
galP1 attccactaatttattccatgtcacacttttcgcatctttgttatgctatggttatttcataccataa 58
PLlacO1 ataaatgtgagcggataacaattgacattgtgagcggataacaagatactgagcacatcagcaggacgcactgacc 59
Pfnrs aaaaacgccgcaaagtttgagcgaagtcaataaactctctacccattcagggcaatatctctctt 60
PfdhF tgaataaatagtgcccgtaatatcagggaatgaccccacataaaatgtggcataaaagatgcatactgtagtcgagagcgcgtatgcgtgatttgatta 61
Psal ggggcctcgcttgggttattgctggtgcccggccgggcgcaatattcatgttgatgatttattatatatcgagtggtgtatttatttatattgtttgctccgttaccgttattaacag 233
Pvan attggatccaattgacagctagctcagtcctaggtaccattggatccaatag 234
在一些實施方式中，啟動子為內源啟動子或外源啟動子。外源啟動子是指與編碼區可操作組合的啟動子，其中所述啟動子不是生物體基因組中與所述編碼區天然相關的啟動子。基因組中與編碼區天然相關或相連的啟動子被稱為所述編碼區的內源啟動子。在一些實施方式中，啟動子可操作地連接於目標基因的轉錄起始位址的上游或下游。
在一些實施方式中，啟動子選自：BBa_J23101、BBa_J23108、BBa_J23110、PfnrS、Psal、Pvan、BBa_J23119、BBa_J23102，或BBa_J23114。 ii. 核糖體結合位址
如本文所用，術語“核糖體結合位址”(“RBS”)是指起始蛋白質轉譯時核糖體結合於的mRNA上的序列。RBS為大約35個核苷酸長，並且含有三個離散結構域：(1)Shine-Dalgarno(SD)序列，(2)間隔區，和(3)編碼序列(CDS)的前五到六個密碼子。RBS和變異體在所屬領域中眾所周知，並且包含但不限於USP45、合成型(Synthesized)、Amuc_1102、OmpA。示範性RBS的核苷酸序列包含選自由以下組成的群組的核苷酸序列：如表5中所示的SEQ ID NO: 62-65，和其具有至少80%(例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)序列一致性的同源序列。在某些實施方式中，核糖體結合位址可操作性地連接於目標基因編碼區域的上游8-13核苷酸處。 表5 核糖體結合位址(RBS)
RBS 序列 SEQ ID NO:
USP45 ggaggaaaaattaaaaaagaac 62
合成型 aaagaggagaaa 63
Amuc_1102 agggaa 64
OmpA taacgagg 65
iii. 順反子
如本文所用，術語“順反子”是指經轉錄且編碼多肽的核酸序列的區段。順反子和變異體在所屬領域中眾所周知，並且包含但不限於GFP、BCD2、螢光素酶、MBP。示範性順反子的核苷酸序列包含選自由以下組成的群組的核苷酸序列：如表6中所示的SEQ ID NO: 66-75，和其具有至少80%(例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)序列一致性的同源序列。在某些實施方式中，順反子可操作性地連接於目標基因編碼區域的N端。 表6 順反子
順反子 序列 SEQ ID NO:
T7g10 胺基酸序列 LSL 66
DNA序列 ttaagttta 67
GFP 胺基酸序列 MRKGEEKEVN 68
DNA序列 atgcgtaaaggcgaagagaaggaggttaactga 69
BCD2 胺基酸序列 MKAIFVLKHLNHAKEVF 70
DNA序列 atgaaagcaattttcgtactgaaacatcttaatcatgctaaggaggttttctaa 71
螢光素酶 胺基酸序列 MIMSGYKEVN 72
DNA序列 atgattatgtccggttataaggaggttaactga 73
MBP 胺基酸序列 MKIEAGKLVQKEVN 74
DNA序列 atgaaaatcgaagcaggtaaactggtacagaaggaggttaactga 75
iv. 終止子
如本文所用，術語“終止子”是指提供RNA聚合酶轉錄終止信號的核苷酸序列，其防止核苷酸後續併入到所得多核苷酸鏈，並且由此中斷聚合酶媒介的延伸。在一些實施方式中，本發明中使用的終止子為T7終止子。在一些實施方式中，終止子包含選自由以下組成的群組的核苷酸序列：如表7中所示的SEQ ID NO: 76-79，和其具有至少80%(例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)序列一致性的同源序列。在某些實施方式中，終止子可操作性地連接於編碼基因的3'末端。在一些實施方式中，本發明中使用的終止子為rrnB_T1_T7Te_終止子，所述rrnB_T1_T7Te_終止子包括rrnB_T1_終止子和T7Te_終止子串聯所得的序列，具體序列如下：caaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcg(SEQ ID NO: 242)。 表7 轉錄終止子
轉錄終止子 序列 SEQ ID NO:
rrnB_T1_終止子 caaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctc 76
rrnB_T1(突變體)_終止子 caaataaaacgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctc 77
T7Te_終止子 ggctcaccttcgggtgggcctttctgcg 78
LPP_終止子 tagtacctgtgaagtgaaaaatggcgcacattgtgcgccattttttttgtctgccgtttaccgcta 79
D. 微生物中的分泌系統和 / 或輸出路徑
在某些實施方式中，在本文所提供的外源性表現匣中，編碼Amuc_1100多肽、IL-10和/或IL-22的多核苷酸序列可操作地連接於信號肽。
如本文所用，術語“信號肽”或“信號序列”是指可以用於將異源多肽分泌到經培養細菌的周質或培養基中或將Amuc_1100多肽、IL-10和/或IL22分泌到周質中的胜肽。異源多肽的信號可以與細菌同源，或其可以是異源的，包含對於細菌中所產生的多肽原生的信號。對於Amuc_1100、IL-10和/或IL22，信號序列通常為細菌細胞內源性的，但其不必是內源性的，只要其對於其目標有效即可。分泌胜肽的非限制性實例包含USP45, OppA(ECOLIN_07295)、OmpA、OmpF、cvaC、TorA、fdnG、dmsA、PelB、HlyA、粘附素(ECOLIN_19880)、DsbA(ECOLIN_21525)、Gltl(ECOLIN_03430)、GspD(ECO LIN_16495)、HdeB(ECOLIN_19410)、MalE(ECOLIN_22540)、PhoA(ECOLIN_02255)、PpiA(ECOLIN_18620)、TolB、tort、mglB和lamB。在一些實施方式中，所述的分泌胜肽是USP45。
在某些實施方式中，本文提供的用於Amuc_1100、IL-10和/或IL22分泌的信號肽包含USP45、OmpA、DsbA、pelB、Cel-CD、sat或Amuc_1100、IL-10和/或IL22的內源信號肽(或者叫做“自體信號肽”，在本文中，“內源信號肽”與“自體信號肽”具有相同含義，都表示野生型多肽序列中原始具有或者天然存在的信號肽序列)。示範性信號肽的核苷酸序列包含選自由以下組成的群組的核苷酸序列：如表9中所示的SEQ ID NO: 123-135，和其具有至少80%(例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)序列一致性的同源序列。在一些實施方式中，信號肽包含選自由以下組成的群組的胺基酸序列：如表8中所示的SEQ ID NO: 80-122，和其具有至少80%(例如至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)序列一致性的同源序列。在一些實施方式中，信號肽可操作地連接於表現目標蛋白的N端，在一些實施方式中，目標蛋白(例如Amuc_1100、IL-10和/或IL-22)的自體信號肽序列被去除，然後在N端與選定的信號肽(如本文中所述的第一信號肽，第二信號肽或者第三信號肽，例如USP45信號肽)連接(即自體信號肽被替換為選定的信號肽)，用於蛋白的分泌。
在一些實施方式中，表現匣包含編碼可操作地連接於信號肽和自轉運蛋白結構域的Amuc_1100、IL-10和/或IL-22的核苷酸序列，其中信號肽和自轉運蛋白結構域可操作地連接於Amuc_1100、IL-10和/或IL-22的相對端，例如信號肽可操作地連接於Amuc_1100、IL-10和/或IL-22的N端，並且自轉運蛋白結構域可操作地連接於Amuc_1100、IL-10和/或IL-22的C端。所述建構體可用於V型自分泌媒介的分泌，其中在透過原生分泌系統(如Sec系統)將前驅物蛋白質從細胞質易位到周質隔室中時，去除N端信號肽，並且另外，一旦自分泌物易位跨越外膜，可以透過自催化或蛋白酶催化的例如OmpT裂解去除C端自轉運蛋白結構域，從而將成熟蛋白質(例如Amuc_1100多肽、IL-10和/或IL-22)釋放到細胞外環境中。 表8 信號肽胺基酸序列
信號肽 胺基酸序列 SEQ ID NO:
Amuc_1100 MSNWITDNKPAAMVAGVGLLLFLGLSATGY 80
AnsB MEFFKKTALAALVMGFSGAALA 81
Bla MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFA 82
Caf1M MILNRLSTLGIITFGMLSFAPGPPPGPPRVS 83
Cel-CD EGNTREDNFKHLLGNDNVKR 84
Cex MKKAKAIFLFILIVSGFLLVA 85
DsbA MKKIWLALAGLVLAFSASA 86
EltB MNKVKFYVLFTALLSPLCAHG 87
FkpA MKSLFKVTLLATTMAVALHAPITFA 88
LamB MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMA 89
Lpp MKATKLVLGAVILGSTLLAG 90
LTB MNKVKCYVLFTALLSSLYAHG 91
MalE MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA 92
MglB MNKKVLTLSAVMASMLFGAAAHA 93
Npr MGLGKKLSVAVAASFMSLTISLPGVQA 94
OmpA MKKTAIAIAVALAGFATVAQA 95
OmpC MKVKVLSLLVPALLVAGAANA 96
OmpF MMKRNILAVIVPALLVAGTANA 97
OmpT MRAKLLGIVLTTPIAISPFA 98
OsmY MTMTRLKISKTLLAVMLTSAVATGSAYA 99
PelB MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA 100
PgaA MYSSSRKRCPKTKWALKLLTAAFLAA 101
PgaB MLRNGNKYLLMLVSIIMLTA 102
PhoA MKQSTIALALLPLLFTPVTKA 103
PhoE MKKSTLALVVMGIVASASVQA 104
Sat MNKIYSLKYSAATGGLIAVSELAKRVSGKTNRKLVATMLSLAVAGTVNA 105
SfmC MMTKIKLLMLIIFYLIISASAHA 106
Skp MKKWLLAAGLGLALATSAQA 107
Sta1 MKKLMLAIFISVLSFPSFS 108
StiI MKKNIAFLLASMFVFSIATNAYA 109
SurA MKNWKTLLLGIAMIANTSFA 110
TolB MKQALRVAFGFLILWASVLHA 111
TorA MNNNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA 112
TorT MRVLLFLLLSLFMLPAFS 113
USP45 MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYA 114
XynS MFKFKKKFLVGLTAAFMSISMFSATASA 115
YebF MKKRGAFLGLLLVSACASVFA 116
csgA_N22 MKLLKVAAIAAIVFSGSALAGVVPQYGGGGGNHGGGGNNSGPN 117
FlgI_N22 VIKFLSALILLLVTTAAQAGVVPQYGGGGGNHGGGGNNSGPN 118
sfmC_N22 MMTKIKLLMLIIFYLIISASAHAGVVPQYGGGGGNHGGGGNNSGPN 119
USP45_N22 MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYAGVVPQYGGGGGNHGGGGNNSGPN 120
YraI_N22 MSKRTFAVILTLLCSFCIGQALA GVVPQYGGGGGNHGGGGNNSGPN 121
csgA MKLLKVAAIAAIVFSGSALAGVVPQYGGGGGNHGGGGNNSGPNSELNIYQYGGGNSALALQADARNSDLTITQHGGGNGADVGQGSDDSSIDLTQRGFGNSATLDQWNGKDSTMTVKQFGGGNGAAVDQTASNSSVNVTQVGFGNNATAHQY 122
表9 部分信號肽DNA序列
信號肽 DNA序列 SEQ ID NO:
Amuc_1100 atgagcaactggatcaccgacaacaaaccggctgcgatggttgcgggtgtgggcctgctgctgttcctgggtctgagcgcgaccggctac 123
Cel-CD gaaggaaacactcgtgaagacaattttaaacatttattaggtaatgacaatgttaaacgc 124
DsbA atgaagaaaatctggctggcgctggcgggtctggtgctggcgttcagcgcgagcgcg 125
OmpA atgaagaaaaccgcgattgcgattgcggtggcgctggcgggtttcgcgaccgttgcgcaggcg 126
PelB atgaagtacctgctgccgaccgcggcggcgggtctgctgctgctggcggcgcagccggcgatggcg 127
Sat atgaataaaatatactcccttaaatatagtgctgccactggcggactcattgctgtttctgaattagcgaaaagagtttctggtaaaacaaaccgaaaacttgtagcaacaatgttgtctctggctgttgccggtacagtaaatgca 128
USP45 aagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcg 129
csgA_N22 atgaaacttttaaaagtagcagcaattgcagcaatcgtattctccggtagcgctctggcaggtgttgttcctcagtacggcggcggcggtggcaaccacggtggtggcggtaataacagcggtccgaat 130
FlgI_N22 gtgataaagtttctgtcagcactgatattacttcttgttaccaccgccgttcaggccggtgttgttcctcagtacggcggcggcggtggcaaccacggtggtggcggtaataacagcggtccgaat 131
sfmC_N22 atgatgactaaaataaagttattgatgctcattatattttatttaatcatttcggccagcgcccatgctggtgttgttcctcagtacggcggcggcggtggcaaccacggtggtggcggtaataacagcggtccgaat 132
USP45_N22 atgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcgggtgttgttcctcagtacggcggcggcggtggcaaccacggtggtggcggtaataacagcggtccgaat 133
YraI_N22 atgtcaaaacgaacattcgcggtgatattaaccttgttgtgtagcttctgtattggccaggcgcttgcaggtgttgttcctcagtacggcggcggcggtggcaaccacggtggtggcggtaataacagcggtccgaat 134
csgA atgaaacttttaaaagtagcagcaattgcagcaatcgtattctccggtagcgctctggcaggtgttgttcctcagtacggcggcggcggtggcaaccacggtggtggcggtaataacagcggtccgaattcagagctgaatatttaccagtacggtggcggtaactctgctcttgctctgcaagctgacgcccgtaactctgatctgaccattacccagcacggcggcggtaatggcgcagatgtgggccaaggttctgatgacagctcaatcgatctgactcagcgtggtttcggcaacagcgctactcttgatcagtggaatggtaaagattctactatgactgttaaacagttcggtggcggtaacggtgctgctgttgaccagactgcatctaactccagcgttaacgtcactcaggttggctttggtaacaacgcgaccgctcatcagtac 135
在一些實施例中，信號肽可以透過存在於經遺傳修飾的微生物(例如經遺傳修飾的細菌)中的輸出路徑和/或分泌系統加工。信號肽通常在輸出的前驅物蛋白質的N端，並且可以將前驅物蛋白質引導到細菌細胞質膜中的輸出路徑。分泌系統能夠在從經基因工程改造的微生物(如細菌)分泌成熟蛋白質之前從前驅物蛋白質去除信號肽。
如本文所用，術語“分泌系統”在本文中與“輸出系統”和“輸出路徑”可互換地使用，是指能夠從微生物(例如細菌細胞質)分泌或輸出所表現的多肽產物(例如Amuc_1100多肽)的原生或非原生分泌機制。如大腸桿菌的革蘭氏陰性細菌中從外向內，存在外膜(OM)、肽聚糖細胞壁、周質、內膜(IM)和細胞質隔室。OM為極有效且選擇性的滲透性屏障。OM為由內葉處的磷脂和外葉處的糖脂以及脂蛋白和β桶形蛋白組成的脂質雙層。OM透過稱為Lpp的脂蛋白固定到底層肽聚糖。周質密集地填充有蛋白質，且其比細胞質更粘稠。IM為磷脂雙層並且主要位置容納在能量產生、脂質生物合成、蛋白質分泌和轉運中起作用的膜蛋白。
在細菌中，存在兩種常見蛋白質輸出路徑，包含普遍存在的一般分泌(或Sec)路徑和雙精胺酸易位(或Tat)路徑。通常，Sec路徑處理未折疊狀態的較高分子量前驅物蛋白質，其中信號肽將受質蛋白質標靶到膜結合的Sec移位酶。前驅物目標蛋白質遞送到移位酶並且透過SecA、SecD和SecF穿過SecYEG孔。伴護蛋白SecB、GroEL-GroES、DnaK-DnaJ-GrpE輔助目標蛋白運輸。Tat路徑通常運輸完全折疊或甚至寡聚狀態的蛋白質，且革蘭氏陰性和陽性細菌中都由組分TatA、TatB和TatC組成。在膜易位之後，透過信號肽酶去除信號肽並且分泌成熟蛋白質。
對於革蘭氏陰性細菌，其具有專用單步分泌系統，並且分泌系統的非限制性實例包含Sat分泌系統、I型分泌系統(T1SS)、II型分泌系統(T2SS)、III型分泌系統(T3SS)、IV型分泌系統(T4SS)、V型分泌系統(T5SS)、VI型分泌系統(T6SS)和多藥物流出泵的耐藥性-結瘤-分裂(resistance-nodulation-division，RND)家族、各種單膜分泌系統。
在一些實施例中，分泌系統對於經遺傳修飾的微生物是原生或非原生的系統。對於微生物“原生”意思是分泌系統通常存在於微生物中，而對於微生物“非原生”意思是分泌系統不通常存在於微生物中，例如額外分泌系統，如來自細菌或病毒的不同物種、菌株或亞菌株的分泌系統，或與來自同一亞型的微生物的未經修飾的分泌系統相比經修飾和/或突變的分泌系統。
在一些實施方式中，本發明的經遺傳修飾的微生物進一步包含微生物基因組中的一種或多種基因改造。在一些實施方式中，其中所述一種或多種基因組改造包括對分泌系統的基因工程改造和/或優化以使得至少一種外膜蛋白編碼基因被刪除、失活或抑制。
在一些實施方式中，分泌系統經基因工程改造和/或優化以使得經遺傳修飾的微生物中的至少一種外膜蛋白編碼基因被刪除、失活或抑制。在一些實施例中，所述外膜蛋白選自由以下組成的群組：OmpC、OmpA、OmpF、OmpT、pldA、pagP、tolA、Pal、To1B、degS、mrcA和lpp。
為了製造能夠分泌所需治療性蛋白質或胜肽的革蘭氏陰性細菌(例如EcN)，需要遺傳修飾細菌宿主並且使其具有“漏”或去穩定化的外膜，但不影響宿主細菌化學物理活性。基因，例如lpp、ompC、ompA、ompF、ompT、pldA、pagP、tolA、to1B、pal、degS、degP和nlpI可以被刪除或誘發突變以產生“漏”的外膜。Lpp為細菌細胞中最豐富的多肽，且充當細菌細胞壁與肽聚糖的主要“訂書針”。lpp的缺失對細菌生長具有極小影響，但增加Amuc_1100的分泌，例如增加至少一倍。誘導型啟動子可以用於替換所選擇的一種或多種基因的內源啟動子以使對細胞存活率的負面影響最小化。
基因或編碼區的“刪除/缺失”或“失活”或“抑制”意指使由所述基因或編碼區編碼的酵素或蛋白質不產生，或以非活性形式產生於微生物中，或以低於在相同或類似生長條件下在微生物的野生型形式中發現的含量在微生物中產生。這可以透過例如以下方法中的一種或多種實現：(1)同源重組，(2)基於RNA干擾的技術，(3)ZFN和TALEN，(4)CRISPR/Cas系統。
在一些實施方式中，分泌系統經基因工程改造以使得至少一種伴護蛋白編碼基因被擴增、過表現或活化。
伴護蛋白涉及許多重要的生物過程，如寡聚蛋白複合物的蛋白質折疊和聚集，使蛋白質前驅物維持在未折疊狀態以促進蛋白質跨膜運輸，並使變性的蛋白質能夠解聚合和修復。其主要是輔助其它胜肽維持正常構形，以形成正確的寡聚結構，從而發揮正常的生理功能。各種伴護蛋白是所屬領域中眾所周知的。在一些實施方式中，伴護蛋白選自由以下組成的群組：dsbA、dsbC、dnaK、dnaJ、grpE、groES、groEL、tig、fkpA、surA、skp、PpiD和DegP。在一些實施例中，伴護蛋白選自由以下組成的群組：來自70 kDa熱休克蛋白(Hsp70)的胞質SSA亞家族的Ssa1p、Ssa2p、Ssa3p和Ssa4p，BiP、Kar2、Lhs1、Sil1、Sec63、蛋白二硫鍵異構酶Pdi1p，在一些實施例中，伴護蛋白由dsbA、dsbC、dnaK、dnaJ、grpE、groES、groEL、tig、fkpA和surA組成。
基因或編碼區的“過表現(overexpressed/overexpression)”意指使由所述基因或編碼區編碼的酵素或蛋白質以高於在相同或類似生長條件下在微生物的野生型形式中發現的含量的含量在微生物中產生。這可以透過例如以下方法中的一種或多種實現：(1)設置更強的啟動子，(2)設置更強的核糖體結合位址，如5'-AGGAGG的DNA序列，位於轉譯起始密碼子上游約四到十個鹼基處，(3)設置終止子或更強的終止子，(4)改進在編碼區中的一個或多個位址處的密碼子的選擇，(5)提高mRNA穩定性，和(6)透過在染色體中引入多個複本或將匣置於多複本質體上來增加基因的複本數。由過表現的基因產生的酵素或蛋白質稱為“過產生”的。“過表現”的基因或“過產生”的蛋白質可以對於微生物是原生的，或其可以透過遺傳修飾方法從不同生物體移植到微生物中，在後一種情況下，酵素或蛋白質和編碼酶或蛋白質的基因或編碼區稱為“外來”或“異源”的。外來或異源基因和蛋白質為過表現和過產生的，因為其不存在於未基因工程改造的微生物中。
對於酵母，分泌系統主要包含初生蛋白質易位、內質網(ER)中的蛋白質折疊、醣基化、蛋白質分選和運輸。轉譯期間信號肽一從核糖體出現，新合成的膜或分泌蛋白質就由信號辨識顆粒(SRP)辨識，隨後標靶到穿過Sec61或Ssh1易位子孔的轉譯後分泌。已實施各種方法以改進酵母中的異源蛋白質產生：(1)基因工程改造信號肽並且提高啟動子強度和質體複本數；(2)基因工程改造宿主菌株的轉譯後路徑，例如過表現ER折疊伴護蛋白和囊泡運輸組件，和減少細胞間和細胞外蛋白水解。異源蛋白質的分泌的示範性酵母分泌信號肽包含釀酒酵母α-交配因子(α-Mating Factor，α-MF)肽原前驅物(pre pro-peptide)、來自馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)的菊粉酶的信號肽、來自普通菜豆凝集素(Phaseolus vulgaris agglutinin)的PHAE的信號肽、病毒毒素原前驅物(prepro toxin)的信號肽、米根黴(Rhizopus oryzae)澱粉酶或來自真菌裡氏木黴(Trichoderma reesei)的疏水蛋白信號序列的信號肽。 E. 基因組整合位址
在一些實施方式中，外源性表現匣整合於經遺傳修飾的微生物的基因組中。
在一些實施方式中，所述外源性表現匣包含在質體中，且所述質體被引入所述微生物中並且適合在所述微生物中表現。
在一些實施方式中，本申請所述的經遺傳修飾的微生物能夠穩定生長、穩定表現非天然遺傳物質，例如編碼Amuc_1100、IL-10和/或IL-22的基因，或表現這些多肽/蛋白質的外源表現匣。在一些實施方式中，所述非天然遺傳物質被導入到微生物的基因組中或在染色體外質體上進行複製，從而使得該非天然遺傳物質被保留、轉錄和表現。
在一些實施方式中，穩定的微生物(如，細菌)可以是包含表現且分泌Amuc_1100、IL-10和/或IL-22的經遺傳修飾的微生物，其中攜帶編碼Amuc_1100、IL-10和/或IL-22的外源表現匣的質體或染色體被穩定地維持在該經遺傳修飾的微生物中，使得所述外源表現匣可以在所述經遺傳修飾的微生物中被表現，且所述經遺傳修飾的微生物能夠在體外和/或在體內存活和/或生長。穩定的微生物能夠在體外(例如，在培養基中)或在體內(例如，在消化道中)存活並生長。
在一些實施方式中，複本數影響非天然遺傳物質的表現的穩定性。在一些實施方式中，複本數影響非天然遺傳物質的表現的位準。在其中所述經遺傳修飾的微生物包含一個或更多個基因序列和一個或更多個基因匣的實施方式中，基因序列可以存在於一個或更多個質體上，並且基因匣可以存在於微生物染色體中，且反之亦然。另外，任何基因、基因匣或調節區域的多個複本(例如一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個)可以存在於微生物中，其中基因、基因匣或調節區域的一個或更多個複本可以如本文描述被突變或以其他方式改變。在一些實施方式中，將經遺傳修飾的微生物基因工程化為包含相同基因、基因匣或調節區域的多個複本以增強複本數。在一些實施方式中，將經遺傳修飾的微生物基因工程化為包含進行多種不同功能的基因匣的多種不同組件。在一些實施方式中，將經遺傳修飾的微生物基因工程化為包含不同基因、基因匣或調節區域的一個或更多個複本，以產生表現多於一種治療性分子和/或進行多於一種功能的經遺傳修飾的微生物。在一些實施方式中，複本數影響非天然遺傳物質的表現的穩定性。在一些實施方式中，複本數影響非天然遺傳物質的表現的位準。
在一些實施方式中，兩個或更多個基因序列為相同基因的多個複本。在一些實施方式中，兩個或更多個基因序列為編碼不同基因的序列。在一些實施方式中，兩個或更多個基因序列為編碼一個或更多個不同基因的多個複本的序列。在一些實施方式中，經遺傳修飾的微生物包含用於治療或預防發炎性疾病或自體免疫疾病的分子的一個或更多個基因匣。例如，經遺傳修飾的微生物可以包含用於治療或預防發炎性疾病或自體免疫疾病的分子的兩個或更多個基因匣。在一些實施方式中，兩個或更多個基因匣為相同基因匣的多個複本。在一些實施方式中，兩個或更多個基因匣為用於產生相同或不同治療或預防發炎性疾病或自體免疫疾病的分子的不同基因匣。在一些實施方式中，兩個或更多個基因匣為用於分子的多個複本的基因匣。
另外，任何調節區域、啟動子、基因、和/或基因匣的多個複本可以存在於經遺傳修飾的微生物中，其中調節區域、啟動子、基因、和/或基因匣的一個或更多個複本可以如本文描述被突變或以其他方式改變。在一些實施方式中，將經遺傳修飾的微生物基因工程化為包含相同調節區域、啟動子、基因、和/或基因匣的多個複本以增強複本數或者以包含進行多種不同功能的基因匣的多種不同組件或者以包含不同調節區域、啟動子、基因、和/或基因匣的一個或更多個複本以產生表現多於一個治療性分子和/或進行多於一種功能的經遺傳修飾的微生物。
在一些實施方式中，外源性表現匣透過CRISPR-Cas基因組編輯系統整合於經遺傳修飾的微生物的基因組中。本文提供的任何適合的微生物都可以經基因工程改造，以使得外源性表現匣整合到基因組中。
在一些實施方式中，經遺傳修飾的微生物為大腸桿菌的菌株 Nissle 1917(EcN)，並且外源性表現匣整合到EcN基因組中的位址中。在一些實施方式中，EcN基因組中的適合整合位址為整合位址agaI/rsmI、lacZ、kefB、malP/T、yicS/nepl、rhtB/C、maeB、malE/K、yieN、lldD、maeA、pflB或araB/C。用於本發明中的Amuc_1100、IL-10和/或IL-22整合於EcN基因組位址中。不希望受任何理論束縛，但認為本發明的EcN的基因組位址對於插入Amuc_1100、IL-10和/或IL-22的表現匣，透過以下特徵中的至少一個是有利的：(1)所述位址的基因工程改造所影響的一種或多種細菌基因不是EcN生長所必需的，並且不改變宿主細菌的生物化學和生理活性，(2)所述位址可以容易地被編輯，和(3)所述位址中的Amuc_1100基因匣、IL-10和/或IL-22基因匣可以被轉錄。 F. 營養缺陷體
在一些實施方式中，本發明的微生物進一步包含營養缺陷相關基因中的至少一個失活或缺失。
為了產生環境友好型細菌，可以透過基因編輯使細菌細胞生存所必需的一些必需基因被刪除或失活，使經基因工程改造的細菌成為營養缺陷體。如本文所用，術語“營養缺陷體”是指微生物(例如微生物體菌株)的生長需要特定代謝物的外部來源，所述代謝物由於後天基因缺陷而不能合成。
如本文所用，術語“營養缺陷相關基因”是指微生物(例如微生物體，如細菌)生存所需的基因。營養缺陷相關基因可以是微生物體產生生存或生長所必需的營養素所必需的，或者可以是檢測環境中調節轉錄因子活性的信號所必需的，其中不存在所述信號將引起細胞死亡。
在一些實施方式中，營養缺陷型修飾意圖使微生物體在缺乏外源添加的生存或生長所必需的營養素時死亡，因為所述微生物體缺乏產生必需營養素所必需的一種或多種基因。在一些實施方式中，本文所述的經遺傳修飾的細菌中的任一種還包含細胞生存和/或生長所需基因的缺失或突變。
細菌中的各種營養缺陷相關基因是所屬領域中眾所周知的。示範性營養缺陷相關基因包含但不限於：thyA、cysE、glnA、ilvD、leuB、lysA、serA、metA、glyA、hisB、ilvA、pheA、proA、thrC、trpC、tyrA、uraA、dapF、flhD、metB、metC、proAB、yhbV、yagG、hemB、secD、secF、ribD、ribE、thiL、dxs、ispA、dnaX、adk、hemH、IpxH、cysS、fold、rplT、infC、thrS、nadE、gapA、yeaZ、aspS、argS、pgsA、yeflA、metG、folE、yejM、gyrA、nrdA、nrdB、folC、accD、fabB、gltX、ligA、zipA、dapE、dapA、der、hisS、ispG、suhB、tadA、acpS、era、rnc、fisB、eno、pyrG、chpR、Igt、fbaA、pgk、yqgD、metK、yqgF、plsC、ygiT、pare、ribB、cca、ygjD、tdcF、yraL、yihA、ftsN、murl、murB、birA、secE、nusG、rplJ、rplL、rpoB、rpoC、ubiA、plsB、lexA、dnaB、ssb、alsK、groS、psd、orn、yjeE、rpsR、chpS、ppa、valS、yjgP、yjgQ、dnaC、ribF、IspA、ispH、dapB、folA、imp、yabQ、flsL、flsl、murE、murF、mraY、murD、ftsW、murG、murC、ftsQ、ftsA、ftsZ、IpxC、secM、secA、can、folK、hemL、yadR、dapD、map、rpsB、infB、nusA、ftsH、obgE、rpmA、rplU、ispB、murA、yrbB、yrbK、yhbN、rpsl、rplM、degS、mreD、mreC、mreB、accB、accC、yrdC、def、fint、rplQ、rpoA、rpsD、rpsK、rpsM、entD、mrdB、mrdA、nadD、hlepB、rpoE、pssA、yfiO、rplS、trmD、rpsP、ffh、grpE、yfjB、csrA、ispF、ispD、rplW、rplD、rplC、rpsJ、fusA、rpsG、rpsL、trpS、yrfF、asd、rpoH、ftsX、ftsE、ftsY、frr、dxr、ispU、rfaK、kdtA、coaD、rpmB、djp、dut、gmk、spot、gyrB、dnaN、dnaA、rpmH、rnpA、yidC、tnaB、glmS、glmU、wzyE、hemD、hemC、yigP、ubiB、ubiD、hemG、secY、rplO、rpmD、rpsE、rplR、rplF、rpsH、rpsN、rplE、rplX、rplN、rpsQ、rpmC、rplP、rpsC、rplV、rpsS、rplB、cdsA、yaeL、yaeT、lpxD、fabZ、IpxA、IpxB、dnaE、accA、tilS、proS、yafF、tsf、pyrH、olA、rlpB、leuS、Int、glnS、fldA、cydA、infA、cydC、ftsK、lolA、serS、rpsA、msbA、IpxK、kdsB、mukF、mukE、mukB、asnS、fabA、mviN、rne、yceQ、fabD、fabG、acpP、tmk、holB、lolC、lolD、lolE、purB、ymflC、minE、mind、pth、rsA、ispE、lolB、hemA、prfA、prmC、kdsA、topA、ribA、fabi、racR、dicA、yd B、tyrS、ribC、ydiL、pheT、pheS、yhhQ、bcsB、glyQ、yibJ和gpsA。
在一種修飾中，必需基因thyA被刪除或被另一基因替代，使得經遺傳修飾的細菌依賴於外源胸腺嘧啶而生長或生存。向生長培養基添加胸腺嘧啶或天然具有高胸腺嘧啶含量的人體腸道可以支持thyA營養缺陷型細菌的生長和生存。這種修飾是為了確保經遺傳修飾的細菌不能在腸道外或在缺乏營養缺陷基因產物的環境中生長和生存。
在一些實施方式中，微生物是一種或多種選自由以下組成的群組的物質的營養缺陷體：尿嘧啶、胸腺嘧啶、二胺基庚二酸、亮胺酸、組胺酸、色胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、腺嘌呤和非天然存在的胺基酸。在一些實施方式中，非天然存在的胺基酸選自由以下組成的群組：l-4,4ʹ-聯苯丙胺酸、對乙醯基-l-苯丙胺酸、對碘-l-苯丙胺酸和對疊氮基-l-苯丙胺酸。
在一些實施方式中，微生物包含變構調節的轉錄因子，所述轉錄因子能夠檢測調節所述轉錄因子的活性的環境中的信號，其中不存在所述信號將引起細胞死亡。所述“信號傳遞分子-轉錄因子”對可以包含選自由以下組成的群組的任一種或多種：色胺酸-TrpR、IPTG-LacI、苯甲酸酯衍生物-XylS、ATc-TetR、半乳糖-GalR、雌二醇-雌激素受體雜合蛋白、纖維二糖-CelR和高絲胺酸內酯-luxR。 G. 內源質體的缺失
在一些實施方式中，經遺傳修飾的細菌具有一種或多種內源質體的缺失。
一些底盤細菌宿主包含一種或多種內源質體，其為其轉錄消耗相當多的資源。不受任何理論束縛，認為刪除這些內源質體以釋放可以更好地用於異源基因表現的資源。
一種或多種內源質體可以透過所屬領域中已知的方法從目標微生物去除。舉例來說，EcN包含兩種內源質體pMUT1和pMUT2，其可以透過任何適當的方法從EcN去除。一種例示的方式是透過CRISPR-Cas9媒介的DNA雙鏈切割。簡而言之，可以在EcN中導入特異性結合pMUT1或pMUT2的嚮導RNA(gRNA或單鏈嚮導RNA，即sgRNA)和表現Cas9蛋白的核酸序列(例如質體)，從而在EcN中透過Cas9蛋白媒介的DNA雙鏈切割破壞pMUT1或pMUT2。作為另一個實施方式，也可以先將EcN中的pMUT2替換為表現特定抗性基因(例如卡那黴素抗性基因)的重組pMUT2質體，例如透過篩選具有抗性的重組EcN。然後再導入特異性結合該抗性基因的gRNA或sgRNA和表現Cas9蛋白的核酸序列(例如質體)，從而在EcN中Cas9蛋白媒介的DNA雙鏈切割破壞替換後的重組pMUT2質體。
本申請的發明人驚訝地發現，本發明所述的經遺傳修飾的微生物(如，細菌)不僅可以穩定地生長並保持活力，而且可以在其基因組中同時整合至少兩種外源基因並仍然穩定高效地表現和分泌這些至少兩種外源基因所編碼的多肽/蛋白。更重要的是，所述表現分泌的全新外源多肽組合(Amuc_1100/IL-10/IL-22之至少兩者組合)的微生物透過腸道施用，在動物模型展現出了對多種發炎性疾病或自體免疫性疾病(如，發炎性腸病)的治療效果甚至是意料不到的協同作用，因此本發明的基因工程微生物作為活體藥物具有廣闊的臨床應用前景。
本發明還提供了所述的經遺傳修飾的微生物的製備方法，其中所述的製備方法包括步驟：向微生物中引入可外源性表現本發明的Amuc_1100、IL-10和/或IL-22的核苷酸序列，以使得所述核苷酸序列中的外源基因可以在所述微生物中表現，從而獲得所述的經遺傳修飾的微生物。
在一些實施方式中，本發明的例示性的優化的Amuc_1100表現匣具有以下序列SEQ ID NO: 139至SEQ ID NO: 143中任一所示的結構。IL-10表現匣具有以下序列SEQ ID NO: 144至SEQ ID NO: 156和235中任一所示的結構。IL-22表現匣具有以下序列SEQ ID NO: 157至SEQ ID NO: 163中任一所示的結構。 含有不同調控元件的 Amuc_1100 序列例示
在一些實施方式中，本申請提供了多種含有不同調控元件(例如不同啟動子、不同信號肽、不同順反子等)的Amuc_1100具體的表現匣的序列，具體如下所示。在一些實施方式中，本申請還提供了包含任一所述Amuc_1100具體表現匣序列的經遺傳修飾的微生物(例如EcN)。本申請提供的Amuc_1100具體表現匣的序列的例示如下所示：
BBa_J23101_USP45_Amuc_1100(Y259A)_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4101、CBT4103和CBT4108的相應表現匣，SEQ ID NO: 139) tctagagcttgtcgacgtctcgagtttacagctagctcagtcctaggtattatgctagcctcgaggaaagaggagaaagaagcttaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcgattgttaacagcaagcgtagcgagctggataagaaaatcagcattgcggcgaaagagatcaagagcgcgaacgcggcggaaattaccccgagccgtagcagcaacgaggaactggagaaagaactgaaccgttacgcgaaggcggttggtagcctggaaaccgcgtataaaccgtttctggcgagcagcgcgctggtgccgaccaccccgaccgcgttccaaaacgagctgaaaacctttcgtgacagcctgatcagcagctgcaagaaaaagaacatcctgattaccgataccagcagctggctgggcttccaggtttacagcacccaagcgccgagcgtgcaggcggcgagcaccctgggttttgagctgaaagcgattaacagcctggttaacaagctggcggaatgcggcctgagcaaattcatcaaggtgtatcgtccgcagctgccgattgaaaccccggcgaacaacccggaggaaagcgacgaagcggatcaggcgccgtggaccccgatgccgctggagatcgcgttccagggtgaccgtgaaagcgttctgaaagcgatgaacgcgattaccggcatgcaagattacctgtttaccgtgaacagcatccgtattcgtaacgaacgtatgatgccgccgccaatcgcgaacccggctgcggcgaagccggctgcggcgcagccggcgaccggtgcggcgagcctgaccccggcggacgaggctgcggcgccggctgcgccggcgatccagcaagttattaaaccggctatgggcaaggaacaggtgttcgttcaagtgagcctgaacctggtgcactttaaccagccgaaagcgcaagagccgagcgaagatcatcatcaccaccaccactaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
BBa_J23110_USP45_Amuc_1100(Y259A)_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4102、CBT4107、CBT4108和CBT4109的相應表現匣，SEQ ID NO: 140) tctagagcttgtcgacgtctcgagtttacggctagctcagtcctaggtacaatgctagcctcgaggaaagaggagaaagaagcttaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcgattgttaacagcaagcgtagcgagctggataagaaaatcagcattgcggcgaaagagatcaagagcgcgaacgcggcggaaattaccccgagccgtagcagcaacgaggaactggagaaagaactgaaccgttacgcgaaggcggttggtagcctggaaaccgcgtataaaccgtttctggcgagcagcgcgctggtgccgaccaccccgaccgcgttccaaaacgagctgaaaacctttcgtgacagcctgatcagcagctgcaagaaaaagaacatcctgattaccgataccagcagctggctgggcttccaggtttacagcacccaagcgccgagcgtgcaggcggcgagcaccctgggttttgagctgaaagcgattaacagcctggttaacaagctggcggaatgcggcctgagcaaattcatcaaggtgtatcgtccgcagctgccgattgaaaccccggcgaacaacccggaggaaagcgacgaagcggatcaggcgccgtggaccccgatgccgctggagatcgcgttccagggtgaccgtgaaagcgttctgaaagcgatgaacgcgattaccggcatgcaagattacctgtttaccgtgaacagcatccgtattcgtaacgaacgtatgatgccgccgccaatcgcgaacccggctgcggcgaagccggctgcggcgcagccggcgaccggtgcggcgagcctgaccccggcggacgaggctgcggcgccggctgcgccggcgatccagcaagttattaaaccggctatgggcaaggaacaggtgttcgttcaagtgagcctgaacctggtgcactttaaccagccgaaagcgcaagagccgagcgaagatcatcatcaccaccaccactaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
BBa_J23101_USP45_Amuc_1100(WT)_rrnB_T1(突變體)_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4068、CBT4069、CBT4067和CBT4070的相應表現匣，SEQ ID NO: 141) tctagagcttgtcgacgtctcgagtttacagctagctcagtcctaggtattatgctagcctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcgggtagcagccatcatcaccaccaccacgacgacgacgacaaaattgttaacagcaagcgtagcgagctggataagaaaatcagcattgcggcgaaagagatcaagagcgcgaacgcggcggaaattaccccgagccgtagcagcaacgaggaactggagaaagaactgaaccgttacgcgaaggcggttggtagcctggaaaccgcgtataaaccgtttctggcgagcagcgcgctggtgccgaccaccccgaccgcgttccaaaacgagctgaaaacctttcgtgacagcctgatcagcagctgcaagaaaaagaacatcctgattaccgataccagcagctggctgggcttccaggtttacagcacccaagcgccgagcgtgcaggcggcgagcaccctgggttttgagctgaaagcgattaacagcctggttaacaagctggcggaatgcggcctgagcaaattcatcaaggtgtatcgtccgcagctgccgattgaaaccccggcgaacaacccggaggaaagcgacgaagcggatcaggcgccgtggaccccgatgccgctggagatcgcgttccagggtgaccgtgaaagcgttctgaaagcgatgaacgcgattaccggcatgcaagattacctgtttaccgtgaacagcatccgtattcgtaacgaacgtatgatgccgccgccaatcgcgaacccggctgcggcgaagccggctgcggcgcagccggcgaccggtgcggcgagcctgaccccggcggacgaggctgcggcgccggctgcgccggcgatccagcaagttattaaaccgtatatgggcaaggaacaggtgttcgttcaagtgagcctgaacctggtgcactttaaccagccgaaagcgcaagagccgagcgaagattgacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
BBa_J23110_USP45_Amuc_1100(WT)_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4105、CBT4106、CBT4068、CBT4069、CBT4067和CBT4070的相應表現匣，SEQ ID NO: 142) tctagagcttgtcgacgtctcgagtttacggctagctcagtcctaggtacaatgctagcctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcgggtagcagccatcatcaccaccaccacgacgacgacgacaaaattgttaacagcaagcgtagcgagctggataagaaaatcagcattgcggcgaaagagatcaagagcgcgaacgcggcggaaattaccccgagccgtagcagcaacgaggaactggagaaagaactgaaccgttacgcgaaggcggttggtagcctggaaaccgcgtataaaccgtttctggcgagcagcgcgctggtgccgaccaccccgaccgcgttccaaaacgagctgaaaacctttcgtgacagcctgatcagcagctgcaagaaaaagaacatcctgattaccgataccagcagctggctgggcttccaggtttacagcacccaagcgccgagcgtgcaggcggcgagcaccctgggttttgagctgaaagcgattaacagcctggttaacaagctggcggaatgcggcctgagcaaattcatcaaggtgtatcgtccgcagctgccgattgaaaccccggcgaacaacccggaggaaagcgacgaagcggatcaggcgccgtggaccccgatgccgctggagatcgcgttccagggtgaccgtgaaagcgttctgaaagcgatgaacgcgattaccggcatgcaagattacctgtttaccgtgaacagcatccgtattcgtaacgaacgtatgatgccgccgccaatcgcgaacccggctgcggcgaagccggctgcggcgcagccggcgaccggtgcggcgagcctgaccccggcggacgaggctgcggcgccggctgcgccggcgatccagcaagttattaaaccgtatatgggcaaggaacaggtgttcgttcaagtgagcctgaacctggtgcactttaaccagccgaaagcgcaagagccgagcgaagattgacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
PfnrS_USP45_Amuc_1100(WT)_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4080、CBT4096、CBT4088、CBT4098和CBT4111的相應表現匣，SEQ ID NO: 143) tctagagcttgtcgacgtctcgagaaaaacgccgcaaagtttgagcgaagtcaataaactctctacccattcagggcaatatctctcttctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcgggtagcagccatcatcaccaccaccacgacgacgacgacaaaattgttaacagcaagcgtagcgagctggataagaaaatcagcattgcggcgaaagagatcaagagcgcgaacgcggcggaaattaccccgagccgtagcagcaacgaggaactggagaaagaactgaaccgttacgcgaaggcggttggtagcctggaaaccgcgtataaaccgtttctggcgagcagcgcgctggtgccgaccaccccgaccgcgttccaaaacgagctgaaaacctttcgtgacagcctgatcagcagctgcaagaaaaagaacatcctgattaccgataccagcagctggctgggcttccaggtttacagcacccaagcgccgagcgtgcaggcggcgagcaccctgggttttgagctgaaagcgattaacagcctggttaacaagctggcggaatgcggcctgagcaaattcatcaaggtgtatcgtccgcagctgccgattgaaaccccggcgaacaacccggaggaaagcgacgaagcggatcaggcgccgtggaccccgatgccgctggagatcgcgttccagggtgaccgtgaaagcgttctgaaagcgatgaacgcgattaccggcatgcaagattacctgtttaccgtgaacagcatccgtattcgtaacgaacgtatgatgccgccgccaatcgcgaacccggctgcggcgaagccggctgcggcgcagccggcgaccggtgcggcgagcctgaccccggcggacgaggctgcggcgccggctgcgccggcgatccagcaagttattaaaccgtatatgggcaaggaacaggtgttcgttcaagtgagcctgaacctggtgcactttaaccagccgaaagcgcaagagccgagcgaagattgacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag 含有調控元件的 IL-10 序列例示
在一些實施方式中，本申請提供了多種含有不同調控元件(例如不同啟動子、不同信號肽、不同順反子)的IL-10具體的表現匣的序列，具體如下所示。在一些實施方式中，本申請還提供了包含任一所述IL-10具體表現匣序列的經遺傳修飾的微生物(例如EcN)。本申請提供的IL-10具體表現匣的序列的例示如下所示：
BBa_J23101_USP45_IL-10_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4003的相應表現匣，SEQ ID NO: 144) tctagagcttgtcgacgtctcgagtttacagctagctcagtcctaggtattatgctagcctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcgagcccgggtcagggtacccaaagcgaaaacagctgcacccacttcccgggcaacctgccgaacatgctgcgtgacctgcgtgatgcgttcagccgtgtgaaaaccttcttccagatgaaagaccaactggataacctgctgctgaaggagagcctgctggaggacttcaaaggttacctgggctgccaggcgctgagcgaaatgatccaattttatctggaggaagtgatgccgcaggcggagaaccaagacccggatattaaggcgcacgttaacagcctgggcgagaacctgaaaaccctgcgtctgcgtctgcgtcgttgccaccgtttcctgccgtgcgagaacaaaagcaaggcggtggaacaggttaagaacgcgtttaacaaactgcaagagaagggcatctataaagcgatgagcgaattcgatatctttattaactacatcgaggcgtatatgaccatgaaaattcgtaactagtaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
BBa_J23110_USP45_IL-10_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4005、CBT4071、CBT4072、CBT4073、CBT4074、CBT4112、CBT4020、CBT4075、CBT4076和CBT4077的相應表現匣，SEQ ID NO: 145) tctagagcttgtcgacgtctcgagtttacggctagctcagtcctaggtacaatgctagcctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcgagcccgggtcagggtacccaaagcgaaaacagctgcacccacttcccgggcaacctgccgaacatgctgcgtgacctgcgtgatgcgttcagccgtgtgaaaaccttcttccagatgaaagaccaactggataacctgctgctgaaggagagcctgctggaggacttcaaaggttacctgggctgccaggcgctgagcgaaatgatccaattttatctggaggaagtgatgccgcaggcggagaaccaagacccggatattaaggcgcacgttaacagcctgggcgagaacctgaaaaccctgcgtctgcgtctgcgtcgttgccaccgtttcctgccgtgcgagaacaaaagcaaggcggtggaacaggttaagaacgcgtttaacaaactgcaagagaagggcatctataaagcgatgagcgaattcgatatctttattaactacatcgaggcgtatatgaccatgaaaattcgtaactagtaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
BBa_J23108_USP45_IL-10_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4004的相應表現匣，SEQ ID NO: 146) tctagagcttgtcgacgtctcgagctgacagctagctcagtcctaggtataatgctagcctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcgagcccgggtcagggtacccaaagcgaaaacagctgcacccacttcccgggcaacctgccgaacatgctgcgtgacctgcgtgatgcgttcagccgtgtgaaaaccttcttccagatgaaagaccaactggataacctgctgctgaaggagagcctgctggaggacttcaaaggttacctgggctgccaggcgctgagcgaaatgatccaattttatctggaggaagtgatgccgcaggcggagaaccaagacccggatattaaggcgcacgttaacagcctgggcgagaacctgaaaaccctgcgtctgcgtctgcgtcgttgccaccgtttcctgccgtgcgagaacaaaagcaaggcggtggaacaggttaagaacgcgtttaacaaactgcaagagaagggcatctataaagcgatgagcgaattcgatatctttattaactacatcgaggcgtatatgaccatgaaaattcgtaactagtaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
BBa_J23101_DsbA_IL-10_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4007的相應表現匣，SEQ ID NO: 147) tctagagcttgtcgacgtctcgagtttacagctagctcagtcctaggtattatgctagcctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgaagaaaatctggctggcgctggcgggtctggtgctggcgttcagcgcgagcgcgagcccgggtcagggtacccaaagcgaaaacagctgcacccacttcccgggcaacctgccgaacatgctgcgtgacctgcgtgatgcgttcagccgtgtgaaaaccttcttccagatgaaagaccaactggataacctgctgctgaaggagagcctgctggaggacttcaaaggttacctgggctgccaggcgctgagcgaaatgatccaattttatctggaggaagtgatgccgcaggcggagaaccaagacccggatattaaggcgcacgttaacagcctgggcgagaacctgaaaaccctgcgtctgcgtctgcgtcgttgccaccgtttcctgccgtgcgagaacaaaagcaaggcggtggaacaggttaagaacgcgtttaacaaactgcaagagaagggcatctataaagcgatgagcgaattcgatatctttattaactacatcgaggcgtatatgaccatgaaaattcgtaactagtaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
BBa_J23101_OmpA_IL-10_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4009的相應表現匣，SEQ ID NO: 148) tctagagcttgtcgacgtctcgagtttacagctagctcagtcctaggtattatgctagcctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgaagaaaaccgcgattgcgattgcggtggcgctggcgggtttcgcgaccgttgcgcaggcgagcccgggtcagggtacccaaagcgaaaacagctgcacccacttcccgggcaacctgccgaacatgctgcgtgacctgcgtgatgcgttcagccgtgtgaaaaccttcttccagatgaaagaccaactggataacctgctgctgaaggagagcctgctggaggacttcaaaggttacctgggctgccaggcgctgagcgaaatgatccaattttatctggaggaagtgatgccgcaggcggagaaccaagacccggatattaaggcgcacgttaacagcctgggcgagaacctgaaaaccctgcgtctgcgtctgcgtcgttgccaccgtttcctgccgtgcgagaacaaaagcaaggcggtggaacaggttaagaacgcgtttaacaaactgcaagagaagggcatctataaagcgatgagcgaattcgatatctttattaactacatcgaggcgtatatgaccatgaaaattcgtaactagtaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
BBa_J23101_PelB_IL-10_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4011的相應表現匣，SEQ ID NO: 149) tctagagcttgtcgacgtctcgagtttacagctagctcagtcctaggtattatgctagcctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgaagtacctgctgccgaccgcggcggcgggtctgctgctgctggcggcgcagccggcgatggcgagcccgggtcagggtacccaaagcgaaaacagctgcacccacttcccgggcaacctgccgaacatgctgcgtgacctgcgtgatgcgttcagccgtgtgaaaaccttcttccagatgaaagaccaactggataacctgctgctgaaggagagcctgctggaggacttcaaaggttacctgggctgccaggcgctgagcgaaatgatccaattttatctggaggaagtgatgccgcaggcggagaaccaagacccggatattaaggcgcacgttaacagcctgggcgagaacctgaaaaccctgcgtctgcgtctgcgtcgttgccaccgtttcctgccgtgcgagaacaaaagcaaggcggtggaacaggttaagaacgcgtttaacaaactgcaagagaagggcatctataaagcgatgagcgaattcgatatctttattaactacatcgaggcgtatatgaccatgaaaattcgtaactagtaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
BBa_J23101_YebF_IL-10_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4013的相應表現匣，SEQ ID NO: 150) tctagagcttgtcgacgtctcgagtttacagctagctcagtcctaggtattatgctagcctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgaaaaaaagaggggcgtttttagggctgttgttggtttctgcctgcgcatcagttttcgctgccaataatgaaaccagcaagtcggtcactttcccaaagtgtgaaggtctggatgctgccggaattgccgcgagcgtaaaacgtgattaccaacaaaatcgcgtggcgcgctgggctgatgatcaaaaaattgtcggtcaggccgatcccgtggcatgggtcagtttgcaggacattcaggggaaagatgataaatggtcagtaccgctaaccgtgcgtggtaaaagtgccgatattcattaccaggtcagcgtggactgcaaagcgggaatggcggaatatcagcggcgtcaccaccaccaccaccacgacgatgacgataagagcccgggtcagggtacccaaagcgaaaacagctgcacccacttcccgggcaacctgccgaacatgctgcgtgacctgcgtgatgcgttcagccgtgtgaaaaccttcttccagatgaaagaccaactggataacctgctgctgaaggagagcctgctggaggacttcaaaggttacctgggctgccaggcgctgagcgaaatgatccaattttatctggaggaagtgatgccgcaggcggagaaccaagacccggatattaaggcgcacgttaacagcctgggcgagaacctgaaaaccctgcgtctgcgtctgcgtcgttgccaccgtttcctgccgtgcgagaacaaaagcaaggcggtggaacaggttaagaacgcgtttaacaaactgcaagagaagggcatctataaagcgatgagcgaattcgatatctttattaactacatcgaggcgtatatgaccatgaaaattcgtaactagtaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
BBa_J23110_T7g10_USP45_IL-10_rrnB_T1_T7 Te(包含於本發明實施例菌株CBT4026的相應表現匣，SEQ ID NO: 151) tctagagcttgtcgacgtctcgagtttacggctagctcagtcctaggtacaatgctagcctcgagttaagtttagaaagaggagaaagaagcttatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcgagcccgggtcagggtacccaaagcgaaaacagctgcacccacttcccgggcaacctgccgaacatgctgcgtgacctgcgtgatgcgttcagccgtgtgaaaaccttcttccagatgaaagaccaactggataacctgctgctgaaggagagcctgctggaggacttcaaaggttacctgggctgccaggcgctgagcgaaatgatccaattttatctggaggaagtgatgccgcaggcggagaaccaagacccggatattaaggcgcacgttaacagcctgggcgagaacctgaaaaccctgcgtctgcgtctgcgtcgttgccaccgtttcctgccgtgcgagaacaaaagcaaggcggtggaacaggttaagaacgcgtttaacaaactgcaagagaagggcatctataaagcgatgagcgaattcgatatctttattaactacatcgaggcgtatatgaccatgaaaattcgtaactagtaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
BBa_J23110_BCD2_USP45_IL-10_rrnB_T1_T7 Te(包含於本發明實施例菌株CBT4028、CBT4067、CBT4068、CBT4063和CBT4062的相應表現匣，SEQ ID NO: 152) tctagagcttgtcgacgtctcgagtttacggctagctcagtcctaggtacaatgctagcctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgaaagcaattttcgtactgaaacatcttaatcatgctaaggaggttttctaatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcgagcccgggtcagggtacccaaagcgaaaacagctgcacccacttcccgggcaacctgccgaacatgctgcgtgacctgcgtgatgcgttcagccgtgtgaaaaccttcttccagatgaaagaccaactggataacctgctgctgaaggagagcctgctggaggacttcaaaggttacctgggctgccaggcgctgagcgaaatgatccaattttatctggaggaagtgatgccgcaggcggagaaccaagacccggatattaaggcgcacgttaacagcctgggcgagaacctgaaaaccctgcgtctgcgtctgcgtcgttgccaccgtttcctgccgtgcgagaacaaaagcaaggcggtggaacaggttaagaacgcgtttaacaaactgcaagagaagggcatctataaagcgatgagcgaattcgatatctttattaactacatcgaggcgtatatgaccatgaaaattcgtaactagtaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
BBa_J23110_GFP_USP45_IL-10_rrnB_T1_T7Te (包含於本發明實施例菌株CBT4029的相應表現匣，SEQ ID NO: 153) tctagagcttgtcgacgtctcgagtttacggctagctcagtcctaggtacaatgctagcctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgcgtaaaggcgaagagaaggaggttaactgatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcgagcccgggtcagggtacccaaagcgaaaacagctgcacccacttcccgggcaacctgccgaacatgctgcgtgacctgcgtgatgcgttcagccgtgtgaaaaccttcttccagatgaaagaccaactggataacctgctgctgaaggagagcctgctggaggacttcaaaggttacctgggctgccaggcgctgagcgaaatgatccaattttatctggaggaagtgatgccgcaggcggagaaccaagacccggatattaaggcgcacgttaacagcctgggcgagaacctgaaaaccctgcgtctgcgtctgcgtcgttgccaccgtttcctgccgtgcgagaacaaaagcaaggcggtggaacaggttaagaacgcgtttaacaaactgcaagagaagggcatctataaagcgatgagcgaattcgatatctttattaactacatcgaggcgtatatgaccatgaaaattcgtaactagtaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
BBa_J23110_螢光素酶_USP45_IL-10_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4030的相應表現匣，SEQ ID NO: 154) tctagagcttgtcgacgtctcgagtttacggctagctcagtcctaggtacaatgctagcctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgattatgtccggttataaggaggttaactgatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcgagcccgggtcagggtacccaaagcgaaaacagctgcacccacttcccgggcaacctgccgaacatgctgcgtgacctgcgtgatgcgttcagccgtgtgaaaaccttcttccagatgaaagaccaactggataacctgctgctgaaggagagcctgctggaggacttcaaaggttacctgggctgccaggcgctgagcgaaatgatccaattttatctggaggaagtgatgccgcaggcggagaaccaagacccggatattaaggcgcacgttaacagcctgggcgagaacctgaaaaccctgcgtctgcgtctgcgtcgttgccaccgtttcctgccgtgcgagaacaaaagcaaggcggtggaacaggttaagaacgcgtttaacaaactgcaagagaagggcatctataaagcgatgagcgaattcgatatctttattaactacatcgaggcgtatatgaccatgaaaattcgtaactagtaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
PfnrS_BCD2_USP45_IL-10_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4078的相應表現匣，SEQ ID NO: 155) Tctagagcttgtcgacgtctcgagaaaaacgccgcaaagtttgagcgaagtcaataaactctctacccattcagggcaatatctctcttctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgaaagcaattttcgtactgaaacatcttaatcatgctaaggaggttttctaatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcgagcccgggtcagggtacccaaagcgaaaacagctgcacccacttcccgggcaacctgccgaacatgctgcgtgacctgcgtgatgcgttcagccgtgtgaaaaccttcttccagatgaaagaccaactggataacctgctgctgaaggagagcctgctggaggacttcaaaggttacctgggctgccaggcgctgagcgaaatgatccaattttatctggaggaagtgatgccgcaggcggagaaccaagacccggatattaaggcgcacgttaacagcctgggcgagaacctgaaaaccctgcgtctgcgtctgcgtcgttgccaccgtttcctgccgtgcgagaacaaaagcaaggcggtggaacaggttaagaacgcgtttaacaaactgcaagagaagggcatctataaagcgatgagcgaattcgatatctttattaactacatcgaggcgtatatgaccatgaaaattcgtaactagtaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
PfnrS_USP45_IL-10_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4084、CBT4088、CBT4110和CBT4111的相應表現匣，SEQ ID NO: 156) Tctagagcttgtcgacgtctcgagaaaaacgccgcaaagtttgagcgaagtcaataaactctctacccattcagggcaatatctctcttctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcgagcccgggtcagggtacccaaagcgaaaacagctgcacccacttcccgggcaacctgccgaacatgctgcgtgacctgcgtgatgcgttcagccgtgtgaaaaccttcttccagatgaaagaccaactggataacctgctgctgaaggagagcctgctggaggacttcaaaggttacctgggctgccaggcgctgagcgaaatgatccaattttatctggaggaagtgatgccgcaggcggagaaccaagacccggatattaaggcgcacgttaacagcctgggcgagaacctgaaaaccctgcgtctgcgtctgcgtcgttgccaccgtttcctgccgtgcgagaacaaaagcaaggcggtggaacaggttaagaacgcgtttaacaaactgcaagagaagggcatctataaagcgatgagcgaattcgatatctttattaactacatcgaggcgtatatgaccatgaaaattcgtaactagtaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
Psal_sTRSV-HHRz_USP45_IL-10_rrnB_T1_T7 Te(包含於本發明實施例菌株CBT4113的相應表現匣，SEQ ID NO: 235) ggggcctcgcttgggttattgctggtgcccggccgggcgcaatattcatgttgatgatttattatatatcgagtggtgtatttatttatattgtttgctccgttaccgttattaacagctgtcaccggatgtgctttccggtctgatgagtccgtgaggacgaaacagcctctacaaataattttgtttaatactagagaaagaggggaaatactagatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcgagcccgggtcagggtacccaaagcgaaaacagctgcacccacttcccgggcaacctgccgaacatgctgcgtgacctgcgtgatgcgttcagccgtgtgaaaaccttcttccagatgaaagaccaactggataacctgctgctgaaggagagcctgctggaggacttcaaaggttacctgggctgccaggcgctgagcgaaatgatccaattttatctggaggaagtgatgccgcaggcggagaaccaagacccggatattaaggcgcacgttaacagcctgggcgagaacctgaaaaccctgcgtctgcgtctgcgtcgttgccaccgtttcctgccgtgcgagaacaaaagcaaggcggtggaacaggttaagaacgcgtttaacaaactgcaagagaagggcatctataaagcgatgagcgaattcgatatctttattaactacatcgaggcgtatatgaccatgaaaattcgtaactaggagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag 含有不同調控元件的 IL-22 序列例示
在一些實施方式中，本申請提供了多種含有不同調控元件(例如不同啟動子)的IL-22具體的表現匣的序列，具體如下所示。在一些實施方式中，本申請還提供了包含任一所述IL-22具體表現匣序列的經遺傳修飾的微生物(例如EcN)。本申請提供的IL-22具體表現匣的序列的例示如下所示：
BBa_J23119_USP45_IL-22_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4038的相應表現匣，SEQ ID NO: 157) tctagagtctcgagttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagcctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcggcgccgatcagcagccactgccgtctggacaaaagcaacttccagcaaccgtatattaccaaccgtacctttatgctggcgaaagaggcgagcctggcggacaacaacaccgatgtgcgtctgatcggcgagaaactgttccacggcgttagcatgagcgaacgttgctacctgatgaagcaggtgctgaactttaccctggaggaagttctgttcccgcaaagcgatcgttttcagccgtatatgcaagaggtggttccgttcctggcgcgtctgagcaaccgtctgagcacctgccacatcgaaggtgacgatctgcacattcagcgtaacgtgcaaaaactgaaggacaccgttaaaaagctgggcgagagcggcgaaatcaaagcgattggcgaactggatctgctgtttatgagcctgcgtaacgcgtgcatttagtaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
BBa_J23101_USP45_IL-22_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4041的相應表現匣，SEQ ID NO: 158) tctagagcttgtcgacgtctcgagtttacagctagctcagtcctaggtattatgctagcctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcggcgccgatcagcagccactgccgtctggacaaaagcaacttccagcaaccgtatattaccaaccgtacctttatgctggcgaaagaggcgagcctggcggacaacaacaccgatgtgcgtctgatcggcgagaaactgttccacggcgttagcatgagcgaacgttgctacctgatgaagcaggtgctgaactttaccctggaggaagttctgttcccgcaaagcgatcgttttcagccgtatatgcaagaggtggttccgttcctggcgcgtctgagcaaccgtctgagcacctgccacatcgaaggtgacgatctgcacattcagcgtaacgtgcaaaaactgaaggacaccgttaaaaagctgggcgagagcggcgaaatcaaagcgattggcgaactggatctgctgtttatgagcctgcgtaacgcgtgcatttagtaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
BBa_J23102_USP45_IL-22_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4042的相應表現匣，SEQ ID NO: 159) tctagagcttgtcgacgtctcgagttgacagctagctcagtcctaggtactgtgctagcctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcggcgccgatcagcagccactgccgtctggacaaaagcaacttccagcaaccgtatattaccaaccgtacctttatgctggcgaaagaggcgagcctggcggacaacaacaccgatgtgcgtctgatcggcgagaaactgttccacggcgttagcatgagcgaacgttgctacctgatgaagcaggtgctgaactttaccctggaggaagttctgttcccgcaaagcgatcgttttcagccgtatatgcaagaggtggttccgttcctggcgcgtctgagcaaccgtctgagcacctgccacatcgaaggtgacgatctgcacattcagcgtaacgtgcaaaaactgaaggacaccgttaaaaagctgggcgagagcggcgaaatcaaagcgattggcgaactggatctgctgtttatgagcctgcgtaacgcgtgcatttagtaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
BBa_J23108_USP45_IL-22_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4043的相應表現匣，SEQ ID NO: 160) tctagagcttgtcgacgtctcgagctgacagctagctcagtcctaggtataatgctagcctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcggcgccgatcagcagccactgccgtctggacaaaagcaacttccagcaaccgtatattaccaaccgtacctttatgctggcgaaagaggcgagcctggcggacaacaacaccgatgtgcgtctgatcggcgagaaactgttccacggcgttagcatgagcgaacgttgctacctgatgaagcaggtgctgaactttaccctggaggaagttctgttcccgcaaagcgatcgttttcagccgtatatgcaagaggtggttccgttcctggcgcgtctgagcaaccgtctgagcacctgccacatcgaaggtgacgatctgcacattcagcgtaacgtgcaaaaactgaaggacaccgttaaaaagctgggcgagagcggcgaaatcaaagcgattggcgaactggatctgctgtttatgagcctgcgtaacgcgtgcatttagtaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
BBa_J23110_USP45_IL-22_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4039、CBT4016、CBT4110和CBT4111的相應表現匣，SEQ ID NO: 161) tctagagcttgtcgacgtctcgagtttacggctagctcagtcctaggtacaatgctagcctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcggcgccgatcagcagccactgccgtctggacaaaagcaacttccagcaaccgtatattaccaaccgtacctttatgctggcgaaagaggcgagcctggcggacaacaacaccgatgtgcgtctgatcggcgagaaactgttccacggcgttagcatgagcgaacgttgctacctgatgaagcaggtgctgaactttaccctggaggaagttctgttcccgcaaagcgatcgttttcagccgtatatgcaagaggtggttccgttcctggcgcgtctgagcaaccgtctgagcacctgccacatcgaaggtgacgatctgcacattcagcgtaacgtgcaaaaactgaaggacaccgttaaaaagctgggcgagagcggcgaaatcaaagcgattggcgaactggatctgctgtttatgagcctgcgtaacgcgtgcatttagtaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
BBa_J23114_USP45_IL-22_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4040、CBT4066、CBT4069、CBT4063和CBT4067的相應表現匣，SEQ ID NO: 162) tctagagcttgtcgacgtctcgagtttatggctagctcagtcctaggtacaatgctagcctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcggcgccgatcagcagccactgccgtctggacaaaagcaacttccagcaaccgtatattaccaaccgtacctttatgctggcgaaagaggcgagcctggcggacaacaacaccgatgtgcgtctgatcggcgagaaactgttccacggcgttagcatgagcgaacgttgctacctgatgaagcaggtgctgaactttaccctggaggaagttctgttcccgcaaagcgatcgttttcagccgtatatgcaagaggtggttccgttcctggcgcgtctgagcaaccgtctgagcacctgccacatcgaaggtgacgatctgcacattcagcgtaacgtgcaaaaactgaaggacaccgttaaaaagctgggcgagagcggcgaaatcaaagcgattggcgaactggatctgctgtttatgagcctgcgtaacgcgtgcatttagtaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
PfnrS_USP45_IL-22_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4095和CBT4098的相應表現匣，SEQ ID NO: 163) Tctagagcttgtcgacgtctcgagaaaaacgccgcaaagtttgagcgaagtcaataaactctctacccattcagggcaatatctctcttctcgaggaaagaggagaaagaagcttatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcggcgccgatcagcagccactgccgtctggacaaaagcaacttccagcaaccgtatattaccaaccgtacctttatgctggcgaaagaggcgagcctggcggacaacaacaccgatgtgcgtctgatcggcgagaaactgttccacggcgttagcatgagcgaacgttgctacctgatgaagcaggtgctgaactttaccctggaggaagttctgttcccgcaaagcgatcgttttcagccgtatatgcaagaggtggttccgttcctggcgcgtctgagcaaccgtctgagcacctgccacatcgaaggtgacgatctgcacattcagcgtaacgtgcaaaaactgaaggacaccgttaaaaagctgggcgagagcggcgaaatcaaagcgattggcgaactggatctgctgtttatgagcctgcgtaacgcgtgcatttagtaacgagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag 含有不同調控元件的 IL-17A 序列例示
本申請提供的IL-17A具體表現匣的序列的例示如下所示：
Psal_USP45_IL-17A_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4114的相應表現匣，SEQ ID NO: 236) ggggcctcgcttgggttattgctggtgcccggccgggcgcaatattcatgttgatgatttattatatatcgagtggtgtatttatttatattgtttgctccgttaccgttattaacagctgtcaccggatgtgctttccggtctgatgagtccgtgaggacgaaacagcctctacaaataattttgtttaatactagagaaagaggggaaatactagatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcgggtattacaatcccgcgtaatccgggttgtccgaatagtgaagataaaaattttccgcgtacagttatggttaatctgaatattcataaccgtaacacaaacaccaatccgaaacgtagtagcgattattataatcgtagcacaagcccgtggaatctgcatcgtaacgaagatccggaacgttatccaagcgttatctgggaagcaaaatgccgccatctgggttgtatcaatgcagatggtaacgttgattatcatatgaatagcgtgccgattcagcaggaaattctggttctgcgtcgtgaaccgccgcattgtccgaatagctttcgtctggaaaaaattctggttagcgttggttgtacctgtgttaccccgattgttcatcatgttgcacatcatcatcatcatcattaagagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag 含有不同調控元件的 IL-19 序列例示
本申請提供的IL-19具體表現匣的序列的例示如下所示：
Psal_USP45_IL-19_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4114的相應表現匣，SEQ ID NO: 237) ggggcctcgcttgggttattgctggtgcccggccgggcgcaatattcatgttgatgatttattatatatcgagtggtgtatttatttatattgtttgctccgttaccgttattaacagctgtcaccggatgtgctttccggtctgatgagtccgtgaggacgaaacagcctctacaaataattttgtttaatactagagaaagaggggaaatactagatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcgctgcgtcgttgtctgattagcaccgatatgcatcatattgaagaaagctttcaggaaattaaacgtgccattcaggcaaaagatacctttccgaatgttaccattctgagcaccctggaaaccctgcagattatcaaaccactggatgtttgttgtgttaccaaaaatctgctggccttttatgttgatcgtgtttttaaagatcatcaggaaccgaatccgaaaattctgcgtaaaattagtagcattgccaatagctttctgtatatgcagaaaaccctgcgccagtgtcaggaacagcgtcagtgtcattgtcgtcaggaagcaaccaatgcaacccgtgtgattcatgataactatgatcagctggaagttcatgcagcagcgattaaaagcctgggtgaactggatgtgtttctggcatggattaataaaaatcatgaagtgatgtttagcgcacatcatcatcatcatcattaagagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag 含有不同調控元件的 IL-23 序列例示
本申請提供的IL-23具體表現匣的序列的例示如下所示：
Psal_USP45_IL-12p40_linker1_IL-23p19_rrnB_ T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4114的相應表現匣，SEQ ID NO: 238) ggggcctcgcttgggttattgctggtgcccggccgggcgcaatattcatgttgatgatttattatatatcgagtggtgtatttatttatattgtttgctccgttaccgttattaacagctgtcaccggatgtgctttccggtctgatgagtccgtgaggacgaaacagcctctacaaataattttgtttaatactagagaaagaggggaaatactagatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcgatctgggaactgaaaaaggatgtttatgtggttgaactggattggtatccggatgcaccgggcgaaatggtggttctgacgtgtgatacgccggaagaagatggtattacctggacactggatcagagcagcgaagttctgggcagtggtaaaaccctgacgattcaggttaaagaatttggtgatgcaggtcagtatacctgtcataaaggtggtgaagttctgagccattccctgctgctgctgcataaaaaggaagatggtatctggagcaccgatattctgaaagatcagaaagaaccgaaaaacaaaacctttctgcgttgcgaagcgaaaaattattcaggccgttttacctgttggtggctgacgaccattagcacagatctgacctttagcgtgaaaagcagccgtggtagcagcgatccgcagggtgttacttgtggtgcagcaacgctgtctgcagaacgtgttcgtggtgataataaagaatatgaatatagcgtggaatgccaggaagattcagcatgtccggcagcagaagaaagcctgccgattgaagtgatggttgatgcagttcataaactgaaatatgaaaactataccagcagcttttttatccgtgatattattaaaccggaccctccgaaaaatctgcagctgaaacctctgaaaaatagtcgtcaggtggaagtgtcctgggaatatccggatacctggagcaccccacatagctattttagtctgaccttttgtgttcaggttcagggcaaatcaaaacgcgaaaaaaaagatcgtgtttttaccgataaaaccagcgcaaccgttatttgtcgtaaaaatgcaagcattagcgttcgtgcacaggatcgttattatagcagcagctggagcgaatgggcaagcgttccgtgtagcggtagcaccagcggtagcggtaaaccgggtagcggtgaaggtagcaccaaaggtcgtgcagttccgggtggtagcagcccggcatggacccagtgtcagcagctgagccagaaactgtgtaccctggcatggagcgcacatccgctggttggtcatatggatctgcgtgaagaaggtgatgaagaaaccaccaatgatgttccgcatattcagtgtggtgatggttgtgatccgcagggtctgcgtgataatagccagttttgtctgcagcgtattcatcagggtctgattttttatgaaaaactgctgggtagcgatatttttaccggtgaaccgagcctgctgccggatagcccggttggtcagctgcatgcaagcctgctgggtctgagccagctgctgcagccggaaggtcatcattgggaaacccagcagattccgagcctgagcccgagccagccgtggcagcgtctgctgctgcgttttaaaattctgcgtagcctgcaggcatttgttgcagttgcagcacgtgtttttgcacatggtgcagcaaccctgagcccgcatcatcatcatcatcattaagagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag 含有不同調控元件的 IL-35 序列例示
本申請提供的IL-35具體表現匣的序列的例示如下所示：
Psal_USP45_EBI3_linker2_IL-12p35_rrnB_T1_ T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4114的相應表現匣，SEQ ID NO: 239) ggggcctcgcttgggttattgctggtgcccggccgggcgcaatattcatgttgatgatttattatatatcgagtggtgtatttatttatattgtttgctccgttaccgttattaacagctgtcaccggatgtgctttccggtctgatgagtccgtgaggacgaaacagcctctacaaataattttgtttaatactagagaaagaggggaaatactagatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcgcgcaaaggtccgccggcagcactgaccctgccgcgtgttcagtgtcgtgcatcccgctatccgattgcagttgattgtagttggaccctgccgccggcaccgaattccacctcaccggttagctttattgctacctatcgtctgggtatggccgcacgtggtcattcatggccttgtctgcagcagaccccgaccagcacgagctgtaccatcaccgatgttcagctgttttctatggcaccgtatgttctgaatgttacggcagttcatccgtggggttcaagcagctcttttgttccatttattaccgaacatatcatcaaaccggaccctccggaaggtgttcgtctgagcccgctggcagaacgtcagctgcaggttcagtgggaaccgccaggttcatggccgtttcctgaaatttttagcctgaaatattggattcgttataaacgtcagggtgcggcccgttttcatcgtgttggtcctattgaagcaacctcatttattctgcgtgcggtccgtcctcgtgcccgttattatgttcaggtcgccgcacaggatctgaccgattatggtgaactgagcgattggtcactgccggcaaccgcgaccatgtccctgggtaaaggtggcggcggtagcggcggcggtggtagtggtggcggcggctctggcggcggcggttcccgtaacctgccggttgcgaccccggaccctggcatgtttccgtgtctgcatcattctcagaatctgctgcgtgcagtctctaatatgctgcagaaagcacgtcagaccctggaattttatccgtgtaccagtgaagaaatcgatcatgaagatattaccaaagataaaaccagcaccgtggaagcatgtctgccgctggaactgaccaaaaacgaaagctgtctgaacagccgcgaaaccagttttattacaaatggtagttgtctggcaagccgcaaaaccagctttatgatggcgctgtgtctgagctcaatttatgaagatctgaaaatgtatcaggtggaatttaaaaccatgaatgccaaactgctgatggaccctaaacgtcagatttttctggatcagaatatgctggcagttatcgatgaactgatgcaggcactgaactttaatagcgaaaccgttccgcagaaaagctccctggaagaaccggatttttataaaaccaaaatcaaactgtgcatcctgctgcatgcatttcgtattcgtgcagttaccattgatcgtgtgatgagctatctgaatgcaagccatcatcatcatcatcattaagagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag 含有不同調控元件的 IL-37 序列例示
本申請提供的IL-37具體表現匣的序列的例示如下所示：
Psal_USP45_IL-37_rrnB_T1_T7Te(包含於本發明實施例菌株CBT4114的相應表現匣，SEQ ID NO: 240) ggggcctcgcttgggttattgctggtgcccggccgggcgcaatattcatgttgatgatttattatatatcgagtggtgtatttatttatattgtttgctccgttaccgttattaacagctgtcaccggatgtgctttccggtctgatgagtccgtgaggacgaaacagcctctacaaataattttgtttaatactagagaaagaggggaaatactagatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcggttcataccagtccgaaagtgaaaaatctgaatccgaaaaagtttagcatccatgatcaggatcataaagttctggtactggatagcggtaatctgattgcagtgccggataaaaattatattcgtccggaaattttttttgccctggcaagcagcctgagttcagcctcagcggaaaaaggtagcccgattctgctgggtgttagtaaaggtgaattttgtctgtattgtgataaagataaaggccagagccatccgagtctgcagctgaaaaaggaaaaactgatgaaactggcagcacagaaagaaagcgctcgtcgtccgtttattttttatcgtgcacaggtgggtagctggaatatgctggaaagcgcagcccatccaggttggtttatttgcaccagctgcaattgtaatgaaccggtgggtgttaccgataaatttgaaaatcgtaaacatatcgaatttagctttcagccggtttgtaaagcagaaatgagcccgagcgaagttagtgatcatcatcatcatcatcattaagagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag 含有不同調控元件的 TGF-β 序列例示
本申請提供的TGF-β具體表現匣的序列的例示如下所示：
Psal_sTRSV-HHRz_USP45_TGF-β_rrnB_T1_T7 Te(包含於本發明實施例菌株CBT4114的相應表現匣，SEQ ID NO:241) ggggcctcgcttgggttattgctggtgcccggccgggcgcaatattcatgttgatgatttattatatatcgagtggtgtatttatttatattgtttgctccgttaccgttattaacagctgtcaccggatgtgctttccggtctgatgagtccgtgaggacgaaacagcctctacaaataattttgtttaatactagagaaagaggggaaatactagatgaagaaaaagatcattagcgcgatcctgatgagcaccgtgattctgagcgcggcggcgccgctgagcggtgtttatgcggcactggataccaattattgtttttcaagcaccgaaaaaaattgttgtgttcgtcagctgtatattgattttcgtaaagatctgggttggaaatggattcatgaaccgaaaggttatcatgcaaatttttgtctgggtccgtgtccgtatatttggagcctggatacccagtatagcaaagttctggcactgtataatcagcataatccgggtgcaagcgcagcaccgtgttgtgttccgcaggcactggaaccgctgccgattgtttattatgttggtcgtaaaccgaaagttgaacagctgagcaatatgattgttcgtagctgtaaatgtagccatcatcatcatcatcattaagagctcgatagtgctagtgtagatcgctactagagccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttctgcgtttatatactagaagcggccgctgcag
在一些實施方式中，本申請還提供了多種經遺傳修飾的EcN菌株，其具有如下表10所示的基因型。如表10所示，每種菌株以基因型名稱來命名，其中EcN代表大腸桿菌E. Coli Nissle 1918，ΔmaeB代表所述菌株中的maeB位址進行插入，底線部分代表本申請所述的具體表現匣名稱，例如 BBa_J23101_USP45_IL-10代表該表現匣中具有BBa_J23101啟動子，其可操作地連接於USP45信號肽的編碼序列以及IL-10多肽的編碼序列。具體表現匣的核酸序列如本申請的序列號SEQ ID NO: 139到SEQ ID NO: 163所示。一些菌株還缺失了一個或多個外膜蛋白，在其基因型名稱體現為，例如ΔLPP，其代表缺失LPP外膜蛋白。一些菌株還過表現了一個或多個分子伴護蛋白，在其基因型名稱體現為，例如ΔyicS/nepI::BBa_J23114_dsbA_dsbC_dnaK_ dnaJ_grpE，其代表在yicS/nepI位址處插入了表現分子伴護蛋白_dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpE的表現匣，該表現匣中具有可操作地連接的BBa_J23114啟動子序列。本領域技術人員根據本申請的描述，結合表10中所列出的基因型名稱，能夠知道每種菌株中具有的特定遺傳修飾，並且能夠確定上述特定遺傳修飾，例如，透過對特定的插入序列或插入位址處的序列設計引子或探針，以進行檢測和鑒定。 表10 本文所述的菌株基因型
菌株 基因型
CBT4003 EcNΔmaeB:: BBa_J23101_USP45_IL-10
CBT4004 EcNΔmaeB::BBa_J23108_USP45_IL-10
CBT4005 EcNΔmaeB::BBa_J23110_USP45_IL-10
CBT4007 EcNΔmaeB::BBa_J23101_DsbA_IL-10
CBT4009 EcNΔmaeB::BBa_J23101_OmpA_IL-10
CBT4011 EcNΔmaeB::BBa_J23101_PelB_IL-10
CBT4013 EcNΔmaeB::BBa_J23101_YebF_IL-10
CBT4016 EcNΔkefB::BBa_J23110_USP45_IL-22ΔLPP
CBT4020 EcNΔmaeB::BBa_J23110_USP45_IL-10ΔLPP
CBT4026 EcNΔmaeB::BBa_J23110_T7g10_USP45_IL-10
CBT4028 EcNΔmaeB::BBa_J23110_BCD2_USP45_IL-10
CBT4029 EcNΔmaeB::BBa_J23110_GFP_USP45_IL-10
CBT4030 EcNΔmaeB::BBa_J23110_螢光素酶_USP45_IL-10
CBT4038 EcNΔmaeB::BBa_J23119_USP45_IL-22
CBT4039 EcNΔkefB::BBa_J23110_USP45_IL-22
CBT4040 EcNΔkefB::BBa_J23114_USP45_IL-22
CBT4041 EcNΔkefB::BBa_J23101_USP45_IL-22
CBT4042 EcNΔkefB::BBa_J23102_USP45_IL-22
CBT4043 EcNΔkefB::BBa_J23108_USP45_IL-22
CBT4062 EcNΔmaeB::BBa_J23110_BCD2_USP45_IL-10ΔLPPΔyicS/nepI::BBa_J23114_dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpEΔyieN::BBa_J23114_groES_groEL_tig_ fkpA_surA
CBT4063 EcNΔkefB::BBa_J23114_USP45_IL-22ΔmaeB::BBa_J23110_BCD2_USP45_IL-10ΔLPPΔyicS/nepI::BBa_J23114_dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpEΔyieN::BBa_J23114_groES_groEL_tig_ fkpA_surA
CBT4066 EcNΔkefB::BBa_J23114_USP45_IL-22ΔLPPΔyicS/nepI::BBa_J23114_dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpEΔyieN::BBa_J23114_groES_groEL_tig_ fkpA_surA
CBT4067 EcNΔmaeB::BBa_J23110_BCD2_USP45_IL-10ΔkefB::BBa_J23114_USP45_IL-22ΔagaI/rsmI::BBa_J23101_USP45_Amuc_1100ΔmalP/T::BBa_J23110_USP45_Amuc_1100ΔLPPΔyicS/nepI::BBa_J23114_dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpEΔyieN::BBa_J23114_groES_groEL_tig_ fkpA_surA
CBT4068 EcNΔmaeB::BBa_J23110_BCD2_USP45_IL-10ΔagaI/rsmI::BBa_J23101_USP45_Amuc_1100ΔmalP/T::BBa_J23110_USP45_Amuc_1100ΔLPPΔyicS/nepI::BBa_J23114_dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpEΔyieN::BBa_J23114_groES_groEL_tig_ fkpA_surA
CBT4069 EcNΔkefB::BBa_J23114_USP45_IL-22ΔagaI/rsmI::BBa_J23101_USP45_Amuc_1100ΔmalP/T::BBa_J23110_USP45_Amuc_1100ΔLPPΔyicS/nepI::BBa_J23114_ dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpEΔyieN::BBa_J23114_groES_groEL_tig_ fkpA_surA
CBT4070 EcNΔagaI/rsmI::BBa_J23101_USP45_Amuc_1100ΔmalP/T::BBa_J23110_USP45_Amuc_1100ΔLPPΔyicS/nepI::BBa_J23114_dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpEΔyieN::BBa_J23114_groES_groEL_tig_ fkpA_surA
CBT4071 EcNΔmaeB::BBa_J23110_USP45_IL-10ΔtolQ
CBT4072 EcNΔmaeB::BBa_J23110_USP45_IL-10ΔtolR
CBT4073 EcNΔmaeB::BBa_J23110_USP45_IL-10ΔtolA
CBT4074 EcNΔmaeB::BBa_J23110_USP45_IL-10Δpal
CBT4075 EcNΔmaeB::BBa_J23110_BCD2_USP45_IL-10ΔLPPΔmrcAΔyicS/nepI::BBa_J23114_dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpEΔyieN::BBa_J23114_groES_groEL_tig_ fkpA_surA
CBT4076 EcNΔmaeB::BBa_J23110_BCD2_USP45_IL-10ΔLPPΔompTΔyicS/nepI::BBa_J23114_dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpEΔyieN::BBa_J23114_groES_groEL_tig_ fkpA_surA
CBT4077 EcNΔmaeB::BBa_J23110_BCD2_USP45_IL-10ΔLPPΔompTΔmrcAΔyicS/nepI::BBa_J23114_dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpEΔyieN::BBa_J23114_groES_groEL_tig_ fkpA_surA
CBT4078 EcNΔmaeB::PfnrS_BCD2_USP45_IL-10ΔLPPΔyicS/nepI::BBa_J23114_dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpEΔyieN::BBa_J23114_groES_groEL_tig_ fkpA_surA
CBT4080 EcNΔlldD::PfnrS_USP45_Amuc_1100ΔmaeA::PfnrS_USP45_Amuc_1100ΔLPP
CBT4084 EcNΔmaeB::PfnrS_USP45_IL-10ΔyicS/nepI::BBa_J23114_dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpEΔyieN/trkD::BBa_J23114_groES_groEL_tig_ fkpA_surAΔLPPΔmrcA
CBT4088 EcNΔmaeB::PfnrS_USP45_IL-10ΔagaI/rsmI::PfnrS_USP45_Amuc_1100ΔyicS/nepI::BBa_J23114_dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpEΔyieN/trkD::BBa_J23114_groES_groEL_tig_ fkpA_surAΔLPPΔmrcA
CBT4095 EcNΔkefB::PfnrS_USP45_IL-22ΔyicS/nepI::BBa_J23114_dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpEΔyieN::BBa_J23114_groES_groEL_tig_ fkpA_surAΔLPPΔmrcA
CBT4096 EcNΔagaI/rsmI::PfnrS_USP45_Amuc_1100ΔyicS/nepI::BBa_J23114_dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpEΔyieN/trkD::BBa_J23114_groES_groEL_tig_ fkpA_surAΔLPPΔmrcA
CBT4098 EcNΔkefB::PfnrS_USP45_IL-22ΔagaI/rsmI::PfnrS_USP45_Amuc_1100ΔyicS/nepI::BBa_J23114_dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpEΔyieN/trkD::BBa_J23114_groES_groEL_tig_ fkpA_surAΔLPPΔmrcA
CBT4101 EcNΔagaI/rsmI::BBa_J23101_USP45_Amuc_1100(Y259A)
CBT4102 EcNΔagaI/rsmI::BBa_J23110_USP45_Amuc_1100(Y259A)ΔmalP/T::BBa_J23110_USP45_Amuc_1100(Y259A)
CBT4103 EcNΔagaI/rsmI::BBa_J23101_USP45_Amuc_1100(Y259A)ΔmalP/T::BBa_J23101_USP45_Amuc_1100(Y259A)ΔpflB::BBa_J23101_USP45_Amuc_1100(Y259A)
CBT4105 EcNΔagaI/rsmI::BBa_J23110_USP45_Amuc_1100ΔmalP/T::BBa_J23110_USP45_Amuc_1100ΔLPP
CBT4106 EcNΔagaI/rsmI::BBa_J23110_USP45_Amuc_1100ΔmalP/T::BBa_J23110_USP45_Amuc_1100ΔLPPΔompT
CBT4107 EcNΔagaI/rsmI::BBa_J23110_USP45_Amuc_1100(Y259A)
CBT4108 EcNΔagaI/rsmI::BBa_J23110_USP45_Amuc_1100(Y259A)ΔmalP/T::BBa_J23110_USP45_Amuc_1100(Y259A)ΔpflB::BBa_J23101_USP45_Amuc_1100(Y259A)
CBT4109 EcNΔagaI/rsmI::BBa_J23110_USP45_Amuc_1100(Y259A)ΔmalP/T::BBa_J23110_USP45_Amuc_1100(Y259A)ΔpflB::BBa_J23110_USP45_Amuc_1100(Y259A)
CBT4110 EcNΔmaeB::PfnrS_USP45_IL-10ΔkefB::BBa_J23110_USP45_IL-22ΔyicS/nepI::BBa_J23114_dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpEΔyieN/trkD::BBa_J23114_groES_groEL_tig_ fkpA_surAΔLPPΔmrcA
CBT4111 EcNΔmaeB::PfnrS_USP45_IL-10ΔkefB::BBa_J23110_USP45_IL-22ΔagaI/rsmI::PfnrS_USP45_Amuc_1100ΔyicS/nepI::BBa_J23114_ dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpEΔyieN/trkD::BBa_J23114_groES_groEL_tig_ fkpA_surAΔLPPΔmrcA
CBT4112 EcNΔmaeB::BBa_J23110_USP45_IL-10ΔpalΔmrcA
CBT4113 EcNΔmaeB::Psal-sTRSV-HHRz_USP45_IL-10_rrnB_T1_T7Te_PlacIQ_NahRAM_terΔyicS/nepI::BBa_J23114_dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpEΔyieN/trkD::BBa_J23114_groES_groEL_tig_ fkpA_surAΔLPPΔmrcA
CBT4114 EcNΔyicS/nepI::BBa_J23114_dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpEΔyieN/trkD::BBa_J23114_groES_groEL_tig_ fkpA_surAΔLPPΔmrcA
III. 組成物和套組
在另一方面，本發明提供一種組成物，其包含：(a)包含本發明的經遺傳修飾的微生物；和(b)生理學上可接受的載劑。
如本文使用的，“組成物”指本發明的遺傳工程化的細菌與其他組分諸如生理上合適的載劑的製劑。可以互換使用的表現方式“生理上可接受的載劑”指不會對生物體引起顯著刺激並且不會消除所施用的經遺傳修飾的微生物的生物學活性和特性的載劑或稀釋劑。
細菌可以約10 4到約10 13個菌落形成單位(CFU)範圍內的量存在於組成物中。舉例來說，微生物的有效量可以是約10 5CFU到約10 13CFU，優選地約10 6CFU到約10 13CFU，優選地約10 7CFU到約10 12CFU，更優選地約10 8CFU到約10 12CFU的量。微生物可以是活細胞或可以是死細胞。微生物的有效性與本文所提供的Amuc_1100、IL-10和/或IL-22的存在相關。
在一些實施方式中，本文所公開的組成物可以經配製用於口服施用，並且可以是營養或滋養組成物，例如食品、食品增補劑、飼料或飼料增補劑，如乳製品，例如發酵乳製品，如酸奶或酸奶飲料。在此情況下，組成物可包含營養學上可接受的載劑，其可為適合的食物基。所屬領域的技術人員知道可涵蓋活或死微生物體且可呈現為食品增補劑(例如，丸劑、片劑等)或功能性食品(例如飲料、發酵酸奶等)的多種配方。本文所公開的組成物還可以在膠囊、丸劑、液體溶液中配製為藥劑，例如配製為囊封的凍乾細菌等。在一些實施方式中，所述的組成物是益生菌組成物。
本文所公開的組成物可以被配製成單次施用或多次施用而對給定個體有效。舉例來說，單次施用實質上有效降低施用組成物的哺乳動物個體的標靶疾病病狀的監測症狀。
在一些實施例中，配製組成物以使得單一口服劑量含有至少或至少約1×10 4CFU的細菌實體和/或真菌實體，且單一口服劑量將通常含有約或至少1×10 4、1×10 5、1×10 6、1×10 7、1×10 8、1×10 9、1×10 10、1×10 11、1×10 12、1×10 13的細菌實體和/或真菌實體。如果已知，例如給定菌株的細胞的濃度或所有菌株的合計濃度為例如每克組成物或每施用劑量1×10 4、1×10 5、1×10 6、1×10 7、1×10 8、1×10 9、1×10 10、1×10 11、1×10 12、1×10 13個活細菌實體(例如CFU)。在一些實施方式中，所述組成物中包含1×10 8– 1×10 12CFU的本發明所述的經遺傳修飾的微生物。
在一些配方中，按質量計，組成物含有至少約0.5%、1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或大於90%本發明的微生物。在一些配方中，按質量計，所施用的劑量不超過200、300、400、500、600、700、800、900毫克或1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8或1.9克的本申請提供的微生物。
用於本文所公開的組成物的生理學上可接受的載劑可包含例如生理學上可接受的液體、凝膠或固體載劑、水性媒劑、非水性媒劑、抗微生物劑、等滲劑、緩衝劑、抗氧化劑、懸浮劑/分散劑、螯合劑(sequestering/chelating agent)、稀釋劑、佐劑、賦形劑或無毒輔助物質、所屬領域中已知的其它組分或其各種組合。在一些實施方式中，本發明所述的組成物為液態製劑、固態製劑、半固態製劑。在一些實施方式中，所述的液態製劑選自下組：溶液製品或懸浮液製品。
為了進一步說明，水性媒劑可包含如氯化鈉注射液、林格注射液、等滲右旋糖注射液、無菌水注射液或右旋糖和乳酸林格注射液；非水性媒劑可包含如植物來源的不揮發性油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油；抗微生物劑可為抑細菌或抑真菌濃度，和/或可以添加到在多劑量容器中的組成物中，所述容器包含苯酚或甲酚、汞劑、苯甲醇、氯丁醇、甲基和丙基對羥基苯甲酸酯、硫柳汞、苯紮氯銨和苄索氯銨。等滲劑可以包含如氯化鈉或右旋糖；緩衝劑可以包含如磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝劑；抗氧化劑可以包含如硫酸氫鈉；懸浮劑和分散劑可以包含如羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮；螯合劑可以包含如乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇四乙酸(EGTA)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。適合的賦形劑可包含例如水、生理鹽水、右旋糖、甘油或乙醇。適合的無毒輔助物質可包含例如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑、溶解性增強劑或如乙酸鈉、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或環糊精的試劑。
在一些實施方式中，本文所提供的組成物可為藥物組成物。在一些實施方式中，本文所提供的組成物可以是食品增補劑。本文所提供的組成物除本文所提供的經遺傳修飾的微生物之外可以包含藥學上、營養學上(nutritionally/alimentarily)或生理學上可接受的載劑。優選形式將取決於預期施用模式和(治療性)應用。載劑可以是適合於將本文提供的經遺傳修飾的微生物遞送到哺乳動物(例如人類)的胃腸道，優選地哺乳動物的腸粘膜屏障(更優選地結腸粘膜屏障)附近或內的任何相容性生理學上可接受的無毒物質。在一些實施方式中，所述藥物組成物的劑型選自下組：粉末劑、散劑、片劑、糖衣劑、膠囊劑、顆粒劑、懸浮劑、溶液劑、糖漿劑、滴劑、舌下含片、或其組合。
組成物可為液體溶液、懸浮液、乳液、丸劑、膠囊、片劑、持續釋放製劑或散劑。口服製劑可包含標準載劑，如藥物級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。在另一方面，本發明提供了一種套組，其包含本發明所述的組成物。
必要時，所述套組可進一步包含各種常規藥物套組組分中的一種或多種，例如具有一種或多種藥學上可接受的載劑的容器、額外容器等，如對所屬領域的技術人員將顯而易見。套組中還可以包含作為插頁或標籤的說明書，指示應施用的組分的量、施用指南和/或混合組分的指南。 IV. 適應症和治療方法
另一方面，本發明提供了一種治療或預防有需要的個體的發炎性疾病或自體免疫疾病的方法，所述方法包括：向所述個體施用有效量的本發明所述的經遺傳修飾的微生物，或本發明所述的組成物。在某些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物表現至少一種選自下組的外源基因：編碼表現Amuc_1100多肽的外源基因、或編碼表現IL-10多肽的外源基因、或編碼表現IL-22多肽的外源基因、或以上任意組合的外源基因。
在一方面，本發明還提供了一種在正在接受藥物治療的個體中改善藥物治療效果的方法，所述藥物包括治療發炎性疾病或自體免疫疾病的藥物，所述方法包括：向所述個體施用有效量的本發明所述的經遺傳修飾的微生物，或本發明所述的組成物。在某些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物表現至少一種選自下組的外源基因：編碼表現Amuc_1100多肽的外源基因、或編碼表現IL-10多肽的外源基因、或編碼表現IL-22多肽的外源基因、或以上任意組合的外源基因。
在本發明的另一方面，還提供了如本發明所述的經遺傳修飾的微生物或本發明組成物在用於製備治療或預防發炎性疾病或自體免疫疾病的藥物中的用途。
在一些實施方式中，所述發炎性疾病或自體免疫疾病是發炎性腸病(IBD)。在一些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物包含分別編碼Amuc_1100多肽和IL-10多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物包含分別編碼IL-10多肽和IL-22多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物包含分別編碼Amuc_1100多肽和IL-22多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述的經遺傳修飾的微生物包含編碼IL-10多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述的經遺傳修飾的微生物包含編碼Amuc_1100多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述的經遺傳修飾的微生物包含編碼IL-22多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述的經遺傳修飾的微生物包含分別編碼Amuc_1100多肽、IL-10多肽和IL-22多肽的外源基因。
在一些實施方式中，所述發炎性疾病或自體免疫疾病是系統性紅斑狼瘡(SLE)。在一些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物包含分別編碼Amuc_1100多肽和IL-10多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物包含分別編碼IL-10多肽和IL-22多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物包含分別編碼Amuc_1100多肽和IL-22多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述的經遺傳修飾的微生物包含編碼IL-10多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述的經遺傳修飾的微生物包含編碼Amuc_1100多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述的經遺傳修飾的微生物包含編碼IL-22多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述的經遺傳修飾的微生物包含分別編碼Amuc_1100多肽、IL-10多肽和IL-22多肽的外源基因。
在一些實施方式中，所述發炎性疾病或自體免疫疾病是關節炎。在一些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物包含分別編碼Amuc_1100多肽和IL-10多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物包含分別編碼IL-10多肽和IL-22多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物包含分別編碼Amuc_1100多肽和IL-22多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述的經遺傳修飾的微生物包含編碼IL-10多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述的經遺傳修飾的微生物包含編碼Amuc_1100多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述的經遺傳修飾的微生物包含編碼IL-22多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述的經遺傳修飾的微生物包含分別編碼Amuc_1100多肽、IL-10多肽和IL-22多肽的外源基因。
在一些實施方式中，所述發炎性疾病或自體免疫疾病是哮喘。在一些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物包含分別編碼Amuc_1100多肽和IL-10多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物包含分別編碼IL-10多肽和IL-22多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物包含分別編碼Amuc_1100多肽和IL-22多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述的經遺傳修飾的微生物包含編碼IL-10多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述的經遺傳修飾的微生物包含編碼Amuc_1100多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述的經遺傳修飾的微生物包含編碼IL-22多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述的經遺傳修飾的微生物包含分別編碼Amuc_1100多肽、IL-10多肽和IL-22多肽的外源基因。
在一些實施方式中，所述發炎性疾病或自體免疫疾病是移植物抗宿主病(GvHD)。在一些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物包含分別編碼Amuc_1100多肽和IL-10多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物包含分別編碼IL-10多肽和IL-22多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述經遺傳修飾的微生物包含分別編碼Amuc_1100多肽和IL-22多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述的經遺傳修飾的微生物包含編碼IL-10多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述的經遺傳修飾的微生物包含編碼Amuc_1100多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述的經遺傳修飾的微生物包含編碼IL-22多肽的外源基因。在一些實施方式中，所述的經遺傳修飾的微生物包含分別編碼Amuc_1100多肽、IL-10多肽和IL-22多肽的外源基因。
在一些實施方式中，所述的受試者具有發炎性疾病或自體免疫疾病的病症/疾病(例如，本文描述的那些)或紊亂，或者具有所述疾病/病症的誘因。其宗旨是治療、治癒、減輕、解除、改變、矯正、緩解、改善或影響疾病/病症，或引起該疾病/病症的誘因。
如本文所用，疾病、病症或病狀的“治療”包含預防或緩解疾病、病症或病狀，減緩疾病、病症或病狀的發作或發展速率，降低罹患疾病、病症或病狀的風險，預防或延緩與疾病、病症或病狀相關的症狀的發展，減少或結束與疾病、病症或病狀相關的症狀，使疾病、病症或病狀完全或部分消退，治癒疾病、病症或病狀，或其某一組合。
如本文所用，術語“有效量”是指產生所需結果所必需的一種或多種藥劑的量和/或劑量和/或劑量方案，例如足以在個體中緩和與個體正在接受療法的疾病病狀相關的一種或多種症狀的量，或足以減輕個體中疾病病狀的嚴重程度或延緩其進展的量(例如治療有效量)，足以降低個體中疾病病狀的風險或延緩其發作，和/或降低其最終嚴重程度的量(例如預防有效量)。有效量根據以下因素有所不同：被治療的病症的嚴重程度、個體患者參數、包括年齡、身體狀況、身高、性別和體重、治療的持續時間、所述並行治療的性質(如果有的話)、以及全科醫生或其他醫生的知識和經驗範圍內的其他因素。這些因素是在本領域中公知的，並且可以透過不超出常規的實驗來確定。它通常優選的以合理的醫學判斷得出的安全的、其使用的各個組分或組合的最大劑量。但是如本領域的普通技術人員可理解的，患者可能跟據醫療原因、心理原因或幾乎任何其他原因堅持要求較低劑量或可耐受的劑量。
如本文所用，術語“個體”包含人類和非人類動物。非人類動物包含所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，如非人類靈長類動物、小鼠、大鼠、貓、兔、羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬行動物。除指出的以外，術語“患者”或“個體”在本文中可互換使用。
如本文所用，術語“發炎性疾病或自體免疫疾病”包括但不限於，發炎性疾病和自體免疫疾病。所述發炎性疾病可以包括自體免疫疾病，如發炎性腸病。“發炎性腸病”或“IBD”在本文中可互換使用，指與消化道發炎相關的一類疾病，以在胃腸道中通常由T細胞和活化的巨噬細胞驅動的顯著局部發炎以及受損的上皮屏障功能為特徵(Ghishan等，2014)，包括但不限於，克隆氏病、潰瘍性結腸炎、白塞氏疾病(Behcet's disease)、淋巴細胞性結腸炎、膠原性結腸炎、轉移性結腸炎和不確定性結腸炎。
本文所述的“自體免疫疾病”還包括移植物抗宿主病(GvHD)、系統性紅斑狼瘡、關節炎(如類風濕性關節炎、骨關節炎、銀屑病性關節炎或青少年特發性關節炎)、哮喘(如過敏性哮喘或中性顆粒細胞性哮喘)。
本文所用的術語“移植物抗宿主”或“GVH”是指移植(供體)細胞對抗微生物和組織產生免疫反應。本文所用的術語“移植物抗宿主病”或“GvHD”是指一種由於由GVH所產生的移植(移植物)細胞對微生物和組織的影響所引起的非正常狀態(包括急性和慢性)。例如，從他人獲得血液或骨髓移植的患者具有患急性GvHD的風險。急性移植物抗宿主病(GvHD)是一種由供體免疫細胞引起的在移植有同種異體骨髓或血液細胞的患者中的病症。腸表皮和肝臟是經常受到影響的組織，嚴重時，GvHD可以引起皮膚起泡或過度腹瀉和消瘦。由供體免疫細胞引起的在肝臟中的發炎可以導致引起黃疸的阻塞。其它組織例如肺和胸腺也可能受到影響。對GvHD的診斷通常可以透過使用顯微鏡查看一小片皮膚、肝、胃或腸以對特定發炎特徵進行觀察來證實。
系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種具有高度異質性的自體免疫性疾病(autoimmune disease，AID)，發作和緩解貫穿其中，臨床表現複雜多樣，血清中出現以抗核抗體為代表的多種自體抗體和多系統受累是主要的臨床特徵。SLE的症狀因人而異，可能從輕到重。常見症狀包括關節疼痛和腫脹、發燒、胸痛、脫髮、口腔潰瘍、淋巴結腫大、感覺疲勞，還有一種紅疹，最常見於面部。通常會有疾病發作期和症狀較少的緩解期。SLE的病因尚不清楚。它被認為與遺傳和環境因素有關。在同卵雙胞胎中，如果一個受到影響，另一個也有24%的可能性。女性性激素、陽光、吸煙、維生素D缺乏和某些感染也被認為會增加風險。SLE的診斷具有一定的困難，目前主要是基於症狀和實驗室測試的組合來進行診斷的。
類風濕性關節炎(RA)是一種長期的自體免疫性疾病，其主要影響關節。RA通常會導致關節發熱、腫脹和疼痛，並且在休息後疼痛和僵硬往往會惡化。最常見的是手腕和手部受累，身體兩側的關節通常相同。RA也可能影響身體的其他部位，包括皮膚、眼睛、肺、心臟、神經和血液。這可能導致紅血球計數低、肺部周圍發炎和心臟周圍發炎，也可能出現發燒和低能。通常，症狀會在數周到數月內逐漸出現。雖然類風濕性關節炎的病因尚不清楚，但據信它涉及遺傳和環境因素的組合。潛在的發病機制涉及人體免疫系統攻擊關節，這導致關節囊發炎和增厚，也會影響潛在的骨骼和軟骨。RA的診斷主要基於患者的體徵和症狀。在具體的診斷中，還可能結合X光和實驗室檢查以支持診斷或排除具有類似症狀的其他疾病。
在一些實施方式中，所述的自體免疫疾病選自下組：發炎性腸病(例如克隆氏病或潰瘍性結腸炎)、移植物抗宿主病(GvHD)、系統性紅斑狼瘡、關節炎(如類風濕性關節炎、骨關節炎、銀屑病性關節炎或青少年特發性關節炎)、哮喘(如過敏性哮喘或中性顆粒細胞性哮喘)，或其組合。在一些實施方式中，其中所述自體免疫疾病包括移植物抗宿主病(GvHD)。在一些實施方式中，其中所述自體免疫疾病包括發炎性腸病(如克隆氏病或潰瘍性結腸炎)、系統性紅斑狼瘡、哮喘、多發性硬化和/或風濕性關節炎。
大約70%的人體免疫系統在胃腸道。腸道自體免疫疾病(如發炎性腸病)與非腸道自體免疫疾病(如多發性硬化症)之間存在許多相關性和共同的疾病信號，包括1)細胞激素信號改變，2)免疫細胞活性改變，3)腸道菌群失調。無論在動物模型還是人體中，腸道菌群失調都與自體免疫疾病的發病機制密切相關。例如，在類風濕性關節炎和發炎性腸病的早期階段可以發現微生物成分的變化。一些獨立的研究指出，西班牙和中國的SLE患者都存在腸道微生物群失調。腸道細菌的平衡對免疫系統的調節和發育至關重要。同時，發炎狀態下腸道屏障功能受損，促使細菌從粘膜層洩漏到血管，從而刺激局部和全身的自體免疫途徑。
腸道發炎信號途徑、先天免疫系統和適應性免疫系統中的多個標的已成為利用小分子、抗體、基因治療或腸道微生物治療方法開發新藥物的研究熱點。其中，以轉基因細菌為原料的細菌載體基因治療的潛力最近被業界所認可。然而，雖然這些經遺傳修飾的微生物已經在一些臨床前模型中顯示出功效，但尚未觀察到對患者的功效。
不希望受任何已有理論束縛，為了解決上述尚未滿足的臨床需求，本申請的發明人透過建構基因工程微生物(例如基因工程大腸桿菌EcN)作為活體藥物，在腸道施用以導入外源多肽激素或其組合，由於基因工程菌能夠在腸道內持續表現分泌外源多肽激素，就可以在一段時間內連續作用於腸道細胞，從而增強腸道屏障和/或提高腸道免疫，進而改善身體免疫疾病的症狀。如果病灶位於腸道，則本發明經遺傳修飾的微生物預期可以分佈在病灶附近，其分泌的多肽激素甚至可直接作用於病灶部位的細胞，從而發揮治療效果。而這樣的作用機制是多肽類藥物所無法達到的，這是因為：如果口服多肽類藥物，則多肽很容易在腸道內被降解從而導致療效不佳。即使透過使用更好的遞送載體能一定程度上改善口服多肽的效果，但這仍然難以滿足治療需求並且導致高成本的問題；對於血清注射的方式，患者依從性問題很嚴重，並且由於細胞激素類藥物直接進入血液循環，可能會帶來更多的副作用。
發明人首先篩選了適合微生物表現和分泌、並能夠在腸道的局部遞送中起到治療效果的外源基因組合。需要說明的是，活體藥物需要保持微生物的活力從而能夠正常生長並在體內發揮治療作用，但是微生物持續表現外源多肽，特別是兩種甚至更多種外源多肽則勢必對細胞穩定帶來一定壓力，因此這就首先要求微生物表現的外源多肽不能對微生物自身活力產生過大不利影響，否則，微生物狀態不佳將影響其表現和分泌治療性外源多肽的能力，甚至微生物可能會透過內部的壓力機制調低甚至關閉外源基因的表現，從而導致基因工程微生物建構失敗。不過，哪些外源基因適合治療性基因工程微生物的表現仍然是未知的且難以預期的，在非活體藥物領域很多看似適合在微生物中表現的外源基因，建構用於治療目的的基因工程菌時反而無法成功。發明人在篩選過程中確實發現了一些外源激素不適合利用本發明的基因工程微生物進行表現分泌，於是最終放棄(例如IL-19、IL-23、IL-37等)。發明人在確定了Amuc_1100、IL-10和/或IL-22多肽作為組合的基礎後，進一步對這些多肽的信號肽(替換了各自自身的信號肽)和表現匣中的表現調控元件(例如選擇合適的啟動子、順反子、核糖體結合位址等)以及底盤細菌的結構(選擇剔除特定的膜蛋白以提高膜的通透性)等進行了全面優化，從而使得基因工程菌能夠高效穩定的表現上述全新的外源基因組合，在多個動物疾病模型中也證實了表現外源激素組合的全部或部分基因工程菌對多種發炎性疾病或自免性疾病產生了預料不到的療效甚至表現出協同作用，具有廣闊的臨床應用前景。
提供以下實施例以更好地說明要求保護的發明，並且不應將其解釋為限制本發明的範圍。下文全部或部分描述的所有具體組成物，材料和方法均落入本發明的範圍內。這些特定的組成，材料和方法無意於限制本發明，而僅是為了說明落入本發明範圍內的特定實施例。本領域技術人員可以開發等同的組成物，材料和方法，而無需行使發明的能力並且不脫離本發明的範圍。將理解的是，可以在本文描述的過程中做出許多變化，同時仍然保持在本發明的範圍內。發明人的意圖是，這樣的變化包括在本發明的範圍內。 實施例 實施例 1 ：細菌基因組的編輯方案 1.1 sgRNA 設計
在目標整合位址序列的兩條鏈上尋找連接NGG PAM序列的20 bp序列(N20NGG)並且針對EnN基因組進行blast處理。選擇獨特的20 bp序列作為目標整合位址的sgRNA。選擇sgRNA上游和下游的300-500 bp序列作為左同源臂(LHA)和右同源臂(RHA)。 1.2 sgRNA 質體建構
將sgRNA序列添加到gRNA骨架反向引子的5’端，透過PCR擴增並用限制性內切酶PstI和SpeI進行限制酶切割，將限制酶切割後的PCR產物片段與同樣限制酶切割的質體pCBT003(SEQ ID NO：137)連接，形成pCBT003_sgRNA質體。 1.3 供體基因片段的製備
待整合到EcN基因組的外源基因由金斯瑞(GeneScript)在選殖質體(例如pUC57)上合成。外源基因以合成的質體為模板進行擴增，所選整合位址的LHA和RHA以EcN的基因組為模板擴增。用於擴增這些片段的PCR引子彼此具有15-20 bp的同源序列，因此它們可以透過重疊PCR連接起來，得到的包含LHA-外源基因-RHA的PCR產物用作供體基因片段。 實施例 2 ：質體轉化方案 2.1 EcN/pCBT001 電穿孔勝任細胞的製備
將100-200 ng pCBT001質體(表現Cas9蛋白的質體，SEQ ID NO: 136)添加到100 μL EcN電穿孔勝任細胞中，將混合物轉移到2 mm電穿孔杯中，電穿孔條件設置為2.5 kV、25 μF、200 Ω。電穿孔後將細胞懸浮於1 mL SOC，30℃下震盪(220 rpm)培養兩小時。之後將所有細胞塗布於添加有50 μg/mL觀黴素和鏈黴素的LB瓊脂板上並且在30℃下培養過夜。板上生長的菌落為具有pCBT001質體的EcN(EcN/pCBT001)。
將具有抗性的LB瓊脂板上的單一EcN/pCBT001菌落接種到3 mL添加有50 μg/mL觀黴素和鏈黴素的LB液體培養基中，在30℃下震盪(220 rpm)培養過夜，之後將300 μL此過夜培養物接種到30 mL 添加有50 μg/mL觀黴素和鏈黴素的LB液體培養基中，在30℃下在震盪(220 rpm)培養。1小時後將IPTG以1 mM的濃度添加到培養物中。當OD 600達到約0.6時，將細胞用20 mL、10 mL和5 mL 10%的甘油(4℃)洗滌3次，並且最終再懸浮於300 μL 10%甘油(4℃)中，並且以每管100 μL分裝到1.5 mL離心管中。 2.2 pCBT003-sgRNA 質體及供體基因片段的轉化
將大約2 μg含有LHA-外源基因-RHA的供體基因片段PCR產物以及100-200 ng表現整合位址的sgRNA的pCBT003_sgRNA轉化到EcN/pCBT001的電穿孔勝任細胞中。電穿孔後將細胞懸浮於1 mL SOC，30℃下震盪(220 rpm)培養兩小時。之後將所有細胞塗布於添加有50 μg/mL觀黴素、鏈黴素以及100 μg/mL胺苄青黴素的LB瓊脂板上。外源基因表現匣插入EcN基因組的示意圖如圖1所示。 實施例 3 ：去除多餘質體的方案 3.1 外源基因整合的驗證
用於驗證的引子設計在LHA的上游和RHA的下游。選取轉化板上生長的單一菌落用驗證引子進行菌落PCR，透過PCR產物的大小選擇外源基因正確整合到基因組中的選殖株。 3.2 pCBT003_sgRNA 和 pCBT001 質體的去除
將挑選出的正確選殖株接種到3mL添加有50 μg/mL觀黴素、鏈黴素和10 mM阿拉伯糖的LB液體培養基中，在30℃下震盪(220 rpm)培養過夜，隨後將培養物稀釋106倍，取100 μL塗布於添加有50 μg/mL觀黴素和鏈黴素的LB瓊脂板上，30℃下培養過夜。隨後挑選單菌落同時在添加有50 μg/mL觀黴素、鏈黴素和100 μg/mL胺苄青黴素的LB瓊脂板和添加有50 μg/mL觀黴素和鏈黴素的LB瓊脂板上點樣。僅生長在添加有50 μg/mL觀黴素和鏈黴素的LB瓊脂板上的菌落是pCBT003_sgRNA質體消除的菌落。
將pCBT003_sgRNA消除的選殖株接種在LB液體培養基中，42℃下震盪(220rpm)培養過夜，隨後將培養物稀釋10 6倍並且取100 μL塗布於LB瓊脂板上。挑選單菌落同時在LB瓊脂板和添加有50 μg/mL觀黴素和鏈黴素的LB瓊脂板上點樣。僅生長在LB瓊脂板上的菌落是pCBT001消除的菌落。 3.3 內源質體的去除3.3.1 pMUT1的消除
將表現pMUT1的sgRNA 的質體pCBT003_pMUT1_sgRNA轉化進EcN/pCBT001中。pMUT1的消除驗證引子特異性地同源於pMUT1而不與EcN的基因組同源，用pMUT1的驗證引子進行PCR，無法得到PCR產物的菌落為pMUT1消除菌落。 3.3.2 pMUT2的消除
將卡那黴素抗性基因連接到pMUT2上，得到質體pMUT2-kana，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 138所示。將質體pMUT2-kana轉化到EcNΔpMUT1中，將轉化後的細胞塗布於添加有10μg/mL卡那黴素的LB瓊脂板上，長出的菌落為含有質體pMUT2-kana的EcNΔpMUT1。EcNΔpMUT1/pMUT2-kana在添加有10μg/mL卡那黴素的LB液體培養基中傳代數次之後，提取質體，並透過電泳條帶判斷pMUT2是否全部被pMUT2-kana取代。之後將pCBT001轉入pMUT2被全部取代的EcNΔpMUT1/pMUT2-kana中，再將表現卡那黴素抗性基因sgRNA的質體pCBT003_Kana-sgRNA轉入EcNΔpMUT1/pMUT2-kana/pCBT001中。得到的菌落用與卡那黴素抗性基因特異性的引子進行PCR，無法得到PCR產物的菌落為pMUT2-kana消除菌落。
本實施例中標靶pMUT1的sgRNA的序列如SEQ ID NO: 164所示；標靶卡那黴素抗性基因的sgRNA的序列如SEQ ID NO: 165所示
標靶pMUT1的sgRNA序列(SEQ ID NO: 164)： gctgccgctattctgccgct
標靶卡那黴素抗性基因的sgRNA序列(SEQ ID NO: 165)： atgaaggagaaaactcaccg 實施例 4 ：膜蛋白的剔除方案
需要剔除的目標膜蛋白sgRNA的設計方法和sgRNA質體的建構方法同實施例1裡的1.1、1.2所述的方法。選擇目標膜蛋白編碼基因上游和下游的300-500 bp序列作為左同源臂(LHA)和右同源臂(RHA)。所選剔除位址的LHA和RHA以EcN的基因組為模板擴增。用於擴增這些片段的PCR引子彼此具有15-20 bp的同源序列，因此它們可以透過重疊PCR連接起來，得到的包含LHA-RHA的PCR產物用作供體片段。將得到的供體片段的PCR產物和表現剔除位址sgRNA的pCBT003_sgRNA質體同時轉化入含有pCBT001的勝任細胞中，得到的單菌落用剔除位址的驗證引子進行擴增，透過擴增條帶的大小篩選目標蛋白成功從基因組剔除的選殖株。
本實施例中所剔除的膜蛋白包括tolQ、tolR、tolA、pal、lpp、mrcA和ompT。tolQ剔除位址的sgRNA的序列如SEQ ID NO: 166所示，該tolQ剔除位址的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 167和168所示；tolR剔除位址的sgRNA的序列如SEQ ID NO: 169所示，該tolR剔除位址的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 170和171所示；tolA剔除位址的sgRNA的序列如SEQ ID NO: 172所示，該tolA剔除位址的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 173和174所示；pal剔除位址的sgRNA的序列如SEQ ID NO: 175所示，該pal剔除位址的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 176和177所示；lpp剔除位址的sgRNA的序列如SEQ ID NO: 178所示，該lpp剔除位址的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 179和180所示；mrcA剔除位址的sgRNA的序列如SEQ ID NO: 181所示，該mrcA剔除位址的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 182和183所示；ompT剔除位址的sgRNA的序列如SEQ ID NO: 184所示，該ompT剔除位址的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 185和186所示。
標靶tolQ位址的sgRNA序列(SEQ ID NO: 166)： gggaaacgggataatctgag
tolQ位址的左側同源臂(LHA)序列(SEQ ID NO: 167)： gtgaatacaacgctgtttcgatggccggttcgtgtctactatgaagataccgatgccggtggtgtggtgtaccacgccagttacgtcgctttttatgaaagagcacgcacagagatgctgcgtcatcatcatttcagtcaacaggcgctgatggctgaacgcgttgcctttgtggtacgtaaaatgacggtggaatattacgcacctgcgcggctcgacgatatgctcgaaatacagactgaaataacatcaatgcgtggcacctctttggttttcacgcaacgtattgtcaacgccgagaatactttgttgaatgaagcagaggttctggttgtttgcgttgacccactcaaaatgaagcctcgtgcgcttcccaagtctattgtcgcggagtttaagcagtga
tolQ位址的右側同源臂(RHA)序列(SEQ ID NO: 168)： gccatggccagagcgcgtggacgaggtcgtcgcgatctcaagtccgaaatcaacattgtaccgttgctggacgtactgctggtgctgttgctgatctttatggcgacagcgcccatcatcacccagagcgtggaggtcgatctgccagacgctactgaatcacaggcggtgagcagtaacgataatccgccagtgattgttgaagtgtctggtattggtcagtacaccgtggtggttgagaaagatcgtctggagcgtttaccaccagagcaggtggtggcggaagtgtccagccgtttcaaggccaacccgaaaacggtctttctgatcggtggcgcaaaagatgtgccttacgatgaaataattaaagcactgaacttgttacatagtgcgggtgtgaaatcggttggtttaatgacgcagcctatctaaacatctgcgtttcccttgcttgaaagagagcgggtaacaggcgaacagtttttggaaaccgaga
標靶tolR位址的sgRNA序列(SEQ ID NO: 169)： tggtattggtcagtacaccg
tolR位址的左側同源臂(LHA)序列(SEQ ID NO: 170)： gcatcgtgccaatagccatgcgccggaagccgtagtggaaggggcgtcgcgtgcgatgcgtatttccatgaatcgtgaacttgaaaatctggaaacgcacattcctttcctcggtacggttggctccatcagcccgtatattggtctgtttggtacggtctgggggatcatgcacgcctttatcgccctcggggcggtaaaacaagcaacactgcaaatggttgcgcccggtatcgcagaagcgttgattgcgacggcaattggtttgttcgccgcaattccggcggtaatggcttataaccgcctcaaccagcgcgtaaacaaactggaactgaattacgacaactttatggaagagtttaccgcgattctgcaccgccaggcgtttaccgttagcgagagcaacaaggggtaa
tolR位址的右側同源臂(RHA)序列(SEQ ID NO: 171)： acatctgcgtttcccttgcttgaaagagagcgggtaacaggcgaacagtttttggaaaccgagagtgtcaaaggcaaccgaacaaaacgacaagctcaagcgggcgataattatttcagcagtgctgcatgtcatcttatttgcggcgctgatctggagttcgttcgatgagaatatagaagcttcagccggaggcggcggtggttcgtccatcgacgctgtcatggttgattcaggtgcggtagttgaacagtacaaacgtatgcaaagccaggaatcaagcgcgaagcgttctgatgagcagcgcaagatgaaggagcagcaggctgctgaagaactgcgtgagaaacaagcggctgaacaggaacgcctgaagcaacttgagaaagagcggttagcggctcaggagcagaaaaagcaggctgaagaagccgcaaaacaggccgagttaaagcagaagcaagcggaagaggc
標靶tolA位址的sgRNA序列(SEQ ID NO: 172)： agaactgcgtgagaaacaag
tolA點的左側同源臂(LHA)序列(SEQ ID NO: 173)： gccatggccagagcgcgtggacgaggtcgtcgcgatctcaagtccgaaatcaacattgtaccgttgctggacgtactgctggtgctgttgctgatctttatggcgacagcgcccatcatcacccagagcgtggaggtcgatctgccagacgctactgaatcacaggcggtgagcagtaacgataatccgccagtgattgttgaagtgtctggtattggtcagtacaccgtggtggttgagaaagatcgtctggagcgtttaccaccagagcaggtggtggcggaagtgtccagccgtttcaaggccaacccgaaaacggtctttctgatcggtggcgcaaaagatgtgccttacgatgaaataattaaagcactgaacttgttacatagtgcgggtgtgaaatcggttggtttaatgacgcagcctatctaaacatctgcgtttcccttgcttgaaagagagcgggtaacaggcgaacagtttttggaaaccgaga
tolA位址的右側同源臂(RHA)序列(SEQ ID NO: 174)： tcgcgatgttgactgttccgacggtcaacatcaggcaccggttgccacggggttctggtagttttgtgtattttagtttgttaacattctgctaaattatcgtgggccatcggtccagataagggagatatgatgaagcaggcattacgagtagcatttggttttctcatactgtgggcatcagttctgcatgctgaagtccgcattgtgatcgacagcggtgtagattccggtcgtcctattggtgttgttcctttccagtgggcggggcctggtgcggcacctgaagatattggcggcatcgttgctgctgacttgcgtaacagcggtaaatttaatccgttagatcgtgctcgtttgccacagcagccgggtagtgcgcaggaagtacaaccagctgcatggtccgcgctgggcattgacgctgtggttgtcggtcaggtcactccgaatccggatggttcttacaatgttgcttatcaacttgttgacactggcgg
標靶pal位址的sgRNA序列(SEQ ID NO: 175)： agtcaccgtagaaggtcacg
pal位址的左側同源臂(LHA)序列(SEQ ID NO: 176)： tggtcgcagtaacaataccgaaccgacctggttcccggacagccagaacctggcatttacttctgaccaggccggtcgtccgcaggtttataaagtgaatatcaacggcggtgcgccacaacgtattacctgggaaggttcgcagaaccaggatgcggatgtcagcagcgacggtaaatttatggtaatggtcagctccaacggtgggcagcagcacattgccaaacaagatctggcaacgggaggcgtacaagttctgtcgtccacgttcctggatgaaacgccaagtctggcacctaacggcactatggtaatctacagctcttctcaggggatgggatccgtgctgaatttggtttctacagatgggcgtttcaaagcgcgtcttccggcaactgatggacaggtcaaattccctgcctggtcgccgtatctgtgataataattaattgaatagtaaaggaatcattgaa
pal位址的右側同源臂(RHA)序列(SEQ ID NO: 177)： gagaattgcatgagcagtaacttcagacatcaactattgagtctgtcgttactggttggtatagcggccccctgggccgcttttgctcaggcaccaatcagtagtgtcggctcaggctcggtcgaagaccgcgtcactcaacttgagcgtatttctaatgctcacagccagcttttaacccaactccagcaacaactctctgataatcaatccgatattgattccctgcgtggtcagattcaggaaaatcagtatcaactgaatcaggtcgtggagcggcaaaagcagatcctgttgcagatcgacagcctcagcagcggtggtgcagcggcgcaatcaaccagcggcgatcaaagcggtgtggcggcatcaacgacgccgacagctgatgctggtactgcgaatgctggcgcgccggtgaaaagcggtgatgcaaacacggattacaatgcagctattgcgctggtgcag
標靶lpp位址的sgRNA序列(SEQ ID NO: 178)： acgttcaggctgctaaagat
lpp位址的左側同源臂(LHA)序列(SEQ ID NO: 179)： aatacttcccggatgccaccatcctggcactgaccaccaacgaaaaaacggctcaccagttagtactgagcaaaggtgttgtgccgcagctggttaaagagatcacatctactgatgacttctaccgtctgggtaaagaactggctctgcagagcggtctggcacacaaaggtgatgtcgtagttatggtttctggtgcactggtaccgagcggcactactaacaccgcatctgttcacgtcctgtaatattgcttttgtgaattaatttgtatatcgaagcgccctgatgggcgctttttttatttaatcgataaccagaagcaataaaaaatcaaatcggatttcactatataatctcactttatctaagatgaatccgatggaagcatcctgttttctctcaatttttttatctaaaacccagcgttcgatgcttctttgagcgaacgatcaaaaataagtgccttcccatcaaaaaaa
lpp位址的右側同源臂(RHA)序列(SEQ ID NO: 180)： cctgtgaagtgaaaaatggcgcacattgtgcgccatttttttgcctgctatttaccgctactgcgtcgcgcgtaacatattcccttgctctggttccccattctgcgctgactctactgaaggcgcattgctggctgcgggagttgctccactgctcaccgcaaccggataccctgcccgacgatacaacgctttatcgactaacttctgatctacagccttattgtctttaaattgcgtaaagcctgctggcagcgtgtacggcattgtctgaacgttctgctgttcttctgccgatagtggtcgatgtacttcaacataacgcatcccgttaggttccacggaatatttcaccggttcgttgatcactttcaccggtgttcccgtccgcacgctggagaataaagctttaatatccggtgcattcatgcgaataca
標靶mrcA位址的sgRNA序列(SEQ ID NO: 181)： caaaccgttcctctacaccg
mrcA位址的左側同源臂(LHA)序列(SEQ ID NO: 182)： gacagccaggccatttgctcccgctcaccgagggacatcgacgggcgtggaaatgaccgctgtaatgtgcgactggcgggaaacgccaacataatgtgatgacgctgcggcagttcacgactccacggtaacaacgtgttagccagccgctgcacatcaacaatccgcccatctttgataatgtcgttctccagtggcaaccgccaccagcggtgcaataagcattcttttgcgctccgcacgatagcaaccgctaccgcttcttgctgttgtaaatgcaaaccaatttgccagttcttaaatgccattgtgatgatctccttatcacccgtcactctgacgggtatatcaatgcgtctggcttgcctttatactaccgcgcgtttgtttataaactgcccaaatgaaactaaatgg
mrcA位址的右側同源臂(RHA)序列(SEQ ID NO: 183)： ttaaaaaggcgcttcggcgcctttttcagtttgctgacaaagtgcacttgtttatgccagatgcgggtgaacgcgttatccggccaacaaaaaattgaaaattcaataaattgcaggaacttcgtaagcctgataagcgttgtgcatcaggcaaacttcacgcatttacactcgcccctgccctttcaaccattcgcgcacgaggaacagcgcgctgacattacgcgcttcgttgaagtcaggggcttccagcaaatccatcatatgcgccagcggccagcgcacctgtggtagcggctctggctcatcgccttccagtgattccgggtagagatcttgcgctaccacgatattcattttgctggaaaagtaagacggtgccatgctgagcttcttcaaaaaagtcagatcgttcgcaccaaatccaacctcttcttttagctcgcggttagcggcttca
標靶ompT位址的sgRNA序列(SEQ ID NO: 184)： cctgggactcatggccggat
ompT位址的左側同源臂(LHA)序列(SEQ ID NO: 185)： cccagcccttgtcgatgccgcgttcaggctagcttcgttcaaatccattaaagatatcagactactctcaggtacgtgagtaaggtaaaacccagttccaacgccaatatccagatggttgttacctaaatgttccagaaagtgtggaagaaggtgttcctttgtaggacatccccatgcaagccgatttgatactcccaaaacccaccagtcataaagctttagggtaagtggtgtgtaaattttagccccatcatctgtgttttttttcattagtttcaccgtgttatagttttatttgtgaattaaatcaattatagagatgaattacaaggggttaaatgatgccacggcataacgaatttgaatatattgggtcttgtgttgcggtaagaggttacacgccaggacgcaggttaaatgcttacaatattaggggatattgtttgcttttaacggtaaacaaattccccggggctatacaataccaccggggagaaaatctatttaacgttg
ompT位址的右側同源臂(RHA)序列(SEQ ID NO: 186)： aaaaggtctccattcaatcgttttaatgattgagtatgtattttttatatctaacttaatgagtcaattgtatattgccccactgtttatattttgtttaacattgaatttttgtcacaatgcgctgtcagttttttagtttaattgtctgtttgtgttttgtattgtggttttatgggctaattatttttttctttgtggagtttttatctattcaagtgccatgcctttagatgcatattagcgataatagcatgaggtttatcctcaattgctgtgttttttagtataaaaaagaggaacaaaactgagacacataaggcctcgcaatggcttgcaaggttttacatattttgaggtggtggaacgtgtgaacgcagagatggcgcggtaatttgttgatttaaaatgtcgttcttggagtttctaagtcgtgggctacaggttcgaatcctgcagggcgagccatttcctcgccatttatttgttcccttttacaaattacaccatcactttgttgtcgcggttttgctaaataattggaacacgtcagacgaataaaatgaaaacagaaattctgctaaacaattcatcttgccaggattttgattaggaaagtgaaa 實施例 5 ：過表現分子伴護蛋白的方案 5.1 分子伴護蛋白的選擇
利用質體在基因工程菌CBT4020中表現不同分子伴護蛋白組合，基因工程菌在LB中培養24小時後表現的IL-10在培養基上清液及胞內的產量如表11所示。結果顯示，可以透過表現分子伴護蛋白提高IL-10的產量，同時表現分子伴護蛋白dsbA、dsbC、dnaK、dnaJ、grpE、groES、groEL、tig、fkpA、surA的效果最好。 表11 不同分子伴護蛋白組合及IL-10的產量
過表現分子伴護蛋白 IL-10產量 (ng/mL/OD 600)
上清液 胞內
dnaK、dnaJ、grpE 24.92±0.75 8.39±1.86
groES、groEL 21.93±1.72 7.13±0.08
tig 23.26±1.01 8.3±2.46
dsbA、dsbC、fkpA、surA 19±1.88 7.41±1.93
dsbA、dsbC、dnaK、dnaJ、grpE、groES、groEL、tig、fkpA、surA 28.97±4.75 17.04±1.02
無 14.88±0.21 6.52±0.06
5.2 分子伴護蛋白質體的建構5.2.1 質體pCBT012的建構
啟動子BBa_J23114、核糖體結合位址(RBS)以合成質體為模板進行擴增，groES、groEL、tig編碼序列以質體pG-TF2為模板進行擴增，fkpA、surA編碼序列以及插入位址yieN的LHA和RHA以EcN的基因組為模板擴增，轉錄終止子以質體pCBT003為模板擴增，標靶yieN位址的sgRNA表現序列以sgRNA表現質體pCBT003_yieN_sgRNA為模板擴增。用於擴增這些片段的PCR引子彼此具有15-20 bp的同源序列，因此它們可以透過重疊PCR連接起，得到兩側分別與LHA和RHA-yieN_sgRNA序列連接的供體基因片段表現匣，分子伴護蛋白表現匣上各元件從5’到3’按如下順序排列：5’-啟動子-核糖體結合位址(RBS)-groES-groEL-tig-fkpA-surA編碼序列-終止子。pCBT012質體骨架以質體pCBT010為模板進行擴增，用於擴增pCBT012質體骨架的PCR引子與分子伴護蛋白表現匣具有15-20 bp的同源序列，因此可以使用套組ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit (Vazyme)與分子伴護蛋白表現匣連接起來，形成質體pCBT012(SEQ ID NO: 215)。
質體pCBT010序列(SEQ ID NO: 187)： gaattccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaacttgtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctggttataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttctttacgatgccattgggatatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcctgaaaatctcgataactcaaaaaatacgcccggtagtgatcttatttcattatggtgaaagttggaacctcttacgtgccgatcaacgtctcattttcgccaaaagttggcccagggcttcccggtatcaacagggacaccaggatttatttattctgcgaagtgatcttccgtcacaggtatttattcgggatcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccactggtaattgatttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatctgtaggtcgttcgctccaagctggaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagaatttctgccattcatccgcttattatcacttattcaggcgtagcaaccaggcgtttaagggcaccaataactgccttaaaaaaattacgccccgccctgccactcatcgcagtactgttgtaattcattaagcattctgccgacatggaagccatcacaaacggcatgatgaacctgaatcgccagcggcatcagcaccttgtcgccttgcgtataatatttgcccatggtgaaaacgggggcgaagaagttgtccatattggccacgtttaaatcaaaactggtgaaactcacccagggattggctgagacgaaaaacatattctcaataaaccctttagggaaataggccaggttttcaccgtaacacgccacatcttgcgaatatatgtgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtattcactccagagcgatgaaaacgtttcagtttgctcatggaaaacggtgtaacaagggtgaacactatcccatatcaccagctcaccgtctttcattgccatacg 5.2.2 質體pCBT013的建構
啟動子BBa_J23114、核糖體結合位址(RBS)以合成質體為模板進行擴增，dnaK、dnaJ、grpE編碼序列以質體pKJE7為模板進行擴增，dsbA、dsbC編碼序列以及插入位址yicS/nepI的LHA和RHA以EcN的基因組為模板擴增，轉錄終止子以質體pCBT003為模板擴增，標靶yicS/nepI位址的sgRNA表現序列以sgRNA表現質體pCBT003_yicS/nepI_sgRNA為模板擴增。用於擴增這些片段的PCR引子彼此具有15-20 bp的同源序列，因此它們可以透過重疊PCR連接起，得到兩側分別與LHA和RHA-yicS/nepI_sgRNA序列連接的供體基因片段表現匣，分子伴護蛋白表現匣上各元件從5’到3’按如下順序排列：5’-啟動子-核糖體結合位址(RBS)-dsbA-dsbC-dnaK-dnaJ-grpE編碼序列-終止子。pCBT013質體骨架以質體pCBT010為模板進行擴增，用於擴增pCBT013質體骨架的PCR引子與分子伴護蛋白表現匣具有15-20 bp的同源序列，因此可以使用套組ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit (Vazyme)與分子伴護蛋白表現匣連接起來，形成質體pCBT013(SEQ ID NO: 216)。 5.3 分子伴護蛋白的基因組整合
將表現分子伴護蛋白的質體pCBT012、pCBT013分別轉化入含有pCBT001的勝任細胞中，得到的單菌落用插入位址的驗證引子進行擴增，透過擴增條帶的大小篩選分子伴護蛋白表現匣成功插入基因組的選殖株。各個分子伴護蛋白的序列登錄號如表12所示。 表12 分子伴護蛋白
分子伴護蛋白 Uniprot ID
dsbA P0AEG4
dsbC P0AEG6
dnaK P0A6Y8
dnaJ P08622
grpE P09372
groES P0A6F9
groEL P0A6F5
tig P0A850
fkpA P45523
surA P0ABZ6
標靶yieN插入位址的sgRNA的序列如SEQ ID NO: 188所示，該yieN插入位址的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 189和190所示。標靶yicS/nepI插入位址的sgRNA的序列如SEQ ID NO: 191所示，該yicS/nepI插入位址的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 192和193所示。
標靶yieN位址的sgRNA序列(SEQ ID NO: 188)： gagggtgagccataatgaag
yieN位址的左側同源臂(LHA)序列(SEQ ID NO: 189)： tccgagacataaggcgcatccggtaatttatccagttgctggcgcagcataaaaatcagctcaaatacatgatcgggcagcgtaatttcaccaatctctttctgccagcgttcatattcttcatctgtgatctgcaaggaggcaggaaccggattgtcattttcatcctgttgactggtcagcatggagcggaaattcgctttatcctgcactttatctaaccacagacgaatcagcatgcgatcatataacgcttccagactgctgtctgcttccggcagctcgttggaggccgccaccagcagacgcatcgggattttttctacgagtgcgccgttgcggaactggcgctcgttaatggcggtgagcagggtattaagaattgccggacccgctttccagatctcatccagaaagacgatttcagcttccggcaggtaaccgctggttaaacgttcatagcgcccttcatcttttagcgcctgaatagaaaggggaccaaaaacttcttccggcgtggagaagcgggtcatcagatattcaaacgcgcggg
yieN位址的右側同源臂(RHA)序列(SEQ ID NO: 190)： aatgtggccgcatttaggagtacgattttgccgttaatcgtgcatactgtgcgcttttttgtgggccaagggactaagcacacatttcatatttcaacgaaagactagtctatgagcactgataataagcaatcattgcccgcgattaccctcgcggcgattggagttgtctacggcgatattggtaccagcccgttatatacacttcgtgaatgtttgtccggccagtttggttttggcgttgaacgcgatgccgtgtttggctttttatcgctgatcttctggctgctaatctttgtggtttccattaaatatctcaccttcgtgatgcgggcagata
標靶yicS/nepI位址的sgRNA序列(SEQ ID NO: 191)： ctgaccaacgcttctttacc
yicS/NepI位址的左側同源臂(LHA)序列(SEQ ID NO: 192)： aacgaaacgctatcgataagaataaaaaggaataaaagtggaatataaagtctggcacttcttactgaccacgcaaacacctttcgtacagcatgatgagagcggcaaaagcaaactacacttatgcttcattcgatgcacatttgcagaaggttgccgctatgaagccaacgatgctactcatgattaccgtattcctgatttttccagccatttctcaggccgagtcgccattcagttctctacagtcggcaaaagagaaaaccacggtattgcaagatttacgtaaaatttgcacgccacaggcgtcattatcagatgaagcgtgggaaaagttaatgttgtcagatgaaaacaataaacaacatatacgcgaggccatcgtggcgatggaacgtaataatcagagcaattattgggaagcgttgggtaaggtagaatgcccggatatgtaagaacggcaacaaccactg
yicS/NepI位址的右側同源臂(RHA)序列(SEQ ID NO: 193)： accaacgcttctttacctgatatcaggatttcttcattttcacctttgcagtcaccaacaatgcagtcagcaacatcaatgtgccggacaacatcagcggcgaagtcagaccaatgttatccaacgcataaccgccgattgccgcaccgcaggtgttagcaagctgaataacggccacctgaatagatccagccttttctgcctgatcggccaatgagcgagtgatccacgttgaccaaccaacgggaattaaagcaaaggtcagcccccagataatcgcaacaccagtagcaacaattttatagcttccccacagcgtcagtaccagcgcgctcagggcgagcacaaacggtgcgcccgctaaggccagtttcaccgaacgtttgagaataaacgacgaaagcgatgtcccgacaaagctggcgataccaaaactcagcagcaccagggttaagccatcaaca 實施例 6 ：菌株的建構 6.1 表現 IL-10 的菌株建構 6.1.1 IL-10 供體基因片段表現匣的建構步驟
IL-10 編碼序列、信號肽、啟動子、核糖體結合位址(RBS)以及順反子等由金斯瑞(GeneScript)在選殖質體(例如pUC57)上合成。IL-10編碼序列、信號肽、啟動子、核糖體結合位址(RBS)以及順反子等以合成質體為模板進行擴增，插入位址的LHA和RHA以EcN的基因組為模板擴增，轉錄終止子以質體pCBT003為模板擴增。用於擴增這些片段的PCR引子彼此具有15-20 bp的同源序列，因此它們可以透過重疊PCR連接起，得到兩側分別與LHA和RHA序列連接的供體基因片段表現匣，表現匣上各元件從5’到3’按如下順序排列：5’-啟動子-核糖體結合位址(RBS)-順反子-信號肽-IL-10編碼序列-終止子(所建構的各供體基因片段表現匣的序列結構如SEQ ID NO: 144-156、235所示)。將得到的兩側帶有LHA和RHA序列的供體基因片段表現匣的PCR產物和表現sgRNA的pCBT003_maeB_sgRNA質體同時轉化入含有pCBT001的勝任細胞中，得到的單菌落用插入位址的驗證引子進行擴增，透過擴增條帶的大小篩選IL-10成功插入基因組的選殖株。IL-10的產量用ELISA套組(義翹神州，KIT10947A)檢測。
本實施例中的IL-10編碼序列均為編碼野生型人IL-10(SEQ ID NO: 11)的序列；所插入的位址為EcN基因組的maeB，標靶maeB位址的sgRNA的序列如SEQ ID NO: 194所示，該maeB位址的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 195和196所示。
標靶maeB位址的sgRNA序列(SEQ ID NO: 194)： gaaggggaagaggcgcgcgt
maeB位址的左側同源臂(LHA)序列(SEQ ID NO: 195)： gtggtggatgacggtaaacgtaccctcgatgatgtgattgaaggcgcggatattttcctcggctgttccggcccgaaagtgctgacccaggaaatggtgaagaaaatggcccgtgcgccaatgatcctggcgctggcgaacccggaaccggaaattctgccgccgctggcgaaagaagtgcgtccggatgccatcatctgtaccggccgttccgactacccgaaccaggtgaacaacgtcctttgcttcccgtttatcttccgtggcgcgctggacgttggcgcaaccgccatcaacgaagagatgaaactggcggcagtacgcgcgattgcagaactggcccatgcggaacagagtgaagtggtggcttcagcgtatggcgatcaggatctgagctttggtccggaatacatcattcc
maeB位址的右側同源臂(RHA)序列(SEQ ID NO: 196)： gcgaaaccgatccttattggtcgtccgaacgtgatcgaaatgcgcattcagaaactgggcttgcagatcaagtcgggcgttgattttgagatcgtcaataacgaatccgatccgcgctttaaagagtactggaccgaatacttccagatcatgaagcgtcgcggtgtcactcaggagcaggcgcagcgtgcgctgatcagtaacccgacagtgatcggcgcgatcatggttcagcgtggcgaagccgatgcaatgatttgcggtacggtgggcgattatcatgaacactttagcgtggtgaaaaatgtctttggttatcgcgatggcgttcacaccgcaggtgcaat
本實施例中所得到的各表現IL-10的菌株及其中的插入元件和剔除元件資訊如下表13所示。相關元件的序列如表2-表9的序列所示。 表13 IL-10表現菌株的各元件資訊
菌株名稱 啟動子 RBS 順反子 信號肽 終止子 剔除蛋白 是否過表現分子伴護蛋白 表現匣序列SEQ ID NO
CBT4007 BBa_J23101 合成型 無 DsbA rrnB_T1_T7Te_終止子 無 否 147
CBT4009 BBa_J23101 合成型 無 OmpA rrnB_T1_T7Te_終止子 無 否 148
CBT4011 BBa_J23101 合成型 無 PelB rrnB_T1_T7Te_終止子 無 否 149
CBT4013 BBa_J23101 合成型 無 YebF rrnB_T1_T7Te_終止子 無 否 150
CBT4003 BBa_J23101 合成型 無 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 無 否 144
CBT4004 BBa_J23108 合成型 無 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 無 否 146
CBT4005 BBa_J23110 合成型 無 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 無 否 145
CBT4026 BBa_J23110 合成型 T7g10 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 無 否 151
CBT4028 BBa_J23110 合成型 BCD2 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 無 否 152
CBT4029 BBa_J23110 合成型 GFP USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 無 否 153
CBT4030 BBa_J23110 合成型 螢光素酶 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 無 否 154
CBT4071 BBa_J23110 合成型 無 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 tolQ 否 145
CBT4072 BBa_J23110 合成型 無 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 tolR 否 145
CBT4073 BBa_J23110 合成型 無 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 tolA 否 145
CBT4074 BBa_J23110 合成型 無 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 pal 否 145
CBT4112 BBa_J23110 合成型 無 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 pal、mrcA 否 145
CBT4020 BBa_J23110 合成型 無 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 LPP 否 145
CBT4062 BBa_J23110 合成型 BCD2 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 LPP 是 152
CBT4075 BBa_J23110 合成型 BCD2 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 LPP、mrcA 是 145
CBT4076 BBa_J23110 合成型 BCD2 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 LPP、ompT 是 145
CBT4077 BBa_J23110 合成型 BCD2 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 LPP、ompT、mrcA 是 145
CBT4078 PfnrS 合成型 BCD2 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 LPP 是 155
6.1.2 IL-10 表現條件的優化
使用不同信號肽的基因工程菌在LB中培養24小時後表現的IL-10在培養基上清液及胞內的產量如表14所示。其中，菌株CBT4007中使用了dsbA信號肽；菌株CBT4009中使用了ompA信號肽；菌株CBT4011中使用了pelB信號肽；菌株CBT4013中使用了yebF信號肽，菌株CBT4003中使用了USP45信號肽。在同樣的稀釋度下，使用OmpA、PelB、YebF信號肽的基因工程菌樣品中IL-10的濃度低於檢測下線，使用USP45信號肽時，IL-10的產量顯著高於DsbA信號肽。 表14 使用不同信號肽的基因工程菌基因型及IL-10的產量
菌株 表現匣中的信號肽 IL-10產量 (ng/mL)
上清液 胞內
CBT4007 DsbA 1.02±0.73 1.23±0.05
CBT4009 OmpA -* -
CBT4011 PelB - -
CBT4013 YebF - -
CBT4003 USP45 6.15±4.12 4.47±3.39
*：“-”表示低於檢測下限
使用不同啟動子的基因工程菌在LB中培養24小時後表現的IL-10在培養基上清液及胞內的產量如表15所示。其中，菌株CBT4003中使用BBa_J23101啟動子；菌株CBT4004中使用BBa_J23108啟動子；菌株CBT4005中使用BBa_J23110啟動子。結果顯示，可以透過選用合適的啟動子(例如BBa_J23101啟動子)來調節IL-10的產量。 表15 使用不同啟動子的基因工程菌基因型及IL-10的產量
菌株 表現匣中的啟動子 IL-10產量 (ng/mL)
上清液 胞內
CBT4003 J23101 15.92±5.75 49.56±3.42
CBT4004 J23108 3.64±0.54 29.03±7.31
CBT4005 J23110 6.99±1.49 35.39±1.15
使用不同順反子的基因工程菌在LB中培養24小時後表現的IL-10在培養基上清液中的產量如表16所示。其中，菌株CBT4026中使用順反子T7g10；菌株CBT4028中使用順反子BCD2；菌株CBT4029中使用順反子GFP；菌株CBT4030中使用順反子Lucifierase(螢光素酶)。結果顯示，可以透過選擇不同的順反子來調節IL-10的產量。 表16 使用不同順反子的基因工程菌基因型及IL-10的產量
菌株 表現匣中的順反子 IL-10產量 (ng/mL)
CBT4005 無 3.07±0.49
CBT4026 T7g10 3.35±2.3
CBT4028 BCD2 6.58±2.12
CBT4029 GFP 1.77±0.12
CBT4030 螢光素酶 1.26±0.39
剔除不同膜蛋白的基因工程菌以及過表現分子伴護蛋白的基因工程菌在LB中培養12小時後表現的IL-10在培養基上清液及胞內的產量如表17所示。其中，菌株CBT4071、CBT4072、CBT4073、CBT4074、CBT4020分別剔除了膜蛋白tolQ、tolR、tolA、pal和lpp，對照為未改造外膜的菌株CBT4005。結果顯示，單獨剔除tolQ、tolR、tolA、pal和lpp可以顯著提高IL-10的產量與分泌效率。
CBT4062 為剔除膜蛋白lpp並過表現分子伴護蛋白的基因工程菌株。分子伴護蛋白的過表現透過在菌株yicS/nepI位址插入BBa_J23114啟動子啟動的dsbA、dsbC、dnaK、dnaJ、和grpE，和在yieN位址插入BBa_J23114啟動子啟動的groES、groEL、tig、fkpA和surA，各個分子伴護蛋白的序列登錄號如表12所示。與只剔除lpp但不過表現分子伴護蛋白的對照菌株CBT4028比，CBT4062中分子伴護蛋白的過表現可以顯著提高IL-10的產量。CBT4075為同時剔除lpp和mrcA並過表現分子伴護蛋白的基因工程菌株，CBT4076為同時剔除lpp和ompT並過表現分子伴護蛋白的基因工程菌株，與單獨剔除lpp並過表現分子伴護蛋白的CBT4062相比，lpp與mrcA或ompT的組合剔除進一步顯著提高了IL-10的產量與分泌位準。而lpp、mrcA、ompT三個膜蛋白同時剔除並過表現分子伴護蛋白的菌株CBT4077並沒有顯示出更高的IL-10產量。CBT4112為同時剔除pal和mrcA的基因工程菌株，與只剔除pal的CBT4074相比，IL-10的產量沒有顯著變化。因此，mrcA只有在和lpp組合剔除時才能提高蛋白的分泌效率。 表17 剔除不同膜蛋白的基因工程菌以及過表現分子伴護蛋白的基因工程菌基因型及IL-10的產量
菌株 順反子 剔除的外膜蛋白 過表現分子伴護蛋白 IL-10產量 (ng/mL)
上清液 胞內
CBT4005 無 無 否 4.23±0.09 12.06±2.37
CBT4071 無 tolQ 否 38.39±2.14 9.73±2.9
CBT4072 無 tolR 否 44.3±13.36 13.02±11.03
CBT4073 無 tolA 否 34.19±0.82 1.75±0.14
CBT4074 無 pal 否 38.1±1.98 50.32±1.28
CBT4112 無 pal、mrcA 否 41.69±12.07 49.35±5.73
CBT4020 無 LPP 否 50.18±1.29 171.1±4.46
CBT4028 BCD2 LPP 否 69.35±11.87 121.53±21.11
CBT4062 BCD2 LPP 是 97.71±0.36 106.9±11.55
CBT4075 BCD2 LPP、mrcA 是 177.21±52.8 163.4±11.66
CBT4076 BCD2 LPP、ompT 是 160.85±4.75 179.87±14.95
CBT4077 BCD2 LPP、ompT、mrcA 是 123.38±95.77 105.93±49.23
針對使用厭氧啟動子的菌株CBT4078(EcNΔmaeB::PfnrS_BCD2_USP45_IL-10ΔLPPΔyic S/nepI::BBa_J23114_dsbA_dsbC_dnaK_dnaJ_grpEΔyieN::BBa_J23114_groES_groEL_tig_ fkpA_surA)，對有氧和厭氧條件下在LB(磷酸鹽檸檬酸緩衝體系調pH=8.0)+1% w/v葡萄糖培養基中的IL-10表現量進行了比較，結果如圖2所示。結果顯示，使用厭氧啟動子時，厭氧培養得到的IL-10產量顯著高於有氧培養。 6.2 表現 IL-22 的菌株建構 6.2.1 IL-22 供體基因片段表現匣的建構步驟
IL-22編碼序列、信號肽、啟動子、核糖體結合位址(RBS)以及順反子等由金斯瑞(GeneScript)在選殖質體(例如pUC57)上合成。IL-22編碼序列、信號肽、啟動子、核糖體結合位址(RBS)以及順反子等以合成質體為模板進行擴增，插入位址的LHA和RHA以EcN的基因組為模板擴增，轉錄終止子以質體pCBT003為模板擴增。用於擴增這些片段的PCR引子彼此具有15-20 bp的同源序列，因此它們可以透過重疊PCR連接起，得到兩側分別與LHA和RHA序列連接的供體基因片段表現匣，表現匣上各元件從5’到3’按如下順序排列：5’-啟動子-核糖體結合位址(RBS)-順反子-信號肽-IL-22編碼序列-終止子(所建構的各供體基因片段表現匣的序列結構如SEQ ID NO: 157-163所示)。將得到的兩側帶有LHA和RHA序列的供體基因片段表現匣的PCR產物和表現sgRNA的pCBT003_kefB_sgRNA質體或pCBT003_maeB_sgRNA質體同時轉化入含有pCBT001的勝任細胞中，得到的單菌落用插入位址的驗證引子進行擴增，透過擴增條帶的大小篩選IL-22成功插入基因組的選殖株。IL-22的產量用ELISA套組(義翹神州，KIT13059)檢測。
本實施例中的IL-22編碼序列均為編碼野生型人IL-22(SEQ ID NO: 15)的序列；所插入的位址EcN基因組的位址maeB(CBT4038)或位址kefB(CBT4041、CBT4042、CBT4043、CBT4039、CBT4040、CBT4016)。標靶maeB位址的sgRNA的序列如SEQ ID NO: 194所示，該maeB位址的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 195和196所示。標靶kefB位址的sgRNA的序列如SEQ ID NO: 197所示，該kefB位址的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 198和199所示。
標靶kefB位址的sgRNA序列(SEQ ID NO: 197)： gccggaagacactatgaagc
kefB位址的左側同源臂(LHA)序列(SEQ ID NO: 198)： ttgtttatggatgcgctggggttgtcgatggcgctcggtacgtttattgcgggtgtgctactggcggaaagtgaatatcgccatgaactggaaacggctatcgatcccttcaaaggcttgctgctcggtttgttctttatctctgtcggcatgtcgctcaacctcggggtgctttatacccatctgttgtgggtagtgataagtgtggttgtgctggtggcggtgaaaattctcgtgctgtatctgctggcgcgattgtatggcgtgcgcagttctgagcggatgcagtttgctggcgtgttgagtcagggcggtgagtttgcctttgtcctcttttctaccgcttcttcacaacgcttattccagggcgaccagat
kefB位址的右側同源臂(RHA)序列(SEQ ID NO: 199)： ttgcatattcttgcgcgagcgcgcggacgtgtggaagcgcatgagttattacaggcaggggtgacgcagttttcccgtgaaacattctccagtgcgttagagctggggcgcaagacgctggtcacgcttggcatgcatccgcatcaggcgcagcgcgcgcaactgcattttcgccgcctggatatgcgaatgctgcgggagttaatcccgatgcatgctgataccgtacaaatttctcgcgccagggaagcccgacgtgaactggaagagattttccagcgtgaaatgcaacaagaacgacgccagctggacggctgggatgaatttgagt
本實施例中所涉及的各表現IL-22的菌株的具體資訊如下表18所示，相關元件的序列如表2-表9的序列所示。 表18 IL-22表現菌株的各元件資訊
菌株名稱 啟動子 RBS 順反子 信號肽 終止子 剔除蛋白 是否表現分子伴護蛋白 表現匣序列SEQ ID NO
CBT4038 BBa_J23119 合成型 無 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 無 否 157
CBT4041 BBa_J23101 合成型 無 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 無 否 158
CBT4042 BBa_J23102 合成型 無 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 無 否 159
CBT4043 BBa_J23108 合成型 無 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 無 否 160
CBT4039 BBa_J23110 合成型 無 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 無 否 161
CBT4040 BBa_J23114 合成型 無 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 無 否 162
CBT4016 BBa_J23110 合成型 無 USP45 rrnB_T1_T7Te_終止子 LPP 否 161
6.2.2 IL-22 表現條件的優化
使用不同啟動子的基因工程菌在LB中培養24小時後表現的IL-22在培養基上清液及胞內的產量如表19所示。其中，菌株CBT4038中使用BBa_J23119啟動子(插入ΔmaeB位址)；菌株CBT4041中使用BBa_J23101啟動子；菌株CBT4042中使用BBa_J23102啟動子；菌株CBT4043中使用BBa_J23108啟動子；菌株CBT4039中使用BBa_J23110；菌株CBT4040中使用BBa_J23114啟動子。結果顯示，可以透過選用合適的啟動子(例如BBa_J23119啟動子)來調節IL-22的產量。 表19 使用不同啟動子的基因工程菌基因型及IL-22的產量
菌株 表現匣中的啟動子 IL-22產量 (ng/mL)
上清液 胞內
CBT4038 BBa_J23119 259.09±18.23 90.09±23.47
CBT4041 BBa_J23101 145.6±50.1 40.91±1.62
CBT4042 BBa_J23102 157.7±22.56 30.17±3.37
CBT4043 BBa_J23108 58.53±2.85 15.18±1.89
CBT4039 BBa_J23110 94.5±2.65 18.32±4.8
CBT4040 BBa_J23114 4.78±0.63 0.21±0.23
剔除不同膜蛋白的基因工程菌以及過表現分子伴護蛋白的基因工程菌在LB中培養24小時後表現的IL-22在培養基上清液及胞內的產量如表20所示。結果表明，剔除了膜蛋白LPP的菌株CBT4016的IL-22分泌率顯著高於未剔除LPP的菌株CBT4039。 表20 剔除不同膜蛋白的基因工程菌基因型及IL-22的產量
菌株 表現匣中的啟動子 剔除的外膜蛋白 IL-22產量 (ng/mL)
上清液 胞內
CBT4039 BBa_J23110 無 67.36±4.03 36.5±2.47
CBT4016 BBa_J23110 LPP 377.45±22.6 27.12±2.72
6.3 表現 Amuc_1100 的菌株建構 6.3.1 Amuc_1100 供體基因片段表現匣的建構步驟
Amuc_1100 編碼序列、信號肽、啟動子、核糖體結合位址(RBS)以及順反子等由金斯瑞(GeneScript）在選殖質體(例如pUC57)上合成。Amuc_1100編碼序列、信號肽、啟動子、核糖體結合位址(RBS)以及順反子等以合成質體為模板進行擴增，插入位址的LHA和RHA以EcN的基因組為模板擴增，轉錄終止子以質體pCBT003為模板擴增。用於擴增這些片段的PCR引子彼此具有15-20 bp的同源序列，因此它們可以透過重疊PCR連接起，得到兩側分別與LHA和RHA序列連接的供體基因片段表現匣，表現匣上各元件從5’到3’按如下順序排列：5’-啟動子-核糖體結合位址(RBS)-順反子-信號肽-Amuc_1100編碼序列-終止子(所建構的各供體基因片段表現匣的序列結構如SEQ ID NO: 139-143所示)。將得到的兩側帶有LHA和RHA序列的供體基因片段表現匣的PCR產物和表現sgRNA的pCBT003_agaI/rsmI_sgRNA質體或pCBT003_malP /T_sgRNA質體或pCBT003_pflB_sgRNA質體或pCBT003_lldD_sgRNA質體或pCBT003_maeA_sgRNA質體同時轉化入含有pCBT001的勝任細胞中，得到的單菌落用插入位址的驗證引子進行擴增，透過擴增條帶的大小篩選Amuc_1100成功插入基因組的選殖株。
本實施例中的Amuc_1100編碼序列為編碼野生型Amuc_1100(SEQ ID NO: 5，表21中以WT所示)或Y259A突變型Amuc_1100(第259位的編號是基於SEQ ID NO: 5所示序列的編號，表21中以Y259A所示)的序列。當插入1個複本的Amuc_1100時，所插入的位址EcN基因組的agaI/rsmI位址；當插入2個複本的Amuc_1100時，所插入的第一和第二位址分別為EcN基因組的位址agaI/rsmI位址和malP/T位址；當插入3個複本的Amuc_1100時，所插入的第一、第二和第三位址分別為EcN基因組的位址agaI/rsmI、malP/T位址和位址pflB。
標靶agaI/rsmI位址的sgRNA的序列如SEQ ID NO: 200所示，該agaI/rsmI位址的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 201和202所示。標靶malP/T位址的sgRNA的序列如SEQ ID NO: 203所示，該malP/T位址的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 204和205所示。標靶pflB位址的sgRNA的序列如SEQ ID NO: 206所示，該pflB位址的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 207和208所示。標靶lldD位址的sgRNA的序列如SEQ ID NO: 209所示，該lldD位址的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 210和211所示。標靶maeA位址的sgRNA的序列如SEQ ID NO: 212所示，該maeA位址的兩側同源臂序列分別如SEQ ID NO: 213和214所示。
標靶agaI/rsmI位址的sgRNA序列(SEQ ID NO: 200)： ggcgagttaacgacgacaca
agaI/rsmI位址的左側同源臂(LHA)序列(SEQ ID NO: 201)： gcgctaaaagctattgaagcggagccgcgcacgctgattttttatgaatctacccaccgtctgttagatagcctggaagatatcgttgcggtattaggcgaatcccgttacgtggttctggcgcgtgagctaaccaaaacctgggaaaccattcacggcgcgcccgttggcgagctgctggcgtgggtaaaagaagatgaaaaccgtcgcaaaggcgaaatggtgctgattgtcgaaggccataaagcgcaggaaaatgacttgcctgctgatgccctgcgcacgctggcgctgctacaggcagaactgccgctgaaaaaagcggcggcgctggccgcagaaattcacggcgtgaagaaaaatgcgctgtataagtatgcgctggagcagcagggagagtgattacaggcgtcgcagcaggaatagcgctac
agaI/rsmI位址的右側同源臂(RHA)序列(SEQ ID NO: 202)： tcacgcatgtgaaatggttatgcagccataaaaatgaagccgggatagcggtggagactttagccgtgagaaaacgttctgtcgcatcctgttttccttcgccagtcaccagtaacaaaacttcgcgggcattgagaatatccttcaggcctaaggtgatcccacgagtcacgggacggtccgcggtttttaacatctcatgttgctgtgttctggcatcaagttgactgatatggcaggctggttgcaggctttctcccggttcgttcagcccaagatgaccgtttttccccaatccgagaacgcataaatccagaccgcctttgcgcgcaatcaggttcgttacccgttcgcactctgtctcatttatctcttcggagcgaaagctgatgagctggtcttcacgcagccccagcggctgcacgatatgctgttgtaggaaagtttcgcaggtg
標靶malP/T位址的sgRNA序列(SEQ ID NO: 203)： ttgcgtattttcaaaaagcg
malP/T位址的左側同源臂(LHA)序列(SEQ ID NO: 204)： accagccgagattcaacaggttgttgcccgtcaggcgaccaatcaaaaactccattgagatgtagttaacatgtcgctgattcgccactggcttggcgaatggctgagcacgcagcatttcggccagtgcttcgctcactgccagccaccactggcgaggagtcatttcagccgcagaatttaagccataacgctgccactgacgtgaaagcgcttcctgaaattgcttatcgttaaaaataggttgtgacataggagttccacttttcttagattttcaacacaacgttatcgctagtttgccaggctcgatgttgaccttcctcatcctgcgggggattaggcagggaggagttgcggggatgagcaaggaaatgtgatctcgaccacttaaagctagtgcaatccacaggattagcagcaaatcaatgccataccgcgcagaaaatctgtatctaagtgcaaaaaatggccgtt
malP/T位址的右側同源臂(RHA)序列(SEQ ID NO: 205)： cgtattttcaaaaagcggaaggtaactctataaattaagtaaaggagtgaaacagtttcacaagtaaaatatcaagtgtgctccatctcattcttaatagatttattaagatcatctttttagatggcactttcatcagaaatgaagaagaaacccttgcttaaatgaaactgatgaacataaggaaaataccgtacaacccagtattcacgctggatcagcgtcgttttaggtgagttgttaataaacatttggaattgtgacacagtgcaaattcagacacataaaaaaacgtcatcgcttgcattagaaaggtttctggccgaccttataaccattaattacgaagcgcaaaaaaaataatatttcctcattttccacagtgaagtgattaactatgctgattccgtcaaaattaagtcgtccggttcgactcgaccataccgtggttcgtga
標靶pflB位址的sgRNA序列(SEQ ID NO: 206)： ccgtgacgttatccgcacca
pflB位址的左側同源臂(LHA)序列(SEQ ID NO: 207)： acgatgacctgatgcgtccggacttcaacaacgatgactacgctattgcttgctgcgtaagcccgatgatcgttggtaaacaaatgcagttcttcggtgcgcgtgcaaacctggcgaaaaccatgctgtacgcaatcaacggcggcgttgacgaaaaactgaaaatgcaggttggtccgaagtctgaaccgatcaaaggcgatgtcctgaactatgatgaagtgatggagcgcatggatcacttcatggactggctggctaaacagtacatcactgcactgaacatcatccactacatgcacgacaagtacagctacgaagcctctctgatggcgctgcacgaccgtgacgttatcc
pflB位址的右側同源臂(RHA)序列(SEQ ID NO: 208)： gtgacgctatcccgactcagtctgttctgaccatcacttctaacgttgtgtatggtaagaaaactggtaacaccccagacggtcgtcgtgctggcgcgccgttcggaccgggtgctaacccgatgcacggtcgtgaccagaaaggtgctgtagcgtctctgacttccgttgctaaactgccgtttgcttacgctaaagatggtatctcctacaccttctctatcgttccgaacgcactgggtaaagacgacgaagttcgtaagaccaacctggctggtctgatggatggttacttccaccacgaagcatccatcgaaggtggtcagcacctgaacgttaacgtgatgaaccgtgaaatgctgctcgacgcgatggaaaacccggaaaaatatccgcagctgaccatccgtgtatctggctacgcagtacgtttcaactcgct
標靶lldD位址的sgRNA序列(SEQ ID NO: 209)： gttatcgtgatgcgcattct
lldD位址的左側同源臂(LHA)序列(SEQ ID NO: 210)： tttccgcagccagcgattatcgcgccgcagcgcaacgcattctgccgccgttcctgttccactatatggatgggggggcatattctgaatacacgctgcgccgcaacgtggaagatttgtcagaagtggcgctgcgccagcgtattctgaaaaacatgtctgacttaagcctggaaacgacgctgtttaatgagaaattgtcgatgccggtggcgctaggtccggtaggtttgtgtggcatgtatgcgcgacgcggcgaagttcaggctgccaaagcagcagatgcgcatggcattccgtttactctctcgacggtttccgtttgcccgattgaagaagtggctccggctatcaaacgtccgatgtggttccagctttatgtgctgcgcgatcgcggctttatgcgtaacgccctggagcgagcaaaagccgcgggttgttcgacgctggttttcacc
lldD位址的右側同源臂(RHA)序列(SEQ ID NO: 211)： gatccgcgatttctgggatggcccgatggtgatcaaagggatcctcgatccggaagatgcgcgcgatgcagtacgttttggtgctgatggaattgtggtttctaaccacggtggccgccagttagatggcgtactctcttctgctcgtgcactgcctgctattgcggatgcggtgaaaggtgatatcgccattctggcggatagcggaatacgtaacgggcttgatgtcgtgcgtatgattgcgctcggtgccgacaccgtactgctgggtcgtgctttcctgtatgcactggcaacagcgggccaggcgggtgtagctaatctgctaaatctgatcgaaaaagagatgaaagtggcgatgacgctgactggcgcgaaatcgattagcgaaattacgcaagattcgctggtgcaggggctgggtaaagagttgcctgcggca
標靶maeA位址的sgRNA序列(SEQ ID NO: 212)： taacacccagcccgatgccc
maeA位址的左側同源臂(LHA)序列(SEQ ID NO: 213)： ttctgcatagcaggtgaggcaaatgagatttattcgccactacccagtatggatgagatctgaaaaagggagaggaaaattgcccggtagccttcactaccgggcgcaggcttagatggaggtacggcggtagtcgcggtattcggcgtgccagaaattatcatcaatggcctgttgcagagcttcggcagacgttttcaccgccacgccttgctgctgcgccattttgccaaccgcaaaggcaattgcgcgggagactttctgaatatctttcagttccggcagtaccagaccttcgccgttcaggaccagcggcgaatactgagcaagcatttcacttgccgacatcagcatctc
maeA位址的右側同源臂(RHA)序列(SEQ ID NO: 214)： gagattttcgcgcttctgcaccagtttggtctggaaaggcagcaggttcggcatcttgtcggtcagcaggccaaagcgatcgaccataaagactttctgccgcgccgcttcctcgcttaatccttcgcgctgggtctgggcgatgatcatttcggcaatgccgcatcccgctgaacctgcgccaaggaagacgatttttttctcgcttaactgaccacctgccgcgcggctggctgcgatcagtgtgccgactgttaccgccgcggtgccctgaatgtcatcgttaaaagaacaaatttcattgcgatagcggttaagtaacggcatcgcatttttttgtgcgaagtcttcaaactgcaacagtacgtccggccagcgttgtttcacagcctggataaattcatcaacaaattcatagtattcgtcgtcagtgatacgcggattacgccagcccatatacagcggatcgttaagcagctgttggttgttggtgccgacatccagcaccaccggaagggtataggccggactgatgccgccacaggcggtatagagcgacagtttaccgatcgga
Amuc_1100的產量用Western Blot方法檢測。菌株資訊如表21所示。相關元件的序列如表2-表9的序列所示。 表21 Amuc_1100表現菌株
菌株名稱 啟動子 RBS 順反子 信號肽 編碼蛋白 終止子 剔除蛋白 是否表現分子伴護蛋白 表現匣序列SEQ ID NO
CBT4101 BBa_J23101 合成型 無 USP45 Y259A rrnB_T1_T7Te _終止子 無 否 139
CBT4102 BBa_J23110 合成型 無 USP45 Y259A rrnB_T1_T7Te _終止子 無 否 140
BBa_J23110 合成型 無 USP45 Y259A rrnB_T1_T7Te _終止子 140
CBT4103 BBa_J23101 合成型 無 USP45 Y259A rrnB_T1_T7Te _終止子 無 否 139
BBa_J23101 合成型 無 USP45 Y259A rrnB_T1_T7Te _終止子 139
BBa_J23101 合成型 無 USP45 Y259A rrnB_T1_T7Te _終止子 139
CBT4105 BBa_J23110 合成型 無 USP45 WT rrnB_T1_T7Te _終止子 LPP 否 142
BBa_J23110 合成型 無 USP45 WT rrnB_T1_T7Te _終止子 142
CBT4106 BBa_J23110 合成型 無 USP45 WT rrnB_T1_T7Te _終止子 LPP、ompT 否 142
BBa_J23110 合成型 無 USP45 WT rrnB_T1_T7Te _終止子 142
CBT4107 BBa_J23110 合成型 無 USP45 Y259A rrnB_T1_T7Te _終止子 無 否 140
CBT4108 BBa_J23110 合成型 無 USP45 Y259A rrnB_T1_T7Te _終止子 無 否 140
BBa_J23110 合成型 無 USP45 Y259A rrnB_T1_T7Te _終止子 140
BBa_J23101 合成型 無 USP45 Y259A rrnB_T1_T7Te _終止子 139
CBT4109 BBa_J23110 合成型 無 USP45 Y259A rrnB_T1_T7Te _終止子 無 否 140
BBa_J23110 合成型 無 USP45 Y259A rrnB_T1_T7Te _終止子 140
BBa_J23110 合成型 無 USP45 Y259A rrnB_T1_T7Te _終止子 140
6.3.2 Amuc_1100 表現條件的優化
對不同複本數的Amuc_1100(Y259A)表現量進行了比較，結果如圖3A所示。其中，泳道A和B為菌株CBT4101，其表現一個複本的使用BBA_J23101啟動子的Amuc_1100(Y259A)；泳道C為菌株CBT4107，其表現一個複本的使用BBA_J23110啟動子的Amuc_1100(Y259A)；泳道D為菌株CBT4102，其表現兩個複本的使用BBA_J23110啟動子的Amuc_1100(Y259A)；泳道E為菌株CBT4103，其表現三個複本的使用BBA_J23101啟動子的Amuc_1100(Y259A)；泳道F為菌株CBT4108，其表現三個複本的Amuc_1100(Y259A)，其中一個複本使用BBA_J23101啟動子，另外兩個複本使用BBA_J23110啟動子；泳道G為菌株CBT4109，其表現三個複本的使用BBA_J23110啟動子的Amuc_1100(Y259A)。該結果顯示，可以透過增加複本數來提高Amuc_1100的表現量。
透過改造細胞外膜提高Amuc_1100的穩定性，並對此進行了測定和比較，結果如圖3B所示。其中，菌株CBT4106中剔除了膜蛋白LPP和ompT；菌株CBT4105只剔除了膜蛋白LPP。該結果顯示，剔除ompT可以減少上清液中Amuc_1100的降解。 6.4 表現 IL-10 、 IL-22 和 / 或 Amuc_1100 組合的菌株建構
IL-10、IL-22、Amuc_1100供體基因片段的製備方法同本實施例6.1、6.2和6.3所述的方法。同時表現IL-10和IL-22的兩組合菌株的建構是將IL-22供體基因片段轉入已表現IL-10的菌株中；同時表現IL-10和Amuc_1100的兩組合菌株的建構是將Amuc_1100供體基因片段轉入已表現IL-10的菌株中；同時表現IL-22和Amuc_1100的兩組合菌株的建構是將Amuc_1100供體基因片段轉入已表現IL-22的菌株中；同時表現IL-10、IL-22和Amuc_1100的三組合菌株的建構是將Amuc_1100供體基因片段轉入已同時表現IL-10和IL-22的菌株中。本實施例中所得到的各組合菌株及其中的插入元件和剔除元件資訊如下表21所示，相關元件的序列如表2-表9的序列所示。 表21 組合表現菌株中的各元件資訊
菌株名稱 插入位址 啟動子 RBS 順反子 信號肽 編碼蛋白 終止子 剔除蛋白 是否表現分子伴護蛋白 表現匣序列SEQ ID NO
CBT4068 maeB BBa_J23110 合成型 BCD2 USP45 IL-10 rrnB_T1_T7Te_終止子 無 是 152
agaI/ rsmI BBa_J23101 合成型 無 USP45 Amuc_ 1100 (WT) rrnB_T1（突變體）_T7Te_終止子 LPP 141
malP/T BBa_J23110 合成型 無 USP45 Amuc_ 1100 (WT) rrnB_T1_T7Te_終止子 142
CBT4066 kefB BBa_J23114 合成型 無 USP45 IL-22 rrnB_T1_T7Te_終止子 LPP 是 162
CBT4069 kefB BBa_J23114 合成型 無 USP45 IL-22 rrnB_T1_T7Te_終止子 LPP 是 162
agaI/ rsmI BBa_J23101 合成型 無 USP45 Amuc_ 1100 (WT) rrnB_T1（突變體）_T7Te_終止子 141
malP/T BBa_J23110 合成型 無 USP45 Amuc_ 1100 (WT) rrnB_T1_T7Te_終止子 142
CBT4063 kefB BBa_J23114 合成型 無 USP45 IL-22 rrnB_T1_T7Te_終止子 LPP 是 162
maeB BBa_J23110 合成型 BCD2 USP45 IL-10 rrnB_T1_T7Te_終止子 152
CBT4067 maeB BBa_J23110 合成型 BCD2 USP45 IL-10 rrnB_T1_T7Te_終止子 LPP 是 152
kefB BBa_J23114 合成型 無 USP45 IL-22 rrnB_T1_T7Te_終止子 162
agaI/ rsmI BBa_J23101 合成型 無 USP45 Amuc_ 1100 (WT) rrnB_T1（突變體）_T7Te_終止子 141
malP/T BBa_J23110 合成型 無 USP45 Amuc_ 1100 (WT) rrnB_T1_T7Te_終止子 142
CBT4070 agaI/ rsmI BBa_J23101 合成型 無 USP45 Amuc_ 1100 (WT) rrnB_T1（突變體）_T7Te_終止子 LPP 是 141
malP/T BBa_J23110 合成型 無 USP45 Amuc_ 1100 (WT) rrnB_T1_T7Te_終止子 142
CBT4080 lldD PfnrS 合成型 無 USP45 Amuc_ 1100 (WT) rrnB_T1_T7Te_終止子 LPP 否 143
maeA PfnrS 合成型 無 USP45 Amuc_ 1100 (WT) rrnB_T1_T7Te_終止子 143
其中，同時表現IL-10、IL-22和Amuc_1100的三組合菌株中，各基因在EcN染色體上的位置的示意圖如圖4A所示。 6.5 菌株生長狀態的測定
單獨表現、雙基因組合表現、三基因組合表現菌株的生長曲線如圖4B所示。其中，CBT4070單獨表現Amuc_1100；CBT4062單獨表現IL-10；CBT4068同時表現IL-10和Amuc_1100；CBT4066單獨表現IL-22；CBT4069同時表現IL-22和Amuc_1100；CBT4063同時表現IL-10和IL-22；CBT4067同時表現IL-10、IL-22和Amuc_1100。菌株資訊如表10所示。
結果表明，所建構的單獨表現、雙基因組合表現、三基因組合表現的基因工程菌的生長未受到顯著影響。 6.6 外源基因表現量的測定
單獨表現、雙基因組合表現、三基因組合表現菌株上清液中IL-10和IL-22的表現量結果如表23所示。其中，CBT4062單獨表現IL-10；CBT4068同時表現IL-10和Amuc_1100；CBT4066單獨表現IL-22；CBT4069同時表現IL-22和Amuc_1100；CBT4070單獨表現Amuc_1100；CBT4063同時表現IL-10和IL-22；CBT4067同時表現IL-10、IL-22和Amuc_1100。該結果顯示，組合表現基因工程菌IL-10、IL-22以及Amuc_1100的表現不會因組合而降低。 表23 組合菌株基因型及IL-10、IL-22和Amuc_1100的表現量
菌株 表現匣中的基因 剔除的外膜蛋白 過表現分子伴護蛋白 IL-10產量 (ng/mL) IL-22產量 (ng/mL) Amuc_1100產量 (ng/mL)
CBT4062 IL-10 ΔLPP 是 63.26±2.55 -
CBT4068 IL-10 Amuc_1100(2複本) ΔLPP 是 81.4±1.3 - 506.69±39.429
CBT4066 IL-22 ΔLPP 是 - 71.28±9.83
CBT4069 IL-22 Amuc_1100(2複本) ΔLPP 是 - 103.62±8.4 483.12±173.9
CBT4063 IL-22 IL-10 ΔLPP 是 81.24±18.39 59.06±1.41
CBT4067 IL-10 IL-22 Amuc_1100(2複本) ΔLPP 是 79±9.1 93.59±6.12 571.72±29.19
CBT4070 Amuc_1100(2複本) ΔLPP 是 - - 653.71±151.95
實施例 7 ：表現蛋白的活性檢測 7.1 IL-10 活性檢測
將所要檢測的樣品用全細胞培養液稀釋到合適的濃度，將20 μL稀釋好的樣品以及IL-10標準品分別加入到平底96孔盤中，其中EcN的樣品用作陰性對照。製備~280,000細胞/mL的HEK-Blue™ IL-10 Cells(InvivoGen, Cat # hkb-il10)細胞懸浮液，並將180 μL該懸浮液(~50,000細胞)迅速加入到已添加有樣品的孔中。將96孔盤在5% CO 2下37℃培養22小時，之後取20 μL上清液加入到新的平底96孔盤中，並在每孔中加入180 μL QUANTI-Blue試劑，37℃培育一小時後讀取A 620的數值。
單獨表現、雙基因組合表現、三基因組合表現菌株上清液中分泌的IL-10的細胞活性如圖4C所示。其中，陰性對照為不表現IL-10的EcN上清液；IL-10標準品濃度為30 ng/mL；CBT4062單獨表現IL-10，樣品濃度稀釋為21 ng/mL；CBT4068同時表現IL-10和Amuc_1100，樣品濃度稀釋為28 ng/mL；CBT4063同時表現IL-10和IL-22，樣品濃度稀釋為21 ng/mL；CBT4067同時表現IL-10、IL-22和Amuc_1100，樣品濃度稀釋為29 ng/mL。
結果顯示，組合表現基因工程菌表現分泌的IL-10具有生物活性且其活性與標準品具有可比性。 7.2 IL-22 活性檢測
將所要檢測的樣品用全細胞培養液稀釋到合適的濃度，將20 μL稀釋好的樣品以及IL-22標準品分別加入到平底96孔盤中，其中EcN的樣品用作陰性對照。製備~280,000 cells/mL的HEK-Blue™ IL-22 Cells(InvivoGen, Cat # hkb-il22)細胞懸浮液，並將180 μL該懸浮液(~50,000 cells)迅速加入到已添加有樣品的孔中。將96孔盤在5% CO 2下37℃培養22小時，之後取20 μL上清液加入到新的平底96孔盤中，並在每孔中加入180 μL QUANTI-Blue試劑，37℃培育一小時後讀取A 620的數值。
單獨表現、雙基因組合表現、三基因組合表現菌株上清液中分泌的IL-22的細胞活性如圖4D所示。其中，陰性對照為不表現IL-22的EcN上清液；CBT4066單獨表現IL-22，CBT4069同時表現IL-22和Amuc_1100；CBT4063同時表現IL-22和IL-10；CBT4067同時表現IL-10、IL-22和Amuc_1100；IL-22標準品及各菌株樣品濃度皆稀釋為0.33 ng/mL、1 ng/mL以及3 ng/mL。
結果顯示，組合表現基因工程菌表現分泌的IL-22具有生物活性且其活性與標準品具有可比性 7.3 Amuc_1100 活性檢測
將所要檢測的樣品用全細胞培養液稀釋到合適的濃度，將20 μL稀釋好的樣品以及Amuc_1100標準品分別加入到平底96孔盤中，其中EcN的樣品用作陰性對照。製備~280,000細胞/mL的HEK-Blue™ hTLR2 Cells (InvivoGen, Cat # hkb-htlr2)細胞懸浮液，並將180 μL該懸浮液(~50,000 cells)迅速加入到已添加有樣品的孔中。將96孔盤在5% CO 2下37℃培養22小時，之後取20 μL上清液加入到新的平底96孔盤中，並在每孔中加入180 μL QUANTI-Blue試劑，37℃培育一小時後讀取A 620的數值。
選取菌株CBT4080作為測定對象，對其上清液中分泌的Amuc_1100的活性進行了檢測，結果如圖4E所示。其中，陰性對照為不表現Amuc_1100的EcN上清液純化產物；Amuc_1100標準品濃度為40 μg/mL；CBT4080純化樣品純度約為70%，濃度為28.8 μg/mL。該結果顯示，基因工程菌表現分泌的Amuc_1100具有生物活性且其活性與標準品具有可比性。 實施例 8 ：厭氧誘導表現 IL-10 、 IL-22 和 / 或 Amuc_1100 組合的菌株建構
IL-10、IL-22、Amuc_1100供體基因片段的製備方法同實施例6裡的6.1、6.2和6.3所述的方法。同時表現IL-10和IL-22的兩組合菌株的建構是將IL-22供體基因片段轉入已表現IL-10的菌株中；同時表現IL-10和Amuc_1100的兩組合菌株的建構是將Amuc_1100供體基因片段轉入已表現IL-10的菌株中；同時表現IL-22和Amuc_1100的兩組合菌株的建構是將Amuc_1100供體基因片段轉入已表現IL-22的菌株中；同時表現IL-10、IL-22和Amuc_1100的三組合菌株的建構是將Amuc_1100供體基因片段轉入已同時表現IL-10和IL-22的菌株中。本實施例中所得到的各組合菌株及其中的插入元件和剔除元件資訊如下表24所示，相關元件的序列如表2-表9的序列所示。 表24 實施例8所用組合表現菌株的各元件資訊
菌株名稱 插入位址 啟動子 RBS 順反子 信號肽胜肽 編碼蛋白 終止子 剔除蛋白 是否表現分子伴護蛋白 表現匣序列SEQ ID NO
CBT4084 maeB PfnrS 合成型 無 USP45 IL-10 rrnB_T1_T7Te_終止子 LPP、mrcA 是 156
CBT4095 kefB PfnrS 合成型 無 USP45 IL-22 rrnB_T1_T7Te_終止子 LPP、mrcA 是 163
CBT4096 agaI/ rsmI PfnrS 合成型 無 USP45 Amuc_ 1100 (WT) rrnB_T1_T7Te_終止子 LPP、mrcA 是 143
CBT4088 maeB PfnrS 合成型 無 USP45 IL-10 rrnB_T1_T7Te_終止子 LPP、mrcA 是 156
agaI/ rsmI PfnrS 合成型 無 USP45 Amuc_ 1100 (WT) rrnB_T1_T7Te_終止子 143
CBT4098 kefB PfnrS 合成型 無 USP45 IL-22 rrnB_T1_T7Te_終止子 LPP、mrcA 是 163
agaI/ rsmI PfnrS 合成型 無 USP45 Amuc_ 1100 (WT) rrnB_T1_T7Te_終止子 143
CBT4110 maeB PfnrS 合成型 無 USP45 IL-10 rrnB_T1_T7Te_終止子 LPP、mrcA 是 156
kefB BBa_J23110 合成型 無 USP45 IL-22 rrnB_T1_T7Te_終止子 161
CBT4111 maeB PfnrS 合成型 無 USP45 IL-10 rrnB_T1_T7Te_終止子 LPP、mrcA 是 156
kefB BBa_J23110 合成型 無 USP45 IL-22 rrnB_T1_T7Te_終止子 161
agaI/ rsmI PfnrS 合成型 無 USP45 Amuc_ 1100 (WT) rrnB_T1_T7Te_終止子 143
實驗所用菌株在LB(磷酸鹽檸檬酸緩衝體系調pH = 8.0)+1% w/v 葡萄糖培養基中有氧培養4小時厭氧培養2小時後培養基上清液中IL-10、IL-22、Amuc_1100的表現量如表25所示。 表25 實驗所用菌株IL-10、IL-22、Amuc_1100的表現量
菌株 表現匣中的基因 剔除的外膜蛋白 過表現分子伴護蛋白 IL-10產量(ng/mL/OD 600) IL-22產量(ng/mL/OD 600) Amuc_1100產量(ng/mL/OD 600)
CBT4084 IL-10 LPP、mrcA 是 575.78±113.77 -
CBT4095 IL-22 LPP、mrcA 是 - 4118.86±1137.64 -
CBT4096 Amuc_1100 LPP、mrcA 是 - - 1367.93±382.91
CBT4088 IL-10 Amuc_1100 LPP、mrcA 是 394.76±51.09 3574.56±876.35
CBT4098 IL-22 Amuc_1100 LPP、mrcA 是 - 4526.74±1978.42 2313.41±560.97
CBT4110 IL-10 IL-22 LPP、mrcA 是 932.18±206.25 3268.59±281.37 -
CBT4111 IL-10 IL-22 Amuc_1100 LPP、mrcA 是 464.77±4.65 1904.9±361.77 4589.59±1359.36
實施例 9 ：水楊酸誘導表現 IL-10 的質體建構
水楊酸誘導啟動子Psal、核酶(sTRSV-HHRz)、核糖體結合位址(RBS)、水楊酸誘導啟動子的抑制子表現匣5’-PlacIQ-NahRAM-ter-3’等由金斯瑞(GeneScript)在選殖質體(例如pUC57)上合成。不含有啟動子的IL-10 表現匣5’-USP45_IL-10_rrnB_T1_T7Te-3’序列以CBT4084菌株基因組為模板進行擴增，Psal_sTRSV-HHRz_RBS和PlacIQ_NahRAM_ter以合成質體為模板擴增，插入位址maeB的LHA和RHA以EcN的基因組為模板擴增，maeB位址的sgRNA以質體pCBT003_maeB_sgRNA為模板擴增，質體骨架以pCBT010為模板擴增。用於擴增這些片段的PCR引子彼此具有15-20 bp的同源序列，因此可以使用套組ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit (Vazyme)連接起來，形成包含一端與LHA連接的表現匣5’-Psal-sTRSV HHRz_RBS_USP45_IL-10_rrnB_T1_T7Te-3’、另一端與RHA連接的表現匣5’-PlacIQ-NahRAM-ter-3’(序列如SEQ ID NO: 243所示)以及maeB位址sgRNA的質體pCBT010_maeB_Psal_IL-10。將質體pCBT010_maeB_Psal_IL-10轉化入含有pCBT001的勝任細胞中，得到的單菌落用插入位址的驗證引子進行擴增，透過擴增條帶的大小篩選IL-10成功插入基因組的選殖株。IL-10的產量用ELISA套組(義翹神州，KIT10947A)檢測。
PlacIQ-NahRAM-ter序列(SEQ ID NO: 243) atggcggcgcgccatcgaatggtgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcatgggggttgaatatggaactgcgtgacctggatttaaacctgctggtggtgttcaaccagttgctggtcgacagacgcgtctctgtcactgcggagaacctgggcctgacccagcctgccgtgagcaatgcgctgaaacgcctgcgcacctcgctacaggacccactcttcgtgcgcacacatcagggaatggaacccacaccctatgccgcgcatctggccgagcacgtcacttcggccatgcacgcactgcgcaacgccctacagcaccatgaaagcttcgatccgctgaccagcgagcgtaccttcaccctggccatgaccgacattggcgagatctacttcatgccgcggctgatggatgcgctggctcaccaggcccccaattgcgtgatcagtacggtgcgcgacagttcgatgagcctgatgcaggccttgcagaacggaaccgtggacttggccgtgggcctgcttcccaatctgcaaactggcttctttcagcgccggctgctccagaatcactacgtgtgcctatgtcgcaaggaccatccagtcacccgcgaacccctgactctggagcgcttctgttcctacggccacgtgcgtgtcatcgccgctggcaccggccacggcgaggtggacacgtacatgacacgggtcggcatccggcgcgacatccgtctggaagtgccgcacttcgccgccgttggccacatcctccagcgcaccgatctgctcgccactgtgccgatatgtttagccgactgctgcgtagagcccttcggcctaagcgccttgccgcacccagtcgtcttgcctgaaatagccatcaacatgttctggcatgcgaagtaccacaaggacctagccaatatttggttgcggcaactgatgtttgacctgtttacggattgataaggatcctaattggtaacgaatcagacaattgacggctcgagggagtagcatagggtttgcagaatccctgcttcgtccatttgacaggcacattatgcatcgatgataagctgtcaaacatgagcagatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcaaatattttatctg 表26 實施例9所用表現菌株的各元件資訊
菌株名稱 插入位址 啟動子 RBS 核酶 信號肽 編碼蛋白 終止子 剔除蛋白 是否表現分子伴護蛋白 表現匣序列SEQ ID NO
CBT4113 maeB Psal 合成型 sTRSV-HHRz USP45 IL-10 rrnB_T1_T7Te_終止子 LPP、mrcA 是 235
菌株CBT4113在LB培養基中有氧培養3小時後添加不同濃度水楊酸鈉繼續培養1-4小時後培養基上清液中IL-10的表現量如圖5所示。結果顯示透過調節誘導劑的濃度和誘導時間可以實現對IL-10表現量的精準調控。 實施例 10 ：其他細胞激素的表現
此外，申請人還嘗試選擇了其他多種同樣具有免疫調節作用的細胞激素，例如IL-23(IL-12p40_linker1_IL-23p19)、IL-17A、IL-19、IL-35(EBI3_linker2_IL-12p35)、IL-37和TGF-β，並建構基因工程菌以期嘗試研究其體內效果。具體過程如下：、IL-23(IL-12p40_linker1_IL-23p19)、IL-17A、IL-19、IL-35(EBI3 _linker2_IL-12p35)、IL-37、TGF-β編碼序列以合成的質體為模板擴增，包含水楊酸誘導啟動子Psal、核酶(sTRSV-HHRz)、核糖體結合位址(RBS)、分泌信號肽USP45的5’-Psal_sTRSV-HHRz_RBS_USP45-3’序列、包含轉錄終止子rrnB_T1_T7Te以及水楊酸調控元件PlacIQ-NahRAM-ter的5’-rrnB_T1_ T7Te_PlacIQ_NahRAM_ter-3’的質體骨架序列以質體pCBT010_maeB_Psal_IL-10為模板進行擴增。用於擴增這些片段的PCR引子彼此具有15-20 bp的同源序列，因此可以使用套組ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit (Vazyme)連接起來，形成包含表現匣5’-Psal-sTRSV HHRz_RBS_USP45_細胞激素_rrnB_T1_T7Te-3’、以及表現匣pCBT010_Psal_IL-23、pCBT010_Psal_IL-17A、pCBT010_Psal_IL-19、pCBT010_ Psal_IL-35、pCBT010_Psal_IL-37、pCBT010_Psal_TGF-β。將這些質體分別底盤菌CBT4114(基因型見表XX)中轉化勝任細胞中，得到的單菌落用質體的驗證引子進行擴增，透過擴增條帶的大小驗證質體的成功轉入。細胞激素的產量用ELISA套組檢測，本實施例所使用的套組如表27所示。 表27 細胞激素檢測套組
品牌 貨號 名稱
聯科生物 EK1177-48 Human IL-17AF ELISA Kit
聯科生物 EK123-48 Human IL-23 ELISA Kit
Abclonal RK00175 Human IL-19 ELISA kit
聯科生物 EK135-48 Human IL-35 ELISA kit
Abclonal RK00117 Human IL-37 ELISA kit
聯科生物 EK981-48 Human/Mouse/Rat TGF-β1 ELISA Kit
含有這些細胞激素表現質體的菌株在LB培養基中有氧培養4小時添加100μM水楊酸鈉繼續培養2小時後上清液和胞內的細胞激素含量如表28所示。 表28 各菌株在水楊酸誘導下的細胞激素產量
菌株 表達表現載體 表現匣中的基因 剔除的外膜蛋白 過表現分子伴護蛋白 上清液產量(ng/mL/OD600) 胞內產量(ng/mL/OD600)
CBT4114 質體pCBT010_Psal_IL-23 IL-23 LPP、mrcA 是 0.01±0.00 0.02±0.00
CBT4114 質體pCBT010_Psal_IL-17A IL-17A LPP、mrcA 是 0.14±0.02 1.35±0.15
CBT4114 質體pCBT010_Psal_IL-19 IL-19 LPP、mrcA 是 0.23±0.06 0.73±0.00
CBT4114 質體pCBT010_Psal_IL-35 IL-35 LPP、mrcA 是 0.65±0.01 3.89±0.19
CBT4114 質體pCBT010_Psal_IL-37 IL-37 LPP、mrcA 是 0.08±0.02 3.1±0.36
CBT4114 質體pCBT010_Psal_TGF-β TGF-β LPP、mrcA 是 0.09±0.01 0.14±0.02
結果意外的發現，上述細胞激素的表現分泌量都過低，難以達到起效濃度，推測EcN可能對這些蛋白的耐受力較差或者上述蛋白表現後並不穩定，因此上述激素不適合在EcN中進行表現分泌。 實施例 11 ： T 細胞移植誘導的小鼠腸炎 (IBD) 模型藥效研究
本實驗所用的小鼠腸炎透過向嚴重複合型免疫缺陷(SCID)小鼠(缺乏T細胞和B細胞)注射純化的CD4 +CD45RB high細胞(不含有調節T細胞)誘導形成。Balb/C小鼠(20 g，8-10周齡)用於製備CD4 +CD45RB low和CD4 +CD45RB high細胞，RAG1 -/-小鼠(20 g，8-10周齡)用於接收T細胞轉移。RAG1 -/-小鼠被隨機分為11組，每組10隻。第1組為健康組，接受CD4 +CD45RB low細胞，第2-11組為疾病組，接受CD4 +CD45RB high細胞。T細胞移植誘導當天為第0天，從第14天開始給藥。在LB中有氧培養4小時的EcN、CBT4084、CBT4095、CBT4096、CBT4088、CBT4098、CBT 4110、CBT4111菌液濃縮重新懸浮於0.2 M碳酸氫鈉+1% w/v葡萄糖水溶液中。第2組為陽性給藥組，在第14-37天每7天腹腔注射TNF-α抗體一次，同時每天灌胃100 μL EcN菌懸浮液。EcN、CBT4084、CBT4095、CBT4096、CBT4088、CBT4098、CBT4110、CBT4111的100μL菌懸浮液分別灌胃給第3-11組，每天一次，給藥量為每隻小鼠2.5×10 9CFU。第41天殺小鼠並測量腸子的長度，同時做HE染色病理分析。
在各實驗組中，T細胞移植誘導的小鼠腸炎模型藥效終點結腸長度如圖6A所示。其中，CBT4096單獨表現Amuc_1100；CBT4084單獨表現IL-10；CBT4088同時表現IL-10和Amuc_1100；CBT4095單獨表現IL-22；CBT4098同時表現IL-22和Amuc_1100；CBT4110同時表現IL-10和IL-22；CBT4111同時表現IL-10、IL-22和Amuc_1100。結果顯示，無論單獨表現還是組合表現的基因工程菌對與保持腸炎模型小鼠的結腸長度皆有效果，而統計分析顯示，所有組合表現的基因工程菌的結腸長度均顯著長於對照組( p＜0.05)且與陽性對照藥TNF-α抗體的效果有可比性，說明在T細胞移植誘導的小鼠腸炎模型中組合表現的基因工程菌治療效果優於單獨表現的基因工程菌。
EcN對照組、同時表現IL-10和IL-22的CBT4110小鼠結腸HE染色樣本如圖6B所示，CBT4110小鼠的結腸發炎情況顯著好於對照組。 實施例 12 ： DSS 誘導的小鼠腸炎 (IBD) 模型藥效研究
除了實施例11的小鼠腸道模型外，申請人還在DSS誘導的小鼠腸炎模型中進一步驗證基因工程菌對小鼠腸炎的治療效果。具體地，Balb/C小鼠(20 g，C57/B6小鼠50隻，8周齡，18-20 g，雌性。隨機分成10組模型組，每組5隻小鼠，於第0天開始飲用2.5%DSS，4天換成正常水3天，共4輪DSS誘導。第1組為模型對照組，不給藥，第2組為陽性藥組，從第0天至第27天每天透過灌胃給陽性藥CsA ，給藥量為25mpk。在LB中有氧培養4小時的EcN、CBT4096、CBT4088、CBT4098、CBT4110菌液濃縮重新懸浮於0.2 M 碳酸氫鈉+1% w/v葡萄糖水溶液中。EcN、CBT4096、CBT4088、CBT4098、CBT4110的100μL菌懸浮液分別灌胃給第3-10組，每天一次，給藥量為每隻小鼠2.5×10 9CFU，於第 0天開始給藥至第27天結束，第28天為實驗終點，殺小鼠並測量腸子的長度。
DSS誘導的小鼠腸炎模型體重變化、DAI評分(Disease activity index，疾病活動指數，也是常用的評價腸炎的指標)及藥效終點結腸長度如圖7所示。與EcN對照組相比，基因工程菌CBT4096、CBT4088、CBT4098、CBT4110組的結腸長度均顯著增長( p＜0.05)(圖7C)，其中在維持體重(圖7A)和降低DAI評分(圖7B)方面，CBT4110具有更顯著優勢( p＜0.001)。 實施例 13 ： GvHD 模型藥效研究
BALB/c(H-2d)小鼠和C57BL/6(H-2b)小鼠(6-8周齡）分別用作供體和受體骨髓移植(BMT)的當天為第0天，輻照的當天為第-1天。第1組有7隻同源移植小鼠，第2-10組有9隻同源移植小鼠，第11組有7隻只輻照不移植的小鼠。在LB中有氧培養4小時的EcN、CBT4084、CBT4095、CBT4096、CBT4088、CBT4098、CBT4110、CBT4111菌液濃縮重新懸浮於0.2 M碳酸氫鈉+1% w/v葡萄糖水溶液中。從第-1天開始到第30天，第1組、第2組、第10組和第11組的小鼠分別灌胃給藥含有2.5×10 9CFU的100 μL EcN細胞懸浮液，同時第10組的小鼠每天注射給藥20 mg/kg潑尼松，CBT4084、CBT4095、CBT4096、CBT4088、CBT4098、CBT4110、CBT4111的100μL菌懸浮液分別灌胃給第3-9組，每天記錄小鼠的存活率。
GvHD動物模型的存活率如圖8所示。結果表明，在第20天時，單獨表現Amuc_1100的CBT4096、同時表現IL-22和Amuc_1100的CBT4098、同時表現IL-10和IL-22的CBT4110、同時表現IL-10、IL-22和Amuc_1100的CBT4111組的小鼠都與陽性藥組有相同甚至更高的存活率。在第25天時，同時表現IL-10和Amuc_1100的CBT4088、同時表現IL-22和Amuc_1100的CBT4098、同時表現IL-10和IL-22的CBT4110、同時表現IL-10、IL-22和Amuc_1100的CBT4111組的小鼠都比單獨表現IL-10的CBT4084、單獨表現IL-22的CBT1095、單獨表現Amuc_1100的CBT4096組的小鼠有更高的存活率，說明在GvHD模型中組合表現的基因工程菌都不同程度的優於單獨表現的基因工程菌。而在第30天實驗結束時，同時表現IL-22和Amuc_1100的CBT4098組的存活率仍然接近陽性藥組。由此可見，表現IL-22和Amuc_1100的基因工程菌對GvHD具有最顯著的治療作用。 實施例 14 ： SLE 模型藥效研究
首先評價了同時表現兩種蛋白的基因工程菌與分別單獨表現一種蛋白的基因工程菌在SLE模型中的治療效果，具體地，SLE模型採用MRL/MpJ-Faslpr小鼠，MRL/MpJ小鼠作為陰性對照，給藥時間為8周。在LB中有氧培養4小時的EcN、CBT4084、CBT4096、CBT4088菌液濃縮重新懸浮於0.2 M碳酸氫鈉+1% w/v葡萄糖水溶液中。實驗小鼠共分為6組，第1組為陰性對照組，包含5隻MRL/MpJ小鼠，第2組為陽性給藥組，包含10隻MRL/MpJ-Faslpr小鼠，每天灌胃給9 mg/kg潑尼松以及100 μL EcN菌懸浮液。第3-6組為給藥組，各包含10隻MRL/MpJ-Faslpr小鼠，每天灌胃給100 μL EcN、CBT4084、CBT4096、CBT4088菌懸浮液，給藥量為每隻小鼠2.5×10 9CFU。實驗結束後，取腎臟製作切片，評估腎小管損傷情況。
腎小管損傷情況如圖9A所示，與對照EcN相比，單獨表現IL-10的基因工程菌CBT4084和單獨表現Amuc_1100的基因工程菌CBT4096並不能顯著減輕腎小管的損傷，但是同時表現IL-10和Amuc_1100的基因工程菌CBT4088能夠顯著減輕腎小管的損傷，說明在SLE模型中，同時表現IL-10和Amuc_1100產生了協同作用。
接下來，進一步比較了同時表現IL-10和Amuc_1100(CBT4088)、IL-10和IL-22(CBT4110)、以及同時表現IL-10、IL-22和Amuc_1100的基因工程菌(CBT4111)的治療效果。具體地，實驗小鼠共分為5組，第1組為陰性對照組，包含6隻MRL/MpJ小鼠，第2-5組為給藥組，各包含10隻MRL/MpJ-Faslpr小鼠，每天灌胃給100 μL EcN、CBT4088、CBT4110、CBT4111菌懸浮液，給藥量為每隻小鼠1.0×10 10CFU。實驗終點檢測血清中抗雙鏈DNA抗體IgG濃度，尿液中白蛋白濃度，並取腎臟製作切片進行PAS染色，評估腎小球損傷情況。
首先，檢測了SLE的血清學標誌物抗雙鏈DNA抗體IgG在小鼠血清中的濃度變化，結果如圖9B所示，CBT4088和CBT4110均可以顯著降低模型小鼠血清中抗雙鏈DNA抗體IgG濃度( p＜0.01)，而CBT4088的降幅最大。腎臟PAS染色顯示EcN組中疾病小鼠腎小球毛細血管內皮細胞和系膜細胞顯著增生，球囊腔變窄或閉塞，腎小球功能喪失，而CBT4088以及CBT4111的病理切片顯示有明顯好轉(圖9D)。不過僅CBT4088能夠顯著降低尿液中白蛋白濃度(腎臟損傷程度的指標)( p＜0.01)(圖9C)。以上結果表明，同時表現IL-10和Amuc_1100的基因工程菌CBT4088在治療SLE方面具有最佳的效果。 實施例 15 ： CIA 模型藥效研究
膠原蛋白誘導的關節炎(collagen-induced athritis，CIA)是一種實驗性自發性免疫疾病，用二型膠原蛋白免疫齧齒動物易感染品系(大鼠和小鼠)可以誘導出CIA。經免疫的動物可出現一種自發性免疫媒介的多發性關節炎。CIA模型採用DBA/1小鼠。在第0天當天，所有DBA/1小鼠用2%-5%異氟烷麻醉後，在距離身體2-3 cm尾根部皮下注射50 μL膠原乳劑。三周後，即第21天，於尾根部同法注射相同體積膠原乳劑攻擊。第二次膠原乳劑攻擊當天將造模的動物按照體重隨機分成6組，每組5或10隻小鼠，分組當天開始給藥。在LB中有氧培養4小時的EcN、CBT4088、CBT4098、CBT4110、CBT4111菌液濃縮重新懸浮於0.2 M碳酸氫鈉+1% w/v葡萄糖水溶液中。第1-5組各包含10隻小鼠，每天灌胃給100 μL EcN、CBT4088、CBT4098、CBT4110、CBT4111菌懸浮液，給藥量為每隻小鼠1.5×10 10細胞，第6組為陽性給藥組，包含5隻小鼠，每天灌胃給100 μL EcN以及0.2 mg/kg地塞米松。給藥時間為36天，每週兩次觀察每組動物四肢的關節炎發病情況並進行評分，同時測量前後足墊的厚度。
小鼠前後足墊的厚度以及四肢的關節炎發病情況評分如圖10所示，同時表現IL-10和Amuc_1100的基因工程菌CBT4088、同時表現IL-22和Amuc_1100的基因工程菌CBT4098、同時表現IL-10和IL-22的基因工程菌CBT4110以及同時表現IL-10、IL-22和Amuc_1100的基因工程菌CBT4111都可以一定程度的減輕疾病的嚴重程度，其中，同時表現IL-10和Amuc_1100的CBT4088對於足墊厚度(圖10A)以及疾病評分(圖10B)的改善最為顯著( p＜0.05)。 實施例 16 ： OVA 誘導的哮喘模型藥效研究
哮喘是氣道的慢性發炎性疾病，其特徵是二型T輔助淋巴細胞(T helper 2 cell，Th2)、嗜酸性顆粒細胞數量的增加以及氣道發炎的出現。它伴有高位準的血清免疫球蛋白E(IgE)，以及由過敏原特異性Th2細胞在肺內產生的介白素4(IL-4)、介白素5(IL-5) 和介白素13(IL-13)。氣道發炎與氣道和肺組織中嗜酸性顆粒細胞、中性顆粒細胞以及T和B淋巴細胞的浸潤有關。
在這項研究中，卵清蛋白(OVA)誘導的哮喘模型採用BALB/c雌性小鼠。將小鼠按體重隨機分為7組，給藥週期為31天。在LB中有氧培養4小時的EcN、CBT4088、CBT4098、CBT4110、CBT4111菌液濃縮重新懸浮於0.2 M碳酸氫鈉+1% w/v葡萄糖水溶液中。第1-5組各10隻小鼠，每天灌胃給100 μL EcN、CBT4088、CBT4098、CBT4110、CBT4111菌懸浮液，給藥量為每隻小鼠1.5×10 10細胞。第6組為陽性給藥組，包含6隻小鼠，每天灌胃給100 μL EcN菌懸浮液，其中第27至31天額外給陽性藥地塞米松1 mg/kg。第7組為未誘導致敏對照組，包含5隻小鼠，每天灌胃給100 μL EcN菌懸浮液。第1-6組小鼠在第1天和第14天腹腔注射100 μL致敏溶液(含有20 μg卵清蛋白和2 mg明礬)，作為對照第7組小鼠注射100 μL PBS溶液。在第28、29、30天，第1-6組的小鼠用溶於PBS(pH=7.2)的1% OVA溶液攻擊30分鐘，作為對照第7組的小鼠用PBS(pH=7.2)溶液進行攻擊。
在第32天，所有動物都被安樂死。肺透過氣管插管用PBS(pH=7.2)溶液進行灌洗。肺泡灌洗液(BALF)中的細胞總數由血細胞計數器計數。使用細胞離心塗片和瑞氏-吉姆薩染色後，從細胞離心製備物中進行嗜酸性顆粒細胞、巨噬細胞、中性顆粒細胞、淋巴細胞計數。
肺泡灌洗液(BALF)中的細胞計數結果如圖11A~11E所示，與第1組只給EcN的對照相比，所有給藥組肺泡灌洗液(BALF)中的細胞總數、嗜酸性顆粒細胞數和巨噬細胞數都有所下降，其中同時表現IL-22和Amuc_1100的CBT4098可以顯著降低細胞總數(p＜0.01)、嗜酸性顆粒細胞數(p＜0.05)和巨噬細胞數(p＜0.05)。而同時表現IL-10和IL-22的CBT4110以及同時表現IL-10、IL-22和Amuc_1100的CBT4111也可以顯著降低細胞總數和巨噬細胞數。
雖然已經參考特定實施例(其中一些是優選實施例)具體示出和描述了本發明，本領域技術人員應當理解，在不脫離本文公開的精神和範圍的情況下，可以在形式和細節上進行各種改變。
圖1展示了外源基因表現匣插入EcN基因組的示意圖。
圖2有氧與厭氧條件對菌株CBT4078所表現的IL-10的產量的比較結果。
圖3展示了不同複本數的Amuc_1100(Y259A)表現量的比較結果(A圖)、透過改造細胞外膜以提高Amuc_1100的穩定性的比較結果(B圖)。其中，A圖中的A欄和B欄代表只有一個Amuc_1100(Y259A)複本在啟動子BBA_J23101控制下的菌株CBT4101，C欄代表只有一個Amuc_1100(Y259A)複本在啟動子BBA_J23110控制下的菌株CBT4107，D欄代表有兩個Amuc_1100(Y259A)複本在啟動子BBA_J23110控制下的菌株CBT4102，E欄代表有三個Amuc_1100(Y259A)複本在啟動子BBA_J23101控制下的菌株CBT4103，F欄代表有一個在啟動子BBA_J23101控制下的Amuc_1100(Y259A)複本和兩個啟動子BBA_J23110控制下的Amuc_1100(Y259A)複本的菌株CBT4108，G欄代表有三個Amuc_1100(Y259A)複本在啟動子BBA_J23110控制下的菌株CBT4109。
圖4A展示了表現IL-10、IL-22和Amuc_1100組合的EcN染色體譜圖； 圖4B展示了單獨表現、雙基因組合表現、三基因組合表現菌株的生長狀態； 圖4C展示了分泌的IL-10的生物活性； 圖4D展示了分泌的IL-22的生物活性； 圖4E展示了分泌的Amuc_1100的生物活性； 圖中的“標準品(40 μg/mL)”代表Amuc_1100標準品，其濃度為40 μg/mL，“EcN”代表菌株EcN分泌的Amuc_1100，“CBT4080(28.8 μg/mL)”代表菌株CBT4080的Amuc_1100，其濃度為28.8 μg/mL。
圖5展示了添加不同濃度水楊酸鈉繼續培養1-4小時後培養基上清液中IL-10的表現量。
圖6A展示了T細胞移植誘導的小鼠腸炎模型中，使用不同菌株的藥效終點結腸長度的比較結果； 圖6B展示了T細胞移植誘導的小鼠腸炎模型中，使用不同菌株的結腸組織病理切片HE染色結果。
圖7A展示了DSS誘導的小鼠腸炎模型體重變化； 圖7B展示了DSS誘導的小鼠腸炎模型DAI評分； 圖7C展示了DSS誘導的小鼠腸炎模型藥效終點結腸長度。
圖8展示了GvHD動物模型中各實驗組小鼠的存活率。
圖9A展示了SLE動物模型中各實驗組小鼠腎小管損傷情況評分； 圖9B展示了SLE動物模型中各實驗組小鼠血清中抗雙鏈DNA抗體IgG濃度； 圖9C展示了SLE動物模型中各實驗組小鼠尿液中白蛋白濃度； 圖9D展示了SLE動物模型中各實驗組小鼠腎臟組織病理切片PAS染色結果所顯示的腎小球損傷情況。
圖10A展示了CIA動物模型中各實驗組小鼠足墊厚度。 圖10B展示了CIA動物模型中各實驗組小鼠疾病評分。
圖11A展示了哮喘動物模型中各實驗組小鼠的肺泡灌洗液(BALF)中的細胞總數計數結果； 圖11B展示了哮喘動物模型中各實驗組小鼠的肺泡灌洗液(BALF)中的嗜酸性顆粒細胞計數結果； 圖11C展示了哮喘動物模型中各實驗組小鼠的肺泡灌洗液(BALF)中的巨噬細胞計數結果； 圖11D展示了哮喘動物模型中各實驗組小鼠的肺泡灌洗液(BALF)中的中性顆粒細胞計數結果； 圖11E展示了哮喘動物模型中各實驗組小鼠的肺泡灌洗液(BALF)中的淋巴細胞計數結果。
圖12展示了表現Cas9蛋白的pCBT001質體所具有的核苷酸序列(SEQ ID NO: 136)。
圖13展示了pCBT003質體所具有的核苷酸序列(SEQ ID NO: 137)。
圖14展示了pMUT2-kana質體所具有的核苷酸序列(SEQ ID NO: 138)。
圖15展示了pCBT012質體所具有的核苷酸序列(SEQ ID NO: 215)。
圖16展示了pCBT013質體所具有的核苷酸序列(SEQ ID NO:216)。
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Claims (78)

  1. 一種經遺傳修飾的微生物，其包含至少兩種分別編碼選自下組的多肽的外源基因： a)   Amuc_1100多肽； b)   IL-10多肽；以及 c)   IL-22多肽。
  2. 如請求項1所述的經遺傳修飾的微生物，其包含： a)   分別編碼Amuc_1100多肽和IL-10多肽的外源基因； b)   分別編碼IL-10多肽和IL-22多肽的外源基因；或者 c)   分別編碼Amuc_1100多肽和IL-22多肽的外源基因。
  3. 如請求項1所述的經遺傳修飾的微生物，其包含分別編碼Amuc_1100多肽、IL-10多肽和IL-22多肽的外源基因。
  4. 一種經遺傳修飾的微生物，其包含編碼Amuc_1100多肽、IL-10多肽或者IL-22多肽的外源基因。
  5. 如前述任一請求項所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述Amuc_1100多肽是野生型Amuc_1100多肽，或與野生型Amuc_1100多肽在功能上等效的功能等效物。
  6. 如前述任一請求項所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述IL-10多肽是野生型IL-10多肽，或與野生型IL-10多肽在功能上等效的功能等效物。
  7. 如前述任一請求項所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述IL-22多肽是野生型IL-22多肽，或與野生型IL-22多肽在功能上等效的功能等效物。
  8. 如請求項5所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述功能等效物包含野生型Amuc_1100多肽的突變體、片段、融合物、衍生物或其任何組合，並至少部分保留野生型Amuc_1100的一種或多種生物功能，可選地，所述生物功能選自下組：a)調節和/或促進哺乳動物的腸道免疫系統功能，b)維持、恢復和/或增加哺乳動物的腸粘膜屏障的物理完整性，和c)活化TLR2。
  9. 如請求項8所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述野生型Amuc_1100多肽的片段具有： (a)如SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列，或具有與SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列具有至少80%序列一致性的胺基酸序列，或 (b)如SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列具有至少80%序列一致性的胺基酸序列。
  10. 如前述任一請求項所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述Amuc_1100多肽包含SEQ ID NO: 5所示的序列，或包含與SEQ ID NO: 5所示的序列具有至少80%序列一致性且仍保持調節腸道免疫和/或活化toll樣受體2(TLR2)的活性的胺基酸序列。
  11. 如前述任一請求項所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述Amuc_1100多肽在第259位的Y具有突變，所述第259位的編號是基於SEQ ID NO: 5所示序列的編號；優選地，所述Amuc_1100多肽在第259位具有Y259A或Y259S突變，所述第259位的編號是基於SEQ ID NO: 5所示序列的編號。
  12. 如前述任一請求項所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述IL-10多肽包含SEQ ID NO: 11所示的序列，或包含與SEQ ID NO: 11所示序列具有至少80%序列一致性且仍保持調節免疫細胞的活性的胺基酸序列。
  13. 如前述任一請求項所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述IL-22多肽包含SEQ ID NO: 15所示的序列，或包含與SEQ ID NO: 15所示序列具有至少80%序列一致性且仍保持結合IL-22受體並調節IL-22受體表達細胞的活性的胺基酸序列。
  14. 如前述任一項請求項所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述微生物能夠表達和/或分泌所述外源基因編碼的多肽；或者 所述微生物能夠在人或動物的腸道中表達和/或分泌所述外源基因編碼的多肽。
  15. 如前述任一請求項所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述外源基因包含在外源性表現匣中。
  16. 如請求項15所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述外源性表現匣包含在質體中，且所述質體被引入所述微生物中並且適合在所述微生物中表現。
  17. 如請求項15所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述外源性表現匣整合於所述經遺傳修飾的微生物的基因組中。
  18. 如請求項15所述的經遺傳修飾的微生物，其中，所述微生物包含：第一外源性表現匣，其含有編碼Amuc_1100多肽的核苷酸序列，以及第二外源性表現匣，其含有編碼IL-10多肽的核苷酸序列；或者 所述微生物包含：第二外源性表現匣，其含有編碼IL-10多肽的核苷酸序列，以及第三外源性表現匣，其含有編碼IL-22多肽的核苷酸序列；或者 所述微生物包含：第一外源性表現匣，其含有編碼Amuc_1100多肽的核苷酸序列，以及第三外源性表現匣，其含有編碼IL-22多肽的核苷酸序列；或者 所述微生物包含：第一外源性表現匣，其含有編碼Amuc_1100多肽的核苷酸序列，第二外源性表現匣，其含有編碼IL-10多肽的核苷酸序列，以及第三外源性表現匣，其含有編碼IL-22多肽的核苷酸序列；或者 所述微生物包含第一外源性表現匣，其含有編碼Amuc_1100多肽的核苷酸序列；或者 所述微生物包含第二外源性表現匣，其含有編碼IL-10多肽的核苷酸序列；或者 所述微生物包含第三外源性表現匣，其含有編碼IL-22多肽的核苷酸序列。
  19. 如請求項15-18中任一項所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述外源性表現匣在基因組中存在一個或更多個複本(例如兩個、三個、四個、五個或六個等)。
  20. 如前述任一項請求項所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述Amuc_1100多肽、IL-10多肽和/或IL-22多肽是去除了自身信號肽序列的多肽。
  21. 如請求項20所述的經遺傳修飾的微生物，所述Amuc_1100多肽在N端與第一信號肽連接，所述IL-10多肽在N端與第二信號肽連接，和/或所述IL-22多肽在N端與第三信號肽連接，優選地，所述第一信號肽、第二信號肽和/或第三信號肽能夠將所述Amuc_1100多肽、所述IL-10多肽和/或所述IL-22多肽分泌到細胞外。
  22. 如請求項20所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述第一信號肽、第二信號肽、第三信號肽可以相同或不同，可以分別包含選自由SEQ ID NO: 80-122所示序列組成的胺基酸序列，或包含與所述胺基酸序列具有至少80%序列一致性的同源序列； 優選地，其中第一信號肽、第二信號肽、和/或第三信號肽是USP45信號肽，並且所述USP45信號肽具有如SEQ ID NO: 114所示的胺基酸序列或者與SEQ ID NO: 114具有至少80%序列一致性的同源序列。
  23. 如請求項21所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述第一信號肽、第二信號肽、和/或第三信號肽可以透過存在於所述微生物中的分泌系統加工； 特別地，所述分泌系統對於所述微生物是原生或非原生的系統。
  24. 如請求項15至23中任一項所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述外源基因與表現調控元件可操作性連接；優選地，所述表現調控元件包含啟動子，更優選地，所述啟動子選自下組：BBa_J23101、BBa_J23108、BBa_J23110、PfnrS、Psal、Pvan、BBa_J23119、BBa_J23102和BBa_J23114。
  25. 如請求項24所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述表現調控元件包含核糖體結合位址(RBS)，優選地，所述核糖體結合位址的核苷酸序列如SEQ ID NO: 63所示。
  26. 如請求項24或25所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述表現調控元件包含順反子，優選地，所述順反子選自T7g10、BCD2、GFP和螢光素酶。
  27. 如請求項24至26中任一項所述的經遺傳修飾的微生物，其中，所述表現調控元件包含終止子，優選地，所述終止子為rrnB_T1_T7Te終止子，更優選地，所述rrnB_T1_T7Te終止子的序列如SEQ ID NO: 242所示。
  28. 如前述任一請求項所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述經遺傳修飾的微生物進一步包含對所述微生物基因組的一種或多種其它基因改造。
  29. 如請求項28所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述一種或多種其它基因改造包括對分泌系統的基因工程改造和/或優化以使得至少一種外膜蛋白編碼基因被刪除、失活或抑制。
  30. 如請求項29所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述外膜蛋白選自下組：lpp、mrcA、ompT、tolQ、tolR、tolA和pal。
  31. 如請求項29所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述至少一種外膜蛋白包括：lpp、mrcA和/或ompT。
  32. 如請求項29所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述至少一種外膜蛋白為lpp和mrcA。
  33. 如請求項29至32中任一項所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述經遺傳修飾的微生物進一步包含一種或多種過表現的分子伴護蛋白。
  34. 如請求項33所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述分子伴護蛋白選自下組：dsbA、dsbC、dnaK、dnaJ、grpE、groES、groEL、tig、fkpA、surA或上述任意兩種或更多種(例如三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或者十種)分子伴護蛋白的組合。
  35. 如請求項28所述的經遺傳修飾的微生物，所述一種或多種其它基因改造包括至少一個營養缺陷相關基因的失活或缺失。
  36. 如前述任一請求項所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述微生物是一種或多種選自由以下組成的群組的物質的營養缺陷體：尿嘧啶、胸腺嘧啶、二胺基庚二酸、亮胺酸、組胺酸、色胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、腺嘌呤和非野生型胺基酸。
  37. 如請求項36所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述非野生型胺基酸選自由以下組成的群組：l-4,4ʹ-聯苯丙胺酸、對乙醯基-l-苯丙胺酸、對碘-l-苯丙胺酸和對疊氮基-l-苯丙胺酸。
  38. 如前述任一請求項所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述微生物包含細菌、古細菌、真菌或藻類。
  39. 如請求項38所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述真菌包括酵母或絲狀真菌。
  40. 如前述任一請求項所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述微生物包含益生微生物體或非病原性微生物體。
  41. 如請求項40所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述益生微生物體為益生細菌或益生酵母。
  42. 如請求項41所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述益生細菌選自由以下組成的群組：擬桿菌(Bacteroides)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)、梭菌(Clostridium)、埃希氏菌(Escherichia)、乳桿菌(Lactobacillus)和乳球菌(Lactococcus)。
  43. 如請求項42所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述益生細菌屬於埃希氏菌屬。
  44. 如請求項42所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述益生細菌是大腸桿菌(Escherichia coli)Nissle 1917菌株(EcN)。
  45. 如請求項41所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述益生細菌是人類腸道正常存在的細菌。
  46. 如請求項41所述的經遺傳修飾的微生物，其中所述益生酵母選自由以下組成的群組：釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、產朊假絲酵母(Candida utilis)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)和卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)。
  47. 一種經遺傳修飾的微生物的組合，其包含至少兩種(例如兩種、三種或四種等)不同的如請求項1-46中任一項所述的經遺傳修飾的微生物。
  48. 一種包含至少一個重組表現匣的核苷酸序列，其包含i) 至少一種或至少兩種分別編碼Amuc_1100多肽、IL-10肽和/或IL-22多肽的外源基因，以及ii)可操作地連接所述至少一種或至少兩種外源基因的一個或多個調控元件。
  49. 如請求項48所述的核苷酸序列，其包含分別編碼下述多肽的外源基因：a) Amuc_1100多肽和IL-10多肽；b) IL-10多肽和IL-22多肽，或c) Amuc_1100多肽和IL-22多肽。
  50. 如請求項48所述的核苷酸序列，其包含分別編碼Amuc_1100多肽、IL-10多肽和IL-22多肽的外源基因。
  51. 如請求項48所述的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含：第一重組表現匣，所述第一重組表現匣包含編碼Amuc_1100多肽的核苷酸序列，以及與之可操作性連接的一個或多個調控元件；第二重組表現匣，所述第二重組表現匣包含編碼IL-10多肽的核苷酸序列，以及與之可操作性連接的一個或多個調控元件；和/或第三重組表現匣，所述第三重組表現匣包含編碼IL-22多肽的核苷酸序列，以及與之可操作性連接的一個或多個調控元件。
  52. 如請求項51所述的核苷酸序列，其中所述編碼Amuc_1100多肽的核苷酸序列編碼自體信號肽被替換為第一信號肽的Amuc_1100多肽，所述編碼IL-10的核苷酸序列編碼自體信號肽被替換為第二信號肽的IL-10多肽，和/或所述編碼IL-22多肽的核苷酸序列編碼自體信號肽被替換為第三信號肽的IL-22多肽。
  53. 如請求項52所述的核苷酸序列，其中所述第一信號肽、第二信號肽、第三信號肽可以相同或不同，可選地，所述第一信號肽、第二信號肽、和/或第三信號肽是USP45信號肽，並且所述USP45信號肽具有如SEQ ID NO: 114所示的胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 114具有至少80%序列一致性的同源序列。
  54. 如請求項48所述的核苷酸序列，其中所述一個或多個調控元件包含啟動子、核糖體結合位址(RBS)、順反子、終止子或其任何組合。
  55. 如請求項54所述的核苷酸序列，其中， 所述啟動子選自：BBa_J23101、BBa_J23108、BBa_J23110、PfnrS、Psal、Pvan、BBa_J23119、BBa_J23102，或BBa_J23114； 所述核糖體結合位址是合成型，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 63所示； 所述順反子選自下組：T7g10、BCD2、GFP、螢光素酶；和/或 所述終止子為rrnB_T1_T7Te終止子，優選地，所述終止子的序列如SEQ ID NO: 242所示。
  56. 如請求項48所述的核苷酸序列，其中所述重組表現匣適合於在益生細菌或益生酵母中表現。
  57. 如請求項48所述的核苷酸序列，其包含SEQ ID NO: 139-163和235中任一所示的核苷酸序列，或其組合。
  58. 一種組成物，其中所述組成物包含： (a) 作為活性成分的如請求項1-46中任一項所述的經遺傳修飾的微生物或如請求項47所述的經遺傳修飾的微生物的組合；和 (b) 生理學上或藥理學上可接受的載劑。
  59. 如請求項58所述的組成物，其中所述的組成物為藥物組成物。
  60. 如請求項59所述的組成物，其中所述藥物組成物為口服製劑。
  61. 如請求項59所述的組成物，其中所述的藥物組成物為液態製劑、固態製劑或半固態製劑。
  62. 如請求項59所述的組成物，其中所述的藥物組成物的劑型選自下組：粉末劑、散劑、片劑、糖衣劑、膠囊劑、顆粒劑、懸浮劑、溶液劑、糖漿劑、滴劑及舌下含片。
  63. 如請求項60所述的組成物，其中所述的液態製劑選自下組：溶液製品或懸浮液製品。
  64. 如請求項59所述的組成物，其中所述藥物組成物包含1×10 8– 1×10 12CFU的如請求項1-46中任一項所述的經遺傳修飾的微生物或如請求項47所述的經遺傳修飾的微生物的組合。
  65. 如請求項58所述的組成物，其中所述組成物是可食用組成物。
  66. 如請求項58所述的組成物，其中所述組成物是益生菌組成物。
  67. 如請求項58所述的組成物，其中所述組成物是食品增補劑。
  68. 一種如請求項1-46中任一所述的經遺傳修飾的微生物、如請求項47所述的經遺傳修飾的微生物的組合，或如請求項58所述的組成物在用於製備治療或預防發炎性疾病或自體免疫疾病的藥物中的用途。
  69. 如請求項68所述的用途，其中所述的自體免疫疾病選自下組：發炎性腸病、移植物抗宿主病(GvHD)、系統性紅斑狼瘡(SLE)、關節炎、哮喘，或其組合。
  70. 如請求項69所述的用途，其中所述自體免疫疾病包括發炎性腸病包括克隆氏病或潰瘍性結腸炎，和/或所述關節炎包括類風濕性關節炎、骨關節炎、銀屑病性關節炎或青少年特發性關節炎，和/或所述哮喘包括過敏性哮喘或中性顆粒細胞性哮喘。
  71. 一種如請求項1-46中任一項所述的經遺傳修飾的微生物、或如請求項47所述的經遺傳修飾的微生物的組合，或如請求項58-69中任一項所述的組成物在製備用於改善發炎性疾病或自體免疫疾病治療藥物的治療效果的藥物中的用途。
  72. 一種如請求項1-46中任一項所述的經遺傳修飾的微生物的製備方法，其中所述的製備方法包括步驟： 向微生物中引入請求項48-57中任一項所述的核苷酸序列，以使得所述核苷酸序列中的外源基因可以在所述微生物中表現。
  73. 一種在有需要的個體中治療或預防發炎性疾病或自體免疫疾病的方法，其包括： 向所述個體施用有效量的如請求項1-46中任一項所述的經遺傳修飾的微生物、或如請求項47所述的經遺傳修飾的微生物的組合，或如請求項58-69中任一項所述的組成物。
  74. 如請求項73所述的方法，其中所述自體免疫疾病選自下組：發炎性腸病、移植物抗宿主病(GvHD)、系統性紅斑狼瘡、關節炎、哮喘，或其組合。
  75. 如請求項73所述的方法，所述自體免疫疾病包括發炎性腸病包括克隆氏病或潰瘍性結腸炎，和/或所述關節炎包括類風濕性關節炎、骨關節炎、銀屑病性關節炎或青少年特發性關節炎，和/或所述哮喘包括過敏性哮喘或中性顆粒細胞性哮喘。
  76. 一種在正在接受藥物治療的個體中改善藥物治療效果的方法，所述藥物包括治療發炎性疾病或自體免疫疾病的藥物，所述方法包括： 向所述個體施用有效量的如請求項1-46中任一項所述的經遺傳修飾的微生物、或如請求項47所述的經遺傳修飾的微生物的組合，或如請求項58-67中任一項所述的組成物。
  77. 一種經遺傳修飾的微生物在製備用於治療發炎性疾病或自體免疫疾病的藥物中的用途，其中所述的發炎性疾病或自體免疫疾病選自下組：發炎性腸病(IBD)、移植物抗宿主病(GvHD)、系統性紅斑狼瘡(SLE)、關節炎和哮喘； 其中所述經遺傳修飾的微生物包含至少一種、至少兩種或至少三種分別編碼選自下組的多肽的外源基因： a) Amuc_1100多肽； b) IL-10多肽；和 c) IL-22多肽。
  78. 如請求項77所述的用途，其中： (1)所述經遺傳修飾的微生物包含分別編碼Amuc_1100多肽和IL-10多肽的外源基因； (2)所述經遺傳修飾的微生物包含分別編碼IL-10多肽和IL-22多肽的外源基因； (3)所述經遺傳修飾的微生物包含分別編碼Amuc_1100多肽和IL-22多肽的外源基因； (4)所述的經遺傳修飾的微生物包含編碼IL-10多肽的外源基因； (5)所述的經遺傳修飾的微生物包含編碼Amuc_1100多肽的外源基因； (6)所述的經遺傳修飾的微生物包含編碼IL-22多肽的外源基因；或 (7)所述的經遺傳修飾的微生物包含分別編碼Amuc_1100多肽、IL-10多肽和IL-22多肽的外源基因。
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CN110709093A (zh) * 2017-04-17 2020-01-17 加利福尼亚大学董事会 工程化细菌和使用方法
CN110698547B (zh) * 2019-10-31 2023-01-03 南京农业大学 重组表达的阿克曼菌膜蛋白Amuc_1100及其应用
CN110950937B (zh) * 2019-11-25 2021-05-04 安徽大学 一种改造的艾克曼菌Amuc_1100蛋白及其制备方法和应用
WO2021127235A1 (en) * 2019-12-20 2021-06-24 Persephone Biosciences, Inc. Compositions for modulating gut microflora populations, enhancing drug potency and treating cancer, and methods for making and using same
CN113413466B (zh) * 2020-12-15 2022-08-19 和度生物医药(上海)有限公司 用于治疗癌症的amuc_1100和免疫检查点调节剂的组合疗法

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