JP2012528575A - 新規ヘリコバクター・ピロリ株およびその使用 - Google Patents
新規ヘリコバクター・ピロリ株およびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は生物活性物質の送達に有用なヘリコバクター・ピロリ株に関する。特に、本発明は、(a)低病原性、(b)自然に形質転換する能力、および(c)宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニー形成する能力を有するH.ピロリ分離株を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
Description
本発明は生物活性物質の送達に有用であるヘリコバクター・ピロリ株に関する。
共生細菌または弱毒生病原体などの生細菌は、例えば、ワクチン抗原、生物活性分子、またはDNAも含めた、様々な生物活性物質を送達するための魅力的な媒体として表される。細菌性送達媒体に内在する利点は、経口投与、および長期間にわたる化合物の持続放出を含み、それは反復投与の必要性を取り除くものである。
最近の市販のワクチンおよび薬剤は、大部分は非経口的に投与され、複数回の投与を必要とし、かつ医療スタッフおよび低温流通体系に依存している。生細菌性媒体は従来の予防薬および治療薬の代替手段を提供する。それらは経口で送達可能であり、1回の投与だけで十分であって、かつ例えば多重抗原などの大きな分子を送達可能である。さらに、細菌性媒体は大規模な製造および処方設計によく適しており、かつ凍結乾燥しても安定である。これらの特性はこの送達形態を魅力的なものとし、かつ様々なワクチンおよび薬剤に対して、服薬遵守の増加、より優れた分配、および費用削減をもたらし得る。
いくつかの細菌性送達システムは、Shigella spp.(米国特許第7,235,234号)、Salmonella spp.(米国特許出願公開第20090022691号)、およびLactobacillus spp.(米国特許出願公開第20090074734号)を含めた様々な細菌に基づいて提案されてきたが、これらのシステムには多数の問題が内在している。
一般に、細菌は送達媒体としての使用のために必要な特徴を有する株を産生するよう操作される。重要なことは、細菌の安全性プロフィールが確保されなければならないことである。伝統的に、送達媒体として使用される細菌は、病原性が弱いかまたは非病原性となるように弱毒化されてきた。しかしながら、病原性遺伝子は再取得可能であり、結果として細菌は病気を引き起こすことが可能な病原型に戻り得るため、これらの細菌の安全性を確保することは困難である。さらに、細菌株を形質転換または動物モデルにおけるコロニー形成に適するように操作することは、二次的な望ましくない特徴をもたらし、少なくとも実験の妨げとなり、かつ細菌性送達媒体の診療所への移行を遅らせる結果になり得る。例えば、実験がマウスなどの動物において実施可能である株の操作は、株が標的宿主、典型的にはヒトにコロニー形成しない結果になり得る。従って、所望の特徴を有する株を産生するための細菌の操作は、可能であれば避けるべきである。
本発明の発明者は、細菌性送達システムにおけるヘリコバクター・ピロリの使用を以前に提案し(米国特許出願公開第20070134264号)、上記で特定した多数の問題を解決した。しかしながら、米国特許出願公開第20070134264号が細菌性送達媒体としてのH.ピロリの使用に関する豊富な情報を提供しても、特定の特徴を有する特定の細菌株の開発は有益であろう。
第1の態様では、本発明は以下の特徴を有するH.ピロリ分離株を提供する。(a)低病原性、(b)自然に形質転換する能力、および(c)宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニー形成する能力。
H.ピロリは、生物活性物質のためにそれ自身の生細菌性送達媒体としての使用を適切とする固有の特徴を有する。本発明のH.ピロリ株は無症状の個体から分離されて最小の病状を示し、ヒトに使用するための安全な株を提供する。さらに、本発明の株は自然に形質転換可能であり、かつ事前に適応せずにH.ピロリ−マウスモデルにコロニー形成可能である。これは前臨床実験を促進し、かつ株の操作が最小限であり、ヒトに対して結果の正確、直接な翻訳を可能とすることを意味する。従って、本発明のH.ピロリ株は生細菌性送達媒体としての使用において大変適している。
いくつかの実施形態では、本発明のH.ピロリは哺乳類対象において慢性感染を引き起こすことが可能である。
いくつかの実施形態では、本発明のH.ピロリ株は、例えば、vacA s1またはcagAなどの1以上の機能性の病原性因子を発現しない。
第2の態様では、本発明はH.ピロリ分離株を提供し、それは、
(i)vacA s1もしくはcagA陰性、または
(ii)vacA s2およびcagA陽性、のどちらかであり、
前記H.ピロリ株は、
(a)低病原性、
(b)自然に形質転換する能力、および
(c)宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニー形成する能力、を有する。
(i)vacA s1もしくはcagA陰性、または
(ii)vacA s2およびcagA陽性、のどちらかであり、
前記H.ピロリ株は、
(a)低病原性、
(b)自然に形質転換する能力、および
(c)宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニー形成する能力、を有する。
いくつかの実施形態では、本発明は、受入番号第V09/009101号にてNational Measurement Instituteに寄託されたOND737、受入番号第V09/009102号にてNational Measurement Instituteに寄託されたOND738、受入番号第V09/009103号にてNational Measurement Instituteに寄託されたOND739、受入番号第V10/014059号にてNational Measurement Instituteに寄託されたOND248、受入番号第V10/014060号にてNational Measurement Instituteに寄託されたOND256、受入番号第V09/009104号にてNational Measurement Instituteに寄託されたOND740、または上述したように定義された能力を有するそれらの変異体もしくは誘導体から成る群より選択される株の特徴を有するH.ピロリ株を提供する。
第3の態様では、本発明は、受入番号第V09/009101号にてNational Measurement Instituteに寄託されたH.ピロリ株OND737を提供する。
第4の態様では、本発明は、受入番号第V09/009102号にてNational Measurement Instituteに寄託されたH.ピロリ株OND738を提供する。
第5の態様では、本発明は、受入番号第V09/009103号にてNational Measurement Instituteに寄託されたH.ピロリ株OND739を提供する。
第6の態様では、本発明は、受入番号第V09/009104号にてNational Measurement Instituteに寄託されたH.ピロリ株OND740を提供する。
第7の態様では、本発明は、受入番号第V10/014059号にてNational Measurement Instituteに寄託されたH.ピロリ株OND248を提供する。
第8の態様では、本発明は、受入番号第V10/014060号にてNational Measurement Instituteに寄託されたH.ピロリ株OND256を提供する。
H.ピロリ分離株は形質転換されることで、対象遺伝子(gene of interest)を発現する組換え株を産生し得る。いくつかの実施形態では、対象遺伝子は核酸によってコードされ、それは単離された形態で得られることが好ましい。本発明の単離された核酸分子は、cDNA、ゲノムDNA、RNA、またはそれらのハイブリッド分子であり得ることが当業者に理解されよう。好ましくは、単離された核酸はcDNAである。
好ましくは、単離された核酸は組換え株のゲノムに組み込まれる。
単離された核酸は、H.ピロリに相同または非相同的なポリペプチドをコードし得る。
いくつかの態様では、単離された核酸は、抗原などの生物活性物質、有機分子、例えば遺伝子産物もしくは遺伝子配列(単離された核酸)などの治療薬または予防薬などの薬物をコードする。
特異的、非保護的な循環抗体および長期持続性の存在などのH.ピロリ感染における固有の特徴は、H.ピロリがワクチン抗原の送達に特に有用であることを意味する。従って、いくつかの実施形態では、本発明は対象抗原を発現する組み換えH.ピロリ株の投与によって、個体において抗体反応を誘導する方法を提供する。
第9の態様では、本発明は生体内において生物活性物質の送達に適したH.ピロリ株を特定する方法を提供する。それは、(a)H.ピロリ感染のために、H.ピロリ株を無症状の個体から分離すること、(b)株が自然に形質転換する能力を有するかどうかを決定すること、および(c)株が宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニー形成する能力を有しているかどうかを決定することを含む。自然に形質転換する能力および宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニー形成する能力を有する株は、生体内における生物活性物質の送達に適している。
第11の態様では、本発明はヘリコバクター感染における最適化された動物モデルを提供する。動物はカゼインが豊富な餌および/または酸性水を与えられているため、カゼインが豊富な餌および/または酸性水が与えられていない動物と比較して、ヘリコバクター種のコロニー形成は強化され得る。
いくつかの実施形態では、動物はカゼインが豊富な餌および酸性水の両方が与えられており、水は約pH2である。いくつかの実施形態では、動物はマウスである。
第12の態様では、本発明はヘリコバクター種を特定するためのランダム増幅多型DNAポリメラーゼ連鎖反応の使用を提供する。
いくつかの実施形態では、ヘリコバクターDNAは、SEQ ID NO:1に示される配列を有するフォワードプライマーおよびSEQ ID NO:2に示される配列を有するリバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される。
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の例示された方法に限定されず、かつ当然ながら変化し得ることが理解される。また、本明細書において使用される用語は本発明の特定の実施形態を説明する目的のためにのみ使用され、かつ限定することを意図せず、それは添付の特許請求の範囲によってのみ限定され得ることが理解される。
本明細書において引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、本明細書の前後を問わず、その全体が本明細書において参照により援用される。しかしながら、本明細書において言及される刊行物は、刊行物において報告される手順、試薬、およびベクターの説明および開示の目的のために引用され、それは本発明と関連して使用され得る。本発明は先の発明の存在によって、このような刊行物に先行する権利を有しないものと解釈されてはならない。
さらに、本発明の実施には、特に指示がない限り、当業者の技能の範囲内で、従来の微生物学、免疫学および分子生物学の技術、ならびに薬理学を使用する。このような技術は当業者に周知であり、文献において十分に説明されている。例えば、Prescottらの「Microbiology」(1999年)第4版、WCB McGraw−Hill;Sambrookらの「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」(1989年)(2001年)第2版および第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press;およびRoittらの「Immunology」(1998年)、第5版、Mosbyを参照のこと。
本明細書および添付の請求の範囲において用いられる単数形「a」、「an」および「the」は、文脈から明らかにそうでないことが示されていなければ、複数のものを含むことに留意する必要がある。従って、例えば、「核酸」への言及は複数のそのような核酸を含み、かつ「分離された株」への言及は1以上の株への言及等である。別段の規定がない限りは、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるそれらと類似または同等のあらゆる材料および方法は、本発明を実施または試験するために使用可能であり、好ましい材料および方法をこれから記載する。
後の特許請求の範囲および本発明の前述の説明では、文脈から言語または必要な意味を表すために別に要求される場合を除いて、用語「含む(comprise)」または「含む(comrises)もしくは「含まれている(comprising)」などの変形は、包括的に、すなわち、述べられた特徴の存在を明細書に含めるために使用されるが、本発明の種々の実施形態におけるさらなる特徴の存在または追加を排除するために使用されるものではない。
本明細書で用いられる用語「から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用されるとき、組み合わせに対するあらゆる本質的な意義の他の要素を排除することを意味するものとする。従って、本明細書において定義される要素から本質的になる組成物は、分離および精製の方法からの微量汚染物質、およびリン酸緩衝食塩水、防腐剤などの薬学的に受容可能なキャリアを排除するものではない。「からなる」は、その他の成分の微量元素および本発明の組成物を投与するための多くの方法段階を超えるものは排除されることを意味するものとする。これらの変化する用語のそれぞれから定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
本発明は生細菌性送達媒体として有用なヘリコバクター・ピロリ株に関する。これらの株の重要な特徴は、それらの低病原性にある。用語「低病原性」は無症状、すなわち消化性潰瘍または胃癌を引き起こさず、かつ胃粘膜における最小の病状、すなわち胃上皮の萎縮、リンパ球浸潤、または顆粒球浸潤がわずかに存在するかまたは存在しない病状を引き起こす、感染を確立することが可能なH.ピロリ株を指す。
いくつかの実施形態では、本発明のヘリコバクター・ピロリ株は1以上の機能性の病原性因子を発現しない。病原性遺伝子によってコードされる病原性因子は、上皮細胞に損傷を与えることによる粘膜防壁の破壊、および消化性潰瘍および胃癌を含む明らかな疾患を引き起こす。例えば、病原性遺伝子のvacA s1は細胞空胞化毒素をコードし、一方で、病原性遺伝子のcagAはIV型分泌を介して宿主細胞に注入される毒素をコードする。特定の実施形態では、本発明の株はvacA s1またはcagAのどちらかが欠損している、すなわち機能性のvacA s1またはcagAのどちらかを発現しない。特定の仮説になんら束縛されるものではないが、これらの病原性因子の両方が病原性に必要とされるようである。
細菌性輸送手段は低病原性を有することが重要な一方で、それらが慢性感染を引き起こすことも望まれる。用語「慢性感染」は、6ヶ月以上継続する感染を指す。そのため、いくつかの実施形態では、本発明のH.ピロリ株は哺乳類対象において慢性感染を引き起こす能力を有し得る。
本明細書において用いられる用語「哺乳類対象」は、ヒト、霊長類、ウマ科の動物、イヌ科の動物、またはネコ科の動物を指す。
また、本発明のH.ピロリ株は自然に形質転換する能力を有する。用語「自然に形質転換する」、「自然形質転換」、およびそれらの文法的に同等なものは、自然界において通常発生しない、例えばエレクトロポレーションなどの条件を用いずに、実験室条件における外来性DNAの取り込み、ゲノムへの組み込み、および発現から生じる細胞の遺伝子変異を指す。この特徴は生物活性物質をコードする対象遺伝子の細菌ゲノムへの組み込み、および「組換株」の産生を促進する。
また、本発明のH.ピロリ株は事前に宿主適応せずに、マウスに感染およびコロニー形成する能力を有する。ヒトから採取された細菌は、必ずしもマウスなどの異なる種を感染させるというわけではない。従って、宿主適応は、マウスモデルにおける実験が始まる前によく要求される。マウスの宿主適応は、一般に、宿主適応変異株を産生するためにマウス間で細胞を継代することを含む。さらに、一旦実験がマウスにおいて完結すると、株は次にヒトに感染およびコロニー形成し得ず、それはさらなる操作が要求される結果となる。従って、宿主適応を行わずにマウスに感染可能なヒトからのH.ピロリ分離株の使用は、H.ピロリに対する操作を限定し、株のヒトへの直接の翻訳を可能とする。
本発明の発明者は上述した細菌性輸送媒体の望ましい特徴を有するH.ピロリの臨床分離株の非排他的な例を特定した。特定されたH.ピロリ株を、ブダペスト条約に従って、National Measurement Institute(NMI),1/153 Bertie Street,Port Melbourne,Victoria,Australiaに、2009年4月22日(OND737、OND738、OND739、およびOND740)、ならびに2010年5月28日(OND248およびOND256)に寄託した。H.ピロリ株には、以下の受入番号が割り当てられた。V09/009101(OND737)、V09/009102(OND738)、V09/009103(OND739)、V09/009104(OND740)、V10/014059(OND248)、およびV10/014060(OND256)。
また、本発明は、H.ピロリ株のOND737、OND738、OND739、OND740、OND248、およびOND256の変異体または誘導体も検討する。本明細書において用いられる用語「変異体」または「誘導体」は、H.ピロリ株のOND737、OND738、OND739、OND740、OND248、およびOND256と、少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約90%、および最も好ましくは少なくとも約95%同一のゲノムDNAを有し、かつ本明細書に記載の株の特徴と一致する細菌を指す。
本発明のH.ピロリ株は、生物活性物質を送達するために使用され得る。生細菌性送達媒体は、生物活性物質をコードする遺伝子(geneまたはgenes)を発現することによって生物活性物質を送達する。一般に、対象遺伝子は核酸によってコードされ、それは単離された形態で得られることが好ましい。本発明の単離された核酸分子は、cDNA、ゲノムDNA、RNA、またはそれらのハイブリッド分子であり得ることが当業者に理解されるであろう。好ましくは、単離された核酸はcDNAである。
本明細書において用いられる用語「単離された核酸」は核酸であり、その構造は、あらゆる天然型の核酸、または3つを超える別々の遺伝子にまたがる天然型のゲノム核酸のいかなる断片とも同一ではない。従って、用語は、例えば(a)天然型ゲノムDNA分子の一部の配列を有するが、天然型の生物ゲノムにおける分子の一部に隣接(flank)するコード配列の両方に隣接しないDNA分子、(b)結果的に生じる分子がいかなる天然型のベクターまたはゲノムDNAとも同一にならないように、原核生物または真核生物のベクターもしくはゲノムDNAに組み込まれる核酸、(c)cDNA、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって産生される断片、または制限断片などの別々の分子、および(d)ハイブリッド遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列、を網羅する。核酸を単離するための方法は当業者に周知である。
単離された核酸は相同または非相同であり得る。しかしながら、一般に、単離された核酸は非相同であり得る、すなわち、H.ピロリによって、もしくは細菌への導入の前に、またはそれらの祖先によってまったく発現されない。
いくつかの実施形態では、単離された核酸は生物活性物質をコードする。本発明の方法は様々な生物活性物質を送達するために使用可能であることが、当業者に理解され得る。適した薬剤の例としては、例えば局所または全身の代謝に影響を与える内分泌活性をもたらすことが可能な薬剤、および/または、免疫/造血システムに属する細胞の活性を制御可能な薬剤、および/または体内の様々な正常細胞または新生細胞における生存率、成長、および分化に影響を与え、または損傷および感染に対する急性期炎症反応における免疫の制御または誘導に影響を与えることが可能な薬剤、および/またはそれらの標的細胞受容体に作用するケモカインによって仲介される細胞および組織の感染に対する抵抗、または上皮細胞の増殖、または創傷治癒の促進を、増強または誘導することが可能である薬剤、および/、または体内での細胞による物質の発現または産生を調節する薬剤などの、局所的または体系的に機能させることが可能なものが挙げられる。
このような生物活性物質の特定の実施形態には、インスリン、成長ホルモン、プロラクチン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン、血管作動性腸管ポリペプチド、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、GM−CSF、M−CSF、SCF、IFN−γ、EPO、G−CSF、LIF、OSM、CNTF、GH、PRL、またはIFN α/βなどの逆平行4αヘリックス束構造を取る構造群1サイトカイン、しばしば細胞表面結合性であり、対称性ホモトリマーを形成し、サブユニットがサイトカインの腫瘍壊死因子(TNF)ファミリー、例えばTNFα、TNFβ、CD40、CD27もしくはFASリガンド、サイトカインのIL−1ファミリー、線維芽細胞成長因子ファミリー、血小板由来成長因子、形質転換成長因子β、および神経成長因子などの特定のウイルスコートタンパク質について記載されたβ−ジェリーロールの構造を取る構造群2サイトカイン、各々が細胞外領域において少なくとも1つの上皮成長因子(EGF)ドメインを含む大きな膜貫通型前駆体分子として生産される短鎖α/β分子、例えば、サイトカインのEGFファミリー、保存されたシステイン残基の周辺でグループ化されたアミノ酸配列を持つことを特徴とするケモカイン(C−CもしくはC−X−Cケモカインサブグループ)、またはインスリン関連サイトカインを含む構造群3サイトカイン、例えばEGF、免疫グロブリン様およびクリングルドメインなどの異なるドメインからなるヘレグリンまたはニューレグリンなどのモザイク構造を示す構造群4サイトカインが含まれる。
あるいは、生物活性物質は上記で定義した生物活性物質に対する受容体または拮抗薬であり得る。
従って、本発明は、薬学的用途のため、例えばヒトまたは動物の治療法、特に予防法(ワクチン接種)における使用のために、生物活性物質を発現する組換えH.ピロリ株を提供する。
特異的、非保護的な循環抗体および長期持続性の存在などのH.ピロリ感染の固有の特徴は、H.ピロリがワクチン抗原の送達および個人における抗体反応の誘導に特に有用であることを意味している。従って、特定の実施形態では、本発明は抗原を発現する組み換えH.ピロリ株、および細菌を個体に投与することによって個体における抗体反応を誘導する方法を提供する。「抗体反応」は、組換え細菌によって発現された対象抗原に対する特異的な抗体の誘導を指す。
生物活性物質をコードする単離された核酸は、当技術分野で周知のあらゆる方法によってH.ピロリ株のゲノムに組み込まれ得る。例えば、発現ベクターおよび/またはベクタープラスミドは、単離された核酸の形態の対象遺伝子を細菌染色体に挿入するために使用され得る。好ましい実施形態では、単離された核酸は、自然形質転換および相同組換えによって、細菌染色体に組み込まれ得る。例えば、5−15μlのTE緩衝液中に抗生物質マーカーまたは変異rpsL対立遺伝子(Dailidieneら、(2006年)「Contraselectable streptomycin susceptibility determinant for genetic manipulation and analysis of Helicobacter pylori」 Appl Environ Microbiol,72,5908−5914)を含む、0.3−2μgのDNA断片を、H.ピロリ培養物に加えて混合する。その後、細菌をガス室において24時間インキュベートする。DNA処理細胞を回収し、カナマイシン(10μg/ml)、クロラムフェニコール(10μg/ml)、ストレプトマイシン(10μg/ml)、およびエリスロマイシン(10μg/ml)が添加された選択血液寒天培地に蒔く。細菌の成長は、形質転換が成功したことを示す。
また、本発明は細菌性送達媒体としての使用に適したH.ピロリ株を特定する方法を提供する。該方法の第1段階は、H.ピロリ感染のために、H.ピロリ株を無症状の個体から単離することを含む。好ましくは、個体は少なくとも50歳であり、H.ピロリ感染に対して無症状であり、かつ胃上皮の萎縮を示さないかわずかに示す。その後、単離された株は、株が自然に形質転換する能力を有するかどうか、かつ宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニーを形成する能力を有するかどうかを決定するために試験され得る。自然に形質転換可能かつ宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニー形成可能である単離された株は、細菌性送達媒体としての使用、および生体内における生物活性物質の送達に適していると指定され得る。
本発明は以下の限定されない実施例のみを参照してさらに説明される。しなしながら、以下の実施例は例示性を示すのみであり、決して上述の本発明の一般性を制限するものとして見なされるべきではないことが理解されるべきである。
臨床株の分離
23個のH.ピロリ臨床分離株を、スウェーデンのKarolinska Instituteから入手し、50個のH.ピロリ臨床分離株を、西オーストラリア州のSir Charles Gardiner Hospitalから入手した。臨床分離株をグリセロールストックから起こし、ガス制御室内で6つの抗生物質選択血液寒天培地(バンコマイシン 10μg/ml、乳酸トリメトプリム μg/ml、ポリミキシンB 2500IU/L、アンホテリシンB 2.5μg/ml)で成長させた。24時間の成長の後、細菌をプレートから採取し、BHIB(Oxoid社)中で再懸濁させた。細菌をプレートから直接収集し、光学濃度を600nm(OD600)で測定して、1ml当たり約1×109の細菌を得た。株の遺伝子型決定は以前に説明したように実施した(Tiwariら、(2007年)「A simple multiplex PCR assay for diagnosing virulent Helicobacter pylori infection in human gastric biopsy specimens from subjects with gastric carcinoma and other gastro−duodenal diseases」J Appl Microbiol,103,2353−2360)。
23個のH.ピロリ臨床分離株を、スウェーデンのKarolinska Instituteから入手し、50個のH.ピロリ臨床分離株を、西オーストラリア州のSir Charles Gardiner Hospitalから入手した。臨床分離株をグリセロールストックから起こし、ガス制御室内で6つの抗生物質選択血液寒天培地(バンコマイシン 10μg/ml、乳酸トリメトプリム μg/ml、ポリミキシンB 2500IU/L、アンホテリシンB 2.5μg/ml)で成長させた。24時間の成長の後、細菌をプレートから採取し、BHIB(Oxoid社)中で再懸濁させた。細菌をプレートから直接収集し、光学濃度を600nm(OD600)で測定して、1ml当たり約1×109の細菌を得た。株の遺伝子型決定は以前に説明したように実施した(Tiwariら、(2007年)「A simple multiplex PCR assay for diagnosing virulent Helicobacter pylori infection in human gastric biopsy specimens from subjects with gastric carcinoma and other gastro−duodenal diseases」J Appl Microbiol,103,2353−2360)。
全ての臨床分離株を、DNAを取り出して相同組換えによってDNAをそれらのゲノムに組み込むそれらの能力のために、スクリーニングした。H.ピロリ臨床分離株をグリセロールストックから選択寒天培地に接種した。プレートを、2つのCampygenキットガスパックを含むガス制御室において、2−4日間37℃でインキュベートした。細菌を継代培養し、新たなプレートに再度蒔いた。プレートを37℃にて18−20時間室内でさらにインキュベートし、単一コロニーをDENT(Oxoid社、SR0147)が添加された新たなプレートに蒔いた。プレートをCO2インキュベータ中で5時間インキュベートした。次に、5−15μlのTE緩衝液中に抗生物質マーカーまたは変異rpsL対立遺伝子(Dailidieneら、(2006年)「Contraselectable streptomycin susceptibility determinant for genetic manipulation and analysis of Helicobacter pylori」 Appl Environ Microbiol,72,5908−5914)を含む、0.3−2μgのDNA断片を、H.ピロリ株に加えて混合した。細菌をガス室内でさらに24時間インキュベートした。DNA処理細胞を回収し、カナマイシン(10μg/ml)、クロラムフェニコール(10μg/ml)、ストレプトマイシン(10μg/ml)、およびエリスロマイシン(10μg/ml)が添加された選択血液寒天培地に蒔いてインキュベートした。細菌の成長を形質転換後に決定した。
図1は自然に形質転換することが可能で、かつ抗生物質耐性となった株の頻度を示している。スクリーニングした73個の株のうち、約60%(42/73)、Karolinska(K)Instituteからの14株、およびSCGH(H)からの28株が、それらの抗生物質耐性の表現型に基づいて、DNAを有した自然形質転換性であると特定された。次いで、これらの株をそれらのコロニー形成能のために、マウスモデルにおいて生体内で試験した(実施例2)。
H.ピロリ DBA/2Jマウスモデルにおいて胃にコロニー形成する臨床分離株の特定
実施例1(図1)で特定された42個の臨床分離株の、DBA/2Jマウスモデルにおいて胃粘膜にコロニー形成するそれらの能力を試験した。
実施例1(図1)で特定された42個の臨床分離株の、DBA/2Jマウスモデルにおいて胃粘膜にコロニー形成するそれらの能力を試験した。
6−8週齢の雌のDBA/2Jマウスモデルを、オーストラリアのAnimal Resources Centreから購入した。全てのマウスはH.ピロリフリーであり、実験の開始前に2週間の順化期間が認められた。動物は、特別の定めのない限り、酸性水および標準(魚粉ベース)の囓歯類飼料を自由に与えた。いくつかの実験では、動物に、菜食(魚粉フリー)、または準合成のカゼインが豊富なタンパク質飼料、および中性(非酸性の)飲料水を与えた。飼料は西オーストラリア州のSpecialty Feeds社から供給された。全ての実験研究は、承認RA 3/100/676を受けて、the University of Western Australia Animal Ethics Committeeによって承認されている。
マウス(n=3)をBHIB中で1×109CFU/mlの細菌を用いて攻撃した。コロニー形成のレベルを決定するために、胃組織を攻撃から4または24週間後のどちらかに動物から収集した。胃を大弯に沿って切開し、残留した餌をPBSを用いて穏やかに洗浄して除去した。開いた胃を500μlのPBSに入れて、振動数30にて30秒間5mmのステンレス鋼ビーズを用いて均質化した(Qiagen TissueLyser II)。サンプルを振動数10にて2分間さらに均質化した。ホモジネートの段階希釈を、アンホテリシンB(8μg/ml)、トリメトプリム(5μg/ml)およびバンコマイシン(6μg/ml)、ナリジクス酸(10μg/ml)、ポリミキシンB(10μg/ml)、およびバシトラシン(200μg/ml)が添加されたBHI寒天培地に蒔いた。プレートを2つのCampygenキットガスパック(Oxoid社、CN0025A)を含むガス制御室におき、37℃でインキュベートした。細菌成長を蒔いてから5−7日後に決定した。
自然形質転換性であると特定された42株のうち、たった15株がDBA/2JH.ピロリマウスモデルにおけるコロニー形成に成功することが可能であった(図2)。供給源からの予備実験結果を表1にまとめた。最良のコロニー形成株を特定し、生体内でのコロニー形成の強さおよび感染頻度をさらに実証した。
形質転換性のコロニー形成H.ピロリ臨床分離株の概要
感染の強さおよび頻度
実施例2においてマウスモデルにコロニー形成した15個の株の強さをさらに調査するために、より多くの動物数を用いたより多くの実験を実施した。これは真の生着菌である臨床分離株の選択を可能とした。自然に形質転換可能であり、かつマウスの胃粘膜にコロニー形成可能と上記で特定された各株に対して複数回の実験を行った。つまり、マウス(n=10−12)を1×109CFU/mlの細菌を用いて攻撃した。4週間後、細菌をマウスの胃組織から培養して定量した。
実施例2においてマウスモデルにコロニー形成した15個の株の強さをさらに調査するために、より多くの動物数を用いたより多くの実験を実施した。これは真の生着菌である臨床分離株の選択を可能とした。自然に形質転換可能であり、かつマウスの胃粘膜にコロニー形成可能と上記で特定された各株に対して複数回の実験を行った。つまり、マウス(n=10−12)を1×109CFU/mlの細菌を用いて攻撃した。4週間後、細菌をマウスの胃組織から培養して定量した。
その結果、予備の生体内スクリーニングにおいて特定された5株(K6、K8、Kl8、H27、およびH40)は、マウスの胃粘膜において強い生着菌である一方で、残りの10株は弱い生着菌であることが示された。SCGH臨床分離株が弱くて不整合なコロニー形成結果を示したので、2回目の実験後に終了した(図3)。また、SCGH株はKarolinska Instituteからの供給された株と比較してよりゆっくりと成長した。これらの差異は、個々の場所での培養および貯蔵の技術の差異に起因するものであろう。
DBA/2Jマウスモデルにおける長期コロニー形成
H.ピロリ株による慢性感染を確立する能力について、長期コロニー形成実験を実施することによって取り組んだ。初回(1回目)のコロニー形成データに基づいて、最も強いコロニー形成臨床分離株と最も弱いコロニー形成臨床分離株の選択物を試験した。実施例2において購入および扱ったマウス(n=4−6)を、1×109CFU/mlのコロニー形成H.ピロリ株(K6、K8、K11、K18、H27、およびH41)、ならびに非コロニー形成株(K12、K14、K16、K17、H23、およびH44)を用いて経口攻撃した。経口攻撃から6ヵ月後、上述の実施例において説明したように、細菌をマウスの胃組織から収集して培養し、定量した。強い生着菌株;K6、K8、K18、およびH27は、約50%の動物をなお感染させることが可能であった(図4)。予想通り、非コロニー形成株に感染したマウスはコロニー形成せず、弱いコロニー形成株K11およびH41は、長期の間マウスの胃粘膜にコロニー形成することは不可能であった。これは、異なる株はマウスの胃にコロニー形成するための異なる能力を有していることを示しており、ここに私たちは宿主適応せずにコロニー形成可能である少なくとも4つの株を特定した。
H.ピロリ株による慢性感染を確立する能力について、長期コロニー形成実験を実施することによって取り組んだ。初回(1回目)のコロニー形成データに基づいて、最も強いコロニー形成臨床分離株と最も弱いコロニー形成臨床分離株の選択物を試験した。実施例2において購入および扱ったマウス(n=4−6)を、1×109CFU/mlのコロニー形成H.ピロリ株(K6、K8、K11、K18、H27、およびH41)、ならびに非コロニー形成株(K12、K14、K16、K17、H23、およびH44)を用いて経口攻撃した。経口攻撃から6ヵ月後、上述の実施例において説明したように、細菌をマウスの胃組織から収集して培養し、定量した。強い生着菌株;K6、K8、K18、およびH27は、約50%の動物をなお感染させることが可能であった(図4)。予想通り、非コロニー形成株に感染したマウスはコロニー形成せず、弱いコロニー形成株K11およびH41は、長期の間マウスの胃粘膜にコロニー形成することは不可能であった。これは、異なる株はマウスの胃にコロニー形成するための異なる能力を有していることを示しており、ここに私たちは宿主適応せずにコロニー形成可能である少なくとも4つの株を特定した。
コロニー形成H.ピロリ臨床分離株の免疫原性
次に、私たちは生体内マウスモデルにおいて特定されたコロニー形成H.ピロリ株の免疫原性を決定し、かつそれらを非コロニー形成株と比較した。H.ピロリ臨床分離株を、DBA/2Jマウスモデルにおける経口攻撃から3ヶ月後に、それらの特異的IgG抗体反応を誘導する能力に対して試験した。マウス(n=5)を、1×109CFU/mlのコロニー形成H.ピロリ株(K6、K8、K11、K18、H27、およびH41)、ならびに非コロニー形成株(K12、K14、K16、K17、H23、およびH44)を用いて経口攻撃した。感染から3か月後、動物を出血させ、血清を回収し、かつH.ピロリ特異的IgG抗体をELISAによって測定した。
次に、私たちは生体内マウスモデルにおいて特定されたコロニー形成H.ピロリ株の免疫原性を決定し、かつそれらを非コロニー形成株と比較した。H.ピロリ臨床分離株を、DBA/2Jマウスモデルにおける経口攻撃から3ヶ月後に、それらの特異的IgG抗体反応を誘導する能力に対して試験した。マウス(n=5)を、1×109CFU/mlのコロニー形成H.ピロリ株(K6、K8、K11、K18、H27、およびH41)、ならびに非コロニー形成株(K12、K14、K16、K17、H23、およびH44)を用いて経口攻撃した。感染から3か月後、動物を出血させ、血清を回収し、かつH.ピロリ特異的IgG抗体をELISAによって測定した。
96ウェルプレート(Nunc社 Maxisorb(登録商標))を10μg/mlのH.ピロリX47細胞溶解物で被覆し、4℃で一晩インキュベートした。その後、プレートをPBS/0.05%のTween(登録商標)20で5回洗浄し、37℃で2時間2%のBSAでブロックした。プレートを2回洗浄し、血清サンプル(1/20希釈)をウェルに加え、二つ組で行った。その後、プレートを室温(RT)にて1時間インキュベートし、次いで洗浄し、検出抗体(アルカリホスファターゼと結合する抗−マウスIgG、1/1000、Sigma社)を加えた。さらに、プレートを室温で1時間インキュベートし、その後洗浄した。プレートを40分間p−NPPを用いて作成し、その後反応を2MのNaOHで停止させた。光学濃度値を405nmで測定することで抗体力価を示した。
その結果、2つの最も強い生着菌株であるK6およびK8が、最も免疫原性が高いことを示した(図5)。臨床分離株、K11、K18、H27、およびH41は極めて免疫原性が低かった。興味深いことに、臨床分離株H44は、マウスモデルに感染してから4週間後に胃粘膜にコロニー形成することが不可能であるにもかかわらず、経口攻撃から3か月後に強いH.ピロリ特異的IgG反応を示した。それはこの株が実験の進行中における早い時期にマウスに一時的に感染し得ることが示唆される。
さらなる分析では、H.ピロリ特異的IgG抗体を、コロニー形成株を用いて攻撃されたマウスにおいて最大で5か月まで測定した。その結果、K6およびK8の株は、攻撃から最大で5か月後まで、最も強くかつ最も持続的なH.ピロリ特異的抗体反応を誘導することが示された(図6)。これらのデータは、K6およびK8の株が最も免疫原性が高い一方で、K11、K18、H27、およびH41は免疫原性が低いという観察結果を支持している。
H.ピロリC57BL/6マウスモデルにおいて胃にコロニー形成する臨床分離株の特定
候補H.ピロリ株をDBA/2マウスモデルにおけるスクリーニング(実施例2)において見落としていないことを確保するために、私たちはC57BL/6マウスモデルのスクリーニングを再検討した。これは臨床分離株による感染に対して非許容的である。
候補H.ピロリ株をDBA/2マウスモデルにおけるスクリーニング(実施例2)において見落としていないことを確保するために、私たちはC57BL/6マウスモデルのスクリーニングを再検討した。これは臨床分離株による感染に対して非許容的である。
6−8週齢の雌のC57BL/6マウスをオーストラリアのAnimal Resources Centreから購入した。全てのマウスはH.ピロリフリーであり、実験の開始前に2種間の順化期間が認められた。動物は、特別の定めのない限り、酸性水および標準(魚粉ベース)の囓歯類飼料を自由に与えた。いくつかの実験では、動物に、菜食(魚粉フリー)、または準合成のカゼインが豊富なタンパク質飼料、および中性(非酸性の)飲料水を与えた。飼料は西オーストラリア州のSpecialty Feeds社から供給された。全ての実験研究は、承認RA 3/100/676を受けて、the University of Western Australia Animal Ethics Committeeによって承認されている。
実施例1によって特定された14個の形質転換性H.ピロリ株を、実施例2において使用されたものと同様の手順によってコロニー形成を試験した。私たちは、C57BL/6マウスモデルにおいてコロニー形成に成功したさらなる株K4を特定し、かつ第2の株のK12も、この株のコロニー形成は極めて弱いが検出した(図7)。また、K8株も本モデルにおいて弱い生着菌として発見した。全ての残りのH.ピロリ臨床分離株はC57BL/6マウスにおいてコロニー形成不可能であった。
H.ピロリマウスモデルの最適化
モデルマウスがH.ピロリに対して自然宿主ではなく、かつ本モデルにおいて感染の確立は難しいところもあるので、私たちは、生体内におけるH.ピロリ株のコロニー形成を向上させるために、餌および水を含めた飼料における改良を試験してマウスモデルを最適化することを設定した。
モデルマウスがH.ピロリに対して自然宿主ではなく、かつ本モデルにおいて感染の確立は難しいところもあるので、私たちは、生体内におけるH.ピロリ株のコロニー形成を向上させるために、餌および水を含めた飼料における改良を試験してマウスモデルを最適化することを設定した。
初めに、私たちは標準魚粉ベース飼料、菜食(非魚粉)、および準合成のカゼインが豊富なタンパク質飼料(93G)を含む異なる飼料を比較した。次に、私たちは酸性(pH2.5)対中性(pH6)の飲料水の効果を評価した。これらの手法を試験することで、どれがX47研究室株を用いたC57BL/6およびDBA/2マウスモデルにおけるコロニー形成の改善をもたらすかを決定した。
その結果、標準魚粉飼料と比較すると、カゼインが豊富な93Gの飼料(Specialty Feeds社、西オーストラリア州)が与えられたマウスにおいてH.ピロリによる改善されたコロニー形成が示された(表2)。菜食(魚粉フリー)の飼料はコロニー形成においていかなる改善も示さなかった(データ非表示)。準合成のカゼインが豊富な飼料を使用することで、マウスにおけるH.ピロリコロニー形成の比率を増加させ、改善したマウスモデルをもたらした。興味深いことに、標準酸性水(pH2)から中性水(pH6)へ飲料水を変更することで胃における細菌量が減少し、モデルに対して悪影響を及ぼした(表2)。実際、酸性水の使用は、マウスの胃においてその他の細菌の存在を抑制する可能性が高いため、マウスにとってより好ましかった。その後の生体内におけるスクリーニング試験はこれらの飼料条件下で実施した。
マウスモデルにおいて飼料がH.ピロリのコロニー形成に与える影響
さらなるマウスモデルにおけるH.ピロリコロニー形成株のスクリーニング
各H.ピロリ臨床分離株が固有の特性を有し、かつ特徴的に異なるため、遺伝的背景が異なるその他のマウス株が生体内モデルとしてより適している可能性があった。従って、私たちはC3H、FVB/n、CBA、DBA/2、129/s、およびSwiss(ARC)を含む6個のマウス株における、以前に特定した5個のH.ピロリ株(K4、K8、K12、K11、およびK18)のコロニー形成に対してスクリーニングした。
各H.ピロリ臨床分離株が固有の特性を有し、かつ特徴的に異なるため、遺伝的背景が異なるその他のマウス株が生体内モデルとしてより適している可能性があった。従って、私たちはC3H、FVB/n、CBA、DBA/2、129/s、およびSwiss(ARC)を含む6個のマウス株における、以前に特定した5個のH.ピロリ株(K4、K8、K12、K11、およびK18)のコロニー形成に対してスクリーニングした。
6−8週齢の雌のDBA/2J、C3H、CBA、FVB/n、129/s、Swiss(ARC)、およびC57BL/6マウスを、オーストラリアのAnimal Resources Centreから購入した。全てのマウスはH.ピロリフリーであり、実験の開始前に2種間の順化期間が認められた。動物は、特別の定めのない限り、酸性水および標準(魚粉ベース)の囓歯類飼料を自由に与えた。いくつかの実験では、動物に、菜食(魚粉フリー)、または準合成のカゼインが豊富なタンパク質飼料、および中性(非酸性の)飲料水を与えた。飼料は西オーストラリア州のSpecialty Feeds社から供給された。全ての実験研究は、承認RA 3/100/676を受けて、the University of Western Australia Animal Ethics Committeeによって承認されている。
培養が困難なために、K6株を本実験に含めなかった。さらに、マウス適応株X47をコンパレータとして含め、全ての実験は準合成のカゼインが豊富なタンパク質飼料(93G飼料)および酸性水を与えたマウスを用いて実施した。
その結果、K4、K8、およびK18の株はほとんどのマウス株に良好から高度な程度にコロニー形成可能であることが示された。K11およびK12の株はかなり低い頻度ではあるが、種々のマウスにコロニー形成可能であった。予想通り、X47はすべてのマウス株において、高レベルの細菌量を有してしっかりコロニー形成可能であった。これらの結果を以下の表3および図8に示す。
総合すると、K4、K8、およびK18は、マウスにおける広域スペクトルの強い生着菌であると考えられ、種々のマウスモデルにおいて最も良好に機能した。その一方で、K11およびK12はマウスのより弱い生着菌であった。
種々のマウス株におけるH.ピロリ臨床株のコロニー形成比率
スナネズミモデルにおけるH.ピロリコロニー形成株のスクリーニング
6個の特定されたH.ピロリ株(K4、K6、K8、K12、K11、およびK18)が強くて広域の生着菌であるかどうかを検証するために、それらをスナネズミモデルにおいてスクリーニングした。スナネズミモデルは、ヒト感染において観察される病状(胃炎)と密接に類似しているため、H.ピロリ感染とより関連するモデルである。
6個の特定されたH.ピロリ株(K4、K6、K8、K12、K11、およびK18)が強くて広域の生着菌であるかどうかを検証するために、それらをスナネズミモデルにおいてスクリーニングした。スナネズミモデルは、ヒト感染において観察される病状(胃炎)と密接に類似しているため、H.ピロリ感染とより関連するモデルである。
つまり、8−12週齢の動物を、ウマ血清(8%)、バンコマイシン(10mg/l)、トリメトプリム(5mg/l)、ナイスタチン(1mg/l)が添加された寒天培地(GC agar、Oxoid社、ドイツ)において成長した約1×109の生存H.ピロリ(5株の個別の株またはプール)を用いて、5日間にわたって3回経口攻撃した。動物を感染から3−5週間後に犠牲にし、胃を大弯に沿って開け、胃組織を幽門洞と胃体部に分離して保存した。各幽門洞と胃体部の組織試料を1mlのブルセラブロス中で均質化し、適切な希釈を選択血清プレート(GC agar,上述を参照のこと)上に広げ、37℃で最大5日間、微好気的条件下(85%N2、10%CO2、5%O2)でインキュベートした。コロニー形成単位(CFU)の数を胃組織1グラム当たりで示した。
最初のスクリーニングでは、全ての4株(個々に攻撃)はスナネズミの胃粘膜にコロニー形成できなかった。次いで、残りの形質転換性の10個のK株を試験するために、2回目のスクリーニングを実施した。スナネズミを5株の混合物を用いて攻撃し、コロニー形成株を胃の生体組織から培養し、遺伝子型決定指紋法によって特定した。興味深いことに、K4およびK12の2株はスナネズミ宿主にコロニー形成可能であり(図9)、両方の株はDBA/2マウスモデルにおける最初のスクリーニングでは特定されなかった。
さらに、マウスにおける広範囲のスクリーニングの後、K4株はマウスおよびスナネズミのモデルの両方における良好で強い生着菌であることが示された。これらのデータは、H.ピロリ株の多様性、および前臨床動物モデルでのヒト臨床分離株の使用における困難性を反映している。
サルモデルにおけるH.ピロリコロニー形成株のスクリーニング
非ヒト霊長類(サル)はヒトと密接に関係していると考えられており、そのため、H.ピロリ感染を含めてヒト疾患の関連モデルである。ここに、私たちは以前に特定したH.ピロリ株をサルモデルにおいて検証するよう設定した。
非ヒト霊長類(サル)はヒトと密接に関係していると考えられており、そのため、H.ピロリ感染を含めてヒト疾患の関連モデルである。ここに、私たちは以前に特定したH.ピロリ株をサルモデルにおいて検証するよう設定した。
Valley Biosystems社(ウエストサクラメント、カリフォルニア州)から入手した成長した(>5歳)カニクイザルを、サルにおいて95%の感受性および94%の特異性がある血清学(Solnickら、(2001年)、Infect.Immun.69:6887−6892)を用いて、H.ピロリ感染に対して最初にスクリーニングした。また、血清陰性のサルは内視鏡検査を受け、H.ピロリのそれらの陰性培養および組織像を、H.ピロリ攻撃実験において使用するために、デービスのCalifornia National Primate Research Centerに転送した。私たちは、動物の約25%が血清陰性であり、75%が胃生検において陰性であることを予測する。
H.ピロリに感染していないサルをH.ピロリ攻撃またはコントロールを受け取るように無作為に割り当てた。H.ピロリ株のK6(OND737)、K8(OND738)、およびK11(OND739)の混合物を攻撃に使用した。培養が困難なために、OND740を本実験に使用しなかった。約1×109の生存H.ピロリをケタミン(10mg/kg IM)で鎮静されたサルに経口投与で接種した。攻撃から1ヵ月後に胃生検を行い、H.ピロリ感染を確認した。CFUを以前に記載したように定量した。
K6およびK11の2株はサルの胃にコロニー形成することに成功した(図9)。
株の臨床的および遺伝子型の特徴
4つの選択マウス−コロニー形成株および2つのスナネズミ−コロニー形成株(K4、K12)の臨床的および組織学的なデータを図9にまとめた。6つの選択株を、それぞれOND737、OND738、OND739、OND740、OND248、およびOND256と指定した(表4)。
4つの選択マウス−コロニー形成株および2つのスナネズミ−コロニー形成株(K4、K12)の臨床的および組織学的なデータを図9にまとめた。6つの選択株を、それぞれOND737、OND738、OND739、OND740、OND248、およびOND256と指定した(表4)。
H.ピロリ株の命名法
全ての株は52歳を超える無症状の患者に由来するものである。内視鏡検査において、胃上皮の萎縮はわずかにまたは全く観察されず、かつK18(OND740)株のみが高度の顆粒球浸潤を示した。株の遺伝子型において、vacA s1、vacA s2、cagA、cagT、cagPAI、およびhrgAの対立遺伝子の存在をマルチプレックスPCRで試験した。興味深いことに、株はvacA s1もしくはcagA陰性(K6)、またはvacA s2およびcagA陽性のどちらかであり、それはvacA s1の対立遺伝子およびcagAが無症状の患者において排他的に存在することを示唆している。
その結果、H.ピロリのヒト臨床分離株において、それらの病原性、免疫原性、および毒性は著しく変化し得ることが示された。ここに、私たちは、H.ピロリ株は、DNAを取り出し、それを相同組換えによってそれらのゲノムに組み込み、マウスの胃にコロニー形成し、かつ特異的抗体を誘導するそれらの能力もまた変化することを示す。本研究は、宿主適応せずにH.ピロリ動物モデルにおいて強い生着菌である6個のH.ピロリ株を特定した。
さらに、特定株の2つは特異抗体の高力価を誘導し、かつ1つの株は両モデルにおいて強い生着菌であった。総合すると、本研究は、それらの無症状の高齢患者からの分離、胃における低級の臨床病状、遺伝子操作、動物モデルにおける胃にコロニー形成する能力、および強い免疫反応を誘発する能力に基づいて、細菌性送達媒体としての使用に適した複数のH.ピロリ株を特定した。
H.ピロリ臨床分離株のイムノブロット分析
H.ピロリ株がそれらの免疫原性特性の点で異なるかどうかを決定するためにイムノブロット分析を実施し、DBA/2マウスモデルにおいて得られた血清を使用して、選択されたH.ピロリ臨床分離株(K6、K8、K11、K18、およびH41)のタンパク質パターンを特定した。全細胞溶解液、ならびに外膜および内膜のタンパク質に対するイムノブロットをそれぞれのH.ピロリ株に対して比較した。X47を使用し、この株はマウスにおいて免疫原性があることが知られているためベンチマークとして含めた。
H.ピロリ株がそれらの免疫原性特性の点で異なるかどうかを決定するためにイムノブロット分析を実施し、DBA/2マウスモデルにおいて得られた血清を使用して、選択されたH.ピロリ臨床分離株(K6、K8、K11、K18、およびH41)のタンパク質パターンを特定した。全細胞溶解液、ならびに外膜および内膜のタンパク質に対するイムノブロットをそれぞれのH.ピロリ株に対して比較した。X47を使用し、この株はマウスにおいて免疫原性があることが知られているためベンチマークとして含めた。
プレート培養から収集した細菌を400μlの1×PBS中で10OD600nmの濃度に希釈し、2回30秒間、超音波処理した。超音波処理の後、細菌懸濁液をSDS−PAGEのために5分間95℃で加熱して室温まで冷却し、100μlの5×サンプル緩衝液中で変性させた。
あるいは、細菌を収集して、外膜タンパク質をグリシン抽出によって抽出した。10OD600nmの単位に相当する細胞ペレットを、200μlのグリシン緩衝液(pH2.2)中に再懸濁させて、室温にて5分間インキュベートした。その後、細胞を遠心分離した(2分、14000rpm、室温)。上清を30μlのTris(pH10.8)と混合し、タンパク質分画を中和した。上述したSDS−PAGEのために、グリシン抽出のペレットを400μlの1×PBS中で再懸濁し、超音波処理して5×サンプル緩衝液中で変性させた。
サンプル(各レーン10μl)を、4%の濃縮用ゲルおよび10%の分離ゲルを用いたMiniPROTEAN(登録商標)Tetra Cell electrophorese unit(Biorad社)を使用して、SDSポリアクリルアミドミニゲルにて電気泳動した。分離した抗原を、Trans−Blot(登録商標)SD Semi−Dry Transfer Cell(Biorad社)を用いて、Immobilon−P Transfer(0.45μM)membrane(Millipore社)に転写した。1×TBS+0.2%Tween(登録商標)20中で5%の脱脂粉乳を用いて4℃で一晩膜をブロックした。
膜を各H.ピロリ株(1×TBS+0.1%Tween(登録商標)20中にて1:50希釈)で感染させたマウスの血清を用いて、室温で1時間インキュベートした。膜を1×TBS+0.1%Tween(登録商標)20を用いて3回洗浄し、その後、1×TBS+0.1%のTween(登録商標)20中で希釈したHRP結合ヤギ抗マウスIgG Fcγ(Jackson Immunoresearch社)の1:5000希釈を用いて室温にて1時間インキュベートした。膜を上述したように1×TBS+0.1%Tween(登録商標)20を用いて洗浄し、Chemiluminescent Peroxidase Substrate−3 solution(Sigma社)を用いてインキュベートした。膜をFujiFilm LAS−3000撮像装置を用いてバンドパターンを評価した。
その結果、各細菌株には、免疫原性タンパク質の一般的なパターンがあり、そのパターン特性はわずかに変化することが示された。K6、K8、およびK18の株はより強いバンドパターンを示した。それはこれらの株が生体内においてより免疫原性があり得ることを示唆しており(図10)、以前に示した血清学データと一致している。
H.ピロリ臨床分離株の遺伝子指紋法
遺伝子指紋法は細菌集団の遺伝的変異性を評価するために使用可能である。これらの指紋法は各株に対して固有の特定パターンをもたらす。14個の形質転換性K株の遺伝子指紋を、宿主がいくつかの株の混合物で攻撃された実験条件にて産生細菌分離株を特定するために作成した。RAPD PCR分析は各H.ピロリ株を解析するための固有の遺伝子パターンを可能にする。
遺伝子指紋法は細菌集団の遺伝的変異性を評価するために使用可能である。これらの指紋法は各株に対して固有の特定パターンをもたらす。14個の形質転換性K株の遺伝子指紋を、宿主がいくつかの株の混合物で攻撃された実験条件にて産生細菌分離株を特定するために作成した。RAPD PCR分析は各H.ピロリ株を解析するための固有の遺伝子パターンを可能にする。
細菌株を微好気性環境中においてコロンビア血液寒天培地上で37℃で48時間培養した。密集成長した寒天培地の約半分からの細菌細胞量を0.85%の塩化ナトリウム溶液中に注意深く収集し、4000gで8分間遠心分離した。上澄みを廃棄し、ペレットを180μlの消化緩衝液および20μlのプロテイナーゼK中で懸濁させた。サンプルを時々ボルテックスしながら55℃で4−12時間インキュベートし、その後、ゲノムDNAを指示書に従って、Invitrogen社のPurelinkゲノムDNAミニキットを用いて精製した。
RAPDを、Akopyanzらの(1992年)Nucl.Acids Res.,20:5137−5142に記載されているように実施した。
プライマー1254および1281を使用した。プライマーはPSR反応において常時別々に使用した。
1254(5’−CCGCAGCCAA−3’) SEQ ID NO:1
1281(5’−AACGCGCAAC−3’) SEQ ID NO:2
1281(5’−AACGCGCAAC−3’) SEQ ID NO:2
PCR反応(50μl体積)最終濃度:
−緩衝液 100mM Tris−HCl、500mM KCl、pH 8.3
−dNTPs 各250μM
−プライマー 0.8μM 1254または1281のどちらか
−MgCl2 3mM
−BSA 0.01%(w/v)
−テンプレート 10−100 ng DNA(通常、5μlの抽出gDNAサンプル)
−Taq 2単位(Roche社の組換えTaqポリメラーゼ)
−緩衝液 100mM Tris−HCl、500mM KCl、pH 8.3
−dNTPs 各250μM
−プライマー 0.8μM 1254または1281のどちらか
−MgCl2 3mM
−BSA 0.01%(w/v)
−テンプレート 10−100 ng DNA(通常、5μlの抽出gDNAサンプル)
−Taq 2単位(Roche社の組換えTaqポリメラーゼ)
増幅サイクル:
4サイクル[94℃、5分;36℃、5分;および72℃、5分]
30サイクル[94℃、1分;36℃、1分;および72℃、2分]
72℃で10分
4サイクル[94℃、5分;36℃、5分;および72℃、5分]
30サイクル[94℃、1分;36℃、1分;および72℃、2分]
72℃で10分
ゲル電気泳動:
10−15μlのPCR産物を1時間90Vにて1.5%(w/v)のアガロースゲルを介して分離した。
10−15μlのPCR産物を1時間90Vにて1.5%(w/v)のアガロースゲルを介して分離した。
予想通り、両方のプライマーから、14個の個々のK株の任意に増幅したゲノムDNAサンプルの固有バンドパターンを得た(図11)。ある株については、どちらかのプライマーはより特徴的なバンドパターンを形成した。OND258(K14)およびOND253(K9)は最もよく似ており、家族性株であることを示している可能性がある。表4には、OND特定番号に関連するH.ピロリ株の命名法をまとめている。
Claims (23)
- 以下の特徴、(a)低病原性、(b)自然に形質転換する能力、および(c)宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニー形成する能力、を有するH.ピロリ分離株。
- 請求項1に記載のH.ピロリ分離株であって、前記H.ピロリは哺乳類対象において慢性感染を引き起こすことが可能なH.ピロリ分離株。
- 請求項1または2に記載のH.ピロリ分離株であって、前記H.ピロリは1以上の機能性の病原性因子を発現しないH.ピロリ分離株。
- 請求項3に記載のH.ピロリ分離株であって、前記病原性因子はvacA s1またはcagAであるH.ピロリ分離株。
- H.ピロリ分離株は、
(i)vacA s1もしくはcagA陰性、または
(ii)vacA s2およびcagA陽性、のどちらかであり、
前記H.ピロリ株は、
(a)低病原性、
(b)自然に形質転換する能力、および
(c)宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニー形成する能力、を有するH.ピロリ分離株。 - 請求項1から3ののH.ピロリ分離株であって、前記H.ピロリは受入番号第V09/009101号にてNational Measurement Instituteに寄託されたOND737、受入番号第V09/009102号にてNational Measurement Instituteに寄託されたOND738、受入番号第V09/009103号にてNational Measurement Instituteに寄託されたOND739、受入番号第V10/014059号にてNational Measurement Instituteに寄託されたOND248、受入番号第V10/014060号にてNational Measurement Instituteに寄託されたOND256、受入番号第V09/009104号にてNational Measurement Instituteに寄託されたOND740、または、それらの変異体もしくは誘導体から成る群より選択されるH.ピロリ分離株。
- 受入番号第V09/009101号にてNational Measurement Instituteに寄託された、H.ピロリ分離株OND737。
- 受入番号第V09/009102号にてNational Measurement Instituteに寄託された、H.ピロリ分離株OND738。
- 受入番号第V09/009103号にてNational Measurement Instituteに寄託された、H.ピロリ分離株OND739。
- 受入番号第V09/009104号にてNational Measurement Instituteに寄託された、H.ピロリ分離株OND740。
- 受入番号第V10/014059号にてNational Measurement Instituteに寄託された、H.ピロリ分離株OND248。
- 受入番号第V10/014060号にてNational Measurement Instituteに寄託された、H.ピロリ分離株OND256。
- 請求項1から12のいずれか一項に記載のH.ピロリ分離株であって、それは核酸分子によってコードされた対照遺伝子で形質転換されるH.ピロリ分離株。
- 請求項13に記載のH.ピロリ分離株であって、前記単離された核酸分子はH.ピロリ株のゲノムに組み込まれるH.ピロリ分離株。
- 請求項13または14に記載のH.ピロリ分離株であって、前記単離された核酸分子はH.ピロリに相同なポリペプチドをコードするH.ピロリ分離株。
- 請求項13または14に記載のH.ピロリ分離株であって、前記単離された核酸分子はH.ピロリに非相同なポリペプチドをコードするH.ピロリ分離株。
- 請求項1から16のいずれか一項に記載のH.ピロリ分離株を投与する段階を含む、哺乳類対象において抗体反応を誘導する方法。
- 生体内における生物活性物質の送達に適したH.ピロリ株を特定する方法であって、
(a)H.ピロリ感染のために無症状個体からH.ピロリ株を分離する段階、
(b)前記株が自然に形質転換する能力を有するかどうかを決定する段階、および
(c)前記株が宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニー形成する能力を有するかどうかを決定する段階を含み、
自然に形質転換する能力および宿主適応せずにマウスの胃粘膜にコロニー形成する能力を有する株は、生体内において生物活性物質の送達に適している方法。 - ヘリコバクター感染における最適化動物モデルであって、前記動物はカゼインが豊富な餌および/または酸性水が与えられているため、ヘリコバクター種によるコロニー形成は、カゼインが豊富な餌および/または酸性水が与えられていない動物と比較して強化され得る最適化動物モデル。
- 請求項19に記載の最適化動物モデルであって、前記動物はカゼインが豊富な餌および酸性水が与えられており、前記水は約pH2である最適化動物モデル。
- 請求項19または20に記載の最適化動物モデルであって、前記動物はマウスである最適化動物モデル。
- ヘリコバクター種を特定するためのランダム増幅多型DNAポリメラーゼ連鎖反応の使用。
- 請求項22に記載の使用であって、ヘリコバクターDNAは前記ヘリコバクター種から単離されて、SEQ ID NO:1に示される配列を有するフォワードプライマーおよびSEQ ID NO:2に示される配列を有するリバースプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される使用。
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