PL217128B1 - Syntetyczne geny kodujące fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych przeznaczone do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej, fragmenty DNA zawierające te geny, sposób otrzymywania tych peptydów w układzie mikrobiologicznym (bakteryjnym) oraz ich zastosowanie medyczne - Google Patents
Syntetyczne geny kodujące fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych przeznaczone do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej, fragmenty DNA zawierające te geny, sposób otrzymywania tych peptydów w układzie mikrobiologicznym (bakteryjnym) oraz ich zastosowanie medyczneInfo
- Publication number
- PL217128B1 PL217128B1 PL392037A PL39203710A PL217128B1 PL 217128 B1 PL217128 B1 PL 217128B1 PL 392037 A PL392037 A PL 392037A PL 39203710 A PL39203710 A PL 39203710A PL 217128 B1 PL217128 B1 PL 217128B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- formula
- bacteria
- gene
- synthetic genes
- dna
- Prior art date
Links
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 42
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 42
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 41
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 22
- 230000009246 food effect Effects 0.000 title claims abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 53
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 title claims description 48
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 34
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 title claims description 29
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 title claims description 29
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 7
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 52
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 42
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 33
- 241000194035 Lactococcus lactis Species 0.000 claims description 29
- 101150104624 ptcB gene Proteins 0.000 claims description 27
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 26
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 24
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 19
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 claims description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 14
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 13
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 11
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 10
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 9
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 claims description 8
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 claims description 8
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 6
- 108010064578 myelin proteolipid protein (139-151) Proteins 0.000 claims description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 6
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 claims description 5
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 5
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000005862 Whey Substances 0.000 claims description 4
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 235000016127 added sugars Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 claims description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 3
- PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N Aesculin Natural products OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1Oc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N 0.000 claims description 2
- WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N Cichoriin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)c1c(O)cc2c(OC(=O)C=C2)c1 WNBCMONIPIJTSB-BGNCJLHMSA-N 0.000 claims description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 2
- NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N Salicin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1)c1c(CO)cccc1 NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N 0.000 claims description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 2
- NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N alpha-salicin Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 2
- XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N esculin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C(=C1)O)=CC2=C1OC(=O)C=C2 XHCADAYNFIFUHF-TVKJYDDYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940093496 esculin Drugs 0.000 claims description 2
- AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N esculin Natural products OC1OC(COc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O)C(O)C(O)C1O AWRMZKLXZLNBBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 2
- 229960003082 galactose Drugs 0.000 claims description 2
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 claims description 2
- NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N salicin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N 0.000 claims description 2
- 229940120668 salicin Drugs 0.000 claims description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 2
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 1
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 abstract description 12
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 5
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 3
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 2
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 2
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 2
- 239000001968 M17 agar Substances 0.000 description 2
- 102000002233 Myelin-Oligodendrocyte Glycoprotein Human genes 0.000 description 2
- 108010000123 Myelin-Oligodendrocyte Glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 102000003797 Neuropeptides Human genes 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 2
- 239000005428 food component Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 2
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 2
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 241001134772 Bifidobacterium pseudocatenulatum Species 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108010010256 Dietary Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000015781 Dietary Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010051539 HLA-DR2 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 1
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 1
- 101100494726 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pep-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010010974 Proteolipids Proteins 0.000 description 1
- 102000016202 Proteolipids Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 235000021245 dietary protein Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 235000021001 fermented dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 235000021107 fermented food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 235000021474 generally recognized As safe (food) Nutrition 0.000 description 1
- 235000021473 generally recognized as safe (food ingredients) Nutrition 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 229940124622 immune-modulator drug Drugs 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 210000005027 intestinal barrier Anatomy 0.000 description 1
- 230000007358 intestinal barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000020192 tolerance induction in gut-associated lymphoid tissue Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania niskocząsteczkowych peptydów, pochodnych białek mieliny rdzenia kręgowego, w bakteriach, zwłaszcza mlekowych, w celu otrzymania preparatów pojedynczych i skojarzonych peptydów mielinowych do stosowania w medycynie, zwłaszcza przeznaczonych do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej.
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania syntetycznych genów kodujących niskocząsteczkowe peptydy mielinowe, pochodnych fragmentów białek rdzenia kręgowego ssaków, oraz sposób ich mikrobiologicznego wytwarzania w bakteriach mlekowych, preparaty pojedyncze i skojarzone tych peptydów oraz ich zastosowanie w medycynie do indukcji specyficznej tolerancji pokarmowej.
WPROWADZENIE
Stwardnienie rozsiane jest chorobą destrukcyjną centralnego układu nerwowego, która dotyka głównie ludzi młodych, między 20 a 40 rokiem życia. Dane dotyczące zachorowalności wskazują, że w Polsce choruje na nią ok. 60 000 osób. Jest to choroba o podłożu autoimmunologicznym, na którą, jak dotąd, nie ma skutecznego leku. Leki immunomodulujące, jak interferon i copaxon, jedynie zmieniają przebieg choroby, zmniejszając ilość rzutów, ale po 6 latach leczenia niepełnosprawność osób ze stwardnieniem rozsianym jest taka sama jak bez leczenia. Ponadto kuracja tego schorzenia jest dość kosztowna, a refundacja kosztów leczenia - sporadyczna. Stąd też potrzeba intensywnych badań nad nowymi skutecznymi i ekonomicznie opłacalnymi metodami leczenia tego przewlekłego schorzenia immunologicznego.
Choroby autoimmunologiczne polegają na patologicznym rozpoznawaniu przez układ odpornościowy białek własnych organizmu jako obcych antygenów, co w konsekwencji prowadzi do uruchamiania mechanizmów eliminacji tych antygenów. Fragmenty białek mieliny ośrodkowego układu nerwowego stanowią antygeny patologicznie rozpoznawane przez przeciwciała w stwardnieniu rozsianym.
Znany jest mechanizm tolerancji pokarmowej, w którym następuje specyficzne odczulanie układu odpornościowego na składniki pokarmowe. Zaproponowano wykorzystanie tego mechanizmu do wywoływania tolerancji na epitopy białek w chorobach autoimmunologicznych takich jak reumatyzm i stwardnienie rozsiane. W badaniach własnych Autorów wykazano, że hydrolizaty rdzenia kręgowego zwierząt hodowlanych, zawierające niskocząsteczkowe fragmenty peptydowe mieliny, wykazują działanie modulujące przebieg eksperymentalnego alergicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE), w modelu zwierzęcym stwardnienia rozsianego (SM) (1).
Podjęcie badań mających na celu opracowanie sposobu wytwarzania peptydów mielinowych w bakteriach mlekowych wiązało się z kilkoma przesłankami: (i) ważna pozycja stwardnienia rozsianego pośród chorób występujących w Polsce; (ii) niska skuteczność i wysokie koszty leczenia tej choroby; (iii) wykazanie skuteczności peptydów w terapii tej jednostki chorobowej; (iv) udokumentowana rola jelita (przewodu pokarmowego) w systemie odporności organizmu; (v) dotychczasowe pozytywne wyniki stosowania bakterii mlekowych, jako producentów czynników immunomodulacyjnych (cytokin i antygenów), w tym także, jako szczepionek doustnych; (vi) dane wskazujące, że bakterie potęgują efekt tolerancji pokarmowej (2).
AKTUALNY STAN WIEDZY
Rozpoznanym celem ataku na układ odpornościowy w stwardnieniu rozsianym oraz w zwierzęcym modelu zapalenia mózgu i rdzenia EAE są białka składowe mieliny. Głównymi białkowymi składnikami mieliny są trzy białka:
(i) zasadowe białko mieliny, MBP (od ang. Myelin basie protein) o sekwencji aminokwasowej u człowieka przedstawionej na rysunku wzorem 13 (3) (ii) białko prolipidowe PLP (od ang. proteolipid protein) o sekwencji aminokwasowej u człowieka przedstawionej na rysunku wzorem 14 (4) (iii) Glikoproteina oligodendrocytów mieliny, MOG (od ang. myelin-oligodendrocyte glycoprotein) o sekwencji aminokwasowej u człowieka przedstawionej na rysunku wzorem 15 (5).
Badania ostatniej dekady dostarczają dowodów, że fragmenty peptydowe, będące produktami częściowej hydrolizy białek pokarmowych, również mają zdolność przenikania przez barierę jelitową. Niektóre krótkie peptydy przenikają przez tę barierę łatwiej niż pojedyncze aminokwasy. Aby odróżnić pokarmowe peptydy przenikające do krwi z jelita, od białek inwazyjnych bakterii i wirusów, organizmy wytworzyły specyficzny system prezentacji antygenów pokarmowych. Rezultatem takiej prezentacji jest obniżenie specyficznej immunogenności na konkretne sekwencje peptydowe (jak również inne, niepeptydowe składniki pokarmowe). Zjawisko to nazwano „tolerancją pokarmową (ang. „oral tolerance).
Niniejszy wynalazek opiera się na wstępnych badaniach własnych. Zastosowanie preparatu otrzymanego w wyniku hydrolizy rdzenia kręgowego w arbitralnie dobranej dawce, u szczurów z EAE powodowało zmniejszenie objawów zapalnych zarówno przy podawaniu wyprzedzającym jak i po wywołaniu EAE (6).
PL 217 128 B1
Wykorzystanie bakterii fermentacji mlekowej, jako fabryk biologicznych produkujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych jest bardzo atrakcyjne naukowo i aplikacyjnie i prezentuje wiele korzystnych cech medyczno-farmakologicznych.
Bakterie fermentacji mlekowej, zwane inaczej bakteriami kwasu mlekowego lub bakteriami mlekowymi (ang. Lactic Acid Bacteria, LAB), stanowią dużą i bardzo zróżnicowaną taksonomicznie grupę bakterii gramdodatnich. Niewątpliwą zaletą tych bakterii jest nadany im status GRAS (ang. Generalny Regarded As Safe), tj. bakterii niechorobotwórczych i bezpiecznych dla człowieka i zwierząt. Bakterie mlekowe stanowią bardzo ważny przedmiot zastosowań biotechnologicznych i obiekt badań podstawowych i aplikacyjnych. Biotechnologia z udziałem bakterii mlekowych jest stosowana w różnych gałęziach przemysłu (7) - spożywczym (np. produkcja fermentowanych artykułów mleczarskich, żywności oraz pasz i dodatków do pasz), chemicznym (np. produkcja polimerów i enzymów) i farmaceutycznym (np. preparaty pro biotyczne typu Lakcid czy Lactovaginal). W ostatnich latach duże nadzieje wiąże się z wykorzystaniem tych bakterii do produkcji tzw. żywności funkcjonalnej, preparatów probiotycznych oraz leków o charakterze szczepionek doustnych (7, 8, 9). Wśród tych ostatnich duże nadzieje wiąże się z możliwością wykorzystania bakterii mlekowych jako wektorów szczepionkowych (10-12). Również podczas ostatnich kilku latach obserwuje się na świecie nasilenie badań nad wykorzystaniem bakterii mlekowych do produkcji różnych białek o znaczeniu terapeutycznym lub profilaktycznym. Bakterie fermentacji mlekowej próbuje się wykorzystać w profilaktyce i zwalczaniu zespołu chorobowego, zwanego IBD (ang. Inflammatory Bowel Disease - przewlekłym, nieswoistym zapaleniu jelita), który obejmuje także chorobę Leśniowskiego-Crohna (w skrócie zwaną chorobą Crohna) i wrzodziejące zapalenie jelita grubego (ang. ulcerative colitis).
Przedmiotem wynalazku jest opracowanie układu biologicznego, opartego o bakterie fermentacji mlekowej, wytwarzającego fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, do stworzenia preparatu przeznaczonego do wywoływania tolerancji pokarmowej.
Wyboru fragmentów peptydowych naturalnych białek mielinowych do zastosowania w wynalazku dokonano na podstawie badań własnych, które wskazały, iż u chorych na stwardnienie rozsiane identyfikowany jest antygen HLA-DR2 rozpoznający fragment 84-103 białka MBP (13). Przeciwciała do innych fragmentów trzech zasadniczych białek są również identyfikowane (14, 15) a w miarę postępu choroby następuje zwiększanie się liczby rozpoznawanych antygenów pochodzących z trzech podstawowych białek mieliny. Powyższe obserwacje wiążą się prawdopodobnie z dostępnością zarówno tych białek jak i ich fragmentów u chorych. Immunogenność wybranych peptydowych fragmentów naturalnych białek mielinowych potwierdzona została również na zwierzęcych modelach EAE (16, 17, 18).
Nieoczekiwanie, okazało się, że w wyniku realizacji wynalazku, możliwe jest:
a) wytwarzanie syntetycznych genów kodujących wybrane fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych metodą PCR;
b) klonowanie, w komórkach wybranych szczepów gramdodatnich bakterii mlekowych z rodzaju Lactococcus otrzymanych genów rekombinowanych z odpowiednimi wektorami do klonowania;
c) ekspresja w wybranych rodzajach bakterii mlekowych (Lactococcus, Bifidobacterium, Lactobacillus) genów kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych;
d) klonowanie genów kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych w komórkach bakterii gramujemnej (Escherichia coli);
e) optymalizacja biosyntezy peptydów mielinowych w bakteriach mlekowych.
Syntetyczne geny kodujące fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, przeznaczone do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej, według wynalazku, charakteryzują się tym, że zawierają co najmniej jedną sekwencję nukleotydową kodującą fragment białka mielinowego, wybraną z grupy obejmującej: sekwencję nukleotydową dla fragmentu MBP21-40, przedstawioną wzorem 1, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 1a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu MOG35-55, przedstawioną wzorem 2, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 2a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu MBP85-97, przedstawioną wzorem 3, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 3a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu PLP139-151, przedstawioną wzorem 4, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 4a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu PLP178-191, przedstawioną wzorem 5, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 5a.
Sposób wytwarzania genów kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, według wynalazku polega na zsyntetyzowaniu metodą PCR syntetycznych genów kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, z wykorzystaniem specyficznych dla każdego pep4
PL 217 128 B1 tydu 2 komplementarnych starterów („LONG) przedstawionych w Tabeli 1, których sekwencje nukleotydowe zostały zaprojektowane tak, aby odpowiadały kodonom preferencyjnie występującym u bakterii z gatunku Lactococcus lactis. Dodatkowo do sekwencji nukleotydowej starterów „FLONG (forward LONG) dla peptydów MBP85-97, PLP139-151 oraz PLP178-191 wprowadza się sekwencję, odpowiadającą kodonowi START translacji (ATG), tuż przed sekwencją kodującą pierwszy aminokwas oryginalnych sekwencji peptydowych. Jednocześnie końce 5' starterów „FLONG_peptyd zawierają dodatkową, typową dla bakterii Lactococcus lactis sekwencję RBS (ang. ribosome-binding site; miejsce wiązania rybosomów), rozpoznawaną przez maszynerię translacyjną oraz sekwencje 'spacer' (sekwencję łącznikową) zlokalizowaną między regionem RBS, a kodonem START translacji. Startery „LONG stosuje się jako matrycę, na której techniką PCR przeprowadza się syntezę syntetycznych genów przy użyciu krótkich starterów („SHORT) homologicznych do 5' końców starterów „FLONG_peptyd i „RLONG_peptyd, przy czym końce 5' starterów „SHORT niosą dodatkowo sekwencje rozpoznawane przez specyficzne endonukleazy restrykcyjne, preferencyjnie SaII (dla startera forward SHORT) oraz PstI (dla startera reverse SHORT), natomiast końce 5' starterów „revSHORT_peptyd (reverse SHORT) posiadają dodatkowo dwukrotnie powtórzoną sekwencję odpowiadającą kodonowi STOP translacji (TAA) (Tabela 2).
Przedmiotem wynalazku są także, otrzymane w wyniku przeprowadzenia powyższej reakcji PCR, z zastosowaniem zaprojektowanych starterów „LONG i „SHORT, fragmenty DNA, o sekwencjach nukleotydowych, według wynalazku, w obrębie których zawarte są sekwencje syntetycznych genów wybranych fragmentów peptydowych naturalnych białek mielinowych (sekwencje podkreślone), według wynalazku, przedstawione wzorem 6, wzorem 7, wzorem 8, wzorem 9 i wzorem 10.
Sposób klonowania wytworzonych fragmentów DNA zawierających syntetyczne geny, według wynalazku, polega na tym, że poddaje się je trawieniu enzymami restrykcyjnymi, korzystnie PstI i SaII, a następnie łączy z wektorem plazmidowym zdolnym do replikacji w komórkach bakterii mlekowych, korzystnie z rodzaju Lactococcus zwłaszcza z wektorem pIL253, trawionym uprzednio tymi samymi enzymami restrykcyjnymi, w celu uzyskania plazmidów rekombinowanych, w których orientacja wklonowanych produktów PCR (wstawek) jest zgodna z kierunkiem transkrypcji kierowanej z wewnętrznego promotora obecnego w wektorze, po czym zrekombinowane DNA wprowadza się metodą elektroporacji do komórek szczepów bakteryjnych, które inkubuje się w znany sposób. Z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy gen, korzystnie poprzez analizę otrzymanych transformantów techniką PCR na obecność wstawek o określonej długości, odpowiadającej długością fragmentom DNA zawierającym oczekiwane syntetyczne geny. Zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanych genów z sekwencjami nukleotydowymi genów syntetycznych potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA.
W sposobie klonowania według wynalazku, korzystnie jako gramdodatnie szczepy bakterii mlekowych, do których wprowadza się rekombinowane DNA, stosuje się korzystnie szczepy z rodzaju Lactococcus, zwłaszcza Lactococcus lactis IL1403, Lactococcus lactis IBB477 oraz Lactococcus lactis IBB360, o różnym stopniu przeżywalności w przewodzie pokarmowym ssaków oraz inne rodzaje bakterii mlekowych, preferencyjnie Lactobacillus oraz Bifidobacterium.
Sposób wytwarzania wybranych peptydów w układzie bakteryjnym, korzystnie, według wynalazku, polega na ekspresji syntetycznych genów wybranych peptydów w komórkach szczepów bakterii mlekowych, zwłaszcza z rodzaju Lactococcus poprzez ich hodowle na znanym podłożu specyficznym dla bakterii mlekowych, preferencyjnie na pożywce Μ17 lub podłożu zdefiniowanym typu CDN (z ang. chemically defined medium), z dodatkiem cukru, korzystnie glukozy lub celobiozy, w stężeniu nie mniejszym niż 0.5% lub też na mleku, serwatce czy też innym odpowiednim podłożu, w temperaturze w granicach 20°C-30°C, preferencyjnie 30°C.
Sposób klonowania syntetycznych genów wybranych peptydów mielinowych w bakteriach gramujemnych, korzystnie z gatunku Escherichia coli, według wynalazku, polega na tym, że łączy się syntetyczny gen amplifikowany odpowiednimi starterami 'SHORT' (Tabela 2) z wektorem, preferencyjnie z komercyjnie dostępnym plazmidem pGEMT-Easy lub innym wektorem, zdolnym do replikacji w komórkach bakterii gramujemnych, korzystnie z gatunku Escherichia coli, w celu uzyskania plazmidów rekombinowanych. Zrekombinowane DNA wprowadzane jest znaną metodą, np. elektroporacji, do komórek szczepów bakteryjnych, które hoduje się w znany sposób. Z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy gen, korzystnie poprzez analizę otrzymanych transformantów techniką PCR na obecność wstawek o określonej długości, odpowiadającej długością fragmentom DNA zawierającym oczekiwane syntetyczne geny. Zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanych fragmentów DNA z sekwencjami nukleotydowymi genów syntetycznych potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA.
PL 217 128 B1
W sposobie klonowania według wynalazku korzystnie jako gramujemne szczepy bakteryjne, do których wprowadza się rekombinowane DNA, stosuje się bakterie z gatunku Escherichia coli, korzystnie szczep TG1.
Sposób optymalizacji ekspresji syntetycznych genów wybranych fragmentów peptydowych naturalnych białek mielinowych, według wynalazku, korzystnie polega na zastąpieniu wewnętrznego konstytutywnego promotora na wektorze plazmidowym, replikującym się w komórkach L. lactis, promotorem regulowanym, korzystnie regionem promotorowym genu pochodzącego z genomu bakterii L. lactis lub innego gatunku czy z genomu bakteriofaga, preferencyjnie regionem promotorowym genu ptcB, zaangażowanego w katabolizm cukrów u bakterii mlekowych z rodzaju Lactococcus, który jest regulowany poprzez obecność w pożywce różnych cukrów, takich jak: celobioza, galaktoza, salicyna, eskulina, glukoza.
Sposób zoptymalizowanej produkcji peptydów w układzie bakteryjnym, według wynalazku, korzystnie polega na hodowli komórek niosących rekombinowany wektor plazmidowy (ze sklonowanym syntetycznym genem oraz odpowiednim regionem promotorowym, korzystnie promotorem genu ptcB z genomu bakterii z rodzaju Lactococcus) na znanym podłożu specyficznym dla bakterii mlekowych, preferencyjnie na podłożu zdefiniowanym typu CDM (chemically defined medium), z dodatkiem cukru, korzystnie glukozy lub celobiozy, o stężeniu > 0.5%, lub też na mleku, serwatce czy innym odpowiednim podłożu, w temperaturze w granicach 20°-30°C, preferencyjnie 30°C.
Przedmiotem wynalazku jest także sekwencja nukleotydowa regionu promotorowego genu ptcB, o długości obejmującej region -10 i -35, przedstawiona wzorem 11, do stosowania w optymalizacji produkcji syntetycznych genów, kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, według wynalazku.
Sposób wytwarzania sekwencji nukleotydowej regionu promotorowego genu ptcB z L. lactis oraz sposób zastąpienia nim wewnętrznego konstytutywnego promotora na wektorze plazmidowym replikującym się w komórkach L. lactis, przez region promotorowy genu ptcB z L. lactis, według wynalazku, polega na tym, że region promotorowy genu ptcB wytwarza się w reakcji PCR, poprzez użycie jako matrycy chromosomalnego DNA szczepu L. lactis IL1403 oraz pary starterów (ptcBfor i ptcBrev) o sekwencjach komplementarnych do sekwencji DNA okalających region promotorowy chromosomalnego genu ptcB oraz zmodyfikowanych tak, aby na ich końcach 5' znajdowały się sekwencje rozpoznawane przez odpowiednie endonukleazy restrykcyjne, preferencyjnie VspI (dla startera ptcBfor) oraz NciI (dla startera ptcBrev) (Tabela 3). W wyniku reakcji PCR, używając tak zaprojektowanych starterów, według wynalazku, otrzymuje się fragment DNA o sekwencji nukleotydowej przedstawionej wzorem 12, w obrębie których zawarta jest sekwencja regionu promotorowego genu ptcB (podkreślona).
Tak uzyskany produkt poddaje się działaniu enzymami restrykcyjnymi, preferencyjnie VspI i NciI a następnie łączy się go z rekombinowanymi wektorami niosącymi syntetyczne geny, kodującymi wybrane fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, z których usunięto oryginalny region promotorowy (np. poprzez działanie tych samych restryktaz). Zrekombinowane DNA wprowadzane jest metodą elektroporacji do komórek szczepów bakteryjnych, które hoduje się w znany sposób. Z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy region promotorowy, korzystnie poprzez analizę otrzymanych transformantów techniką PCR na obecność fragmentu DNA o oczekiwanej długości, odpowiadającej długością wybranemu regionowi promotorowemu genu ptcB. Zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanego fragmentu DNA z sekwencją nukleotydową regionu promotorowego genu ptcB, według wynalazku, potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie bakterii produkujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych według wynalazku, do wywołania efektu tolerancji pokarmowej.
Zastosowanie sekwencji nukleotydowej regionu promotorowego genu ptcB, o długości obejmującej region -10 i -35, przedstawionej wzorem 11, według wynalazku, do optymalizacji produkcji syntetycznych genów kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych według wynalazku, do wywołania efektu tolerancji pokarmowej.
Oczekuje się, że bakterie produkujące fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, według wynalazku, będą wywoływać efekt tolerancji pokarmowej podobny jak ten opisany w literaturze dotyczącej doustnego podania mieszaniny peptydów w postaci hydrolizatu rdzenia kręgowego pochodzenia zwierzęcego, opublikowany w wyniku badań własnych (1, 6).
Materiały i metody
Szczepy bakteryjne, warunki hodowlane i stosowane plazmidy
Szczepy bakteryjne i plazmidy stosowane w niniejszych badaniach przedstawiono w Tabeli 4. Szczepy Lactococcus lactis hodowano na podłożach M17 (Oxoid, Anglia) z dodatkiem 0.5% glukozy
PL 217 128 B1 lub podłożu zdefiniowanym typu CDM (z ang. chemically defined medium), z dodatkiem glukozy lub cellobiozy (0.5%-1%), w temperaturze 20°C-30°C. Szczepy Escherichia coli hodowano na podłożu
Luria-Bertani (LB), w temperaturze 37°C. Gdy zachodziła potrzeba, w celach selekcyjnych, stosowano -1 -1 następujące antybiotyki: erytromycynę 5 μg ml- dla L. lactis oraz ampicylinę 100 μg ml- dla E. coli.
Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku.
P r z y k ł a d I
Syntetyczne geny zsyntetyzowano metodą PCR używając jako matrycy dla każdego peptydu 2 komplementarnych starterów (for/rev„LONG) oraz 2 krótkich starterów (for/rev„SHORT) homologicznych odpowiednio do skrajnych sekwencji starterów „LONG (Tabela 1). W wyniku reakcji amplifikacji PCR otrzymywano produkty o oczekiwanej długości, które następnie trawiono enzymem SaII oraz PstI i łączono z plazmidem zdolnym do replikacji w komórkach bakteryjnych z rodzaju Lactococcus - pIL253, trawionym uprzednio również tymi samymi enzymami. Kolejno obydwa DNA zrekombionowano ze sobą i wprowadzano metodą elektroporacji do komórek wybranych szczepów Lactococcus lactis, które hodowano na -1 podłożu stałym M17 agar z dodatkiem 0.5% glukozy oraz erytromycyną o końcowym stężeniu 5 ng ml-, a z wyhodowanej populacji wyodrębniono metodą PCR, z zastosowaniem odpowiednich starterów, komórki zawierające oczekiwane syntetyczne geny. Zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanych fragmentów DNA z sekwencjami nukleotydowymi genów syntetycznych potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA.
Otrzymane prawidłowe rekombinowane plazmidy wyizolowano znaną metodą z komórek bakterii Lactococcus i wprowadzano poprzez elektroporację do komórek innych rodzajów bakterii mlekowych, tj. Bifidobacterium i Lactobacillus.
Komórki szczepów L. lactis transformowano znaną techniką elektroporacji (19). Komórki Bifidobacterium i Lactobacillus transformowano znaną techniką elektroporacji według wcześniej ustalonych procedur (20, 21).
Pozostałe techniki biologii molekularnej użyte w przykładzie były zgodne ze standardową metodyką (22).
T a b e l a 1
Sekwencje starterów („LONG”) użytych jako matryca do amplifikacji sztucznych genów neuropeptydów
| Nazwa neuropeptydu | Nazwa startera | Sekwencje starterów (forward/reverse) |
| MBP21-40 | FLONG MPB21 | 5' GAGTATTTCTATGGATCA- TGCTCGTCATGGTTTTTTACCACGTCATCGTGATACTGGTATTTTAGATTCA 3' |
| RLONG MPB21 | 5' TGAATCTAAAATACCAGT- ATCACGATGACGTGGTAAAAAACCATGACGAGCATGATCCATAGAAATACTC 3' | |
| MOG35-55 | FLONG MOG35 | 5' GTATTTCTATGGAAGTTG- GATGGTATCGTTCACCATTTTCACGTGTTGTTCATTTATATCGTAATGG 3' |
| RLONG MOG35 | 5' CCATTACGATATAAATGA- ACAACACGTGAAAATGGTGAACGATACCATCCAACTTCCTAGAAATAC 3' | |
| MBP85-97 | FLONG MPB85 | 5' GTATTTCTATGCCAGGATCACGTCCACATTTAATTCGTTTATTTTCACGT 3' |
| RLONG MPB85 | 5' ACGTGAAAATAAACGAATTAAATGTGGACGTGATCCTGGCATAGAAATAC 3' | |
| PLP139-151 | FLONG PLP139 | 5' GTATTTCTATGCATTCATTAGGAAATGGTTAGGACATCCAGATAAATTT 3' |
| RLONG PLP139 | 5' AAATTTATCTGGATGTCCTAACCATTTTCCTAATGAATGCATAGAAATAC 3' |
PL 217 128 B1 cd. tabeli 1
| PLP178-191 | FLONG PLP178 | 5' GTATTTCTATGAATACATGGACAACATGTCAATCAATTGCTTTTCCATC 3' |
| RLONG PLP178 | 5' GATGGAAAAGCAATTGATTGACATGTTGTCCATGTATTCATAGAAATAC 3' |
P r z y k ł a d II
Produkcja wybranych peptydów w komórkach bakterii mlekowych polegała na ekspresji syntetycznych genów w komórkach bakteryjnych poprzez ich hodowlę na podłożu zdefiniowanym typu CDM (z ang. chemically defined medium), z dodatkiem celobiozy, w stężeniu nie mniejszym niż 0.5%, w temperaturze w granicach 20°C-30°C, preferencyjnie 30°C, do osiągnięcia gęstości optycznej OD600 >0.6.
P r z y k ł a d III
Badanie ekspresji syntetycznych genów wybranych peptydów mielinowych na poziomie transkrypcji przeprowadzano wykorzystując metodę RT-PCR. Z bakteryjnych szczepów niosących rekombinowane plazmidy izolowano całkowite RNA, które po odpowiedniej obróbce poddawano reakcji odwrotnej transkrypcji przy użyciu starterów reverse (revSHORT_peptyd) komplementarnych do końca 3' nici kodującej syntetyczny gen (Tabela 2). Otrzymane cDNA podawano następnie reakcji amplifikacji techniką klasycznego PCR, wykorzystując dwie pary starterów (forSHORTUniv i revSHORT_peptyd) (Tabela 2). W wyniku eksperymentu otrzymywano fragmenty DNA, o długości odpowiadającej długości każdego z genów.
T a b e l a 2
Sekwencje starterów „SHORT” użytych do amplifikacji sztucznych genów neuropeptydów
| Nazwa neuropeptydu | Nazwa startera | Sekwencje starterów |
| Starter uniwersalny forward | ForSHORTUniv | 5' ACGCGTCGACAAGGAGTATTTCTATG 3' |
| MBP21-40 | rev SHORT MBP21 | 5' AACTGCAGTTATTATGAATCTAAAATACCAG 3' |
| MOG35-55 | rev SHORT MOG35 | 5' AACTGCAGTTATTATTTTCCATTACGATA 3' |
| MBP85-97 | rev SHORT MBP85 | 5' AACTGCAGTTATTAACGTGAAAATAAACG 3' |
| PLP139-151 | rev SHORT PLP139 | 5' AACTGCAGTTATTAAAATTTATCTGG 3' |
| PLP178-191 | rev SHORT PLP178 | 5' AACTGCAGTTATTATTTTGATGGAAAAGC 3' |
P r z y k ł a d IV
Badania ekspresji syntetycznych genów wybranych peptydów mielinowych na poziomie translacji przeprowadzano metodą immunoblottingu, wykorzystując ekstrakty białkowe, otrzymane znanymi metodami z hodowli komórek bakteryjnych zawierających rekombinowane plazmidy, zawieszone w buforze PBS, pH 7.4 oraz odpowiednie, specyficzne przeciwciała, dostępne komercyjnie.
P r z y k ł a d V
Region promotorowy genu ptcB zamplifikowano metodą PCR na matrycy genomowego DNA szczepu L. lactis IL1403 przy użyciu odpowiednich starterów (Tabela 3). W wyniku reakcji amplifikacji PCR otrzymywano produkt o oczekiwanej długości, który następnie trawiono enzymami NciI oraz VspI i łączono z plazmidem pIL253, zdolnym do replikacji w komórkach bakteryjnych z rodzaju Lactococcus, trawionym uprzednio tymi samymi enzymami. Zrekombionowane DNA wprowadzano metodą elektroporacji do komórek szczepu L. lactis, które hodowano na podłożu stałym M17 agar z dodatkiem
0.5% glukozy oraz erytromycyną o końcowym stężeniu 5 μg m- , a z wyhodowanej populacji wyodrębniono metodą PCR, z zastosowaniem odpowiednich starterów, komórki zawierające region promotorowy genu ptcB.
Komórki szczepów L. lactis transformowano techniką elektroporacji (19).
Pozostałe techniki biologii molekularnej użyte w przykładzie były zgodne ze standardową metodyką (22).
T a b e l a 3
Sekwencje starterów użyte do amplifikacji regionu promotorowego genu ptcB
| Nazwa startera | sekwencja starterów |
| ptcBfor | 5' GCGATTAATGTCGCCTAAAGGTTGC 3' |
| ptcBrev | 5' AATCCCGGCGTTTTATAATTTAACGTTC 3' |
PL 217 128 B1
P r z y k ł a d VI
Syntetyczne geny peptydów amplifikowano metodą PCR przy użyciu odpowiednich starterów 'SHORT' (Tabela 2) a następnie łączono z wektorem zdolnym do replikacji w komórkach bakterii Escherichia coli - pGEMT-Easy. Zrekombinowane DNA wprowadzano metodą elektroporacji do komórek szczepu E. coli, które hodowano na podłożu LB agar z dodatkiem ampicyliny o końcowym stęże-1 niu 100 μg ml- , a z wyhodowanej populacji wyodrębniono metodą PCR, z zastosowaniem odpowiednich starterów, komórki zawierające oczekiwane syntetyczne geny. Zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanych fragmentów DNA z sekwencjami nukleotydowymi genów syntetycznych potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA.
Komórki E. coli transformowano techniką elektroporacji (22).
Pozostałe techniki biologii molekularnej użyte w przykładzie były zgodne ze standardową metodyką (22).
P r z y k ł a d VII
Strukturę sekwencji nukleotydowej syntetycznych genów wybranych peptydów mielinowych oraz regionu promotorowego genu ptcB, według wynalazku, potwierdzano przez sekwencjonowanie fragmentów DNA przy zastosowaniu zestawu BigDye Terminator (Promega, USA) i sekwenatora ABI377 (Applied Biosystem, USA) oraz stosując rekombinowane plazmidy jako matrycę i startery o sekwencjach komplementarnych do skrajnych sekwencji dla każdej ze wstawek. Uzyskane sekwencje nukleotydowe analizowano przy pomocy programu BLAST (23).
T a b e l a 4 Szczepy i plazmidy
| Szczep | genotyp | źródło |
| Lactococcus lactis | ||
| IL1403 | laboratoryjny szczep, bezplazmidowy | (24) |
| IBB360 | Szczep o potencjalnych właściwościach autolizujących | J. Bardowski - kolekcja własna IBB PAN |
| IBB477 | Szczep o potencjalnych właściwościach adhezyjnych, Tcr | J. Życka-Krzesińska - kolekcja własna IBB PAN |
| Bifidobacterium | ||
| Bifidobacterium pseudocatenulatum M115 | Human intestinal isolate; plazmid free | IPLA Laboratory Collection |
| Lactobacillus | ||
| Lactobacillus plantarum | NCFB1193 | NCFB Collection |
| Escherichia coli | ||
| TG1 | supE Q(hsdm-mcrB)(rk-mk-McrB)thi Q(lac-oroAB)F'[traD36 lacIq lacZ QM15 proA+B+] | (25) |
| Plazmid | ||
| pIL253 | Eryr, wektor do klonowania genów w bakteriach z rodzaju Lactococcus | (26) |
| pIL253-_p[ptcB] | Eryr, wektor do klonowania genów w bakteriach z rodzaju Lactococcus, z regulowanym regionem promotorowym genu ptcB | ta praca |
| pGEMT-Easy | AmpR, wektor do klonowania genów w bakteriach z rodzaju Escherichia coli | Promega |
* Eryr - oporność na erytromycynę Ampr - oporność na erytromycynę
Claims (15)
1. Syntetyczne geny kodujące fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych, przeznaczone do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej, zawierają co najmniej jedną sekwencję nukleotydową kodującą fragment białka mielinowego, wybraną z grupy obejmującej: sekwencję nukleotydową dla fragmentu MBP21-40, przedstawioną wzorem 1, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 1a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu MOG35-55, przedstawioną wzorem 2, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 2a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu MBP85-97, przedstawioną wzorem 3, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 3a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu PLP139-151, przedstawioną wzorem 4, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 4a, i/lub sekwencję nukleotydową dla fragmentu PLP178-191, przedstawioną wzorem 5, kodującą peptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej wzorem 5a.
2. Sposób wytwarzania genów kodujących wybrane fragmenty peptydowe białek mielinowych przeznaczonych do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej, znamienny tym, że syntetyzuje się metodą PCR syntetyczne geny kodujące wybrane peptydy, z wykorzystaniem specyficznych dla każdego peptydu 2 komplementarnych starterów („LONG) przedstawionych w Tabeli 1, których sekwencje nukleotydowe zostały zaprojektowane tak, aby odpowiadały kodonom preferencyjnie występującym u bakterii z gatunku Lactococcus lactis, przy czym do sekwencji nukleotydowej starterów „FLONG (forward LONG) dla peptydów MBP85-97, PLP139-151 oraz PLP178-191 wprowadza się sekwencję, odpowiadającą kodonowi START translacji (ATG), tuż przed sekwencją kodującą pierwszy aminokwas oryginalnych sekwencji peptydowych, a jednocześnie końce 5' starterów „FLONG_peptyd zawierają dodatkową, typową dla bakterii Lactococcus lactis sekwencję RBS (ang. ribosome-binding site; miejsce wiązania rybosomów), rozpoznawaną przez maszynerię translacyjną oraz sekwencję 'spacer' (sekwencję łącznikową) zlokalizowaną między regionem RBS, a kodonem START translacji, przy czym startery „LONG stosuje się jako matrycę, na której techniką PCR przeprowadza się syntezę syntetycznych genów przy użyciu krótkich starterów („SHORT) homologicznych do 5' końców starterów „FLONG_peptyd i „RLONG_peptyd, a końce 5' starterów „SHORT niosą dodatkowo sekwencje rozpoznawane przez specyficzne endonukleazy restrykcyjne, preferencyjnie SaII (dla startera forward SHORT) oraz PstI (dla startera reverse SHORT), natomiast końce 5' starterów „revSHORT_peptyd (reverse SHORT) posiadają dodatkowo dwukrotnie powtórzoną sekwencję odpowiadającą kodonowi STOP translacji (TAA), w celu otrzymania fragmentu DNA, w obrębie którego zawarta jest sekwencja syntetycznego genu o wzorze 1, wzorze 2, wzorze 3, wzorze 4 lub wzorze 5, kodującego wybrany fragment peptydowy naturalnego białka mielinowego.
3. Fragmenty DNA, zawierające sekwencje syntetycznych genów wybranych fragmentów peptydowych naturalnych białek mieliny (sekwencje podkreślone), przeznaczonych do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej, o sekwencjach nukleotydowych przedstawionych wzorem 6, wzorem 7, wzorem 8, wzorem 9 i wzorem 10.
4. Sposób klonowania wytworzonych fragmentów DNA zawierających syntetyczne geny, według zastrz. 1, znamienny tym, że poddaje się je trawieniu enzymami restrykcyjnymi, korzystnie PstI i SalI, a następnie łączy z wektorem plazmidowym zdolnym do replikacji w komórkach bakterii mlekowych, korzystnie z rodzaju Lactococcus, zwłaszcza z wektorem pIL253, trawionym uprzednio tymi
PL 217 128 B1 samymi enzymami restrykcyjnymi, w celu uzyskania plazmidów rekombinowanych, w których orientacja wklonowanych produktów PCR (wstawek) jest zgodna z kierunkiem transkrypcji kierowanej z wewnętrznego promotora obecnego w wektorze, po czym zrekombinowane DNA wprowadza się metodą elektroporacji do komórek szczepów bakteryjnych, które inkubuje się w znany sposób, a z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy gen, korzystnie poprzez analizę otrzyma nych transformantów techniką PCR na obecność wstawek o określonej długości, odpowiadającej długością fragmentom DNA zawierającym oczekiwane syntetyczne geny, po czym zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanych genów z sekwencjami nukleotydowymi genów syntetycznych potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako gramdodatnie szczepy bakterii mlekowych, do których wprowadza się rekombinowane DNA, stosuje się korzystnie szczepy z rodzaju Lactococcus, np. Lactococcus lactis IL1403, Lactococcus lactis IBB477 oraz Lactococcus lactis IBB360, o różnym stopniu przeżywalności w przewodzie pokarmowym ssaków oraz inne rodzaje bakterii mlekowych, preferencyjnie Lactobacillus oraz Bifidobacterium.
6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że poddaje się ekspresji syntetyczne geny wybranych fragmentów peptydowych w komórkach szczepów bakterii mlekowych, zwłaszcza z rodzaju Lactococcus, poprzez ich hodowle na znanym podłożu specyficznym dla bakterii mlekowych, preferencyjnie na pożywce M17 lub podłożu zdefiniowanym typu CDM (z ang. chemically defined medium), z dodatkiem cukru, korzystnie glukozy lub celobiozy, w stężeniu nie mniejszym niż 0.5% lub też na mleku, serwatce czy też innym odpowiednim podłożu, w temperaturze w granicach 20°C-30°C, preferencyjnie 30°C.
7. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że poddaje się ekspresji syntetyczne geny wybranych fragmentów peptydowych w komórkach szczepów bakterii z gatunku Escherichia coli, poprzez połączenie syntetycznego genu amplifikowanego odpowiednimi starterami 'SHORT' z wektorem, preferencyjnie ze zlinearyzowanym komercyjnym plazmidem pGENT-Easy lub innym, zdolnym do replikacji w komórkach bakterii gramujemnych, korzystnie z gatunku Escherichia coli, przy czym zrekombinowane DNA wprowadza się znaną metodą, korzystnie metodą elektroporacji, do komórek szczepów bakteryjnych, które hoduje się w znany sposób, a z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy gen, korzystnie poprzez analizę otrzymanych transformantów techniką PCR na obecność wstawek o określonej długości, odpowiadającej długością fragmentom DNA zawierającym oczekiwane syntetyczne geny, po czym zgodność sekwencji nukleotydowych sklonowanych genów z sekwencjami nukleotydowymi genów syntetycznych potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako gramujemne szczepy bakteryjne, do których wprowadza się rekombinowane DNA, stosuje się bakterie z gatunku Escherichia coli, zwłaszcza szczep TG1.
9. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że do optymalizacji biosyntezy peptydów w bakteriach mlekowych stosuje się region promotorowy genu ptcB.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że zastępuje się wewnętrzny konstytutywny promotor na wektorze plazmidowym, replikującym się w komórkach L. lactis, promotorem regulowanym, korzystnie regionem promotorowym genu pochodzącego z genomu bakterii L. lactis lub innego gatunku czy z genomu bakteriofaga, preferencyjnie regionem promotorowym genu ptcB, aangażowanego w katabolizm cukrów u bakterii mlekowych z rodzaju Lactococcus, regulowanym poprzez obecność w pożywce różnych cukrów, takich jak: celobioza, galaktoza, salicyna, eskulina, glukoza.
11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że hoduje się komórki niosące rekombinowany wektor plazmidowy ze sklonowanym syntetycznym genem oraz odpowiednim regionem promotorowym, korzystnie promotorem genu ptcB z genomu bakterii z rodzaju Lactococcus, na znanym podłożu specyficznym dla bakterii mlekowych, zwłaszcza na podłożu zdefiniowanym typu CDM (chemically defined medium), z dodatkiem cukru, korzystnie glukozy lub celobiozy, o stężeniu > 0.5%, lub też na mleku, serwatce czy innym odpowiednim podłożu, w temperaturze w granicach 20°-30°C, preferencyjnie 30°C.
12. Sekwencja nukleotydowa regionu promotorowego genu ptcB, o długości obejmującej region -10 i -35, przedstawiona wzorem 11 przeznaczona do optymalizacji produkcji syntetycznych genów kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych według zastrz. 1.
13. Sposób wytwarzania sekwencji nukleotydowej regionu promotorowego genu ptcB z L. lactis oraz sposób zastąpienia nim wewnętrznego konstytutywnego promotora na wektorze plazmidowym,
PL 217 128 B1 replikującym się w komórkach L. lactis, znamienny tym, że region promotorowy genu ptcB wytwarza się w reakcji PCR, poprzez użycie jako matrycy chromosomalnego DNA szczepu L. lactis IL1403 oraz pary starterów (ptcBfor i ptcBrev) o sekwencjach komplementarnych do sekwencji DNA okalających region promotorowy chromosomalnego genu oraz zmodyfikowanych tak, aby na ich końcach 5' znajdowały się sekwencje rozpoznawane przez odpowiednie endonukleazy restrykcyjne, preferencyjnie VspI (dla startera ptcBfor) oraz NciI (dla startera ptcBrev). W wyniku reakcji PCR, używając tak zaprojektowanych starterów, otrzymuje się fragment DNA o sekwencji nukleotydowej przedstawionej wzorem 12, w obrębie których zawarta jest sekwencja regionu promotorowego genu ptcB (podkreślona), a następnie tak uzyskany produkt poddaje się działaniu enzymami restrykcyjnymi, preferencyjnie VspI i NciI, a następnie łączy się go z rekombinowanymi wektorami niosącymi syntetyczne geny, kodujące wybrane peptydy, z których usunięto oryginalny region promotorowy, korzystnie poprzez działanie tych samych restryktaz, a zrekombinowane DNA wprowadza się metodą elektroporacji do komórek szczepów bakteryjnych, które hoduje się w znany sposób, a z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy region promotorowy, korzystnie poprzez analizę otrzymanych transformantów techniką PCR na obecność fragmentu DNA o oczekiwanej długości, odpowiadającej długości wybranemu regionowi promotorowemu genu ptcB, następnie zgodność sekwencji nukleotydowej sklonowanego fragmentu DNA z sekwencją nukleotydową regionu promotorowego genu ptcB potwierdza się techniką sekwencjonowania DNA.
14. Zastosowanie bakterii zawierających syntetyczne geny kodujące fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych według zastrz. 1, do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej.
15. Zastosowanie sekwencji nukleotydowej regionu promotorowego genu ptcB, o długości obejmującej region -10 i -35, przedstawionej wzorem 11, według zastrz. 12 do optymalizacji produkcji syntetycznych genów kodujących fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych według zastrz. 1.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL392037A PL217128B1 (pl) | 2010-08-02 | 2010-08-02 | Syntetyczne geny kodujące fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych przeznaczone do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej, fragmenty DNA zawierające te geny, sposób otrzymywania tych peptydów w układzie mikrobiologicznym (bakteryjnym) oraz ich zastosowanie medyczne |
| EP11176165.6A EP2436693B1 (en) | 2010-08-02 | 2011-08-01 | Synthetic genes encoding peptide fragments of natural myelin proteins for induction of oral tolerance, DNA fragment comprising these genes, means of obtaining these peptides in a microbial (bacterial) system and their medical application |
| ES11176165.6T ES2561667T3 (es) | 2010-08-02 | 2011-08-01 | Genes sintéticos que codifican fragmentos de péptido de proteínas naturales de mielina para la inducción de la tolerancia oral, fragmento de ADN que comprende estos genes, medios para obtener estos péptidos en un sistema microbiano (bacteriano) y su aplicación médica |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL392037A PL217128B1 (pl) | 2010-08-02 | 2010-08-02 | Syntetyczne geny kodujące fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych przeznaczone do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej, fragmenty DNA zawierające te geny, sposób otrzymywania tych peptydów w układzie mikrobiologicznym (bakteryjnym) oraz ich zastosowanie medyczne |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL392037A1 PL392037A1 (pl) | 2012-02-13 |
| PL217128B1 true PL217128B1 (pl) | 2014-06-30 |
Family
ID=45442797
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL392037A PL217128B1 (pl) | 2010-08-02 | 2010-08-02 | Syntetyczne geny kodujące fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych przeznaczone do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej, fragmenty DNA zawierające te geny, sposób otrzymywania tych peptydów w układzie mikrobiologicznym (bakteryjnym) oraz ich zastosowanie medyczne |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP2436693B1 (pl) |
| ES (1) | ES2561667T3 (pl) |
| PL (1) | PL217128B1 (pl) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013104424A1 (en) * | 2012-01-13 | 2013-07-18 | Instytut Biochemii I Biofizyki Pan | Synthetic genes encoding peptide fragments of natural myelin proteins for induction of oral tolerance, dna fragment comprising these genes, means of obtaining these peptides in a microbial (bacterial) system and their medical application |
| WO2013107526A2 (en) * | 2012-01-22 | 2013-07-25 | Instytut Biochemii I Biofizyki Pan | Synthetic genes encoding peptide fragments of natural myelin proteins for induction of oral tolerance, dna fragment comprising these genes, means of obtaining these peptides in a microbial (bacterial) system and their medical application |
| GB201300684D0 (en) | 2013-01-15 | 2013-02-27 | Apitope Int Nv | Peptide |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL132611A0 (en) * | 1999-10-27 | 2001-03-19 | Yeda Res & Dev | Synthetic genes and polypeptides and pharmaceutical compositions comprising them |
| EP1723965A1 (en) * | 2005-05-18 | 2006-11-22 | Stallergenes Sa | Compositions for antigen-specific induction of immuno-tolerance via oral immunization |
-
2010
- 2010-08-02 PL PL392037A patent/PL217128B1/pl unknown
-
2011
- 2011-08-01 EP EP11176165.6A patent/EP2436693B1/en not_active Not-in-force
- 2011-08-01 ES ES11176165.6T patent/ES2561667T3/es active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL392037A1 (pl) | 2012-02-13 |
| EP2436693A3 (en) | 2012-08-15 |
| EP2436693B1 (en) | 2016-01-20 |
| ES2561667T3 (es) | 2016-02-29 |
| EP2436693A2 (en) | 2012-04-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tavares et al. | Novel strategies for efficient production and delivery of live biotherapeutics and biotechnological uses of Lactococcus lactis: the lactic acid bacterium model | |
| JP6641262B2 (ja) | ポリペプチド及びイムノモジュレーション | |
| JP6918854B2 (ja) | 免疫調節ミニ細胞および使用方法 | |
| CN102317311B (zh) | 鼠李糖乳杆菌菌毛多肽和产生它们的方法 | |
| US20220127628A1 (en) | A genetically modified lactobacillus and uses thereof | |
| Levit et al. | Use of genetically modified lactic acid bacteria and bifidobacteria as live delivery vectors for human and animal health | |
| Effendi et al. | Prospective and challenges of live bacterial therapeutics from a superhero Escherichia coli Nissle 1917 | |
| CN107903310B (zh) | 一种重组膜蛋白、微生物、含有其的组合物及应用 | |
| EP2597151A2 (en) | Recombinant microorganisms, methods for preparing vaccine strains, antigens, and vector vaccine compositions of same, uses thereof, and related antibodies, diagnostic kit, and treatment and/or prophylactic methods | |
| PL217128B1 (pl) | Syntetyczne geny kodujące fragmenty peptydowe naturalnych białek mielinowych przeznaczone do wywoływania efektu tolerancji pokarmowej, fragmenty DNA zawierające te geny, sposób otrzymywania tych peptydów w układzie mikrobiologicznym (bakteryjnym) oraz ich zastosowanie medyczne | |
| KR20230064602A (ko) | Gm-csf의 분비를 위한 발현벡터 및 이에 의해 형질전환된 항암 재조합 균주 | |
| Scott et al. | Non-adjuvanted flagellin elicits a non-specific protective immune response in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) towards bacterial infections | |
| Israr et al. | Lactic acid bacteria as vectors: a novel approach for mucosal vaccine delivery | |
| US20250236838A1 (en) | E. coli nissle strain with improved transformation efficiency | |
| Ghatani et al. | Bifidobacterial Genome Editing for Potential Probiotic Development | |
| Dolatabadi et al. | Lactococcus lactis as an oral vector for cloning of heat shock protein A from Helicobacter pylori. | |
| Rodrigues et al. | A review of Campylobacter jejuni pathogenesis: main virulence factors and their use as biomarkers | |
| US20220241400A1 (en) | Immunomodulation platform and methods of use | |
| US20170209501A1 (en) | Production of omega 3 fatty acids by recombinant escherichia coli nissle 1917 | |
| WO2013107526A2 (en) | Synthetic genes encoding peptide fragments of natural myelin proteins for induction of oral tolerance, dna fragment comprising these genes, means of obtaining these peptides in a microbial (bacterial) system and their medical application | |
| WO2013104424A1 (en) | Synthetic genes encoding peptide fragments of natural myelin proteins for induction of oral tolerance, dna fragment comprising these genes, means of obtaining these peptides in a microbial (bacterial) system and their medical application | |
| Liu et al. | Construction and characterization of recombinant attenuated Salmonella typhimurium expressing the babA2/ureI fusion gene of Helicobacter pylori | |
| TWI458824B (zh) | 沙門氏桿菌及含其之疫苗 | |
| CN117460416A (zh) | 沙门氏菌疫苗 | |
| KR20240146562A (ko) | 이종 단백질을 분비하는 항암 균주 및 이를 포함하는 항암 조성물 |