CN107903310B

CN107903310B - 一种重组膜蛋白、微生物、含有其的组合物及应用

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Publication number: CN107903310B
Application number: CN201711135853.6A
Authority: CN
Inventors: 苏志坚; 李校堃; 周汛; 杨海涛; 张羽飞; 杨波
Original assignee: Guangzhou Bestron Medical Equipment Co ltd; Guangzhou Baisilun Biological Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Bai slen Biological Technology Co. Ltd.
Priority date: 2017-11-16
Filing date: 2017-11-16
Publication date: 2021-02-05
Anticipated expiration: 2037-11-16
Also published as: CN107903310A

Abstract

本申请涉及重组膜蛋白、微生物、含有其的组合物，特别是其在在预防和/或改善生物代谢病症中的应用。其中，重组膜蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

Description

一种重组膜蛋白、微生物、含有其的组合物及应用

技术领域

本申请涉及重组膜蛋白、微生物、含有其的组合物，特别是其在在预防和/或改善生物代谢病症中的应用。

背景技术

当今社会中，人口肥胖问题日益严重，且低龄化倾向明显。而作为糖尿病、心血管疾病、肝脏疾病和肿瘤等多种疾病的诱发因素，肥胖症已被世界各国卫生组织视为最重要的、最亟待解决的公共健康问题之一。研究早已证实，个人的不良生活方式，如摄入过高热量、不合理的膳食结构、较少的身体活动、及有益的肠道菌群降低等，是造成肥胖的关键原因。

人体消化道是一个复杂的系统。食物经过口腔、胃和小肠的消化分解后，停留在大肠。肠道菌群利用这些未完全消化的食物进行新陈代谢活动，为人体提供营养、能量、免疫保护等功能。前人研究表明，与正常体重的人相比，肥胖患者的肠道菌群结构差异明显，主要是肠道细菌的多样性发生显著下降。人为地改变特定菌群的数量，如厚壁菌门和拟杆菌门的细菌，可以改善甚至治愈肥胖相关的代谢性疾病。Wen等通过对比正常鼠和转基因小鼠肠道内菌群结构后，在转基因小鼠肠道内提高乳杆菌、理研菌和紫单胞菌的数量，结果发现，这些细菌含量的提升可以显著缓解1型糖尿病模型小鼠体内各种病理指征(L.Wen etal.,Innate immunity and intestinal microbiota in thedevelopment of type1diabetes.2008,Nature,455(7216):1109–1113)。

疣微菌门(Verrucomicrobia)广泛分布于水体、陆地及高等动物的肠道中。在人体内，疣微菌门细菌占肠道微生物总数的1-5％(M.Derrien et al.,The mucin degraderakkermansia muciniphila is an abundant resident of the human intestinaltract.2008,Applied and environmental microbiology,74(5):1646–1648)。阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)属于疣微菌门，是一种寄居在肠道粘液层的革兰氏阴性菌，其可以降解肠道粘液中的粘蛋白，并为其它肠道共生细菌提供半乳糖、海藻糖和N-乙酰葡萄糖胺等小分子物质。临床研究结果提示，与正常体重人肠道菌群相比，肥胖和2型糖尿病人肠道中阿克曼氏菌的含量显著降低。而通过口服方法重复施用阿克曼氏菌可以改善或者治疗肥胖症、糖尿病、葡萄糖耐受不良、异常脂质代谢、动脉粥样硬化、高血压、心脏病、中风、非酒精性脂肪肝病、高血糖症、肝性脂肪变性、血脂异常、与超重和肥胖症相关的免疫系统功能障碍等多种疾病。

进一步的研究发现，连续口服阿克曼氏菌细胞膜上的一种膜蛋白(Amuc_1100)同样可以改善肥胖或糖尿病模型老鼠体内的新陈代谢，其降低体重的能力与使用阿克曼氏菌相当。并能显著减少肠道炎症、降低体重以及调整体内脂肪含量至正常水平(H.Plovier etal.A purified membrane protein from Akkermansiamuciniphila or the pasteurizedbacterium improves metabolism in obese and diabetic mice.Nature medicine,2017,23(1):107-113)。

发明内容

为了更好地改善肥胖和/或糖尿病患者或潜在肥胖和/或糖尿病人群的状况，本申请获得了一种重组膜蛋白，特别是能够表达产生该蛋白的重组微生物。

具体来讲，本申请之一提供了一种重组膜蛋白，其氨基酸序列包含如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。包含在如SEQ ID No.1中的如SEQ ID No.3的氨基酸序列可以等同替换为与其具有相同功能的氨基酸序列，这是本领域技术人员容易理解的，并且这种等同替换也在本申请的保护范围内。

本申请之二提供了一种能够编码如本申请之一所述的重组膜蛋白的核苷酸序列。

在一个具体实施方式中，所述核苷酸序列包含如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

本申请之三提供了一种微生物，其能够表达产生如本申请之一所述的重组膜蛋白。

在一个具体实施方式中，所述微生物中含有如本申请之二所述的核苷酸序列。

在一个具体实施方式中，所述核苷酸序列位于表达载体上。

在一个具体实施方式中，所述微生物选自益生菌中的至少一种。

在一个具体实施方式中，所述微生物选自双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococus)、肠球菌属(Enterococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus)中的至少一种。

在一个具体实施方式中，优选所述微生物选自双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、粪肠球菌(Enterococcus faecium)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳酸链球菌(Streptococus lactis)中的至少一种。例如：双歧杆菌属长双歧杆菌(Bifidobacterium longum，ATCC 55813)、乳球菌属乳酸乳球菌(Lactococcus lactis，ATCC 19257)、肠球菌属粪肠球菌(Enterococcus faecium，ATCCBAA-2319)、乳杆菌属干酪乳杆菌(Lactobacillus casei，ATCC 393)、链球菌属乳酸链球菌(Streptococus lactis，ATCC 8403)。

本申请之四提供了一种组合物，所述组合物中包含如本申请之一所述的重组膜蛋白和/或如本申请之三中任意一项所述的微生物。

在一个具体实施方式中，所述组合物可以为食品、药品、饲料中的一种。并且根据作为食品、药品和饲料的用途，本领域的技术人员可以合理地添加相应的可接受的主料或辅料。由于部分生物群体对高脂食物具有很高的偏好性，为了在满足其口感偏好的同时，有效的控制其体重的增长，可以在组合物中加入高脂成分，例如，胆固醇、动物油脂、植物油脂、坚果等等。

在一个具体实施方式中，所述重组蛋白和/或所述微生物在所述组合物中的含量可以具有药学上的有效量。在用于食品和饲料时，所述重组蛋白和/或所述微生物的用量可以比较低，而用于作为药品时，则用量会偏高，这是本领域技术人员容易理解的。

在一个具体实施方式中，所述重组蛋白在所述组合物中的质量百分含量为2％至30％。

在一个具体实施方式中，所述微生物在所述组合物中的含量为1×10⁷cfu/g至1×10¹¹cfu/g。

本申请之五提供了如本申请之一所述的重组膜蛋白、本申请之二所述的核苷酸序列、如本申请之三中任意一项所述的微生物，以及如本申请之四所述的组合物中的至少一种在预防和/或改善生物代谢病症中的应用。或者换种表达方式讲，本申请之五提供了如本申请之一所述的重组膜蛋白、本申请之二所述的核苷酸序列、如本申请之三中任意一项所述的微生物，以及如本申请之四所述的组合物中的至少一种在制备用于预防和/或改善生物代谢病症药物和/或食品中的应用。

在一个具体实施方式中，所述生物选自人和/或动物中的一种。

在一个具体实施方式中，所述动物选自哺乳动物中的一种。

在一个具体实施方式中，所述哺乳动物可以为宠物。例如猫、狗、豚鼠、兔等。

在一个具体实施方式中，所述代谢病症选自肥胖症和/或糖尿病。

在一个具体实施方式中，所述肥胖为高脂饮食导致的肥胖。

在一个具体实施方式中，所述糖尿病为1或2型糖尿病。

“益生菌”是指提供对生物的保健或健康有益作用的微生物或微生物组分。根据定义，所述益生菌都具有被证明的非病原特性。

本申请中的微生物可以单独使用或者作为药物组合物的主要成分用于预防和改善因高脂饮食而导致的肥胖和糖尿病，其包含药效学有效量的本申请的重组膜蛋白或本申请的以表面展示方式表达重组膜蛋白的微生物。

本领域技术人员应该注意，上述“药学上的有效量”或“有效量”意指治疗有效量，本领域技术人员根据现有技术、经过简单的、有限次的实验即可确定其具体的数值。

本申请中的核苷酸序列可以交付给生物公司(例如按照Itatura等人所述的技术(Science，1977，198：1056-1063))来合成，也可以利用本领域已知的技术从宿主基因组中获得和鉴定基因。而本领域已知的技术包括进行基因的合成、克隆和重组表达载体的构建、核苷酸序列的鉴定、宿主细胞的转化和培养及重组蛋白的分离鉴定等操作参见Sambrooket al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989。

本申请的有益效果：

本申请的重组膜蛋白，特别是重组微生物能够更好地改善代谢病症(例如肥胖症和/或糖尿病)，其可以显著降低因高脂饮食而引起的体重超重的问题；能够使生物的体重从过高水平恢复到正常水平。而且还能显著地改善高脂饮食生物的糖耐量。

附图说明

图1显示了乳杆菌表达质粒pEH9-SAL的质粒图谱。

图2显示了重组膜蛋白的Western Blot检测示意图：1.空白对照；2.从大肠杆菌中重组表达及纯化后的阿克曼氏菌膜蛋白；3.本申请的重组膜蛋白融合蛋白。

图3显示了口服重组干酪乳杆菌对高脂饮食小鼠体重变化的影响；

正常饲料对照组、高脂饲料模型组、重组干酪乳杆菌组(表面展示表达融合蛋白的乳杆菌1×10⁹CFU/天，约含5μg融合蛋白)、混合干酪乳杆菌组(3μg阿克曼氏菌膜蛋白Amuc_1100冻干粉+干酪乳杆菌1×10⁹CFU/天)、干酪乳杆菌组(干酪乳杆菌1×10⁹CFU/天)及阿克曼氏菌(阿克曼氏菌1×10⁹CFU/天)。各处理组动物每天通过灌胃的方式分别口服施用悬浮于磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS)中的干酪乳杆菌、阿克曼氏菌、混合干酪乳杆菌和重组干酪乳杆菌，正常对照组及高脂饲料模型组动物分别施用等体积磷酸盐缓冲液。各处理组及高脂饲料模型组动物饲喂高脂饲料(每100克饲料中含有26.2％蛋白质、26.3％碳水化合物及34.9％脂肪，含524千卡路里热量)，而正常饲料对照组动物则投喂不含高脂成分的普通饲料。图中所有的点代表动物增重的数值，***表示p<0.001(vs高脂饲料模型组)；**表示p<0.01(vs高脂饲料模型组)；*表示p<0.01(重组干酪乳杆菌组vs混合干酪乳杆菌组)；#表示p<0.05(混合干酪乳杆菌vs干酪乳杆菌组)；$表示p<0.05(重组干酪乳杆菌组vs阿克曼氏菌组)。

图4显示了不同剂量的重组干酪乳杆菌对高脂饮食小鼠体重变化的影响；

正常饲料对照组、高脂饲料模型组、低剂量重组干酪乳杆菌组(1×10⁷CFU/天)、中剂量重组干酪乳杆菌组(1×10⁹CFU/天)及高剂量重组干酪乳杆菌组(1×10¹¹ CFU/天)。各处理组动物每天通过灌胃的方式分别口服施用不同剂量的悬浮于磷酸盐缓冲液中的重组干酪乳杆菌，正常对照组及高脂饲料模型组动物分别施用等体积磷酸盐缓冲液。各处理组及高脂饲料模型组动物投喂高脂饲料(100克饲料中含有26.2％蛋白质、26.3％碳水化合物及34.9％脂肪，约含524千卡路里热量)，而正常饲料对照组动物则投喂不含高脂成分的普通饲料。(图中所有的点代表动物增重的数值，***表示p<0.001,**表示p<0.01，vs高脂饲料模型组)。

图5显示了口服重组干酪乳杆菌对高脂饮食小鼠血清血糖含量变化的影响；

分为正常饲料对照组、高脂饲料模型组、重组干酪乳杆菌组(表达融合蛋白的重组乳杆菌1x10⁹CFU/天)以及干酪乳杆菌组(1×10⁹CFU/天)。各处理组动物每天通过灌胃方式分别口服重组干酪乳杆菌和干酪乳杆菌组，而对照组及模型组动物则使用等体积磷酸盐缓冲液。各处理组及高脂饲料模型组动物投喂高脂饲料(饲料中含有26.2％蛋白质、26.3％碳水化合物及34.9％脂肪，每克饲料约含5.24千卡路里热量)，而正常饲料对照组动物则投喂普通饲料。(图中所有的点代表血糖含量的平均值，*表示p<0.05,vs高脂饲料模型组。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。

需要说明的是，本领域技术人员应该理解，下述实施例中所用的试剂、酶类等除特别说明外，均为可从试剂公司商购的分析纯级别的试剂或酶类。

pEH9R载体的获取来源：参见Nguyen et al.,A Food-Grade System forInducible Gene Expression in Lactobacillusplantarum Using an AlanineRacemase-Encoding Selection Marker.2011,J.Agric.Food Chem.,59:5617–5624。

阿克曼氏菌购自美国ATCC资源中心(编号：ATCC BAA-835)，培养方法：脑心浸液培养基厌氧培养48-72小时。培养基配方(基于1升培养基总重量)：4克牛脑浸粉、4克牛心浸粉、5克蛋白胨、16克酪蛋白胨、5克氯化钠、2克葡萄糖、2.5克磷酸氢二钠，pH值7.4±0.2。

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)固体培养基：基于1升培养基总重量：0.4克磷酸氢二钾(KH₂PO₄)、0.53克磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)、0.3克氯化铵(NH₄Cl)、0.3克氯化钠(NaCl)、0.1克氯化镁(MgCl₂)、0.11克氯化钙(CaCl₂)、4克碳酸氢钠(NaHCO₃)、0.25克硫化钠(Na₂S)、16克大豆蛋白胨、4克苏氨酸、5.54克N-乙酰葡糖胺、4.5克葡萄糖、15克琼脂粉，pH＝7.0。121℃灭菌20min。

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)表达培养基：基于1升培养基总重量：0.4克磷酸氢二钾(KH₂PO₄)、0.53克磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)、0.3克氯化铵(NH₄Cl)、0.3克氯化钠(NaCl)、0.1克氯化镁(MgCl₂)、0.11克氯化钙(CaCl₂)、4克碳酸氢钠(NaHCO₃)、0.25克硫化钠(Na₂S)、16克大豆蛋白胨、4克苏氨酸、5.54克N-乙酰葡糖胺、4.5克葡萄糖，pH＝7.0。121℃灭菌20min。

实施例1阿克曼氏菌膜蛋白Amuc_1100重组表达质粒的构建、表达以及口服样品的制备

参考Plovier等人的报道的方法(H.Plovieret al.A purified membraneprotein from Akkermansia muciniphila or the pasteurized bacterium improvesmetabolism in obese and diabetic mice.Nature medicine,2017,23(1):107-113)，利用基因工程方法在大肠杆菌系统中表达出含有组氨酸标签的阿克曼氏菌膜蛋白Amuc_1100，然后通过组氨酸标记凝胶亲和层析方法得到纯化的膜蛋白Amuc_1100。利用低温真空干燥的方法冻干蛋白，用于抗体的制备、Western实验中的阳性对照以及小鼠口服实验。实验前用磷酸缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS)重悬蛋白。

其中，Amuc_1100膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

实施例2重组表达质粒pEH9-SAL的构建及表达

在本申请中，获得了重组膜蛋白(融合蛋白，重组融合蛋白)的氨基酸序列，其如SEQ ID No.1所示。依据益生菌干酪乳杆菌的氨基酸偏好密码子的数据及利用化学合成的方法，获得了能够编码如SEQ ID No.1所示序列的核苷酸，该核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。送到苏州泓迅生物科技股份有限公司进行全基因合成，并将该DNA片段(编码如SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列，由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成)克隆到乳杆菌表达质粒pEH9R中，获得重组表达质粒pEH9-SAL，质粒图谱见图1。从转化菌株中抽提重组质粒pEH9-SAL，本领域的技术人员熟知的方法测序确定片段插入的方向以及编码的氨基酸都是正确的(参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。将测序正确的重组表达质粒利用电转方法(1.25kV，200Ω，25μF)转化至宿主菌干酪乳杆菌(Lactobacillus casei，购自ATCC，Catalog：393，USA)中，并通过含终浓度为100微克/毫升的红霉素的固体培养基在厌氧条件下倒置培养48小时，筛选阳性转化子，得到重组干酪乳杆菌。

将含有表达质粒pEH9-SAL的重组干酪乳杆菌接种到含终浓度为100微克/毫升的红霉素的表达培养基中。在37℃、厌氧条件培养至OD₆₀₀＝2(大约24-36小时)时，在培养基中加入终浓度为25毫克/升的诱导多肽SppIP(SEQ ID No.5，由上海吉尔生化有限公司合成，上海，中国)，继续培养重组干酪乳杆菌8小时。发酵结束后，最终获得表面展示融合蛋白的重组干酪乳杆菌。

然后，将发酵产物在12,000转/分钟下离心10分钟，收集菌体。按1∶10的比例(体积/重量)加入0.02摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)重悬菌体。超声波破碎仪破碎细胞后，18,000转/分钟离心30分钟，收集上清。

聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及蛋白杂交(Western-blot)检测和分析融合蛋白的表达(具体操作参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。凝胶电泳分析结果表明，经诱导多肽诱导8小时后，获得分子量约为52kDa的重组蛋白，与预期的分子量相当。对凝胶进行薄层层析扫描分析，结果提示，重组蛋白的表达量约为1毫克/升。随后，利用抗阿克曼氏菌膜蛋白Amuc_1100抗体(抗体定制于南京金斯瑞生物科技有限公司，江苏，中国)与重组融合蛋白及膜蛋白Amuc_1100(参见实施例1)进行Western蛋白杂交实验，见图3。结果表明，两种蛋白均可以与Amuc_1100膜蛋白抗体产生阳性反应。这些结果说明，重组融合蛋白在乳杆菌中获得表达。

实施例3口服干酪乳杆菌(不含重组蛋白)的样品制备

将干酪乳杆菌(Lactobacillus casei，ATCC 393)接种到不含抗生素的干酪乳酸菌表达培养基中。37℃、厌氧条件培养至OD₆₀₀＝2(大约18-36小时)时，离心收获干酪乳杆菌。利用平板计数方法计算细菌菌落数(Colony-Forming Units，CFU)，并利用生物工程人员熟知的方法进行冷冻干燥并置4℃保存(周华伟，等，乳酸菌冻干保藏相关影响因素的研究进展，2005，生命科学研究，9(2)：72-76)。实验前用磷酸缓冲液(Phosphate buffersaline，PBS)重悬菌体。

实施例4重组干酪乳杆菌控制小鼠因高脂饮食而导致的体重增加并可以维持小鼠肠道菌群的多样性

从广东省实验动物中心购买SPF级昆明种雄性小鼠(12周龄，体重约24±2g/只)，适应性喂饲7天后，随机分为5组：正常饲料对照组、高脂饲料模型组、干酪乳杆菌组(干酪乳杆菌，1×10⁹CFU/天)、阿克曼氏菌组(阿克曼氏菌，购自美国ATCC资源中心，编号ATCC BAA-835，1×10⁹CFU/天)、混合干酪乳杆菌组(3μg Amuc_1100膜蛋白冻干粉+干酪乳杆菌1×10⁹CFU/天)及重组干酪乳杆菌组(实施例2，表达融合蛋白的重组干酪乳杆菌1×10⁹CFU/天，约含5μg融合蛋白。由于融合蛋白的分子量大于裸Amuc_1100膜蛋白的分子量，经换算，5μg的融合蛋白相当于3μg的Amuc_1100膜蛋白)。各处理组动物每天通过灌胃的方式分别口服施用悬浮于磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS)中的干酪乳杆菌、阿克曼氏菌、混合干酪乳杆菌和重组干酪乳杆菌，，正常饲料对照组及高脂饲料模型组动物则使用等体积的磷酸盐缓冲液。各处理组及高脂饲料模型组动物饲喂高脂饲料(每100克饲料中含有26.2％蛋白质、26.3％碳水化合物及34.9％脂肪，含524千卡路里热量)，正常饲料对照组动物则投喂普通饲料。实验连续进行6周。

在实验开始前及结束后称体重。实验结果显示，正常饲料对照组动物平均体重增加仅为2.60±0.78克，而高脂饲料模型组动物平均体重增加了12.38±3.19克。饲喂干酪乳杆菌、阿克曼氏菌、混合干酪乳杆菌以及重组干酪乳杆菌均可以显著抑制实验动物体重的增加，其平均增重分别为10.49±2.86、8.76±0.63、7.58±2.19和5.11±1.84克(图3)；但是经过比较可知，相比于干酪乳杆菌组，混合干酪乳杆菌组中的小鼠体重得到了明显有效的控制；相比于阿克曼氏菌组，混合干酪乳杆菌组中的小鼠体重也得到了明显有效的控制；相比于混合干酪乳杆菌组，重组干酪乳杆菌组中的小鼠体重进一步得到了更好的控制。

同时，在实验开始前及结束后，收集各组实验动物肠道中的粪便，利用QIAGEN公司核酸提取试剂盒(QIAamp DNA Stool Mini Kit，货号：51504，德国)从粪便样品中提取菌群的基因组DNA。将样品送到深圳华大基因科技有限公司进行宏基因组测序，然后利用从业人员熟知的生物信息学和统计学方法，对粪便中细菌种类进行统计分析。统计的结果表明，所采用的小鼠在实验前，其肠道中菌群香农多样性指数(Shannon index)均为3.95±0.062。实验结束后，正常饲料对照组的肠道菌群香农多样性指数为4.05±0.075，高脂模型组的则为3.20±0.11。干酪乳杆菌组、阿克曼氏菌组、混合干酪乳酸菌组以及重组干酪乳杆菌组的香农指数分别为3.58±0.074，3.47±0.039，3.68±0.091和4.01±0.046。这个结果提示，口服混合干酪乳杆菌对动物肠道菌群多样性的维持能力显著优于单独的阿克曼氏菌和干酪乳杆菌；而重组干酪乳杆菌对动物肠道菌群多样性的维持能力又显著优于混合干酪乳杆菌。

实施例5不同剂量重组干酪乳杆菌对小鼠因高脂饮食而导致体重增加的抵抗效应

从广东省实验动物中心购买SPF级昆明种雄性小鼠(12周龄，体重约24±2g/只)，适应性喂饲7天后，随机分为5组：正常饲料对照组、高脂饲料模型组(100克饲料中含有26.2％蛋白质、26.3％碳水化合物及34.9％脂肪，约含524千卡路里热量)、低剂量重组菌组(1×10⁷CFU/天)、中剂量重组菌组(1×10⁹CFU/天)及高剂量重组菌组(1×10¹¹CFU/天)。各处理组动物每天通过灌胃的方式分别口服施用悬浮于磷酸盐缓冲液中的不同剂量的重组干酪乳杆菌，，正常饲料对照组及高脂饲料模型组动物则使用等体积的磷酸盐缓冲液。各处理组及高脂饲料模型组动物投喂高脂饲料，正常饲料对照组动物则投喂普通饲料。实验连续进行6周。在实验开始前及结束后称体重。实验结果显示，正常饲料对照组动物平均体重增加为3.10±0.375克，高脂饲料模型组动物平均体重增加了11.51±3.352克。饲喂不同剂量的表达融合蛋白的干酪乳杆菌的平均增重，从低剂量到高剂量依次为10.13±1.987、5.86±2.033和5.73±3.056克(图4)。从图中可知，低剂量处理组与高脂饲料模型组之间没有显著差异，说明低剂量处理组控制小鼠体重效果不佳；而中剂量和高剂量处理组与高脂饲料模型组相比均产生了显著的差异，说明中剂量和高剂量处理组可以有效控制小鼠体重；并且，中剂量和高剂量处理组之间没有显著差异，说明控制小鼠体重增加并非一直随着重组干酪乳杆菌的用量的增加而效果更好，而是在达到1×10¹¹CFU/天后，不再产生更优的效果，因此，出于节省成本的考虑，可以将重组干酪乳杆菌的用量控制在这个水平以下。

实施例6口服糖耐量测定

从广东省实验动物中心购买SPF级昆明种雄性小鼠(12周龄，体重约24±2g/只)，适应性喂饲7天后，随机分为3组：正常饲料对照组、高脂饲料模型组、重组干酪乳杆菌组(表达融合蛋白的重组乳杆菌1×10⁹ CFU/天)和干酪乳杆菌(1×10⁹ CFU/天)。各处理组动物每天通过灌胃的方式分别口服施用悬浮于磷酸盐缓冲液中的干酪乳杆菌、混合干酪乳杆菌和重组干酪乳杆菌，正常饲料对照组及高脂饲料模型组动物则使用等体积的磷酸盐缓冲液。各处理组及高脂饲料模型组动物投喂高脂饲料，正常饲料对照组动物则投喂普通饲料。实验连续进行8周后，开始糖耐量测定。所有动物禁食10小时，尾静脉取血。然后，通过灌胃方法口服葡萄糖溶液(2克/公斤体重)。服后30、60、90和120分钟分别取血，利用血糖仪测定口服葡萄糖溶液前后血清血糖的含量。实验结果表明，经过饲喂4周的重组干酪乳杆菌，实验动物的糖耐量得到显著改善，与高脂饲料模型组相比，糖耐量曲线下面积下降了25.2％，在p<0.05水平上重组干酪乳杆菌组与高脂饲料模型组的糖耐量存在显著差异。在p<0.05水平上重组干酪乳杆菌组与干酪乳杆菌处理组的糖耐量也存在显著差异。而作为对照的干酪乳杆菌处理组与高脂饲料模型组相比，仅下降了8.2％，在p<0.05水平上干酪乳杆菌处理组与高脂饲料模型组的糖耐量没有显著差异(图5)。

序列表

<110> 广州佰斯伦生物技术公司

李校堃

<120> 一种重组膜蛋白、微生物、含有其的组合物及应用

<130> LHA1760722

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 475

<212> PRT

<213> 人工序列(non)

<400> 1

Met Ala Ala Leu Leu Val Gly Thr Met Leu Ser Met Leu Thr Val Ile

1 5 10 15

Leu Ala Leu Pro Met Leu Gly Ser Thr Ala His Ala Leu Gly Met Ser

20 25 30

Ala Thr Ile Thr Ala Ala Leu Pro Ala Ala Met Val Ala Gly Val Gly

35 40 45

Leu Leu Leu Pro Leu Gly Leu Ser Ala Thr Gly Thr Ile Val Ala Ser

50 55 60

Leu Ala Ser Gly Leu Ala Leu Leu Ile Ser Ile Ala Ala Leu Gly Ile

65 70 75 80

Leu Ser Ala Ala Ala Ala Gly Ile Thr Pro Ser Ala Ser Ser Ala Gly

85 90 95

Gly Leu Gly Leu Gly Leu Ala Ala Thr Ala Leu Ala Val Gly Ser Leu

100 105 110

Gly Thr Ala Thr Leu Pro Pro Leu Ala Ser Ser Ala Leu Val Pro Thr

115 120 125

Thr Pro Thr Ala Pro Gly Ala Gly Leu Leu Thr Pro Ala Ala Ser Leu

130 135 140

Ile Ser Ser Cys Leu Leu Leu Ala Ile Leu Ile Thr Ala Thr Ser Ser

145 150 155 160

Thr Leu Gly Pro Gly Val Thr Ser Thr Gly Ala Pro Ser Val Gly Ala

165 170 175

Ala Ser Thr Leu Gly Pro Gly Leu Leu Ala Ile Ala Ser Leu Val Ala

180 185 190

Leu Leu Ala Gly Cys Gly Leu Ser Leu Pro Ile Leu Val Thr Ala Pro

195 200 205

Gly Leu Pro Ile Gly Thr Pro Ala Ala Ala Pro Gly Gly Ser Ala Gly

210 215 220

Ala Ala Gly Ala Pro Thr Thr Pro Met Pro Leu Gly Ile Ala Pro Gly

225 230 235 240

Gly Ala Ala Gly Ser Val Leu Leu Ala Met Ala Ala Ile Thr Gly Met

245 250 255

Gly Ala Thr Leu Pro Thr Val Ala Ser Ile Ala Ile Ala Ala Gly Ala

260 265 270

Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Ala Pro Ala Ala Ala Leu Pro Ala Ala

275 280 285

Ala Gly Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr Pro Ala Ala Gly Ala

290 295 300

Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gly Gly Val Ile Leu Pro Thr Met

305 310 315 320

Gly Leu Gly Gly Val Pro Val Gly Val Ser Leu Ala Leu Val His Pro

325 330 335

Ala Gly Pro Leu Ala Gly Gly Pro Ser Gly Ala Gly Gly Pro Gly Thr

340 345 350

Thr Gly Pro Ser Leu Pro Ala Gly Pro Gly Thr Thr Gly Pro Ser Gly

355 360 365

Pro Gly Leu Pro Gly Leu Pro Gly Gly Pro Gly Thr Thr Gly Pro Gly

370 375 380

Ala Pro Gly Thr Thr Gly Pro Thr Ala Pro Gly Pro Gly Ala Pro Ala

385 390 395 400

Val Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ala Ala Pro Leu Pro Gly Gly Ser Gly

405 410 415

Leu Gly Gly Pro Ala Leu Pro Gly Leu Ile Leu Gly Pro Ser Thr Gly

420 425 430

Val Ala Gly Ala Gly Gly Thr Val Gly Ala Gly Val Thr Thr Gly Met

435 440 445

Ala Gly Pro Gly Thr Pro Thr Gly Ser Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly

450 455 460

Thr Ala His Gly Thr Leu Pro Gly Thr Ser Gly

465 470 475

<210> 2

<211> 1428

<212> DNA

<213> 人工序列(non)

<400> 2

atgcgtcgta agttagttgg ttacatgtta tcaatgttaa ctgttatttt agctttattc 60

atgttaggtt caactgctca tgctaaggaa atgtcaaact ggattactga taacaagcca 120

gctgctatgg ttgctggtgt tggtttatta ttattcttag gtttatcagc tactggttac 180

attgttaact caaagcgttc agaattagat aagaagattt caattgctgc taaggaaatt 240

aagtcagcta acgctgctga aattactcca tcacgttcat caaacgaaga attagaaaag 300

gaattaaacc gttacgctaa ggctgttggt tcattagaaa ctgcttacaa gccattctta 360

gcttcatcag ctttagttcc aactactcca actgctttcc aaaacgaatt aaagactttc 420

cgtgattcat taatttcatc atgtaagaag aagaacattt taattactga tacttcatca 480

tggttaggtt tccaagttta ctcaactcaa gctccatcag ttcaagctgc ttcaacttta 540

ggtttcgaat taaaggctat taactcatta gttaacaagt tagctgaatg tggtttatca 600

aagttcatta aggtttaccg tccacaatta ccaattgaaa ctccagctaa caacccagaa 660

gaatcagatg aagctgatca agctccatgg actccaatgc cattagaaat tgctttccaa 720

ggtgatcgtg aatcagtttt aaaggctatg aacgctatta ctggtatgca agattactta 780

ttcactgtta actcaattcg tattcgtaac gaacgtatga tgccaccacc aattgctaac 840

ccagctgctg ctaagccagc tgctgctcaa ccagctactg gtgctgcttc attaactcca 900

gctgatgaag ctgctgctcc agctgctcca gctattcaac aagttattaa gccatacatg 960

ggtaaggaac aagttttcgt tcaagtttca ttaaacttag ttcatttcaa ccaaccaaag 1020

gctcaagaac catcagaaga tggtgaacca ggtactactg aaccatcaaa gccagatgaa 1080

ccaggtacta ctgaaccatc acaaccaggt aagccaggta agccaggtga accaggtact 1140

actgaaccag gtaacccagg tactactggt ccaactgctc cacaaccaga acgtccagct 1200

gttccaggtc catcacaacc agctgctcca aagccaggtc aatcaggttt aggtcaacca 1260

gctttaccag gtttaattaa gcaaccatca actggtgtta acggtgctgg tggtactgtt 1320

ggtaacggtg ttactactgg tatgaacggt ttcggtactc caactggttc agatcaatca 1380

acttcagctg gttacaacca tggtacttta ccacaaactt cagaataa 1428

<210> 3

<211> 317

<212> PRT

<213> 阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)

<400> 3

Met Ser Asn Trp Ile Thr Asp Asn Lys Pro Ala Ala Met Val Ala Gly

1 5 10 15

Val Gly Leu Leu Leu Phe Leu Gly Leu Ser Ala Thr Gly Tyr Ile Val

20 25 30

Asn Ser Lys Arg Ser Glu Leu Asp Lys Lys Ile Ser Ile Ala Ala Lys

35 40 45

Glu Ile Lys Ser Ala Asn Ala Ala Glu Ile Thr Pro Ser Arg Ser Ser

50 55 60

Asn Glu Glu Leu Glu Lys Glu Leu Asn Arg Tyr Ala Lys Ala Val Gly

65 70 75 80

Ser Leu Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Phe Leu Ala Ser Ser Ala Leu Val

85 90 95

Pro Thr Thr Pro Thr Ala Phe Gln Asn Glu Leu Lys Thr Phe Arg Asp

100 105 110

Ser Leu Ile Ser Ser Cys Lys Lys Lys Asn Ile Leu Ile Thr Asp Thr

115 120 125

Ser Ser Trp Leu Gly Phe Gln Val Tyr Ser Thr Gln Ala Pro Ser Val

130 135 140

Gln Ala Ala Ser Thr Leu Gly Phe Glu Leu Lys Ala Ile Asn Ser Leu

145 150 155 160

Val Asn Lys Leu Ala Glu Cys Gly Leu Ser Lys Phe Ile Lys Val Tyr

165 170 175

Arg Pro Gln Leu Pro Ile Glu Thr Pro Ala Asn Asn Pro Glu Glu Ser

180 185 190

Asp Glu Ala Asp Gln Ala Pro Trp Thr Pro Met Pro Leu Glu Ile Ala

195 200 205

Phe Gln Gly Asp Arg Glu Ser Val Leu Lys Ala Met Asn Ala Ile Thr

210 215 220

Gly Met Gln Asp Tyr Leu Phe Thr Val Asn Ser Ile Arg Ile Arg Asn

225 230 235 240

Glu Arg Met Met Pro Pro Pro Ile Ala Asn Pro Ala Ala Ala Lys Pro

245 250 255

Ala Ala Ala Gln Pro Ala Thr Gly Ala Ala Ser Leu Thr Pro Ala Asp

260 265 270

Glu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ile Gln Gln Val Ile Lys Pro

275 280 285

Tyr Met Gly Lys Glu Gln Val Phe Val Gln Val Ser Leu Asn Leu Val

290 295 300

His Phe Asn Gln Pro Lys Ala Gln Glu Pro Ser Glu Asp

305 310 315

<210> 4

<211> 954

<212> DNA

<213> 阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)

<400> 4

atgtcaaact ggattactga taacaagcca gctgctatgg ttgctggtgt tggtttatta 60

ttattcttag gtttatcagc tactggttac attgttaact caaagcgttc agaattagat 120

aagaagattt caattgctgc taaggaaatt aagtcagcta acgctgctga aattactcca 180

tcacgttcat caaacgaaga attagaaaag gaattaaacc gttacgctaa ggctgttggt 240

tcattagaaa ctgcttacaa gccattctta gcttcatcag ctttagttcc aactactcca 300

actgctttcc aaaacgaatt aaagactttc cgtgattcat taatttcatc atgtaagaag 360

aagaacattt taattactga tacttcatca tggttaggtt tccaagttta ctcaactcaa 420

gctccatcag ttcaagctgc ttcaacttta ggtttcgaat taaaggctat taactcatta 480

gttaacaagt tagctgaatg tggtttatca aagttcatta aggtttaccg tccacaatta 540

ccaattgaaa ctccagctaa caacccagaa gaatcagatg aagctgatca agctccatgg 600

actccaatgc cattagaaat tgctttccaa ggtgatcgtg aatcagtttt aaaggctatg 660

aacgctatta ctggtatgca agattactta ttcactgtta actcaattcg tattcgtaac 720

gaacgtatga tgccaccacc aattgctaac ccagctgctg ctaagccagc tgctgctcaa 780

ccagctactg gtgctgcttc attaactcca gctgatgaag ctgctgctcc agctgctcca 840

gctattcaac aagttattaa gccatacatg ggtaaggaac aagttttcgt tcaagtttca 900

ttaaacttag ttcatttcaa ccaaccaaag gctcaagaac catcagaaga ttaa 954

<210> 5

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列(non)

<400> 5

Met Met Ile Phe Lys Glu Leu Ser Glu Lys Glu Leu Gln Lys Ile Asn

1 5 10 15

Gly Gly Met Ala Gly Asn Ser Ser Asn Phe Ile His Lys Ile Lys Gln

20 25 30

Ile Phe Thr His Arg

35

Claims

1.一种重组膜蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种能够编码如权利要求1所述的重组膜蛋白的核酸。

3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸的序列如SEQ ID No.2所示。

4.一种微生物，其能够表达产生如权利要求1所述的重组膜蛋白。

5.根据权利要求4所述的微生物，其特征在于，所述微生物中含有如权利要求2或3所述的核酸。

6.根据权利要求5所述的微生物，其特征在于，所述核酸位于表达载体上。

7.根据权利要求4-6中任意一项所述的微生物，其特征在于，所述微生物选自益生菌中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的微生物，其特征在于，所述微生物选自双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococus)、肠球菌属(Enterococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus)中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的微生物，其特征在于，所述微生物选自双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、粪肠球菌(Enterococcusfaecium)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳酸链球菌(Streptococus lactis)中的至少一种。

10.一种组合物，所述组合物中包含如权利要求1所述的重组膜蛋白和/或如权利要求4-9中任意一项所述的微生物。

11.根据权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述重组蛋白在所述组合物中的质量百分含量为2％至30％。

12.根据权利要求10或11所述组合物，其特征在于，所述微生物在所述组合物中的含量为1×10⁷cfu/g至1×10¹¹cfu/g。

13.如权利要求1所述的重组膜蛋白、如权利要求2或3所述的核酸、如权利要求4-9中任意一项所述的微生物、以及如权利要求10至12中任意一项所述的组合物中的至少一种在用于制备预防和/或改善生物代谢病症药物中的应用。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述生物选自人和/或动物中的一种。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述动物选自哺乳动物中的一种。

16.根据权利要求13至15中任意一项所述的应用，其特征在于，所述代谢病症选自肥胖症和/或糖尿病。

17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述肥胖为高脂饮食导致的肥胖；和/或所述糖尿病为1或2型糖尿病。