JP5085547B2 - 生理活性ポリペプチドの細菌性送達 - Google Patents
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Description
i)1つ以上のグラム陰性細菌株を対象から単離する工程;
ii)前記1つ以上のグラム陰性細菌株を標識する工程;
iii)前記1つ以上の標識グラム陰性細菌株を前記対象に再導入する工程;及び
iv)前記1つ以上のグラム陰性細菌株が前記対象でコロニー形成するかどうか判定する工程;
を含む。
CCEC22と命名された大腸菌(Escherichia coli)コロニー形成株は、2005年8月12日に登録番号NM05/45635で国立計測標準研究所(National Measurement Institute)(前身はAGAL)に寄託された。
他で特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語及び科学用語は、当業者(例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生化学における)によって一般的に理解されているものと同じ意味を有するものとする。
本発明による細菌は、コロニー形成非病原性グラム陰性菌であろう。グラム陰性菌には、サルモネラ、大腸菌、シゲラ、カンピロバクター、フゾバクテリウム、ボルデテラ、パスツレラ菌、アクチノバチルス、ヘモフィルス、及びヒストフィルスが含まれると当業者は理解するであろう。本発明の方法では、コロニー形成非病原性グラム陰性菌の任意の株が使用され得ると考慮される。
本発明はまた、in vivoにおける異種生理活性ポリペプチドの送達に有用なコロニー形成非病原性グラム陰性細菌株を同定する方法を提供する。
i)1つ以上のグラム陰性細菌株を対象から単離する工程;
ii)前記1つ以上のグラム陰性細菌株を標識する工程;
iii)前記1つ以上の標識グラム陰性細菌株を前記対象に再導入する工程;及び
iv)前記1つ以上のグラム陰性細菌株が前記対象でコロニー形成するかどうか判定する工程;
を含む。
当業者ならば、本発明の方法を、様々な生理活性ポリペプチドを送達するのに使用できると解するであろう。適したポリペプチドの例には、局所的または全身的に機能し得るもの、例えば、局所または全身代謝に影響を与える内分泌活性を発揮し得るポリペプチドが含まれる。
(1)Fab、すなわち完全な軽鎖(VL及びCL)と、それに結合した重鎖VH-Cγ1断片とからなる断片であって、抗体全体を酵素パパインで消化して、完全な軽鎖と1本の重鎖の一部とを生成することによって、あるいはFab断片をコードするDNAを非病原性グラム陰性菌に導入することによって産生され得る断片;
(2)Fab'、すなわち抗体全体をペプシンで処理し、それに続いて還元して、完全な軽鎖と重鎖の一部とを生成することによって(抗体1分子あたり2つのFab'断片が得られる)、あるいはFab'断片をコードするDNAを非病原性グラム陰性菌に導入することによって得られる抗体分子断片;
(3)(Fab')2、すなわち2つのジスルフィド結合によって保持された2つのFab'断片の二量体;
(4)Fv、すなわち2本の鎖として発現される軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含有する遺伝子改変断片として定義される断片;
(5)一本鎖抗体(「SCA」)、すなわち遺伝的に融合された単一鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含有する遺伝子改変分子として定義される断片;並びに
(6)単一ドメイン抗体、すなわち典型的に軽鎖を欠失した重鎖可変ドメイン;
が含まれる。
本発明の細菌は、その中に含有されている核酸から生理活性ポリペプチドを発現させる。前記核酸は、前記生理活性ポリペプチドをコードする核酸が細菌内での発現に適切な調節配列の制御下にある、1つ以上の核酸コンストラクトを含んでよい。
本発明の免疫原性組成物(またはワクチン)は、1つ以上の異種抗原及び/または免疫調節タンパク質を発現する、本発明によるコロニー形成非病原性グラム陰性菌を含む。例えば、前記1つ以上の抗原は、ウェルシュ菌等の細菌性病原体に由来する抗原性ポリペプチドであってよい。前記免疫原性組成物における前記1つ以上の免疫調節タンパク質は、アジュバントとして機能してよい。アジュバントとして機能し得るポリペプチドの例には、IL-6及びIL-2等のサイトカインが含まれる。前記免疫原性組成物は、製薬的または獣医学的に許容可能なキャリアをさらに含んでいてもよい。別の実施形態では、前記免疫調節タンパク質は、単独で送達される。
本発明の製剤には、製剤の製造に有用なバルク製剤(bulk drug formulation)が含まれる。そのような製剤は、予防上または治療上有効な量のコロニー形成グラム陰性菌及び製薬的に許容可能なキャリアを含む。製薬的に許容可能なキャリアには、獣医学的に許容可能なキャリアが含まれる。好ましくは、本発明の製剤は、治療上有効な量の本発明の1つ以上のコロニー形成グラム陰性菌及び製薬的に許容可能なキャリアを含む。
排泄腔をスワブでふき取ることによって、またはトリ盲腸内容物を回収するによって、様々な細菌種を市販のニワトリから回収した。2mLのマッコンキー培養液(MacConkey、1905年)中、37℃での各スワブの一晩培養することによって、回収された細菌を濃縮し、その後、1ループの濃縮培養物をマッコンキー寒天プレート上にストリークし、37℃で一晩インキュベーションした。典型的な大腸菌コロニー形態に類似した単一コロニーを、エオシンメチレンブルーラクトーススクロース(EMB)寒天(Holt-Harris及びTeague、1916年)プレート上にストリークし、37℃で一晩培養し、次いで80%グリセロール中に冷凍保存物を調製した。大腸菌と想定された株をCCEC1から101まで命名し、CSIROニワトリ大腸菌(CCEC)株と名付けた。プレート上で観察された特徴的コロニー形態による大腸菌の確証的同定のために、回収されたCCEC株を、さらなる選択培地寒天上(キシロースリジンデオキシコール酸(XLD))(Taylor、1965年)及びOnozによるサルモネラ同定用の寒天上(Onoz及びHoffman、1978年)で培養した。選択寒天プレート上で大腸菌として同定されなかったいずれのCCEC単離株も、さらなる分析には使用しなかった。
パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)分類技術を用いて、大腸菌株(CCEC単離株)をさらに分析した。すべての単離株を分析した後、前記回収物中に25種の異なるXbaI消化DNAプロファイルが見出された。
様々なPFGEサブタイプからの代表的株を、増大する濃度の抗生物質リファンピシンまたはナリジクス酸を含有するブロス中に通して繰り返し循環させ、これらの抗生物質に対する選択可能レベルの耐性を有する株バリアントを単離した。次いで、リファンピシン耐性を有するバリアントを、増大するレベルのナリジクス酸に通して継代培養して、両方の抗生物質に対して耐性を有する株を選択した。様々なPFGEサブタイプの代表的単離株から、我々はリファンピシン(rif)耐性の誘導体、ナリジクス酸(nal)耐性の別のセットの誘導体、及び両方の抗生物質(rif/nal)に耐性のさらに別のセットを単離した。
14羽のSPFニワトリに、2重標識されたPFGEサブタイプ単離株のそれぞれを含有する1mLの混合大腸菌培養物を経口投与した。5羽の接触トリ(in-contact bird)には大腸菌培養物を直接投与しなかった。標識株の存在を検査するために、前記トリから2日毎に排泄腔スワブを採取した。標識株がニワトリ体内にどれだけ長く残留するか検査するために、42日目までスワブを採取した(図1)。混合大腸菌培養物を投与する前には、いかなる2重耐性(rif/nal)細菌単離株も検出されなかった。投与後には、試行期間である42日間の間のあらゆる試料採取点で、すべてのトリから容易に標識株を単離することができた。他のニワトリに投与した1日後のすべての接触トリから、2重耐性大腸菌を単離することができ、このことは同時収容されたトリへの迅速な拡散を示す。投与されたニワトリの盲腸内容物から2重標識株が単離された場合、4種のみのPFGEサブタイププロファイルが回収され(図2)、このことは、これらの株は残留したが、一方で他のすべての株は、実施された分析のレベルでは検出不可能であったことを示す。
前記大腸菌株は、元々健康なニワトリから単離されたものであり、その後のニワトリへの投与による、いかなる有害な健康上の徴候も示されていないが、我々は、次に、前記株が共生細菌叢の無害且つ非病原性の一員であることを、それらの血清型を判定することによって、及び既知の有毒因子の存在を探索することによって確認した。株CCEC31rn、CCEC59rn、及びCCEC101rnは、微生物の同定、O及びH抗原の血清型決定、並びにこれらからの株からの任意の一般的な有毒因子の産生の確認のために、国立大腸菌研究所(National E. coli Laboratory)(オーストラリアメルボルン大学微生物学科微生物学診断部)によって分類された。3種の試料すべてが大腸菌と同定され、すべてが血清型H抗原であるH10を有していた。株CCEC31rnは、α-溶血素を発現していることが示され、O抗原(Ont)を保持していた。株CCEC59rn及びCCEC101rnは、ともに、大腸菌OR:H10として分類され、溶血性ではなかった。Ont:H10またはOR:H10の大腸菌のいずれも、ヒトまたは動物における任意の主要な疾患の発症または疾病の原因であるとは文献に記録されていない。全3株とも、ベロ毒性ではなく、シガ毒素を産生せず、いかなる細胞毒性壊死因子も産生しなかった。
この試行は、市販のブロイラーニワトリが使用されたことを除いて、実施例5で概説したものと本質的に同じであった。試行結果の概要を図3及び4に示す。この試行では、株CCEC31rn、59rn、及び101rnは、最初の試行と同様に回収されたが、試行1で回収された集団のうちのわずかな比率を占めていたCCEC35rnは、試行2では回収されなかった。しかし、CCEC22rnは、これらの市販のトリからかなりの数が回収されたが、試行1では見られなかった。実験用大腸菌株JM109は、ニワトリから迅速に失われ、5日目後には回収できなかった。
多数の大腸菌単離株が、SPFニワトリ及び市販ニワトリの両方の腸に残留すると示され、それゆえ、生ベクターとしての使用するための良い候補であった。ベクターとしての使用するための第二の要件は、送達されるべき組換えタンパク質を発現するように、前記株を遺伝子操作することが可能でなければならないということである。従って、我々は、クローニングベクタープラスミドで形質転換され、モデルタンパク質である緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する能力に関して、前記残留株を試験した。大腸菌株CCEC22rn、31rn、59rn、及び101rnはすべて、標準的な大腸菌電気形質転換(electro-transformation)技術を用いることによって、発現クローニングベクターpQE30で容易に形質転換された。緑色蛍光タンパク質(GFP)を保持するpTracer-CMV2プラスミドを、株CCEC31rn、59rn、及び101rnに導入した場合、全3株がUV光の下で明るい緑色の蛍光表現型を示した。同様に、形質転換細胞を液体培養で増殖させ、蛍光顕微鏡を用いて観察した場合、すべての細胞がGFPの遺伝子を発現した。従って、前記残留大腸菌株は、効率的に組換えタンパク質を発現することができる。
プラスミドpQE9-1L-6は、成熟ニワトリインターロイキン-6(IL-6)の遺伝子を含有しており、これを前記ニワトリ由来の大腸菌ベクターに導入した。分子量約27KDaを有する誘導タンパク質のバンドによって証明されているとおり、組換えニワトリIL-6は、ニワトリ由来の大腸菌ベクターから発現された。IL-6によって誘導された細胞増殖バイオアッセイにおいて、細胞上清のin vitro生物活性を測定した(図6)。IPTGで誘導されたCCEC31rn(pQE9-IL-6)からの上清は、有意な生物活性を示したが、一方で誘導されていない、または前記発現プラスミドを有しない同一の株は、IL-6バイオアッセイにおける生物活性を示さなかった。CCEC31rn(pQE9-IL-6)は、発現プラスミドを保持する一般的に使用されている実験用JM109より高いレベルのIL-6活性を産生した。残留大腸菌株CCEC31rnは、潜在的治療用途を有するサイトカインである組換えIL-6を明らかに産生することができる。
大腸菌ベクター株CCEC31rn、CCEC59rn、及びCCEC101rn中でバクテリオシンP126を構成的に発現するプラスミドを、in vitroバクテリオシン活性の分泌に関して、プレート阻害アッセイによって試験した。リステリアイノクア及びウェルシュ菌(株NE15及びNE18、CSIROコレクション)を実験室で増殖させ、バクテリオシンプレート阻害アッセイにおける試験生物としてプレーティングした。ニワトリ由来大腸菌株の上清中に分泌されたP126は、当該アッセイで試験されたリステリアイノクア及びウェルシュ菌NE株の両方の増殖を阻害した(図7)。
前記残留大腸菌株のうちの1株(CCEC31rn)を用いて、治療用組換えタンパク質をニワトリの腸に送達する生ベクターアプローチの有効性を実証した。送達されるべきタンパク質をコードする遺伝子を保持するプラスミドを、以下に定義するとおりに、この株に導入した。
18日目にCCEC31rn(P126)を接種されたニワトリは、関連コントロール群及び負荷コントロール群と比較して、ウェルシュ菌の負荷から完全に防御されていた(すなわち、この群のいかなるニワトリにおいても病変が観察されなかった)。他の日(1日目または20日目)にこの株及びプラスミドを投与されたニワトリは、それらの関連用量コントロール群または負荷コントロール群と比較して、ウェルシュ菌での負荷からのいかなる防御(病変スコアの低減)も示さなかった。
別々の試行で、市販ブロイラーニワトリに、CCEC31rn(P126)及び関連ベクターコントロールを投与し、負荷の3日後に剖検した。ニワトリ腸内における活性P126タンパク質の存在を、盲腸内容物を試料採取し、PBS中に再懸濁し、遠心分離し、次いで0.22μmフィルターに通して上清を濾過することによって検査した。リステリアイノクアまたはウェルシュ菌を播種された阻害プレートのウェルに、30μlの上清を添加した。前記プレートを37℃で一晩インキュベーションし、阻害の領域を評価した(図9)。
大腸菌ベクターCCEC31rnを用いることによって、成熟ニワトリIL-6をニワトリに送達した。1日目及び18日目に、1mLのCCEC31rn(IL-6)またはCCEC31rn(pQE30)で誘導された培養物をニワトリに投与し、組織試料を腸から回収して、IL-6の生ベクターによる送達の生物学的作用を評価した。
剖検で、ニワトリの盲腸扁桃及び腸内膜からリンパ球を抽出した。計数後、これらのリンパ球の増殖能を評価するために、両試料からの等数のリンパ球を増殖アッセイに使用して、増殖中の細胞に組み込まれる放射性標識を用いて測定した。
盲腸扁桃と腸内膜の切片をIgAについて染色し、各試料中の直線1cmあたりの組織におけるIgA分泌形質細胞の数を計数した。腸内膜から回収された試料(図11)では、IL-6を発現する大腸菌ベクター株を投与されたトリは、基本のプラスミドを保持するベクター株を投与された群のトリより、直線1cmあたりの組織に多数のIgA分泌細胞を有した。これらの2つの群の間の差は、マンホイットニーU検定で検定した際に有意であった(P=0.0286)。粘膜免疫に直接関与していない組織から単離された細胞から予測されるように、これらのトリの盲腸扁桃から回収された2つのニワトリ群の間における平均数は統計的に差がなかった。
P126を発現するサルモネラソフィア(S. sofia)をニワトリリステリア症モデルで試験した。4群、各10羽のSPFニワトリを、2台のバブルアイソレーター(bubble isolator)に収容した(群1及び2を1台のアイソレーターに、3及び4をもう1台に)。治療群は以下のとおりであった。
1.サルモネラソフィアナイア(S. sofia Nair)及びリステリアモノサイトゲネス負荷
2.サルモネラソフィアナイア(P126)及びリステリアモノサイトゲネス負荷
3.リステリアモノサイトゲネス負荷のみ
4.負荷なし
当該結果は、健康なニワトリから回収されたわずかな比率の大腸菌単離株が残留能を有することを示している。概説された方法は、そのような単離株をどのように同定及び試験できるかを明示している。多数の残留株が同定され、それに続いて、有用な生送達ベクターを作製するのに必要とされる他の特徴を有することが示された。それらはプラスミドDNAで形質転換され、in vivo条件でプラスミドベクターを維持し得、さらにモデル組換えタンパク質を発現することができる。
Claims (8)
- 対象に投与した場合に前記対象でコロニー形成する、1つ以上の異種生理活性ポリペプチドを発現するコロニー形成非病原性グラム陰性細菌であって、前記コロニー形成非病原性グラム陰性細菌が1つ以上の異種生理活性ポリペプチドを発現するように改変されている、登録番号NM05/45635で国立計測標準研究所(前身はAGAL)に寄託されているCCEC22、登録番号NM05/45636で国立計測標準研究所(前身はAGAL)に寄託されているCCEC31、または登録番号NM05/45637で国立計測標準研究所(前身はAGAL)に寄託されているCCEC59から選択される、グラム陰性細菌。
- 前記生理活性ポリペプチドの1つ以上が、サイトカイン、ホルモン、酵素、抗菌ペプチド、抗腫瘍剤、酵素、抗体、または抗原である、請求項1に記載のグラム陰性細菌。
- 前記生理活性ポリペプチドのうちの1つ以上が抗菌ペプチドである、請求項2に記載のグラム陰性細菌。
- 1つ以上の異種生理活性ポリペプチドを発現するように改変されている、登録番号NM05/45635で国立計測標準研究所(前身はAGAL)に寄託されているCCEC22、登録番号NM05/45636で国立計測標準研究所(前身はAGAL)に寄託されているCCEC31、または登録番号NM05/45637で国立計測標準研究所(前身はAGAL)に寄託されているCCEC59から選択される、1つ以上の異種生理活性ポリペプチドを発現するコロニー形成非病原性グラム陰性細菌を含む、1つ以上の異種生理活性ポリペプチドを対象に送達するための薬剤。
- 前記生理活性ポリペプチドの1つ以上が、サイトカイン、ホルモン、抗菌ペプチド、抗腫瘍剤、酵素、抗体、または抗原である、請求項4に記載の薬剤。
- 1つ以上の異種生理活性ポリペプチドを発現するように改変されている、登録番号NM05/45635で国立計測標準研究所(前身はAGAL)に寄託されているCCEC22、登録番号NM05/45636で国立計測標準研究所(前身はAGAL)に寄託されているCCEC31、または登録番号NM05/45637で国立計測標準研究所(前身はAGAL)に寄託されているCCEC59から選択される、1つ以上の異種生理活性ポリペプチドを発現するコロニー形成非病原性グラム陰性細菌の治療上有効量を含む、対象において疾患を治療又は予防するための薬剤。
- 登録番号NM05/45635で国立計測標準研究所(前身はAGAL)に寄託されているCCEC22、登録番号NM05/45636で国立計測標準研究所(前身はAGAL)に寄託されているCCEC31、または登録番号NM05/45637で国立計測標準研究所(前身はAGAL)に寄託されているCCEC59から選択される、コロニー形成非病原性グラム陰性細菌。
- 異種生理活性ポリペプチドを発現するように改変されている、請求項7に記載のコロニー形成非病原性グラム陰性細菌。
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