KR20140117787A - 고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 함유하는 살모넬라균증 및 콜리바실로시스 동시 예방용 고스트 백신 조성물 - Google Patents

고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 함유하는 살모넬라균증 및 콜리바실로시스 동시 예방용 고스트 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 함유하는 살모넬라균증 및 콜리바실로시스 동시 예방용 고스트 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 고스트 살모넬라 변이주는 F4ab(K88ab), F4ac(K88ac), F5(K99), F6(FasA) 및 F41로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 부착인자를 발현하는 고스트 살모넬라 변이주로서, 상기 고스트 살모넬라 변이주는 단독 또는 하나 이상의 변이주를 혼합함으로써, 모돈의 점막에서 점막 및 전신 면역반응을 유도하고, 고스트화 과정이 엄격하게 조절되므로, 포유자돈에서 살모넬라균증 및 콜리바실로시스를 동시 예방하는 효과가 우수하다. 따라서, 본 발명에 따른 고스트 살모넬라 변이주를 함유하는 고스트 백신은 모돈에 접종되어 포유자돈의 면역력을 강화시키고, 경구 및 비강 접종이 가능하다.

Description

고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 함유하는 살모넬라균증 및 콜리바실로시스 동시 예방용 고스트 백신 조성물{Ghost vaccine composition containing Ghost Salmonella mutants for preventing pathogenic colibacillosis and salmonellosis}
본 발명은 고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 함유하는 살모넬라균증 및 콜리바실로시스 동시 예방용 고스트 백신 조성물에 관한 것이다.
최근 가축의 성장 촉진을 위해 사용되던 사료 첨가용 항생제가 내성균 출현 등 부작용이 발견되면서 전면 사용 금지되었다. 항생제의 사용금지로 인해, 축산농가에서는 가축 및 가금의 질병 발생률이 현저히 증가하게 되었다. 특히, 대부분의 폐사 원인에 해당하는 소화기 관련 질병의 발생률이 현저히 증가하여 가축 및 가금의 설사 및 탈수가 발생하고, 이로 인한 폐사가 증가하여 축산농가의 경제적 손실이 지속적으로 증가하고 있다.
동물의 폐사 원인 중 약 80%는 포유시기에 발생하는 소화기 관련 질병에 연관이 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 돼지의 경우, 포유자돈의 설사 및 탈수를 일으키는 병원체인 장독소원성 대장균(entrotoxigenic Escherichia coli; ETEC)이 폐사를 일으키는 대표적인 질병 원인균으로 알려져 있다. 현재까지 알려진 포유자돈에서의 장독소원성 대장균의 주요 부착인자는 F4ab(K88ab), F4ac(K88ac), F5(K99), F6(FasA) 및 F41이 있다.
상기 "부착인자"는 세균이 숙주 세포에 부착하는데 사용하는 모든 인자를 지칭한다. 이는 세균의 섬모와 같은 세포 표면 단백질을 포함한다. 세균은 이들 부착인자를 이용하여 숙주의 장관 세포 표면에 안정적으로 부착하여 증식을 시작하고 독소 등을 분비하면서 질병을 일으킨다.
살모넬라 티피무리움은 포유자돈에서 주로 소장 결장염을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 성장을 저해시킴으로써 양돈가에 경제적으로 큰 손실을 초래하고 있는 주요 전염병 중 하나이다.
현재 국내에서 포유자돈을 대상으로 하는 대장균 백신은 크게 두 타입으로 분류하여 판매되고 있다. 즉, 포르말린을 불활화시킨 세균에 면역 보조제를 혼합화시킨 제품과 정제된 각 부착인자 항원에 면역보조제를 혼합한 제품이 판매되고 있다. 그러나, 이러한 기존의 백신은 근육 접종을 실시하므로, 전신 면역은 매우 효과적으로 유도할 수 있으나, 실질적으로 장독소형 대장균이 병변을 일으키는 점막에서는 점막 면역항체를 제대로 유도하지 못해 종종 방어에 실패할 수 있다는 문제점이 있다. 또한, 살모넬라 균주를 포르말린으로 처리한 불활화 백신을 근육 접종할 경우, 돼지에서 야생 살모넬라균을 효과적으로 방어하지 못하는 문제점이 있다.
상기한 바와 같이, 돼지를 대상으로 하는 대장균 백신은 알려져 있지만, 돼지에서 살모넬라균증을 예방하기 위한 백신 및 돼지에서 고스트 유도를 이용한 백신에 대한 개발 및 연구는 전무한 실정이다.
따라서, 살모넬라균증 및 콜리바실로시스를 동시에 예방할 수 있는 고스트백신 조성물의 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.
본 발명자들은 살모넬라균증 및 콜리바실로시스를 동시에 예방할 수 있는 백신에 대해 연구하던 중, 고스트 살모넬라 변이주가 모돈의 점막에서 점막 및 전신 면역반응을 유도하고, 고스트화 과정이 엄격하게 조절되므로, 포유자돈에서 살모넬라균증 및 콜리바실로시스 동시 예방하는 효과가 우수하고, 이를 함유하는 고스트 백신이 모돈에 접종됨으로써 포유자돈의 면역력을 강화시키고, 경구 및 비강 접종이 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 ompA 신호 서열 유전자, 이에 연결된 세포 부착 인자 유전자, asd 유전자; E-lysis 카세트; 및 역방향 아라비노오스 프로모터;를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 고스트 살모넬라 변이주 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 살모넬라균증 및 콜리바실로시스 동시 예방용 고스트 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 돼지의 소화기 질환 예방용 고스트 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 살모넬라균증 및 콜리바실로시스 동시 예방용 사료 첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명은 ompA 신호 서열 유전자, 이에 연결된 세포 부착 인자 유전자, asd 유전자; E-lysis 카세트; 및 역방향 아라비노오스 프로모터;를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 고스트 살모넬라 변이주 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 상기 고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 살모넬라균증 및 콜리바실로시스 동시 예방용 고스트 백신 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 돼지의 소화기 질환 예방용 고스트 백신 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 살모넬라균증 및 콜리바실로시스 동시 예방용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명에 따른 고스트 살모넬라 변이주는 콜리바실로시스의 부착인자인 F4ab(K88ab), F4ac(K88ac), F5(K99), F6(FasA) 및 F41로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 부착인자를 발현하는 고스트 살모넬라 변이주로서, 상기 고스트 살모넬라 변이주는 단독 또는 하나 이상의 변이주를 혼합함으로써, 모돈의 점막에서 점막 및 전신 면역반응을 유도하고, 고스트화 과정이 엄격하게 조절되므로, 포유자돈에서 살모넬라균증 및 콜리바실로시스를 동시 예방하는 효과가 우수하다. 따라서, 본 발명에 따른 고스트 살모넬라 변이주를 함유하는 고스트 백신은 모돈에 접종되어 포유자돈의 면역력을 강화시키고, 경구 및 비강 접종이 가능하다.
도 1은 본 발명의 asd 유전자, E-lysis 유전자 및 역방향 아라비노오스 프로모터를 함유하는 재조합 벡터의 제조과정 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 살모넬라 변이주의 제조과정을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 고스트 살모넬라 변이주를 현미경 촬영법으로 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 살모넬라 변이주의 세포외벽에 발현한 각 부착인자 항원 단백을 웨스턴 블롯 기법을 이용하여 나타낸 도이다[레인 M: 단백질 마커, A: K88ab, B: K88ac, D: K99, E: FasA, 그리고 C 및 F는 대조군을 각각 나타냄].
도 4는 마우스에 백신 조성물을 근육 접종한 후 각 부착인자의 혈청 IgG(A) 및 분변 IgA(B)에 대한 항체역가를 나타낸 도이다.
도 5는 마우스에 백신 조성물을 경구 접종한 후 각 부착인자의 혈청 IgG(A) 및 분변 IgA(B)에 대한 항체역가를 나타낸 도이다.
도 6은 마우스에 각 부착인자를 발현시킨 살모넬라 변이주를 혼합한 백신 조성물을 근육 접종한 후 각 부착인자의 혈청 IgG 및 분변 IgA에 대한 항체역가를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 항원을 혼합하여 접종한 후 소장에서 각 항원에 대한 분비 IgA B 세포를 조직면역염색법으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 백신 조성물에 대한 최적의 백신 접종 횟수을 알아보기 위하여, 마우스에 백신을 접종한 후 각 부착인자의 혈청 IgG(a) 및 분변 IgA(b)에 대한 항체역가를 나타낸 도이다.
도 9은 본 발명의 백신 조성물을 임신 모돈에 접종한 후 각 부착인자의 혈청 IgG에 대한 항체역가를 나타낸 도이다.
도 10는 본 발명의 백신 조성물을 임신 모돈에 접종한 후 각 부착인자의 초유에서 IgG 및 IgA에 대한 항체역가를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 백신 조성물을 임신 모돈에 접종한 후 각 그룹 모돈에서 출생한 자돈이 5일령이 되었을 때 각 부착인자의 혈청 IgG 및 IgA에 대한 항체역가를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 백신 조성물을 마우스에 접종한 후 살모넬라 LPS에 대한 혈청 lgG 및 lgA 항체역가를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 백신 조성물을 마우스에 접종한 후 야생 병독성 살모넬라 균주로 도전감염 후 생존율을 나타낸 도이다.
본 발명은
돼지 살모넬라균증 및 콜리바실로시스를 동시 예방하기 위하여,
단백질을 세포외벽에 발현시키는 ompA 신호 서열 유전자, 이에 연결된 세포 부착 인자 유전자, 및 asd 유전자;
고스트화를 유도하는 E-lysis 유전자를 포함하는 E-lysis 카세트; 및
E-lysis 카세트를 안정적으로 통제하는 역방향 아라비노오스 프로모터;를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
이하 본 발명의 재조합 벡터에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는 ompA 신호 서열 유전자, 이에 연결된 세포 부착 인자 유전자, asd 유전자; E-lysis 카세트; 및 역방향 아라비노오스 프로모터;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 재조합 벡터는 콜리바실로시스의 부착인자인 F4ab(K88ab), F4ac(K88ac), F5(K99), F6(FasA), 및 F41로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 부착인자 유전자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 asd 유전자는 세포벽 합성에 있어서 펩티도글리칸의 크로스 연결에 관여하는 DAP(diaminopimellic acid) 합성의 개시지점에 관련된 효소이다.
본 발명에서 상기 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 선별 표지 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
본 발명에서 상기 "세포용해 유전자(E-lysis gene)"는 대장균의 외막에 터널을 구성하여 구멍을 내서 대장균내 세포 내 핵산성분을 빼내어 용해(lysis)시키는 역할이 있다는 사실이 알려져 있으며(Hutchinson III CA and Sinsheimer RL, J Mol Biol, 1966), E-lysis 유전자에 의한 세포 용해의 결과, 핵산 성분을 포함한 모든 세포 내용물이 세포 외부로 유출되고, 외막(outer membrane), 주변 세포질 공간(periplasmic space) 및 내막(inner membrane)만이 남게 된다.
상기 E-lysis 유전자를 백터에 삽입하여 야생 병원성 살모넬라 균주에 형질전환하여 고스트화 가능 균주를 제조할 수 있다. 고스트화 세포의 최종 생산량을 높이기 위하여 온도 의존성 E-lysis 유전자의 하류에 반대 방향으로 위치한 아라비노오스 프로모터(ParaBAD)를 연결하여 유전자의 발현을 더욱 엄격하게 조절할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 고스트 살모넬라 변이주를 제공한다.
상기 고스트 살모넬라 변이주는 약독화된 고스트 살모넬라 변이주인 것이 바람직하다.
상기 약독화된 고스트 살모넬라 변이주는 lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 것이 바람직하다.
상기 고스트 살모넬라 변이주는 세포 부착 인자를 세포외벽에 발현한다.
상기 고스트 살모넬라 변이주는 대장균의 부착인자 F4ab(K88ab)를 세포 외벽에 발현하는 고스트 살모넬라 변이주, F4ac(K88ac)를 발현하는 고스트 살모넬라 변이주, F5(K99)를 발현하는 고스트 살모넬라 변이주, F6(FasA)를 발현하는 고스트 살모넬라 변이주 및 F41를 발현하는 고스트 살모넬라 변이주의 혼합 균주(기탁번호 KCTC12377BP)인 것이 바람직하다.
상기 고스트 살모넬라 변이주는 25 내지 28℃에서 세포 부착 인자를 세포 외벽에 발현하고, 42 내지 45℃에서 E-lysis 유전자를 발현하여 세포가 고스트화 되는 것을 특징으로 한다.
상기 고스트 살모넬라 변이주는 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 티피무리움 및 살모넬라 갈리나룸으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 균주로부터 유래한 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 고스트 살모넬라 변이주는 F4ab(K88ab), F4ac(K88ac), F5(K99), F6(FasA) 및 F41로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 부착인자를 발현하는 고스트 살모넬라 변이주로서, 상기 고스트 살모넬라 변이주는 단독 또는 하나 이상의 변이주를 혼합함으로써, 모돈의 점막에서 점막 및 전신 면역반응을 유도하고, 고스트화 과정이 엄격하게 조절되므로, 포유자돈에서 살모넬라균증 및 콜리바실로시스를 동시 예방하는 효과가 우수하다. 따라서, 본 발명에 따른 고스트 살모넬라 변이주를 함유하는 고스트 백신은 모돈에 접종되어 포유자돈의 면역력을 강화시키고, 경구 및 비강 접종이 가능하다.
또한, 본 발명은
(1) 단백질을 세포외벽에 발현시키는 ompA 신호 서열, 이에 연결된 세포 부착 인자 유전자 및 asd 유전자;
고스트화를 유도하는 E-lysis 유전자를 포함하는 E-lysis 카세트; 및
E-lysis 카세트를 안정적으로 통제하는 역방향 아라비노오스 프로모터;를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(2) 상기 (1)단계의 재조합 벡터로 lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 약독화된 살모넬라 변이주를 형질전환시켜 고스트 유도용 살모넬라 변이주를 제조하는 단계;
(3) 상기 고스트 유도용 살모넬라 변이주를 선별하여 영양배지에 접종하는 단계;
(4) 상기 (3)단계의 영양배지를 25 내지 28℃의 배양온도로 조절하여 병원성 대장균의 각 부착인자를 살모넬라 변이주 세포외벽에 발현시키는 단계;
(5) 배양온도를 42 내지 45℃로 상승시켜 E-lysis 카세트에 포함되어 있는 cI 유전자의 활성을 억제하여 E-lysis 유전자를 활성화시키는 단계; 및
(6) 활성화된 E-lysis 유전자에 의해 세포외벽에 소공이 형성되고 세포질 내물질이 세포외부로 방출되어 고스트화가 유도되는 단계;를 포함하는 고스트 살모넬라 변이주의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법에서 세포 부착 인자 유전자는 콜리바실로시스의 부착인자인 F4ab(K88ab), F4ac(K88ac), F5(K99), F6(FasA), 및 F41로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 부착인자 유전자인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 살모넬라균증 및 콜리바실로시스 동시 예방용 고스트 백신 조성물을 제공한다.
상기 백신 조성물은 모돈에 접종하여 포유자돈의 살모넬라균증 및 콜리바실로시스에 대한 면역력을 강화시키는 것을 특징으로 한다.
상기 살모넬라균증 및 콜리바실로시스 동시 예방용 고스트 백신 조성물은 경구투여하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 돼지의 소화기 질환 예방용 고스트 백신 조성물을 제공한다.
상기 소화기 질환은 신생자돈 설사병, 조발성 설사병, 3주령 설사병, 백리 또는 포유자돈 설사병을 포함한다.
상기 돼지의 소화기 질환 예방용 고스트 백신 조성물은 경구투여 또는 근육접종이 하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 경구투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 고스트 백신 조성물과 함께 살모넬라균증 및 콜리바실로시스 동시 예방용 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 수크로오스 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 돼지의 무게, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 고스트 백신 조성물의 투여량은 모돈 1두당 약 2×108 내지 2×1012 cells, 바람직하게는 약 2×109 내지 2×1011 cells로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 살모넬라균증 및 콜리바실로시스 동시 예방을 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 살모넬라균증 및 콜리바실로시스 동시 예방용 사료 첨가제를 제공한다.
상기 사료 첨가제는 개별급여 또는 섬유질배합사료(total mixed ration; TMR)에 혼합하여 급여하는 것이 바람직하다.
섬유질배합사료는 조사료와 농후사료를 잘 섞어 급여하는 방식이다. 섬유질배합사료는 주변에서 용이하게 수득할 수 있는 미강이나 깻묵, 버섯 부산물, 비지 및 맥주박 등의 농산부산물 또는 식품부산물을 혼합하여 급여하므로, 사료비를 줄일 수 있다.
상기 사료 첨가제는 경구 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 "사료 첨가제"란 영양적 또는 특정 목적을 위하여 가축 및 가금의 사료에 미량으로 첨가되는 물질을 지칭하는 말로, 보충 사료 또는 특수 사료라고도하며, 조사료와 농후사료와는 달리 소량의 배합만으로도 필수영양소를 완전 공급할 수 있다.
이하, 본 발명은 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명된다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 장독소원성 대장균의 부착인자 유전자를 발현하는 형질전환된 대장균 제작
1. 각 부착인자를 발현하는 살모넬라 균주의 선별 및 이의 배양 조건
단백질 항원 발현과 백신 클로닝 제작을 위한 각 부착인자 발현 유전자는 병원성 대장균인 JOL416(F4ab 발현), JOL417(F4ac 발현), JOL412(F5 발현), JOL415(F6 발현) 및 JOL413(F41 발현)으로부터 확보되었다. 또한 병원성 대장균 야생 분리주인 JOL599(F4 발현), JOL412(F5 발현), JOL415(F6 발현), JOL413(F41 발현)과 살모넬라균 야생 분리주인 JOL389(살모넬라 티피무리움)는 도전감염 균주로 사용하였다. 상기 선별된 균주의 설명 및 입수방법을 표 1에 나타내었다.
균주 설명 입수방법
백신
균주		 JOL1323 F4ab를 발현하는 JOL912
JOL1324 F4ac를 발현하는 JOL912
JOL1325 F5를 발현하는 JOL912
JOL1326 F6을 발현하는 JOL912
JOL1375 F41을 발현하는 JOL912
도전감염 균주 JOL599 F4를 발현하는 Escherichia coli 야생분리주
JOL412 F5(K99) fimbria를 발현하는 Escherichia coli 야생 분리주 국립수의과학검역원
(E. coli G.C.V. K99)
JOL415 F6(FasA) fimbria를 발현하는 Escherichia coli 야생 분리주 국립수의과학검역원
(ETEC E-127 O141: K88ab, F6)
JOL413 F41 fimbria를 발현하는 Escherichia coli 야생 분리주 국립수의과학검역원
(ETEC E-92 O9:K35, K99, F41)
JOL389 Salmonella Typhimurium 야생 분리주 국립수의과학검역원
(Salmonella Typhimurium
ST302)
상기 선별된 균주들을 LB(Luria-Bertani) broth에서 배양하였다. 대장균 χ6212 [F-λ- Φ80Δ(lacZYA-argF) endA1 recA1 hsdR17 deoR thi-1 glnV44 gyrA96 relA1 ΔasdA4]와 약독화 살모넬라 티피무리움(JOL912)(Δlon ΔcpxR Δasd)(기탁번호 KCTC11540BP)은 DAP(diaminopimellic acid)(50 ㎍/ml)가 포함된 LB broth에서 배양하였다. 본 발명의 살모넬라 균주 고스트 유도용 재조합 벡터를 이용하여 병원성 대장균의 각 부착인자를 발현하는 살모넬라 균주를 선별할 때에는 DAP를 포함하지 않는 LB 아가(agar)에서 선별하였다.
2. 살모넬라 균주 고스트 유도용 재조합 벡터의 제조
통상의 재조합 벡터를 제조하는 방법을 이용하여,
i) 단백질을 세포외벽에 발현시키기 위한 ompA 신호 서열;
ii) 고스트 유도를 위한 E-lysis 카세트; 및
iii)보다 안정적으로 E-lysis 카세트를 통제하기 위한 역방향 아라비노오스 프로모터(arabinose promotor);를 포함하는 살모넬라 균주 고스트 유도용 재조합 벡터를 제조하였으며, 이를 도 1에 나타내었다.
3. 병원성 대장균의 총 DNA 추출 및 부착인자 유전자 증폭
병원성 대장균의 총 DNA 추출은 통상적인 방법에 따라 실시하였다. 즉, -70℃에 보관 중인 병원성 대장균을 LB 아가에 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 상기 배양된 콜로니들 중에서 임의의 콜로니 하나를 선별하여 1.5㎕의 LB broth에 접종하였으며 하룻밤 동안 배양한 후 원심분리하였다. 상기 원심분리한 콜로니 함유물의 상층액을 제거한 다음 멸균 증류수를 1㎖ 첨가하여 재부유시켰다. 상기 재부유액을 원심분리한 후 상층액을 제거한 다음 멸균 증류수 50㎕를 첨가하여 한번 더 부유시켰으며, 95℃에서 20분간 가열한 후 원심분리하여 상층액을 조심스럽게 멸균 소형관으로 옮겨 병원성 대장균의 총 DNA로 추출하였다.
장독소원성 대장균 및 장병원성 대장균의 각 부착인자 유전자는 제한효소 절단 부위를 가진 특이 프라이머를 이용하여 PCR 기법으로 증폭하였다. 상기 특이 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다.
부착인자 프라이머 제한효소
장독소원성 대장균 F4ab K88ab CCGCGAATTCGCACATGCCTGGATGACTGG EcoRI
CCGCAAGCTTGTAATAAGTTATTGCTACG HindIII
F4ac K88ac CCGCGAATTCGCACATGCCTGGATGACT EcoRI
CCGCAAGCTTGTAATAAGTAATTGCTACG HindIII
F5 K99 CCGCGAATTCTCTGCGAATACAGGTACTA EcoRI
CCGCAAGCTTCATATAAGTGACTAAGAA HindIII
F6 FasA CCGCGAATTCGCGCCCGCTGAAAACAAC EcoRI
CCGCAAGCTTCGGTGTACCTGCTGAACG HindIII
F41 F41 CCGCGAATTCATGAAAAAGACTCTGATTGC EcoRI
CCGCAAGCTTTTAACTATAAATAACGGTGA HindIII
상기 증폭된 각 부착인자 유전자는 아가로오스 겔을 이용하여 해당 크기를 확인한 다음 AccuPrep 겔 정제키트(Bioneer, Korea)를 이용하여 정제하였다.
상기 프라이머를 이용하여 증폭시킨 유전자의 서열정보는 유전자 은행(젠뱅크; GenBank)에서 F4(K88ab)는 GenBank V00292.1; F4(K88ac)는 GenBank AJ616256.1; F5(K99)는 GenBank M35282.1; F6(FasA)는 GenBank U50547.1; F41은 GenBank X14354.1로 용이하게 입수할 수 있다.
4. 각 부착인자를 발현하는 대장균의 제작
상기 3에서 정제된 PCR 증폭산물과 pQE9(EcoRI과 HindIII) 또는 pET28a(EcoRI과 HindIII) 플라스미드를 상기 표 2에 기재된 제한 효소로 각각 절단한 후 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 상기 절단된 각 단편을 AccuPrep 겔 정제 키트를 이용하여 정제한 다음 T4 DNA 리가아제(Takara, Japan)로 두 산물을 라이게이션하였으며, 이를 E. coli JM109 또는 E. coli Top 10으로 형질전환하였다. 상기 형질전환된 변이주를 앰피실린(pQE9을 발현 플라스미드로 사용하였을 경우) 또는 카나마이신(pET28a를 발현 플라스미드로 사용하였을 경우)이 각각 첨가된 LB 아가에 균일하게 접종하고 건조시킨 다음 37℃에서 하룻밤 동안 배양하여 발현 플라스미드로 형질전환된 E. coli JM109 또는 E. coli Top 10을 선별하였다.
상기 각 부착인자 유전자가 삽입된 플라스미드는 E. coli JM109 또는 E. coli Top 10으로부터 AccuPrep 플라스미드 추출 키트(Bioneer, Korea)를 이용하여 플라스미드를 분리하였다. 상기 분리한 플라스미드를 상기 표 2에 기재된 제한 효소로 각각 절단하고 아가로오스 겔에서 전기영동하여 확인하였다.
상기 확인된 해당 콜로니를 각 발현 플라스미드에 맞는 항생제가 첨가된 5㎖의 LB broth에 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 상기 배양된 균액 중 250㎕를 각 항생제가 첨가된 새로운 5㎖의 LB broth에 재접종하여 45분간 배양한 후 이 중 1㎖를 유도 전 대조군으로 사용하기 위해, 멸균 소형관으로 옮겼다. 나머지 4㎖에는 IPTG(isopropyl-D-thiogalactopyranoside)의 최종 농도가 1mM이 되도록 첨가하여 3시간 동안 배양한 후, 이 중 1㎖는 유도 후 발현 여부를 확인하기 위해 멸균 소형관에 옮겼다. 이후 나머지 3㎖는 발현 단백질이 가용성인지 또는 불용성인지를 확인하기 위해, 4,000×g에서 20분간 원심분리한 후 500㎕의 멸균 PBS(phosphate buffered saline)로 재부유시켰다.
상기 재부유액을 초음파처리(sonication)하여 세포를 분쇄한 후, 10,000×g에서 20분간 원심분리하여 상층액은 새로운 멸균 소형관에 옮기고 침전물(pellet)은 500㎕의 멸균 PBS로 재부유시켰다. 상기 상층액(발현 단백질이 가용성일 경우)과 재부유액(발현 단백질이 불용성일 경우), 유도 전후에 준비한 샘플들을 SDS-PAGE로 전기영동하여 각 부착인자의 발현 여부 및 발현상태를 확인하였다.
5. 각 부착인자 항원 준비
상기 4에서 확인된 콜로니를 LB broth 200㎕에 접종하여 30℃에서 150rpm의 속도로 흔들어 주면서 하룻밤 동안 배양하였다. 상기 배양액에 IPTG의 최종농도가 1mM이 되도록 첨가하여 같은 조건으로 4시간 동안 재배양한 다음 4℃에서 8,000rpm의 속도로 15분간 원심분리하였다. 상기 상층액은 버리고 침전물은 PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride)가 1mM이 되도록 첨가된 10㎖의 멸균 PBS로 재부유시켰다. 이 부유액을 -70℃에서 냉동한 다음 37℃ 수욕조 내에서 해동하였다. 이와 같이 냉동과 해동의 과정을 3회 반복한 다음 마지막으로 해동한 후 부유액을 초음파처리하여 세포들을 분쇄하였다. 이 초음파처리된 세포분쇄용액을 15,000rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하여 상층액을 멸균관에 옮겼다. 발현 단백질이 가용성일 경우에는 완충액 B(100mM NaH2PO4, 10mM Tris·Cl, 8M urea, pH 8.0) 4㎖를 상층액과 혼합하였고 불용성일 경우에는 6㎖의 완충액 B로 침전물을 재부유시킨 후 실온에서 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 상기 반응액을 15,000rpm, 4℃에서 20분간 원심분리한 후 상층액을 레진(resin)이 들어 있는 관으로 옮겨 단백질이 레진과 결합하도록 30분간 교반하였다. 상기 반응액을 준비된 칼럼에 충전시키고 천천히 흘려보낸 다음 완충액 C(100mM NaH2PO4, 10mM Tris·Cl, 8M urea, pH 6.3)를 6㎖씩 충전하여 칼럼을 3회 세정하여　레진과 결합하지 않은 기타 불필요한 단백질을 제거하였다. 2㎖의 용리 완충액(100mM NaH2PO4, 10mM Tris·Cl, 8M urea, pH 4.5)으로 칼럼을 충전시킨 후 20분간 반응시켜 발현 단백질을 레진으로부터 분리시킨 다음 용리 완충액를 1㎖씩 첨가하여 단백질을 회수하였다. 상기 회수된 단백질을 SDS-PAGE에서 전기영동하여 발현 단백질을 확인하였으며 단백질량을 정량한 후 -70℃에 보관하며 ELISA 항원으로 사용하였다.
[ 실시예 2] 부착인자가 세포외벽에 발현하는 고스트 살모넬라 티피무리움 변이주의 제작 및 확인
1. 부착인자 유전자를 발현하는 고스트 유도용 재조합 벡터에 클로닝
상기에서 각 부착인자 유전자의 발현이 확인된 각 플라스미드와 고스트 유도용 재조합 벡터를 상기 표 2에서 기재한 제한효소로 각각 절단한 후 아가로오스 겔에서 전기영동하였다. AccuPrep 겔 정제 키트를 이용하여 아가로오스 겔로부터 절단된 각 부착인자와 고스트 유도용 재조합 벡터 절편을 정제하고 T4 DNA 리가아제를 이용하여 4℃에서 하룻밤 동안 라이게이션하였다. 이 반응액으로 E. coliχ6212를 형질전환시켜 DAP를 첨가하지 않은 LB 아가에 고루 펴서 말린 다음 하룻밤 동안 배양하여 형질전환된 변이주를 선별하였다. 각 부착인자의 확인은 E. coliχ6212로부터 플라스미드를 분리하여 각 부착인자에 해당하는 제한 효소로 절단한 후 아가로오스 겔에서 전기영동하여 최종 확인하였다.
2. 각 부착인자 유전자를 포함하는 살모넬라 균주 고스트 유도용 재조합 벡터로 형질전환된 살모넬라 티피무리움 변이주
상기 1에서 최종 확인된 각 정제 플라스미드를 바이오-레드 마이크로펄서(Bio-Rad MicroPulser)(Bio-Rad, USA)를 이용하여 전기천공법(electropoartion)에 의하여 JOL912 균주(lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실)를 형질전환시켰다. 즉, JOL912를 DAP(50㎍/㎖)이 포함된 LB broth에서 중간-로그 단계(mid-log phase)까지 배양한 후 멸균된 글리세롤을 10% 함유한 증류수로 두 번 세척한 뒤 전기천공용 큐벳에 넣고 정제된 플라스미드 0.1㎍과 섞은 후 전기충격을 가하였다. 반응된 균을 회수하여 DAP를 넣지 않은 1㎖의 LB broth에 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 형질전환된 살모넬라균 변이주를 선별하기 위해 배양된 균액 100㎕를 다시 DAP를 첨가하지 않은 LB 아가에 골고루 펴서 말린 다음 37℃에서 하룻밤 배양한 후 형성된 살모넬라 변이주를 선별하였다. 다수의 콜로니를 선별하여 같은 콜로니를 아라비노오스가 0.2% 첨가된 LB 아가와 아라비노오스가 첨가되어 있지 않은 LB 아가에 각각 접종하여 28℃와 42℃에서 각각 하룻밤 동안 배양하여 42℃에서 성장하지 않고 28℃에서 배양된 같은 콜로니를 최종 선별하여 JOL1323(K88ab 발현), JOL1324(K88ac 발현), JOL1325(K99 발현), JOL1326(FasA 발현), JOL1375(F41 발현)을 얻었다.
본 발명자들은 포유자돈의 콜리바실로시스의 부착인자 F4ab(K88ab), F4ac(K88ac), F5(K99), F6(FasA) 또는 F41 유전자를 각각 포함하는 5개의 살모넬라 변이주 모두를 포함하는 혼합 살모넬라균 변이주를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다(기탁번호 KCTC12377BP) (기탁명 ST-ETEC6). 기탁된 고스트 살모넬라 변이주를 현미경으로 촬영하여 도 2에 나타내었다.
3. 살모넬라 티피무리움 변이주 세포외벽에 발현된 각 부착인자 확인
상기 2에서 제작된 백신 균주가 해당 부착인자를 살모넬라 변이주 세포외벽에 발현하는지를 확인하기 위하여, 각 백신 후보균주를 100㎖ 영양배지(Nutrient broth)에 접종하여 28℃에서 28시간 동안 배양한 후 42℃에서 48시간 동안 배양하여 고스트화를 유도한 다음 7,000rpm에서 원심분리하여 침전물(pellet)을 준비하였다. 각 침전물을 초음파처리(sonication)하여 분쇄한 후 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물을 SDS-PAGE용 샘플 완충액로 재부유시켜 실험에 사용하였다. 95℃에서 5분간 끓인 후 SDS-PAGE를 수행한 다음 PVDF 멤브레인으로 옮겨 차단 완충액(5% skim milk in PBST)으로 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날 Anti-His(Igtherapy, Korea)을 1:5,000으로 희석하여 1시간 동안 반응시킨 후 1:5,000으로 희석된 2차 항체[goat anti-mouse IgG(H+L) HRP]로 1시간 동안 반응시켰다. 이의 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 상기 해당 부착인자가 WEST-oneTM Western Blotting System(Intron Biotechnology, Korea)으로 발색되어 살모넬라 변이주의 세포외벽에서 발현되었다. 즉, 웨스턴 블롯의 결과, 본 발명의 각 부착인자가 살모넬라 세포변이주의 세포외벽에서 발현되는 것을 확인하였다.
[ 실시예 3] 고스트 백신 조성물의 제조
상기 실시예 2의 3에서 해당 부착인자의 발현이 확인된 각 백신 후보균주를 아라비노즈가 첨가된 LB 아가에서 성장시킨 후 임의로 선별된 콜로니 하나를 200㎖의 영양배지에 접종하여 28℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포수를 파악하기 위하여 멸균 식염수에 희석하여 아라비노즈가 함유된 LB 아가에 도말한 뒤 콜로니 수를 계산하였다. 42℃로 맞춰져 있는 배양기에서 48시간 동안 배양하여 99%이상 유전공학적 기법에 의해 고스트 유도시켰다. 고스트 유도된 배양액을 원심분리하여 멸균 PBS에 부유시킨 다음 얼음에 보관하며 제조당일 또는 제조 다음 날에 실험에 사용하였다.
[ 실험예 1] 고스트 백신 조성물에 대한 최적의 접종경로 선별
1. 마우스에서 접종 경로별 백신 접종
5주령의 BALB/c 암컷 마우스를 구입하여 전북대학교 실험동물사육장에서 사육하면서 약 1주일 동안 사육 적응 기간을 거친 후 실험에 사용하였다.
마우스는 크게 두 집단, 즉 근육 접종(표 3)과 경구 접종(표 4)으로 구분하여 접종하였으며, 기재된 접종경로별 접종량에 따라 각 부착인자별로 접종하였다. 상기 두 마우스 집단은 총 5 그룹(그룹 A, B, C, D 및 E)으로구분하여 실험에 사용되었다.
그룹 두수 접종균주 접종량 접종 경로
A 8 Control 멸균 PBS 접종 근육
B 8 K88ab 1×108 cells in 100㎕ 멸균 PBS
C 8 K88ac 1×108 cells/100㎕
D 8 K99 1×108 cells/100㎕
E 8 FasA 1×108 cells/100㎕
그룹 두수 접종균주 접종량 접종 경로
A 8 Control 멸균 PBS 접종 경구
B 8 K88ab 1×109 cells/20㎕
C 8 K88ac 1×109 cells/20㎕
D 8 K99 1×109 cells/20㎕
E 8 FasA 1×109 cells/20㎕
2. 가검물 채취 및 각 부착인자에 대한 면역반응 측정
접종 전 및 접종 후 2주 간격으로 sIgA와 IgG를 측정하기 위해 각각 분변과 혈액을 채취하였다. 상기 분변은 무게를 측정한 후 소디움 아자이드(sodium azide)가 0.1% 함유된 PBS로 100㎎/㎖가 되도록 부유시켰다. 이후 상기 분변 부유용액을 13,200rpm에서 10분간 원심분리한 후 이의 상층액을 분리하여 -20℃에 보관하면서 실험에 사용하였다. 상기 혈청은 마우스의 안와후 정맥을 통해 채혈한 후 4,000×g에서 5분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하고 -20℃에 보관하며 실험에 사용하였다.
본 발명의 각 부착인자-특이 sIgA항체와 IgG항체를 측정하기 위해 ELISA를 수행하였다. ELISA 플레이트(ELISA plate)에 실시예 1의 5에서 정제된 각 부착인자 항원 단백을 500ng/웰(well)의 농도로 분주한 후 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날 각 플레이트 Tween 20을 0.05% 함유된 PBS로 3번 세척한 후 차단 완충액(3% skim milk in PBS)으로 30분간 반응시킨 다음 상기 혈청을 PBST로 1:100(v/v)으로, 상기 분변을 1:3(v/v)으로 각각 희석하였으며, 이를 각 웰에 100㎕씩 분주한 후 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다.
혈청의 경우에는 peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG HRP를, 분변의 경우에는 peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgA HRP를 1:5,000의 비율로 각각 희석하여 각 웰에 100㎕씩 분주한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. OPD가 함유된 기질액을 각 웰 당 100㎕씩 분주하여 발색시켰으며, 3M 황산으로 반응을 정지시킨 다음 492nm에서 흡광도를 측정하였다. 항체의 농도는 표준 단백 농도에 기초하여 측정하였다.
접종 후 4주차가 된 마우스를 희생시켜 무균적으로 비장을 채취하고 분쇄한 다음 조직 내 세포를 꺼내 세포 착색제(stainer)로 남은 조직을 제거하였다. 이를 원심분리하여 세포를 가라앉힌 다음 RPMI[모든 RPMI(RPMI, 1640, supplemented, Sigma)는 10% heat-inactivated fetal bovine serum ;FBS, 100 IU/㎖ penicillin 그리고 100㎍/㎖ streptomycine이 포함되어 있다]로 부유시키고 재차 원심분리하여 세포를 가라앉혔으며, 이에 적혈구 파괴 완충액를 첨가하여 침전된 세포를 다시 부유시켜 적혈구를 제거하였다. 이후 원심분리하여 세포 침전물을 멸균 PBS로 세척하였다. 상기 과정을 두 차례 더 반복하고 RPMI에 부유된 비장세포(splenocyte)의 수를 측정하여 각 그룹에 해당하는 항원과 함께 최종 세포수가 1×107cells이 되도록 24 웰 배양 플레이트에 분주하여 실험에 사용하였다.
3. 접종경로별 각 부착인자에 대한 면역반응 결과
본 발명의 백신에 대한 최적화 경로를 선별하기 위하여, 근육 접종경로와 경구 접종경로에 대한 각 부착인자의 면역반응 결과를 관찰하였다. 상기 표 3 및 4에 기재된 방법으로 접종하였으며, 이에 대한 항체역가를 6주 동안 ELISA로 측정하였다. 이의 결과를 도 4 및 5에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 백신 후보균주를 근육접종한 실험군의 접종 후 2주차에 K99 및 FasA 부착인자에 대한 sIgA의 항체역가는 대조군에 비하여 현저하게 상승하였으며, 4주차부터의 항체역가는 대조군과 유사하였다. 또한, 본 발명의 백신 후보균주를 근육접종한 실험군의 K88ab, K88ac, K99 및 FasA 부착인자에 대한 IgG의 항체역가는 실험한 6주 동안 계속 상승하여 높은 면역반응을 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 백신 후보균주를 경구접종한 실험군은 접종 후 2주차에 상기 근육접종 실험군과 마찬가지로 K99 및 FasA 부착인자에 대한 sIgA의 항체역가가 대조군에 비하여 유의하게 상승하였으나 상승폭이 낮고 개체차가 크게 나타났다. 또한, 본 발명의 백신 후보균주를 경구접종한 실험군은 K88ab 항원을 제외한 각 부착인자의 IgG에 대한 항체역가가 6주 동안 상승하는 것으로 측정된 반면, 근육접종한 실험군은 경구접종한 실험군보다 IgG에 대한 항체역가의 상승폭이 작았다.
따라서, 본 발명의 백신 조성물에 대한 최적 접종경로를 근육 접종경로로 결정하였다.
[ 실험예 2] 각 부착인자를 발현하는 후보균주를 혼합하여 마우스에 근육접종한 면역반응 유도 실험
1. 마우스에서 백신 후보균주를 혼합한 후 근육접종
5주령의 BALB/c 암컷 마우스를 구입하였으며, 본 발명의 각 부착인자를 발현하는 백신 후보균주를 혼합하여 근육접종하였다. 백신접종 개요는 하기 표 5에 나타내었다.
그룹 두수 접종균주 접종량 접종 경로
A 8 Control 멸균 PBS 접종
B 10 K88ac+K99+FasA+F41 1×108 cells in 100㎕ 멸균 PBS 근육
2. 각 부착인자에 대한 면역반응 측정
접종 전, 접종 후 2주, 4주 및 6주 차에서 분변 sIgA 및 혈청 IgG에 대한 항체역가를 측정하기 위하여, 상기 실험예 1의 2와 같은 방법으로 가검물을 채취하고 ELISA로 측정하였다.
면역조직염색법(Immunohistochemistry, IHC)을 수행하기 위하여, 접종 2주 차의 마우스를 24시간 동안 절식시킨 후 희생시켜 멸균된 상태에서 장(intestine)을 분리하였다. 분리된 장의 공장과 회장을 동결절편물(Frozen section compound)(Surgipath FSC22. Leica Microsystems. USA)을 이용하여 -70℃에 보관하며 실험에 사용하였다. 블럭을 7㎛로 동결절편(frozen section)(Mircrom HM520 Thermo USA)하여 건조하였으며 -20℃에 보관하였다. 조직 샘플을 메탄올:에탄올(1:1, v/v) 용액에 넣어 -20℃에서 10분간 고정한 뒤 0.01M PBS로 5분간 3회 세척하고 0.1M PBS에 0.5%로 희석시킨 과산화수소에 10분간 반응시킨 다음 0.01M PBS로 3회 세척하였다. 이후 peroxidase-blocking regent(DAKO) 100㎕를 조직위에 떨어트려 1시간 반응시킨 뒤 다시 세척하고 각각의 항원을 0.1M PBS에 50㎍/ml로 희석하여 100㎕를 떨어트려 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 세척 후 해당 항원에 따른 polyclonal anti-rabbit IgG를 캡쳐하기 위해 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 후 2차 항체로 항-토끼 Ig(Vector ILaboratories, Inc.)를 실온에서 1 시간 동안 반응시키고, 다시 세척 후 사용 직전에 제조된 AEC 기질(substrates)을 즉시 반응시켰다. 헤마톡실린(Hematoxilin)으로 염색하여 광학현미경(DP72. OLYMPUS. Japan)의 200배와 400 배율로 각각 확인하였다.
3. 각 부착인자에 대한 면역반응
K88ab, K88ac, K99 및 FasA 부착인자를 발현하는 백신 후보균주를 혼합하여 1×108cells/100㎕로 근육접종하였다. 접종 전 및 접종 후, 2주 간격으로 8주 동안 가검물을 채취한 샘플로 ELISA를 수행하였다. 이의 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 8주 동안 모든 항원의 IgG에 대한 항체역가가 지속적으로 상승 및 유지되었다. 특히 K88ab와 FasA 항원의 IgG에 대한 항체역가가 매우 높았으며 K88ac 및 K99에 대한 항체역가도 높았다. sIgA에 대한 항체역가를 측정한 결과, 백신 접종 후 2주차에 sIgA에 대한 항체역가가 대조군에 비해 높게 나타났다.
마우스의 소장에 백신 후보균주를 혼합하여 근육접종한 실험에서, 각 부착인자 항원에 대한 분비 IgA B 세포의 존재여부를 면역조직염색법으로 확인하였다. 이의 결과를 도 7에 나타내었으며, 도 7의 조직면역 염색의 결과를 수치화한 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
그룹 Mean no. of cells/mm2SD.
K88ab K88ac
대조군 0.24±0.20 0.26±0.23
접종군 2.13±1.19* 3.02±1.65*
도 7 및 표 6에 나타난 바와 같이, 대조군에서는 각 부착인자의 항원에 대한 분비 IgA B 세포를 관찰할 수 없었던 반면, 실험군에서는 각 부착인자-특이 분비 IgA B 세포가 관찰되었다.
[ 실험예 3] 마우스를 대상으로 한 접종 횟수 결정 실험
1. 실험동물 및 백신 접종
각 부착인자 항원을 발현하는 백신 후보균주들을 혼합하여 근육접종으로 1회, 2회, 3회 접종한 다음 유도된 면역반응을 확인하였으며 최적의 접종 횟수를 결정하였다. 이를 위해 5주령의 BALB/c 암컷 마우스를 40두를 구입하였으며, 각 백신 균주를 각각 2.5×107 cells/25㎕로 농축한 후 혼합하여 접종량이 총 1×108 cells/100㎕이 되도록 혼합한 다음 근육접종하였다. 이의 접종개요를 하기 표 7에 나타내었다.
그룹 두수 접종균주 접종량 접종경로
1차 접종 2차 접종 3차 접종
A 10 대조군 PBS PBS PBS 근육
B 10 K88ab+K88ac+K99+FasA 1×108 cells in 100㎕ - -
C 10 K88ab+K88ac+K99+FasA 1×108 cells in 100㎕ 1×108 cells in 100㎕ -
D 10 K88ab+K88ac+K99+FasA 1×108 cells in 100㎕ 1×108 cells in 100㎕ 1×108 cells in 100㎕
표 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 각 부착인자인 K88ab, K88ac, K99 및 FasA 핌브리아(fimbria)를 발현하는 고스트 백신(ghost vaccine; 사균 백신)을 혼합한 후 근육접종하였다.
2. 가검물 채취 및 면역반응 측정 방법
접종 전 및 최종 접종 후, 8주 동안 분변 sIgA 및 혈청 IgG에 대한 항체역가를 측정하기 위하여, 상기 실험예 1의 2와 같은 방법으로 가검물을 채취하고 상기 항체역가를 2주 간격으로 ELISA를 이용하여 측정하였다.
3. 접종횟수에 따른 면역반응 측정 결과
상기 표 7의 접종 횟수에 따른 면역반응을 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 그룹 B, C 및 D의 혈청 IgG에 대한 항체역가가 최종 접종 후 8주 동안 유지되었다. 1차 접종만 실시한 B 그룹의 sIgA의 항체역가는 2주차에서 한번 상승한 후 떨어지는 반면, 추가 접종, 즉 부스터를 시행한 두 그룹, C 및 D의 항체역가는 한번 상승한 이후 계속 유지되어 백신 조성물의 효과가 지속되는 것으로 확인되었다.
[ 실험예 4] 임신 모돈에 백신 접종 후 포유자돈에서의 면역 반응 유도 실험
1. 실험 동물, 균주 및 백신 접종
분만 예정 5주 전의 모돈 중에서 다음과 같은 조건의 모돈을 선별하여 실험동물로 사용하였다.
상시 선별조건은 살모넬라균증 및 콜리바실로시스에 감염된 병력이 없으며, 병원성 대장균에 대한 예방접종이 실시되지 않은 모돈임을 조건으로 하였다. 상기의 조건에 의해 선별된 모돈 18두와 그 모돈에서 출생한 자돈 118두를 실험에 사용하였다.
K88ab, K88ac, K99, FasA 및 F41 부착인자 항원을 각각 발현하는 약독화 살모넬라 백신 균주를 실험에 사용하였다.
또한, K88ab, K88ac, K99, FasA 및 F41 부착인자 항원을 각각 발현하는 살모넬라 변이주를 고스트 유도한 다음 혼합하여 고스트 백신으로 사용하였다.
실험군은 각 모돈 한 마리당 표 8에서와 같은 접종량으로 근육 또는 경구로 접종하였으며, 대조군은 2ml의 멸균 PBS를 근육접종하였다. 2차 접종군은 상기와 같은 방법으로 접종한 다음 21일째에 한 번 더 추가 접종하였다. 이의 접종방법을 표 8에 나타내었다.
그룹 두수 접종균주 접종량 접종
경로 		도전
감염
1차 접종
(분만 5주전)		 2차 접종
(분만 2주전)
A 3 Control PBS PBS 근육 5일령
B 3 상업용 백신 fimbria 정제 백신 fimbria 정제 백신
C 3 K88ab+K88ac+K99+FasA+F41+LTB 혼합백신 혼합백신
D 3 K88ab+K88ac+K99+FasA+F41+LTB 혼합 백신
(2×109 cells)		 혼합백신
(2×109 cells)		 경구
E 3 K88ab+K88ac+K99+FasA+F41+LTB 혼합백신
(2×1010 cells)		 혼합백신
(2×1010 cells)
F 3 K88ab+K88ac+K99+FasA+F41+LTB 혼합백신
(2×1011 cells)		 혼합백신
(2×1011 cells)
2. 가검물 채취와 항체역가 측정 그리고 도전감염
i) 모돈 : 접종 전(분만 5주 전), 1차 접종 후 3주(2차 접종 전, 분만 2주 전), 1차 접종 후 5주(분만 당일)로 이루어진 그룹별로 각각 채혈하여 혈청을 분리한 다음 -20℃에 보관하며 실험에 사용하였다.
ii) 자돈 : 도전감염 전에 각각 채혈하여 혈청을 분리한 다음 -20℃에 보관하며 실험에 사용하였다.
iii) 초유 : 분만 당일에 초유를 채취하여 -20℃에 보관하며 실험에 사용하였다.
돼지 초유에서 접종 항원의 점막 IgG 및 sIgA에 대한 항체역가를 측정하였고 모돈 및 자돈의 혈청에서 같은 항원의 특이 혈청 IgG에 대한 항체역가를 각각 측정하였다.
혈청 및 초유에서 각 항원의 특정 항체역가를 측정하기 위하여, ELISA 플레이트의 시료 웰에 정제된 항원 단백질을 500ng/웰의 농도로, 표준 웰에는 goat anti-pig IgG 또는 goat anti-pig IgA를 각각 500ng/웰, 100ng/웰의 농도로 분주한 후 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 다음 코팅하였다. ELISA 플레이트는 PBS-Tween 20(PBST)으로 3번 세척한 후 차단 완충액(phosphate-buffered saline [pH7.4], 1% bovine serum albumin 사용)으로 30분간 반응시켰다. 혈청 및 초유는 차단 완충액로 각각 1:200내지 1: 400의 배율로 각각 희석하여 각 웰당 100㎕씩 분주한 후 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. Peroxidase-conjugated goat anti-pig IgG HRP 또는 peroxidase-conjugated goat anti-pig IgA HRP를 각각 1:100,000 및 1:50,000의 배율로 희석하여 각 웰당 100㎕씩 분주한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. OPD-기질(substrate) 반응액을 각 웰당 100㎕씩 분주하여 발색시킨 다음 3M 황산으로 반응을 정지시켜 492nm에서 OD값을 측정하였다. 각 항원-특이 항체의 농도는 표준 단백질(standard protein) 농도에 기초하여 측정하였다.
국내 돼지에서 발생빈도가 높은 4종의 병원성 대장균 혈청형(F4, F5, F6, F41)을 섞어 경구 감염시킨 후 설사 및 폐사 유무로 방어능에 대한 효과를 측정하였다.
3. 면역반응 및 방어 여부 측정 결과
가. 모돈 혈청에서의 면역반응
모돈에서 모든 부착인자-특이 혈청 IgG 항체역가를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 그룹 D를 제외한 모든 그룹의 모돈에서 IgG 항체역가는 접종 3주(3 PPI)후부터 접종 5주(5 PPI)후까지 대조군보다 높게 관찰되었다.
나. 모돈 초유에서의 면역반응
모돈의 초유에서 모든 부착인자 항원의 IgA 및 IgG에 대한 항체역가를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 그룹 E와 F에서는 모든 항원의 IgA 및 IgG에 대한 항체역가가 대조군보다 현저히 높게 관찰된 반면, 그룹 A, B, C는 일부 항원의 항체역가가 대조군보다 약간 높게 관찰되었다. 또한, 일부 모돈에서는 대조군과 유사한 항체역가가 관찰되기도 하였다. 그룹 D의 경우, 일부의 항원의 항체역가가 대조군과 유사하였다.
다. 자돈 혈청에서의 면역반응
자돈 혈청에서 모든 부착인자의 IgG 및 IgA에 대한 항체역가를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 자돈 혈청에서 측정된 항체역가는 모돈 초유에서 측정된 항체역가와 유사하여 면역반응이 유사한 것으로 확인되었다. 그룹 E와 F에서 모든 항원에 대하여 대조군 대비 월등한 항체역가가 관찰된 반면, 그룹 A, B, C는 일부 항원에서 대조군보다 약간 높은 항체역가가 관찰되었으며, 그 편차도 심하게 나타났다. 또한, 일부 항원에서는 대조군과 유사한 항체역가를 보이는 자돈도 관찰되었다. 그룹 D의 경우, 대다수의 항원에서 대조군과 유사한 항체역가가 관찰되었다.
라. 도전감염 후 자돈에서의 면역 방어 효과
도전감염 후 자돈에서의 면역방어 효과를 표 9에 나타내었다.
Group 도전감염
자돈
출생
두수		 설사
두수		 폐사
두수
A 18 16 3
B 23 7
C 17 4 1
D 17 10
E 20 0
F 23 0
표 9에 나타난 바와 같이, 그룹 E 및 F의 생후 1주령의 자돈에서는 설사가 관찰되지 않았다. 반면, 그룹 B, C 및 D의 자돈에서는 각각 30.3%, 23.5%(1두 폐사) 및 58.8%의 비율로 설사가 관찰되었으며, 대조군은 88.9%의 비율로 설사가 관찰되었고 이 중 3두가 설사로 인한 탈수로 폐사하였다.
4. 결론
상기 결과를 종합하여 보면, 본 발명에서 개발된 백신과 상업용 백신을 접종한 모돈의 초유에서 IgG 및 IgA에 대한 항체역가는 높게 측정되었다. 각각의 백신을 접종한 모돈으로부터 출생한 자돈은 높은 항체를 함유하는 모유를 섭취함으로써 면역력이 강화된다. 생후 1주령의 자돈에서 혈청의 IgG 및 IgA에 대한 항체역가가 대조군보다 높게 관찰되었다. 또한, 백신을 접종한 모돈 그룹으로부터 출생한 자돈들이 5일령이 되었을 때, 병원성 야생균주로 도전감염시킨 다음 면역 방어 여부를 확인한 결과, 대조군에서는 약 90%의 비율로 설사가 관찰되고 그 중 약 20%가 폐사된 반면, 상업용 백신이나 개발 백신을 근육접종한 자돈에서는 약 30%에서만 설사가 관찰되었다. 더욱이, 접종 균량 2×1010 cells 이상으로 경구접종한 자돈은 설사가 관찰되지 않았다.
따라서, 본 발명의 고스트 백신은 이를 근육 또는 경구로 접종할 경우, 상업용 백신과 유사한 수준으로 병원성 대장균에 대한 면역 방어 효과를 나타내며, 접종 균량 2×1010 cells 이상으로 경구접종할 경우, 병원성 대장균에 우수한 면역 방어 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
[실험예 5] 마우스에서 고스트 사균백신 근육 접종 후 살모넬라에 대한 방어 효과
1. 실험동물, 사용균주의 선정 및 백신의 예방 접종
5주령의 BALB/c 암컷 마우스 30두를 구입하여 전북대학교 실험동물사육장에서 사육하면서 약 1주일 동안 사육 적응 기간을 거친 후 실험에 사용하였으며, 약독화된 살모넬라 균주를 고스트 사균화하여 실험에 사용하였다. 이의 실험 개요를 하기 표 10에 나타내었다.
변이주/플라스미드 설명 기원
변이주
S. Tyhphmurium
JOL1376 JOL912 containing pMMP172
JOL389 돼지에서 분리한 야외 독성균주
-80℃에서 보관하고 있던 살모넬라 티피무리움 고스트 백신(Salmonella Typimurium ghost vaccine) 균주를 아라비노오스(arabinose)가 첨가된 LB agar에서 성장시켜 선택한 콜로니를 영양배지에 접종하여 28℃에서 24시간 동안 배양한 후 CFU(colony forming unit)를 확인하였다. 이후 42℃에서 48시간 동안 완전히 고스트를 유도한 다음, 오염 여부와 고스트화 여부를 확인하였으며, 이의 배양액을 원심분리하여 침전물을 분리하여 멸균 PBS로 부유시킨 뒤 12시간 이상 냉동보관시킨 후, 실험에 사용하였다.
가. 접종량
본 발명의 고스트 사균백신에 대한 살모넬라에 대한 방어 효과를 확인하기 위하여, 상기 백신을 1×109 cells/0.1 ml PBS 로 근육접종하였다.
나. 예방 접종
1차 접종은 다음과 같이 수행하였다. 실험군의 각 마우스는 각 개체당 상기 가.에 기재된 백신 접종량으로 근육 접종하였으며, 대조군의 각 마우스는 각 개체당 상기 백신 접종량과 동량으로 멸균 PBS를(0.1ml) 근육접종하였다. 2차 접종은 상기 1차 접종과 동일한 균수 및 방법으로 접종하였으며, 1차 접종 후 21일째에 한 번 더 추가 접종하였다. 상기 접종 개요를 하기 표 11에 나타내었다.
그룹 두수 접종균주 접종량 접종
경로 		도전
감염
1차 접종 2차 접종
A 10 Control PBS PBS 근육 2차 접종 3주 후
B 10 약독화 살모넬라 고스트 백신 - 살모넬라 고스트 백신 근육 2차 접종 3주 후
C 10 약독화 살모넬라 고스트 백신 살모넬라 고스트 백신 살모넬라 고스트 백신 근육 2차 접종 3주 후
2. 가검물 채취와 항체역가 측정 및 도전감염
가. 채혈
접종 전, 1차 접종 후 3주 (2차 접종 전), 6주 (도전감연 전)째에 각 그룹별로 채혈하여 혈청을 분리한 다음 -20℃에 보관하며 실험에 사용하였다.
나. 분변
상기 가.에 기재된 시기와 동일한 시기에 각 그룹별로 분변을 채취하였다. 분변의 경우 분변은 무게를 잰 후 아지드화 나트륨(sodium azide)가 0.1% 함유된 PBS로 100mg/ml가 되도록 부유시킨 후 13,200 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 분리하여 -20℃에 보관하며 실험에 사용하였다.
다. 항체 역가 측정
살모넬라 티피무리움 균주(Salmonella Typhimurium)의 LPS에 대한 특이 sIgA 항체와 IgG 항체를 측정하기 위해 ELISA를 수행하였다. 시료 웰에는 정제된 항원을 500ng/웰의 농도로, 표준 웰에는 고스트 항-마우스(goat anti-mouse) IgG 또는 고스트 항-마우스 sIgA를 각각 200ng/웰의 농도로 분주한 후 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 코팅된 플레이트는 Tween 20이 0.05% 함유된 PBS (PBST)으로 3번 세척한 후 블로킹 완충용액(3% 스킨 밀크 in PBS)으로 블로킹한 다음 혈청은 PBST로 1:100 으로 분변(Fecal)은 1:3으로 각각 희석한 다음 100씩 각 웰에 분주한 후, 37℃에서 1시간30분 동안 반응시켰다. 혈청의 경우 퍼옥시다아제-결합된(peroxidase-conjugated) 고스트 항-마우스 IgG, HRP(horseradish peroxidase) 그리고 분변 샘플의 경우에는 퍼옥시다아제-결합된 고스트 항-마우스 IgA HRP를 1:5,000의 배율로 희석하여 각 웰에 100μl씩 각각 분주한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. OPD-기질 반응액을 각 웰당 100μl씩 분주하여 발색시킨 후 3M H2SO4로 종결시킨(stop) 후 492nm에서 OD값을 측정하였다. 각 항원에 대한 특이 항체의 농도는 표준 단백질(standard protein) 농도를 기초로 하여 측정하였다.
라. 도전감염
2차 접종 후 3주째에 국내 돼지에서 분리한 야외독성 살모넬라 균주를 경구 감염시킨 후 폐사 여부를 확인하여 도전감염에 대한 방어능을 측정하였다.
3. 면역반응 및 도전감염에 대한 방어능 측정 결과
가. 혈청에서의 면역반응
살모넬라 LPS-특이 혈청 IgG 항체역가를 측정한 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 예방 백신을 1차만 접종한 그룹에서의 IgG 항체역가는 접종 3주 후부터 대조군보다 우수한 것으로 관찰되었다. 또한, 예방 백신을 1차, 2차 모두 접종한 그룹에서의 IgG 항체역가는 예방 백신을 1차만 접종한 그룹의 항체 역가보다 현저히 우수한 것으로 관찰되었다. 또한, 그룹 A와 B에서 IgA에 대한 항체역가가 대조군보다 현저히 우수한 것으로 관찰되었다. 그러나, IgG 항체역가와는 달리 IgA 항체 역가는 1차, 2차 모두 접종한 그룹이 1차만 접종한 그룹보다 낮게 관찰되었다.
나. 도전감염 후 마우스에서의 방어능 측정
상기 기재된 방법에 따라 도전감염시킨 마우스에서의 도전감염 방어능을 측정하였으며, 이의 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, 그룹 B (□) 마우스에서는 도전감염 후 11일째에 1두만이 폐사한 반면, 그룹 C (△) 마우스에서는 도전감염 후 8일째, 10일째 그리고 13일째에 각각 1두씩 폐사하였다. 또한, 대조군인 그룹 A (◇) 마우스에서는 도전감염 후 8일째부터 13일째까지 하루에 1두씩 폐사하여, 총 마우스의 40%만이 생존하였다.
4. 결론
상기 기재된 내용을 종합한 결과, 본 발명의 고스트 사균백신을 1회 접종한 그룹에서의 혈청 IgG 및 IgA에 대한 항체역가는 백신접종 3주 후, 대조군에 비해 현저히 우수한 것으로 확인되었다. 또한, 1차, 2차 모두 접종한 그룹의 항체역가도대조군에 비해 현저히 우수한 것으로 관찰되었으며, 특히 1차, 2차 모두 접종한 그룹에서의 혈청의 IgG 항체역가는 1차만 접종한 그룹보다 현저히 우수한 것으로 확인되었다. 그러나, 혈청의 IgG 항체역가와는 달리 혈청의 IgA 항체역가는 1차, 2차 모두 접종한 그룹이 1차만 접종한 그룹보다 낮은 것으로 확인되었다.
또한, 야생 병독성 살모넬라균주를 도전감염시킨 후, 이에 대한 폐사 여부를 확인한 결과, 1차만 접종한 그룹에서는 90%의 생존율이 관찰된 반면, 1차, 2차 모두 접종한 그룹에서는 70%의 생존율이 관찰되었다. 또한, 대조군에서는 40%의 생존율이 관찰되었다.
따라서, 본 발명의 고스트 백신은 1×109 cells 량을 근육 접종으로 1차 접종만 할 경우, 병원성 살모넬라 균주에 대한 가장 우수한 면역 방어 효과를 나타내는 것으로 판단되었다.
한국생명공학연구원 KCTC12377BP 20130228

Claims (18)

  1. 돼지 살모넬라균증 및 콜리바실로시스를 동시 예방하기 위하여,
    단백질을 세포외벽에 발현시키는 ompA 신호 서열 유전자, 이에 연결된 세포 부착 인자 유전자, 및 asd 유전자;
    고스트화를 유도하는 E-lysis 유전자를 포함하는 E-lysis 카세트; 및
    E-lysis 카세트를 안정적으로 통제하는 역방향 아라비노오스 프로모터;를 포함하는 재조합 벡터.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 콜리바실로시스의 부착인자인 F4ab(K88ab), F4ac(K88ac), F5(K99), F6(FasA), 및 F41로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 부착인자 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  3. 제 1항 또는 제 2항의 재조합 벡터로 형질전환된 고스트 살모넬라 변이주.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 고스트 살모넬라 변이주는 약독화된 고스트 살모넬라 변이주인 것을 특징으로 하는, 고스트 살모넬라 변이주.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 약독화된 고스트 살모넬라 변이주는 lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 것을 특징으로 하는, 고스트 살모넬라 변이주.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 고스트 살모넬라 변이주는 세포 부착 인자를 세포외벽에 발현하는 것을 특징으로 하는, 고스트 살모넬라 변이주.
  7. 제 3항에 있어서, 상기 고스트 살모넬라 변이주는 대장균의 세포 부착 인자 F4ab(K88ab)를 세포 외벽에 발현하는 고스트 살모넬라 변이주, F4ac(K88ac)를 발현하는 고스트 살모넬라 변이주, F5(K99)를 발현하는 고스트 살모넬라 변이주, F6(FasA)를 발현하는 고스트 살모넬라 변이주 및 F41를 발현하는 고스트 살모넬라 변이주의 혼합 균주인 것을 특징으로 하는, 고스트 살모넬라 변이주(기탁번호 KCTC12377BP).
  8. 제 3항에 있어서, 상기 고스트 살모넬라 변이주는 25 내지 28℃에서 세포 부착 인자를 세포 외벽에 발현하고, 42 내지 45℃에서 E-lysis 유전자를 발현하여 세포가 고스트화 되는 것을 특징으로 하는, 고스트 살모넬라 변이주.
  9. 제 3항에 있어서, 상기 고스트 살모넬라 변이주는 살모넬라 엔테리티디스, 살모넬라 티피무리움 및 살모넬라 갈리나룸으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 균주로부터 유래한 것을 특징으로 하는, 고스트 살모넬라 변이주.
  10. (1) 단백질을 세포외벽에 발현시키는 ompA 신호 서열, 이에 연결된 세포 부착 인자 유전자 및 asd 유전자;
    고스트화를 유도하는 E-lysis 유전자를 포함하는 E-lysis 카세트; 및
    E-lysis 카세트를 안정적으로 통제하는 역방향 아라비노오스 프로모터;를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
    (2) 상기 (1)단계의 재조합 벡터로 lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 약독화된 살모넬라 변이주를 형질전환시켜 고스트 유도용 살모넬라 변이주를 제조하는 단계;
    (3) 상기 고스트 유도용 살모넬라 변이주를 선별하여 영양배지에 접종하는 단계;
    (4) 상기 (3)단계의 영양배지를 25 내지 28℃의 배양온도로 조절하여 병원성 대장균의 각 부착인자를 살모넬라 변이주 세포외벽에 발현시키는 단계;
    (5) 배양온도를 42 내지 45℃로 상승시켜 E-lysis 카세트에 포함되어 있는 cI 유전자의 활성을 억제하여 E-lysis 유전자를 활성화시키는 단계; 및
    (6) 활성화된 E-lysis 유전자에 의해 세포외벽에 소공이 형성되고 세포질 내물질이 세포외부로 방출되어 고스트화가 유도되는 단계;를 포함하는 살모넬라균증 및 콜리바실로시스 동시예방용 백신개발을 위한 고스트 살모넬라 변이주의 제조방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 세포 부착 인자 유전자는 콜리바실로시스의 부착인자인 F4ab(K88ab), F4ac(K88ac), F5(K99), F6(FasA), 및 F41로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 부착인자 유전자인 것을 특징으로 하는, 고스트 살모넬라 변이주의 제조방법.
  12. 제 3항의 고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 살모넬라균증 및 콜리바실로시스 동시 예방용 고스트 백신 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 백신 조성물은 모돈에 접종하여 포유자돈의 살모넬라균증 및 콜리바실로시스에 대한 면역력을 강화시키는 것을 특징으로 하는, 살모넬라균증 및 콜리바실로시스 동시 예방용 고스트 백신 조성물.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 고스트 백신 조성물은 경구투여하는 것을 특징으로 하는, 살모넬라균증 및 콜리바실로시스 동시 예방용 백신 조성물.
  15. 제 3항의 고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 돼지의 소화기 질환 예방용 고스트 백신 조성물.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 소화기 질환은 신생자돈 설사병, 조발성 설사병, 3주령 설사병, 백리, 포유자돈 설사병 또는 이유자돈 설사병을 포함하는 것을 특징으로 하는, 돼지의 소화기 질환의 예방 및 치료용 고스트 백신 조성물.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 고스트 백신 조성물은 경구투여하는 것을 특징으로 하는, 돼지의 소화기 질환 예방용 고스트 백신 조성물.
  18. 제 3항의 고스트 살모넬라 변이주를 유효성분으로 포함하는 살모넬라균증 및 콜리바실로시스 동시 예방용 사료 첨가제.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20190033708A (ko) 2017-09-22 2019-04-01 전북대학교산학협력단 세균 고스트의 제조 방법 및 세균 고스트 제조용 벡터

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