CN116693693A - 一种融合表达gcrv vp6和ltb的重组乳酸菌及其制备方法与应用 - Google Patents

一种融合表达gcrv vp6和ltb的重组乳酸菌及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程及分子免疫学技术领域，具体涉及一种融合表达GCRV VP6和LTB的重组乳酸菌及其制备方法与应用。本发明提供了一种融合蛋白，包含GCRV VP6蛋白和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位蛋白；通过大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)蛋白可以进一步提升VP6蛋白被肠黏膜免疫组织抗原呈递细胞直接识别并呈递抗原，介导提高口服疫苗的黏膜免疫保护效果，增强鱼体抗病毒能力。

Description

一种融合表达GCRV VP6和LTB的重组乳酸菌及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于基因工程及分子免疫学技术领域，具体涉及一种融合表达GCRV VP6和LTB的重组乳酸菌及其制备方法与应用。
背景技术
草鱼出血病是由草鱼呼肠孤病毒引起的一种严重危害养殖草鱼的病毒性疾病，是我国二类动物疫病，在我国各草鱼主养地区均有发生。草鱼感染后主要症状是体内外各个器官和组织出现斑点状或块状充血。病鱼眼球突出，鳃丝苍白或充血。脑膜腔、肌肉、肠道、肠系膜、鳔壁、胆囊、肝、脾、肾等器官充血，死亡率高达90％以上。由于草鱼出血病致死率高、流行范围广，给我国草鱼养殖业带来了巨大的经济损失。流行病学调查结果表明目前基因II型草鱼呼肠孤病毒是目前引起草鱼出血病发生的主流行毒株。
草鱼呼肠孤病毒(GCRV)隶属呼肠孤病毒科，水生动物呼肠孤病毒属，无囊膜构造，具两层衣壳结构，病毒对酸和氯仿不敏感，对热(56℃)稳定。GCRV病毒基因组由11条大小不同且不连续的双链RNA节段组成，可编码12种蛋白：其中，7种为结构蛋白和5种为非结构蛋白。其中，结构蛋白VP1由GCRV S1节段编码，推测具有病毒RNA转录时的甲基转移酶活性(methylase)，参与病毒mRNA复制过程中的加帽，但免疫家兔后产生的抗体中和活性不高。VP2蛋白由GCRV S2节段编码，推测具有RNA聚合酶活性。VP3蛋白由GCRV S3节段编码，推测具有核苷水解酶活性和RNA解旋酶活性，主要参与病毒转录过程中的能量供应。通过重组杆状病毒组装的II型GCRV VP3、VP4和NS38颗粒样病毒免疫草鱼后可产生免疫保护。但是同VP2类似，VP3免疫家兔后不产生中和抗体。Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的GCRV VP4蛋白均由S6节段编码，是主要的外衣壳蛋白，参与病毒基因组转录过程，并与病毒包涵体的形成有关。有研究表明，将可以表达GCRV VP4蛋白的枯草杆菌芽孢口服疫苗和DNA疫苗免疫草鱼可产生特异性抗体并具有一定的免疫保护作用。Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的GCRV VP5蛋白由S5节段编码，结构中具有一个呼肠孤病毒M2保守结构域，与病毒粒子进入宿主细胞过程有关，具有核苷水解酶活性但抗体无中和活性。VP7蛋白与不完整的VP5蛋白可以形成异源二聚体，构成GCRV的外衣壳，具有蛋白裂解作用，使用重组VP7蛋白或者DNA疫苗免疫草鱼可以有效抵抗GCRV的感染。
目前草鱼出血病最有效的防控方法是疫苗接种。传统的草鱼出血病疫苗虽然能够很好的保护养殖草鱼免受感染，但是肌肉注射的免疫方式操作难度大，限制了草鱼出血病疫苗的推广应用。此外，随着流行毒株基因型的改变，传统疫苗的免疫屏障被不断突破，保护效力不断下降。因此开发免疫操作简便、保护效果良好的草鱼出血病疫苗是目前该疫病防控的关键。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种融合蛋白。
本发明第二方面的目的，在于提供与本发明第一方面的融合蛋白相关的生物材料。
本发明第三方面的目的，在于提供一种重组乳酸菌。
本发明第四方面的目的，在于提供本发明第三方面的重组乳酸菌的制备方法。
本发明第五方面的目的，在于提供本发明第一方面的融合蛋白、第二方面的生物材料和/或第三方面的重组乳酸菌的应用。
本发明第六方面的目的，在于提供一种产品。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种融合蛋白，包含GCRV VP6蛋白和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)蛋白。
优选地，所述GCRV VP6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
优选地，所述GCRV VP6蛋白和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)蛋白之间还包含连接肽。
优选地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第二个方面，提供与本发明第一个方面的融合蛋白相关的生物材料，所述材料包含c1)～c8)中任一种：
c1)编码本发明第一个方面的融合蛋白的核酸分子；
c2)包含c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)包含c1)所述核酸分子的载体；
c4)包含c2)所述表达盒的载体；
c5)包含c1)所述核酸分子的转基因细胞系；
c6)包含c2)所述表达盒的转基因细胞系；
c7)包含c3)所述载体的转基因细胞系；
c8)包含c4)所述载体的转基因细胞系。
优选地，所述转基因细胞系不包含繁殖材料。
优选地，所述核酸分子中GCRV VP6的序列如SEQ ID NO.4所示。
优选地，所述核酸分子中LTB的序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，所述核酸分子中连接肽的序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的第三个方面，提供一种重组乳酸菌，所述重组乳酸菌包含本发明第一个方面的融合蛋白的编码基因。
优选地，所述编码基因中GCRV VP6的序列如SEQ ID NO.4所示。
优选地，所述编码基因中LTB的序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，所述编码基因中连接肽的序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，所述乳酸菌选自乳球菌亚种、链球菌亚种、乳杆菌亚种、明串珠菌亚种、片球菌亚种、短杆菌亚种以及丙酸杆菌亚种。
优选地，所述乳酸菌包含乳酸乳球菌；进一步包含乳酸乳球菌NZ9000。
优选地，所述重组乳酸菌的名称为L.lactis pNZ8148-LTB-VP6，保藏于位于中国武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2023年2月27日；保藏编号是CCTCCNO：M2023214，分类命名为：乳酸乳球菌pNZ8148-LTB-VP6(Lactococcus lactis pNZ8148-LTB-VP6)。
本发明的第四个方面，提供本发明第三个方面的重组乳酸菌的制备方法，将本发明第一个方面的融合蛋白的编码基因导入乳酸菌中。
优选地，所述本发明第一个方面的融合蛋白的编码基因通过重组载体导入乳酸菌。
优选地，所述重组载体为将所述本发明第一个方面的融合蛋白的编码基因插入表达载体的多克隆位点后得到的载体。
优选地，所述表达载体可为现有技术中常见的表达载体，例如：pNZ8148、pNZ8048、pNZ9530、pNZ8149、pLEISS、pNZ2013、pNZ2103、pLEB590、pNZ8112、pIAβ5、pW425et、pW425t、pW425等。
优选地，所述表达载体为pNZ8148。
优选地，所述导入的方式为电转化。
本发明的第五个方面，提供本发明第一个方面的融合蛋白、本发明第二个方面的生物材料和/或本发明第三个方面的重组乳酸菌在制备产品中的应用；所述产品具有h1)～h2)中至少一种功能：
h1)预防草鱼呼肠孤病毒感染；
h2)治疗和/或预防草鱼呼肠孤病毒感染所引起的疾病。
优选地，所述草鱼呼肠孤病毒为II型草鱼呼肠孤病毒。
优选地，所述草鱼呼肠孤病毒感染所引起的疾病为草鱼出血病。
优选地，所述产品包含饲料、饲料添加剂、药物、试剂中的至少一种。
优选地，所述药物通过口服途径施用。
优选地，所述药物还包含药学上可接受的辅料。
优选地，所述药物为疫苗，进一步为口服疫苗。
优选地，所述产品的施用对象为水产动物；进一步为淡水鱼；更进一步为鲤科淡水鱼。
本发明的第六个方面，提供一种产品，包含i1)～i3)中至少一种：
i1)本发明第一个方面的融合蛋白；
i2)本发明第二个方面的生物材料；
i3)本发明第三个方面的重组乳酸菌。
优选地，所述产品具有h1)～h2)中至少一种功能：
h1)预防草鱼呼肠孤病毒感染；
h2)治疗和/或预防草鱼呼肠孤病毒感染所引起的疾病。
优选地，所述草鱼呼肠孤病毒为II型草鱼呼肠孤病毒。
优选地，所述草鱼呼肠孤病毒感染所引起的疾病为草鱼出血病。
优选地，所述产品包含饲料、饲料添加剂、药物、试剂中的至少一种。
优选地，所述药物通过口服途径施用。
优选地，所述药物还包含药学上可接受的辅料。
优选地，所述药物为疫苗，进一步为口服疫苗。
优选地，所述产品的施用对象为水产动物；进一步为淡水鱼；更进一步为鲤科淡水鱼。
优选地，一种口服疫苗，包含佐剂和本发明第三个方面的重组乳酸菌。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种融合蛋白，包含GCRV VP6蛋白和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)蛋白；通过大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)蛋白可以进一步提升VP6蛋白被肠黏膜免疫组织抗原呈递细胞直接识别并呈递抗原，介导提高口服疫苗的黏膜免疫保护效果，增强鱼体抗病毒能力。
本发明提供了一种重组乳酸菌，首先分析了GCRV VP6的功能域和结构进行分析，选取VP6的N端编码基因和大肠杆菌不耐热毒素B亚基基因，并进行密码子优化，构建重组质粒pNZ8148-LTB-VP6，通过电转化方式，转入乳酸菌L.lactis NZ9000，获得重组乳酸菌，利用Western blot和间接ELISA技术来确定重组菌中目的蛋白成功展示表达，对实验动物进行口服免疫，采集后肠组织，通过qPCR测定各组织中免疫相关基因的表达量水平，结果表明重组乳酸菌通过口服免疫能够刺激鱼体不同免疫组织产生免疫应答反应，在免疫后第42d，腹腔注射GCRV强毒，pNZ8148-VP6/L.lactis、L.lactis pNZ8148-LTB-VP6免疫组相对存活率(RPS)分别为41.84％、51.32％，口服L.lactis pNZ8148-LTB-VP6具有较好的保护效果，添加LTB黏膜佐剂可以增强保护效果；该重组乳酸菌以乳酸菌作为活载体，共表达GCRV VP6蛋白和LTB，既能发挥乳酸菌的益生功能，又能增强鱼体针对草鱼呼肠孤病毒流行毒株的抵抗力，提高乳酸菌的草鱼出血病生态防病效果。
同时，以乳酸菌作为载体制备草鱼出血病生态防控的产品，通过口服免疫，操作简便安全不易引起鱼体应激，适合大水面和小规格鱼类免疫。此外，乳酸菌还具有很好的生物安全性，乳酸菌是公认的食品安全级微生物，不需进行蛋白表达后处理，简化了生物工程生产的下游环节，大幅降低生产成本。乳酸菌是一类存在于动物黏膜系统中的共生细菌，对酸碱胆盐具有一定耐受性，能够很好的保护所携带抗原，可持续刺激鱼类黏膜免疫系统分泌黏膜抗体。同时，乳酸菌代谢产生的乳酸、细菌素等物质对水产养殖常见致病菌的具有明显抑制作用，通过占位等方式调节胃肠道菌群来维持胃肠道微生态平衡，并可以促进鱼体生长，提高鱼体免疫力。同时乳酸菌还具有多种益生功能：可以通过分泌产生的乳酸等有机酸和细菌肽等细菌素抑制致病菌生长；通过激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平增强免疫功能，提高鱼群的群体免疫力；合成蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，提高饲料利用率，并合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素；乳酸菌的稳定性好，耐受消化道的酸性环境，可以携带抗原蛋白到肠道黏膜免疫组织，使鱼体获得特异性免疫保护。
附图说明
图1是重组质粒pNZ8148-LTB-VP6的PCR鉴定和酶切鉴定结果图：其中，M：DNAmarker(DL5000)；泳道1：pNZ8148-LTB-VP6质粒；泳道2：单酶切(Nco I)；泳道3：双酶切(NcoI、HindⅢ)；泳道4：PCR鉴定。
图2是重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP6在不同浓度诱导剂乳链球菌肽Nisin诱导下的表达产物的免疫印记(Western-blot)分析结果图：其中，M：蛋白Marker；泳道1：50ng/mL Nisin；泳道2：100ng/mL Nisin；泳道3：300ng/mL Nisin；泳道4：500ng/mLNisin；泳道5：700ng/mL Nisin；泳道6：1000ng/mL Nisin；泳道7：1500ng/mL Nisin；在Nisin浓度为1000ng/mL诱导条件下，融合蛋白表达量最大。
图3是重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP6表达产物的间接ELISA分析结果图。
图4是重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP6在稀有鮈鲫肠道中的抗原驻留能力分析结果图：其中，A是第一次免疫后的第72h下稀有鮈鲫肠道中重组乳酸菌L.lactispNZ8148-LTB-VP6在含氯霉素的GM17固体平板上生长的直观图；B是第一次免疫后不同时间下稀有鮈鲫肠道中重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP6的活菌计数结果图，数据代表三尾鱼的means±SEM；C是随机挑取平板上菌(第一次免疫后的第72h下稀有鮈鲫肠道中重组乳酸菌pNZ8148-LTB-VP6/L.lactis在含氯霉素的GM17固体平板上生长的菌)进行PCR特异性扩增LTB-VP6片段的结果图，M：DNA marker(DL5000)，泳道1-16：LTB-VP6基因。
图5是稀有鮈鲫口服免疫重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP6后肠中免疫相关基因(IL-1β、IFNα、IRF7、MHCII、Mx、MyD88、NF-κB、TLR3、TLR5)的相对表达量图：其中，A是稀有鮈鲫口服免疫重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP6后肠中IRF7的相对表达量图；B是稀有鮈鲫口服免疫重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP6后肠中IL-1β的相对表达量图；C是稀有鮈鲫口服免疫重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP6后肠中IFNα的相对表达量图；D是稀有鮈鲫口服免疫重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP6后肠中MHCII的相对表达量图；E是稀有鮈鲫口服免疫重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP6后肠中Mx的相对表达量图；F是稀有鮈鲫口服免疫重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP6后肠中MyD88的相对表达量图；G是稀有鮈鲫口服免疫重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP6后肠中NF-κB的相对表达量图；H是稀有鮈鲫口服免疫重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP6后肠中TLR3的相对表达量图；I是稀有鮈鲫口服免疫重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP6后肠中TLR5的相对表达量图；采用2-ΔΔCt法计算免疫相关基因的相对mRNA表达水平，与PBS对照组有显著差异的值用星号表示(单因素方差分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
图6是稀有鮈鲫口服免疫重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP6后经GCRV-HuNan1307攻毒连续14天监测实验鱼累积死亡率曲线图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实验动物：稀有鮈鲫是由中国科学院水生生物所赠送，体长4±0.5cm。
菌、毒株：II型草鱼呼肠孤病毒由珠江水产研究所水产病害与免疫研究室分离保存，其分离方法为：实验室采用PSF细胞进行分离培养，具体方法：将病毒过滤除菌后接种在致密单层PSF细胞上，28℃吸附1小时，补加等量含有5％胎牛血清的M199培养基，28℃细胞培养箱中继续培养5～7天，通过反复冻融2次后收获病毒，具体方法可见《草鱼呼肠孤病毒分子流行病学、全基因组序列及流行株灭活疫苗研究》【D】曾伟伟，华南农业大学。
主要试剂：pNZ8148表达载体、乳酸乳球菌NZ9000购于广州勤卓生物科技有限公司、Trizol Reagent、PrimeScriptTMRT reagent Kit、Takara Nco I、HindⅢ限制性内切酶、Takara Ex基因组DNA提取试剂盒、Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)、Competent CellPreparation Kit均购买于宝日医生物技术有限公司，SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR购买于艾科瑞生物科技有限公司，LB肉汤培养基购买于广东环凯微生物科技有限公司，GM17肉汤培养基购买于北京酷来搏科技有限公司，氯霉素购买于北京索莱宝科技有限公司，乳酸链球菌素Nisin购买于上海麦克林生化科技有限公司，Goat anti-Rabbit IgG(H&L)-FITC抗体购买于安诺伦(北京)生物科技有限公司，Goat Anti-Mouse IgG,(H+L)抗体购买于赛默飞世尔科技公司，TMB显色液、反应终止液、SDS-PAGE和Western blot相关试剂均购买于苏州新赛美生物科技有限公司，Anti-6X His/>抗体购买于Abcam公司。
实施例1GCRV VP6的生物信息学分析
根据NCBI中提交的基因II型GCRV HuNan 1307株病毒VP6基因(GenBank登录号为KU254575)的核酸序列，通过Expasy在线氨基酸翻译网站获得该核酸序列的氨基酸序列(https://web.expasy.org/translate/)。
利用SMART工具网站来预测GCRVVP6蛋白的特定功能结构域。通过ExPASy网站上的SWISS-MODEL软件对GCRV VP6蛋白的三级结构进行比对折叠，模拟或构建蛋白质的空间构建图。使用TMHMM2.0在线服务器(https://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)分析VP6的跨膜区。
生物信息学结果表明，VP6蛋白包含两个功能结构域，分别位于蛋白的N端和C端，均由单独的三聚体形成。N端纤维尾巴的三聚体形成不需要ATP或伴侣蛋白的参与，直接排列成三卷螺旋状固定于病毒粒子上；C端的球状头部与蛋白受体相互作用，其翻译后的组装与Hsp90的磷酸化有关。此外，在N端尾部发现了一个小区域与靶细胞表面的唾液酸结合，推测可能与促进细胞凋亡相关。因此VP6的N端在病毒感染过程中的重要作用，可能是潜在的具有良好免疫原性的抗原蛋白。VP6的N端包含两种二级结构，分别是α-螺旋和无规卷曲；VP6的N端是通过几个长短不一的无规卷曲将5个α-螺旋连接在一起，形成一个简单的三级结构，VP6的N端没有跨膜区，也没有更高级结构或复杂的修饰加工，比较适合在原核表达系统中进行表达。
实施例2表达LTB-VP6的重组质粒的制备
重组表达载体pNZ8148-LTB-VP6的合成和鉴定
根据试剂盒说明书制备E.coli MC1061感受态细胞：
(1)试验前4℃预冷低温离心机，整个试验注意保持低温。
(2)将保存于-80℃的MC1061甘油菌株取出进行划线于LB固体平板，于37℃静置培养过夜。
(3)挑取单菌落于LB培养基，37℃，振荡培养过夜。
(4)将菌液以1:20(v/v)接种于LB培养基中，37℃，振荡培养3～5h，OD600nm约为0.35～0.5。
(5)将菌液分装，每管1mL菌液，4℃，4000r/min离心5min，弃上清。
(6)加入Solution A(冰上预冷)，每管100μL，轻柔混合均匀。
(7)4℃，4000r/min离心5min，弃上清。
(8)加入Solution B(冰上预冷)，每管100μL，轻柔混合均匀。
(9)-80℃保存。
根据表达载体pNZ8148的基因序列，选择Nco I和HindⅢ两个酶切位点将LTB基因、linker和GCRV VP6基因插入其中，在HindⅢ前加入一段His标签(由6个组氨酸残基组成)，同时根据乳酸菌表达的偏好性对插入序列进展密码子优化，优化是根据乳酸乳球菌在蛋白表达过程中对编码氨基酸密码子的偏好性，以及插入片段中整体GC含量，对部分碱基进行调整，密码子优化依据密码子的简并性原则，不改变氨基酸序列，更利于插入片段在乳酸乳球菌中表达，密码子优化采用人工合成的方式实现的。
其中，GCRV VP6的氨基酸序列为：IVSEAYQSIAMGPLTLQDGYYRALSVITLIYLASL TGRLGPDRTYYGFYVQFPKKRKFEDLGYFAYNADGRNVAVLQSINAYIYCASPDWQYSCALYYLHVLSALSLSWTDPVGMIDGFSCVNQFTDVPGWSATNRALHTHSFNWFNLLEDAIDTLVARRYWTNAEGQAIRQEWTAARDRWRVIMDATRDEDDLVVFRTPDDCRRRLKPYGDNNWTRA(SEQ ID NO.1)；
LTB的氨基酸序列为：NKVKCYVLFTALLSSLYAHGAPQTITELCSEYRNTQIYTINDKIL SYTESMAGKREMVIITFKSGETFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRITYLTETKIDKLCV WNNKTPNSIAAISMEN(SEQ ID NO.2)；
Linker的氨基酸序列为：GGGGS(SEQ ID NO.3)；
GCRV VP6的核苷酸序列为：ATTGTTTCTGAAGCATATCAATCAATTGCAATGGGACC GCTGACCTTACAAGATGGTTATTATCGGGCACTAAGTGTGATTACGCTTATCTACCTTGCCTCGCTTACCGGACGTTTGGGACCAGACCGAACATATTACGGCTTTTATGTTCAATTTCCTAAAAAACGTAAATTTGAAGATTTAGGGTATTTTGCCTACAATGCTGATGGACGAAATGTTGCTGTGCTACAGAGTATTAATGCTTATATTTATTGTGCAAGTCCTGATTGGCAATATTCTTGTGCGTTATACTACTTGCATGTCTTATCAGCCCTCTCTTTATCCTGGACTGACCCAGTTGGAATGATTGACGGTTTTTCATGCGTAAATCAGTTTACTGATGTTCCAGGTTGGTCAGCAACGAATCGTGCTTTGCATACTCACTCATTCAATTGGTTTAATCTTTTAGAGGATGCTATAGATACTTTAGTCGCTAGACGTTATTGGACAAATGCGGAAGGTCAAGCAATTCGTCAAGAATGGACGGCAGCACGAGACCGTTGGCGTGTCATTATGGATGCAACCCGTGATGAAGACGATTTGGTTGTTTTTAGAACTCCAGATGATTGTCGCAGAAGATTAAAACCTTATGGAGATAATAACTGGACGCGCGCC(SEQ ID NO.4)；
LTB的核苷酸序列为：AACAAAGTAAAATGTTATGTACTTTTCACAGCTCTTTTGAGT AGCCTTTATGCTCATGGAGCACCACAAACTATAACAGAGCTTTGTAGCGAATATCGTAATACTCAAATTTATACAATCAATGATAAAATCCTCAGTTATACTGAATCAATGGCTGGTAAAAGAGAAATGGTTATTATTACATTTAAATCTGGTGAAACTTTCCAAGTTGAAGTACCTGGGAGTCAACATATTGATTCACAAAAAAAGGCTATTGAACGTATGAAAGATACACTGAGAATCACTTATTTGACAGAAACAAAAATTGATAAGTTATGTGTTTGGAATAATAAAACACCCAACTCTATTGCTGCGATTTCTATGGAAAAT(SEQ ID NO.5)；
Linker的核苷酸序列为：GGTGGCGGTGGCTCA(SEQ ID NO.6)；
His标签的序列为：CATCATCATCATCACCAC(SEQ ID NO.7)。
重组表达载体pNZ8148-LTB-VP6由金斯瑞生物科技股份有限公司合成。根据说明书对收到的质粒冻干粉末进行稀释用于后续操作。
将合成的重组表达载体pNZ8148-LTB-VP6转化至E.coli MC1061感受态细胞中，转化步骤如下：
(1)试验前将水浴锅预热至42℃。
(2)取出保存于-80℃冰箱的感受态细胞，在冰上融化30min，超净工作台中加入1ng的pNZ8148-LTB-VP6质粒，轻柔混合，冰中静置25min。
(3)42℃水浴锅中热激45s，迅速放入冰中静置5min。
(4)试管中加入M17培养基，37℃振荡复苏1h。
(5)1000r/min离心1min，弃掉部分上清。
(6)将剩余菌液混合并均匀涂布至LB固体平板(含5μg/mL氯霉素)。
(7)37℃过夜培养。
挑取单克隆，接种到含有氯霉素抗性LB培养基中，37℃、200r/min震荡培养12h，提取质粒后进行酶切验证和PCR鉴定，并送至测序公司进行测序。PCR和酶切鉴定结果表明成功构建重组质粒pNZ8148-LTB-VP6(图1)。
实施例3表达LTB-VP6的重组乳酸菌的制备
制备L.lactis NZ9000感受态细胞，将制备好的感受态细胞保存至-80℃。提取pNZ8148-LTB-VP6质粒后将其电转化至上述感受态细胞中，转化步骤如下：
(1)试验前将电转杯、恢复培养基(含有0.5M蔗糖，0.02M的MgCL2，0.002M的CaCL2的M17液体培养基)预冷。
(2)将L.lactis NZ9000感受态细胞在冰中融化10min，超净工作台中加入1μg质粒，轻柔混合，冰中静置10min。
(3)将混合物转入2mm预冷电转杯中，擦干电转杯外水珠，避免爆杯。
(4)迅速点击，电击条件为：25000V，5ms。
(5)迅速加入900μL预冷恢复培养基，均匀混合后置于冰上10min，30℃厌氧培养4h，3500r/min离心1min，弃掉800μL上清。
(6)将剩余菌液吹悬后均匀涂布至含有5μg/mL氯霉素的GM17固体平板，30℃厌氧静置过夜培养。提取单菌落于含有10μg/mL氯霉素的GM17肉汤培养基中，30℃静置培养。将鉴定正确的表达LTB-VP6的重组乳酸菌命名为L.lactis pNZ8148-LTB-VP6，保藏于位于中国武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2023年2月27日；保藏编号是CCTCC M 2023214，分类命名为：乳酸乳球菌pNZ8148-LTB-VP6(Lactococcus lactispNZ8148-LTB-VP6)。
重组乳酸菌的表达。将挑取L.lactis pNZ8148-LTB-VP6菌落接种于10mL GM17肉汤培养基(含10μg/mL氯霉素Cm)，30℃厌氧静置培养过夜。取培养菌液按1：50比例接种于300mL含有10μg/mL氯霉素的GM17肉汤培养基中，30℃厌氧静置培养4h使其处于对数生长期，分别加入50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、700ng/mL、1000ng/mL和1500ng/mL诱导剂乳链球菌肽Nisin，30℃诱导4h。
表达产物的免疫印记(Western-blot)分析。将诱导后样品以4℃，12000r/min离心15min，弃上清，用6mL1×PBS溶液悬浮，进行超声破碎，破碎功率为200w，工作2s，休息5s，共30min。按比例加入SDS凝胶上样缓冲液，混匀后煮沸10min，在12％ SDS-PAGE上进行蛋白电泳分析。经SDS-PAGE电泳后将凝胶上的蛋白转移至NC膜，于5％脱脂奶粉中封闭，4℃过夜或37℃2h。加入PBST(PBS+0.05％Tween-20)清洗3次，每次5min。以鼠抗His单克隆抗体作为一抗，4℃孵育过夜(≥15h)。加入PBST清洗3次，每次5min。加入HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，室温孵育1h。加入PBST清洗3次，每次5min。按照DAB显色试剂盒说明书进行显色并观察结果。重组乳酸菌经诱导后，在1000ng/mL诱导剂乳链球菌肽表达量最大(图2)。
表达产物的间接ELISA分析。将诱导后超声破壁的L.lactis pNZ8148-LTB-VP6(L.lactis pNZ8148-LTB-VP6(破碎))、pNZ8148-VP6/L.lactis(pNZ8148-VP6/L.lactis(破碎)，其中，pNZ8148-VP6/L.lactis为专利文献CN114908029A中保藏编号为CCTCC NO：M2022323的重组乳酸菌)以及完整菌体(L.lactis pNZ8148-LTB-VP6(全菌)、pNZ8148-VP6/L.lactis(全菌))分别作为抗原包被96孔ELISA反应板(酶标板)，以pNZ8148/L.lactis为阴性对照，每孔100μL，4℃包被过夜。PBST清洗3次，每次5min。每孔加入300μL含有5％脱脂奶粉封闭。清洗，同步骤2。每孔100μL加入稀释的VP6蛋白的单克隆抗体，4℃孵育过夜。PBST清洗3次，每次5min。每孔100μL加入稀释的HRP标记羊抗鼠IgG，室温孵育1h。PBST清洗3次，每次5min。按照说明书加入150μL NcmTMB One显色液，37℃避光显色20min，加50μL反应终止液(2M H2SO4)终止反应，酶标测定仪测定OD450nm值。所有数据表示为平均值±标准误差。数据经过Student's T检验分析，P<0.05被认为具有统计学意义。L.lactis pNZ8148-LTB-VP6组的OD450nm值与对照组相比均具有显著性差异(p＜0.05)。同时，经破碎的菌体包被与菌体直接包被结果没有显著性差异(p≥0.05)。表明菌体表面携带LTB-VP6融合蛋白(图3)。
实施例4稀有鮈鲫口服重组乳酸菌后免疫调节作用评价
将健康稀有鮈鲫随机分为4组，每组100尾，分别为PBS空白对照组，pNZ8148/L.lactis空载对照组(L.lactis NZ9000空菌对照组)，L.lactis pNZ8148-LTB-VP6免疫组，pNZ8148-VP6/L.lactis免疫组(pNZ8148-VP6/L.lactis为专利文献CN114908029A中保藏编号为CCTCCNO：M2022323的重组乳酸菌)。免疫方式为灌胃口服免疫，隔2周免疫一次，共免疫2次，每次连续灌胃3d，免疫剂量为10μL 2×109CFU/mL/鱼/d。
重组乳酸菌鱼类肠道驻留能力评价。在第一次免疫后的第3h、6h、12h、24h、48h和72h收集后肠组织进行活菌计数以确定重组乳酸菌是否可以长时间驻留在后肠部位进行抗原呈递。每个样品中加入500μL 1×PBS溶液，组织匀浆后进行1、101、102、103、104、105倍比稀释，每个样品吸取200μL涂布至含有5μg/mL氯霉素的GM17固体平板，28℃静置厌氧过夜培养，进行菌落计数。结果表明重组乳酸菌口服面以后在鱼肠道内可以驻留72小时以上(图4)。
重组乳酸菌口服免疫后对鱼类免疫增强作用检测。分别在免疫后第7d、14d、21d和28d从各组中随机取5尾稀有鮈鲫收集后肠组织，提取各组织的总RNA后进行反转录，以β-actin作为内参基因，以获得的cDNA作为模板通过qRT-PCR测定各组织中TLR3、TLR5、MyD88、NF-κB、IFNα、Mx、IRF7、MHCII和IL-1β的相对表达量。各基因引物序列信息如表1所示，引物序列由上述测序公司合成。实验进行三次生物学重复。qRT-PCR反应体系如下：10μL2×SYBRGreen Taq HS Premix，引物各0.4μL，0.4μL ROX，2μL cDNA模板以及加ddH2O补齐至20μL，95℃预变性5min后进入循环：95℃，15s变性；60℃，45s退火；共循环35次。测定结果使用2-ΔΔCt算法进行分析。所有数据为平均值±标准误差。数据经过Student's t检验分析，P<0.05被认为具有统计学意义。结果表明重组乳酸菌L.lactis pNZ8148-LTB-VP6口服免疫后可以在鱼类肠黏膜免疫组织中被抗原呈递细胞直接识别呈递抗原并引起免疫应答反应(图5)。
表1荧光定量PCR中的引物序列
实施例5重组乳酸菌口服免疫保护评价
在实施例3的稀有鮈鲫免疫后第42天，每尾鱼腹腔注射20μL GCRV HuNan1307强毒株病毒液(LD50为10-4.35LD50/20μL)(每组大约重复70尾)，保持攻毒鱼在28℃～30℃水温环境中饲养。攻毒后连续14d内对所有实验鱼进行监测，记录发病率与死亡率，计算相对保护率(RPS，RPS＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％)。结果表明，与PBS空白对照相比，pNZ8148-VP6/L.lactis、L.lactis pNZ8148-LTB-VP6的相对保护率分别为42.9％、51.32％；口服免疫重组乳酸菌可提高实验鱼在GCRV感染中的存活率：口服免疫pNZ8148-VP6/L.lactis可以获得一定免疫保护，LTB可以介导提高口服疫苗的黏膜免疫保护效果(图6)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种融合蛋白，包含GCRV VP6蛋白和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位蛋白。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：
所述GCRV VP6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，所述大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；优选地，所述GCRV VP6蛋白和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位蛋白之间还包含连接肽。
3.与权利要求1或2所述的融合蛋白相关的生物材料，所述材料包含c1)～c8)中任一种：
c1)编码权利要求1或2所述的融合蛋白的核酸分子；
c2)包含c1)所述核酸分子的表达盒；
c3)包含c1)所述核酸分子的载体；
c4)包含c2)所述表达盒的载体；
c5)包含c1)所述核酸分子的转基因细胞系；
c6)包含c2)所述表达盒的转基因细胞系；
c7)包含c3)所述载体的转基因细胞系；
c8)包含c4)所述载体的转基因细胞系。
4.一种重组乳酸菌，所述重组乳酸菌包含权利要求1或2所述的融合蛋白的编码基因。
5.根据权利要求4所述的重组乳酸菌，其特征在于：
所述乳酸菌选自乳球菌亚种、链球菌亚种、乳杆菌亚种、明串珠菌亚种、片球菌亚种、短杆菌亚种以及丙酸杆菌亚种；
优选地，所述乳酸菌包含乳酸乳球菌；
优选地，所述重组乳酸菌的名称为L.lactis pNZ8148-LTB-VP6，保藏于位于中国武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2023年2月27日；保藏编号是CCTCCNO：M2023214，分类命名为：乳酸乳球菌pNZ8148-LTB-VP6(Lactococcus lactispNZ8148-LTB-VP6)。
6.权利要求4或5所述的重组乳酸菌的制备方法，将权利要求1～2任一项所述的融合蛋白的编码基因导入乳酸菌中。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：
所述权利要求1～2任一项所述的融合蛋白的编码基因通过重组载体导入乳酸菌；
优选地，所述重组载体为将权利要求1～2任一项所述的融合蛋白的编码基因插入表达载体的多克隆位点后得到的载体。
8.权利要求1～2任一项所述的融合蛋白、权利要求3所述的生物材料和/或权利要求4～5任一项所述的重组乳酸菌在制备产品中的应用；所述产品具有h1)～h2)中至少一种功能：h1)预防草鱼呼肠孤病毒感染；
h2)治疗和/或预防草鱼呼肠孤病毒感染所引起的疾病；
优选地，所述产品包含饲料、饲料添加剂、药物、试剂中的至少一种；
优选地，所述药物还包含药学上可接受的辅料；
优选地，所述药物为疫苗。
9.一种产品，包含i1)～i3)中至少一种：
i1)权利要求1～2任一项所述的融合蛋白；
i2)权利要求3所述的生物材料；
i3)权利要求4～5任一项所述的重组乳酸菌。
10.一种口服疫苗，包含佐剂和权利要求4～5任一项所述的重组乳酸菌。
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