JP2024513263A - サルモネラワクチン - Google Patents
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Abstract
改変細菌、及び、細菌感染の予防又は治療のために改変細菌を使用する方法を提供する。改変細菌は、ホリンタンパク質をコードし産生するように、及びリゾチームをコードし産生するように、細菌のゲノムが変更されるような1以上のゲノム改変を含む。改変細菌は、自己分解性SE血清型ティフィムリウム(S.ティフィムリウム)の形態のサルモネラ・エンテリカ(SE)の一種を用いて説明される。【選択図】図1A
Description
本願は、2021年4月5日に出願された米国仮特許出願第63/171,067号の優先権を主張するものであり、その開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
[連邦政府後援研究に関する声明]
本発明は、米国農務省(USDA)より授与された20196703029564の下、政府の支援を受けて発明されたものである。政府は本発明について一定の権利を有する。
本発明は、米国農務省(USDA)より授与された20196703029564の下、政府の支援を受けて発明されたものである。政府は本発明について一定の権利を有する。
[配列表]
本願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。2022年4月5日に作成された当該ASCIIファイルは、UMD_Salmonella_Vaccine_ST25.txtと命名され、サイズは11,819バイトである。
本願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。2022年4月5日に作成された当該ASCIIファイルは、UMD_Salmonella_Vaccine_ST25.txtと命名され、サイズは11,819バイトである。
本開示は一般に、改変細菌及び細菌感染に対するワクチンとしてのその使用に関する。
食物由来の病原性微生物はヒト腸管疾患を誘発し、これは食品安全における世界的な主要懸念事項として認識されている(Goodwin & Shiptsova, 2002)。サルモネラ・エンテリカ(SE:Salmonella enterica)は、食物に由来する主要な病原体であり、米国を含む先進国において、多くの集団発生、入院、死亡、そして多大な経済的負担を引き起こしている(Basler, Nguyen, Anderson, Hancock, & Behravesh, 2016)。サルモネラは汚染された食品、特に鶏肉や卵を介してヒトに感染する。SEの様々な血清型の中でも、ティフィムリウム(Typhimurium)とエンテリティディス(Enteritidis)がヒトへの感染を引き起こす上位2つの血清型であり、腸内常在菌叢として鶏の腸内でコロニー形成している(Ricke, Dunkley, & Durant, 2013)。したがって、鶏のS.ティフィムリウムとS.エンテリティディスのコロニー形成を抑制することは、鶏肉と鶏卵の生産工程におけるプレハーベストとポストハーベストの両レベルで交差汚染のリスクを低減し、SEによる食品媒介性感染を減少させる見込みのある方法である。
現在、AviPro(登録商標)MEGAN(登録商標)VAC 1を含む弱毒サルモネラワクチンが利用可能であり、これは、SE血清型のコロニー形成をわずかに減少させることができるが、インビトロ条件下では、抗原特異的抗体の発現数が限られているため、その有効性は満足できるものではない(Michel, Clermont, Denamur, & Tenaillon, 2010)。そのため、宿主免疫系では多数の標的抗原が利用されている。従って、SEから保護するための改良された組成物及び方法に対する継続的かつ満たされていない需要が存在する。本開示は、この需要に関連するものである。
本開示は、改変細菌、及び、細菌感染の予防又は治療のために当該改変細菌を使用する方法を提供する。改変細菌は、ホリン(holin)タンパク質をコードし産生するように、及びリゾチームをコードし産生するように細菌のゲノムを変更する、1つ以上のゲノム改変を含む。本組成物及び方法は、ヒト及びヒト以外の動物への使用に適している。
特定の例では、改変細菌は、改変細菌が投与される個体に対して非病原性である。改変細菌は、改変によって非病原性となってもよく、あるいは改変細菌は、改変される前に非病原性であってもよい。複数の実施形態において、改変細菌はサルモネラである。複数の実施形態において、改変細菌は非病原性サルモネラである。いくつかの実施形態において、非病原性細菌は、サルモネラ・エンテリカ(SE)である。いくつかの実施形態において、SEは、SE細胞内自己分解(自己溶菌)SE血清型(serovar)ティフィムリウム(S. Typhimurium)である。
ホリンタンパク質及びリゾチームタンパク質は特に限定されず、例えば、任意のファージゲノムによってコードされ得る。ある実施例では、ホリンタンパク質はサルモネラ・ティフィムリウム特異的バクテリオファージP22の遺伝子13によってコードされ、及び/又は、リゾチームはS.ティフィムリウム特異的バクテリオファージP22の遺伝子19によってコードされる。一例では、ホリンタンパク質は、サルモネラ・ティフィムリウム特異的バクテリオファージP22の遺伝子13によってコードされ、及び、リゾチームはS.ティフィムリウム特異的バクテリオファージP22の遺伝子19によってコードされる。
ホリンタンパク質及びリゾチームをコードする遺伝子の挿入は、任意の適切な技術を用いて達成することができ、これには、記載されたタンパク質をコードする1つ以上のオープンリーディングフレームを含む1つ以上のDNAポリヌクレオチドの相同組換えが含まれるが、必ずしもこれに限定されない。相同組換えは、任意の適切な技術を用いて達成することができ、その非限定的な例は、本明細書の実施例に提供される。代替的な実施形態では、1つ以上のガイドRNA指向性ヌクレアーゼを使用して、ホリンタンパク質及びリゾチームをコードする遺伝子を含む1つ以上のDNAテンプレートを挿入することができる。
ホリンタンパク質及びリゾチームの発現は、任意の適切なプロモーター(これは、細菌中で機能的であり、ホリンタンパク質及びリゾチームをコードする遺伝子に作動可能に連結している)を用いて駆動することができる。複数の実施形態において、異種プロモーターが使用され得る。複数の実施形態において、内因性プロモーターが使用され得る。複数の実施形態において、ホリンタンパク質及びリゾチームをコードする遺伝子の挿入は、両方の遺伝子の発現が、内因性sseAプロモーターによって駆動されるように構成される。従って、複数の実施形態において、ホリンタンパク質及びリゾチームをコードする遺伝子は、内因性sseAプロモーターの下流で細菌の染色体に導入される。
本開示の実施例でより詳細に説明する特定の例では、ホリンタンパク質とリゾチームの発現により細胞内自己分解が生じる。
本開示はまた、細菌感染に対する予防的又は治療的効果を個体にもたらすために、記載された改変細菌の有効量を、それを必要とする動物に導入することを提供する。改変細菌は、任意の適切な経路を用いて動物に導入され得る。複数の実施形態において、改変細菌は個体に経口的に導入される。非限定的な例では、改変細菌は、飲料水に改変細菌を含有させることにより動物に導入される。特定の実施例において、改変細菌を動物に導入すると、個体において炎症性サイトカインの産生が刺激される。特定の実施形態において、改変細菌を導入することにより、個体中のサルモネラ菌が減少する。特定の実施形態において、サルモネラ菌を減少させることには、サルモネラ菌の腸内定着(コロニー形成)を減少させること、サルモネラ菌の糞便排出を減少させること、又はそれらの組み合わせが含まれる。
改変細菌が導入される動物は特に限定されない。複数の実施形態において、動物はヒト又はヒト以外の動物である。いくつかの例では、動物は鳥類動物である。
本開示はまた、記載された改変細菌を含むワクチン製剤を提供する。複数の実施形態において、本開示は、ワクチン株とみなされる改変細菌を提供する。
本開示はまた、記載された改変細菌を含む製品も提供する。このような製品は、改変細菌が保持される密封可能な容器を含み得る。製品は、それを必要とする個体に改変細菌を投与するための指示を提示する印刷物をさらに含み得る。本開示はまた、再構成に使用するための及び記載された方法に使用するための、凍結保存又は凍結乾燥された改変細菌を提供する。
以下にさらに記載するように、本開示の非限定的な実施形態は、サルモネラの溶解に必須であるS.ティフィムリウム特異的バクテリオファージP22の溶菌遺伝子13及び19を用いて説明される。遺伝子13は、ホリンタンパク質をコードし、ホリンタンパク質は、孔を形成することによって細胞膜を破壊し、遺伝子19によってコードされるリゾチームの細菌細胞壁へのアクセスを提供する(サルモネラ菌種を溶解するために)。この生きたサルモネラワクチン株、すなわち、細胞内自己溶解性SE血清型ティフィムリウムLT2を、本明細書ではSTLT2+P13+19と呼ぶ。このワクチン株を試験し、ニワトリのマクロファージ細胞を用いて、細菌の増殖、付着活性、細胞内生存率、炎症性サイトカイン及びエンドソームtoll様レセプター(TLR:toll-like receptor)のmRNA発現を特性評価するとともに、免疫の刺激、腸内サルモネラ菌コロニー形成の予防、腸内微生物の組成を評価することにより、ニワトリ腸内でのサルモネラ菌コロニー形成に対するそのin vivo有効性を調べた。
[図1A]
pDS132-down-13/19-sseA構築の模式図。pET-16b-13/19からXbaI/BamHI二重消化で溶出した遺伝子13及び19には、リボソーム結合部位(rbs:ribosomal binding site)が含まれていた。
pDS132-down-13/19-sseA構築の模式図。pET-16b-13/19からXbaI/BamHI二重消化で溶出した遺伝子13及び19には、リボソーム結合部位(rbs:ribosomal binding site)が含まれていた。
[図1B]
sseAオープンリーディングフレーム(orf:open reading frame)が、rbs-遺伝子13と19の上流に挿入され、sseA orfの下流がrbs-遺伝子13と19の下流に挿入される様子を示す模式図。
sseAオープンリーディングフレーム(orf:open reading frame)が、rbs-遺伝子13と19の上流に挿入され、sseA orfの下流がrbs-遺伝子13と19の下流に挿入される様子を示す模式図。
[図1C]
完成したプラスミドpDS132-down-13/19-sseA(LT2への接合DNA導入のために接合ドナー株である大腸菌B2155に形質転換された)を示す模式図。
完成したプラスミドpDS132-down-13/19-sseA(LT2への接合DNA導入のために接合ドナー株である大腸菌B2155に形質転換された)を示す模式図。
[図2]
STLT2+P13+19(sse-13/19)とLT2(WT)間での細菌増殖と生存率の比較。STLT2+P13+19及びLT2の増殖曲線(A)、開始期(0時間)及び定常期(8時間)における生存率(B)。データは平均値±SDで表される。**は、WTと比較してp<0.01。
STLT2+P13+19(sse-13/19)とLT2(WT)間での細菌増殖と生存率の比較。STLT2+P13+19及びLT2の増殖曲線(A)、開始期(0時間)及び定常期(8時間)における生存率(B)。データは平均値±SDで表される。**は、WTと比較してp<0.01。
[図3]
HD11細胞におけるSTLT2+P13+19(INC-ATLY)とLT2(WT)の接着能力(A)と細胞内生存率(B)。データは平均値±SDで表される。***は, WTと比較してp<0.001。
HD11細胞におけるSTLT2+P13+19(INC-ATLY)とLT2(WT)の接着能力(A)と細胞内生存率(B)。データは平均値±SDで表される。***は, WTと比較してp<0.001。
[図4]
P22遺伝子(13と19)の相対的mRNA発現量をパネル(A)に示し、HD11細胞における感染24時間後のSTLT2+P13+19(INC-ATLY)とLT2(WT)におけるSPI-1遺伝子(invA, invE, invF)とSPI-2遺伝子(pipB, sifA, sseA, sseJ, sspH2)の相対的mRNA発現をパネル(B)に示す。データは平均値±SDで表される。***は, WTと比較してp<0.001。
P22遺伝子(13と19)の相対的mRNA発現量をパネル(A)に示し、HD11細胞における感染24時間後のSTLT2+P13+19(INC-ATLY)とLT2(WT)におけるSPI-1遺伝子(invA, invE, invF)とSPI-2遺伝子(pipB, sifA, sseA, sseJ, sspH2)の相対的mRNA発現をパネル(B)に示す。データは平均値±SDで表される。***は, WTと比較してp<0.001。
[図5]
STLT2+P13+19(INC-ATLY)又はLT2(WT)-感染HD11細胞における、IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-18, LITAF, iNOS, TLR3, TLR7遺伝子の相対的mRNA発現。データは平均値±SDで表される。WT-感染HD11細胞と比較して、**はp<0.01、***はp<0.001。
STLT2+P13+19(INC-ATLY)又はLT2(WT)-感染HD11細胞における、IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-18, LITAF, iNOS, TLR3, TLR7遺伝子の相対的mRNA発現。データは平均値±SDで表される。WT-感染HD11細胞と比較して、**はp<0.01、***はp<0.001。
[図6]
STLT2+P13+19ワクチン接種が有る場合又は無い場合の、ニワトリにおけるサルモネラ菌コロニー形成と排出の比較。STLT2+P13+19を、1日目と7日目にニワトリに経口投与した。ニワトリは14日目にS.ティフィムリウム又はS.エンテリティディスをチャレンジされた。サルモネラの糞便排出(A)、及び、回腸(B)、空腸(C)、盲腸(D)を含む腸管のコロニー形成を調べた。データは平均値±SDで表される。サルモネラと比較して、*はp<0.05、**はp<0.01;S.ティフィムリウムと比較して、#はp<0.05、###はp<0.001。
STLT2+P13+19ワクチン接種が有る場合又は無い場合の、ニワトリにおけるサルモネラ菌コロニー形成と排出の比較。STLT2+P13+19を、1日目と7日目にニワトリに経口投与した。ニワトリは14日目にS.ティフィムリウム又はS.エンテリティディスをチャレンジされた。サルモネラの糞便排出(A)、及び、回腸(B)、空腸(C)、盲腸(D)を含む腸管のコロニー形成を調べた。データは平均値±SDで表される。サルモネラと比較して、*はp<0.05、**はp<0.01;S.ティフィムリウムと比較して、#はp<0.05、###はp<0.001。
[図7]
STLT2+P13+19をワクチン接種したニワトリにおける免疫刺激。STLT2+P13+19ワクチン接種(V)が有る場合又は無い場合において、S.ティフィムリウム(ST)又はS.エンテリティディス(SE)をチャレンジしたニワトリにおける、相対的mRNA発現量(A)、及び、血清サイトカインレベル[iNOS(B), IL-6(C), IL-8(D), IL-12(E), TNF-α(F)]を測定し、比較した。データは平均値±SDで表される。異なる文字(a、b、c)は、群間の有意差(p<0.05)を示す。
STLT2+P13+19をワクチン接種したニワトリにおける免疫刺激。STLT2+P13+19ワクチン接種(V)が有る場合又は無い場合において、S.ティフィムリウム(ST)又はS.エンテリティディス(SE)をチャレンジしたニワトリにおける、相対的mRNA発現量(A)、及び、血清サイトカインレベル[iNOS(B), IL-6(C), IL-8(D), IL-12(E), TNF-α(F)]を測定し、比較した。データは平均値±SDで表される。異なる文字(a、b、c)は、群間の有意差(p<0.05)を示す。
[図8]
STLT2+P13+19ワクチン接種によるニワトリ腸内細菌叢の調節。STLT2+P13+19経口ワクチン接種がニワトリ腸内微生物組成に及ぼす影響を、門(A)及び属(B)レベルで評価した。STは、S.ティフィムリウムでチャレンジしたニワトリ;ST+Vは、S.ティフィムリウムでチャレンジし、且つSTLT2+P13+19ワクチン接種を行ったニワトリ;SEは、S.エンテリティディスでチャレンジしたニワトリ;SE+Vは、S.エンテリティディスでチャレンジし、且つSTLT2+P13+19ワクチン接種を行ったニワトリ。
STLT2+P13+19ワクチン接種によるニワトリ腸内細菌叢の調節。STLT2+P13+19経口ワクチン接種がニワトリ腸内微生物組成に及ぼす影響を、門(A)及び属(B)レベルで評価した。STは、S.ティフィムリウムでチャレンジしたニワトリ;ST+Vは、S.ティフィムリウムでチャレンジし、且つSTLT2+P13+19ワクチン接種を行ったニワトリ;SEは、S.エンテリティディスでチャレンジしたニワトリ;SE+Vは、S.エンテリティディスでチャレンジし、且つSTLT2+P13+19ワクチン接種を行ったニワトリ。
[図9]
クロラムフェニコール耐性遺伝子(cat)を含まない相同組換えの図。相同組換えが起こると、R6Kori, mobRP4, cat, sacBが欠失した。
クロラムフェニコール耐性遺伝子(cat)を含まない相同組換えの図。相同組換えが起こると、R6Kori, mobRP4, cat, sacBが欠失した。
[図10]
PCR増幅によるSTLT2+P13+19の確認。増幅されたPCR産物サイズは、LT2(STLT2 WT)では0.9kb、STLT2+P13+19(STLT2 INC-ATLY)では1.8kbであった。
PCR増幅によるSTLT2+P13+19の確認。増幅されたPCR産物サイズは、LT2(STLT2 WT)では0.9kb、STLT2+P13+19(STLT2 INC-ATLY)では1.8kbであった。
反対の指定がない限り、本明細書全体を通じて与えられるすべての最大の数値限定は、あたかもそのようなより低い数値限定が本明細書に明示的に書かれているかのように、あらゆるより低い数値限定を含むことが意図されている。本明細書を通じて与えられるすべての最小の数値限定は、あたかもそのようなより高い数値限定が本明細書に明示的に書かれているかのように、あらゆるより高い数値限定を含む。本明細書を通じて与えられるすべての数値範囲は、あたかもそのようなより狭い数値範囲がすべて本明細書に明示的に書かれているかのように、そのような広い数値範囲内に入るあらゆるより狭い数値範囲を含む。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形、「及び」「前記」は、文脈上明らかにそうでないことが指示されない限り、複数形の参照を含む。
本開示は、本明細書に記載されるすべてのポリヌクレオチド配列、そのようなすべてのポリヌクレオチドのDNA及びRNA等価物(cDNA構築物を含むがこれらに限定されない)、ならびに本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるすべてのポリペプチドを含む。本開示は、本明細書に記載されるすべてのアミノ酸配列、及びそのすべての機能的フラグメントを含む。機能的フラグメントは、細菌の殺傷に関与する能力を保持する、記載されたタンパク質の連続セグメントである。
複数の実施形態において、本開示は改変細菌を提供する。改変細菌は、1つ以上のゲノム改変を含む。ゲノム改変は、1つ以上のDNAポリヌクレオチドを細菌のゲノムに導入して、ホリンタンパク質をコードし産生するように、及びリゾチームをコードし産生するように細菌のゲノムを変更することを含む。ホリンタンパク質及びリゾチームタンパク質は任意の供給源に由来し得る。複数の実施形態において、ホリンタンパク質及びリゾチームタンパク質は、ファージによりコードされたタンパク質から適応される。複数の実施形態において、ホリンタンパク質は、サルモネラ・ティフィムリウム-特異的バクテリオファージP22の遺伝子13によってコードされ、及び/又はリゾチームは、S.ティフィムリウム-特異的バクテリオファージP22の遺伝子19によってコードされる。一例では、ホリンタンパク質は、サルモネラ・ティフィムリウム-特異的バクテリオファージP22の遺伝子13によってコードされ、及び、リゾチームはS.ティフィムリウム-特異的バクテリオファージP22の遺伝子19によってコードされる。
特定の例では、改変細菌は、改変細菌が投与される個体に対して非病原性である。改変細菌は、改変によって非病原性となってもよいし、あるいは改変細菌は、改変される前に非病原性であってもよい。複数の実施形態において、改変細菌はサルモネラである。複数の実施形態において、改変細菌は非病原性サルモネラである。いくつかの実施形態において、非病原性細菌は、サルモネラ・エンテリカ(SE)である。複数の実施形態において、改変細菌は、非病原性サルモネラである。いくつかの実施形態において、非病原性細菌は、サルモネラ・エンテリカ(SE)である。いくつかの実施形態において、SEは、SE細胞内自己分解性SE血清型ティフィムリウム(S.ティフィムリウム)である。一実施形態において、本開示は、ワクチン株とみなされ得る改変細菌を提供する。SE血清型ティフィムリウムLT2を用いて実証されたワクチン株の非限定的な実施形態を、本明細書ではSTLT2+P13+19と呼ぶ。野生型SE血清型ティフィムリウムLT2は、アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC:American Type Culture Collection)番号19585で入手可能である。
ホリンタンパク質及びリゾチームタンパク質は特に限定されず、例えば、任意のファージゲノムによってコードされ得る。ある実施例では、ホリンタンパク質はサルモネラ・ティフィムリウム-特異的バクテリオファージP22の遺伝子13によってコードされ、及び/又は、リゾチームはサルモネラ・ティフィムリウム-特異的バクテリオファージP22の遺伝子19によってコードされる。一例では、ホリンタンパク質はサルモネラ・ティフィムリウム-特異的バクテリオファージP22の遺伝子13によってコードされ、及び、リゾチームはサルモネラ・ティフィムリウム-特異的バクテリオファージP22の遺伝子19によってコードされる。実施例に記載の改変型細菌を産生するために使用したアミノ酸配列の代表的かつ非限定的な例を以下に示す:P22遺伝子13によってコードされるサルモネラバクテリオファージホリンのアミノ酸配列は以下の通りである:
MKKMPEKHDLLTAMMAAKEQGIGAILAFAMAYLRGRYNGGAFKKTLIDATMCAIIAWFIRDLLVFAGLSSNLAYIASVFIGYIGTDSIGSLIKRFAAKKAGVDDANQQ (配列番号1)
MKKMPEKHDLLTAMMAAKEQGIGAILAFAMAYLRGRYNGGAFKKTLIDATMCAIIAWFIRDLLVFAGLSSNLAYIASVFIGYIGTDSIGSLIKRFAAKKAGVDDANQQ (配列番号1)
P22遺伝子19によってコードされるエンドリシン(本明細書ではリゾチームとも呼ばれる)のアミノ酸配列。リゾチームのアミノ酸配列は、以下の通りである:
MMQISSNGITRLKREEGERLKAYSDSRGIPTIGVGHTGKVDGNSVASGMTITAEKSSELLKEDLQWVEDAISSLVRVPLNQNQYDALCSLIFNIGKSAFAGSTVLRQLNLKNYQAAADAFLLWKKAGKDPDILLPRRRRERALFLS (配列番号2)
MMQISSNGITRLKREEGERLKAYSDSRGIPTIGVGHTGKVDGNSVASGMTITAEKSSELLKEDLQWVEDAISSLVRVPLNQNQYDALCSLIFNIGKSAFAGSTVLRQLNLKNYQAAADAFLLWKKAGKDPDILLPRRRRERALFLS (配列番号2)
本開示は、記載されたタンパク質の変異体にも関する。そのような変異体は、様々な方法で機能し得る変化したアミノ酸配列を有し得る。変異体は、変異誘発、すなわち、不連続点変異又はトランケーションによって、又は任意の他の適切なアプローチによって生成され得る。記載されたタンパク質のタンパク質フラグメント又はペプチドフラグメントの生物学的に活性な部分は、本開示のタンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であるアミノ酸配列、又は本開示のタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、対応する全長タンパク質の少なくとも1つの活性を示す。典型的には、生物学的に活性な部分は、対応するタンパク質の少なくとも1つの活性を有するドメイン又はモチーフを含む。特定の実施形態において、本開示は、相同タンパク質を含む。特定の実施形態における相同性は、少なくとも50%、65%、75%、80%、85%である。特定の実施形態において、相同性は、記載されたホリン及びリゾチームタンパク質のアミノ酸配列と比較して、少なくとも90%、95%、97%、98%、又は少なくとも99%である。改変細菌の産生に使用するためのベクター及びポリヌクレオチドが、本開示により提供される。ポリヌクレオチドは、記載されたタンパク質の一方又は両方をコードするポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする任意の配列を含んでいてもよい。ベクターを含む細胞も本開示に含まれる。本開示はまた、改変細菌を作製する記載された方法も含む。
ホリン及びリゾチームをコードする遺伝子は、任意の適切なアプローチを用いて細菌の染色体に導入することができる。改変細菌を生産するために使用される組成物及び方法の1つの非限定的な図解が、相同組換えアプローチの略図を含む図9に示されている。この図は、sseA遺伝子への相同組込みを示す。プラスミドpSD132は、プラスミドが提供する構築物がsseA配列に隣接する13及び19遺伝子を有するセグメントを含むように、十分な長さのsseA遺伝子のセグメントを有する左右の相同性アームを含む。このように、記載されたプラスミドのセグメントは、13及び19遺伝子の発現が、上流の内因性sseA遺伝子プロモーターからの発現によって駆動されるような様式で組み換えられた、記載されたタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。
図9に示す例では、13遺伝子と19遺伝子がsseA遺伝子に示されるように組み換えられる。sseA遺伝子のヌクレオチド配列は以下の通りである:
GAGGGGAATGATGATAAAGAAAAAGGCTGCGTTTAGTGAATATCGTGATTTAGAGCAAAGTTACATGCAGCTAAATCACTGTCTTAAAAAATTTCACCAAATCCGGGCTAAGGTGAGTCAACAGCTTGCTGAAAGGGCAGAGAGCCCCAAAAATAGCAGAGAGACAGAGAGTATTCTTCATAACCTATTTCCACAAGGCGTTGCCGGGGTTAACCAGGAGGCCGAGAAGGATTTAAAGAAAATAGTAAGTTTGTTTAAACAACTTGAAGTACGACTGAAACAACTTAATGCTCAAGCCCCGGTGGAGATACCGTCAGGAAAAACAAAAAGGTAA (配列番号3)/NCBI accession NP_460362.1)
サルモネラに組換えられると、sseAオペロン配列は以下の通りである:
GACTCGCTACGCTCGCCCTTCGGGCCGCCGCTAG (配列番号47)
「Xu, X., & Hensel, M. (2010). Systematic analysis of the SSRAB virulon of salmonella enterica. Infection and Immunity, 78(1), 49-58. https://doi.org/10.1128/iai.00931-09」に記載の通り。
GAGGGGAATGATGATAAAGAAAAAGGCTGCGTTTAGTGAATATCGTGATTTAGAGCAAAGTTACATGCAGCTAAATCACTGTCTTAAAAAATTTCACCAAATCCGGGCTAAGGTGAGTCAACAGCTTGCTGAAAGGGCAGAGAGCCCCAAAAATAGCAGAGAGACAGAGAGTATTCTTCATAACCTATTTCCACAAGGCGTTGCCGGGGTTAACCAGGAGGCCGAGAAGGATTTAAAGAAAATAGTAAGTTTGTTTAAACAACTTGAAGTACGACTGAAACAACTTAATGCTCAAGCCCCGGTGGAGATACCGTCAGGAAAAACAAAAAGGTAA (配列番号3)/NCBI accession NP_460362.1)
サルモネラに組換えられると、sseAオペロン配列は以下の通りである:
GACTCGCTACGCTCGCCCTTCGGGCCGCCGCTAG (配列番号47)
「Xu, X., & Hensel, M. (2010). Systematic analysis of the SSRAB virulon of salmonella enterica. Infection and Immunity, 78(1), 49-58. https://doi.org/10.1128/iai.00931-09」に記載の通り。
sseA遺伝子は、SSEAタンパク質をコードしており、そのアミノ酸配列は以下の通りである:
MMIKKKAAFSEYRDLEQSYMQLNHCLKKFHQIRAKVSQQLAERAESPKNSRETESILHNLFPQGVAGVNQEAEKDLKKIVSLFKQLEVRLKQLNAQAPVEIPSGKTKR (配列番号4)/(NCBI accession NP_460362.1)
MMIKKKAAFSEYRDLEQSYMQLNHCLKKFHQIRAKVSQQLAERAESPKNSRETESILHNLFPQGVAGVNQEAEKDLKKIVSLFKQLEVRLKQLNAQAPVEIPSGKTKR (配列番号4)/(NCBI accession NP_460362.1)
図9に記載されたアプローチは、本明細書においてSE血清型ティフィムリウムLT2(STLT2+P13+19)と呼ばれる菌株の生産を図示するが、限定を意図するものではない。本開示は、13及び19遺伝子をバイシストロンエレメントとして組み込むこと、又は各遺伝子を別々に組み込むことを含むが、記載されたタンパク質が、改変細菌において機能的である適切なプロモーターに作動可能に連結されることを条件とする。従って、記載された遺伝子の挿入は、例えば、ガイド指向性RNAヌクレアーゼ、TALONS、ジンクフィンガー、及び当業者に明らかであろう他のデザイナーヌクレアーゼを用いて達成され得る。本開示には、図9に示すように、記載遺伝子をN-C末端の順で導入すること、及び19遺伝子が13遺伝子のN末端になるように順序を逆にすることが含まれる。
sseA遺伝子は、sseAプロモーターが遺伝子の発現を駆動するように相同組換えサイトとして使用されるが、これは非限定的な実施形態である。代替的な実施形態において、記載された遺伝子に作動可能に連結され、それゆえその発現を駆動するように使用されるプロモーターは、細菌に対して異種であってもよく、それは異なる生物から採取されるか、又は由来することを意味し、あるいはsseA構築物を用いて例示されるように、その生物に対して内因性であってもよい。本開示はまた、その生物に内因性であるが、新しい位置(記載された遺伝子の発現を駆動できるものの、内因性遺伝子座とは異なる遺伝子座にある)に導入されているプロモーターを導入することも含む。
記載された2つのタンパク質の発現は、単一のmRNAからの翻訳に起因する可能性がある。タンパク質が別々のタンパク質として産生されるように、翻訳が不連続であってもよい。そのようなものとして、本開示は、例えば、配列内リボソーム進入部位(IRES:internal ribosome entry site)、又はリボソームスキッピングペプチドによって、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを分離することを含み、これらの多くは当技術分野で既知であり、本開示での使用に適合させることができる。以下の実施例で使用される実施形態では、翻訳は、遺伝子13及び19の両方の配列を含む単一のmRNA鎖上で起こる。これらは、一方向タンデムオープンリーディングフレーム(ORF)において互いに隣り合って配向される。したがって、遺伝子19は遺伝子13のすぐ下流に位置し、遺伝子13のORFの停止コドンと遺伝子19のORFの開始コドンが重なっている。P22遺伝子13と19のこれらの重なり合ったORFは、mRNAがステムループ構造を形成するように構成されている。一方向性のタンデムORFにおけるこのステムループ構造は、翻訳カップリングを引き起こし、これは近くにある第二の下流タンパク質(この例では、遺伝子19によってコードされるタンパク質)の翻訳開始を可能にするリボソーム再開の一形態である。例えば、「Rennell, D., & Poteete, A. R. (1989). Genetic analysis of bacteriophage P22 lysozyme structure. Genetics, 123(3), 431-440, and Wright, B. W., Molloy, M. P., & Jaschke, P. R. (2021). Overlapping genes in natural and engineered genomes. Nature Reviews Genetics, 23(3), 154-168.」を参照。
本開示は、単離された改変細菌、前記改変細菌を含む細胞培養物、及び前記改変細菌を含むキットを含む。一実施形態において、キットは、改変細菌を含む1つ以上の密封容器を含み、改変細菌の使用説明を提供する印刷物を含んでもよい。
本開示は、細菌が培養される培地を含む。本開示は、任意の形態の容器に保持された改変細菌を含む(例えば、細菌を含む容器(vessel)。これには、あらゆるオペレーション段階の容器が含まれる)。複数の実施形態において、容器は、細胞培養皿、フラスコ、密封可能なチューブ、又はバイオリアクターである。複数の実施形態において、バイオリアクターは、少なくとも2リットルの容積を有する。複数の実施形態において、本開示の改変細菌を作製及び/又は産生するために使用されるバイオリアクターは、2リットルから最大300万リットル(上限及び下限値、その間のすべての数及び数の範囲を含む)までの容積を有する。
改変細菌は、他の成分なしで使用されてもよく、又は希釈剤などの任意の適切な他の剤とともに使用されてもよく、例えば、飲料水を含むが必ずしもこれに限定されない水溶液に改変細菌を入れることによって使用することができる。本開示の改変細菌を含む組成物は、他の抗菌剤を含むこともできる。例えば、改変細菌は、アミノグリコシド類、βラクタム類(クラブラン酸などのβラクタマーゼ阻害剤を伴って又は伴わずに)、マクロライド類、グリコペプチド類、ポリペプチド類、セファロスポリン類、リンコサミド類、ケトライド類、リファンピシン、ポリケチド(ポリケタイド)類、カルバペネム、プレウロムチリン(pleuromutilin)、キノロン類、ストレプトグラミン類、オキサゾリジノン類、又はリポペプチド類などのクラスのメンバーである抗生物質とともに使用することができる。
複数の実施形態において、本開示は、記載された改変細菌を、それを必要とするヒト個体に投与することを含む。他の実施形態において、本開示は、獣医学的アプローチを含み、したがって、この局面において、非ヒト哺乳動物における記載された改変細菌の使用に関係する。複数の実施形態において、改変細菌は鳥類動物に投与される。複数の実施形態において、鳥類動物は任意のタイプの家禽である。複数の実施形態において、鳥類動物はキジ目(Galliforme)であり、したがって、体重の思い地上で餌を食べる鳥(七面鳥、ライチョウ、ニワトリ(chicken)、新世界ウズラ(New World quail)及び旧世界ウズラ(Old World quail)を含む)の任意のメンバーを含む。複数の実施形態において、鳥類動物は、家畜化された家禽(家畜化されたニワトリ及び七面鳥を含むがこれらに限定されない)である。複数の実施形態において、ニワトリは、Gallus gallus(例えばGallus gallus domestic)である。複数の実施形態において、ニワトリは雄鶏又は雌鶏である。複数の実施形態において、ニワトリはブロイラー鶏である。複数の実施形態において、鳥類動物は成鳥又は幼鳥である。複数の実施形態において、本開示のワクチンは、鳥類動物の集団、すなわち群れに投与され得る。複数の実施形態において、例えば集団免疫又は群れ免疫を達成するために、群れの50~85%又はそれ以上のメンバーがワクチン接種される。
他の非限定的な実施形態において、記載される細菌は、反芻動物に投与され、これには、ウシ属、ヒツジ、アンテロープ、シカ、キリン、及びそれらの近縁種が含まれるが必ずしもこれらに限定されず、さらにラクダ科動物のようなシュード反芻動物が含まれ得る。複数の実施形態において、反芻動物は、Bos属のメンバーであるウシ属(bovine)哺乳動物である(雄ウシ、雌ウシ、バッファローなど)。一実施形態では、反芻動物は乳牛である。
一実施形態において、本開示は、イノシシ(Sus)属の任意のメンバーに、本開示の改変細菌を投与することを含み、従って、任意のブタ(swine)で本発明を実施することを包含し、その例は、一般に豚(swine 又は hog)とも呼ばれる家畜ブタ(すなわち、Sus domesticus)に限定されない。
本開示はまた、非ウシ属及び非反芻哺乳動物(ウマ科、イヌ科、ネコ科を含むが必ずしもこれらに限定されない)にワクチンを投与することも含む。
記載された改変細菌を含む組成物は、粘膜内層に誘導することができ、そこに留まることにより、常在病原因菌を死滅させる。粘膜内層は、例えば、上下気道、眼、頬腔、鼻、直腸、膣、歯周ポケット、腸(intestines)及び結腸(colon)を含む。粘膜組織の自然な排除又は浄化機構に起因して、本開示は、粘膜組織に接着性を示す剤の添加を含む。
記載された改変細菌を投与する場合、治療上有効な投与量は、まず細胞培養アッセイ又は動物モデルのいずれかで推定することができる。動物モデルを用いて、望ましい濃度範囲と投与経路を達成することもできる。このような情報は、ヒト又はヒト以外の動物への投与に有用な用量と投与経路を決定するために使用できる。正確な投与量は、個々の医師、又は、獣医学に熟練した個人のような他の医療提供者が、治療される個体を考慮して選択する。投与量及び投与方法は、所望の効果を維持するのに十分な量の改変細菌を提供するように調整することができる。考慮され得る追加的な因子には、疾患状態の種類及び重症度、年齢、被験体の体重;食餌、所望の治療期間、投与方法、並びに投与の時間及び頻度が含まれる。
本開示は、抗生物質耐性細菌を含む、細菌感染症、関連感染症又は状態を治療する方法を含み、これには、細菌又は被験体(特定の細菌に感染もしくは暴露された、又は暴露された疑いのあるもしくはリスクのある被験体)に、特定の細菌を死滅させるのに有効な量の本開示の改変細菌を投与することが含まれる。本開示の方法は、サルモネラ感染症にかかりやすい動物、あるいは本開示の組成物を投与する必要がある動物、又は本開示の組成物を投与することで恩恵を受ける動物に適用されることが期待される。特定のアプローチにおいて、改変細菌は、病原性細菌を死滅させるか又は増殖を減少させるために使用される。複数の実施形態において、改変細菌によって影響を受ける細菌は、任意のタイプの病原性サルモネラ、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、又は大腸菌を含む。特定の実施形態において、本開示の改変細菌の使用は、感染から(例えば、個体の臓器、組織、皮膚、生物学的液体の感染から)の細菌集団の根絶をもたらし、及び/又は、細菌の糞便排出を減少させるかもしくは排除する。改変細菌を使用して得られた結果は、適切な対照と比較することができる。複数の実施形態において、改変細菌の使用は、対照と比較して改善された結果を提供する。複数の実施形態において、対照は、改変されていない細菌、又は従前に記載されたワクチン製剤を含む。
複数の実施形態において、改変細菌は、グラム陽性細菌又はグラム陰性細菌(細菌感染症又は関連する状態を含む)の死滅、除菌(decolonization)、予防又は治療のために使用される。複数の実施形態において、改変細菌の使用は、細菌生残細胞(bacterial persister cell)、及び/又は、休眠状態にある生きているが培養が不可能な(VBNC:viable but non-culturable)細菌を減少及び/又は根絶する。
複数の実施形態において、改変細菌の使用は、体液性免疫応答、細胞媒介免疫応答、又はそれらの組合せを生じる。複数の実施形態において、記載された改変細菌の使用は、実施例においてより十分に記載されるように、サイトカインの産生を刺激する。複数の実施形態において、改変細菌の使用は、実施例においてより十分に記載されるように、Toll様受容体の発現を刺激する。複数の実施形態において、改変細菌の使用は、実施例においてより十分に記載されるように、インターロイキンの発現を刺激する。
本開示は、本開示の例示として提供される以下の非限定的な実施例を参照することにより、よりよく理解され得る。
本実施例では、以下の実施例で説明する結果を得るために使用した材料と方法を提供する。
菌株と培養条件:
3つのSE株(非病原性ティフィムリウム ATCC 19585 (LT2)、病原性ティフィムリウム ATCC 14028 (STY)、病原性エンテリティディス ATCC 13076(SEE))は、アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC, Manassas, VA, USA)から購入した。大腸菌TOP10は、Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)から、大腸菌DH5α及びB2155は、Delaware University(Newark, DE, USA)から購入した。すべての菌株を、LB(Luria-Bertani)培地(Difco, Becton, Dickinson and Co., Sparks, MD, USA)で37℃にて一晩培養した。ジアミノピメリン酸(DAP, 0.3mM)は、DAP栄養要求体である大腸菌B2155の増殖のために用いた。pCR2.1又はpET16b誘導体プラスミドを含む株の培養にはアンピシリン(100μg/mL)を用いた。クロラムフェニコール(30μg/mL)は、pDS132誘導体プラスミドを含む菌株の培養のために使用した。
3つのSE株(非病原性ティフィムリウム ATCC 19585 (LT2)、病原性ティフィムリウム ATCC 14028 (STY)、病原性エンテリティディス ATCC 13076(SEE))は、アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC, Manassas, VA, USA)から購入した。大腸菌TOP10は、Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)から、大腸菌DH5α及びB2155は、Delaware University(Newark, DE, USA)から購入した。すべての菌株を、LB(Luria-Bertani)培地(Difco, Becton, Dickinson and Co., Sparks, MD, USA)で37℃にて一晩培養した。ジアミノピメリン酸(DAP, 0.3mM)は、DAP栄養要求体である大腸菌B2155の増殖のために用いた。pCR2.1又はpET16b誘導体プラスミドを含む株の培養にはアンピシリン(100μg/mL)を用いた。クロラムフェニコール(30μg/mL)は、pDS132誘導体プラスミドを含む菌株の培養のために使用した。
細胞株と培養条件
HD-11(ニワトリマクロファージ)細胞は、アメリカ食品医薬品局の免疫生物学部門(Laurel, MD, USA)から入手した。HD-11細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS; Corning, Manassas, VA, USA)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM, Corning, Manassas, VA, USA)で、150cm2のT-フラスコ(Corning, Manassas, VA, USA)中、5%CO2・100%湿度、37℃にて培養した。HD-11細胞を24ウェルプレートで一晩培養し、単層細胞を採取した。
HD-11(ニワトリマクロファージ)細胞は、アメリカ食品医薬品局の免疫生物学部門(Laurel, MD, USA)から入手した。HD-11細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS; Corning, Manassas, VA, USA)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM, Corning, Manassas, VA, USA)で、150cm2のT-フラスコ(Corning, Manassas, VA, USA)中、5%CO2・100%湿度、37℃にて培養した。HD-11細胞を24ウェルプレートで一晩培養し、単層細胞を採取した。
自己分解性サルモネラワクチン株の構築
LT2とバクテリオファージP22(ATCC, Manassas, VA, USA)のゲノムDNAを、DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen, Germantown, MD, USA)を用いて単離した。バクテリオファージP22由来の753bpの遺伝子13及び19断片を、NdeI及びBamHIリンカーで連結したプライマーを用いてPCRで増幅した。327bpのsseA(SPI-2遺伝子)及び317bp下流(LT2由来のsseA断片の)は、それぞれXbaI & XhoI/XbaIリンカー、及びBamHI/SacIリンカーで連結したプライマーを用いて、PCRで増幅した。PCRはMastercycler(Eppendorf, Hauppauge, NY, USA)で行い、94℃・2分(1サイクル)、94℃・30秒、60℃・30秒、72℃・60秒(30サイクル)、72℃・2分(1サイクル)でプログラムした。
LT2とバクテリオファージP22(ATCC, Manassas, VA, USA)のゲノムDNAを、DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen, Germantown, MD, USA)を用いて単離した。バクテリオファージP22由来の753bpの遺伝子13及び19断片を、NdeI及びBamHIリンカーで連結したプライマーを用いてPCRで増幅した。327bpのsseA(SPI-2遺伝子)及び317bp下流(LT2由来のsseA断片の)は、それぞれXbaI & XhoI/XbaIリンカー、及びBamHI/SacIリンカーで連結したプライマーを用いて、PCRで増幅した。PCRはMastercycler(Eppendorf, Hauppauge, NY, USA)で行い、94℃・2分(1サイクル)、94℃・30秒、60℃・30秒、72℃・60秒(30サイクル)、72℃・2分(1サイクル)でプログラムした。
13/19遺伝子アンプリコンを、NdeI/BamHIで二重消化し、NdeI/BamHIで二重消化したpET16bにライゲーションし、さらなる形質転換とプラスミド単離のためにpET16b-13/19を形成した。次に、pET16b-13/19の大腸菌TOP10への形質転換を、化学的にコンピテントな細胞を用いたヒートショック形質転換によって行い、続いて100μg/mlのアンピシリンを添加したLB寒天培地上で選択した。プラスミドDNA精製キット(iNtRON Biotechnology, Lynnwood, WA, USA)を用いて、pET16b-13/19を単離した。単離したpET16b-13/19をXbaI/BamHIで二重消化し、リボソーム結合部位(rbs)と遺伝子13及び19を溶出させ、XbaI/BamHIで二重消化したpCR2.1にライゲーションし、pCR2.1-13/19を形成し、さらに大腸菌TOP10に形質転換し、上記のようにプラスミドを単離した。sseAアンプリコンをXbaIで消化し、XbaIで消化したpCR2.1-13/19にライゲーションしてpCR2.1-13/19-sseAを形成し、大腸菌TOP10へのさらなる形質転換とプラスミド単離を上記のように行った)。sseA下流アンプリコンをBamHI/SacIで消化し、二重消化したpCR2.1-13/19-sseAにライゲーションし、pCR2.1-down-13/19-sseAを形成し、大腸菌TOP10へのさらなる形質転換とプラスミド単離を上記のように行った。単離されたpCR2.1-down-13/19-sseAをXhoI/SacIで二重消化し、sseA-rbs-13/19-sseA下流断片を溶出し、SalI/SacI二重消化pDS132にライゲーションし、pDS132-SR13/19SDを形成し、大腸菌DH5αへのさらなる形質転換及びプラスミド単離を上記のように行った。単離されたpDS132-down-13/19-sseAを大腸菌B2155に形質転換し、30μg/mlのクロラムフェニコールと0.3mMのDAPを添加したLB寒天培地で選択した。pDS132-down-13/19-sseAの構築物の概略図を図1に示す。
大腸菌B2155-pDS132-down-13/19-sseA(ドナー)を、30μg/mlのクロラムフェニコールと0.3mMのDAPを加えたLB培地で培養し、LT2(レシピエント)をLB培地で一晩培養した。その後、ドナーとレシピエントの培養液を1:1の割合で混合した。混合した菌体を13,000rpmで1分間遠心し、菌体ペレットを0.3mMのDAPを含む0.1mlのLB培地に懸濁した。接合DNA伝達のために、懸濁した細菌混合物をLB寒天培地(0.3mMのDAP添加)に滴下し、37℃で一晩インキュベートした。一晩培養した混合菌体を、30μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地に広げ、37℃で一晩培養し、DAP栄養要求体大腸菌B2155と非接合LT2を根絶した。その後、培養物を30μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB培地に移し、37℃で一晩培養した後、クロラムフェニコールを含まないLB培地に移し、37℃で一晩培養し、遺伝子13及び19をLT2のゲノムDNAへ組み込み、その後、5%スクロースを含むLB寒天培地で選択した。組み込みは、sseA orf上流特異的プライマーと、317bpのsseA遺伝子下流Rプライマーを用いるPCR増幅で決定した。
STLT2 +P13+19 の増殖、付着活性、細胞内生存率分析
STLT2+P13+19及びLT2を、3mlのLB培地で一晩培養した。一晩培養した菌株の濃度を、50mlのLB培地で0.01(OD600nm)に調整し、37℃・180rpmでインキュベートした。菌の増殖は、OD600nmで2時間ごとに10時間にわたって測定した。STLT2+P13+19とLT2の生存率は、培養0時間と8時間におけるコロニー形成単位(CFU:colony forming unit)アッセイによって決定した。Pengら(2015)による従前の方法に従って、付着及び細胞内STLT2+P13+19またはLT2を測定し、比較した。
STLT2+P13+19及びLT2を、3mlのLB培地で一晩培養した。一晩培養した菌株の濃度を、50mlのLB培地で0.01(OD600nm)に調整し、37℃・180rpmでインキュベートした。菌の増殖は、OD600nmで2時間ごとに10時間にわたって測定した。STLT2+P13+19とLT2の生存率は、培養0時間と8時間におけるコロニー形成単位(CFU:colony forming unit)アッセイによって決定した。Pengら(2015)による従前の方法に従って、付着及び細胞内STLT2+P13+19またはLT2を測定し、比較した。
動物実験
生後1日の特定病原体不検出のヒナを、Charles River(Frederick, MD)から購入し、メリーランド大学の動物実験委員会(IACUC:Institutional Animal Care and Use Committee、プロトコル番号1160542-2)が承認したガイドラインとプロトコルに従い、37℃、12時間/12時間の照明サイクルで飼育し、飼料と水を自由に与えて育てた。ニワトリはさらにA、B、C、D群に分けられた(n=15/群)。
生後1日の特定病原体不検出のヒナを、Charles River(Frederick, MD)から購入し、メリーランド大学の動物実験委員会(IACUC:Institutional Animal Care and Use Committee、プロトコル番号1160542-2)が承認したガイドラインとプロトコルに従い、37℃、12時間/12時間の照明サイクルで飼育し、飼料と水を自由に与えて育てた。ニワトリはさらにA、B、C、D群に分けられた(n=15/群)。
PBSに懸濁したSTLT2+P13+19の一晩培養液のアリコート100μLを、1日目と8日目に経口ガベージでニワトリ(B群とD群:109CFU/ヒナ)に与えた。15日目に、109CFUの細菌を含むSTY(グループA及びB)又はSE(グループC及びD)懸濁液100μLを、各ヒナに経口ガベージで与えた。ヒナはその後2週間飼育され、通常の水道水を与え、成長促進剤や合成化学物質を含まないニワトリ用スターター飼料(マッシュ)を与えた。2週目、3週目、4週目の終わりに、各群から5羽、5羽、5羽のヒナを安楽死させた。
1週目から開始し、各群から15の糞便サンプルを採取した。安楽死させたニワトリの盲腸、空腸、回腸を分離して採取した。糞便及び腸内サンプル中のサルモネラ菌数はキシロース-リジン-デオキシコール酸(XLD:Xylose Lysine Deoxycholate)寒天培地にプレーティングすることによって定量し、STY又はSEの数は100μg/mlのカナマイシンを添加したXLD寒天培地にプレーティングすることによって定量した。さらなるサイトカイン分析のために、2週目、3週目、4週目の終わりに、安楽死させたニワトリの心臓から血液を採取した。
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA:Enzyme-Linked Immuno-Sorbant Assay)
ニワトリの全血サンプルを、室温で30分間放置することにより、妨害なしで凝固させた。その後、3,000rpmで10分間遠心分離し、凝固物を除去した。上清を指定血清として回収し、4℃で維持した。IL-6、IL-8、IL-12、iNOS、及びTNF-αの血清分泌レベルは、それぞれIL-6、IL-8、IL-12、iNOS、及びTNF-α用のELISAキット(MyBioSource, Inc., San Diego, CA, USA)を用いて製造業者のプロトコルにしたがって測定した。
ニワトリの全血サンプルを、室温で30分間放置することにより、妨害なしで凝固させた。その後、3,000rpmで10分間遠心分離し、凝固物を除去した。上清を指定血清として回収し、4℃で維持した。IL-6、IL-8、IL-12、iNOS、及びTNF-αの血清分泌レベルは、それぞれIL-6、IL-8、IL-12、iNOS、及びTNF-α用のELISAキット(MyBioSource, Inc., San Diego, CA, USA)を用いて製造業者のプロトコルにしたがって測定した。
定量的PCR(qPCR)
細菌細胞、HD11細胞、又はニワトリの全血を、1×PBSで3回洗浄した。RNA抽出、cDNA逆転写、及びqPCRは、Pengら(2019)による従前の方法に従って行った。遺伝子13/19及びSPI-1/2については、データの正規化のために50sリボソームタンパク質L5を対照遺伝子として用い、サイトカイン及びTLRについては、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH:glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)を対照とした。オリゴヌクレオチドプライマー(Eurofins MWG Operon, Huntsville, AL, USA)を表2に示す。
細菌細胞、HD11細胞、又はニワトリの全血を、1×PBSで3回洗浄した。RNA抽出、cDNA逆転写、及びqPCRは、Pengら(2019)による従前の方法に従って行った。遺伝子13/19及びSPI-1/2については、データの正規化のために50sリボソームタンパク質L5を対照遺伝子として用い、サイトカイン及びTLRについては、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH:glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)を対照とした。オリゴヌクレオチドプライマー(Eurofins MWG Operon, Huntsville, AL, USA)を表2に示す。
ニワトリの腸内微生物組成分析
微生物ゲノムDNAは、製造業者の指示に従って、PureLink Microbiome DNA Purification Kit(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いて、動物実験の最終日に採取した個々のニワトリ盲腸液サンプルから抽出した。Nextera DNA Library Preparation Kit及びNextera Index Kit(Illumina, San Diego, CA, USA)を用いて、微生物16S rRNA遺伝子のV3-V4領域をターゲットとするDNAライブラリーを調製した。その後、v3 600-サイクルキット(Illumina, San Diego, CA, USA)を用いて、Illumina MiSeqシステムによる2×300bpのペアエンドリード(paired-end reads)シーケンシングを行った。生配列データは、BCL2FastQ、DeconSeq、及びMothurソフトウェアを用いて前処理及び品質管理を行った。同一性97%の16S rRNA遺伝子配列変異体を用いて、操作的分類単位(OUT:operational taxonomic unit)を定義した。特定の門又は属の相対的な分類学的存在量は、特定の分類群のリード数を、全16S rRNA遺伝子のリード数で割って計算した。RソフトウェアのANCOMパッケージを使用して、異なるグループのニワトリ盲腸の微生物組成の有意差を決定した。
微生物ゲノムDNAは、製造業者の指示に従って、PureLink Microbiome DNA Purification Kit(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いて、動物実験の最終日に採取した個々のニワトリ盲腸液サンプルから抽出した。Nextera DNA Library Preparation Kit及びNextera Index Kit(Illumina, San Diego, CA, USA)を用いて、微生物16S rRNA遺伝子のV3-V4領域をターゲットとするDNAライブラリーを調製した。その後、v3 600-サイクルキット(Illumina, San Diego, CA, USA)を用いて、Illumina MiSeqシステムによる2×300bpのペアエンドリード(paired-end reads)シーケンシングを行った。生配列データは、BCL2FastQ、DeconSeq、及びMothurソフトウェアを用いて前処理及び品質管理を行った。同一性97%の16S rRNA遺伝子配列変異体を用いて、操作的分類単位(OUT:operational taxonomic unit)を定義した。特定の門又は属の相対的な分類学的存在量は、特定の分類群のリード数を、全16S rRNA遺伝子のリード数で割って計算した。RソフトウェアのANCOMパッケージを使用して、異なるグループのニワトリ盲腸の微生物組成の有意差を決定した。
統計解析
すべてのデータは、少なくとも三回の個々の独立した実験を行って得た。群間差はP値が0.05未満の場合に有意とみなした。
すべてのデータは、少なくとも三回の個々の独立した実験を行って得た。群間差はP値が0.05未満の場合に有意とみなした。
インビトロでのSTLT2 +P13+19 の増殖
野生型LT2に遺伝子13と19を挿入した後のSTLT2+P13+19の増殖と生存能力を比較した(図2)。STLT2+P13+19は、LT2よりも有意に増殖が速い傾向があった(特に最初の10時間)。両株とも培養後2時間以内に対数期に入り、8時間後には定常期に達した(図2A)。具体的には、LT2は開始期(2時間)及び定常期(8時間)にて、それぞれ5.34×106CFU/ml、5.65×108CFU/mlであったのに対し、STLT2+P13+19では、5.01×106CFU/ml、6.01×108CFU/mlであった(図2B)。これにより、サルモネラワクチン株STLT2+P13+19は、良好に増殖できること、及び、野生型よりもさらに良好に増殖できることが示された。
野生型LT2に遺伝子13と19を挿入した後のSTLT2+P13+19の増殖と生存能力を比較した(図2)。STLT2+P13+19は、LT2よりも有意に増殖が速い傾向があった(特に最初の10時間)。両株とも培養後2時間以内に対数期に入り、8時間後には定常期に達した(図2A)。具体的には、LT2は開始期(2時間)及び定常期(8時間)にて、それぞれ5.34×106CFU/ml、5.65×108CFU/mlであったのに対し、STLT2+P13+19では、5.01×106CFU/ml、6.01×108CFU/mlであった(図2B)。これにより、サルモネラワクチン株STLT2+P13+19は、良好に増殖できること、及び、野生型よりもさらに良好に増殖できることが示された。
HD11細胞におけるSTLT2 +P13+19 の細胞内生存率の低下
STLT2+P13+19とLT2のHD11細胞への接着能、及び、HD11細胞内での生存率を比較した(図3)。HD-11細胞に対するLT2及びSTLT2+P13+19の接着能は、ともに同程度であった。しかし、STLT2+P13+19の細胞内生存率は、野生株LT2と比較して、感染後4時間及び24時間でそれぞれ93.59%、94.42%(対LT2)と有意に低下した(図3B)。一方、生存能と増殖能に関しては、LT2は感染4時間後に比べて感染24時間後に2.22倍と有意に増加したが、STLT2+P13+19は1.93倍と有意な増加は見られなかった(図3B)。
STLT2+P13+19とLT2のHD11細胞への接着能、及び、HD11細胞内での生存率を比較した(図3)。HD-11細胞に対するLT2及びSTLT2+P13+19の接着能は、ともに同程度であった。しかし、STLT2+P13+19の細胞内生存率は、野生株LT2と比較して、感染後4時間及び24時間でそれぞれ93.59%、94.42%(対LT2)と有意に低下した(図3B)。一方、生存能と増殖能に関しては、LT2は感染4時間後に比べて感染24時間後に2.22倍と有意に増加したが、STLT2+P13+19は1.93倍と有意な増加は見られなかった(図3B)。
HD11細胞に感染した後の、STLT2 +P13+19 におけるP22ホリン/リゾチーム遺伝子及びSPI-1/2遺伝子の発現
バクテリオファージP22のホリン遺伝子(遺伝子13)とリゾチーム遺伝子(遺伝子19)のサルモネラワクチン株への組み込みが成功したことを確認するために、HD11細胞への感染後24時間におけるそれらのmRNA発現を調べ、その結果を図4Aに示す。予想通り、両mRNAは高発現していた。遺伝子13(約2000倍増加)と遺伝子19(約1500倍増加)の遺伝子発現が有意に上昇していることが観察された。さらに、HD11細胞へ感染後のSTLT2+P13+19とLT2との間で、浸潤及び細胞内生存関連遺伝子のmRNA発現も比較した(図4B)。invA、invE、invF遺伝子を含むSPI-1遺伝子の発現、及びpipB、sifA、sseJ、sspH2遺伝子を含むSPI-2遺伝子の発現には、HD11細胞への感染後24時間で、これら2株の間に有意差は認められなかった。しかしながら、STLT2+P13+19におけるsseA遺伝子のmRNA発現は、HD11細胞への感染後、LT2よりも5倍高かった(図4B)。この結果は、P22ホリン及びリゾチーム遺伝子のサルモネラワクチン株への組み込みが成功し、細胞内条件下でワクチン株におけるsseA遺伝子の発現が活性化されたことを実証している。
バクテリオファージP22のホリン遺伝子(遺伝子13)とリゾチーム遺伝子(遺伝子19)のサルモネラワクチン株への組み込みが成功したことを確認するために、HD11細胞への感染後24時間におけるそれらのmRNA発現を調べ、その結果を図4Aに示す。予想通り、両mRNAは高発現していた。遺伝子13(約2000倍増加)と遺伝子19(約1500倍増加)の遺伝子発現が有意に上昇していることが観察された。さらに、HD11細胞へ感染後のSTLT2+P13+19とLT2との間で、浸潤及び細胞内生存関連遺伝子のmRNA発現も比較した(図4B)。invA、invE、invF遺伝子を含むSPI-1遺伝子の発現、及びpipB、sifA、sseJ、sspH2遺伝子を含むSPI-2遺伝子の発現には、HD11細胞への感染後24時間で、これら2株の間に有意差は認められなかった。しかしながら、STLT2+P13+19におけるsseA遺伝子のmRNA発現は、HD11細胞への感染後、LT2よりも5倍高かった(図4B)。この結果は、P22ホリン及びリゾチーム遺伝子のサルモネラワクチン株への組み込みが成功し、細胞内条件下でワクチン株におけるsseA遺伝子の発現が活性化されたことを実証している。
STLT2 +P13+19 が感染したHD11細胞は、炎症性サイトカインとエンドソームTLR遺伝子発現を刺激する
次に、STLT2+P13+19感染が、HD11細胞の細胞性自然免疫に与える刺激効果をさらに評価するために、STLT2+P13+19又はLT2に感染させたHD11細胞における炎症性サイトカイン及びエンドソームTLRの遺伝子発現を調べた(図5)。炎症性サイトカイン遺伝子については、STLT2+P13+19に24時間感染したHD11細胞では、LT2に24時間感染したHD11細胞と比較して、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-18、iNOS、LITAFのmRNA発現量がそれぞれ1.68倍、8.85倍、5.56倍、2.65倍、2.19倍、2.36倍、11.34倍高いことが観察された。一方、STLT2+P13+19-感染HD11細胞におけるエンドソームTLR3及びTLR7のmRNA発現量は、LT2感染HD11細胞における発現量よりも、それぞれ12.16倍及び5.70倍と、有意に高いことが確認された(図5)。
次に、STLT2+P13+19感染が、HD11細胞の細胞性自然免疫に与える刺激効果をさらに評価するために、STLT2+P13+19又はLT2に感染させたHD11細胞における炎症性サイトカイン及びエンドソームTLRの遺伝子発現を調べた(図5)。炎症性サイトカイン遺伝子については、STLT2+P13+19に24時間感染したHD11細胞では、LT2に24時間感染したHD11細胞と比較して、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-18、iNOS、LITAFのmRNA発現量がそれぞれ1.68倍、8.85倍、5.56倍、2.65倍、2.19倍、2.36倍、11.34倍高いことが観察された。一方、STLT2+P13+19-感染HD11細胞におけるエンドソームTLR3及びTLR7のmRNA発現量は、LT2感染HD11細胞における発現量よりも、それぞれ12.16倍及び5.70倍と、有意に高いことが確認された(図5)。
STLT2 +P13+19 ワクチン接種により、ニワトリの腸内におけるサルモネラ菌コロニー形成が減少する
STLT2+P13+19を、ニワトリの半数に二回経口投与した。1日目に初回ワクチン接種を行い、7日目にもう1回ブーストし、その後、14日目にすべてのニワトリにSTYまたはSEEチャレンジを行った。図6Aに示すように、毎週採取したニワトリの糞便サンプルの微生物学的分析によると、STLT2+P13+19ワクチンを接種したニワトリでは、7日目(0.079log)と14日目(0.213log)に、糞便中のサルモネラ菌数が数値的に(p>0.05)減少した;STLT2+P13+19ワクチン接種を行ったニワトリと行わなかったニワトリでは、糞便中のサルモネラ量の差が2週間後に有意(p<0.01)となり、21日目には1.023log、28日目には1.136logを示した。STYとSEEは、チャレンジ後に検出された(21日目及び28日目)。STLT2+P13+19ワクチン接種を受けたニワトリの糞便サンプルはいずれもSTYを含まなかったが、ワクチン接種しなかったニワトリでは21日目と28日目にそれぞれ2.847logと3.512logとなった(p<0.001)。しかし、STLT2+P13+19ワクチン接種の有無のニワトリ間において、糞便SEE量の差はわずかであり(p>0.05)、21日目と28日目のワクチン接種ニワトリにおいて、それぞれ0.648log及び1.651log少ない細菌数を示した。
STLT2+P13+19を、ニワトリの半数に二回経口投与した。1日目に初回ワクチン接種を行い、7日目にもう1回ブーストし、その後、14日目にすべてのニワトリにSTYまたはSEEチャレンジを行った。図6Aに示すように、毎週採取したニワトリの糞便サンプルの微生物学的分析によると、STLT2+P13+19ワクチンを接種したニワトリでは、7日目(0.079log)と14日目(0.213log)に、糞便中のサルモネラ菌数が数値的に(p>0.05)減少した;STLT2+P13+19ワクチン接種を行ったニワトリと行わなかったニワトリでは、糞便中のサルモネラ量の差が2週間後に有意(p<0.01)となり、21日目には1.023log、28日目には1.136logを示した。STYとSEEは、チャレンジ後に検出された(21日目及び28日目)。STLT2+P13+19ワクチン接種を受けたニワトリの糞便サンプルはいずれもSTYを含まなかったが、ワクチン接種しなかったニワトリでは21日目と28日目にそれぞれ2.847logと3.512logとなった(p<0.001)。しかし、STLT2+P13+19ワクチン接種の有無のニワトリ間において、糞便SEE量の差はわずかであり(p>0.05)、21日目と28日目のワクチン接種ニワトリにおいて、それぞれ0.648log及び1.651log少ない細菌数を示した。
回腸(図6B)、空腸(図6C)、盲腸(図6D)を含む様々な腸の部位で、腸内サルモネ ラコロニー形成を同様に微生物学的に評価した。14日目において、STLT2+P13+19ワクチン接種を受けたニワトリのサルモネラコロニー形成量は、回腸、空腸、盲腸でいずれも数値的に減少した(それぞれ0.007log、0.105log、0.234log)(p>0.05)。腸内サルモネラのコロニー形成の差は、21日目と28日目に大きくなった;ワクチンを接種したニワトリは回腸、空腸、盲腸のサルモネラが0.3log以上有意に減少した(p<0.05)。一方、糞便サンプルと同じ傾向で、STLT2+P13+19ワクチン接種を受けたニワトリの回腸、空腸、盲腸では、腸内STYは検出されず、ワクチンを接種しなかったニワトリと比較して、21日目と28日目の両方で有意な減少を示した(p<0.05)。しかし、腸内のSEEコロニー形成は、STLT2+P13+19により数値的に減少しただけであった(p>0.05)。
STLT2 +P13+19 ワクチン接種によるサイトカイン分泌の刺激
さらに、STLT2+P13+19ワクチン接種後のニワトリの血清サイトカイン分泌を、qPCR分析により転写レベルで調べた。STLT2+P13+19で免疫したニワトリの血清中では、ワクチンを接種しなかったがSTYでチャレンジしたニワトリと比較して、調べたすべての炎症性サイトカインの遺伝子発現が、さまざまな倍率で有意に(p<0.001)上昇した(図7A)。具体的には、STLT2+P13+19は、iNOSのmRNA発現を14日目に3.256倍、21日目に2.543倍、28日目に2.234倍促進した。同様に、STLT2+P13+19ワクチン接種後のIL-6、IL-12、TNF-αのmRNA発現は、14日目に最も上昇し、それぞれ3.492倍、3.543倍、5.993倍の増加を示した。一方、これら3つのサイトカインの刺激傾向は14日目以降に低下し、28日目にはそれぞれ2.983倍、2.808倍、4.727倍の増加で終わった。これに対して、IL-8の遺伝子発現は異なる変化の傾向を示し、21日目に2.543倍と最も上昇した。
さらに、STLT2+P13+19ワクチン接種後のニワトリの血清サイトカイン分泌を、qPCR分析により転写レベルで調べた。STLT2+P13+19で免疫したニワトリの血清中では、ワクチンを接種しなかったがSTYでチャレンジしたニワトリと比較して、調べたすべての炎症性サイトカインの遺伝子発現が、さまざまな倍率で有意に(p<0.001)上昇した(図7A)。具体的には、STLT2+P13+19は、iNOSのmRNA発現を14日目に3.256倍、21日目に2.543倍、28日目に2.234倍促進した。同様に、STLT2+P13+19ワクチン接種後のIL-6、IL-12、TNF-αのmRNA発現は、14日目に最も上昇し、それぞれ3.492倍、3.543倍、5.993倍の増加を示した。一方、これら3つのサイトカインの刺激傾向は14日目以降に低下し、28日目にはそれぞれ2.983倍、2.808倍、4.727倍の増加で終わった。これに対して、IL-8の遺伝子発現は異なる変化の傾向を示し、21日目に2.543倍と最も上昇した。
血清サイトカインの刺激傾向をさらに検証するために、上記各サイトカイン分泌に対するSTLT2+P13+19による促進効果をELISAにより個別に評価した。全体として、ELISAによる結果は転写レベルに基づく所見と一致していた(図7B~F)。iNOSの血清濃度は、STLT2+P13+19ワクチン接種により、STYでチャレンジしたニワトリにおいて、14日目、21日目、及び28日目に、それぞれ1.825倍、1.774倍、及び1.731倍と有意に(p<0.001)刺激された(図7B);IL-6は2.377倍、1.821倍及び1.725倍(図7C);IL-8は1.080倍、1.095倍及び1.078倍(図7D);IL-12は1.733倍、1.877倍及び1.588倍(図7E);TNF-αは2.169倍、1.997倍及び1.497倍(図7F)刺激された。
STLT2 +P13+19 ワクチン接種がニワトリの腸内微生物組成に及ぼす影響
腸内細菌叢を、16S rDNA配列決定によって解析した。メタゲノムシークエンシングから合計2,082,356の生リードが得られ、腸内細菌サンプルあたり約173,530リードが得られた。Greengenesデータベースに基づき、フィルタリングされた高品質リードを分類学的に分類し、門レベルと属レベルの両方で解析した。
腸内細菌叢を、16S rDNA配列決定によって解析した。メタゲノムシークエンシングから合計2,082,356の生リードが得られ、腸内細菌サンプルあたり約173,530リードが得られた。Greengenesデータベースに基づき、フィルタリングされた高品質リードを分類学的に分類し、門レベルと属レベルの両方で解析した。
門レベルでは、ファーミキューテス(Firmicutes)、バクテロイデス(Bacteroidetes)、アクチノバクテリア(Actinobacteria)、プロテオバクテリア(Proteobacteria)がすべての腸液サンプルにおいて最も豊富に存在する4つの門であり、全細菌存在量の95%以上を占めた(図8A)。細菌チャレンジは、STYの急速な腸内コロニー形成をもたらし、28日目に21.41%と相対的に高い存在量のプロテオバクテリアを誘導した;STYでチャレンジしたニワトリの4週間相対腸内存在量は、ファーミキューテスが56.29%、バクテロイデスが12.13%、アクチノバクテリアが6.11%であった。同様に、SEEチャレンジによる4週間の相対腸内存在量は、ファーミキューテスが56.32%、バクテロイデスが12.93%、アクチノバクテリアが10.87%、プロテオバクテリアが16.61%であった。ワクチンを接種しなかったSTYチャレンジニワトリと比較して、STLT2+P13+19で免疫したニワトリは、プロテオバクテリアの有意(p<0.001)に低い存在量(17.70%減少)、及びファーミキューテスの有意に高い存在量(15.52%増加)を示し、バクテロイデスの存在量(0.80%増加)とアクチノバクテリア存在量(1.67%増加)は数値的(p>0.05)に高かった。しかしながら、SEE-チャレンジニワトリにおいて、STLT2+P13+19ワクチン接種は、プロテオバクテリアの数値的な(p>0.05)減少(0.99%)のみを誘導し、ファーミキューテス、バクテロイデス、アクチノバクテリアの存在量は、それぞれ9.81%(p<0.01)、5.02%(p<0.05)、3.15%(p<0.05)増加した。
属レベルでは、STLT2+P13+19ワクチン接種により、Anaerotruncus属(0.58~1.14%増)、Faecalibacterium属(0.59~0.96%増)、Intestinimonas属(0.25~1.18%増)及びRuminococcus属(0.42~1.80%増)の相対的な存在量が一貫して増加し、他方、サルモネラの存在量は減少した(0.02~0.04%減)。一方、ワクチン防御のないSTY-チャレンジニワトリの腸内に存在する属と比較すると、STLT2+P13+19で免疫されたニワトリでは、Acinetobacter(6.87%減少)、Escherichia(10.35%減少)、Holdemania(1.41%減少)、Proteus(1.10%減少)の存在量が有意に低く、Bifidobacterium(2.27%増加)、Desulfomonile(1.17%増加)、Erysipelotrichaceae(2.44%増加)、Lactobacillus(6.13%増加)、Weissella(1.22%増加)の存在量が有意に高かった。
上記の説明から、LT2株が、記載されたサルモネラ生ワクチン株を開発するための鋳型株として使用されたことが認識されるであろう。侵入後に、サルモネラを含む液胞(vacuole)が形成され、その中でサルモネラ菌は増殖し、SPI-2遺伝子を発現して生存する(Fabrega & Vila, 2013; LaRock, Chaudhary, & Miller, 2015)。sseAは、III型分泌系のエフェクターシャペロンタンパク質のトランスロケーションに必須であるSPI-2遺伝子の1つである(Braukmann, Methner, & Berndt, 2015)(Coombes, Brown, Kujat-Choy, Vallance, & Finlay, 2003)。バクテリオファージP22の遺伝子13と19(ホリンとリゾチームをコードする)は、サルモネラを溶菌するエフェクターである;ホリンタンパク質は孔を形成して細菌細胞膜を破壊し、リゾチームは細菌細胞壁のペプチドグリカン層を分解する(Vander Byl & Kropinski, 2000)。したがって、サルモネラワクチン株においてsseAプロモーターで制御された遺伝子13及び19の発現が、細胞内溶菌につながるかどうかを解析した。
STLT2+P13+19株とLT2株のin vitroでの増殖は、ともに2時間のインキュベーション後に対数期に入り、8時間のインキュベーション後に定常期に達したことから、遺伝子13及び19は、STLT2+P13+19の増殖に影響を与えないことが示唆された。それに対して、STLT2+P13+19の細胞内生存率は、遺伝子13及び19の発現に起因して野生型より94%低下した。このことは、遺伝子13及び19の発現が、細胞内条件下でsseAプロモーターにより誘導されたことを示唆している。
TLR3とTLR7は一般に、微生物や宿主由来の核酸によって刺激されると、エンドソーム膜表面に局在するので(Lee & Barton, 2014)、STLT2+P13+19-感染HD11細胞におけるTLR3とTLR7のmRNA発現が高いことは、STLT2+P13+19の細胞内自己分解の証拠となる(O'Neill, Golenbock, & Bowie, 2013)。以前に、感染した骨髄由来マクロファージにおいて、TLR7がS.ティフィムリウムを認識できることが示されており(Arpaia et al., 2011)、一方、TLR3はサルモネラのリポ多糖によって誘導されることができ(Heinz et al., 2003)、このことは、サルモネラを含む液胞でのSTLT2+P13+19の溶解は、エンドソームTLRを誘導・刺激し、さらに、下流のシグナル伝達経路を活性化する可能性があることを示唆している。一方、STLT2+P13+19はまた、HD11細胞において重要な炎症性サイトカインをより高いmRNAレベルで誘導し、このことは、STLT2+P13+19ライセートが、T細胞及びB細胞を活性化又は分化させることができ、宿主においてサルモネラに対するエフェクター細胞性免疫応答及び抗体産生をさらに導く可能性があることを示唆している。
これまでに、S.ティフィムリウム由来の弱毒化生ワクチンは、家禽におけるサルモネラの排出及びコロニー形成を減少させる上で、様々なレベルの有効性を達成してきた。例えば、1日目及び7日目にχ9241-tHP経口ワクチンを接種すると、鶏の糞便及び盲腸内のS.ティフィムリウムを約2log減少させることができた(Jiang et al., 2010);Megan VAC-1株をワクチン接種した鶏は、糞便中のサルモネラ有病率が約25%低下した(Dorea et al., 2010);Vaxsafe(登録商標)STの投与により、産卵鶏におけるS.ティフィムリウムの糞便排出が約50%減少した(Sharma et al., 2018)。前述のワクチンと比較して、本明細書に記載のSTLT2+P13+19は、STYの糞便排出及び腸内コロニー形成を100%排除し、全サルモネラ有病率を顕著に減少させることにより、より効率的かつ効果的である。殺菌活性を有するNOの産生は、炎症反応の重要なメディエーターとして機能するため(Singh et al., 2012)、細胞内病原体に対する鶏の自然免疫活性化の一般的な指標としてiNOSを選択した。iNOSに加えて、我々は他の重要な炎症促進性サイトカインIL-6、IL-8、IL-12、及びTNF-αのレベル上昇も検出し(Xu et al., 2019)、サルモネラ菌に対する炎症反応を刺激するSTLT2+P13+19ワクチン接種の有効性を実証している。一方、メタゲノム解析に基づくと、調整された腸内微生物組成は、ELISAから得られた知見と潜在的に関連する可能性がある。組換え弱毒サルモネラワクチンが鶏の腸内細菌叢に及ぼすユニークな影響については、以前にも報告されている(Redweik, Daniels, Severin, Lyte, & Mellata, 2019)。本開示では、サルモネラによるチャレンジは、ファーミキューテスの存在量の低下とプロテオバクテリアの存在量の増加によって示される腸内微生物共生バランス失調(dysbiosis)を誘導した(Khan & Chousalkar, 2020)。STLT2+P13+19は、ファーミキューテス(ラクトバチルスやビフィドバクテリウムなど)を回復させ、刺激された炎症性サイトカインに関連するプロテオバクテリア、特にサルモネラを減少させることによって、腸内細菌叢を効果的に形成した。
従って、本開示により、記載された細胞内自己分解サルモネラ菌株STLT2+P13+19が、サルモネラワクチン株として使用できることが明らかになった。この株は、sseAプロモーターによって転写制御されたバクテリオファージP22の溶菌遺伝子13及び19を保有している。STLT2+P13+19の菌の増殖、生存率、HD11細胞への付着は、野生型と同様である。対照的に、STLT2+P13+19は、細胞内生存率が大幅に低下し、HD11細胞において炎症性サイトカインとエンドソームTLRを有意に誘導した。in vivoモデルに基づくと、鶏におけるSTLT2+P13+19ワクチン接種は、サルモネラ(特にSTY)の腸内コロニー形成を有意に減少させ、炎症性反応を刺激し、腸内微生物組成を調節する。したがって、本開示は、STLT2+P13+19を、鶏のサルモネラワクチン株として使用することを実証し、これは、鶏肉汚染のリスクを低減し、ヒトにおける食物由来のサルモネラ中毒の予防に貢献する可能性がある。
以下に列挙され、本明細書で参照される文書は、本明細書の明示的開示と矛盾する記述、主題のディスクレーマーまたは否認を除き、また、組み込まれた資料が本明細書の明示的開示と矛盾する範囲を除き(その場合、本開示の文言が統制する)、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。以下の文献の参照による組み込みは、組み込まれた資料が本開示の先行技術であることを出願人が認めたものとはみなされず、また、いかなる文書も本開示の特許性にとって重要であるとみなされないものとする。
前述の実施例は説明のために提供されたものであり、本開示の範囲を限定するものではない。
Claims (20)
- ホリンタンパク質をコードするように、且つ、リゾチームをコードするように、細菌のゲノムが改変されている改変細菌。
- 細菌が非病原性である、請求項1に記載の改変細菌。
- 細菌が非病原性サルモネラである、請求項2に記載の改変細菌。
- 非病原性細菌が、サルモネラ・エンテリカ(SE)である、請求項3に記載の改変細菌。
- SEが、SE細胞内自己分解性SE血清型ティフィムリウム(S.ティフィムリウム)である、請求項4に記載の改変細菌。
- ホリンタンパク質が、サルモネラ・ティフィムリウム-特異的バクテリオファージP22の遺伝子13によってコードされ、リゾチームが、サルモネラ・ティフィムリウム-特異的バクテリオファージP22の遺伝子19によってコードされる、請求項5に記載の改変細菌。
- ホリンタンパク質をコードする遺伝子及びリゾチームをコードする遺伝子が、内因性細菌プロモーターに作動可能に連結されている、請求項6に記載の改変細菌。
- 内因性細菌プロモーターがsseAプロモーターである、請求項7に記載の改変細菌。
- ホリンタンパク質をコードする遺伝子及びリゾチームをコードする遺伝子が、内因性sseAプロモーターの下流で細菌の染色体に導入される、請求項8に記載の改変細菌。
- ホリンタンパク質及びリゾチームのsseA促進発現が、細胞内自己分解をもたらす、請求項9に記載の改変細菌。
- 請求項1~10のいずれか1項に記載の改変細菌の有効量を、それを必要とする動物に導入することを含む方法であって、前記導入が、動物の細菌感染に対して予防的又は治療的効果を有する、方法。
- 改変細菌が経口的に個体に導入される、請求項11に記載の方法。
- 改変細菌を導入することが、個体において炎症性サイトカインの産生を刺激する、請求項12に記載の方法。
- 改変細菌を導入することが、個体内のサルモネラを減少させる、請求項13に記載の方法。
- サルモネラを減少させることが、サルモネラの腸内コロニー形成、サルモネラの糞便排出、又はそれらの組み合わせを減少させることを含む、請求項14に記載の方法。
- 個体が鳥類動物である、請求項15に記載の方法。
- 請求項1~10のいずれか1項に記載の改変細菌を含むワクチン製剤。
- 請求項1~10のいずれか1項に記載の改変細菌を含む製品であって、改変細菌を保持する密封可能な容器を含む、製品。
- 改変細菌が凍結保存又は凍結乾燥されている、請求項18に記載の製品。
- 改変細菌を、それを必要とする個体に投与するための指示を提供する印刷物をさらに含む、請求項18に記載の製品。
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