MX2008012057A - Vacuna de salmonera con virus vivos atenuada. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a cepas mutantes dobles y triples atenuadas de una bacteria que infecta especies veterinarias, como Salmonella en(erica y/o Escherichia coli (una patogénica); los mutantes de la invención contienen por lo menos una primera modificación genética y por lo menos una segunda modificación genética, dicha primera modificación en uno o más genes de movilidad, y dicha segunda modificación en uno o más genes involucrados en la supervivencia o la proliferación del patógeno en el hospedador; la presente invención también se refiere a vacunas atenuadas vivas a base de dichos mulantes para la prevención contra otras Salmonellosis y/o una infección por un patógeno de E. coli en una especie veterinaria.

Description

VACUNA DE SALMONELA CON VIRUS VIVOS ATENUADA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a mutantes bacterianos atenuados, en particular a mutantes atenuados de Salmonella entérica y a una vacuna con virus vivos atenuada que comprende los mismos. Los mutantes dobles, triples, múltiples de la invención permiten con ventaja una diferenciación serológica entre los animales vacunados y los animales (no vacunados) que se han expuesto a un campo natural tal como el campo natural de S. entérica. Las salmonellas son bacilos Gram-negativos, anaerobios facultativos, móviles, que fermentan azúcares distintos de la lactosa, que pertenecen a la familia de las enterobacterias. Las salmonelas habitualmente se transmiten a los seres humanos por el consumo de alimentos contaminados y producen salmonelosis. E. coli es otro miembro de la familia de las Enterobacteriaceae. Las salmonelas se han aislado de muchas especies animales incluyendo, las vacas, los pollos, los pavos, las ovejas, los cerdos, los perros, los gatos, los caballos, los monos, las focas, los lagartos y las serpientes. El 95% de los patógenos importantes de Salmonella pertenecen a S. entérica, con la S. entérica serovariedad Typhimurium (S. Typhimurium) y S. entérica serovariedad Enteritidis (S. Enteritidis) las formas más frecuentes.

Las infecciones por Salmonella son un problema médico y veterinario grave en todo el mundo y producen preocupación en la industria alimentaria. El alimento contaminado no puede identificarse fácilmente. El control de la salmonelosis es importante, para impedir infecciones humanas potencialmente letales y considerables pérdidas económicas en la industria conservera de animales. La presencia omnipresente de la Salmonella en la naturaleza complica el control de la enfermedad precisamente por la detección y erradicación de animales infectados. Se han probado varias estrategias de control basadas en los principios de exclusión competitiva y vacunación para controlar la infección de por ejemplo, las aves de corral. La vacunación de animales de granja se considera con frecuencia la vía más eficaz para prevenir las zoonosis producidas por la Salmonella. Las vacunas atenuadas de células completas y las vacunas de subunidades se utilizan en la prevención de las infecciones por Salmonella en los animales y en los seres humanos con resultados variables. Las vacunas inactivadas en general proporcionan poca protección frente a la salmonelosis. Las vacunas de Salmonella atenuadas con virus vivos son potencialmente superiores a las preparaciones inactivadas debido a: (i) su capacidad para producir inmunidad mediada por las células además de respuestas al anticuerpo; (ii) la administración oral sin riesgo de contaminación por la aguja; (iii) eficacia después de la administración de una sola dosis; (iv) producción de respuestas inmunitarias en múltiples puntos de la mucosa; (v) bajo coste de producción; y (vi) su posible utilización como vehículos para la administración de antígenos recombinantes al sistema inmunitario. Se ha probado la eficacia de las siguientes cepas mutantes atenuadas para provocar una respuesta inmunitaria protectora en los animales tratados: (1 ) cepas que llevan mutaciones en los genes aro (Alderton et al., 1991, Avian diseases 35: 435-422; Schiemann y Montgomery, 1991, Veterinary Microbiology 27: 295-308), (2) cepas que llevan eliminaciones en los genes cya (adenilato ciclasa) y/o crp (receptor de AMP cíclico) (patentes US. n° 5.389.368; US n° 5.855.879; US n° 5.855.880; Hassan y Curtiss, 1997; Avian Diseases 41:783-791; Porter et al. 1993, Avian Diseases 37:265-273) y (3) cepas que llevan mutaciones en los genes del operón guaB/k de S. typhi ( Wang et al., 2001, Infection and Immunity 69:4734-4741; documento WO 99/58146 y patente US n° 6.190.669). Hasta ahora solamente la cepa Megan® Vac1 de vacuna, que lleva consigo eliminaciones en los genes cya y crp ha sido eficaz, al menos en parte. Esta cepa no proporciona protección completa (http://www.meganhealth.com/meqanvac.html). McFarland y Stocker ( 1987, Microbial pathogenesis 3:129-141) describieron la virulencia de los mutantes de la inserción de guaA y guaB Tn10 de S. Typhimurim y S. dublin en ratones BALB/c. A alta dosis (2.5* 107 CFU para S. Typhimurium y 104 cfu para S. dublin), estos autores describieron una letalidad significativa de los animales, procedente de la multiplicación de la cepa auxótrofa. Asimismo el muíante AguaB demostró no ser candidato adecuado para una protección firme y segura contra la fiebre tifoidea. Esté presentó una virulencia residual significativa en los ratones (Wang et al., 2001 ). Hay por lo tanto todavía necesidad de cepas de la vacuna de Salmonella atenuadas con virus vivos, así como de cepas de la vacuna de Salmonella atenuadas con virus vivos mejoradas de bacterias que infectan especies veterinarias en general. Los animales vacunados con frecuencia producen anticuerpos contra diferentes antígenos del patógeno. El problema es que los anímales vacunados como tales no pueden ya distinguirse de los animales que han estado en contacto con una cepa de ámbito natural tal como la cepa del ámbito de Salmonella, y son posiblemente infectadas con ésta. Por lo tanto, existe también necesidad de cepas atenuadas con microbios vivos mejoradas similares a las cepas de la vacuna atenuada contra Salmonella que harían posible dicha diferenciación.

Objetivos de la invención Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar cepas de Salmonella entérica atenuadas con una mutación doble o triple. Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una vacuna con virus vivos atenuada contra la salmonelosis y procedimientos de prevención basados en la misma. Todavía otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar cepas de Salmonella atenuadas que son útiles como vector con microbios vivos y como vacunas mediadas por ADN que expresan xenoantígenos. Dichas cepas son muy adecuadas para el desarrollo de vacunas incluyendo las vacunas polivalentes. Todavía otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento para conseguir mutantes por eliminación de S. entérica de la invención. Además otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una cepa de Salmonella atenuadas que permite una diferenciación serológica entre animales vacunados y no vacunados incluso posiblemente de animales infectados. Además otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar los mismos materiales y procedimientos para la preparación de cepas atenuadas de bacterias que infectan especies veterinarias en general, más en particular aves de corral.

El objetivo general consiste en mejorar la seguridad de los alimentos y la salud de los animales.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Algunos mutantes de Salmonella entérica auxótrofos de AguaB con una mutación por eliminación en el gen guaB presentan virulencia residual. Se descubrió que modificaciones adicionales (preferentemente eliminaciones) en uno o más genes implicados en la movilidad reducían la virulencia restante sin afectar las capacidades inmunógenas de la cepa. Un primer aspecto de la invención por consiguiente se refiere a una cepa muíante atenuada de una bacteria que infecta especies veterinarias, en particular una cepa mutante atenuada de S. entérica, en la que dicha cepa mutante contiene por lo menos una primera modificación genética y por lo menos una segunda modificación genética, dicha primera modificación en uno o más (por lo menos uno) genes con movilidad y dicha segunda modificación en uno o más (por lo menos uno) genes implicados en la supervivencia o en la proliferación de la bacteria o del patógeno (por ejemplo S. entérica) en el hospedador. La expresión "especie bacteriana que infecta la bacteria" en el contexto de la invención se refiere en particular a bacterias que son patógenas para especies veterinarias, y que pueden ser atenuadas mediante las modificaciones genéticas anteriores. La especie veterinaria que infecta la bacteria puede ser una bacteria Gram-negativa. Para las aves de corral se prefieren las bacterias Gram-negativas tales como Salmonella, Pasteurella, Escherichia coli, etc. Las más preferidas son Salmonella entérica y E. coli (patógena). "Patógena para" significa que la bacteria, si no está atenuada, es capaz de producir una enfermedad infecciosa en la especie veterinaria. Las modificaciones genéticas de la invención conducen favorablemente a una función inválida, en otras palabras alteran o afectan la función génica. La modificación en el presente contexto se denomina también "modificación por alteración". La modificación se dice que inactiva el gen en cuestión. Con ventaja, dicha inactivación produce atenuación, por lo menos en un grado que la cepa mutante es adecuada para su utilización en una vacuna con microbios vivos atenuada. La modificación genética puede ser una inserción, una eliminación y/o una sustitución de uno o más nucleótidos en dichos genes. Las cepas mutantes según la invención por dicha modificación están afectadas en una función génica de movilidad y en una función génica necesaria para la supervivencia o la proliferación del patógeno, que conduce a una función inválida (no se forma ningún producto génico funcional) de los genes afectados. Se prefieren mutantes por eliminación, ya que un mutante por inserción puede revertir, restaurando de este modo la patogenicidad de la cepa. La primera modificación consiste en uno o más ( 1 , 2, 3, .. .) genes con movilidad. Ejemplo de un gen implicado en la movilidad son los genes que codifican la flagelina. El mutante de la invención puede tener una modificación (alteración) en los genes fliC y/o el fljB o el fljBA respectivamente (fliC; fljB; fljBA; fliC y fljB; fliC y fljBA; . . . ). Favorablemente los mutantes, en los que se han eliminado todos los genes que codifican la flagelina, son incapaces de congregarse en el medio LB que contiene agar-agar al 0.4% y pueden de este modo distinguirse fácilmente de las cepas móviles naturales. La segunda modificación genética consiste en uno o más genes ( 1 , 2, 3, . . . ) implicados en la supervivencia o en la proliferación del patógeno en su hospedador. Dicho gen puede ser un gen constitutivo o un gen con virulencia. Un ejemplo de un gen constitutivo que puede conducir a cepas atenuadas cuando la función génica está afectada, es el gen guaB que codifica la enzima IMP deshidrogenasa. Dicho mutante es incapaz de formar de nuevo nucleótidos de guanina. También son posibles modificaciones por alteración en el operón guaBA, que conducen favorablemente a una función inválida del gen o genes que codifica(n) o regula(n) la actividad propia de IMP deshidrogenasa. Favorablemente, las cepas mutantes atenuadas de la invención son inmunógenas. La presente invención en particular tiene por objeto proporcionar cepas atenuadas de S. Enteritidis y S. Typhimurium. Preferentemente las modificaciones genéticas de la invención se introducen en una cepa progenitora 76Sa88 tipo 4 del fago S. Enteritidis o en una cepa precursora 1491 S96 de S. Typhimurium. La cepa 76Sa88 es una cepa clínica procedente de un pavo, obtenida en el Veterinary and Agrochemical Research Centre, Groeselenberg 99, B-1 180 Ukkel, Bélgica, que alberga el plásmido pKD46 de replicación sensible a la temperatura, que codifica al sistema de bacteriófago Lambda Red recombinasa. La cepa 1491 S96 es una cepa clínica procedente de un pollo. Una de las cepas atenuadas de S. entérica obtenida según la invención es la cepa SM73 de S. Enteritidis que tiene el número de depósito LMG P-21642. Otro ejemplo es la cepa SM89 atenuada de S. Typhimurium que tiene el número de depósito LMG P-21643. Un muíante preferido de la invención lleva o comprende una modificación genética en el gen guaB y una modificación genética en el gen fliC. Otro mutante preferido de la invención lleva o comprende una modificación genética en un gen guaB y una modificación genética en los genes fljBA. Las cepas adecuadas de la invención son muy adecuadas para su utilización en una vacuna atenuada con virus vivos. Las cepas mutantes de la invención pueden codificar y expresar un xenoantígeno. Otro aspecto de la invención se refiere a una vacuna para inmunizar una especie veterinaria contra una infección bacteriana que comprende: - una cantidad farmacéuticamente eficaz o ¡nmunizadora de una cepa mutante atenuada según la invención; y - un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La presente invención se refiere en particular a vacunas que comprenden cepas mutantes atenuadas de S. entérica o E. coli. En general se administran aproximadamente de 102 cfu a aproximadamente 1010 cfu, preferentemente aproximadamente 105 cfu a aproximadamente 1010 cfu (ejemplos de una cantidad farmacéuticamente eficaz o inmunizadora). Una dosis inmunizadora oscila según la vía de administración. Los expertos en la materia pueden encontrar que la dosis eficaz para una vacuna administrada por vía parenteral puede ser inferior a la de una vacuna similar que se administre mediante agua potable y similares. Las cepas atenuadas de la invención y las composiciones farmacéuticas o las vacunas que comprenden las mismas son muy adecuadas para inmunizar animales tales como, especies veterinarias, ganado y más específicamente aves de corral. Por ejemplo, las cepas atenuadas de Salmonella de la invención, y las composiciones farmacéuticas o las vacunas que comprenden las mismas, son muy adecuadas para inmunizar especies veterinarias y en particular aves de corral tales como pollos frente a la salmonelosis y posiblemente otras enfermedades (por ejemplo, en el caso de un vacuna polivalente). Las cepas atenuadas de la invención son particularmente adecuadas para proteger la especie animal/veterinaria en cuestión contra un ataque por el patógeno (la bacteria que infecta especies veterinarias) en cuestión.

Un aspecto adicional de la invención se refiere por consiguiente a un procedimiento de inmunización de animales, preferentemente especies veterinarias, más preferentemente aves de corral tales como pollos contra una enfermedad producida por una bacteria que infecta especies veterinarias, comprendiendo dicho método las etapas siguientes: - administrar al animal o especie veterinaria que lo necesita un agente inmunizador de una cepa mutante atenuada de la invención y/o de una vacuna que comprende la misma, con lo que a continuación se provoca una respuesta inmunitaria protectora en el animal o especie veterinaria. La presente invención en particular se refiere a los procedimientos de inmunización de especies veterinarias contra la salmonelosis o contra una infección por E. coli patógena. Ejemplos de especies veterinarias que van a ser inmunizadas contra la salmonelosis: aves de corral, ganado pequeño o pesado tales como pollos, pavos, patos, codornices, gallinas de Guinea, cerdos, ovejas, terneras, vacas, etc. Se administra una cantidad inmunizadora a estos animales, preferentemente por vía oral, nasal o parenteral. Un aspecto adicional de la invención se refiere a una cepa mutante de la invención para su utilización como medicamento (por ejemplo para su utilización en una vacuna). Otro aspecto todavía de la invención se refiere a la utilización de una cepa mutante atenuada de la invención para la preparación de un medicamento, tal como una vacuna, para la prevención (y/o tratamiento) de una enfermedad producida por un patógeno (la bacteria que infecta especies veterinarias) tal como la salmonelosis. Los ejemplos de animales o especies veterinarias que se va a tratar y dosis recomendadas se proporcionan anteriormente. Todavía otro aspecto de la invención se refiere a la utilización de mutantes de la invención, y en particular a mutantes de flagelina, como marcadores serológicos para distinguir entre los animales vacunados y los animales que están infectados de manera natural, es decir que se han puesto en contacto y llegan a infectarse por una cepa natural. La invención, por ejemplo, se refiere a un procedimiento para una diferenciación serológica entre los animales vacunados y los animales infectados por una cepa natural, en el que los animales vacunados han sido inmunizados con una cepa mutante en la que un gen de flagelina está inactivado, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes: ensayar en animales la presencia de anticuerpos construidos contra la flagelina, distinguir los animales infectados de los animales vacunados basándose en la presencia o ausencia de dichos anticuerpos. El procedimiento de la invención convenientemente es un procedimiento in vitro. Convenientemente los animales infectados por salmonelas se distinguen como tales de los animales que han sido inmunizados con una vacuna atenuada con microbios vivos según la invención.

Los animales de granja, tales como las aves de corral y en particular los pollos se sabe que generan anticuerpos contra los productos del gen de la flagelina y en particular el producto del gen FliC. Los anticuerpos en cuestión serán detectados de este modo en un animal infectado por una cepa natural (que genera dichos anticuerpos), no obstante no en un animal que ha sido vacunado con una cepa mutante en la que un(os) gen(es) de flagelina está(n) inactivado(s). Estos últimos no generan anticuerpos contra por ejemplo, FliC y/o FljB. La presencia de dichos anticuerpos es indicadora de la presencia de cepas naturales y de este modo de la infección. El procedimiento de la invención de este modo permite con ventaja la detección o el diagnóstico de una infección por Salmonella en los animales vacunados por una cepa mutante en los que un(os) gen(es) de flagelina está(n) inactivado(s). Dicha cepa mutante puede ser una de las cepas de la invención descritas anteriormente en la presente memoria. La inactivación de los genes de flagelina tal como fliC, permite de este modo la utilización de pruebas serológicas, por ejemplo, basadas en la detección de la proteína FliC, para el diagnóstico de la presencia de cepas naturales, tal como de S. entérica natural, en animales (vacunados). En el procedimiento de la invención en los animales se ensayan preferentemente anticuerpos contra FliC. El procedimiento de la invención es aplicable en particular a aves de corral, más preferentemente a pollos.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Se descubrió sorprendentemente que la combinación de la mutación de flagelina (una modificación por alteración en un gen que codifica flagelina; denominada también mutación flagelada) y una mutación auxótrofa pueden conducir a cepas atenuadas muy inmunógenas de S. entérica. Las cepas mutantes según la invención llevan o comprenden una(s) (por lo menos una) modificación o modificaciones en un(os) gen(es) con movilidad y una(s) (por lo menos una) modificación o modificaciones en un(os) gen(es) implicado(s) en la supervivencia o la proliferación del patógeno en su hospedador. Un gen implicado en la supervivencia o proliferación puede ser un gen constituido y/o un gen con virulencia. Ejemplos de dichos genes constituidos y de genes con virulencia pueden encontrarse en (Mastroeni et al., 2000, The Veterinary Journal 161:132-164, incorporada como referencia a la presente memoria). Un ejemplo preferido de un gen constitutivo es el gen guaB, incluso puede imaginarse también una modificación en un gen aro, pur, dap, pab, sipC, phoP, phoQ, pagC, cya, y/o crp. El término "gen" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la secuencia de codificación y a sus secuencias reguladoras tales como las señales de activación y terminación. Dicha inactivación puede obtenerse mediante una eliminación mediante la cual la función del gen guaB se altera. Un experto en la materia conoce cómo obtener dichos mutantes y una prueba sencilla puede decir si la función del gen está alterada. Por ejemplo, la cepa mutante que no puede expresar un producto del gen guaB funcional en medio Mínimo A, a menos que este medio esté enriquecido con guanina, xantina, guanosina o xantosina. Otro ejemplo sencillo puede decir si una función del gen con movilidad tal como si se altera una función del gen de flagelina. Estos mutantes no se congregan en un medio LB que contiene agar-agar al 0.4%. Las modificaciones en los genes en cuestión producirían atenuación de las cepas mutantes, preferentemente por lo menos hasta un grado que sean adecuadas para su utilización en una vacuna con microbios vivos. Los ejemplos que se proporcionan a continuación demuestran que las mutaciones adicionales en un(os) (por lo menos uno; uno o más) gen(es) con movilidad (fliC, fljB y/o fljBA) con ventaja alivió la patogenicidad residual de un mutante por eliminación de guaB y mejoró la protección de los animales inmunizados contra la prueba de provocación con una dosis letal de S. entérica natural. El filamento flagelado de todos los miembros del género Salmonella es un polímero de una sola proteína, la proteína flagelina (van Asten et al., 1995, Journal of Bacteriology 1 77: 1610-1613). FliC es la proteína de la subunidad del filamento en fase 1 de la flagelina {Ciacci-Woolwine et al., 1998, Infection and Immunity 66: 1 127-1 134).

S. Typhimurim tiene dos genes de flagelina (fliC y fljB) que están situados en diferentes puntos del cromosoma y que presentan variación de fase. El activador de fljB forma parte de un fragmento cromosómico que puede invertirse por recombinación específica en el punto. Dependiendo de la orientación, fljB se expresa junto con fljA, este último que codifica un represor del gen fliC; o fliC se lleva hasta expresión. E. coli, otro miembro de las enterobacterias, puede poseer también dos genes de flagelina que comparten respectivamente homología con los genes fliC y fljB de S. entérica ( Tominaga, 2004, Genes Genet. Syst. 79: 1-8). La inactivación del gen fliC en S. Enteritidis (que codifica la proteína flagelada mayor) aumentó tanto la seguridad como la eficacia de una vacuna administrada a la estirpe BALB/c de ratón consanguíneo. Esta estirpe es muy sensible a la salmonelosis generalizada. Esto demuestra entre otras cosas que la flagelina no es antígeno esencial para la provocación de una respuesta inmunitaria protectora contra la Salmonella en ratones BALB/c a pesar sin embargo de muchas indicaciones en la bibliografía. La flagelina de S. Enteritidis es inmunógena en pollos y lleva los determinantes antigénicos H:g,m (van Asten et al., 1995; Wyant et al., 1999, Infection and Immunity 67:1338-1346; Ogushi et al., 2001, The Journal of Biological Chemistry 276:30521-30526). Existen pruebas de que las flageladas de varias especies de bacterias Gram-negativas (por ejemplo las de S. Enteritidis y S. typhi) activan los monocitos para producir citocinas proinflamalorias (por ejemplo, el factor alfa de la necrosis tumoral) y median la activación de la cinasa asociada al receptor de interleucina-1 (IRAK). Se cree por lo tanto que la flagelina Gram-negativa desempeña una función importante y previamente no reconocida en la respuesta inmunitaria innata a las bacterias Gram-negativas. FliC puede ser de particular importancia durante el trascurso de las infecciones en el aparato digestivo (Ciacci-Woolwine et al., 1998; Wyant et al., 1999; Moors et al., 2001, Infection and Immunity 69:4424-4429). Existe mucha ambigüedad en la bibliografía en cuanto al grado en el que los flagelados contribuyen a la virulencia en aves de corral y/o seres humanos. Van Asten et al. (2000, FEMS Microbio!. Lett. 185: 175-9) han demostrado que la activación del gen de flagelina de S. Enteritidis reduce en gran medida (50 veces) la invasión en las células Caco-2 (estirpe celular de carcinoma de colon humano), mientras que la adherencia bacteriana no fue afectada realmente. Dicho informe se limita a resultados in vitro. Parker y Guard-Petter (2001, FEMS Microbiology Letters 204:287-291) por otra parte descubrieron que, en la prueba de provocación oral de pollos, un muíante fliC::Tn 10 fue igualmente virulento para el tipo natural. Esto indica que la presencia de flagelina no fue necesaria para conseguir por lo menos un nivel moderado de invasión después de la prueba de provocación oral. Cuando se aplica por vía subcutánea, los mutantes flagelados se atenuaron de manera significativa en comparación con la cepa natural. Existen por lo tanto muchas indicaciones en la técnica anterior que dan a conocer aparte de construcciones por ejemplo, mutantes dobles (o triples) de S. entérica según la invención. La inactivación de uno o más genes con movilidad ayuda a reducir la virulencia restante o por ejemplo los mutantes por eliminación de guaB pero existen también otras ventajas. La inactivación por ejemplo, del gen fliC permite con ventaja la utilización de pruebas serológicas, basadas en la detección de anticuerpos dirigidos contra la proteína FliC, para el diagnóstico de la presencia de S. entérica natural, por ejemplo, S. Enteritidis, en los animales (vacunados). La inmunodetección es posible por ELISA, por las técnicas RIA y/o cualquier otra prueba o formato inmunológicamente conocido. IDEXX Laboratories posee una prueba en el mercado (FlockChek® Salmonella Enteritidis Antibody Test Kit) para detectar de manera fiable anticuerpos contra determinantes H-antigénicos de la flagelina FliC de S. Enteritidis (epítopos flagelados H:g,m). Lo que se ha comentado anteriormente demuestra que los mutantes dobles y/o triples de S. entérica de la invención, que llevan una modificación genética (alteración) en un gen implicado en la supervivencia o la proliferación del patógeno en el huésped y en un(os) gen(es) implicado(s) en la movilidad presenta ventajas sobre las cepas atenuadas de S. entérica que forman parte de la técnica.

Las cepas mutantes de la invención son muy adecuadas para su utilización en una vacuna atenuada con virus vivos, tal como un vector con microbios vivos y/o una vacuna mediada por ADN. El término "vacuna" significa que incluye vacunas profilácticas así como terapéuticas. Preferentemente la vacuna es profiláctica. Las "Vacunas de vector con microbios vivos", denominadas también "vacunas vehículo" y "sistemas de administración de antígenos de microbios vivos", comprenden un área excitante y versátil de la vacunología (Levine et al., 1990, Microecol. Ther. 19:23-32). En este procedimiento, se modifica una vacuna vírica o bacteriana con microbios vivos de modo que expresa xenoantígenos protectores de otros microorganismos y administra los antígenos al sistema inmunitario, estimulando de este modo una respuesta inmunitaria protectora. Los vectores bacterianos vivos que se están publicando incluyen, entre otros, la Salmonella atenuada. Un objetivo de la invención consiste en proporcionar cepas mutantes atenuadas para su utilización en una vacuna con microbios vivos, posiblemente una vacuna con microbios vivos polivalente o multivalente. "Vacuna polivalente" o "vacuna multivalente" significa en particular una vacuna que comprende determinantes antigénicos de numerosos organismos diferentes causantes de enfermedades. Uno de los objetivos de la invención consiste, por consiguiente, en proporcionar una vacuna contra por ejemplo la salmonelosis que comprende: - una cantidad farmacéuticamente eficaz o inmunizadora de una cepa muíante atenuada de la invención; y - un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Otro objetivo de la invención consiste en proporcionar una vacuna con virus vivos de vector que comprende: - una cantidad farmacéuticamente eficaz o inmunizadora de un cepa muíante de la invención, en la que dicho mutante codifica y expresa un xenoantígeno; y - un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. El xenoantígeno específico empleado en el vector con microbios vivos no es crítico para la presente invención. Aún otro objetivo de la invención consiste en proporcionar una vacuna mediada por ADN que comprende: - una cantidad farmacéuticamente eficaz o una cantidad inmunizadora de una cepa mutante atenuada de la invención; en la que dicho mutante contiene un plásmido que codifica y se expresa en una célula eucariótica, un xenoantígeno; y - un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los detalles en cuanto a la construcción y utilización de vacunas mediadas por ADN pueden encontrarse en la patente US n° 5.877.159, que se ¡ncopora a la presente memoria como referencia en su totalidad. De nuevo, el xenoantígeno específico empleado en la vacuna mediada por ADN no es crítico para la presente invención.

La decisión de si expresar el xenoantígeno en el patógeno (utilizando un activador procariótico en una vacuna de vector con microbios vivos) o en las células invadidas por el patógeno (utilizando un activador eucariótico en una vacuna mediada por ADN) puede basarse en qué construcción de vacuna para este antígeno específico proporciona la mejor respuesta inmunitaria en los estudios con animales o en las pruebas clínicas, y/o, si la glucosilación de un antígeno es esencial para su inmunogenicidad protectora, y/o, si la configuración terciaria correcta de un antígeno se consigue mejor con una forma de expresión que con la otra (patente US n° 5.783.196). La expresión "Cantidad farmacéuticamente eficaz" significa una cantidad mucho mayor que la normal para superar (prevenir y/o tratar) la enfermedad en cuestión, por ejemplo la salmonelosís. "Cantidad inmunizadora" tal como se utiliza en la presente memoria significa de hecho una cantidad que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria (protectora) en el animal que recibe la composición/vacuna farmacéutica. La respuesta inmunitaria provocada puede ser una respuesta humoral, de las mucosas, local y/o celular. Como es sabido en la técnica las cantidades necesarias pueden depender de la edad, el sexo, el peso y de muchos otros factores. Los vehículos o diluyentes específicos farmacéuticamente aceptables empleados no son críticos para la presente invención y son convencionales en la técnica. Ejemplos de diluyentes incluyen: tampón para tamponar los ácidos gástricos en el estómago, tal como tampón de citrato (pH 7.0) que contiene sacarosa, tampón de bicarbonato (pH 7.0) solo o tampón bicarbonato (pH 7.0) que contiene ácido ascórbico, lactosa y opcionalmente aspartamo. Ejemplos de vehículos incluyen: proteínas, por ejemplo, como las que se encuentran en la leche desnatada; azúcares; por ejemplo sacarosa; o polividona. Los mutantes por eliminación según la invención se crearon por técnicas de recombinación homologas convencionales, por lo que el/los gen(es) completo(s) o por lo menos parte de los genes en cuestión en una primera etapa se sustituye(n) por un gen con resistencia y las secuencias de FRT adyacentes. Preferentemente, en una segunda etapa, dicho gen con resistencia se separa por recombinación entre las dos secuencias de FRT. Una secuencia de FRT y las secuencias P1 y P2 de cebado permanecen por el mecanismo molecular de la recombinación que elimina el gen con resistencia a antibióticos según Datsenko y Wanner (2000) (véase por ejemplo la Figura 4). La invención se describirá con más detalle en los ejemplos y formas de realización siguientes haciendo referencia a los dibujos adjuntos. Las formas de realización y ejemplos específicos no pretenden en modo alguno limitar el alcance de la invención reivindicada. El fundamento de los ejemplos proporcionados en la presente memoria para S. entérica son asimismo muy aplicables a otras bacterias (Gram-negativa) que infectan especies veterinarias, más en particular otras bacterias (Gram-negativas) para aves de corral tales como Pasteurella, E. coli (patógena), etc.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 proporciona una visión de conjunto esquemática de la serie de reacciones de la biosíntesis del monofosfato de guanosina. AICAR: 5'-fosforribosil-4-carboxamida-5-aminoimidazol; ATP: trifosfato de adenosina; G: guanina; GMP: monofosfato de guanosina; GR: guanosina; Hx: hipoxantina; HxR: ribósido de hipoxantina (inosina); IMP: monofosfato de inosina; X: xantina, XMP: monofosfato de xantosina; guaA: GMP sintetasa, guaB: IMP deshidrogenasa; guaC: GMP reductasa. La Figura 2 representa el contigo 1294 del genoma de S. Enteritidis (SEC. ID. n°: 19). El codón de iniciación ATG y el codón de terminación TGA del gen guaB están en negrita. N puede ser A, C, T o G. La Figura 3 representa la secuencia del fragmento guaB de S. Enteritidis clonado en p(JC18 (SEC. ID. n°: 20). Los cebadores que se utilizaron son los indicados por flechas horizontales. El fragmento generado con los cebadores GuaB6-GuaB7 se clonó en pUC 8. El codón de iniciación ATG y de terminación TGA del gen guaB de la enzima de restricción Smal CCCGGG se indican en negrita. La Figura 4 representa la secuencia nucleotídica del fragmento por PCR de S. Enteritidis, que incluye la eliminación de guaB, obtenida tras el secuenciado, utilizando el cebador GuaBI O (SEC. ID. n°: 21 ). El fragmento por PCR se amplió con los cebadores GuaB6-GuaB7, utilizando el ADN genómico completo del mutante SM20. La secuencia FRT restante está indicada en letra negrita en cursiva y los cebadores P1 y P2 por flechas (Datsenko y Wanner, 2000, PNAS 97:6640-6645). Los codones de iniciación ATG y de terminación TGA del gen guaB están indicadas en negrita. La Figura 5 representa el gen guaB de S. Typhimurium LT2, apartado 1 17 de 220 del genoma completo (SEC. ID. n°: 22). El codón de iniciación ATG y el codón de terminación TGA del gen guaB están en negrita. La Figura 6 presenta la secuencia nucleotídica obtenida después del secuenciado del fragmento por PCR ampliado con cebadores FNC1 -FNC2 en el ADN completo de los mutantes SM73 y SM89, utilizando los cebadores FliC1 y FliC2 (SEC. ID. n°: 23). La secuencia FRT restante se indica en letra negrita cursiva, los codones de iniciación ATG y de terminación TAA en negrita, y P1 y P2 están indicados con flechas. La Figura 7 presenta la secuencia nucleotídica obtenida después del secuenciado del fragmento PCR ampliado con los cebadores FljBA6-FljBA5 en el ADN completo del mutante SM48 de S. Typhimurium, utilizando el cebador FljBA6 (SEC. ID. n°: 24). El punto FRT restante está indicado en negrita, P1 y P2 están indicados con flechas.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Mutación auxótrofa que afecta al gen guaB Un mutante auxótrofo de la inserción de una S. Enteritidis natural se obtuvo por mutagénesis de la inserción. Solamente cuando se enriquece con guanina, xantina, guanosína o xantosina 0.3 mM pudo desarrollarse la cepa mutante en medio Mínimo A. Estos datos sugieren fuertemente que la mutación auxótrofa de la cepa afecta al gen guaB, que codifica la enzima IMP deshidrogenasa (EC 1 .1 .1 .205). Esta enzima transforma la ¡nosina-5'-monofosfato (IMP) en monofosfato de xantosina (XMP) como se indica en la Figura 1 . Un mutante de la inserción puede revertir, restaurando de este modo la patogenicidad de la cepa. Esto limita su aplicación en una cepa con virus vivos atenuada. En este aspecto se prefieren mutantes por eliminación. Se crearon por consiguiente y se probaron los mutantes por eliminación de guaB de S. Enteritidis y S. Typhimurium. Los genes guaB de ambas serovariantes se proporcionan en las Figuras 2 y 5.

EJEMPLO 2 Mutantes por eliminación de guaB Construcción de los mutantes por eliminación de guaB Se aplicó con este objetivo un procedimiento para generar mutaciones por eliminación en el genoma K12 de E. coli (Datsenko y Wanner, 2000, PNAS 97:6640-6645). Este procedimiento se basa la recombinación homologa, mediada por el sistema bacteriófago ? Red recombinasa, de un fragmento lineal de ADN generado por PCR en el que la secuencia guaB se sustituye por un gen con resistencia a antibióticos. Este gen con resistencia es adyacente a las secuencias de FRT y puede escindirse del genoma por recombinación específica para el sitio, mediada por la FLP recombinasa. Se aplicó PCR por solapamiento (Ho et al., 1989, Gene 77:51-59) para la eliminación de un segmento interno de 861 bp de la secuencia de codificación de guaB. El principio se basa en la utilización de dos series de cebador, GuaB3-GuaB4 (adyacente al extremo 5' del gen guaB). Ambas series contienen cebadores (GuaB4 y GuaB5) que son parcialmente complementarios y a los cuales se añade una secuencia de restricción Smal. Tras la hibridación de las secuencias complementarias resultantes y la elongación de la cadena, la PCR con los cebadores externos GuaB6 y GuaB7 generó un fragmento con una secuencia Smal de 6 pares de bases que sustituye a un segmento interno de 861 pares de bases de la secuencia de codificación guaB. Este fragmento AguaB se clonó en el vector pUC18 (véase la Figura 3). El gen con resistencia al cloranfenicol (cat) con sus secuencias FRT adyacentes se amplió utilizando los cebadores P1 y P2 (Datsenko y Wanner, 2000) y el ADN plásmido pKD3 (Datsenko y Wanner, 2000) como plantilla. Este fragmento de PCR se ligó en la secuencia Smal del fragmento AguaB clonado. El fragmento deseado se generó utilizando cebadores anidados (GuaB6-GuaB7). El fragmento por PCR resultante se electroporó en 76Sa88 de S. Enteritidis que alberga el plásmido pKD46 de replicación sensible a la temperatura, que codifica al sistema de bacteriófago Lambda Red recombinasa. Se probaron transformantes resistentes al cloranfenicol en medio Mínimo A y en medio Mínimo A enriquecido con guanina 0.3 mM. Los mutantes AguaB::catFRT se confirmaron por PCR utilizando las siguientes combinaciones de cebador: GuaB6-GuaB7, GuaB6-P2, GuaB7-P1 y P1 -P2. El muíante AguaBr.catFRT de S. Enteritidis (SM12) se electroporó con el plásmido pCP20 de replicación sensible a la temperatura, que codifica la FLP recombinasa, para eliminar el gen cat. La cepa AguaB de S. Enteritidis resultante se denominó SM20. El fragmento por PCR en el que está situada la eliminación se obtuvo utilizando ADN genómico completo del muíante SM20 y la combinación de cebador GuaB6-GuaB7. La mutación AguaB se confirmó por secuenciado, utilizando el cebador GuaBI O, de este fragmento (véase la Figura 4).

En el cuadro 1 se proporcionan las secuencias de todos los cebadores mencionados anteriormente. Para evitar la presencia de posibles mutaciones adicionales, producidas por la expresión del sistema de la Red recombinasa, se construyó una cepa isógena. La mutación AguaBr. catFRT de la SM12 mutante fue transducida por el bacteriófago P22 HT inf (Davis, R. W., Botstein D. y Roth, J.R. (1980) en Advanced Bacterial Genetics, A manual for genetic engineering. Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor, N. Y.) lisado de SM12 para 76Sa88 de S. Enteritidis natural. Se eliminó el gen car utilizando el plásmido pCP20. La cepa AguaB de S. Enteritidis resultante se denominó SM69 con el número de depósito LMG P-21641 . Se construyó un mutante AguaB de la cepa 1491 S96 de S. Typhimurium utilizando el mismo procedimiento y los mismos cebadores. La cepa resultante se denominó SM 9. SM86 (con el número de depósito LMG P-2 646) es la cepa isógena obtenida de la misma después de la transduccion de AguaBr.catFRT a la cepa 149 S96 utilizando un lisado del bacteriófago P22 HT int' úe SM9 y después la escisión del gen cat. Los mutantes SM19, SM20, SM69 y SM86 de AguaB son sensibles al bacteriófago P22 HT inf. Esto prueba la presencia de lipopolisacáridos (LPS) intactos.

Pruebas de virulencia y protección con el mutante SM20 por eliminación de quaB de S. Enteritidis en ratones Se probó la virulencia del mutante SM20 en ratones por infección oral de ratones BALB/c hembra de 6 a 8 semanas de vida (Pattery et al., 7999, Molecular Microbiology 33:791 -805) en dos experimentos independientes. Éstos se realizaron como se describió anteriormente. La cepa natural 76Sa88 de S. Enteritidis se probó en paralelo como referencia positiva. El mutante SM50 de 76Sa88 AaroA de S. Enteritidis se incluyó en el experimento como referencia de la vacuna. Este mutante lleva una eliminación precisa de la secuencia de codificación aroA completa y se construyó por el procedimiento de Datsenko y Wanner (2000). Los datos completos se dan en los cuadros 2 y 3. Estos resultados demuestran que el mutante SM20 de AguaB está muy atenuado en los ratones pero presenta todavía alguna patogenicidad residual cuando se administra a esta dosis elevada. La inmunización oral con el mutante produce inmunidad protectora contra la infección por una dosis alta de la correspondiente cepa 76Sa88 de S. Enteritidis natural patógena. La protección es por lo menos igual a la protección proporcionada por el mutante SM50 de AaroA de S. Enteritidis.

Pruebas de virulencia y protección con los mutantes SM69 y SM86 por eliminación de puaB isópeno en ratones Se probó la virulencia de los mutantes SM69 y SM86 en ratones por infección oral de ratones BALB/c hembra de 6 a 8 semanas de vida. Las pruebas se realizaron como se describió anteriormente. Las cepas naturales S. Enteritidis 76Sa88 y S. Typhimurium 1491 S96 se probaron en paralelo como controles positivos. Los datos completos se dan en los cuadros 6 y 7, y 10 a 13. Estos resultados demuestran que los mutantes SM69 y SM86 de AguaB están muy atenuados en los ratones, aunque presentan todavía alguna patogenicidad residual cuando se administra a esta dosis elevada. La inmunización oral con el mutante produce inmunidad protectora contra la infección por una dosis alta de la correspondiente cepa natural patógena.

EJEMPLO 3 Mutantes de flagelina de S. Enteritidis y S. Typhimurium Se probó a continuación si una modificación adicional (una más) del gen de movilidad (por ejemplo un gen de flagelina) podría reducir más la patogenicidad residual que queda en mutantes individuales como SM20 que lleva una mutación por eliminación en el gen guaB. Se utilizaron en experimentos preliminares cepas de S. Enteritidis que contienen únicamente un gen que codifica la flagelina, fiiC. Se construyeron mutantes dobles en los que los genes guaB y fliC de S. Enteritidis estaban inactivados. Para S. Typhimurium, se construyeron mutantes dobles (AguaBAfliC; AguaBAfljBA) y triples {AguaBAfliCAfljBA).

Construcción de mutantes ?/7/C (SM24, SM30) Utilizando la PCR la combinación del cebador FNCP1 -FNCP2 en el plásmido pKD3 (catFRT) o pKD4 {kanFRT) de la plantilla se amplía el fragmento recombinante que contiene el gen con resistencia a antibióticos junto con las secuencias FRT y las secuencias P1 y P2 de cebado y prolongaciones homologas para los 50 nucleótidos iniciales ( 1 -50) y los 50 terminales (1468-1518) de la secuencia de codificación fliC. En esta zona, 491 S96 de S. Typhimurium y 76Sa88 de S. Enteritidis presentan respectivamente una identidad de secuencia del 100% y 98% con los cebadores. El cebador FMCP1 contiene una G adicional en la posición 37 en comparación con la SEC. ID. n°: 22. Por consiguiente, el alelo mutante MiC codifica un péptido de 16 aminoácidos, del que los primeros 12 aminoácidos corresponden al terminal amino de FliC. Un segmento interno de 1416 bp (51 -1467) de la secuencia de codificación fliC ( 1 -1 518) será sustituido. El producto resultante de la PCR (1 pg) se electroporó a 1491 S96 de S. Typhimurium (pKD46) y 76Sa88 de S. Enteritidis (pKD46), previamente producido con arabinosa al 0.2%, que codifica el sistema de lambda recombinasa.

Los mutantes de la sustitución del candidato resistente a antibióticos fueron confirmados por PCR, utilizando los cebadores FNC1 y FHC2 y ADN completo de las cepas mutantes y la cepa natural. Se llevó a cabo análisis de restricción para distinguir entre los fragmentos de PCR con aproximadamente el mismo tamaño. Para la restricción del fragmento de PCR de S. Typhimurium natural ampliado con FliC1 -FliC2, se utilizó la enzima EcoRV. Se obtuvieron dos fragmentos (de 470 bp y 1021 bp). El fragmento ampliado para el mutante de la sustitución de fliC no contiene una secuencia de restricción. En el caso de S. Enteritidis se utilizó la enzima Apo\. Esta enzima corta el fragmento fliC natural de S. Enteritidis en 2 piezas (de 345 bp y 1 147 bp). El fragmento obtenido para el mutante por sustitución fliC no contiene una secuencia de restricción Apo\. Se probó la movilidad de los mutantes en el medio LB (Miller, 1992, A short course in bacterial genetics, a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) con agar-agar al 0.4%. S. Typhimurium natural y S. Enteritidis natural se congregan en este medio. El mutante por sustitución fliC de S. Typhimurium se aglomeran, ya que el gen fljB está todavía presente en el mutante. El mutante por sustitución fliC de S. Enteritidis no se aglomera más. Estos resultados fueron confirmados por observación al microscopio. Las células electrocompetentes de diferentes mutantes se prepararon y transformaron por electroporación con el plásmido pCP20 (producido a partir de ?3730 de S. Typhimurium, R. Curtiss, III, S.M. Kelly, P.A. Gulig, C.R. Gentry-Weeks and J. E. Galán. A virulent Salmonella expressing virulence antigens from other pathogens for use as orally-administered vaccines. En: J. Roth, Editor, Virulence Mechanisms, American Society for Microbiology, Washington DC (1988), pág. 311) para eliminar el gen con resistencia a antibióticos. Se incubaron transformantes a 43°C. Esto eliminará el plásmido pCP20 sensible a la temperatura y debería eliminar el gen con resistencia a antibióticos. Se confirmó la pérdida del gen con resistencia a antibióticos en los mutantes AfliC r.catFRT de S. Typhimurium y S. Enteritidis. Los mutantes por eliminación, que se originan a partir de los mutantes por sustitución del resistente al cloranfenicol, se confirmaron por PCR utilizando la combinación de cebador FIÍC1/FNC2. Tanto para AfliC de S. Typhimurium y AfliC de S. Enteritidis se amplió un fragmento de 85 bp. La eliminación se confirmó por secuenciado de los fragmentos ampliados utilizando el cebador FIÍC3. Los mutantes obtenidos se probaron en medio LB que contenía agar-agar 0.4%: S. Typhimurium natural y S. Enteritidis natural congregados en este medio, asimismo MiC de S. Typhimurium se aglomera (el gen flagelado fljB está todavía presente). Como cabía esperar no se aglomeró MiC de S. Enteritidis.

Construcción de mutantes de fljBA (SM48) S. Typhimurium contiene un segundo gen de flagelina, fljB. Este gen se expresa junto con fljA, que codifica el represor de fliC. En el presente caso, se eliminaron tanto fljA como fljB. fljB tiene 1 520 bp de longitud y codifica la proteína flagelina. fljA tiene 539 bp de longitud y codifica el represor de fliC. Longitud total del fragmento que se eliminó (fljBA): 2.127 bp. Se diseñaron cebadores que presentan homología de 51 nucleótidos con las secuencias del gen fljBA y homología con las secuencias del plásmido de la plantilla, que flanquean el gen con resistencia a antibióticos y las secuencias FRT. El cebador FljBAPI presenta homología con la secuencia que parte del codón de iniciación de fljB hasta 51 bp corriente abajo (1 -51 ) y el cebador FljBAP2 presenta homología con la secuencia de iniciación del codón de terminación de fljA hasta 51 bp corriente arriba (2076-2127). Los cebadores FljBAPI y FljBAP2 presentan homología en sus extremos 3' con las secuencias de cebado P1 y P2 en el plásmido de la plantilla que flanquea el gen con resistencia con las secuencias FRT. La PCR que utiliza los cebadores FljBAPI y FljBAP2 (secuencias en el cuadro 1 ) y el ADN pKD3 de la plantilla (catFRT) o pKD4 {kanFRT) ampliaron los fragmentos de longitud deseada. Se electroporó 1 pg del producto de PCR para S. Typhimurium, transformado con pKD46 o pKD20. Se confirmaron por PCR los transformantes resistentes a kanamicina y cloranfenicol seleccionados.

Se probaron los mutantes en medio LB que contenia agar-agar al 0.4%. S. Typhimurium, AfijBA .kanFRT de S. Typhimurium y AfljBA.catFRT de S. Typhimurium congregado (fliC está todavía presente). La movilidad de estas cepas se confirmó por observación al microscopio. Las células electrocompetentes de diferentes mutantes se prepararon y transformaron por electroporación con el plásmido pCP20 (producido a partir de ?3730 mutante de restricción de LT2 de S. Typhimurium) para eliminar el gen con resistencia a antibióticos. Después de 2 horas de incubación a 28°C se colocó el cultivo en placas en medio LB con carbenicilina. Tras la incubación de los transformantes a 43°C en LB se probaron en la pérdida de plásmido y del gen con resistencia a antibióticos. Se confirmaron las mutaciones por eliminación mediante la PROCARIÓTIC y el secuenciado del fragmento. La PCR que utiliza la combinación de cebadores FljBA6/FljBA5 (secuencia en el cuadro 1 ) amplió un fragmento de 21 12 bp para S. Typhimurium natural y un fragmento de 185 bp para el mutante SM48 de AfljBA de S. Typhimurium. Se confirmó la eliminación en el mutante SM48 por secuenciado utilizando el cebador FljBA6 en el fragmento por PCR obtenido utilizando los cebadores FljBA6-FljBA5 (Figura 7).

Construcción del mutante doble 1491 S96 MjBAMiC de S. Typhimurium (SM23) Se utilizó la cepa AfljBA::kanFRT (pKD46) de S. Typhimurium para construir el mutante doble. Se prepararon células electrocompetentes a una temperatura de 28°C (plásmido pKD46 sensible a la temperatura). Las células electrocompetentes se electroporaron con el fragmento fliC recombinante, en el que el gen fliC está sustituido por el gen con resistencia al cloranfenicol (véase los ejemplos al principio). Para identificar y confirmar los mutantes experimentales se siguió el procedimiento utilizado en la construcción del mutante fliC. Genotipo deseado: AfljBA::kanFRT AfliCr.catFRT de S. Typhimurium. Para eliminar el gen con resistencia al antibiótico se siguió el protocolo descrito anteriormente. Se confirmaron por PCR las eliminaciones en AfljBA AfliC (SM23) de S. Typhimurium. El mutante doble AfljBA AfliC de S. Typhimurium (SM23) cabe esperar que no sea móvil en el medio LB con agar-agar al 0.4%. La inmovilidad de la cepa se confirmó por observación al microscopio.

Combinación de las mutaciones auxótrofas y flageladas Se utilizó la transducción de P22 {Davis, R. W., Botstein D. y Roth, J.R. (1980) en Advanced Bacterial Genetics, A manual for genetic engineering. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.) para combinar las mutaciones. Los lisados de P22 de los mutantes por sustitución se utilizaron para construir los mutantes por eliminación combinados. Se confirmó la transducción por PCR (se utilizaron el mismo protocolo y cebadores que en las confirmaciones anteriores). Para la eliminación de los genes con resistencia al antibiótico se utilizó el protocolo descrito anteriormente que utiliza el plásmido cooperador pCP20. Se confirmaron las eliminaciones por PCR. Los mutantes construidos de esta manera son: AfliC AguaB de S. Typhimurium (SM32), AfljBA AguaB de S. Typhimurium (SM35), AfliC AfljBA AguaB de S. Typhimurium (SM27) y AfliC AguaB de S. Enteritidis (SM21 ).

Construcción de mutantes isógenos por eliminación Para excluir la posibilidad de que mutaciones desconocidas adicionales (que pueden tener efecto sobre la atenuación de las cepas) estén presentes en las cepas de vacuna experimentales, dedicadas a la utilización del método descrito por Datsenko y Wanner (2000) para la construcción de los mutantes por eliminación, se construyeron mutantes isógenos por eliminación. Las mutaciones se transdujeron al fondo natural, por medio de transducción del fago P22 (Davis, R. W., Botstein D. y Roth, J.R. (1980) en Advanced Bacterial Genetics, A manual for genetic engineering. Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor, N. Y.). Se utilizaron mutantes por sustitución resistentes al antibiótico como cepa donante. Para la eliminación de los genes con resistencia al antibiótico y confirmación de las deleciones, se utilizaron los mismos protocolos que en los experimentos anteriores.

Mutantes construidos: AguaB de S. Enteritidis (SM69, con el número de depósito LMG P-21 641 ); AfliC de S. Enteritidis (SM71 ); AguaB de S. Typhimurium (SM86, con el número de depósito LMG P-21646); AfliC de S. Typhimurium (SM91 ); AfljBA de S. Typhimurium (SM90), AguaB AfliC de S. Enteritidis (SM73, con el número de depósito LMG P-21642); AguaB AfliC de S. Typhimurium (SM 04); AguaB AfljBA de S. Typhimurium (SM87); AfljBA AfliC de S. Typhimurium (SM83); AguaB AfljBA AfliC de S. Typhimurium (SM89, con el número de depósito LMG P-21643).

EJEMPLO 4 Experimentos de virulencia y protección con las cepas de la vacuna con S. Enteritidis Efecto de la inactivación del gen fliC sobre la virulencia de una cepa de la vacuna de S. Enteritidis Para estudiar el efecto de la inactivación del gen fliC sobre la inmunogenicidad de la cepa de la vacuna con S. Enteritidis, se realizaron dos pruebas independientes de virulencia y protección en ratones BALB/c hembra de 7 semanas de vida tanto con el mutante SM20 (AguaB) y SM 21 (AguaB AfliC) (Cuadros 4 y 5). Para el ensayo de virulencia, se infectaron los ratones por vía oral con una dosis de aproximadamente 108 CFU, lo que corresponde a aproximadamente 105 veces el LD50 de la cepa natural (Pattery et al., 1999, Molecular Microbiology 33:791 -805). Se observaron los ratones durante 21 días. Todos los ratones inoculados con la cepa 76Sa88 de S. Enteritidis natural murieron en 9 días después de la infección, mientras que los ratones de referencia no infectados permanecieron sanos durante el periodo de observación de 21 días. El primer ratón del experimento infectado con el muíante SM20 guaB de S. Enteritidis presentaba síntomas típicos de la enfermedad (actividad reducida, pelo desordenado y dorso curvado) y uno de cada diez murieron. En el segundo experimento no se observaron síntomas de la enfermedad con SM20. El muíante SM21 de guaB AfliC de S. Enteritidis fue asiníomálico en ambos experimentos.

Eficacia de los mutantes SM2Q y SM21 para proporcionar protección: pruebas de protección La eficacia de los muíanles SM20 y SM21 para proporcionar protección se probó tres semanas después de la inmunización inicial mediante prueba de provocación oral con aproximadamenle 105 LD50 de la cepa 76Sa88 de S. Enteritidis natural (LD50= 03 CFU). Se observaron los ratones durante 21 días. Todos los ratones no inmunizados murieron después de la prueba de provocación. En el segundo experimento, murió uno de cada tres ratones vacunados con SM20. Todos los demás ratones vacunados sobrevivieron a la prueba de provocación sin síntomas de enfermedad observables. Estos datos demuestran que ambos mutantes están atenuados y proporcionan protección contra la prueba de provocación con la cepa natural correspondiente. Para determinar qué mutaciones desconocidas no adicionales estaban presentes, que podrían contribuir a la atenuación de las cepas de vacuna experimentales, se transfirieron las mutaciones que contenían los genes con resistencia seleccionares a un fondo natural por transducción de P22 {Davis, R. W., Botstein D. y Roth, J.R. (1980) en Advanced Bacterial Genetics, A manual for genetic engineering. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.).

Eficacia de la inactivación del gen fliC sobre la virulencia de S. Enteritidis: pruebas de virulencia y protección con cepas isógenas Las pruebas de virulencia y protección en ratones BALB/c se repitieron con las cepas SM69 isógenas (AguaB), SM71 (AfliC) y SM73 (AguaB AfliC) tras la confirmación por PCR y caracterización fenotípica como se describió al principio. En este ensayo de virulencia, se incluyó un muíante de AfliC, para estudiar el efecto de la inactivación del gen flic sobre la virulencia de S. Enteritidis. Similares condiciones a las descritas anteriormente se utilizaron para los experimentos de virulencia y prueba de provocación. Los datos obtenidos para los transductantes SM69 y SM73 (Cuadros 6 y 7) confirmaron las observaciones hechas en los experimentos iniciales. La comparación entre ambos mutantes por eliminación guaB indica que el doble mutante SM73 AguaB AfliC de S. Enteritidis está más atenuada y proporciona mejor protección frente a la prueba de provocación con grandes dosis de la cepa natural que el mutante individual SM69 águaB de S. Enteritidis. El ensayo de virulencia realizado con el mutante SM71 MiC de S. Enteritidis demostró que este mutante permanecía virulento como cepa natural a las condiciones aplicadas.

Respuestas inmunolóqicas y producción de anticuerpos Cuarenta y cuatro días después de la inmunización inicial en el primer experimento, se recogieron muestras de sangre de la arteria de la cola de los ratones. Se determinaron los títulos de IgG del antilipopolisacárido (LPS) por medio del ensayo inmunosorbente con enzima ligada (ELISA) utilizando LPS (Sigma) de S. Enteritidis para recubrimiento. La comparación entre los sueros de los ratones inmunizados con SM20 y SM21 demostró que en ambos casos se produjeron respuestas de IgG del suero anti-LPS y que no se midieron diferencias significativas en el valor. La inmunización oral con una segunda y tercera dosis, 66 y 95 días después de la inmunización inicial no aumentó las concentraciones de IgG anti-LPS en el suero (datos no mostrados).

EJEMPLO 5 Experimentos de virulencia y protección con transductantes de S. Typhimurium Se realizaron experimentos de virulencia y protección con los transductantes en ratones BALB/c hembra de 7 semanas de vida. Se inocularon por vía oral a los ratones aproximadamente 108 células. Se observaron los ratones diariamente durante un periodo de 21 días. Después de este periodo, los ratones se sometieron a la prueba de provocación con 108 células de la cadena patógena natural, y los ratones se observaron durante un periodo de 21 días. En los cuadros 10 a 13 se apuntan los síntomas de la enfermedad y la tasa de supervivencia. Los mutantes flagelados individuales y dobles permanecieron muy virulentos cuando se administró por vía oral a todos los ratones muertos. Los ratones inoculados con el muíante guaB presentaban síntomas leves de enfermedades (los ratones habían luchado, solamente dos quedaban vivos). Los mutantes AguaB AfljBA, AguaB AfliC y AguB AfliC AfljBA combinados estaban muy atenuados. No se observaron síntomas de enfermedad durante el periodo de 21 días de observación tras la vacunación. Estos mutantes proporcionaron buena protección después de la prueba de provocación con una dosis elevada de la cepa natural. Solamente pudo observarse una actividad reducida de los ratones después de la prueba de provocación.

Estos resultados también demuestran que las mutaciones flageladas no afectan las capacidades inmunógenas de las cepas cuando se administran a ratones BALB/c. Las mutaciones flageladas pueden ser útiles como marcador serológico para distinguir entre la cepa de la vacuna y la cepa natural. La combinación de la mutación auxótrofa con la(s) mutación o mutaciones flagelada(s) da los mejores resultados en lo que se refiere a la virulencia reducida de los mutantes en ratones y a la protección frente a la correspondiente cepa natural. La atenuación de los mutantes por eliminación triple AguaB AfliC MjBA de S. Typhimurium y los mutantes por eliminación doble de S. Typhimurium, guaB AfljBA y AguaB AfliC, eran comparables.

EJEMPLO 6 Evaluación de la seguridad de las cepas de vacuna de S. enteritidis Evaluación de seguridad del mutante SM69 en pollos de un día de vida inoculados por las vías intratraqueal y de alimentación forzada por vía oral El objetivo de este estudio fue evaluar la seguridad de la cepa patrón SM69 mutante de AguaB de S. Enteritidis sembrada en pollos de un día de vida. Se utilizó la mortalidad como parámetro principal para la determinación de la seguridad.

Los pollos con un día de vida se agruparon por las patas y se colocaron al azar en cada uno de los cuatro grupos de tratamiento (Grupo 1 : SM69-IT, grupo 2: SM69-OG, grupo 3: PBS-IT y Grupo 4: PBS-OG). Después de la inoculación por siembra del patrón, las aves de los grupos 1 y 2 se colocaron en un separador y las de los grupos 3 y 4 en otro separador. Los pollos de los grupos 1 y 2 se inocularon con el patrón SM69 sembrado por vía intratraqueal (IT) o por vía de alimentación forzada por vía oral (OG), respectivamente, con un valor existente de 1 .3 * 108 cfu/0.2 mi por ave. A los pollos en los grupos 3 y 4 se les administraron 0.2 mi de PBS (solución salina tamponada con fosfato) por ave por vía intratraqueal o alimentación forzada por vía oral, respectivamente. Después de la inoculación de SM69 o de PBS, se observó la mortalidad de los pollos diariamente hasta 38 días después de la inoculación. El cuadro 8 resume los resultados de la mortalidad para los 4 grupos. En el grupo 1 , un ave murió durante la inoculación debido a traumatismo por inoculación. Dos aves murieron 2 días después de la inoculación (DPI). Tres aves murieron desde el día 3 al día 13 (a 3, 5 y 13 DPI respectivamente). Un total de 6 aves por lo tanto murieron en el grupo 1 . En el grupo 2, murieron dos aves en total. Una murió durante la inoculación debido al traumatismo por inoculación y otra murió al 5o día después de la inoculación. No murió ningún ave en los grupos tratados con PBS ya sea por vía intratraqueal o por alimentación forzada por vía oral.

Este estudio indica que la cepa SM69 mutante de AguaB de S. Enteritidis no es segura cuando se administra a razón de 1 .3 * 108 cfu por ave con un día de vida por vía intratraqueal o por alimentación forzada por vía oral.

Evaluación de la seguridad de SM69 en pollos de 2 semanas de vida inoculados por las vías intratraqueal y de alimentación forzada por vía oral Se evaluó a continuación la seguridad de la cepa SM69 mutante de AguaB de S. Enteritidis en pollos SPF de 2 semanas de vida por las vías intratraqueal y de alimentación forzada por vía oral. Se utilizó la mortalidad como criterio principal y el peso corporal como criterio secundario para la determinación de la seguridad. Las aves a las 2 semanas de vida se agruparon por las patas y se colocaron al azar en cada uno de los cuatro grupos de tratamiento: SM69-IT, SM69-OG, Poulvac ST-IT y PBS-IT. Diez aves del grupo 1 se inocularon con SM69 por vía intratraqueal; diez aves del grupo 2 se inocularon con SM69 por alimentación forzada por vía oral; diez aves del grupo 3 se inocularon con una vacuna con AroA' de S. Typhimurium (Poulvac® ST) por vía intratraqueal; y cinco aves del grupo 4 se inocularon con PBS por vía intratraqueal. Los pollos en los grupos 1 y 2 se inocularon con el patrón SM69 sembrado por vía intratraqueal o alimentación forzada por vía oral, respectivamente, con el valor real de 2.3 * 108 cfu/0.2 mi por ave. A los pollos del grupo 3 se les administró 2.2 ? 10 cfu/0.2 mi por ave de Poulvac® ST por vía intratraqueal. Los pollos del grupo 4 se administraron por vía intratraqueal con 0.2 mi de PBS por ave. Tras la inoculación, las aves de los grupos 1 y 2 del tratamiento se colocaron en un separador y las de los grupos 3 y 4 en otro separador. Tras las inoculaciones, se observó la mortalidad cada día hasta 21 días después de la inoculación. Se registró también el peso corporal de todas las aves al final del periodo de estudio (21 días). Se utilizaron Poulvac® ST y PBS como referencias del procedimiento intratraqueal. Durante el periodo de observación de 21 d ías, un ave del grupo de tratamiento intratraqueal SM69 (grupo 1 ) murió por un saco vitelino infectado. No se asoció ninguna mortalidad con la inoculación de SM69, lo que indica que la cepa SM69 es segura en el valor probado, 2.3 * 108 cfu por ave por las vías intratraqueal y de alimentación forzada por vía oral. Como cabía esperar, no se observó ninguna muerte ya sea en las aves tratadas con Poulvac® ST al valor de 2.2 ? 108 cfu por ave o en las aves tratadas con PBS, lo que indica que el estudio era válido (Cuadro 9). Se comparó el peso corporal entre los grupos en un análisis de modelo de varianza (ANOVA) con el peso corporal como variable dependiente y el tratamiento se incluyó como una variable independiente. Se hicieron comparaciones de los grupos utilizando la prueba de Tukey para comparaciones múltiples. El nivel de significación se fijó a una p <0.05. El estudio se consideró válido porque los pollos de referencia (grupo de referencia con PBS) permanecieron sanos y libres de signos clínicos o de enfermedades o mortalidad en todo el estudio. No hubo diferencias significativas en el peso corporal final en los pollos a los que se les administró SM69 por inoculación intratraqueal o de alimentación forzada por vía oral, Poulvac® ST o PBS (Cuadro 9). Aun cuando no se creó ninguna referencia de las aves en cada grupo a un día de vida, era improbable que hubiera una diferencia significativa en el peso corporal inicial entre los cuatro grupos ya que las aves se colocaron al azar en cada uno de los cuatro grupos de tratamiento. Puede sacarse en conclusión que SM69 es segura cuando se administra a un valor probado de 2.3 ? 108 cfu por ave a las 2 semanas de vida, ya sea por vía de inoculación intratraqueal o por alimentación forzada por vía oral.

Evaluación de la seguridad de SM73 en pollos de 1 d ía de vida inoculados por las vías intratraqueal y de alimentación forzada por vía oral Se evaluó la seguridad de la cepa SM73 muíante por eliminación de S. Enteritidis (AguaB AflicC) en pollos SPF por las vías intratraqueal y de alimentación forzada por vía oral. Se utilizó la mortalidad como criterio principal y el peso corporal como criterio secundario para la determinación de la seguridad. Todas las aves a las 2 semanas de vida se agruparon por las patas y se asignaron al azar a uno de los cuatro grupos de tratamiento incluidos en este estudio (Grupo 1 : SM73-IT, grupo 2: SM73-OG, grupo 3: Poulvac ST-IT y grpo 4: PBS-IT). Diez aves del grupo 1 se inocularon con SM73 por vía intratraqueal; diez aves del grupo 2 se inocularon con SM73 por alimentación forzada por vía oral; diez aves del grupo 3 se inocularon con una vacuna con AroA de S. Typhimurium (Poulvac® ST) por vía intratraqueal; y cinco aves del grupo 4 se inocularon con PBS por vía intratraqueal. Se utilizaron un total de 4 separadores (uno para cada grupo) en el que los pollos se alojaron durante el estudio. Se inocularon los pollos de un día de vida. Los pollos en los grupos 1 y 2 se inocularon con el patrón SM73 sembrado por vía intratraqueal o alimentación forzada por vía oral, respectivamente, con un valor real de 2.5 x 107 cfu/0.2 mi por ave. A los pollos del grupo 3 se les administró Poulvac® ST por vía intratraqueal con 2.1 ? 107 CFU/0.2 mi por ave. Los pollos del grupo 4 se administraron por vía intratraqueal con 0.2 mi de PBS por ave. Se observó la mortalidad y se registró también el peso corporal tal como se describió anteriormente para SM69. Se utilizaron otra vez Poulvac® ST y PBS como referencias del procedimiento intratraqueal. Durante el periodo de observación de 21 días, no se registró ninguna mortalidad para ningún ave en absoluto. No hubo ninguna diferencia en el peso corporal final de las aves inoculadas con PBS-IT, Poulvac ST-IT y SM73-OG. El peso corporal medio de los grupos SM73-IT fue significativamente inferior en comparación con el grupo SM73-OG (p = 0.0009) pero esto es debido más probablemente a un error experimental.

Del presente experimento puede concluirse que SM73 es seguro cuando se administra al valor probado de 2.5 ? 107 CFU por ave y un día de edad por vía intratraqueal o alimentación forzada por vía oral. Se ha realizado un depósito según el Tratado de Budapest en la BCCM/LMG Culture Collection, Laboratorium voor Mícrobiologie, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gante (Bélgica) para los microorganismos siguientes: SM69 de Salmonella Enteritidis con el número de depósito LMG P-21641 (fecha de depósito: 9 de agosto de 2002); SM73 de S. Enteritidis con el número de depósito LMG P-21642 (fecha de depósito: 9 de agosto de 2002), SM86 de S. Typhimurium con el número de depósito LMG P-21646 (fecha de depósito: 28 de agosto de 2002) y S. Typhimurium con el número de depósito LMG P-21643 (fecha de depósito: 9 de agosto de 2002) . Los depósitos se han realizado en nombre del Prof. J.-P. Hernalsteens, dirección anterior: Vrije Universiteit Brussel, Laboratorium Genetische Virologie, Paardenstraat 65, B-1640 Sint-Genesius-Rhode, dirección actual: Vrije Universiteit Brussel, Onderzoeksgroep Genetische Virologie, Pleinlaan 2, B-1050 Bruselas, Bélgica.

CUADRO 1 Secuencias de cebador SEC ID n° Cebador Secuencia 1 GuaB2 5' CGTT CAGGCG CAACAGGCCG TTGT 3' 2 GuaB3 5 ' GGCTGCOATT GGCGAQGTAG TA 3 ' 3 OuaB 5 ' GGTGATCCCG GGCGTCAAAC GTCAGGGCTT CTTTA 3 ' 4 GuaB5 5' TTGACGCCCG GGATCACCAA AGAGTCCCCG AACTA 3' 5 G aB6 5 ' GCAACAACTC CTGCTGGTTA 3 ' 6 GuaB7 5 ' AGACC5AGGA TCACTTTATC 3 ' 7 GuaBlO 5' AGGAAGTTTG AGAGGATAA 3' 8 Pl 5' GTGTAGGCTG GAGCTGCTTC 3' 9 P2 S' CATATGAATA TCCTCCTTAG 3' 10 F11CP1 5 ' ATGGCACAAG TCATTAATAC AAACAGCCTG TCGCTGGTTG ACCCAGAATA ATGTGTAGGC TGGAGCTGCT TC 3 ' 11 F1ÍCP2 5 ' CGCATTAACG CAGTAAAGAG AGGACGTTTT GCGGAACCTG GTTMGCCTGC GCCACATATG AATATCCTCC TTAG 3 ' 12 FliCl 5' ATGGCACAAG TCATTAATAC AAACAG 3' 13 F11C2 5 ' CGCATTAACG CAGTAAAGAG AGGAC 3 ' 14 FÜC3 5' TATCGGCAAT CTGGAGGCAA 3' 15 FljBAPl 5' ATGGCACAAG TAATCAACAC TAACAGTCTG TCGCTGCTGA CCCAGAATAA CTGTGTAGGC TGGAGCTGCT TC 3' 16 FljBAP2 5' TTATTCAGCG TAGTCCGAAG ACGTGATCCT GCTCACCCAG TCAAACATAA CCATATGAAT ATCCTCCTTA G 3' 17 FljBA5 5 ' CAGCGTAGTC CGAAGACGTG ATC 3 ' ia FL j BA6 5* ACACTAACAG TCTGT CGCTG CT 3' CUADRO 2: Prueba de virulencia en ratones BALB/c del mutante SM20 por eliminación de AguaB de S. Enteritidis Infección Supervivencia Día de Estado de los ratones Cepa Dosis muerte Primer experimento referencia negativa: leche / 1 1/1 1 / Sin síntomas de enfermedad referencia positiva: 76Sa88 de S. Enteritidis 2.1 x10a 0/5 7, 7, 8, 8, 9 referencia de la vacuna. AaroA S 50 de S. Enteritidis 2.5x10a 10/10 / Sin síntomas de enfermedad AguaB SM20 de S. Enteritidis 5.1 x 10a 9/10 13 Síntomas de enfermedad entre el 7° y el 4° día tras la infección Segundo experimento referencia negativa: leche / 4/4 / Sin síntomas de enfermedad referencia positiva: 76Sa88 de S. Enteritidis 1.4x 10a 0/3 8, 9, 9 referencia de la vacuna: AaroA SM50 de S. Enteritidis 2.1 x 10a 3/3 / Sin síntomas de enfermedad AguaB SM20 de S. Enteritidis 1 .9x 10a 3/3 / Sin síntomas de enfermedad CUADRO 3 Prueba de provocación de ratones vacunados con el mutante SM20 por eliminación de guaB de S. Enteritidis Vacunación Prueba de provocación Supervivencia Dia de muerte I Estado de los ratones Cepa Dosis Cepa | Dosis Primer experimento referencia negativa: leche 1 referencia 1 6/6 / Sin síntomas de enfermedad negativa: leche referencia negativa: leche 1 76Sa88 de S. 1.5x10° 0/5 7, 8, 8, 8, 9 Síntomas de enfermedad a partir del 5o Enteritidis día tras la prueba de provocación Referencia de la vacuna: AaroA 2.5x10° 76Sa88 de S. 1.5x10a 3/5 9, 13 Síntomas de enfermedad entre el 7o y el SM50 de S. Enteritidis Enteritidis 14° dia tras la prueba de provocación AguaB SM20 de S. Enteritidis 5,1 x10° 76Sa88 de S. 1.5x10° 5/5 / Los ratones son menos activos entre el Enteritidis día 11° y el 14° tras la prueba de provocación Segundo experimento referencia negativa: leche / referencia / 2/2 / Sin síntomas de enfermedad negativa: leche referencia negativa: leche / 76Sa88 de S. 1.5x10° 0/2 9.18 Enteritidis Referencia de la vacuna: AaroA 2.1 x10° 76Sa88 de S. 1.5x10° 1/3 9, 21 Síntomas de enfermedad entre el día 7o S 50 de S. Enteritidis Enteritidis y el 21° tras la prueba de provocación bguaB S 20 de S. Enteritidis 1.9x10° 76Sa88 de S. 1.5x10a 2/3 10 Síntomas de enfermedad a partir del 9o Enteritidis día tras la infección CUADRO 4 Prueba de virulencia en ratones BALB/c de los mutantes SM20 y SM21 de S. Enteritidis Infección Supervivencia Día de Estado de los ratones Cepa Dosis muerte Primer experimento Referencia negativa: no infectada / 11/11 / Asintomático Referencia positiva: 76a88 de S. Enteritidis 2.1x10a 0/5 7.7, 8, 8, 9 Síntomas graves del 5o día en adelante ¿guaB SM20 de S. Enteritidis 5.1x10a 9/10 / Síntomas leves a graves, a partir del 7° día hasta el 17° día kguaB flcC SM21 de S. Enteritidis 4.3x10a 10/10 / Asintomático Segundo experimento Referencia negativa: no infectada / 4/4 / Asintomático Referencia positiva: 76a88 de S. Enteritidis 1.4x10a 0/3 8, 9, 9 Síntomas graves del 6o día en adelante Aguafi S 20 de S. Enteritidis 1.9x10a 3/3 / Asintomático guaB McC SM21 de S. Enteritidis 3.2x10a 3/3 / Asintomático CUADRO 5 Prueba de provocación de los ratones vacunados con los mutantes SM20 y SM21 de S. Enteritidis Vacunación Prueba de provocación Supervivencia Día de Estado de los Cepa Dosis Cepa Dosis muerte ratones Primer experimento Referencia negativa: / Cepa 76Sa88 natural de S. 1.6?10? 0/5 7, 8, 8, 8, 9 Síntomas graves del 6o leche Enteritidis día en adelante Cepa 76aS88 natural Cepa 76Sa88 natural de S. de S. Enteritidis 2.1x10a Enteritidis 1.6x108 / / guaB SM20 de S. 5.1x10a Cepa 76Sa88 natural de S. 1.6x10B 4/4 8, 8, 19 Asintomático Enteritidis Enteritidis guaB McC SM21 4.3x10a Cepa 76Sa88 natural de S. 1.6x10B 5/5 Asintomático de S. Enteritidis Enteritidis Segundo experiment o Referencia negativa: / Cepa 76Sa88 natural de S. 1.5x10B 0/2 9, 18 Síntomas graves del 6o leche Enteritidis día en adelante Cepa 76aS88 natural Cepa 76Sa88 natural de S. de S. Enteritidis 1.4x108 Enteritidis 1.5x108 / / / guaB SM20 de S. 1.9x10B Cepa 76Sa88 natural de S. 1.5x10B 2/3 10 Ningún síntoma, Enteritidis Enteritidis excepto uno con síntomas graves AguaB MlicC SM21 3.2x10B Cepa 76Sa88 natural de S. 1.5x10B 3/3 / Asintomático de S. Enteritidis Enteritidis CUADRO 6 Prueba de virulencia en ratones BALB/c de los mutantes S 71. SM73 y SM69 de S. Enteritidis Infección Supervivencia Día de Estado de los ratones Cepa Dosis muerte Referencia negativa: no infectada / 4/4 / Asintomático Referencia positiva: 76a88 de S. Enteritidis 3.7x 10a 0/3 7, 8, 9 Síntomas graves del 5° día en adelante MicC SM71 de S. Enteritidis 1 .4x 10a 0/3 6, 8, 8 Síntomas graves del 4o día en adelante AguaS SM69 de S. Enteritidis 7.6x 10a 5/5 / Síntomas leves, a partir del 1 1 ° día hasta el 18° día AguaB MicC SM73 de S. Enteritidis 1 .2x 10a 5/5 / Actividad reducida, a partir del 1 1° día hasta el 13° día CUADRO 7 Prueba de provocación de los ratones vacunados con los mutantes SM71 , S 73 y SM69 de S. Enteritidis Vacunación Prueba de provocación Supervivencia Día de Estado de los Cepa Dosis Cepa Dosis muerte ratones Referencia negativa: / Cepa 76Sa88 natural de S. 3.1 *10* 0/4 8, 8, 8, 9 Síntomas graves leche Enteritidis del 5o día en adelante Cepa 76aS88 natural Cepa 76Sa88 natural de S. 3.1 ? 10? / / / de S. Enteritidis 3.7x10s Enteritidis MicC SM71 de S. 1.4*10B Cepa 76Sa88 natural de S. 3.1 x 10a / / / Enteritidis Enteritidis AguaB SM69 de S. 7.6x 10 Cepa 76Sa88 natural de S. 3.1 * 10B 2/5 8, 8, 19 Síntomas graves Enteritidis Enteritidis del 5o día en adelante guaB MicC SM73 1 .2?10? 5/5 / Asintomático de S. Enteritidis CUADRO 8 Evaluación de seguridad del mutante SM69 de S. Enteritidis en pollos de un día de vida IT Intratraqueal OG Alimentación forzada por vía oral DPI Días tras la inoculación En el grupo 1 , 1 ave murió durante la inoculación; 1 ave murió a los 3, 5 y 13 DPI; y 2 aves a los 2 DPI respectivamente En el grupo 2, 1 ave murió durante la inoculación; y 1 ave murió a los 5 días DPI.

CUADRO 9 Evaluación de seguridad del mutante SM69 de Salmonella en pollos de 2 semanas de vida IT Intratraqueal OG Alimentación forzada por vía oral DPI Días tras la inoculación Muerte debida a infección del saco vitelino Vacuna AroA' con microbios vivos de S. Typhimurium contra S. Typhimurium CUADRO 10 Experimentos de virulencia con cepas mutantes de S. Typhimurium en ratones BALB/c. Inoculación oral con aproximadamente 108 células de la cepa 1491 S96 de S. Typhimurium * muertos tras una lucha CUADRO 11 Experimentos de protección con cepas mutantes de S. Typhimurium en ratones BALB/c. Vacunación oral con aproximadamente 108 células de la cepa 1491 S96 de S. Typhimurium Vacunación Prueba de provocación Cepa 1491S96 Cepa Dosis Supervivencia Estado de los ratones de S. Typhimurium ( 1491 S96 de S. Typhimurium) (días de muerte) AguaB SM86 1491S96 de S. Typhimurium 1.3^ 10' 2/2 Síntomas leves hasta 14 días, después un ratón presentó síntomas evidentes, el otro sanó de nuevo AguaB AfljBA SM87 1491 S96 de S. Typhimurium 1 .3x 10' 5/5 Actividad reducida, entre el 8° día y el 10° día AguaB AfliC AfljBA 1491S96 de S. Typhimurium 1 .3x 10' 5/5 Actividad reducida , entre el 8° d ía y el 10° día SM89 referencia negativa: 1491S96 óe S. Typhimurium 1.3x 10' 0/4 Síntomas graves a partir del 6o día leche en adelante CUADRO 13 Experimentos de protección con las cepas mutantes 149S96 de S. Typhimuríum en ratones BALB/c Vacunación Prueba de provocación Cepa { 1491S96 de S. Dosis Cepa Dosis Supervivencia Estado de los ratones Typhimuríum) ( 1491S96 de S. (días de la Typhimuríum) muerte) AguaB SM86 0.8 ? 10a 1491S96 de S. 2.7 10a 5/5 Actividad reducida desde el 6o día hasta Typhimuríum el 16° día AguaB AfliC SM91 2.5 x 10a 1491S96 de S. 2.7 10a 5/5 Actividad reducida desde el 7° día en Typhimuríum adelante; síntomas leves desde el 8o d ía hasta el 14° día AguaB AfljBA SM87 1 .5 10B 1491S96 de S. 2.7 108 3/5 Síntomas leves entre el 6o día y el 16° Typhimuríum ( 10, 28) día AguaB AfliC AfljBA 1 .7 x 10a 1491S96 de S. 2.7 x 10a 4/5 Actividad reducida entre el 8° día y el SM89 Typhimuríum ( 19) 16° día Referencia (no 1491S96 de S. 2.7 10a 0/5 Síntomas graves desde el 6° día en infectada) Typhimuríum (8, 9, 10, 1 1 , 16) adelante CUADRO 12 Experimentos de virulencia con las cepas mutantes 1491S96 de S. Typhimurium en ratones BALB/c Infección Cepa ( 1491S96 de S. Dosis Supervivencia Estado de los ratones Typhimurium) (días de muerte) SM2 natural 0.8 ? 10a 1 /4 Síntomas de enfermedad a partir del 6o día en adelante ( 1 1 . 13, 14) AguaB SM86 0.8 x 10a 5/5 Síntomas leves el día 13 y 14 AguaB AfliC SM91 2.5 x 108 5/5 Sin síntomas AguaB AfljBA SM87 1 .5 x 10a 5/5 Sin síntomas AguaB AfliC AfljBA SM89 1 .7 10a 5/5 Sin síntomas Referencia (no infectada) - 5/5 Sin síntomas

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1 . - Una cepa mutante atenuada de una bacteria que infecta especies veterinarias, en la que dicho mutante contiene por lo menos una primera modificación genética y por lo menos una segunda modificación genética, dicha primera modificación en uno o más genes con movilidad, y dicha segunda modificación en uno o más genes implicados en la supervivencia o proliferación de la bacteria en el hospedador. 2. - La cepa mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la especie veterinaria es un ave de corral. 3. - La cepa mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque es una cepa de Salmonella entérica o de Escherichia coli. 4. - La cepa mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el gen con movilidad es un gen que codifica la flagelina. 5. - La cepa mutante de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque tiene una mutación en los genes fliC y/o fljB o fljBA. 6. - La cepa mutante de conformidad con la reivindicación 4 ó 5, caracterizada además porque es incapaz de aglomerarse en el medio LB que contiene agar-agar al 0.4%. 7. - La cepa mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el gen implicado en la supervivencia es un gen constitutivo o un gen con virulencia. 8. - La cepa mutante de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el gen constitutivo que está ¡nactivado es el gen guaB. 9. - La cepa mutante de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque la cepa mutante contiene una mutación por eliminación que altera la función del gen guaB. 10. - El mutante de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, caracterizado además porque es incapaz de formar de nuevo nucleotidos de guanina. 1 1 . - La cepa mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque dicha cepa mutante codifica y expresa un xenoantígeno. 12. - La cepa mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque es una cepa atenuada de S. Enteritidis o de S. Typhimurium. 13. - La cepa mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque las modificaciones genéticas se introducen en la cepa progenitora 76Sa88 tipo 4 del fago S. Enteritidis. 14. - La cepa mutante de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque es la cepa SM73 atenuada de S. Enteritidis con el número de depósito LMG P-21642. 1 5. - La cepa mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada además porque las modificaciones genéticas se introducen en una cepa progenitora 1491 S96 de S. Typhimurium. 16. - La cepa mutante de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque es la cepa SM89 atenuada de S. Typhimurium con el número de depósito LMG P-21643. 1 7 - El mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque contiene una modificación genética en el gen guaB y una modificación genética en el gen me. 18. - El mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque contiene una modificación genética en el gen guaB y una modificación genética en los genes fljBA. 19. - El mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque contiene una modificación genética en el gen guaB, una modificación genética en el gen fliC y una modificación genética en los genes fljBA. 20.- La cepa mutante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la modificación se selecciona de entre el grupo constituido por una inserción, una eliminación y/o una sustitución de uno o más nucleótidos en dichos genes. 21 .- Una vacuna para inmunizar una especie veterinaria contra una infección bacteriana, comprendiendo dicha vacuna: una cantidad farmacéuticamente eficaz o inmunizadora de una cepa mutante atenuada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores; y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. 22.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque dicha cepa mutante codifica y expresa un xenoantígeno. 23. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 21 ó 22, caracterizada además porque dicha cepa mutante comprende un plásmido, que codifica y expresa, en una célula eucariótica, un gen extraño. 24. - Un procedimiento de inmunización de una especie veterinaria contra una infección bacteriana, comprendiendo dicho procedimiento la etapa siguiente: administrar a una especie veterinaria que lo necesita un agente ¡nmunizador de una cepa mutante como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 y/o una vacuna como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23. 25. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la especie veterinaria son aves de corral. 26. - El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 ó 25, caracterizado además porque la cepa mutante es una cepa atenuada de S. entérica o de E. coli. 27. - El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, caracterizado además porque la cepa mutante y/o la vacuna se administra por vía oral, nasal o parenteral. 28. - El uso de una cepa mutante como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 destinada a la preparación de una vacuna destinada a la prevención y/o al tratamiento de infecciones en especies veterinarias, preferentemente las aves de corral. 29. - Un procedimiento para una diferenciación serológica entre los animales vacunados y los animales infectados por una cepa natural, en el que los animales vacunados han sido inmunizados con una cepa mutante en la que un gen de flagelina está inactivado, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes: ensayar en animales la presencia de anticuerpos construidos contra la flagelina; diferenciar los animales infectados de los animales vacunados basándose en la presencia o ausencia de dichos anticuerpos. 30. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque dichos anticuerpos son generados por un animal infectado por una cepa natural, no obstante no por un animal que ha sido vacunado con una cepa mutante en la que el gen de flagelina está ¡nactivado, tal como un mutante según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 20. 31 . - El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 30, caracterizado además porque la presencia de dichos anticuerpos indica la presencia de cepas naturales y por lo tanto de infección. 32. - El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31 , caracterizado además porque los animales infectados por Salmonellae se distinguen de los animales que han sido inmunizados con una vacuna con virus vivos atenuada según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23. 33. - El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, caracterizado además porque se analizan en los animales los anticuerpos construidos contra FHC. 34. - El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, caracterizado además porque el animal es una especie veterinaria, preferentemente aves de corral, más preferentemente un pollo.