KR102100503B1 - 개선된 고스트 장관독소형 대장균를 유효성분으로 포함하는 돼지 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물 - Google Patents

개선된 고스트 장관독소형 대장균를 유효성분으로 포함하는 돼지 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 개선된 고스트 장독소 대장균 변이주를 유효성분으로 포함하는 돼지 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

개선된 고스트 장관독소형 대장균를 유효성분으로 포함하는 돼지 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물 {Vaccin compsosition for preventing or treating porcine pathogenic colibacillosis comprising ghost enterotoxigenic Escherichia coli as effective componet}
본 발명은 개선된 고스트 장관독소형 대장균을 유효성분으로 포함하는 돼지 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
장관독소형 대장균 [Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC)]은 설사를 야기하며, 특히 신생자돈 및 이유자돈에서 설사를 일으키며 가장 일반적인 세균 중 하나로 전 세계적으로 양돈 산업에서의 경제적으로 가장 중요한 질병중 하나로 간주된다. ETEC는 보통 핌브리아를 사용하여 장내 상피 세포 표면에 부착하며, 이유 자돈 ETEC에 관계된 중요한 핌브리아 발현 균주로는 F4+ ETEC (세 혈청형 중 K88ac+ ETEC)와 F18ac+ ETEC로 알려져 있다. 이들 ETEC 균주는 장 점막에 부착 후, 장독소, 즉, 열에 안정한 장독소 (STa 와 STb)와 열에 불안정한 장독소(LT)를 분비하여 신생자돈 및 이유 자돈에 심각한 설사를 야기한다. 따라서 이들 핌브리아는 ETEC 설사증에 있어 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.
일반적으로, 이유 후 자돈에서 대부분의 감염은 포유자돈 시기에 예방접종을 통해 예방될 수 있다. 하지만 지금까지 이유 후 자돈에서 대장균증을 예방하기 위해 포유자돈용 예방 백신은 전무한 실정이다. 또한 지금까지 대장균 백신 제조에 사용되어 오는 전형적인 배양 박테리아에 화학적 처리를 가해 생산 되는 불활화 사균 백신은 박테리아 표면 항원들의 구조적 특성에 영향을 미칠 수 있어 잠재적으로 방어 면역을 저해하는 것으로 알려지고 있으며, 더불어 이 불활화 백신은 낮은 수준 및 짧은 기간의 면역 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 그리하여 전통적으로 제조되는 사균 백신 제조 방법은 효과적인 방어면역을 유도하기 위해 강력한 면역 보강제와 더불어 여러 번의 접종을 요구한다. 하지만 전형적인 방법으로 제조된 백신들은 제조에 첨가된 화학약품에 의안 알러지 반응, 백신 접종 부위의 sarcomas와 같은 큰 위험을 가지고 있다. 반면에, 고스트화된 불활화 세균은 생존 상태 세포의 형태 및 세균 부착 특성을 고스란히 간직하고 있는 세포 표면 항원 구조를 그대로 유지하고 있다. 또한 고스트화 된 세균은 고유한 아쥬번트 특성 또한 간직하고 있어 전신 및 점막 그리고 세포성 면역반응을 유도할 수 있는 것으로 보고되고 있다.
전염병에 대한 안전하고 효과적인 백신들을 개발하기 위해서 백신 후보물질로서 세균 고스트 cells의 이용은 새롭고 진보적인 접근 방법이다. 동물들에서 이 새로운 고스트백신 백신 후보물질의 경구 또는 비경구적 접종은 체액성 및 세포성 면역반응을 효과적으로 유도할 수 있는 것으로 알려지고 있다. 더불어 백신 제조과정에서 면역원성에 중요한 부분을 차지하는 부분이 화학적으로든 물리적으로든 변화 없이 불활화되어 세균과 같은 면역원성을 유지한 세포외막 성분을 그대로 보유하고 있다.
대부분의 동식물에서 발견되는 항균 펩타이드 [Antimicrobial peptides (AMPs)]는 선천성 면역반응에 있어 중요한 역할을 담당하고 있으며, 더불어 이 AMPs 세균에 대해 broad-spectrum 활동을 갖는다. 이 항균작용은 이 AMP 들이 세균의 세포막에 결합하여 빠르게 반응하여 세포막에 구멍을 만들어 세포질 성분이 빠져나가 결국 세포가 죽음에 이르게 한다. 지금까지 돼지에서는 11개의 host defense peptide (HDP) 또는 antimicrobial peptide (AMP)가 보고되었으며, 이중 porcine myeloid antimicrobial peptide-36 (PMA-36)이 가장 높은 양성전하를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. PMA36 N-terminal의 α-helical domain이 활성부위로 알려져 있으며. 이 펩타이드는 양성전하를 가진 펩타이드와 세균 세포막의 음성 전하를 가진 분자성분과 전자 결합을 통해 세균 막을 관통할 수 있는 능력을 가지고 있다. 특히, PMAP-36의 36개의 아미노산 중에서 24개의 아미노산(GI24)으로 이루어진 N-terminal의 알파 헤릭스 도메인 또한 PMAP-36이 가지고 있는 항균 효과를 그대로 유지하고 있다.
한편 한국등록특허 제 1478202호에 ‘다목적 고스트 살모넬라 백신 및 이를 이용한 동물 면역반응 유동방법’이 개시되어 있으나 본 발명의 개선된 고스트 장독소 대장균 변이주를 유효성분으로 포함하는 돼지 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명자들은 GI24를 이용하여 F4+ ETEC 균주와 F18+ ETEC 균주를 고스트화를 유도하여 개선된 고스트 장관독소형 대장균 사균체를 제작하였고, 상기 장관독소형 대장균주 사균체를 포함하는 백신이 이유자돈에 있어서 설사를 효과적으로 예방하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기와 같은 본 발명의 과제를 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 GI24 (N-terminal 24-amino acid fragment)를 반응시킨 fimbriae 4 (F4)를 발현하는 장관독소형 대장균 사균체 및 fimbriae 18 (F18)을 발현하는 장관독소형 대장균 사균체를 제공하는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 Fimbriae 4 (F4)를 발현하는 장관독소형 대장균 및 Fimbriae 18 (F18)을 발현하는 장관독소형 대장균은 혼합 균주이며, 미생물 기탁번호 KCTC13847BP(미생물 명칭: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) F4,F18)으로 기탁된 대장균 균주일 수 있다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 하기의 단계를 포함하는 Fimbriae 4 (F4)를 발현하는 장관독소형 대장균 사균체 및 Fimbriae 18 (F18)을 발현하는 장관독소형 대장균 사균체를 제조하는 방법을 제공한다:
(a) F4를 발현하는 장관독소형 대장균 및 F18을 발현하는 장관독소형 대장균 균주를 LB 액체 배지에 접종한 후 35 내지 37℃ 조건으로 배양하는 단계; 및
(c) 상기 배양된 장관독소형 대장균에 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 GI24를 35~37℃ 조건으로 1 시간 내지 24시간 반응시키는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 상기 Fimbriae 4 (F4)를 발현하는 장관독소형 대장균 및 Fimbriae 18 (F18)을 발현하는 장관독소형 대장균은 혼합 균주이며, 미생물 기탁번호 KCTC13847BP(미생물 명칭: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) F4,F18)으로 기탁된 대장균 균주일 수 있다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 장관독소형 대장균 사균체; 이의 배양물 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 돼지의 대장균증 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 백신 조성물은 모돈 또는 자돈에 접종하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 장관독소형 대장균 사균체; 이의 배양물 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 돼지의 대장균증의 예방용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 장관독소형 대장균 사균체를 이유자돈에 근육에 접종한 뒤, 장관독소형 야외균주로 도전감염을 시행한 결과, 본 발명의 균주를 접종한 자돈에서는 설사 및 폐사가 관찰되지 않았다. 따라서 본 발명의 장관독소형 대장균 사균체는 이유자돈에 근육 접종하였을 때 이유 후에 대장균 설사증을 방어할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 장관독소형 대장균에 (A) GI24 펩타이드 미처리 군 및 (B) GI24 펩타이드 처리의 군 전자현미경 사진 결과이다.
도 2는 본 발명의 각 항원 (Group A : 대조군, group B : 고스트 장관독소형 대장균을 포함하는 백신 접종군)에 대한 혈청 항체 역가 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 목적은 상기와 같은 본 발명의 과제를 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 GI24 (N-terminal 24-amino acid fragment)를 반응시킨 fimbriae 4 (F4)를 발현하는 장관독소형 대장균 사균체 및 fimbriae 18 (F18)을 발현하는 장관독소형 대장균 사균체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 Fimbriae 4 (F4)를 발현하는 장관독소형 대장균 및 Fimbriae 18 (F18)을 발현하는 장관독소형 대장균은 혼합 균주이며, 미생물 기탁번호 KCTC13847BP(미생물 명칭: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) F4,F18)으로 기탁된 대장균 균주일 수 있다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 하기의 단계를 포함하는 개fimbriae 4 (F4)를 발현하는 장관독소형 대장균 사균체 또는 fimbriae 18 (F18)을 발현하는 장관독소형 대장균 사균체를 제조하는 방법을 제공할 수 있다:
(a) F4를 발현하는 장관독소형 대장균 및 F18을 발현하는 장관독소형 대장균 균주를 LB 액체 배지에 접종한 후 35 내지 37℃ 조건으로 배양하는 단계; 및
(c) 상기 배양된 장관독소형 대장균에 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 GI24를 35~37℃ 조건으로 1 시간 내지 24시간 반응시키는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 Fimbriae 4 (F4)를 발현하는 장관독소형 대장균 및 Fimbriae 18 (F18)을 발현하는 장관독소형 대장균은 혼합 균주이며, 미생물 기탁번호 KCTC13847BP(미생물 명칭: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) F4,F18)으로 기탁된 대장균 균주일 수 있다.
본 발명은 또 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 장관독소형 대장균 사균체; 이의 배양물 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 돼지의 대장균증 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면 상기 백신 조성물은 모돈 또는 자돈에 접종하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 근육 내, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 바람직하게는 고스트 백신을 경구 또는 근육 내 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 조성물의 투여량은 돼지의 무게, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 고스트 백신 조성물의 투여량은 모돈 1두당 약 2*?*8 내지 2*?*11 세포, 바람직하게는 약 2*?*9 내지 2*?*10 세포로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다. 생체 내 면역은 병원균의 감염 후에 생체 내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동 면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동 면역은 면역에 관계하는 항체의 생성기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.
상기 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤 (iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 서브바이랄 (subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원 보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
또한, 상기 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 드립 (drip) 또는 스프레이 등의 비강용 제형 그리고 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 비강내 투여를 위한 제제에 적합한 침투제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 그러한 적합한 제형물은 안정성과 순응도를 위해 바람직하게 무균, 등장 및 완충되도록 제형화된다. 비강내 투여를 위한 제제는 또한 정상적인 섬모 작용을 유지시키기 위해 점액 분비를 여러 측면에서 자극하도록 제조되며, 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA(1990))에 기술된 바와 같이, 적합한 제형이 바람직하게 등장성의, pH 5.5 내지 6.5를 유지하는 약간 완충된 제형이며, 가장 바람직하게 항미생물 방부제 및 적합한 약물 안정화제를 포함한다.
본 발명은 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 서술한 장관독소형 대장균 사균체; 이의 배양물 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 돼지의 대장균증의 예방용 사료 첨가제를 제공할 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제는 장관독소형 대장균 변이주 또는 이의 혼합물을 원형 그대로 사용하거나 또는 추가적으로 가축에 허용되는 곡류 및 그 부산물 등의 공지된 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염 (중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있으며, 상기 사료첨가제를 공급하는 경우는 가축 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
재료 및 방법
1. 박테리아 균주, 플라스미드 및 생장조건
이 연구에서 사용된 모든 세균 균주들은 표 1에 서술되어 있다. F4+ (HJL593) 그리고 F18+ (HJL565) ETEC 균주들은 백신제조 및 도전감염용 균주로 사용되었다. 본 발명에서 사용되는 F4+ ETEC, F18+ ETEC 균을 분리 동정하기 위해 전에 발표된 논문을 참조하였다 (Kim 등 2010). 설사를 하는 이유 자돈의 분변을 채취하기 위해 직장으로부터 시판용 분변채취용 swab set를 이용하여 분변을 채취한 후 실험실까지 냉장 상태로 운반하였다. 운반된 swab 들은 각각 eosin methylene blue agar (Difco, Sparks, Maryland, USA)에 직접 도말한 후 37℃에서 24시간 배양하였다. 전형적으로 크고 짙은 남색(blue-black)의 녹색 금속광택을 띄는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니는 다시 용혈 여부를 확인하기 위해 혈액배지에 접종하여 37℃에서 16시간 배양하였다. 베타 용혈성을 가진 콜로니 또는 비 용혈성 콜로니 모두 F4 또는 F18 선택적 primer (표 2에 기재)를 이용하여 PCR을 수행하여 각 대장균의 핌브리아 형을 결정하였다. PCR 결과 F4+ ETEC 또는 F18+ ETEC 중 용혈성을 가진 균주를 API32 kit을 사용하여 대장균임을 다시 한 번 확인하였으며 최종 실험에 사용할 균주로 결정하였다 (Kim YJ, Kim JH, Hur J, Lee JH. Isolation of Escherichia coli from piglets in South Korea with diarrhea and characteristics of the virulence genes. Can J Vet Res. 2010, 74(1):59-64) E. coli DH5α와 E. coli BL21(DE3) 균주는 K88ac 및 FedA 항원 생산을 위한 과 발현 호스트 균주로 사용되었다. 모든 균주는 LB broth와 LB 아가 배지에서 배양되었다. 또한 pQE31과 pET28a 플라스미드는 K88ac와 FedA 항원을 과발현 시키기 위해 각각 사용되었다.
Figure 112019047592629-pat00001
2. GI24의 제조
GI24 (서열번호 1번 : GRFRRLRKKTRKRLKKIGKVLKWI-NH2)를 prptron (대전, 한국) 제조하여 실험에 사용하였다.
3. F4+ 및 F18+ ETEC 백신 후보군의 구조
F4+ ETEC 또는 F18+ ETEC 균주의 한 콜로니를 선택하여 각각 200ml의 LB 액체 배지에 접종한 후 37°에서 흡광도가 0.3에 도달할 때까지 배양했다. 배양된 배지에 준비된 GI24 펩타이드를 40 μg/ml가 되도록 첨가하여 각 ETEC 균주가 lysis가 유도 되도록 37°에서 16시간 반응시켰다. 반응 후 lysis 여부를 확인하기 위해 각 반응액 중 100㎕씩을 LB 아가 배지 및 broth에 각각 접종하여 37°에서 5일간 배양하여 colony 형성 유무로 반응액의 lysis 여부를 확인하였다. 또한 확인된 lysis 반응액은 4000 ×에서 30분간 원심 하여 농축되었고, 멸균 PBS로 세 번 세척한 후 최종적으로 1 ×109 cells/ml이 되도록 재 부유시켜 -20°에 보관하며 사용하였다.
4. F4+ 및 F18+ ETEC 백신 후보군의 투사전자현미경 (TEM)
각 ETEC 세균에 대한 GI24 펩타이드 처리 전후 세균 샘플 준비는 F4+ ETEC 및 F18+ ETEC 고스트 백신 제조 방법과 같은 방법으로 준비되었다. TEM은 Lv et al (Lv et al.2014)에 설명된 방식에 따라 촬영되었다. 도 1에서 보는 것처럼, GI24 펩타이드로 처리하지 않은 F4+ ETEC와 F18+ ETEC 균주들은 온전한 세포막과 세포 내를 가득 매운 세포 내용물이 관찰되었다 (도 1A). 반면, GI24 펩타이드에 의해 고스트화된 각 ETEC 균주들은 도 1B에서 보는 것처럼 하나의 구멍이 뚫린 세포막과 더불어 빈 세포 질 공간이 관찰되었다
5. 백신접종과 가검물 채취
Large Yorkshire 포유자돈 20마리를 이 연구에 사용하였으며, 모든 자돈들은 heat lamp를 갖춘 축사로 옮겨졌다. 또한 항생제나 성장촉진제를 첨가하지 않은 상업적인 포유자돈용 사료를 급여했다. 총 20마리의 포유자돈을 2 그룹으로 나눴다. 모든 그룹의 자돈은 근육내투여로 백신을 접종했다 (생 후 2주령 1회, 4주령 2회). Group A의 돼지들은 control으로, 멸균 PBS 2ml로 접종되었다. Group B 돼지들은 2ml의 PBS에 F4+ ETEC와 F18+ ETEC가 각각 1 ×109 고스트 사균체 혼합된 그래서 총 2 ×109 고스트 사균체로 접종되었다. 혈액은 0 WPPI (weeks post prime immunization) (immunization 전), 2 WPPI (2차 접종 전) 4 WPPI (도전감염 전)로 채취되었다. 모든 가검물은 사용하기 전까지 영하 70도에 저장되었다. 본 실험에서 보고된 동물실험은 Korean Council on Animal Care의 인가를 받은 전북대학교 동물윤리 의원회의 승인을 받아 진행하였다.
6. 면역반응 평가를 위한 ELISA
F4+ ETEC와 F18+ ETEC 고스트 백신을 접종한 후 유도된 항체 역가 측정을 위해 HJL667과 HJL669으로부터 재조합 K88ac와 FedA 단백질이 각각 제조사에서 권장하는 방법에 따라 정제되었다. 각 serum 안의 ETEC fimbrial antigen-specific IgG에 대한 OD (optical density)값을 측정하기 위해 돼지의 IgG (Bethyl Lab Inc. Montgomery, TX, USA) ELISA quantitation kit을 제조사의 설명에 따라 사용하였다. 혈청역가를 위해 혈청은 1:400으로 희석되었다. 백신 접종 된 자돈을 대상으로 재조합 K88ac 및 FedA 항원에 대한 각 자돈 혈청 IgG의 항체 역가는 도 2에 나타나 있다. 즉, K88ac 및 FedA에 대한 혈청 IgG의 역가들은 대조군에 비해 접종 군에서 유의 있는 항체 역가의 증가가 관찰되었다 (P ≤ 0.05).
7. 도전감염
도전감염 용 균주인 JHL593과 HJL565는 전에 설명한 방법 (Hur and Lee 2011; and 2013)에 따라 준비하였다. 모든 자돈들은 2ml 혼합액 (F4+ ETEC와 F18+ ETEC 각각 1 ×109 CFU/ml씩 합유)를 경구로 6주령 째에 도전 감염 하였다. 도전감염 후 14일 동안 모든 자돈들의 설사와 폐사가 모니터링 되었다. 도전감염 후 설사가 관찰되면 자돈의 직장 스왑 (swab)으로부터 도전감염 균주의 분리 동정을 실시하였고 분리된 균주 중 표 2에서 서술된 각 핌브리아-특이 프라이머로 PCR을 수행하였다. PCR 결과 도전감염 된 적어도 하나의 ETEC 핌브리아의 유전자 중 하나를 포함했다면 이는 도전감염에 의한 설사라고 간주하였다. 모든 이유자돈들은 생후 6주령 째에 경구로 도전감염 되었다. Group B에 속해있는 10마리의 이유 자돈 사이에서 단 한 마리도 설사를 하지 않았다. 이와 대조적으로, Group A의 자돈 10마리 중 7마리(70%)에서 설사가 관찰되었다.
Figure 112019047592629-pat00002
소화관은 소화와 영양흡수의 주된 공간이다. 게다가 장상피는 세균성 항원들과 독소들이 숙주를 감염하는 것을 예방하는데 중요한 역할을 한다. 신생돈의 intestinal status는 몇몇 요소들에 의해 변할 수 있다. 그런 요소들 사이에서, 젖먹이 돼지 및 이유 자돈들은 특별히 많은 세균성 감염에 예민하다. 그 이유로는 모돈 으로 부터의 분리 및 같이 자란 형제들이 아닌 크기가 비슷한 다른 무리의 자돈들과의 합사 그리고 익숙한 포유가 아닌 사료 및 환경의 변화 등으로 인해 스트레스를 받아 많은 세균에 민감한 시기이다. 점막면역은 전신성 면역(systemic immunity)보다 ETEC colibacillosis에 대한 방어에서 더 중요하다. 포유자돈을 위한 ETEC colibacillosis를 예방하기 위한 몇몇 산업용 모돈 vaccine들은 판매되고 있지만, 이유 자돈을 위한 백신은 아직까지 판매가 되고 있지 않다. 다만 최근에 이유자돈에서 병원성 대장균에 의해 주로 발생하는 부종병에 대한 백신 개발에 대한 연구가 진행되었거나 판매를 위한 막바지 단계에 이르렀을 뿐이다. 그러나 신생자돈에서의 대장균증을 예방하기 위한 포르말린 불활화 백신은 세균 표면 항원의 물리화학적 그리고 구조적 property를 바꾸어 포르말린-불활화 ETEC 백신들은 신생자돈에서 colibacillosis를 예방하는데 효과적이지 않을 수 있다. 그러므로 세균의 구조적 그리고 물리화학적 property들을 변화시키지 않는 새로운 백신을 개발하는 것이 필요하다. GI24 펩타이드에 의해 유도된 ETEC 고스트 백신은 세포에 대한 부착능을 가진 높은 면역원성을 가진 자연 표면구조(native surface structures)들을 유지한 체 세균 세포막에 구멍을 만들어 세포내 세포질성 물질들을 세포 밖으로 내 보내 결국은 불활화 한다. 그러므로 GI24로 유도된 고스트 백신 후보는 돼지에서 좀 더 향상된 vaccine candidate로 사용될 수 있다. 따라서 본 연구에서 GI24 펩타이드를 이유자돈에서 설사를 야기하는 F4+ ETEC와 F18+ ETEC를 고스트로 유도하였으며, 이렇게 유도된 이들 ETEC 고스트 백신 후보를 포유 자돈에 접종한 후 그들 자돈에서의 면역 유도 여부와 도전감염 균주에 대한 방어 여부를 확인하여 보았다. 그 결과 F4+ ETEC 및 F18+ ETEC 고스트 백신을 혼합접종한 그룹에서는 대조군에 비해 K88ac 및 FedA 항원에 대한 혈청 IgG가 유의성 있는 증가가 관찰되어, 이러한 결과는 새로운 ETEC 백신후보의 IM접종이 방어적 면역 반응을 효과적으로 유도할 수 있음을 보여준다. 백신 후보의 효능을 관찰하기 위해서, 모든 자돈은 wild-type의 ETEC strain으로 도전감염시켰다. 대조군인 그룹 A의 자돈에서의 도전감염 이후 설사가 70%에서 관찰되었다. 그러나 백신 접종된 그룹에서의 자돈은 거의 모든 자돈에서 설사가 관찰되지 않아 포유자돈에 고스트 백신후보를 근육 접종하는 것이 이유 후 자돈에서의 ETEC colibacillosis에 대한 방어에 효과적일 수 있다는 것을 보여주었다. 본 발명에서, 포유자돈에 ETEC 고스트 백신을 근육 접종함으로써 전신 면역 반응을 효과적으로 유도하는 것이 확인되었다. 또한 포유자돈에 근육접종한 후 wild-type virulent ETEC strains으로 도전감염 후에는 아무런 임상 증상이 관찰되지 않은 반면, 대조군 그룹의 자돈에서는 설사가 70% 관찰됐다. 그러므로 이러한 결과를 바탕으로 했을 때, 우리의 새로운 백신후보로 포유자돈을 근육 접종하는 것이 이유 후 ETEC colibacillosis를 방어하는데 효과적일 수 있음을 보여준다고 생각된다.
[미생물 기탁증]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13847BP
수탁일자 : 20190502
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY Komipharm International Co., Ltd <120> Vaccin compsosition for preventing or treating porcine pathogenic colibacillosis comprising ghost enterotoxigenic Escherichia coli as effective componet <130> 1065749 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protein of GI24 <400> 1 Gly Arg Phe Arg Arg Leu Arg Lys Lys Thr Arg Lys Arg Leu Lys Lys 1 5 10 15 Ile Gly Lys Val Leu Lys Trp Ile 20 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of F4 <400> 2 gctgcatctg ctgcatctgg tagtg 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of F4 <400> 3 ccactgagtg ctggtagtta cagcc 25 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer of F18 <400> 4 gtgaaaagac tagtgtttat ttc 23 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of F18 <400> 5 cttgtaagta accgcgtaag c 21

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. Fimbriae 4 (F4)를 발현하는 장관독소형 대장균 및 Fimbriae 18 (F18)을 발현하는 장관독소형 대장균은 혼합 균주이며, 미생물 기탁번호 KCTC13847BP(미생물 명칭: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) F4,F18)으로 기탁된 대장균 균주인, Fimbriae 4 (F4)를 발현하는 장관독소형 대장균 사균체 및 Fimbriae 18 (F18)을 발현하는 장관독소형 대장균에 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 GI24를 40 ug/ml의 농도로 반응시켜 제조된 장관독소형 대장균 사균체; 이의 배양물 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 돼지의 대장균증 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 백신 조성물은 모돈 또는 자돈에 접종하는 것을 특징으로 하는, 돼지의 대장균증 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  7. Fimbriae 4 (F4)를 발현하는 장관독소형 대장균 및 Fimbriae 18 (F18)을 발현하는 장관독소형 대장균은 혼합 균주이며, 미생물 기탁번호 KCTC13847BP(미생물 명칭: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) F4,F18)으로 기탁된 대장균 균주인, Fimbriae 4 (F4)를 발현하는 장관독소형 대장균 사균체 및 Fimbriae 18 (F18)을 발현하는 장관독소형 대장균에 서열번호 1의 아미노산으로 표시되는 GI24를 40 ug/ml의 농도로 반응시켜 제조된 장관독소형 대장균 사균체; 이의 배양물 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 돼지의 대장균증의 예방용 사료 첨가제.
KR1020190054525A 2019-05-09 2019-05-09 개선된 고스트 장관독소형 대장균를 유효성분으로 포함하는 돼지 대장균증의 예방 또는 치료용 백신 조성물 KR102100503B1 (ko)

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