KR20110023502A - 소의 병원성 대장균의 부착인자가 형질전환된 약독화 살모넬라균 변이주 및 이를 포함하는 소의 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신조성물 - Google Patents

소의 병원성 대장균의 부착인자가 형질전환된 약독화 살모넬라균 변이주 및 이를 포함하는 소의 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 소의 병원성 대장균의 부착인자(adhesin) 유전자를 포함하는, asd, lon 및 cpxR 유전자를 결실시킨 약독화 살모넬라균에 형질전환시킨 살모넬라 변이주; 및 이를 포함하는, 소의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 살모넬라 변이주의 제조방법; 및 상기 방법에 의하여 제조된 부착인자을 발현 분비하는 살모넬라 변이주를 생균 또는 사균 백신으로 준비하여, 모우 또는 자우에 접종하는 것을 특징으로 하는, 소의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료를 위한 백신화 방법을 제공한다. 이에 의하여, 소 점막 림프조직에 대장균 유래 항원을 효율적으로 전달하여 강력한 점막면역을 유도할 뿐 아니라 백신의 생산과 대량접종이 가능하고, 접종비용과 통증, 염증 등 부작용 감소와 함께 생산과 보관이 용이한 경제적 효과가 있다. 따라서, 살모넬라균에 대한 면역반응을 유도하여 감염을 예방할 뿐만 아니라 발현하는 외부항원에 대한 면역반응도 유도하므로 다가백신으로 사용가능하다.
소 병원성 대장균증, 살모넬라증, 약독화, 백신, 부착인자

Description

소의 병원성 대장균의 부착인자가 형질전환된 약독화 살모넬라균 변이주 및 이를 포함하는 소의 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신조성물{Vaccine composition for protection and treatment against pathogenic Escherichia coli and Salmonella in cattle by administration of attenuated Salmonella expressing adhesin gene of pathogenic Escherichia coli and vaccination method thereof}
본 발명은 소의 병원성 대장균증 및 살모넬라증의 예방 및 치료용 백신조성물 및 백신화 방법에 관한 것이다.
어린 송아지의 세균성 소화기 질병을 예방하기 위해 임신한 모우에 백신을 접종함으로써 형성된 항체를 초유를 통해 송아지에게 전달하는 방법은 모우의 면역항체를 전달하는 유일한 이행수단이자 가장 효과적인 예방접종법이다. 송아지 설사병과 같은 농가수익과 직결된 질병의 경우에는 백신 예방프로그램으로 항체 함량이 높은 초유를 공급하여 사전에 질병을 예방하는 것이 발병 후 치료하는 것에 비해 시간과 비용 면에서 효율적일 수 있다.
기존의 소 병원성 대장균 예방 백신들은 불활화 사균백신(killed vaccine) 이거나 K99, F41 선모 정제백신, 재조합 서브유닛 정제백신으로 수산화 알루미늄겔과 같은 면역증강제(adjuvant)와 혼합하여 근육으로 주사하는 형태로 개발되어 있다. 불활화 사균백신의 경우 특이 항원에 대한 면역반응이 잘 유도되지 않거나 선모 정제백신의 경우 발현유도 및 정제과정이 번거롭고, 재조합 서브유닛 정제 백신의 경우 항원의 분리정제 및 면역성을 증강시켜야 하는 까다로운 제조 공정과정을 거쳐야 한다. 또한, 변성을 방지하고, 백신 부작용을 줄이기 위해 안정적으로 보관해야 하며 각 개체를 주사기를 이용해 접종해야 하는 불편함뿐만 아니라 주사기를 이용하여 항원을 투여하는 경우 소화기 관련 림프조직 또는 점막 관련 림프조직에 항원이 노출되지 않아 점막면역을 강력하게 활성화하지 못하는 단점이 있으며, 구강으로 정제백신을 투여하는 경우에도 소화기관내 낮은 pH 조건등에서 변성이 발생되므로 면역원성을 유지하기는 어렵다.
이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 생백신균을 이용한 동물질병예방 백신개발이 도입될 수 있는데, 생백신 개발에 이용하는 미생물은 동물병원균으로 소화기관련 림프조직 또는 점막관련 림프조직에 부착, 침투한 후 집락을 이룰 수 있어야 한다. 주사기를 이용하는 경우에 비해 생백신은 감염경로인 구강 또는 비강과 같은 점막부위에서 면역반응을 충분히 유도가능하여 병원균의 감염을 효과적으로 방어할 수 있게 된다. 생백신균을 사용하는데 있어 살모넬라균을 다가백신(multivalent)으로 개발하기 위해서는 살모넬라 자체의 병원성을 약화시키고, 외부항원을 발현하여 세포외로 분비할 수 있는 분비체계를 갖추는 방법이 여러 가지로 시도되어 왔으며, 면역원성을 높이기 위해 림프조직 침투력이 증가될 수 있도록 접근이 이루어져 왔다. 외부항원 발현과 균주 선택을 위해서는 asd 유전자를 근간으로 한“balanced-lethal host-vector" 시스템이 개발되었는데, 약독화 살모넬라균주의 peptidoglycan 합성에 필요한 aspartate β-semialdehyde dehydrogenase(asd) 유전자를 결실하여 DAP(diaminopimelic acid) 요구주가 되게한 후 외부항원 유전자를 갖는 asd 플라스미드로 형질전환함으로써 외부항원을 발현시킬 수 있고, 항생제 없이 해당균주를 선택할 수 있도록 하였다. 발현항원의 세포외 분비는 핵심 기술로서 세포 외분비 단백질에 재조합하는 형태로 분비시키거나 β-lactamase signal peptide를 이용하는 방법이 사용되고 있다. 그러나, 발현항원에 대한 면역반응을 충분히 유도하기 위해서는 대량으로 분비될 수 있도록 세포외 분비능력이 더욱 향상되어야 한다.
이에, 본 발명은 signal peptide와 함께 lepB (signal peptidase), secA (ATPase), secB (chaperone) 유전자가 발현되어 재조합 항원의 세포외 분비효율이 향상된 플라스미드 벡터에 소 병원성 대장균의 주요 부착인자 유전자를 재조합 하였고, 이들 항원이 재조합된 플라스미드로 약독화 살모넬라균을 형질전환시켜 백신균을 제조하였다. 형질전환에 사용한 약독화 살모넬라 백신균은 asd 유전자가 결실된 DAP요구주로서 항생제 없이 항원 재조합 균주를 선택할 수 있도록 제작되었을 뿐만 아니라, cpxR을 결실시킴으로써 림프조직 침투력이 증가되어 면역원성을 높이거나 crp 또는 lon 유전자를 결실하여 병원성이 약독화된 것을 특징으로 한다.
백신의 면역원성을 증강시키는 면역증강제로는 병원성 대장균 유래 LTB(heat-labile enterotoxin B subunit), 콜레라균 유래 CTB(cholera toxin B subunit)에 대한 연구가 활발하다. 독소의 독성부위를 제외한 비독성 서브유닛으로서 외부항원과 chimeric 구조를 형성하거나 동시에 투여된 후 면역반응을 증강시키기 때문에 본 발명과 같이 소 병원성 대장균과 살모넬라 예방 백신을 개발하는데 있어 경구용 면역증강제로 활용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 생백신 개발조건에 적합할 뿐 아니라 소 병원성 설사 원인균으로 직접적인 문제가 되는 살모넬라균을 이용하여 약독화 살모넬라 백신균을 병원성 대장균 유래 항원 운반체로 활용하는 경구투여 백신을 도입하고자 한다.
본 발명의 목적은 소의 병원성 대장균의 부착인자 유전자를 포함하는 살모넬라균 변이주 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 살모넬라 변이주를 포함하는 소의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신 조성물, 및 이를 이용한 백신화 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소의 병원성 대장균 부착인자 유전자 K99(fanC), F41(fim41a), Intimin(eaeA), F17(f17A), F17(f17G), CS31A(clpG), Afa(afa8D) 및 Afa(afa8E)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 유전자, 및 asd 유전자를 포함하는, lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주를 제공한다.
또한, 본 발명은 소의 병원성 대장균(E. coli) LTB(heat-labile enterotoxin B subunit) 유전자; 및 asd 유전자를 포함하는, lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주를 제공한다.
또한, 본 발명은 소의 병원성 대장균 부착인자 유전자 K99(fanC), F41(fim41a), Intimin(eaeA), F17(f17A), F17(f17G), CS31A(clpG), Afa(afa8D) 및 Afa(afa8E)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 유전자, 및 asd 유전자를 포함하는, lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주 중 어느 하나 이상을 포함하는, 혼합 살모넬라균 변이주를 제공한다.
또한, 본 발명은 소의 병원성 대장균(E. coli) LTB(heat-labile enterotoxin B subunit) 유전자; 및 asd 유전자를 포함하는, lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주 및 소의 병원성 대장균 부착인자 유전자 K99(fanC), F41(fim41a), Intimin(eaeA), F17(f17A), F17(f17G), CS31A(clpG), Afa(afa8D) 및 Afa(afa8E)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 유전자, 및 asd 유전자를 포함하는, lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주 중 어느 하나 이상을 포함하는, 혼합 살모넬라균 변이주를 포함하는, 혼합 살모넬라균 변이주를 제공하며, 본 발명자들은 이 혼합 살모넬라균 변이주를 기탁기관(한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC))에 기탁하였다(기탁번호 KCTC11542BP).
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 살모넬라균 변이주를 포함하는, 소의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신 조성물를 제공한다.
바람직하게는, 상기 소의 병원성 대장균증은, 소화기 질환, 부종병(edema disease), 호흡기 질환 또는 비뇨생식기계 질환이다.
바람직하게는, 상기 소화기 질환은 송아지 설사증 또는 소 바이러스 설사병(BVD-MD)을 포함한다.
바람직하게는, 상기 소의 병원성 대장균은 장독성 대장균 (entrotoxigenic Escherichia coli; ETEC), 장병원성 대장균 (enteropathogenic Escherichia coli; EPEC), 또는 장침입성 대장균(enteroinvasive E. coli; EIEC)을 포함한다.
바람직하게는, 상기 살모넬라는 살모넬라 타이피무리엄(Salmonella typhimurium), 살모넬라 타이피(S. typhi), 살모넬라 파라타이피(S. paratyphi), 살모넬라 센다이(S. sendai), 살모넬라 갈리나리움(S. gallinarium) 및 살모넬라 엔테리티디스(S. enteritidis)을 포함한다.
바람직하게는, 상기 형질전환시킨 살모넬라 변이주는 생균 또는 사균이며, 사균은 가열 또는 포르말린으로 불활화시킨 사균을 포함한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 또는 비강 경로로 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 백신 조성물을 포함하는, 소의 면역증강 또는 성장 촉진을 위한 사료 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 소의 병원성 대장균 부착인자 유전자 K99(fanC), F41(fim41a), Intimin(eaeA), F17(f17A), F17(f17G), CS31A(clpG), Afa(afa8D) 및 Afa(afa8E)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 유전자를 증폭시키는 단계; (b) 상기 부착인자 유전자를 asd 유전자를 가진 플라스미드에 클로닝하는 단계; (c) 살모넬라 균주의 염색체 DNA에서 lon, cpxR 및 asd 유전자를 결실시켜 약독화 살모넬라 균주를 제조하는 단계; (d) 단계 (b)의 클로닝된 플라스미드를 단계 (c)의 약독화 살모넬라 균주에 형질전환시키는 단계; 및 (e) 형질전환된 살모넬라 변이주를 선별하는 단계를 포함하는 살모넬라 변이주를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 소의 병원성 대장균(E. coli) LTB(heat-labile enterotoxin B subunit) 유전자를 증폭시키는 단계; (b) 상기 LTB 유전자를 asd 유전자를 가진 플라스미드에 클로닝하는 단계; (c) 살모넬라 균주의 염색체 DNA에서 lon, cpxR 및 asd 유전자를 결실시켜 약독화 살모넬라 균주를 제조하는 단계; (d) 단계 (b)의 클로닝된 플라스미드를 단계 (c)의 약독화 살모넬라 균주에 형질전환시키는 단계; 및 (e) 형질전환된 살모넬라 변이주를 선별하는 단계를 포함하는 살모넬라 변이주를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 살모넬라균 변이주를 생균 또는 사균 백신으로 준비하여, 모우 또는 자우에 접종하는 것을 특징으로 하는, 소의 병원성 대장균증 및 살모넬라증의 예방 및 치료를 위한 백신화 방법을 제공한다.
상기 백신화 방법에서, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 또는 비강 경로로 백신을 접종할 수 있다. 바람직하게는, 1차 및 2차 접종시 생균 백신을 경구로 접종할 수 있다. 보다 바람직하게는, 1차 및 2차 접종시 생균 백신을 경구로 접종하되, 2차 접종시 LTB를 발현 분비하는 살모넬라 변이주를 제외한 생균 백신을 접종할 수 있다.
상기한 과제해결수단에 따르면, 본 발명에 따른 백신 조성물은 소 점막 림프조직에 대장균 유래 항원을 효율적으로 전달하여 강력한 점막면역을 유도할 뿐 아니라 백신의 생산과 대량접종이 가능하고, 접종비용과 통증, 염증 등 부작용 감소와 함께 생산과 보관이 용이한 경제적 효과가 있다. 따라서, 살모넬라균에 대한 면역반응을 유도하여 감염을 예방할 뿐만 아니라 발현하는 외부항원에 대한 면역반응도 유도하므로 다가백신으로 사용가능하다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.　 본 발명에서 인용된 문헌은 본 발명의 명세서에 참조로서 통합된다.
실시예
실시예 1: 유전자의 준비 및 재조합
<1-1> 균주의 선정
단백질 발현과 재조합 백신 제작을 위한 각 부착인자 유전자는 병원성 대장균인 JOL412(K99 발현), JOL413(K99 및 F41 발현), JOL132(Intimin 발현), JOL426(F17 및 CS31A 발현), JOL462(Afa 발현)으로부터 확보되었다. 또한, 병원성 대장균 분리주인 JOL412(K99 발현), JOL695(F41 발현), JOL681(Intimin 발현), JOL465(F17 발현), JOL873(CS31A 발현), JOL686(Afa 발현)을 도전감염 균주로 사용하였다.
상기 균주들은 DAP를 첨가하지 않은 LB(Luria-Bertani) 배지에서 배양되었다. 병원성 대장균(Escherichia coli χ7213, JOL767) [F-λ- Φ80Δ(lacZYA-argF) endA1 recA1 hsdR17 deoR thi-1 glnV44 gyrA96 relA1 ΔasdA4 Δlon ΔcpxR] 및 약독화 살모넬라 티피무리움 (JOL912, Δasd Δlon ΔcpxR)은 DAP(diaminopimellic acid)(50 ㎍/ml)이 포함된 LB 배지에서 배양되었다. asd 플라스미드 pBP244에 재조합된 각 병원성 대장균부착인자를 발현 및 분비하는 약독화 살모넬라 티피무리움은 DAP을 포함하지 않은 LB 아가(agar)에서 선택되었다(표 1, 도 2 참조).
실시예에 사용된 균주 및 플라스미드
균주 설명 균주 입수방법
클로닝 제작용 JOL413 K99 부착인자 유전자 fanC 주형 Escherichia coli
F41 부착인자 유전자 fim41a 주형 Escherichia coli 		국립수의과학검역원 E-92
JOL132 Intimin 부착인자 유전자 eaeA 주형 Escherichia coli ATCC43889, 43894
JOL426 F17 부착인자 유전자 f17A, 및 f17G 주형 Escherichia coli
CS31A 부착인자 유전자 clpG 주형 Escherichia coli 		E.coli G.C.V
F17, CS31A,
JOL462 Afa 부착인자 유전자 afaD, 및 afaE 를 발현하는 Escherichia coli Le Bouguenec 등
Vet.Res.,1999,30:317-42
JOL908 pBP244 (Asd 발현 플라스미드)를 가진 Escherichia coli χ7213 Kim 등 J.Microbiol.
Biotechnol., 2007, 17:1316-1323
숙주세포 JOL767 Escherichia coli χ7213 Δlon ΔcpxR Δasd Kim 등 J.Microbiol.
Biotechnol., 2007, 17:1316-1323
JOL912 Salmonella Typhimurium CK110 Δlon ΔcpxR Δasd 특허등록번호 10-0873168
기탁번호
KCTC 11540BP
백신균주 JOL950 Escherichia coli의 fanC를 발현하는 약독화 살모넬라균 기탁번호 KCTC 11542BP
JOL951 Escherichia coli의 fim41a를 발현하는 약독화 살모넬라균
JOL953 Escherichia coli의 eaeA를 발현하는 약독화 살모넬라균
JOL825 Escherichia coli의 f17G를 발현하는 약독화 살모넬라균
JOL952 Escherichia coli의 f17A를 발현하는 약독화 살모넬라균
JOL954 Escherichia coli의 clpG를 발현하는 약독화 살모넬라균
JOL955 Escherichia coli의 afa8D를 발현하는 약독화 살모넬라균
JOL956 Escherichia coli의 afa8E를 발현하는 약독화 살모넬라균
JOL906 Escherichia coli의 eltB를 발현하는 약독화 살모넬라균
도전감염균주 JOL412 K99 부착인자를 발현하는Enterotoxigenic Escherichia coli, K99, STa E. coli G.C.V.
K99
JOL695 F41부착인자를 발현하는 Enterotoxigenic Escherichia coli, F41, STa 국립수의과학검역원 (ETEC E-92
O9:K35, K99, F41)
JOL681 Intimin 부착인자를 발현하는 Enterohemorrhagic Escherichia coli eaeA, Stx1, Stx2 Lee.,Vet.Microbiol.,2009,30;135:401-5
JOL465 F17 부착인자를 발현하는 Enteroinvasive Escherichia coli F17, ColV, Ius E. coli G.C.V.
F17, ColV, Ius
JOL875 CS31A 부착인자를 발현하는 Enteroinvasive Escherichia coli, CS31A, ColV E. coli G.C.V.
CS31A, ColV
JOL686 Afa 부착인자를발현하는 Enteroinvasive Escherichia coli, Afa, Stx1 E. coli G.C.V.
Afa, Stx1
약독화 살모넬라 티피무리움(JOL912, Δlon ΔcpxR Δasd) 에서 결실된 유전자의 서열정보는, lon의 경우 GeneBank FJ609803.1, cpxR은 GeneBank AE006468.1, asd는 GeneBank AF015781.1에서 용이하게 입수할 수 있다. 본 발명자들은 상기 약독화 살모넬라 티피무리움(Δlon ΔcpxR Δasd)균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(기탁번호 KCTC11540BP, Samonella enterica serovar Typhimurium strain JOL912, 2009년 8월 3일 기탁).
<1-2> 병원성 대장균의 DNA 추출 및 부착인자 유전자 증폭
병원성 대장균의 DNA 추출은 통상적인 heating lysis 방법에 따라 준비하였다. 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)으로 해당 부착인자의 주요 서브유닛 유전자 발현이 확인된 병원성 대장균을 LB 아가에 접종하여 37℃에서 하룻밤 배양 한 후 한 클로니를 선택하여 1 ㎖ LB 배지에서 16시간 배양하였다. 이를 원심분리하여 상층 배양액을 제거하고 멸균 증류수로 1회 세척한 후 50㎕ 멸균 증류수를 첨가하여 95℃에서 20분간 가열하였다. 원심분리한 후 상청액만을 멸균 소형튜브로 옮겨 병원성 대장균의 DNA로 추출, 보관하였다.
각 부착인자 유전자는 플라스미드 벡터에 재조합하기 위해 염기서열내에 제한효소 절단부위를 갖도록 고안한 프라이머(표 2)를 이용하여 PCR 기법으로 증폭하였다. 증폭된 유전자는 전기영동으로 크기를 확인하였고 염기서열결정(sequencing)으로 해당 염기서열이 바르게 증폭되었음을 확인하였다. 후속하여, 증폭된 각 유전자를 전기영동 분리 후 아가로스 겔로부터 AccuPrep 겔 정제키트(Bioneer, Korea)를 이용하여 정제하였다.
구분 유전자 프라이머 (5‘→3’) 제한 효소
명칭및 크기(bp)
ETEC K99 fanC 480 F CCGCGAATTCATGAATACAGGTACTATTAACTTC EcoRI
R CCGCAAGCTTTTACATATAAGTGACTAAGAAGGA HindⅢ
F41 fim41a 765 F CCGCGAATTCATGGCTGATTGGACGGAAGGT EcoRI
R CCGCAAGCTTTTAACTATAAATAACGGTGAT HindⅢ
EPEC Intimin eaeA 777 F CCGGGATCCGATGAAAAACGGTCAGCCAGT BamHI
R CCGAAGCTTTATTTTAGCCGGGGTGGTTAT HindⅢ
EIEC F17 f17A 480 F CCGCGAATTCATGTATGACGGTAAAATTACT EcoRI
R CCGCAAGCTTTTACTGATAAGCGATGGTGT HindⅢ
F17 f17G 969 F CCGGAATTCATGGCAGTTTCATTTATTGGCAG EcoRI
R CCGAAGCTTTTACTGATAGGAAAATG HindⅢ
CS31A clpG 774 F CCGGAATTCATGTGGACCACTGGTGATTTTAAT EcoRI
R CCGAAGCTTTTAGTTATAAGTTACTGCCA HindⅢ
Afa afa8D 354 F CCGGGATCCGATGGTTGAACTGAGTCTT BamHI
R CCGAAGCTTTTATGAGCATTCTCCGC HindⅢ
Afa afa8E 456 F CCGGGATCCGATGCTAACTTGCCATGCTGTGA BamHI
R CCGAAGCTTTCAGTCGGTCCAAGTAGT HindⅢ
상기 프라이머를 이용하여 증폭시킨 유전자의 서열정보는, K99(fanC)는 Genebank M35282.1; F41(fim41a)는 GenBank X14354.1; Intimin(eaeA)는 Genebank EF079676.1; F17(f17A) 및 F17(f17G)는 GenBank AF022140.1; CS31A(clpG)는 Genebank M55389.1; Afa(afa8D), Afa(afa8E)는 GenBank AF072900.3 및 LTB는 GenBank EU113255.1에서 용이하게 입수할 수 있다.
<1-3> 부착인자를 발현하는 대장균의 제작
정제한 각 부착인자 유전자의 PCR 증폭산물과 단백질 과발현에 사용할 플라스미드, pQE9, pQE10, pET28a 벡터를 상응하는 제한 효소로 절단한 후 분리 정제하여 T4 DNA 리가아제(Takara, Japan)로 두 산물을 라이게이션 하였다. 단백질 과발현 균주로서 E. coli JM109 또는 E. coli Top 10을 상기 재조합 벡터로 형질전환하였고, 형질전환된 균주는 해당 항생제 마커를 포함한 선택배지에 배양하여 선택하였다. 각 형질전환 균주로부터 부착인자 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 AccuPrep 플라스미드 추출 키트 (Bioneer, Korea)를 이용하여 재분리한 후 표 2의 해당 제한 효소 절단으로 크기를 확인하였고 염기서열결정으로 벡터내에서 ORF(open leading frame)가 바르게 형성된 것을 확인하였다.
상기 재조합이 확인된 부착인자 과발현 균주는 항생제가 첨가된 1㎖ LB 배지에 접종하여 12시간 배양한 후 5㎖ LB broth에 재접종하여 재조합 부착인자 유전자로부터 해당 단백질이 발현되는지 여부를 확인하기 위해 IPTG(isopropyl-βD-thiogalactopyranoside) 첨가로 발현을 유도하였다. 초음파로 세포를 분쇄하여 상층액)과 재부유액으로 구분하여 샘플을 준비한 후, 발현 유도전 대조군과 함께 과발현 유도후 시료를 SDS-PAGE하여 각 부착인자의 발현 여부 및 과발현 상태, 발현단백질의 가용성 또는 불용성 여부를 확인하였다.
<1-4> 각 부착인자 단백질 정제 및 항혈청 준비
상기와 같이, 부착인자 발현이 확인된 각 재조합 균주는 IPTG를 첨가하여 배양한 배양액으로부터 세포만을 분리하여 10㎖의 1mM PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride) -PBS로 재부유하였다. 이를 2 - 3회 -70℃ 동결 후 37℃ 수조에서 해동과정을 반복한 후 초음파로 세포를 분쇄하였고, 이를 원심분리하여, 가용성 발현 단백질을 포함한 상층액은 4㎖ 버퍼 B (100mM NaH2PO4, 10mM Tris. Cl, 8M urea, pH 8.0), 불용성 발현 단백질을 포함한 침전물은 6㎖의 버퍼 B와 각기 혼합하여 실온에서 1시간 교반, 반응시켰다. 이를 원심분리하여 상층액은 단백질과 레진이 결합하도록 30분간 교반하였고, 교반 후 이를 유리섬유가 장착된 분리관에 흘려보낸 후 6㎖ 버퍼 C (100mM NaH2PO4, 10mM Tris. Cl, 8M urea, pH 6.3)로 불필요한 단백질을 세정, 제거하였다. 2㎖ 용출 버퍼(100mM NaH2PO4, 10mM Tris. Cl, 8M urea, pH 4.5)로 발현 단백질을 분리시킨 후 1㎖씩 첨가하여 단백질을 추가분리하였다. 정제한 단백질은 SDS-PAGE하여 정제상태를 확인하였고, 정량 후 -70℃에 보관하며 항혈청 제작 및 ELISA 항원으로 사용하였다.
각 부착인자 단백질의 항혈청은 뉴질랜드 흰토끼(New Zealand white rabbit) 암컷에 각 부착인자 단백질과 프로인드 면역증강제를 (Freund's adjuvant)혼합하여 2회 피하 접종한 후 채혈하여 혈청을 분리하여 준비하였고, 분리한 혈청은 -70℃에 보관하였다. 토끼 혈청내 항-부착인자 항체는 각 서브유닛 단백질을 항원으로 하여 웨스턴 블랏으로 확인하였고(도 3a 및 3b), 소 백신접종 후 유도된 면역반응을 분석하는데 ELISA의 coating 항원으로 사용하였다.
실시 예 2: 각 부착인자를 발현·분비하는 약독화 살모넬라 티피무리움의 제작 및 선별
<2-1> 병원성 대장균 부착인자 유전자의 pBP244 플라스미드 재조합
백신균주의 플라스미드 벡터인 pBP244 (Kim et al.,2007, Journal of Microbiology and Biotechnology, 17: 1316-1323) 는 외부 항원의 분비가 증가되도록 SecA, SecB 그리고 LepB를 발현하며, asd 유전자를 갖는 E. coli와 Salmonella 셔틀 플라스미드이다. 상응하는 동일 제한효소로 절단된 각 부착인자 유전자와 pBP244 절편을 정제키트를 이용하여 아가로스 전기영동 겔로부터 정제하고, T4 DNA 리가아제를 이용하여 라이게이션한 후, 이 반응액으로 E. coli χ7213 (JOL767)을 형질전환시켜 DAP을 첨가하지 않은 LB 아가에서 배양한 후 형질전환균주를 선택하였다. 각 부착인자의 재조합은 E. coli χ7213으로부터 플라스미드를 분리하여 제한 효소 절단법으로 확인하였고, 염기서열결정법으로 재조합된 유전자의 ORF가 바르게 형성된 것을 확인하였다.　　
<2-2> 약독화 살모넬라 티피무리움에 형질전환
상기 재조합 및 염기서열이 최종 확인된 각 플라스미드를 정제하여 전기천공법(electroporation)으로 살모넬라 백신 균주, JOL912 (Δasd Δlon ΔcpxR)를 형질전환시켰다. JOL 912를 DAP (50㎍/㎖)이 포함된 LB broth에서 배양 한 후 ice-cold 10% 글리세롤 함유 증류수로 두 번 세척하여 정제한 재조합 플라스미드와 섞은 후 MicroPulser (Bio-Rad, USA)에서 전기천공을 시행하였다. 이를 1㎖ LB broth 를 첨가하여 1시간 동안 배양한 후 DAP를 첨가하지 않은 LB 배지에서 16시간 배양한 후 형질전환된 해당균주를 선별하였다. 면역증강제로 사용할 E. coli의 haet-labile toxin subunit B (LTB)를 발현하는 생백신 균주 (JOL906)도 동일 방법으로 제작하였다.
<2-3> 항원의 세포외 분비효율이 높은 소 다가백신균주 선별
상기 제작된 소 다가백신 균주가 병원성 대장균 부착인자의 주 서브유닛을 세포 파괴없이 세포외로 분비하는 것을 확인하였고, 그 분비효율을 비교하여 최종 소 다가 생백신 균주로 선별하였다. 주요 서브유닛 단백질의 세포외 분비를 확인하기 위해서 각 백신균주 2x109 CFU의 배양 상층액만을 분리 및 여과한 후 10 % TCA 법으로 농축하였고, SDS-PAGE 후 항-부착인자 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 세포외 분비량을 비교하였다. 그 결과, pBP244 플라스미드 벡터에 서브유닛 유전자를 재조합하여 형질전환시킨 백신균주에서 세포외 분비 효율이 높았다. 최종적으로 소 다가백신 균주로는 K99-JOL950 (fanC), F41-JOL951 (fim41a), Intimin-JOL953 (eaeA), F17A-JOL825 (F17A), F17G-JOL952 (F17G), CS31A-JOL954 (clpG), AfaD-JOL955 (afa8D), AfaE-JOL956 (afa8E), LTB-JOL906 (eltB)을 선별하였다 (표 3, 도 3c 참조).
각 부착인자의 서브유닛 유전자로부터 발현된 단백질을 항원으로 제작된 항-부착인자 항체는 해당 병원성 대장균주를 항원으로 인식하였으므로, 소에서 살모넬라 백신에 의해 분비되는 부착인자 항원에 대한 면역항체는 병원성 대장균 항원을 인식, 방어하는데 기여할 수 있다.
균주명 재조합 백신균주의 특징
JOL950 Attenuated Salmonella expressing fanC K99 ETEC
JOL951 Attenuated Salmonella expressing fim41a F41
JOL953 Attenuated Salmonella expressing eaeA Intimin EPEC
JOL825 Attenuated Salmonella expressing F17A F17 EIEC
JOL952 Attenuated Salmonella expressing F17G
JOL954 Attenuated Salmonella expressing clpG CS31A
JOL955 Attenuated Salmonella expressing afa8D Afa
JOL956 Attenuated Salmonella expressing afa8E
JOL906 Attenuated Salmonella expressing eltB Heat labile toxin Toxin
본 발명자들은 소의 병원성 대장균 부착인자 유전자 K99(fanC), F41(fim41a), Intimin(eaeA), F17(f17A), F17(f17G), CS31A(clpG), Afa(afa8D) 및 Afa(afa8E)인 8개의 살모넬라균 변이주 모두를 포함하는 혼합 살모넬라균 변이주와, 소의 병원성 대장균의 LTB(heat-labile enterotoxin B subunit) 유전자를 포함하는 살모넬라균 변이주를 포함하는, 혼합 살모넬라 변이주를 한국생명공학연구원에 기탁하였다(기탁번호 KCTC11542BP).
실시예 3: 백신 조성물의 제작
동일 백신균주를 구강 생백신, 근육 생백신, 근육 또는 피하 사백신의 형태로 제작하였다(도 4). 구강접종의 경우 접종량을 모우 10 ml, 자우 5 ml로, 근육 또는 피하접종량을 2 ml로 제작하였다.
실시예 2에서 최종 선별된 소 다가백신 균주를 각각의 LB 액체배지에서 16시간동안 배양한 후 생백신은 예방접종 당일, 사백신은 불활화 상태를 확인하기 위해 예방접종 2일전에 본 배양을 하였다. 배양된 백신균주를 각기 접종균수에 맞게 채취하여 PBS로 세척하였고, 이를 백신 조성물의 형태에 따라 부유액을 구분하여 재부유시켰다.
따라서, 구강 생백신은 0.05 % 젤라틴-PBS에 재부유하였고, 근육 생백신은 2 ml PBS에 부유시켜 예방접종에 사용하였다. 또한, 사백신은 최종농도 0.5 % 포르말린-PBS가 되도록 재부유한 후 20 ℃에서 12시간 동안 불활화 하였다. 불활화 백신균체는 PBS로 2회 세척하였고, 이를 20시간 배양하여 불활화 여부를 확인한 후 수산화 알미늄겔을 면역증강제로 혼합하여 사백신으로 예방접종에 사용하였다.
실시예 4: 백신 조성물의 효과 확인
<4-1> 접종량의 결정 및 개별 변이주의 백신 효능 실험
도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, 접종량은 5x1010 CFU로 모우 예방접종 후 초유에서 높은 항체 역가가 유도되어 이를 접종량으로 결정하였다. 도 5a는 LTB 균주 투여에 의한 1차 접종 후 분변 sIgA의 증가를 나타낸 것이며, 도 5b는 초유 항체역가에 따른 접종량을 나타낸 것이다. 또한, 도 5b에서 NC 실험군은 대조군으로서 모우 백신접종을 실시하지 않은 것이고, 1x1010 CFU는 2회 구강생백신 접종군으로서, 분만 8주전 1차(LTB 제외) 및 분만 5주전 2차 접종한 것이고, 5x1010 CFU는 2회 구강생백신 접종군으로서, 분만 8주전 1차(LTB 포함) 및 분만 5주전 2차 접종한 것이다.
한편, 각 백신균주별 모우 접종량 결정을 위하여, JOL825 접종군과 JOL953 접종군을 각 1x109 CFU와 5x109 CFU로 구분하여 2회 구강접종하였다. 접종량별 두 실험군 모우에서는 모두 부작용이 관찰되지 않았다. 그러나, 이로부터 출생한 자우 도전감염에서 1x109 CFU 접종군 출생자우에서 설사가 유도된 반면 5x109 CFU 접종군 출생 자우에서 모두 설사가 유발되지 않아 이를 각 병원성 대장균 부착인자 발현 백신주 접종량으로 하였다.
<4-2> 모우에서 접종 경로별 백신 효능 실험
표 4에 나타낸 바와 같이, 임신한 모우에서 접종경로를 달리하여 예방접종을 시행한 후, 각 서브유닛과 살모넬라 LPS에 대하여 유도된 면역반응을 분석하였다. 면역반응은 예방접종 후 혈청, 분변, 초유 및 우유 시료내 IgG, IgA 항체역가를 ELISA로 정량하여 분석하였고, 항체 정량시 각 서브유닛 단백질과 살모넬라 LPS를 분리정제하여 포획 항체로 사용하였다.
Figure 112009053524978-PAT00001
모우 예방접종군은 A, B, C, D, 및 NC군으로 구분하여, 1회당 5x1010 CFU를 접종하였는데 1차 접종을 구강 생백신으로 시행한 경우에는 LTB 균주(strain)를 포함하여 접종하였다. 이때, A는 2회 구강 생백신을 접종한 실험군으로, 분만 8주전에 1차 접종, 분만 5주전에 2차 접종을 시행하였다. 또한, B는 분만 8주전에 1차 구강 생백신을 접종한 후 5주전 2차 근육 사백신을 병행하여 접종한 실험군, C는 B군의 접종경로 순서를 반대로 하여 분만 8주전 1차 근육 사백신을 접종한 후 5주전 2차 구강 생백신을 접종한 실험군, D는 2회 근육 사백신을 분만 6주전에 1차 접종, 분만 3주전에 2차 접종을 시행한 실험군, 및 NC는 모우에서 백신을 접종하지 않고, PBS만을 투여한 후 실험군 모우로부터 출생한 자우에서 생후 60 시간내와 5주령 도전감염을 실시한 실험군이다. 또한, A1, B1, C1, 및 NC1은 모우로부터 출생한 자우 중 생후 60시간내의 도전감염을 실시한 실험군이며, A2, B2 및 C2는 모우로부터 출생한 자우 중 2 주령 백신 접종 후 5주령 도전감염을 실시한 실험군, NC2는 NC 실험군의 모우로부터 출생한 후 5주령 도전감염을 실시한 실험군, CC는 모우 백신을 접종하지 않고, 자우 2주령 백신을 투여한 후 5주령 도전감염을 실시한 실험군이다.
이때, LTB 균주를 1차 구강 생백신 접종에 포함하여 실시한 것은 분변시료를 통해 분석한 장내 sIgA(secreted IgA) 항체역가가 LTB 균주를 첨가하지 않고, 백신을 접종한 실험군에서 접종 3주 후 높았던 것과 비교하여 접종 1주 후 그보다 높은 분변 sIgA 역가로서 장내 면역반응을 나타냈기 때문이다.
NC 실험군에서 분만 8주전부터 분만후 1주까지 병원성 대장균 주요 서브유닛 단백질과 살모넬라 LPS에 대한 혈청 IgG, IgA, 및 분변 sIgA를 1주별로 정량한 결과, 분만 8주 전 혈청 IgG는 각 항원에 대해 개체별로 다양한 정량가를 보였지만 분만직 후 혈청 IgG의 평균량은 공통적으로 감소하였다. 분만 예정일에 가까울수록 모든 항원에 대한 혈액 내 IgG는 점차 감소하였고, 분만 직후 최저량이었다가 분만 후에는 분만 전 약 3 ~ 6주 동안 감소되었던 항체가 가 1주 내에 대체적으로 회복되었다. 반면, 혈청 IgA는 분만시까지 증가하는 양상으로 항원에 따라 분만 3주전부터 분만직후 최대 역가를 보였다. 분만시점과 연관되어 혈청 IgG의 감소가 현저했던 반면 IgA는 증가되는 특징이 나타났다.
또한, 장내 sIgA는 분만전 1 ~ 2주 사이에 분비가 증가되었으며, 분만직 후에는 이보다 감소하였다. 분만 직후 모우로부터 분비되는 초유와 주별 우유 IgG, IgA는 개체별로 총 항체량과 동일 항원에 대한 항체역가에서 크게 차이를 보였는데, 초유의 항체가 분만 당시 혈중 항체량에 비교할 수 있는 함량이어도 분만 당시 혈중 항체함량이 높은 개체가 초유의 항체가도 함께 높은 것이 아님을 나타내었다. 대조군에서는 공통적으로 분만 3일 후 초유 항체역가가 크게 감소하였고, 1주 후에는 일반우유와 거의 차이가 없었다.
이후, 상기 NC 실험군의 항체가 변화양상과 항체역가를 기준으로 하여 모우 백신 접종의 효능을 분석하고자 한다.
<4-2> 항체 역가 실험
임신한 모우에 백신을 접종한 결과, 2회 구강 생백신 접종군인 A 실험군은 분만시점 초유 IgG 및 IgA, 혈청 IgG 및 IgA, 분변 sIgA에서 항원별로 골고루 높은 역가를 보였다(도 6, 도 7a 및 도 7b, 도 8 및 도 9).
도 6 내지 도 9에서, NC는 모우 백신 미접종 실험군, A는 분만 8주전 1차 구강 생백신 접종, 및 분만 5주전 2차 구강 생백신 접종의 실험군, B는 분만 8주전 1차 구강 생백신 접종, 및 분만 5주전 2차 근육 사백신 접종의 실험군, C는 분만 8주전 1차 근육 사백신 접종, 및 분만 5주전 2차 구강 생백신 접종의 실험군, D는 분만 6주전 1차 근육 사백신 접종, 및 분만 3주전 2차 근육 사백신 접종의 실험군을 나타낸 것이다.
접종시기를 결정하기 위한 예비실험군에서 첫 번째 백신접종을 실시한 시기가 분만시점에 가까울수록 혈청 IgG의 역가가 높았고, 초유내 항체도 IgA 보다는 IgG가 발달한 특징이 있었다.
A 실험군
A 실험군은 초유 IgG, IgA 항체역가가 모두 높았다. 특히 분만 1주후에도 비교적 높은 초유 IgA 항체가를 보여 NC 실험군의 초유 IgA 항체역가가 거의 감소되는 것과는 비교되었다(도 7 참조). 혈청 IgG는 1차 접종 3주 후 높은 역가를 보이다가 분만시에 접종 3주 후보다는 평균적으로 감소하거나 비슷하였는데, 접종 전보다 높은 역가를 보였다(도 8 참조). 백신 미접종 그룹인 NC 실험군의 혈청 IgA는 분만시점까지 완만하게 증가하였지만 A 실험군은 분만시점에 급격히 높은 역가를 나타내었다. 또한, A 실험군은 1차 접종 1주 후 뿐만 아니라 분만 시점에 분변내 sIgA도 높은 값을 나타내었다(도 9 참조). 그러나, 1차 경구 접종 후 근육 사백신을 2차접종으로 병행실시한 B 실험군은 A 실험군에 비해 초유 IgA에서 낮은 항체가를 보였다(도 6 참조).
B 실험군
초유 IgG 항체가는 A 실험군과 같이 높거나 항원에 따라 더 높은 경우도 있었다. B 실험군의 혈청 IgG는 분만시점에 증가되었으며, 혈청 IgA는 항원에 따라 증가하였으나 2회 구강 접종 후 분만시점에 IgA가 최대로 증가했던 A 실험군과 차이가 있었다(도 8 참조). 또한, A 실험군에서 분만 후 1주경에 혈청 IgA가 감소했던것과는 다르게 B 실험군은 혈액내 비교적 높은 역가를 유지하였다. 이러한 모우 혈액내 IgG, IgA 역가는 초유 IgA 항체역가가 낮았던 것과 비교될 수 있었다.
C 실험군
1차 근육 사백신 접종 후 2차 구강 생백신 접종을 실시한 C 실험군은 A 실험군과 같이, 높은 초유 IgG, IgA, 혈청 IgG, IgA, 분변 sIgA 항체가를 보였다(도6 내지 도9).
D 실험군
근육 사백신 접종은 일반적으로 농장에서 병원성 유발균주를 자가백신 형태로 접종하는 방식으로서, 재조합 백신 균주의 경우 야외균주에 비해 용해 가능한 재조합 항원으로 구성될 수 있으므로 이를 근육 사백신으로 2회 접종하였다. 그 결과 A 실험군에 비해 D 실험군이 낮은 초유 IgG, IgA를 분비하고 있음을 알 수 있었다(도 6 참조).
한편, 모우에서 A, 내지 D 실험군 형태의 백신접종은 일반자우 생시체중 범위, 암송아지 20 ~ 25 ㎏, 숫송아지 23 ~ 29 ㎏의 범위에서 자우 생시체중에 영향을 주지 않았다. 접종 후 3 ~ 20일 이내에 발열 및 동통, 식욕부진을 보이지 않았고, 예방접종과 연관된 폐사를 보이지 않았다(표 5).
Figure 112009053524978-PAT00002
상기 실험군 외에 시도하였던 1차 구강 생백신 접종 후 2차 근육 생백신 접종 실험군은 2차 접종량이 5x106 ~ 1x1010 CFU 범위에서 접종 후 1주내 염증과 발열 및 접종 2주 후 접종과 연관된 것으로 추정되는 조산이 유발되어 근육 생백신을 병행 접종하는 것은 제외하기로 하였다.
이와 같이, 구강 생백신 접종은 모우에서 접종에 따른 부작용 없이 안전하였고, 면역항체를 생산하고, 특히 초유를 통해 분비하는데 효과적이었다. 또한, 모우 백신접종을 실시하는데 있어 2회 중 최소 1번은 생균백신의 구강투여가 필요함을 확인할 수 있었고, 근육 사백신을 병행 접종하는 경우 구강 생백신을 2차에 접종하는 것이 초유를 통한 장내 IgA 분비효율을 높았다. 2회 구강 생백신 접종시 1차는 LTB 균주를 포함하여 접종하는 것이 면역반응을 빠르고, 높게 유도되었음을 알 수 있었다.
실시예 5. 자우의 이행항체와 방어능력에 따른 효과
<5-1> 자우의 혈청, 분변 항체역가
상기 표 4를 참조하여 각 모우 실험군으로부터 출생한 자우를 2주령 백신 접종 여부에 따라 각각 2군으로 구분하였다. A1, B1, C1 및 NC1 자우 실험군은 생후 60 시간내 도전감염을 실시하였고, A2, B2 및 C2 자우 실험군은 2주령 백신접종 후 5주령에 도전감염을 실시하였다. NC 실험군의 모우로부터 출생한 자우 중 NC2 실험군은 출생 후 5주령에 도전감염을 실시하였고, 모우 백신을 접종하지 않고 2주령 자우에 백신을 투여한 후 5주령 도전감염을 실시한 실험군을 CC(Calve Control)로 구분하였다.
도 10a, 10b 및 10c에 나타낸 바와 같이, 자우의 이행 항체를 자우의 초유섭취 전과 초유섭취 후, 1주령부터 7주령까지 혈청 IgG, IgA, 분변 sIgA로 분석하였다. 이때, 도 10a은 자우 혈청 IgG의 변화, 도 10b는 자우 혈청 IgA의 변화, 도 10c는 자우 분변 IgA의 변화를 나타낸 것이다.
모우 백신 미접종 NC 실험군으로부터 출생한 자우는, 초유를 섭취하기전 혈청 항체역가가 거의 blank 수준으로 나타났으나 출생 직후 충분한 양의 초유를 섭취한 후에는 초유 내 IgG, IgA 보다 높은 양을 나타내었다. 초유 섭취 후 크게 증가하였던 혈중 IgG의 경우 점점 감소하여 1 ~ 2주째 절반수준이 되었고, IgA는 1주까지 급격히 감소하였다. 또한, 분변 내 sIgA는 초유 섭취 후 증가하였다가 초유내 IgA가 3일후 급격히 감소한 것과는 대조적으로 1주후에서부터 10일까지 감소하였다(도 10a, 10b 및 10c 참조).
도 11a, 11b 및 11c에 나타낸 바와 같이, 모우 백신접종군인 A, B, C 실험군의 자우도 초유섭취 전 자우의 항체역가는 NC 실험군과 같았으나 초유섭취 후 혈청 IgG, IgA, 분변내 sIgA가 모두 크게 증가하였다. 특히, NC 실험군의 자우가 1 ~ 2주령에 그 값이 감소한 것과 대조적으로 1차, 2차 구강 생백신 접종을 실시한 A 실험군과 1차 근육 사백신 접종 후 2차 구강 생백신을 접종한 C 실험군 자우에서 혈청 IgG, IgA는 2주까지도 높은 역가가 유지되었고, 그 이후 서서히 감소하였다. 이들 자우 실험군에서 분변내 sIgA 또한 증가하였는데, 초유섭취 후 거의 초유의 항체역가를 나타내었다.
이에 의하여, 도 10a 내지 10c에서 출생 후 초유 섭취를 확인한 후 12시간 이내부터 시행하였던 병원성 대장균 1차 도전감염은 NC1 실험군에서 혈청 IgG, IgA에 거의 영향이 없었고, NC1, NC2 실험군의 5주령 2차 도전감염 후에는 IgG, IgA가 감소하였다가 회복 되는 반응을 나타냈으며, 5주령 도전감염은 도전감염 1주후 분변 내 sIgA가 일시 증가되어 나타났으나, 이와 대조적으로 도 11a 내지 11c에서 A1, C1(모우 백신접종군 출생 자우) 실험군은 도전감염 2 ~ 3주 후에도 모두 분변내 sIgA가 높았다. 즉, NC1 실험군이 5주령 도전감염 이후 항체가가 증가하는 것과 비교하여 그 값이 더 높았음을 확인하였다(도 10 및 도 11).
한편, 자우의 도전감염은 초유항체 이행에 따른 병원균 대장균 방어능력을 평가하기 위한 것으로, 초유 급여를 확인한 후 생후 12시간 이내에 첫 번째 감염을 실시하였고, 24시간 간격으로 2회 추가하여, 생후 60시간 이내에 총 3회 경구투여한 후, 감염 후 나타나는 임상증상을 관찰하였다. 모우 백신 미접종실험군 자우(NC1)에 재조합된 병원성 대장균 항원을 발현하는 병원성 설사 원인균을 경구 투여하여 설사를 유발하는 균주를 결정하였으며, 구강접종용 생백신과 같은 방법으로 제조하였다(표 6).
Figure 112009053524978-PAT00003
감염실험군은 분만전 모우를 분리사로 이동시켜 분만 후 1모우-1자우/1분리사 형태로 수용하였으며, 자우에 병원균 투여 후 구강접촉 및 배변, 급여, 급수 등 환경을 통한 감염을 예방하기 위하여 분리사면을 차단하고 우사의 바닥을 건조하게 유지시켰다. 출생 직후 병원균 투여에 있어 ETEC, EPEC, EIEC로 각각 구분하여 차례로 감염시키거나 ETEC, EPEC, EIEC 해당균주들을 모두 1회 분량에 혼합하여 3일간 투여하는 방법으로 시도하였는데, NC1 자우에서 모두 EPEC(JOL681), EIEC (JOL465)에 의한 설사가 빈번하였다. 설사는 마지막 병원성균 투여 후 3 ~ 4일째 발생하였고, 유발된 설사 분변으로부터 대장균을 분리한 후 20 CFU를 무작위 선택하여 PCR로 균주를 확인한 결과, 18 ~ 20 CFU (90%이상)가 동일한 균주였으며, 이를 도전감염에서 설사를 유발한 원인균으로 보았다. 감염 자우에서는 기립불능 및 수유, 활동성 저하가 동반되어 나타나 항생제와 수액처치가 필요하였다. NC1 자우군의 경우 치료 후 분변 및 활동상태가 호전되었으나 6마리 중 3마리에서 4 ~ 5주령에 심한 설사가 재발되어 재치료가 필요하였다.
한편, 도 12는 자우 출생직후 시도한 병원성 대장균 도전감염에 의해 1주령에 유발된 혈액이 섞인 수양성 설사, 점액성 설사, 혈액이 섞인 점액성 설사를 나타낸 것이다. 모우 백신 접종군 자우의 도전감염에서는, 1차 구강 생백신 접종 후 2차 근육 사백신 접종 실험군 자우(B1) 중에서 일부가 도전감염주에 의해 설사가 유도된 반면, 1차, 2차 모두 구강 생백신 접종군 자우(A1)와 1차 근육 사백신 접종 후 2차 구강 생백신 접종군 자우(C1)는 출생 직후 도전감염 후부터 5주까지 설사 증상을 보이지 않았다(표 7 참조).
Figure 112009053524978-PAT00004
이와 같이, 모우에서 2회 모두 구강 생백신 접종군의 자우(A1)와 1차 근육 사백신 접종 후 2차 구강 생백신 접종군의 자우(C1)가 초유를 섭취한 후 혈청 IgG, IgA, 분변내 sIgA에서 높은 역가를 보였고, 잔여 역가가 길게 유지되었으며, 병원성 대장균의 도전감염을 방어하였다. 그러나, 모우에서 백신접종을 실시하지 않고, 도전감염을 시행한 자우(NC1)의 경우에는 5주령까지 설사가 재발하였고, 도전감염 균주가 재분리되었던 것과는 대조적으로 상기 다양한 형태의 백신접종을 실시한 모우에서 출생한 자우는 출생 후부터 7주령까지 설사증상을 보이지 않았다. 이들 그룹은 초유를 통하여 모우로부터 병원균을 방어하는 특이항체가 충분히 이행되고 있음을 확인할 수 있었다.
따라서, 상기 실시예를 근거로 하여 본 발명에 따른 백신 조성물은 임신한 모우에서 2회를 접종하는 데, 2회를 모두 구강투여하는 경우에는 1차 LTB 균주를 포함하여 접종하고, 근육 사백신과 병행투여하는 경우에는 2차 접종시 반드시 구강 생백신으로 접종해야 함을 알 수 있었다.
<5-2> 자우의 백신접종 방법별 방어 효과
각 모우 실험군으로부터 출생한 자우 중 출생 직후 도전감염을 실시하지 않은 A2, B2, C2 자우 실험군은 2주령 구강 생백신, 2x109 CFU를 접종하였고, 백신의 효능을 판단하기 위해 5주령에 병원성 대장균 투여균수를 1x107 CFU로 하여 1회 도전감염을 실시하였다(표 4, 표 6). NC 모우 실험군으로부터 출생한 자우 중 NC1 실험군은 출생 직후와 5주령에 도전감염을 반복하였고, NC2 실험군은 출생 후 백신접종 없이 5주령에 도전감염을 실시하였다. 모우 백신을 접종하지 않고, 2주령 자우에 백신을 투여한 후 5주령 도전감염을 실시한 실험군은 CC(Calve Control)로 구분하였다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 모우 백신접종 실험군으로부터 출생한 A2, B2, C2 실험군 2주령 자우의 1회 구강 생백신 접종은 자우의 혈청 IgG, IgA 역가에서 자우 백신접종을 실시하지 않았던 실험군의 혈청 항체역가와는 구분되는 차이가 없었으나 분변내 sIgA는 백신접종 1주 후 크게 증가하였다. 특징적으로 CC 자우 실험군은 분변내 sIgA 역가가 모우 백신접종군으로부터 출생한 자우에 비해 낮았고, 자우 백신 접종에 의한 큰 변화를 보이지 않았다. 5주령 병원성 대장균 도전감염에서는 2주령 자우에 구강 생백신을 접종한 A2, B2, C2, CC 실험군 모두에서 설사가 나타나지 않았다. 그러나 NC 실험군 자우의 5주령 도전감염은 출생 직후 자우보다 적은 균주량, 1회 투여로도 설사가 유발되었다.
따라서, 2주령 자우에서 구강 생백신 접종은 모우 백신접종군 자우 장내 sIgA를 유도하였고, 항체역가에서 차이가 없었지만 모우 백신미접종군 자우에서 병원성 대장균 도전감염을 방어하는데 기여한 것으로 보인다.
도 1은 본 발명의 개관도이다.
도 2는 소 병원성 대장균 부착인자의 서브유닛을 발현, 분비하는 약독화 살모넬라균 제작과정이다.
도 3a 및 도 3b는 재조합 항원의 세포외 분비를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 3c는 약독화 살모넬라가 각 서브유닛을 세포외로 분비하는 결과도이다.
도 4는 각 백신의 제조와 접종방법을 나타낸 것이다.
도 5a 내지 5b는 백신의 조성에 있어, LTB 첨가에 따른 모우 분변 sIgA 변화와 초유 항체역가에 따라 결정된 접종량을 나타낸것이다.
도 6는 백신 접종 경로별 모우의 초유 항체역가를 비교한 것이다.
도 7a 내지 7b는 백신 접종경로별 초유와 분만 1주후 우유의 항체역가를 비교한 것이다.
도 8은 백신 접종 경로별 분만시 모우의 혈청 항체역가를 비교한 것이다.
도 9는 백신 접종 경로별 분만시 모우의 장내 sIgA를 분변 항체가로 비교한 것이다.
도 10a 내지 10c는 백신 미접종 실험군 자우의 혈청, 분변에서 측정한 항체역가의 변화를 나타낸 것이다.
도 11a 내지 11c는 백신 접종 경로별 초유 섭취 자우의 혈청, 분변에서 항체가와 연속성을 비교한 것이다.
도 12는 자우 출생직후 시도한 병원성 대장균 도전감염에 의해 유발된 설사 분변상태이다.
도 13은 백신 접종 경로별 2주령 자우의 백신접종 후 분변의 항체가 변화를 나타낸 것이다.

Claims (27)

  1. 소의 병원성 대장균 부착인자 유전자 K99(fanC), F41(fim41a), Intimin(eaeA), F17(f17A), F17(f17G), CS31A(clpG), Afa(afa8D) 및 Afa(afa8E)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 유전자, 및 asd 유전자를 포함하는, lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주.
  2. 소의 병원성 대장균(E. coli) LTB(heat-labile enterotoxin B subunit) 유전자; 및 asd 유전자를 포함하는, lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주.
  3. 제1항의 변이주 중 어느 하나 이상을 포함하는, 혼합 살모넬라균 변이주.
  4. 제2항의 변이주 및 제3항의 변이주를 포함하는, 혼합 살모넬라균 변이주.
  5. 제4항에 있어서,
    제3항의 변이주는 제1항의 8개의 변이주가 모두 포함하는 것임을 특징으로 하는, 혼합 살모넬라균 변이주.
  6. 제3항의 혼합 살모넬라균 변이주를 포함하는, 소의 병원성 대장균증 및 살모 넬라증의 예방 및 치료용 백신 조성물.
  7. 제4항의 혼합 살모넬라균 변이주를 포함하는, 소의 병원성 대장균증 및 살모넬라증의 예방 및 치료용 백신 조성물.
  8. 제5항의 혼합 살모넬라균 변이주를 포함하는, 소의 병원성 대장균증 및 살모넬라증의 예방 및 치료용 백신 조성물.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    소의 병원성 대장균증은 소화기 질환, 부종병(edema disease), 호흡기 질환 또는 비뇨생식기계 질환을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    소화기 질환은 송아지 설사증 또는 소 바이러스 설사병(BVD-MD)을 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  11. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    소의 병원성 대장균은 장독성 대장균 (entrotoxigenic Escherichia coli; ETEC), 장병원성 대장균 (enteropathogenic Escherichia coli; EPEC), 또는 장침입성 대장균(enteroinvasive E. coli; EIEC)임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  12. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    살모넬라는 살모넬라 타이피무리엄(Salmonella typhimurium), 살모넬라 타이피(S. typhi), 살모넬라 파라타이피(S. paratyphi), 살모넬라 센다이(S. sendai), 살모넬라 갈리나리움(S. gallinarium) 및 살모넬라 엔테리티디스(S. enteritidis)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  13. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    형질전환시킨 살모넬라 변이주는 생균 또는 사균임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    사균은 가열 또는 포르말린으로 불활화시킨 사균임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  15. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 또는 비강 경로로 투여됨을 특징으로 하는 백신 조성물.
  16. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 백신 조성물을 포함하는, 소의 면역증강 또는 성장 촉진을 위한 사료 첨가제.
  17. (a) 소의 병원성 대장균 부착인자 유전자 K99(fanC), F41(fim41a), Intimin(eaeA), F17(f17A), F17(f17G), CS31A(clpG), Afa(afa8D) 및 Afa(afa8E)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 유전자를 증폭시키는 단계;
    (b) 상기 부착인자 유전자를 asd 유전자를 가진 플라스미드에 클로닝하는 단계;
    (c) 살모넬라 균주의 염색체 DNA에서 lon, cpxR 및 asd 유전자를 결실시켜 약독화 살모넬라 균주를 제조하는 단계;
    (d) 단계 (b)의 클로닝된 플라스미드를 단계 (c)의 약독화 살모넬라 균주에 형질전환시키는 단계; 및
    (e) 형질전환된 살모넬라 변이주를 선별하는 단계를 포함하는 살모넬라 변이주를 제조하는 방법.
  18. (a) 소의 병원성 대장균(E. coli) LTB(heat-labile enterotoxin B subunit) 유전자를 증폭시키는 단계;
    (b) 상기 LTB 유전자를 asd 유전자를 가진 플라스미드에 클로닝하는 단계;
    (c) 살모넬라 균주의 염색체 DNA에서 lon, cpxR 및 asd 유전자를 결실시켜 약독화 살모넬라 균주를 제조하는 단계;
    (d) 단계 (b)의 클로닝된 플라스미드를 단계 (c)의 약독화 살모넬라 균주에 형질전환시키는 단계; 및
    (e) 형질전환된 살모넬라 변이주를 선별하는 단계를 포함하는 살모넬라 변이주를 제조하는 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    소의 병원성 대장균은 장독성 대장균 (entrotoxigenic Escherichia coli; ETEC), 장병원성 대장균 (enteropathogenic Escherichia coli; EPEC), 또는 장침입성 대장균(enteroinvasive E. coli; EIEC)임을 특징으로 하는 살모넬라 변이주를 제조하는 방법.
  20. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    살모넬라는 살모넬라 타이피무리엄(Salmonella typhimurium), 살모넬라 타이피(S. typhi), 살모넬라 파라타이피(S. paratyphi), 살모넬라 센다이(S. sendai), 살모넬라 갈리나리움(S. gallinarium) 및 살모넬라 엔테리티디스(S. enteritidis)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나임을 특징으로 하는 살모넬라 변이주를 제조하는 방법.
  21. 제3항의 혼합 살모넬라균 변이주를 변이주생균 또는 사균 백신으로 준비하여, 모우 또는 자우에 접종하는 것을 특징으로 하는, 소의 병원성 대장균증 및 살모넬라증의 예방 및 치료를 위한 백신화 방법.
  22. 제4항의 혼합 살모넬라균 변이주를 변이주생균 또는 사균 백신으로 준비하여, 모우 또는 자우에 접종하는 것을 특징으로 하는, 소의 병원성 대장균증 및 살모넬라증의 예방 및 치료를 위한 백신화 방법.
  23. 제5항의 혼합 살모넬라균 변이주를 생균 또는 사균 백신으로 준비하여, 모우 또는 자우에 접종하는 것을 특징으로 하는, 소의 병원성 대장균증 및 살모넬라증의 예방 및 치료를 위한 백신화 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    사균은 가열 또는 포르말린으로 불활화시킨 사균임을 특징으로 하는 백신화 방법.
  25. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 또는 비강 경로로 투여됨을 특징으로 하는 백신화 방법.
  26. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    1차 및 2차 접종시 생균 백신을 경구로 접종함을 특징으로 하는 백신화 방법.
  27. 제22항 또는 제23항에 있어서,
    1차 및 2차 접종시 생균 백신을 경구로 접종하되, 2차 접종시 LTB를 발현 분비하는 살모넬라 변이주를 제외한 생균 백신을 접종함을 특징으로 하는 백신화 방법.
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