KR20180087937A

KR20180087937A - 이유 자돈의 대장균증을 예방하기 위한 재조합 p22 라이소자임 - pmap36 융합 단백질을 이용한 장내독소형 대장균(etec) 고스트 백신 조성물

Info

Publication number: KR20180087937A
Application number: KR1020170012339A
Authority: KR
Inventors: 허진; 문성철; 정호경; 김미나; 김주현
Original assignee: 주식회사 코미팜; 전북대학교산학협력단
Priority date: 2017-01-26
Filing date: 2017-01-26
Publication date: 2018-08-03
Also published as: KR102000120B1

Abstract

F4와 F18 핌브리아를 발현하는 장내독소형 대장균(enterotoxigenic E. coli, ETEC) 균주는 P22 lysozyme-PMAP36 융합 단백질에 의해 고스트화가 유도되었으며, 이렇게 유도된 세포는 ETEC 고스트 백신으로 효과가 평가되었다. 이 새로운 예방 백신 후보물질의 효능을 평가하기 위해 이 백신 후보물질을 포유 자돈에 근육접종 하였고, 이유 후에 대장균증에 대한 방어여부를 확인하였다. 즉, 그룹 B의 자돈은 생후 2주 째에 약 2 × 10⁹cells이 되도록 각각의 핌브리아 함유 고스트 백신을 근육으로 예방 접종되었고, 대조군인 그룹 A의 포유 자돈은 PBS로 근육 접종되었다. 그룹 B 자돈의 혈청 IgG의 역가는 그룹 A의 자돈의 항체 역가에 비해 유의 있게 증가하였다. 그 후 야생형 ETEC의 도전감염이 있은 후, 그룹 B의 모든 자돈에서 설사 및 폐사가 관찰되지 않은 반면, 그룹 A의 자돈 70%에서 설사증상이 관찰되었고 30%의 폐사율을 보였다. 이 결과는 새로 만든 백신을 포유 자돈에 근육 접종했을 때 이유 후에 대장균 설사증을 효과적으로 방어할 수 있음을 확인할 수 있었다.

Description

이유 자돈의 대장균증을 예방하기 위한 재조합 P22 라이소자임 - PMAP36 융합 단백질을 이용한 장내독소형 대장균(ETEC) 고스트 백신 조성물{The composition of the enterotoxigenic Escherichia coli ghost vaccine candidate by recombinant P22 lysozyme-PMAP36 fusion protein against neonatal piglet colibacillosis}

본 발명은 이유 자돈의 대장균증을 예방하기 위한 재조합 P22 라이소자임-PMAP36 융합 단백질 및 이를 이용한 장내독소형 대장균(ETEC) 고스트 백신 조성물에 관한 것이다.

장내독소형 대장균 (Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)은 설사를 야기하며, 특히 신생자돈 및 이유자돈에서 설사를 일으키며 가장 일반적인 세균 중 하나로 전 세계적으로 양돈 산업에서의 경제적으로 가장 중요한 질병 중 하나로 간주된다. ETEC는 보통 핌브리아를 사용하여 장내 상피 세포 표면에 부착하며, 신생자돈 ETEC에 연관된 네가지 중요한 핌브리아는 K88(F4), K99(F5), F6(Fas) 그리고 F41이며, 이유 자돈 ETEC에 관계된 중요한 핌브리아 발현 균주로는 F4 rm 중에서도 K88ac+ ETEC 및 F18+ ETEC로 알려져 있다. 이들 ETEC 균주는 장 점막에 부착 후, 장독소, 즉, 열에 안정한 장독소와 열에 불안정한 장독소(LT)를 분비하여 신생자돈 및 이유 자돈에 심각한 설사를 야기한다. 따라서 이들 핌브리아는 ETEC 설사증에 있어 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.

일반적으로, 포유 자돈에서 대부분의 감염은 임신 모돈에 예방접종을 통해 예방될 수 있다. 그래서 ETEC 대장균증 예방을 위한 임신 모돈용 예방 백신은 수의학계에서 사용되어 오고 있다. 이들 백신들은 포르말린-불활성화된(formalin-inactivated) K88ab+, K88ac+, K88ad+, K99+, F6+ 그리고 F41+ ETEC whole-cell bacterins(전체-세포 박테린)의 혼합물 또는 purified ETEC fimbrial subunit vaccines(정제한ETEC 핌브리아의 서브유닛 백신)이다. 하지만 배양 박테리아에 화학적 처리를 가해 생산 되는 전통적인 불활화 사균 백신은 박테리아 표면 항원들의 이화학적(physiochemical), 구조적 특성에 영향을 미칠 수 있다. 그리하여 잠재적으로 방어 면역을 저해하는 것으로 알려지고 있으며, 더불어 이 불활화 백신은 낮은 수준 및 짧은 기간의 면역 반응을 유도할 뿐이다. 그리하여 전통적인 사균백신은 효과적인 방어면역을 유도하기 위해 강력한 면역 보강제와 더불어 여러 번의 접종을 요구한다. 하지만 그 백신들은 알러지 반응, 백신 접종 부위의 육종(sarcomas)과 같은 큰 위험을 가지고 있다. 반면에, 고스트화된 불활화 세균은 생존 상태 세포의 형태 및 세균 부착 특성을 고스란히 간직하고 있는 세포 표면 항원성 구조를 그대로 유지하고 있다. 또한 고스트화 된 세균은 고유한 아쥬번트 특성 또한 간직하고 있어 전신 및 점막 그리고 세포성 면역반응을 유도할 수 있다.

전염병에 대한 안전하고 효과적인 백신들을 개발하기 위해서 백신 후보물질로서 세균 고스트 세포(cells)의 이용은 새롭고 진보적인 접근 방법이다. 동물들에서 이 새로운 고스트백신 백신 후보물질의 경구 또는 비경구적 접종은 체액성 및 세포성 면역반응을 효과적으로 유도할 수 있는 것으로 알려지고 있다. 더불어 백신 제조과정에서 면역원성에 중요한 부분을 차지하는 부분이 화학적으로든 물리적으로든 변화 없이 불활화되어 세균과 같은 면역원성을 유지한 세포외막 성분을 그대로 보유하게 된다.

대부분의 동식물에서 발견되는 항균 펩타이드 (Antimicrobial peptides,AMPs)는 선천성 면역반응에 있어 중요한 역할을 담당하고 있으며, 더불어 이 AMPs 세균에 대해 넓은-스펙트럼(broad-spectrum) 활동을 갖는다. 이 항균작용은 이 AMP 들이 세균의 세포막에 결합하여 빠르게 반응하여 세포막에 구멍을 만들어 세포질 성분이 빠져나가 결국 세포가 죽음에 이르게 한다. 지금까지 돼지에서 11개의 AMPs가 발견되었고, 그 중 하나가 돼지 골수의 항균성 펩타이드-36(porcine myeloid antimicrobial peptide-36, PMAP-36)로 세균 세포벽과 결합할 수 있는 가장 많은 net positive charge를 갖고 있다.

지금까지 돼지에서는 11개의 숙주 방어 펩티드(host defense peptide, HDP) 또는 항균성 펩티드(antimicrobial peptide, AMP)가 보고되었으며, 이 중 돼지 골수 항균성의 펩티드-36(porcine myeloid antimicrobial peptide-36, PMAP-36)이 가장 높은 양성전하를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. PMAP36 N-terminal(PMAP36 N-말단)의 α-helical domain(α-나선 도멘인)이 활성부위로 알려져 있으며. 이 펩타이드는 양성전하를 가진 펩타이드와 띄는 세균 세포막의 음성 전하를 가진 분자성분과 전자 결합을 통해 세균 막을 관통할 수 있는 능력을 가지고 있다. 어떤 박테리오파지의 엔도라이신은 외부에서 세균 세포벽을 분쇄할 수 있는 항균활성을 갖고 있는 경우도 있다. 이 두 물질의 그람 양성 및 음성 세균 모두의 세포벽을 공격하여 세포벽의 기계적 강도를 약하게 하고 결국에는 세포벽을 용해시킨다. 특히, 그람 음성 세균에 대한 이 효소의 활성은 이 효소가 막 안으로 들어갈 수 있도록 세포 막 안에 있는 음성 전하를 띄는 리포 다당류(lipopolysaccharide, LPS)와 밀접한 관련이 있다.

본 발명의 목적은 첫 번째로 과발현 시스템을 이용하여 재조합 P22- lysozyme-PMAP36 융합 단백질의 발현 및 정제에 있으며, 그 다음으로는 이 재조합 융합 단백질을 이용하여 F4+ 및 F18+ ETEC 균주들의 고스트화 유도 여부와 이렇게 유도된 세포들의 백신으로서의 효능 여부를 포유 자돈을 이용하여 확인하기 위함이다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 P22-라이소자임-PMAP36의 재조합 유전자; 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산서열로 이루어진 P22-라이소자임-PMAP36의 재조합 유전자를 포함하는 P22-라이소자임-PMAP36 융합 단백질을 제공한다.

또한, P22-라이소자임-PMAP36 융합 단백질에 의해 고스트화가 된 미생물 형질 전환체를 제공한다.

상기 미생물 형질 전환체는 미생물 기탁번호 KCTC18534P(미생물 명칭: Escherichia coli HJL779)으로 기탁된 대장균 균주인 것을 특징으로 한다.

P22-라이소자임-PMAP36 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 이유 자돈의 대장균증 예방용 고스트 백신 조성물을 제공한다.

P22-라이소자임-PMAP36 융합 단백질이 이유 자돈에서 설사를 야기하는 F4+ 또는 F18+ ETEC 균주들의 고스트를 유도함으로써 이유 후 ETEC 대장균 감영증(colibacillosis)을 방어하는 것을 특징으로 하는 이유 자돈의 대장균증 예방용 고스트 백신 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 포유자돈에 ETEC 고스트 백신을 근육접종함으로써 전신 면역 반응을 효과적으로 유도하는 것이 확인되었다. 또한 포유자돈에 근육접종한 후 야생형 독성 ETEC 균주(wild-type virulent ETEC strains)으로 도전 감염 후에는 아무런 임상 증상이 관찰되지 않은 반면, 대조군 그룹의 자돈에서는 설사가 70% 관찰됐다. 더욱이, 대조군에서는 폐사가 관찰됐다. 그러므로, 이러한 결과를 바탕으로 했을 때, 본 발명의 새로운 백신후보로 포유자돈을 근육 접종하는 것이 이유 후 ETEC 대장균 감염증(colibacillosis)을 방어하는데 효과적이다.

도 1은 pET30a-P22 lysozyme-PMAP36 구성도를 나타낸 것이다.
도 2는 15% SDS-PAGE를 이용한 P22 lysozyme-PMAP36 융합 단백질 발현 확인을 나타낸 것이다.
도 3은 정제된 P22 lysozyme-PMAP36 융합 단백질의 Western blot 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 P22 lysozyme, PMAP36 펩타이드 그리고 P22 lysozyme-PMAP36 융합 단백질의 이차 구조 확인을 위한 Circular dichroism (CD) spectroscopy를 나타낸 것이다.
도 5는 전자현미경 사진으로서, 도 5a는 P22 lysozyme-PMAP36 융합 단백질 미처리 군을 나타낸 것이고 도 5b는 P22 lysozyme-PMAP36 융합 단백질 처리 군을 나타낸 것이다.
도 6은 각 항원에 대한 혈청 항체 역가를 나타낸 것으로서 그룹 A는 대조군을, 그룹 B는 백신 접종군을 나타낸다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

재료 및 방법

본 발명에 사용된 세균 및 성장 조건

본 발명에서 사용된 모든 세균 균주들은 표 1에 서술되어 있다. F4+ (HJL593) 그리고 F18+ (HJL565) ETEC 균주들은 백신제조 및 도전감염용 균주로 사용되었다. E. coli DH5α와 E. coli BL21(DE3) 균주는 K88ac 및 FedA 항원 생산을 위한 과발현 host 균주로 사용되었다. 모든 균주는 LB broth와 LB agar에서 배양되었다. 또한 pQE31과 pET28a 플라스미드는 K88ac와 FedA 항원을 과발현 시키기 위해 각각 사용되었으며, pET30a 플라스미드는 P22 lysozyme-PMAP36 fusion protein을 과발현시키기 위해 사용되었다.

하기 표 1은, 연구에 사용된 균주 및 플라스미드를 나타낸 것이다.

Strain/Plasmid	Description	source
strains
E.coli
HJL593	Wild type F4ac (K88ac)⁺LT^+,Sta⁺ETEC isolate from pig	Lab stock
HJL565	Wild type F18⁺ Sta⁺ ETEC isolate from pig	Lab stock
DH5α	fhuA2, D(argF-lacZ), U169, phoA, glnV44, w80, D(lacZ)M15, gyrA96, recA1, relA1, endA1, thi-1,hsdR17	Promega
BL21(DE3)	F^?, ompT, hsdSB (r^? _B, m^? _B), dcm, gal, (DE3)	Promega
HJL667	DH5a K88ac in pQE31	This study
HJL669	BL21(DE3) fedA in pET28a	This study
HJL779	BL21(DE3) P22 lysozyme-PMAP36 in pET30a	This study
Plasmids
pQE31	IPTG-inducible expression vector; Am^r	QIAGEN
pET28a	IPTG-inducible expression vector; Km^r	Novagen
pET30a	IPTG-inducible expression vector; Km^r	Novagen

P22 lysozyme - PMAP 36융합 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝

PMAP 36 라이소자임 단백질에 대한 수정 된 융합 유전자는 화학적으로 (Bioneer, Daejeon, South Korea)를 합성 pET30a 플라스미드에 삽입되었다.

재조합 단백질은 대장균 BL21 (DE3)의 발현 및 니켈 - 니트릴 로트리 아세트산 - 아가 로스 친화도 정제 공정을 사용하여 정제하였다. 정제된 단백질은 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인 하였다.

모든 정제 된 항원을 50 % 글리세롤에 혼합하여 사용할 때까지 -70 ℃에서 보관 하였다.

PMAP 36 펩타이드 유전자를 대장균에서 발현이 잘 되도록 대장균 코돈에 최적화 되었으며, 살모넬라 타이피뮤리움 박테리오파지 P22 (이하 'P22'라고 한다)의 라이소자임 유전자와 함께 바이오니아에서 제조되었다. 각 유전자들은 각 프라이머 set (표 2)를 이용하여 PCR을 통해 증폭되었으며, thrombin cleavage site는 P22 라이소자임의 C-terminal에 PCR을 이용해 첨가되었다. 이렇게 증폭된 P22 라이소자임과 thrombin cleavage site는 NdeI과 BamHI으로 절단되었고 같은 제한효소로 절단된 pET30a에 라이게이션 되었다 (이하 pET30a-P22 라이소자임이라고 한다). 더불어 증폭된 PMAP36 유전자는 BamHI과 NotI으로 절단되었고, 같은 제한효소로 절단된 pET30a-P22 라이소자임 벡터에 라이게이션 되었다 (도 1). 그리고 이들 라이게이션된 벡터 (pET30a=P22 lysozyme-PMAP36)는 E. coliDH5α에 형질전환 되었다.

하기 표 2는, 재조합 P22 lysozyme-PMAP36 융복합 단백질 클로닝을 위해 사용된 프라이머를 나타낸 것이다.

P22 lysozyme - PMAP36 융합 단백질 발현 및 정제

pET30a-P22 lysozyme-PMAP36 벡터를 발현시키기 위해 E. coliBL21(DE3)에 형질전환하였다. 이렇게 형질전환된 대장균으로부터 재조합 P22 lysozyme-PMAP36 융합 단백질을 과발현시키기 위해 한 콜로니를 50 μg/ml 카나마이신(kanamycin)이 함유된 100ml의 루리아-베르타니(Luria-Bertani ,LB) broth에 접종하여 37°C에서 하룻밤동안 배양하였다. 이 배양액 10ml를 신선한 50 μg/ml kanamycin이 함유된 1,000ml의 LB broth로 옮겨 OD600가 0.6이 될 때까지 재 배양하였다. 이 배양액에 이소프로필-b-D-티오가락토피라노시드(isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside,IPTG)가 0.5mM이 되로록 첨가하고, 28℃에서 24시간 배양하여 p22 lysozyme-PMAP36 융합 단백질을 발현을 유도하였다. 이 배양된 셀들을 4℃, 5,000 rpm에서 15분간 원심하여 농축한 다음 20 ml 용균 버퍼(lysis buffer) (10 mM Tris, 1 M NaCl, pH 8.0)로 재부유 한 다음, 소니케이션 (4초 처리, 4초 휴식을 4분간)으로 세포를 파쇄하였다. 4℃, 12,000rpm으로 25분간 원심하여 이 용출액 중에서 수용성 단백질을 농축하였고, 0.45 μm pore size (공극 크기) 의 실린지 필터(syringe filter)로 여과한 다음, AKTA prime FPLC system (GE healthcare, USA) 안에 연결되어 있는 HHistrap FF columm(컬럼)으로 옮겨 정제를 시작하였다. 반응된 columm은 lysis buffer (buffer A)로 세척되었고, 수용성 단백질은 buffer B (10 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 300 mM Imidazole, pH 8.0)의 농도 기울기(gradient concentration)에 따라 분리되었다. 각 분리된 일부(fraction)는 15% SDS-PAGE로 분석되었으며, 정제된 타겟(target) 단백질은 buffer C (PBS buffer, GE healthcare, USA)를 이용하여 투석한 다음 centrcon (cut-off 30 kDa, Amicon, Millipore, Germany)을 이용하여 농축되었다. 마지막으로 P22 lysozyme-PMAP36 융합 단백질은 단백질 정량법(Bradford protein assay)에 의해 농도가 측정되었다.

웨스턴 블로팅 (Western blotting)

정제되고 농축된 P22 lysozyme-PMAP36 융합 단백질은 15% SDS-PAGE에 의해 로딩(loading) 된 후 PVDF 멤브레인(membrane) Millipore, Germany)으로 이 융합 단백질을 이동시킨 후 anti 6-his polyclonal antibody(안티 6-히즈 다중클론항체)(BD, France)를 1:6,000으로 희석하여 일차 항체로 반응시켰다. 세척 후 HRP conjugated goat anti-mouse IgG antibody (Enzo, USA))를 1:12,000으로 희석하여 이차 항체로 반응 시키고 ECL 용액(solution) (SurModics, USA)으로 이 융합 단백질 밴드를 확인하였다.

원편광 이색성 분광법(Circular dichroism spectroscopy)

이 융합 단백질의 이차 구조와 접힘 특성(folding properties)을 평가하기 위해, 정제된 이 융합 단백질은 원거리 자외선 원형 이색성 분광법(far-UV Circular dichroism spectroscopy, JASCO J-1500 spectropolarimeter, wavelength range of 190 nm to 260 nm)로 측정되었다. 즉, 극 스펙스럼에서 각 샘플 (P22 lysozyme, PMAp36 펩타이드, P22 lysozyme-PMAP36 융합 단백질) 0.5 mg/ml씩을 버퍼 D (PBS buffer containing 50% Glycerol) 용해시킨 후 0.1 cm 빔 노정(path length)의 석영 큐벳을 이용하여 298K에서 측정되었다.

Construction of F4+ and F18+ ETEC vaccine candidate

F4+ 또는 F18+ ETEC 균주의 한 콜로니를 선택하여 각각 200ml의 LB 액체 배지에 접종한 후 37°C에서 흡광도가 0.3에 도달할 때까지 배양했다. 배양된 배지에 준비된 P22 lysozyme-PMAP36 융합 단백질을 100 μg/ml가 되도록 첨가하여 각 ETEC 균주가 세포의 용해(lysis)가 유도 되조록 37°C에서 16시간 반응시켰다. 반응 후 세포의 용해(lysis) 여부를 확인하기 위해 각 반응액 중 100㎕씩을 LB 아가에 접종하여 37°C에서 24시간 배양하여 콜로니형성 유무로 반응액의 고스트화 진행여부를 확인하였다. 확인된 고스트 진행 반응액은4000 × g에서 30분간 원심하여 농축되었고, 멸균 PBS로 세 번 세척한 후 최종적으로 1 × 10⁹cells/ml이 되도록 재부유시켜 -20°C에 보관하며 사용하였다.

투사전자현미경(이하 TEM )

각 ETEC 고스트 진행 여부 확인을 위한 샘플은 P22 lysozyme-PMAP36 융합 단백질 처리 전후의 세균샘플 (TEM으로 막 온전성과 세포내 변화를 관찰하기 위한)이 F4+ 그리고 F18+ ETEC 고스트 백신 제조 방법과 같은 방법으로 준비되었다. TEM은 Lv 등이 (Lv, Y., Wang, J., Gao, H., Wang, Z., Dong, N., Ma, Q., et al., (2014). Antimicrobial properties and membrane-active mechanism of a potential α?elical antimicrobial derived from cathelicidin PMAP-36. PLoS . One.9, e86364.) 설명된 방식에 따라 촬영되었다.

백신접종과 가검물 채취

Large Yorkshire 포유자돈 20마리를 본 발명에 사용했으며, 모든 자돈들은 적외선 등(heat lamp)을 갖춘 축사로 옮겨졌다. 또한 항생제나 성장촉진제를 첨가하지 않은 commercial한 포유자돈용 사료를 급여했다. 총 20마리의 포유자돈을 2 그룹으로 나눴다. 모든 그룹의 자돈은 근육내투여로 백신을 접종했다 (생후 2주령 총 1회). 그룹 A의 돼지들은 대조군으로, 멸균 PBS 2ml로 근육접종되었고, 그룹 B 돼지들은 2ml의 PBS에 2 × 10⁹cellsdl 되도록 각 고스트 백신 혼합액(F4+ alc F18+ ETEC가 각각 1 × 10⁹cells이 되도록 제조) 으로 근육 접종되었다. 혈액 sample은 0 (접종 전) 그리고 2 (도전감염 전) WPI (weeks post immunization)로 채취했다. 모든 샘플(sample)은 사용하기까지 영하 70도에 저장했다. 본 실험에서 보고된 동물실험은 Korean Council on Animal Care의 인가를 받은 전북대학교 동물윤리 의원회의 승인을 받아 진행됐다.

면역반응 평가를 위한 ELISA(enzyme linked immunoassay)

F4와 F18 ETEC fimbrial antigen(핌브리아의 항원)들은 HJL667과 HJL669으로부터 각각 제조사에서 권장하는 방법에 따라 정제되었다. 각 serum 안의 ETEC fimbrial antigen-specific IgG에 대한 OD (optical density)값을 측정하기 위해 돼지의 IgG (E100-104, Bethyl Lab Inc. Montgomery, TX, USA) ELISA quantitation kit을 제조사의 설명에 따라 사용했다. 단 세럼 샘플(serum sample)은 IgG 농도 실험에서 400:1로 희석하여 사용했다. 효소반응은 o-phenylenediamine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 연구됐고 automated ELISA spectrophotometer at 492 nm로 측정했다 (TECAN, Salzburg, Austria).

도전감염

도전감염 용 균주인 JHL593과 HJL565는 전에 설명한 방법 (Hur and Lee 2011; and 2013)에 따라 준비했다. 모든 새끼 돼지들은 2ml mixture (1 × 10⁹CFU/ml)를 경구로 4주령 째에 도전감염 되었다. 챌린지 후 14일 동안 모든 새끼돼지들의 설사와 폐사가 모니터링 되었다. 도전감염 후 설사가 관찰되면 자돈의 rectal swab에서 도전감염 균주의 분리 동정을 실시하였고. 분리된 균주 중 PCR using fimbria-specific primers (표 3)을 이용하여 직장 swab으로부터 도전감염 된 하나의 적어도 ETEC fimbriae의 gene 중 하나를 포함했다면 이는 도전감염에 의한 설사라고 간주하였다.

하기 표 3은 도전감염 후 도전감염 균주의 확인을 위해 사용한 프라이머를 나타낸 것이다.

통계적 분석

모든 결과는 평균 ± 표준편차로 표기했다. Mann-Whitney U-test가 백신화된(vaccinated), 비-백신화된(non-vaccinated)으로 구분된 그룹의 serum의 항체가 차이점을 밝히는 데 사용됐다. SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)가 모든 분석에 사용됐으며, P ≤ 0.05가 통계적으로 중요하게 고려됐다.

P22 lysozyme - PMAP36 융합 단백질 발현

15% SDS-PAGE로 발현 및 정제된 융합 단백질을 확인하여 본 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 융합 단백질이 발현되고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 농도를 측정하여 본 결과 1L당 1.8mg이 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

웨스턴 블로팅 (Western blotting)

정제되고 농축된 P22 lysozyme-PMAP36 융합 단백질은 15% SDS-PAGE에 의해 loading 된 후 PVDF membrane (Millipore, Germany)으로 이 융합 단백질을 이동시킨 후 anti 6-his polyclonal antibody (BD, France)를 이용하여 발현여부를 확인하여 본 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 이 융합 단백질 밴드를 확인되었다.

원편광 이색성 분광법(Circular dichroism spectroscopy)

이 융합 단백질의 이차 구조와 folding properties를 평가하기 위해, 정제된 이 융합 단백질은 far-UV Circular dichroism (CD) spectroscopy (JASCO J-1500 spectropolarimeter, wavelength range of 190 nm to 260 nm)로 측정하여 본 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 PMAP36과 P22 lysozyme-PMAP36 융합 단백질에서는 208과 222nm에서 두 개의 전형적인 negative bands 관찰되어 helical 구조가 확인되었다. 다른 한편, 도 4에서 보는 바와 같이 PMAP36과 P22 lysozyme-PMAP36과 큰 차이점이 발견 되지 않는 다는 것은 융합에 따라 PMAP36의 helical 구조가 큰 영향을 받지 않았다는 것을 보여주는 결과이다.

투사전자현미경 ( TEM )

도 5에서 보는 것처럼, P22 lysozyme-PMAP36 융합 단백질로 처리하지 않은 ETEC strain은 온전한 세포막과 세포내에 가득찬 세포 내용물이 관찰되었다 (도 5A). 반면, P22 lysozyme-PMAP36 융합 단백질에 의해 고스트화된 각 ETEC 균들은 도 5B에서 보는 것처럼 하나의 구멍이 뚫린 세포막과 더불어 빈 세포 질 공간이 관찰되었다.

백신 접종 후 유도된 면역반응

백신 접종 된 자돈을 대상으로 K88ac 및 FedA 항원에 대한 각 자돈 혈청 IgG의 항체 역가는 도 6에 나타나 있다. 즉, K88ac 및 FedA에 대한 혈청 IgG의 역가들은 대조군에 비해 접종군에서 유의있는 항체 역가의 증가가 관찰되었다 (P ≤ 0.05).

도전감염에 대한 방어 효과

모든 포유자돈은 생후 4주령 째에 경구로 도전감염 되었다. Group B에 속해있는 10마리의 신생자돈 사이에서 단 한 마리도 설사를 하지 않았으며, 도전감염 14일 후까지 한 마리의 새끼돼지도 폐사하지 않았다. 이와 대조적으로, Group A의 자돈 10마리 중 7마리(70%)에서 설사가 관찰됐으며(도전감염 3일 후), 3마리(30%)는 심한 설사로 사망하였다.

소화관은 소화와 영양흡수의 주된 공간이다. 게다가 장상피는 세균성 항원들과 독소들이 숙주를 감염하는 것을 예방하는데 중요한 역할을 한다. 신생돈의 intestinal status는 몇몇 요소들에 의해 변할 수 있다. 그런 요소들 사이에서, 젖먹이 돼지 및 이유 자돈들은 특별히 많은 세균성 감염에 예민하다. 그 이유로는 모돈으로부터의 분리 및 같이 자란 형제들이 아닌 크기가 비슷한 다른 무리의 자돈들과의 합사 그리고 익숙한 포유가 아닌 사료 및 환경의 변화 등으로 인해 스트레스를 받아 많은 세균에 민감한 시기이다. 점막면역은 전신성 면역(systemic immunity)보다 ETEC colibacillosis에 대한 방어에서 더 중요하다. 포유자돈을 위한 ETEC 대장균증(colibacillosis)을 예방하기 위한 몇몇 산업용 모돈 vaccine들은 판매되고 있지만, 이유 자돈을 위한 백신은 아직까지 판매가 되고 있지 않다. 다만 최근에 이유자돈에서 병원성 대장균에 의해 주로 발생하는 부종병에 대한 백신이 판매되기 시작하였을 뿐이다. 그러나 신생자돈에서의 대장균증을 예방하기 위한 포르말린 불활화 백신은 세균 표면 항원의 물리화학적 그리고 구조적 특성(property)을 바꾸어 포르말린-불활화 ETEC 백신들은 신생자돈에서 colibacillosis를 예방하는데 효과적이지 않을 수 있다. 그러므로, 세균의 구조적 그리고 물리화학적 property들을 변화시키지 않는 새로운 백신을 개발하는 것이 필요하다. P22 lysozyme-PMAP36 융합 단백질에 의해 유도된 ETEC 고스트 백신은 세포에 대한 부착능을 가진 높은 면역원성을 가진 자연 표면구조(native surface structures)들을 유지한 체 세균 세포막에 구멍을 만들어 세포내 세포질성 물질들을 세포 밖으로 내 보내 결국은 불활화 한다. 그러므로, P22 lysozyme-PMAP36 융합 단백질로 유도된 고스트 백신 후보는 돼지에서 좀 더 향상된 vaccine candidate로 사용될 수 있다. 따라서 본 발명에서 P22 lysozyme-PMAP36 융합 단백질을 이유자돈에서 설사를 야기하는 F4+ ETEC와 F18+ ETEC를 고스트로 유도하였으며, 이렇게 유도된 이들 ETEC 고스트 백신 후보를 포유 자돈에 접종한 후 그들 자돈에서의 면역 유도 여부와 도전감염 균주에 대한 방어 여부를 확인하여 보았다.

그 결과 F4+ ETEC 및 F18+ ETEC 고스트 백신을 혼합접종한 그룹에서는 대조군에 비해 K88ac 및 FedA 항원에 대한 혈청 IgG가 유의성 있는 증가가 관찰되어, 이러한 결과는 새로운 ETEC 백신후보의 IM접종이 방어적 면역 반응을 효과적으로 유도할 수 있음을 보여준다. 백신 후보의 효능을 관찰하기 위해서, 모든 자돈은 wild-type의 ETEC strain으로 도전감염시켰다. 대조군인 그룹 A의 자돈에서의 도전감염 이후 설사와 폐사가 70% 그리고 30%로 관찰됐다. 그러나 백신 접종된 그룹에서의 자돈은 거의 모든 자돈에서 설사 및 폐사가 관찰되지 않아 포유자돈에 고스트 백신후보를 근육 접종하는 것이 이유 후 자돈에서의 ETEC colibacillosis에 대한 방어에 효과적일 수 있다는 것을 보여주었다.

본 발명에서, 포유자돈에 ETEC 고스트 백신을 근육접종함으로써 전신 면역 반응을 효과적으로 유도하는 것이 확인되었다. 또한 포유자돈에 근육접종한 후 wild-type virulent ETEC strains으로 도전감염 후에는 아무런 임상 증상이 관찰되지 않은 반면, 대조군 그룹의 자돈에서는 설사가 70% 관찰됐다. 더욱이, 대조군에서는 폐사가 관찰됐다. 그러므로, 이러한 결과를 바탕으로 했을 때, 우리의 새로운 백신후보로 포유자돈을 근육접종하는 것이 이유 후 ETEC colibacillosis를 방어하는데 효과적일 수 있음을 보여준다.

본 발명은 2015년도 정부(교육부)의 재원으로 한국연구재단 기초연구사업의 지원을 받아 수행된 연구임(No. 2015R1D1A1A02062126)

한국생명공학연구원

KCTC18534P

20161228

<110> komipharm Chonbuk National University Industry-University Collaboration Foundation <120> The composition of the enterotoxigenic Escherichia coli ghost vaccine candidate by recombinant P22 lysozyme-PMAP36 fusion protein against neonatal piglet colibacillosis <130> c16-42 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 585 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P22-lysozyme-PMAP36 <400> 1 atgcaccatc atcaccatca catgcaaatc agcagtaacg gaatcaccag attaaaacgt 60 gaagaaggtg agagactaaa agcctattca gatagcaggg ggataccaac cattggggtt 120 gggcataccg gaaaagtgga tggtaattct gtcgcatcag ggatgacaat caccgccgaa 180 aaatcttctg aactgcttaa agaggatttg cagtgggttg aagatgcgat aagtagtctt 240 gttcgcgtcc cgctaaatca gaaccagtat gatgcgctat gtagcctgat attcaacata 300 ggtaaatcag catttgccgg ctctaccgtt cttcgccagt tgaatttaaa gaattaccag 360 gcagcagcag atgctttcct gttatggaaa aaagctggta aagaccctga tattctcctt 420 ccacggaggc ggcgagaaag agcgctgttc ttatcgctgg ttccgcgtgg atccggacga 480 tttagacgtt tacgtaaaaa aacccggaaa cgtctgaaaa agattgggaa agtgttgaaa 540 tggattcctc ctattgtcgg ttcaataccc ttaggttgtg gataa 585 <210> 2 <211> 194 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P22-lysozyme-PMAP36 amino acid sequence <400> 2 Met His His His His His His Met Gln Ile Ser Ser Asn Gly Ile Thr 1 5 10 15 Arg Leu Lys Arg Glu Glu Gly Glu Arg Leu Lys Ala Tyr Ser Asp Ser 20 25 30 Arg Gly Ile Pro Thr Ile Gly Val Gly His Thr Gly Lys Val Asp Gly 35 40 45 Asn Ser Val Ala Ser Gly Met Thr Ile Thr Ala Glu Lys Ser Ser Glu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Asp Leu Gln Trp Val Glu Asp Ala Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Val Arg Val Pro Leu Asn Gln Asn Gln Tyr Asp Ala Leu Cys Ser Leu 85 90 95 Ile Phe Asn Ile Gly Lys Ser Ala Phe Ala Gly Ser Thr Val Leu Arg 100 105 110 Gln Leu Asn Leu Lys Asn Tyr Gln Ala Ala Ala Asp Ala Phe Leu Leu 115 120 125 Trp Lys Lys Ala Gly Lys Asp Pro Asp Ile Leu Leu Pro Arg Arg Arg 130 135 140 Arg Glu Arg Ala Leu Phe Leu Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Arg 145 150 155 160 Phe Arg Arg Leu Arg Lys Lys Thr Arg Lys Arg Leu Lys Lys Ile Gly 165 170 175 Lys Val Leu Lys Trp Ile Pro Pro Ile Val Gly Ser Ile Pro Leu Gly 180 185 190 Cys Gly

Claims

서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 P22-라이소자임-PMAP36의 재조합 유전자; 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산서열로 이루어진 P22-라이소자임-PMAP36의 재조합 유전자를 포함하는 P22-라이소자임-PMAP36 융합 단백질:
(상기 P22는 살모넬라 타이피뮤리움 박테리오파지 P22이고, 상기 PMAP36은 항균성 펩타이드-36(procine myeloid antimicrobial peptide-36, PMAP-36)이다.)
제 1항에 있어서, P22-라이소자임-PMAP36 융합 단백질에 의해 고스트화가 된 미생물 형질 전환체.
제 2항에 있어서, 상기 미생물 형질 전환체는 미생물 기탁번호 KCTC18534P(미생물 명칭: Escherichia coli HJL779)으로 기탁된 대장균 균주인 것을 특징으로 하는 미생물 형질 전환체.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, P22-라이소자임-PMAP36 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 이유 자돈의 대장균증 예방용 고스트 백신 조성물.
제 4항에 있어서, P22-라이소자임-PMAP36 융합 단백질이 이유 자돈에서 설사를 야기하는 F4+ 또는 F18+ ETEC 균주들의 고스트를 유도함으로써 이유 후 ETEC 대장균 감염증(colibacillosis)을 방어하는 것을 특징으로 하는 이유 자돈의 대장균증 예방용 고스트 백신 조성물.