CN110655564B - 一种组合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种组合蛋白及其应用。本发明所述组合蛋白为包括细粒棘球绦虫膜联蛋白EgANX和磷酸丙糖异构酶EgTIM的组合蛋白；或为细粒棘球绦虫膜联蛋白EgANX和磷酸丙糖异构酶EgTIM的融合蛋白。本发明以细粒棘球绦虫膜联蛋白EgANX和磷酸丙糖异构酶EgTIM作为抗细粒棘球绦虫蛋白进行免疫实验，结果显示两个蛋白对犬表现出较好的免疫保护作用，并能够产生稳定的抗体，具备开发犬用细粒棘球绦虫疫苗的潜力。

Description

一种组合蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种组合蛋白及其应用。
背景技术
囊性包虫病又称为囊型棘球蚴病，是由细粒棘球绦虫中绦期幼虫引起的一种全球范围性的人兽共患寄生虫病。该病每年造成约30亿的经济损失，在我国20多个省份有该病发生，主要集中在青海、西藏、新疆等地，据估计我国约有35万-130万包虫病患者。包虫病为我国二类动物疫病，是我国优先防治和重点防范的16种动物疫病之一。
细粒棘球绦虫需要中间宿主(羊牛等家畜)和终末宿主(犬)才能完成其生活史，阻断传播途径的任意一环，均能有效阻断包虫病的传播和感染。犬是细粒棘球绦虫的终末宿主和细粒棘球蚴病的传染源，目前采用的防控措施是“犬犬驱虫，月月驱虫”。由于长期使用化学药物，出现了耐药性、药物残留、环境污染等一系列问题。而疫苗具有安全、无残留、动物无休药期的优点，免疫终末宿主是防控该病的重要措施之一。在我国牧区，犬的总数量远小于家畜数量，因此对犬进行疫苗预防更经济且更利于实施。
目前尚无尚业化的用于免疫犬(终末宿主)的疫苗来预防犬感染细粒棘球绦虫。因此筛选高效的疫苗抗原是今后重点研究方向之一。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种组合蛋白，使其对犬表现出较好的免疫保护作用，并能够产生稳定的抗体，可作为一种针对细粒棘球绦虫的候选疫苗；
本发明的另外一个目的在于提供上述组合蛋白或其编码序列在制备预防细粒棘球绦虫的疫苗中的应用；
本发明的另外一个目的在于提供利用上述组合蛋白制备的预防细粒棘球绦虫的疫苗。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种组合蛋白，其为包括细粒棘球绦虫膜联蛋白EgANX和EgTIM的组合蛋白；或为细粒棘球绦虫膜联蛋白EgANX和EgTIM的融合蛋白。其中，细粒棘球绦虫膜联蛋白EgANX的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述细粒棘球绦虫磷酸丙糖异构酶EgTIM的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明通过原核表达出细粒棘球绦虫的膜联蛋白EgANXA基因(SEQ ID NO:3所示)和磷酸丙糖异构酶Eg-TIM基因(SEQ ID NO:4所示)，用获得的重组蛋白对比格犬进行混合免疫，获得了较高的免疫保护效果。
以所述组合蛋白辅以免疫佐剂免疫比格犬，每只犬肌肉注射200μg蛋白免疫复合物，一共免疫2次，每次间隔两周，二免后两周攻虫，免疫前后以及感染后定期对所有比格犬进行前臂头静脉采血，二免4周后剖检犬进行虫体计数和虫体长宽度测量。在犬的细粒棘球绦虫免疫保护组中，空白对照组平均荷虫数为17420，虫体平均长度为2.19mm，平均宽度为0.33mm；rEgANX-rEgTIM联合免疫组平均荷虫数为5120，虫体的平均长度为1.66mm，平均宽度为0.24mm，减虫率为：70.61％；rEgANX组免疫组平均荷虫数为7425，虫体的平均长度为1.49mm，平均宽度为0.25mm，减虫率为：57.38％。rEgTIM组免疫组平均荷虫数为8155，虫体的平均长度为1.58mm，平均宽度为0.25mm，减虫率为：53.18％。免疫组的虫体长宽度均小于对照组。与对照组相比，免疫组均显著地提高了试验比格犬对细粒棘球绦虫的抵抗能力，且rEgANX和rEgTIM混合免疫组效果最好(P<0.05)。
基于此，本发明提供了所述组合蛋白或其编码序列在制备预防细粒棘球绦虫的疫苗中的应用。
同时，根据应用和本发明具体试验结果，还提供了一种预防细粒棘球绦虫的疫苗，包括本发明所述组合蛋白和免疫佐剂。
在本发明具体实施方式中，所述免疫佐剂为皂素QuilA或弗式佐剂，所述免疫佐剂的浓度为1mg/mL，所述组合蛋白的浓度为100-200μg/mL。
由以上技术方案可知，本发明以细粒棘球绦虫膜联蛋白EgANX和磷酸丙糖异构酶EgTIM作为抗细粒棘球绦虫蛋白进行免疫实验，结果显示两个蛋白对犬表现出较好的免疫保护作用，并能够产生稳定的抗体，具备开发犬用细粒棘球绦虫疫苗的潜力。
附图说明
图1所示为重组蛋白rEgANX和rEgTIM纯化图；其中，M为蛋白质相对分子质量标准；1为纯化后的rEgANX蛋白；2为纯化后的rEgTIM蛋白；
图2所示为血清特异性抗体的间接ELISA检测结果。
具体实施方式
本发明公开了一种组合蛋白及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述组合蛋白及其应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的组合蛋白及其应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明所述细粒棘球绦虫膜联蛋白EgANX和磷酸丙糖异构酶EgTIM可通过分子生物学技术制备获得，一般为以细粒棘球绦虫总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板然后设计引物进行扩增获得目标产物，通过酶切位点连接到载体质粒中，转染至宿主中培养，IPTG诱导并纯化，获得目的重组蛋白。
在本发明具体实施方式，本发明采用Escherichia coli BL21-pET32a(+)-rEgANX、BL21-pET32a(+)-rEgTIM进行蛋白诱导表达，相关宿主菌株购自四川农业大学动物寄生虫病研究中心。
本发明具体实施方式中，所涉及的材料和试剂如下：
1、试验动物
24只5-6月龄比格犬，购自四川养麝研究所都江堰比格犬繁育中心。试验前三个月分别使用肠虫清、左旋咪唑、伊力佳进行试验前驱虫处理。
2、主要试剂和仪器
2.1试验菌株
Escherichia coli BL21-pET32a(+)-rEgANX、BL21-pET32a(+)-rEgTIM由四川农业大学动物寄生虫病研究中心提供。
2.2主要试剂
HRP标记兔抗犬IgG抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；IPTG、Quil A(皂素)购自Sigma公司；96孔酶标板购自Corning公司；辣根过氧化物酶标记的TMB底物显色液购自天根生化科技(北京)有限公司；Mini Profinity Ni-charged IMAC预装柱购自Bio-Rad公司。
2.3主要仪器
光学显微镜：型号BM2100(日本奥林巴斯公司)；NGCTM10中高压层析系统(美国伯乐)；NanoDrop One超微量分光光度计(美国赛默飞)
3、重组蛋白的表达和纯化
取E.coli BL21-pET32a(+)-rEgANX、BL21-pET32a(+)-rEgTIM表达菌株分别接种到含50μg·mL-1Amp的LB培养液中，37℃培养6h直至菌液OD值达到0.6，再加入1mmol/L IPTG诱导表达6h。随后使用NGCTM10中高压层析系统(Bio-Rad，USA)对所表达的重组蛋白进行纯化，将收集得到的蛋白进行超滤，并用SDS-PAGE鉴定,使用NanoDrop One超微量分光光度计进行蛋白浓度测定，将重组蛋白保存于-80℃超低温冰箱。
rEgANX和rEgTIM蛋白：按常规方法进行克隆表达与蛋白纯化蛋白浓度用BCA蛋白试剂盒进行测定。
将保种菌E.coli BL21-pET32a(+)-rEgANX、E.coli BL21-pET32a(+)-rEgTIM复苏并经1mmol/L IPTG在25℃诱导6h，分别得到约52kDa、46kDa的可溶性蛋白(Pet32a(+)的His标签大小约为18kDa，且蛋白性质比较稳定。表明成功表达出重组rEgANX蛋白、重组rEgTIM蛋白。将表达出的重组蛋白通过NI-NTA层析柱纯化，结果显示条带单一，纯度较高，如图1。
以下就本发明所提供的一种组合蛋白及其应用做进一步说明。
实施例1：动物免疫保护试验
1、试验分组
见表1。
表1试验动物分组
Figure BDA0002252179950000041
Figure BDA0002252179950000051
2、混合疫苗的制备
将rEgANX/rEgTIM重组蛋白和皂素Quil A用无菌PBS稀释，分别制成每ml含有100μg rEgANX、100μg rEgTIM和1mgQuil A的免疫混合物；每ml含有200μg rEgANX和1mg Quil A的免疫混合物；每ml含有200μg rEgTIM和1mg Quil A的免疫混合物.
3、免疫程序
试验组每只犬颈部皮下注射1mL的免疫混合物，共免疫两次，首免后间隔两周进行二免。
4、人工感染
二免两周，进行人工感染，试验组和对照组每只比格犬口服70000枚原头蚴。
5、采血
免疫前后以及感染后定期对所有比格犬进行前臂头静脉采血，3500rpm离心10min，对血清进行分离，并保存于-20℃冰箱中。
6、剖检计数
人工感染4周后，对所有组的比格犬进行剖检，记录每只犬小肠内虫体数量，并测量虫体的长度和宽度。
7、血清抗体间接ELISA检测
采用间接ELISA方法，混合组使用rEgANX、rEgTIM重组蛋白分别作为检测抗原对免疫组比格犬血清进行特异性IgG抗体检测。方法如下：用rEgANX、rEgTIM重组蛋白包被ELISA酶标板，4℃过夜，PBST洗涤三次，用5％脱脂牛奶37℃孵育2h，PBST洗涤拍干三次后，加入各组血清(免疫组和空白对照组血清)37℃孵育1h，随后加入HRP标记的兔抗犬IgG抗体37℃孵育1h。PBST洗涤后加入可溶性TMB底物进行显色，并以2MH2SO4终止显色。用酶标仪在紫外波长450nm处测定吸光度值。
8、数据处理
减虫率＝(对照组犬荷虫平均数-免疫组犬荷虫平均数)/对照组犬荷虫平均数×100％
用The Mann–Whitney U test进行检验。同时使用SPSS 20.对各组荷虫数进行统计分析。
9、组合蛋白对犬的免疫保护试验的人工感染结果
在经口感染原头蚴四周后，对实验组和对照组比格犬全部进行剖检，各组感染情况见表2。由表2可知，空白对照组平均荷虫数为17420，虫体平均长度为2.19mm，平均宽度为0.33mm；rEgANX-rEgTIM联合免疫组平均荷虫数为5120，虫体的平均长度为1.66mm，平均宽度为0.24mm，减虫率为：70.61％；rEgANX组免疫组平均荷虫数为7425，虫体的平均长度为1.49mm，平均宽度为0.25mm，减虫率为：57.38％。rEgTIM组免疫组平均荷虫数为8155，虫体的平均长度为1.58mm，平均宽度为0.25mm，减虫率为：53.18％。免疫组的虫体长宽度均小于对照组。与对照组相比，免疫组均显著地提高了试验比格犬对细粒棘球绦虫的抵抗能力，且rEgANX和rEgTIM混合免疫组效果最好(P<0.05)。
表2比格犬感染细粒棘球绦虫数量情况
Figure BDA0002252179950000061
注：*The Mann–Whitney U test被用于检验免疫组相对于对照组虫体数量的差异性，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著；
10、血清特异性抗体的间接ELISA检测
分别使用EgANX、EgTIM重组蛋白作为抗原，用间接ELISA方法对各组比格犬血清特异性抗体进行检测，各组血清抗体的OD450nm值变化如图2。根据图2看出，首免后，免疫组比格犬血清IgG水平有明显上升，在二免后一周，免疫组比格犬血清IgG达到最高水平。随着周次的增加，在二免后四周抗体水平稳定在一定范围。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种组合蛋白及其应用
<130> MP1927430
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Thr Val Lys Pro Cys Cys Asn Phe Asp Ala Asn Thr Asp Ala
1 5 10 15
Gln Thr Leu Glu Lys Ala Met Lys Gly Leu Gly Thr Asp Glu Ala Thr
20 25 30
Ile Ile Asp Val Leu Ala His Arg Thr Ser Arg Gln Arg Arg Glu Ile
35 40 45
Ala Asp Ala Tyr Lys Ala Gln Phe Gly Lys Asp Leu Lys Glu Asp Leu
50 55 60
His Lys Glu Leu Ser Gly Lys Phe Arg Gln Ala Val Glu Trp Ser Phe
65 70 75 80
Tyr Asn Arg Ala His Val Asn Ala Ala Ala Leu Gln Lys Ala Met Lys
85 90 95
Gly Ala Gly Thr Asn Glu Lys Leu Leu Ile Asp Ile Leu Cys Thr Ala
100 105 110
Ser Asn Lys Glu Val Lys Lys Ile Lys Glu Ala Tyr Glu Glu Ile Thr
115 120 125
Gln Lys Ser Leu Glu Asp Asp Val Glu Ser Glu Thr Ser Gly Asp Phe
130 135 140
Lys Arg Val Leu Val Ala Ile Leu Gln Gly Arg Arg Glu Cys Asp Cys
145 150 155 160
Asn Glu Ser Gln Ala His Glu Asp Ala Met Glu Ile Tyr Lys Ala Gly
165 170 175
Glu Asn Lys Leu Gly Thr Asp Glu Ser Thr Phe Thr Arg Ile Leu Cys
180 185 190
Ser Arg Ser His Asp Gln Ile Arg Ile Ile Asn Glu Val Tyr Gln Glu
195 200 205
Glu Thr Gly His Asp Leu Ile Lys Ala Ile Lys Lys Glu Thr Ser Gly
210 215 220
Asp Tyr Glu Glu Ala Leu Cys Arg Ile Val Leu Ala Ser Lys Asp Leu
225 230 235 240
Thr Gly Thr Val Ala Glu Met Leu Tyr Arg Ser Met Lys Gly Ala Gly
245 250 255
Thr Asn Asp Asp Ser Leu Ile Arg Ile Ile Leu Ala His Ser Glu Asp
260 265 270
Asp Leu Arg Lys Ile Gln Ala Lys Phe Asp Ser Thr Tyr Glu Lys Ser
275 280 285
Leu Val Lys Met Ile Ser Gly Asp Thr Ser Gly Asp Tyr Lys Asn Phe
290 295 300
Leu Leu Ala Ile Leu Glu
305 310
<210> 2
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Arg Lys Leu Phe Val Gly Gly Asn Trp Lys Met Asn Gly Ser
1 5 10 15
Tyr Ser His Ile Asp Ser Phe Phe Glu Thr Leu Lys Lys Ala Asp Thr
20 25 30
Asp Pro Asn Ala Asp Val Val Ile Gly Val Pro Ala Cys Tyr Leu Lys
35 40 45
Tyr Ala Gln Asp Lys Ala Pro Asn Gly Ile Lys Ile Ala Ala Glu Asn
50 55 60
Cys Tyr Lys Val Ser Ser Gly Ala Phe Thr Gly Glu Val Ser Thr Glu
65 70 75 80
Met Ile Lys Asp Cys Gly Cys Glu Trp Val Ile Leu Gly His Ser Glu
85 90 95
Arg Arg His Ile Phe Gly Glu Ser Asn Glu Leu Ile Gly Glu Lys Val
100 105 110
Lys His Ala Leu Asp Ser Gly Leu Asn Val Ile Pro Cys Ile Gly Glu
115 120 125
Leu Leu Ser Glu Arg Glu Ala Gly Lys Thr Asn Asp Val Cys Phe Ala
130 135 140
Gln Met Glu Ala Ile Ala Lys Asn Val Pro Ser Lys Glu Ala Trp Asn
145 150 155 160
Lys Val Val Ile Ala Tyr Glu Pro Val Trp Ala Ile Gly Thr Gly Lys
165 170 175
Thr Ala Thr Pro Ala Gln Ala Gln Glu Val His Lys Val Val Arg Asp
180 185 190
Trp Ile Arg Lys His Val Asp Val Gly Ile Ala Asp Lys Val Arg Ile
195 200 205
Leu Tyr Gly Gly Ser Val Thr Ala Ser Asn Ala Lys Asp Leu Gly Ala
210 215 220
Gln Pro Asp Val Asp Gly Phe Leu Val Gly Gly Ala Ser Leu Lys Pro
225 230 235 240
Asp Phe Val Thr Ile Ile Asn Ala Arg Arg
245 250
<210> 3
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggcgactg tcaagccttg ctgcaatttc gatgccaaca cggatgccca aacacttgaa 60
aaagccatga aaggattagg gactgatgag gcaaccatca ttgacgttct cgcacaccgc 120
accagccgcc aacgtcgaga aattgctgat gcctataaag cacagttcgg gaaggatcta 180
aaggaggatt tgcacaaaga gctgagcgga aaattccgtc aggcggtaga gtggtccttc 240
tacaatcgcg cccacgtaaa tgcagctgct ttacagaagg ccatgaaggg tgccggtacc 300
aacgagaagc tgctcattga catcctctgc accgctagca acaaagaagt aaagaaaata 360
aaggaagcct atgaagagat aacacagaaa tcactggaag atgatgtgga gtctgaaacc 420
tctggcgact tcaagcgggt gctggtggcg atcttgcaag gcaggcgtga gtgcgactgt 480
aacgagtcac aggcgcatga ggatgctatg gagatctaca aagctggcga aaataagctt 540
ggaacagacg agtccacatt tacgcgaatc ctgtgctcgc gaagccacga ccaaatccgt 600
ataatcaacg aggtttatca agaagaaact ggtcatgatc tcatcaaagc aatcaaaaaa 660
gaaacctcag gagattacga agaagctctg tgtcgaattg tgctggcatc gaaagatctt 720
actggcacag tcgcggaaat gctctaccgc agcatgaagg gcgcaggaac caacgacgac 780
agtcttatcc gcataatttt agcccattct gaagatgatc ttcgcaaaat tcaggccaaa 840
tttgacagca cctatgaaaa gtcactcgta aaaatgatct cgggtgacac ttctggtgat 900
tacaagaatt ttctgcttgc catactggag taa 933
<210> 4
<211> 753
<212> DNA
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ggtgttcccg cttgctattt gaagtatgct caggataaag ctccgaatgg cattaaaatc 180
gccgccgaaa attgctacaa agttagttct ggtgcattca ctggtgaagt aagcactgaa 240
atgattaaag actgtggatg tgaatgggtc attcttggcc attctgagcg tcgtcacatt 300
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gtttgcttcg ctcaaatgga ggccattgcc aaaaatgttc catcaaagga agcctggaat 480
aaagttgtta ttgcttacga acctgtttgg gccattggca ctggcaagac tgcaacgcca 540
gctcaagctc aagaggttca caaggtcgtt cgtgactgga tccgcaagca cgtggatgtc 600
ggaatcgctg acaaggttag aatcctctac gggggctcgg ttacggcttc caacgccaaa 660
gatctgggtg cccaacccga cgtggatgga ttccttgttg gtggagcctc cctgaaaccc 720
gactttgtca ccatcatcaa cgcaagaaga tga 753

Claims (6)

1.一种组合蛋白，其特征在于，为包括细粒棘球绦虫膜联蛋白EgANX和磷酸丙糖异构酶EgTIM的组合蛋白；或为细粒棘球绦虫膜联蛋白EgANX和磷酸丙糖异构酶EgTIM的融合蛋白；
所述细粒棘球绦虫膜联蛋白EgANX的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述细粒棘球绦虫磷酸丙糖异构酶EgTIM的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述组合蛋白或其编码序列在制备预防细粒棘球绦虫的疫苗中的应用。
3.一种预防细粒棘球绦虫的疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述组合蛋白和免疫佐剂。
4.根据权利要求3所述疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂为皂素Quil A或弗式佐剂。
5.根据权利要求3或4所述疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂的浓度为1mg/mL。
6.根据权利要求3所述疫苗，其特征在于，所述组合蛋白的浓度为100-200μg/mL。
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