CN103874502A - 用于控制病原体的氨基酸序列 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从罗非鱼(O.niloticus)鳃的提取物分离和纯化的抗微生物肽。这样的肽可通过化学合成或通过在异源表达系统例如细菌和酵母中表达，通过常规分子生物学技术来产生。这些肽显示抗多种生物体包括革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌和病毒的抗微生物活性。本发明还包括用于控制病原体的包含所述抗微生物肽的组合物。所述肽在疫苗制剂中用作分子佐剂的用途也是本发明的一部分。

Description

用于控制病原体的氨基酸序列
技术领域
本发明涉及生物技术学领域，具体地涉及抗微生物肽的获得以及它们用于控制病原体的用途。当应用抗微生物肽时，它们有效地实现了由病原体引起的疾病的控制。此外，这些肽有助于增强由包含在疫苗中的各种抗原诱导的免疫应答。
现有技术
鱼具有用作抗广谱病原体的一线防御的强大的先天免疫系统(Subramanian等人(2008)Fish and Shellfish Immunol.25:625–632)，和发育不良的适应性免疫系统(Magnadottir,(2010)MarBiotechnol.12:361–379)。鱼抵抗病原体的方式之一是通过分泌抗微生物肽(AMP)作为先天防御机制。AMP在先天免疫系统中具有重大作用并且保护免受多种细菌、真菌、病毒和引起感染的其它病原体的侵害(Solomon,(2008)Lancet Neurol.7:116–118)。一般地，AMP被分泌在唾液、粘液、循环系统和作为病原体的靶的其它区域中(Noga等人(2010)Comp Biochem Physiol D：Genom Proteom.6:44-54)。
AMP基于它们的氨基酸组成和结构被分成5类。在这些分类中，包括阴离子肽，具有α-螺旋两亲结构的线性肽，富含特定氨基酸的阳离子肽，肽片段和具有形成分子内键的半胱氨酸的肽(Brogden(2005)NatRev Microbiol.3:238–50;Boman(2000)Immunol Rev.173:5-16)。阴离子肽以毫摩尔浓度产生，需要锌作为辅因子，并且显示抗革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的抗微生物活性。具有两亲性α-螺旋结构的线性和阳离子肽具有少于40个氨基酸并且具有在中间部分具有铰链区的三维结构。虽然其结构在溶液中是无序的，但当它们与膜接触时，这些分子采取二级α-螺旋结构(Brogden(2005)Nat Rev Microbiol.3:238-50)。由富含特定氨基酸的线性阳离子肽组成的其它组不具有半胱氨酸残基，从而这些肽在溶液中具有非常柔软的结构(Brogden(2005)Nat Rev Microbiol.3:238–50)。第4组包括带电荷的肽，其是来自更大的蛋白质的片段。这些肽具有抗微生物活性和与其它组的肽相似的结构(Bellamy等人(1992)J Appl Bacteriol.73:472-9;Zanetti等人(1995)FEBS Lett.374:1-5)。第5组肽由约380个成员组成，所述成员包含形成分子内键的6个保守半胱氨酸残基和β片结构(Brogden(2005)Nat Rev Microbiol.3:238-50)。该组包括防御素和海帕西啶(Boman等人(2000)Immunol Rev.173:5-16)。
虽然AMP通常通过结构特征的差异来分类，但存在一些对于这些肽中的大部分肽是共同的特征。例如，它们通常具有少于60个氨基酸，在生理条件下具有广谱抗微生物活性，以及具有正电荷(Zasloff(2002)Nature415:389-395)。大多数两亲性AMP，基于其与病原体例如细菌和有包膜病毒的脂质细胞膜的相互作用，采取促成这些肽的作用机制的结构(Shai(2002)Biopolymers66：236-48;Jelinek和Kolusheva(2005)Curr.Protein Pept.Sci.6：103-14)。该相互作用引起病原体脂质膜的快速去稳定/透化。几个观察表明除了孔形成的机制以外，AMP还可抑制细胞壁、核酸和蛋白质的合成，以及甚至抑制酶活性(Brogden等人(2005)Nat.Immunol.6：558-64;Campagna等人(2007)Biochemistry46：1771-8)。
由于微生物发展抗抗生素抗性的能力以及由病原体引起的对于其还没有适当治疗的疾病的存在，需要寻找具有抗微生物活性的新型分子。
因此，要解决的重要问题是开发能够高效地控制广泛病原体并且对先天和适应性免疫、人和兽医学包括水产业的极其重要的方面具有影响的新型抗微生物产品，特别是蛋白质和/或肽。
发明详述
本发明通过提供用于控制和治疗由病原体产生的感染，包括由细菌、病毒或真菌引起的感染的新型替代物解决了上述问题。在本发明中，首次报道了SEQ ID No.1、2和3的抗微生物肽。本发明的目的还有在它们的氨基酸序列中包含SEQ ID No.1、2或3的氨基酸序列或与SEQID No.1、2或3的肽具有至少80%的同一性的氨基酸序列的氨基酸序列。
从罗非鱼(Oreochromis niloticus(尼罗罗非鱼))鳃蛋白质提取物分离了3种肽，并且对所述肽进行了测序，所述肽称为Oreochromicin I、Oreochromicin II和Oreochromicin III。这些肽未曾在文献中报道过，在本发明中表示为SEQ ID No.1、2和3。这些肽具有抗革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、病毒和真菌的抗微生物作用。本发明的肽可通过从其天然来源分离来获得。此外，所述肽可通过化学合成或通过重组脱氧核糖核酸(DNA)技术来获得。
在本发明的一个实施方案中，抗微生物肽通过在细菌、酵母或高等生物的细胞中重组表达来获得。可将这些抗微生物肽在不同的宿主系统中表达，随后从它们分离而来。在具体的实施方案中，抗微生物肽可在酵母中表达。在优选实施方案中，在毕赤酵母(Pichia pastoris)，优选在培养上清液中进行通过重组DNA技术的表达。还可在细菌中表达本发明的抗微生物肽。在另一个优选实施方案中，在大肠杆菌(Escherichiacoli)中进行通过重组DNA技术的表达。可通过蛋白质分离技术从宿主获得本发明的肽，所述技术为本技术领域内技术人员所公知，例如层析技术、洗涤沉淀等。
抗微生物肽的使用相较于其它抗微生物剂提供了有利方面，因为它们具有小尺寸(～5kDa)，这样当通过浸渍施用时可通过水生生物的皮肤和粘膜被更好地吸收，所述浸渍对于水产业来说是具有有利成本和具有低污染水平的施用途径。另一个有利方面是抗微生物肽刺激先天和适应性免疫活性，并且增强对致病体感染的抗性。
通过考虑每一种肽的氨基酸序列，简并寡核苷酸被设计来通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码每一种成熟肽的核苷酸序列。因此，本发明的另一个目的是包含选自SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6的核酸序列的核酸。
本发明的另一个目的是编码包含SEQ ID No.1、2或3的氨基酸序列或与SEQ ID No.1、2或3的肽具有至少80%的同一性的氨基酸序列的肽的核酸。
本发明还提供了用于控制病原体的组合物，其包含SEQ ID No.1、2或3的肽或与SEQ ID No.1、2或3的肽具有至少80%的同一性的肽。
在本发明的一个实施方案中，其序列被要求保护的抗微生物肽(和包含其的组合物)可用于控制多种病原体例如细菌病原体(气单胞菌属(Aeromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、棒状菌(Corynebacteria)、肠杆菌(Enterobacteria)、嗜血菌属(Haemophilus)、分枝杆菌属(Mycobacteria)、诺卡尔菌属(Nocardia)、粘细菌(Myxobacteria)、链霉菌属(Streptomyces)和弧菌属(Vibrio)等等)；病毒病原体(感染性造血组织坏死病毒、感染性胰腺坏死病毒、出血性败血症病毒、虹彩病毒、鲤鱼出血病毒、鲤春病毒、比目鱼弹状病毒或黑鱼弹状病毒、淋巴囊炎病毒、感染性鲑鱼贫血等)、真菌和卵菌纲(水霉属、绵霉属、Ychthyosporidium hoferi等)。
在本发明的一个实施方案中，将肽Oreochromicin I、Oreochromicin II和Oreochromicin III以及与它们具有至少80%的序列同一性的肽配制成用于控制不同生物包括哺乳动物和水生生物中的病原体的组合物。在病原体的控制中预防性和治疗性施用这样的组合物。施用途径包括用于向人施用的药物和用于在动物的情况下施用药剂或添加剂的所有施用途径，所述施用途径对于本技术领域内的技术人员来说是公知的。在一个实施方案中，口服、胃肠外或通过浸浴施用本发明的用于控制病原体的组合物。
也是本发明的一个方面的是包含选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的氨基酸序列或与SEQ ID No.1,SEQ ID No.2或SEQID No.3具有至少80%的同一性的氨基酸序列的肽用于制造用于控制病原体的组合物的用途。
其另一个方面是提供用于控制攻击几种生物体的病原体的方法，其特征在于给所述生物施用有效量的包含选自SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3的氨基酸序列或与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3具有至少80%的同一性的氨基酸序列的肽。
在具体的实施方案中，通过以0.1至10μg/鱼的浓度定期注射，通过1-15天的间隔(连日或隔日)于淡水或海水中以0.01至0.1mg/L水的肽浓度浸浴来施用本发明的肽。还可将肽用作鱼的饲料添加剂，以约50-750μg的肽/kg饲料的浓度施用。在所有情况下，获得了对由病原体例如病毒、细菌或真菌等引起的疾病的抗性的显著增强。
此外，本发明提供了用作疫苗的分子佐剂的肽。在本发明的说明书中，术语"分子佐剂"是指能够调节针对疫苗抗原的免疫应答、从而产生免疫应答的增强的蛋白质性质的分子。
因此，本发明还提供了疫苗组合物，所述组合物包含含有选自SEQID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的氨基酸序列或与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3具有至少80%的同一性的氨基酸序列的肽(作为分子佐剂)和疫苗抗原。
本发明的另一个方面提供了用于增强对疫苗抗原的免疫应答的方法，所述方法使用疫苗中的肽，所述肽包含选自SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3的氨基酸序列或与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3具有至少80%的同一性的氨基酸序列作为分子佐剂。
附图概述
图1.将抗微生物肽克隆进入用于大肠杆菌(图1A)和用于毕赤酵母(图1B)的表达载体的克隆策略。
图2.从毕赤酵母培养上清液(图2A)和从大肠杆菌破裂上清液(图2B)纯化抗微生物肽。泳道1：Oreochromicin I；泳道2：OreochromicinII，泳道3：Oreochromicin III。
图3.抗微生物肽Oreochromicin I、Oreochromicin II和Oreochromicin III的抗病毒活性。用1μg的pTargeT-Oreochromicin I、pTargeT-Oreochromicin II、pTargeT-Oreochromicin III或pTargeT(作为对照)转染接种在24孔板中的EPC(鲤鱼上皮瘤细胞)细胞，进行24小时。在转染后24小时，添加不同浓度的蛙虹彩病毒(RGV)(10550%的病毒的感染剂量(TCID50)/ml,104TCID50/ml,103TCID50/ml和102TCID50/ml)，48小时后，收集培养上清液，测定病毒滴度。
图4.结合脂多糖(LPS)的抗微生物肽Oreochromicin I、Oreochromicin II、Oreochromicin III的饱和曲线。产生50%的肽(Oreochromicina I,Oreochromicina II和Oreochromicina III)结合的浓度(EC50)分别为1.23μM、1.41μM和2.99μM。
图5.罗非鱼中的抗嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的抗体滴度(n=12)。值代表平均值±标准误差(SE)。
图6.通过利用与肽Oreochromicin I、Oreochromicin II和Oreochromicin III共施用的OVA的免疫而在小鼠中诱导的总免疫球蛋白G(IgG)的滴度。建立4个实验组，每组6只动物。在第0和7天利用6μg的剂量的OVA(于0.2mL PBS中)腹膜内接种阴性对照组(磷酸缓冲盐溶液(PBS)/OVA)。在第0和7天，利用6μg的OVA+0.5μg的每一种肽的剂量(于0.2mL PBS中)腹膜内接种也接受肽的组(PBS/OVA+肽)。不同字母表示统计上显著的差异。值代表平均值±SE(n=6)。
图7.利用与肽Oreochromicin I、Oreochromicin II和Oreochromicin III共施用的OVA免疫在小鼠中诱导的总免疫球蛋白G(IgG)(A)、IgG1和IgG2a(B)的滴度。在第0和14天利用单独的OVA(5μg/动物)或与剂量为0.238x1020个分子/动物(分别相当于0.1、0.12和0.14μg/动物的Oreochromicina I、II和III)和2.38x1020个分子/动物(分别相当于1、1.2和1.4μg/动物的Oreochromicina I、II和III)的肽组合的OVA通过腹膜内注射来免疫雄性Balb/c小鼠(8只/组)。阴性对照组利用0.1mL的PBS进行注射。在第一次免疫后第14天和21天测试OVA-特异性体液免疫应答(总IgG)。在第一次免疫后第21天分析IgG1和IgG2a的抗体滴度。通过ELISA测定OVA-特异性抗体滴度。(A)总的IgG滴度。条柱代表IgG滴度±标准误差(n=8)。使用Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验进行统计分析。星号代表与PBS组的显著差异(*表示p<0.05,***表示p<0.001)。(B)IgG1和IgG2a的滴度。条柱代表抗体滴度±标准误差(n=8)。使用Mann Whitney检验进行统计分析(*表示p<0.05)。
图8.从免疫的动物分离的脾细胞的IFN-γ分泌。Y轴显示利用OVA(10μg/ml)刺激的脾细胞的培养上清液中的IFN-γ浓度。条柱代表IFN-γ的浓度±标准偏差(n=5)。通过ANOVA检验和Bonferroni's多重比较检验进行数据的统计分析(*：p<0.05,***：p<0.001)。
图9.通过用与抗微生物肽Oreochromicin I共施用的MY32蛋白免疫罗非鱼(O.niloticus)而诱导的IgM滴度。在第0和14天通过腹膜内注射免疫鱼(10条鱼/组)。利用0.3mL的PBS注射阴性对照组。在第1次免疫后第14、21和28天分析特异于MY32的体液免疫应答。通过ELISA测定特异于MY32的IgM抗体滴度。条柱代表IgM滴度±标准差(n=10)。通过ANOVA和Newman-Keuls多重比较检验进行数据的统计分析(*表示p<0.05)。
实施例
实施例1.从罗非鱼鳃提取物分离和纯化抗微生物肽
将罗非鱼(Oreochromis niloticus)鳃丝浸渍在液氮中，将所得的粉末在100℃加热10min，然后让其冷却。通过添加150mL的2M HCl、10%(v/v)甲酸、2%(w/v)NaCl和1%(v/v)三氯乙酸的溶液，随后匀浆1-2min来进行蛋白质的提取。将匀浆物以20000x g离心30min，将上清液调整至pH4.0并过滤。将所得滤液用作酸提取物，并应用于Sep-PakC18柱(Waters,Milford,MA,USA)。在用0.1%(v/v)三氯乙酸洗涤后，以80%乙腈/0.1%三氟乙酸洗脱对应于肽的级分。将洗脱物干燥，随后溶解于1M醋酸中，将其吸附至SP-Sephadex C-25的基质。利用1M醋酸、2M吡啶和2M吡啶/醋酸(pH5.0)的洗脱的连续步骤产生5个级分。对于每一级分，显示有抗微生物活性，选择级分2来进行随后的纯化步骤。
将选择的级分冷冻干燥，溶解在含有0.1%三氯乙酸的40%乙腈中。将溶液的等份应用于TSKgel G2000SW柱(凝胶过滤，高效液相色谱(HPLC))，利用含有0.1%三氯乙酸的40%的乙腈进行洗脱。将相同级分重复注射入柱子，将具有低于5kDa的分子量并显示抗微生物活性的所得级分冷冻干燥，随后经历反相色谱(RP-HPLC)和质谱(ESI-MS)。该级分的分子量通过在Tricine-十二烷基硫酸钠(16.5%T/3%C)(缩写为Tricine-SDS-PAGE)上进行凝胶电泳来测定。
在Hewlett-Packard HP1100系统上通过HPLC分离蛋白质。溶剂A为含有0.1%三氯乙酸的5%乙腈，溶剂B为含有0.085%三氯乙酸的80%乙腈。利用溶剂A重建级分A，将其在C8-3柱(4.6x150mm)上经历RP-HPLC。梯度为0-2min0%溶剂B、2-5min0-20%溶剂B、5-55min20-47%溶剂B和55-80min47-100%溶剂B。冷冻干燥显示抗微生物活性的所得级分，于含有25%乙腈的KH2PO4/H3PO45mM(pH3.0)中进行重建，将其加载至PolySulfoethyl Aspartamide柱(4.6x200mm)上。利用线性梯度的KCl洗脱级分。显示最大抗微生物活性的级分的分子量为2527.3、2981.9和3654.6Da。这些肽分别称为Oreochromicin I、II和III。测定每一个具有抗微生物活性的肽的氨基酸序列，在下文中分别称为SEQ ID No.1、2和3。此外，使用BlastX程序进行序列分析，发现这些肽先前未被报道过。
实施例2.用于在大肠杆菌细胞内表达抗微生物肽和在毕赤酵母中细胞外表达抗微生物肽的载体的构建
通过反转录反应从罗非鱼(O.niloticus)的鳃分离的核糖核酸(RNA)获得互补DNA(cDNA)。按照试剂盒"反转录系统"(Promega,USA)中描述的说明书进行反应。简而言之，将4μg总RNA置于不含核酸酶的微量离心管中，在70℃温育10分钟。随后，向其中添加其余反应组分(4μL的25mM MgCl2、2μL的10mM三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)的混合物、2μL的反转录10X缓冲液、0.5μL核糖核酸酶抑制剂、1μL的oligo(dT)500μg/mL、20个单位的逆转录酶和先前利用焦碳酸二乙酯处理的水至20μL的终体积)。将反应物在42℃温育15分钟，在95℃终止反应，进行5分钟。
使用从每一个肽的氨基酸序列设计的简并合成寡核苷酸，通过PCR从获得的cDNA扩增编码抗微生物肽的成熟区域的核苷酸序列。在所有情况下，我们获得具有预期大小的DNA条带。从琼脂糖凝胶纯化条带，将其插入商业载体pGEM-TEasy(Promega)以进行测序。编码肽的DNA序列为SEQ ID No.4、5和6。
使用限制位点NdeI/BamHI将编码抗微生物肽的DNA序列插入大肠杆菌表达载体pAR3040(图1A)。为了扩增对应于每一个肽的条带，使用识别每一个肽的5'和3'末端的特异性序列并且具有帮助克隆进入表达载体的限制性内切酶的识别位点的寡核苷酸。对于每一个肽，选择重组克隆之一来转化大肠杆菌BL21DE3菌株并且使用1mM异丙基-β-D-1-半乳糖硫吡喃糖苷(IPTG)作为诱导剂来诱导在T7启动子调控之下的基因表达。在37℃进行基因表达6小时。通过Tricine-SDS-PAGE和ESI-MS检查重组肽的表达。
将pPS9和pPS10载体以及识别每一个肽的5'和3'序列并且具有限制性内切酶的识别位点的特异性寡核苷酸用于构建毕赤酵母的抗微生物肽表达载体。为了在pPS9载体中进行克隆，使用NcoI和SpeI位点，为了克隆进入pPS10载体，使用NaeI和SpeI位点。这些克隆策略不将氨基酸添加至目标蛋白质(图1B)。
将质粒线性化，随后转化毕赤酵母MP36株。通过电穿孔进行转化。MP36株是营养缺陷型突变体his3，其在转化后获得His+表型。
通过斑点印迹鉴定转化体克隆。通过使用Southern印迹技术测定了在这些克隆中通过用重组质粒的表达盒替代毕赤酵母基因AOX1发生的整合，其对应于Muts表型(低甲醇使用)和His+。毕赤酵母分泌低水平的自身蛋白质并且其培养基不需要蛋白质补充，这样你可预期分泌至细胞外培养基的异源蛋白质，构成了培养基中的总蛋白质的大部分(超过80%)(Tschopp等人(1987)Bio/Technology5:1305-1308)。
通过向培养基中添加甲醇在5升中进行毕赤酵母的肽表达。重组肽的表达及其完整性通过Tricine-SDS-PAGE和ESI-MS来进行检查。
实施例3.抗微生物肽的纯化和生物活性测定
从大肠杆菌破裂上清液或从毕赤酵母培养上清液纯化重组地获得的抗微生物肽。首先，使用具有1kDa的孔径的膜在25mM醋酸钠(pH4.5)中进行透析。将透析的产物应用于利用25mM醋酸钠(pH4.5)平衡的阳离交换CM-Sepharose Fast Flow树脂，利用1M氯化钠,Tris50mM(pH7.6)洗脱蛋白质。收集包含肽的级分，使用具有1kDa的孔径的膜，利用超滤系统进行浓缩。为了进行检测，我们使用254nm的波长。通过Tricine-SDS-PAGE检查纯度，通过考马斯蓝染色显现蛋白质(图2)。
还可使用本技术领域的技术人员已知的方法，通过化学合成获得本发明的肽。肽的抗微生物活性通过微量稀释法来测定。为了测定最小抑制浓度(MIC)，将每一种肽以1:2进行系列稀释。用90μL的MuellerHinton肉汤(细菌)或Sabouraund肉汤(真菌)中的细菌或酵母悬浮液(5x105CFU(菌落形成单位)/mL)温育10微升的每一种稀释的肽，在28℃(对于鱼病原体和真菌)或37℃(对于哺乳动物病原体)温育18小时。MIC被定义为发生细胞生长的抑制时的最低肽浓度。以一式三份进行所有测定，将培养基(无微生物)和未对其添加肽的微生物用作对照。结果示于表1中。
表1.肽Oreochromicin I、Oreochromicin II和Oreochromicin III的抗微生物活性
Figure BDA0000492207390000101
*IC50：产生50%的细菌生长抑制的肽浓度
实施例4.先前用抗微生物肽处理的罗非鱼对嗜水气单胞菌感染的抗性的测定
通过腹膜内注射施用肽
我们继续评价抗微生物肽在体内增强疾病抗性的效用。在第一测试中，我们使用130条体重10g的罗非鱼(O.niloticus)，随后将所述鱼分配在13个实验组中，每组10个动物。进行该测定以测定增强鱼抵抗嗜水气单胞菌攻击的存活所需的最短处理时间。通过腹膜内施用以每条鱼1μg的浓度施用每一种肽，进行2、4、8和15天。设置了施用PBS作为对照的另一个组。实验组为：
组1：PBS
组2：连续2天施用Oreochromicin I
组3：连续4天施用Oreochromicin I
组4：连续8天施用Oreochromicin I
组5：连续15天施用Oreochromicin I
组6：连续2天施用Oreochromicin II
组7：连续4天施用Oreochromicin II
组8：连续8天施用Oreochromicin II
组9：连续15天施用Oreochromicin II
组10：连续2天施用Oreochromicin III
组11：连续4天施用Oreochromicin III
组12：连续8天施用Oreochromicin III
组13：连续15天施用Oreochromicin III
在肽施用的时间后，我们通过腹膜内注射中等致死剂量(LD50)的嗜水气单胞菌进行攻击测试，在7天的过程中记录死亡率。我们将存活的相对百分比(RPS)计算为：
RPS(%)=(对照的死亡%-处理的死亡%)/(对照的死亡%)x100
结果为：观察到利用Oreochromicin I和Oreochromicin III处理15天的鱼相较于接受PBS的组具有45%的存活的增加(测量为RPS)。同时，利用Oreochromicin II处理8天的组相较于接受PBS的组具有48%的存活的增加(RPS)。
进行第二次测试以测定在利用嗜水气单胞菌攻击后增加鱼的存活所需的肽的最佳剂量。我们使用130条体重约10g的罗非鱼(O.niloticus)，将其随机分配入13个实验组，每组10个动物。以每条鱼0.5、1、5和10μg的浓度施用每一种肽，进行15天。实验组为：
组1：PBS
组2：Oreochromicin I0.5μg/鱼
组3：Oreochromicin I1μg/鱼
组4：Oreochromicin I5μg/鱼
组5：Oreochromicin I10μg/鱼
组6：Oreochromicin II0.5μg/鱼
组7：Oreochromicin II1μg/鱼
组8：Oreochromicin II5μg/鱼
组9：Oreochromicin II10μg/鱼
组10：Oreochromicin III0.5μg/鱼
组11：Oreochromicin III1μg/鱼
组12：Oreochromicin III5μg/鱼
组13：Oreochromicin III10μg/鱼
在15天的肽施用后，我们通过腹膜内注射LD50的嗜水气单胞菌进行攻击测试，在7天的过程中记录死亡率。如上所述计算RPS。在攻击后第7天，所有3种肽都显示剂量依赖性效应，并且具有84%至88%的RPS（相较于显示10%的存活率的接受单独的PBS的组）。
通过浸浴施用肽
进行测试以测定在用嗜水气单胞菌攻击后通过浸浴施用的每一种肽对鱼的存活的作用。使用1300条孵育后5天的罗非鱼(O.niloticus)幼苗，将其随机分配在13个实验组中，每组100条幼苗。以0.01、0.05、0.1和0.5mg的肽/升水的浓度施用每一种肽，进行15天。实验组为：
组1：PBS
组2：Oreochromicin I0.01mg/L
组3：Oreochromicin I0.05mg/L
组4：Oreochromicin I0.1mg/L
组5：Oreochromicin I0.5mg/L
组6：Oreochromicin II0.01mg/L
组7：Oreochromicin II0.05mg/L
组8：Oreochromicin II0.1mg/L
组9：Oreochromicin II0.5mg/L
组10：Oreochromicin III0.01mg/L
组11：Oreochromicin III0.05mg/L
组12：Oreochromicin III0.1mg/L
组13：Oreochromicin III0.5mg/L
在15天的肽施用后，我们通过浸浴施用LD50的嗜水气单胞菌来进行攻击测试，在10天的过程中记录死亡率。如先前所述计算RPS。在攻击后第10天，所有3种肽都显示剂量依赖性和76%至89%的RPS（相较于显示18%的存活率的仅接受PBS的组）。
作为饲料添加剂的口服施用
进行测试以测定作为饲料添加剂口服施用的每一种肽对利用嗜水气单胞菌攻击后鱼的存活的作用。我们使用130条体重约10g的罗非鱼(O.niloticus)，将其随机分配在13个实验组中，每组10只动物。以50、250、500和750μg/kg的饲料的浓度施用每一种肽，进行30天。实验组为：
组1：PBS
组2：Oreochromicin I50μg/Kg
组3：Oreochromicin I250μg/Kg
组4：Oreochromicin I500μg/Kg
组5：Oreochromicin I750μg/Kg
组6：Oreochromicina II50μg/Kg
组7：Oreochromicina II250μg/Kg
组8：Oreochromicina II500μg/Kg
组9：Oreochromicina II750μg/Kg
组10：Oreochromicina III50μg/Kg
组11：Oreochromicina III250μg/Kg。
组12：Oreochromicina III500μg/Kg。
组13：Oreochromicina III750μg/Kg。
在30天的肽施用后，我们通过腹膜内注射LD50的嗜水气单胞菌进行攻击测试，在10天的过程中记录死亡率。计算RPS。在攻击后第10天，所有3种肽都显示剂量依赖性作用和80%至95%的RPS（相较于显示13%的存活率的仅接受PBS的组）。
实施例5.小鼠对金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌感染的抗性的测定
我们研究了抗微生物肽Oreochromicin I和Oreochromicin II保护小鼠免受致死剂量的细菌金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌感染的能力。在该测定中使用了体重25g的4周龄雄性小鼠(ICR)。将细菌在37℃于大豆胰蛋白胨肉汤中生长8小时。
产生90至100%的死亡率所需的细菌的量通过在PBS中稀释培养物来制备。基于550nm处的吸光度估计活菌落的数目，通过接种物的涂板系列稀释进行验证。取决于测试的微生物和施用途径，我们使用4.5x106和1.4x109CFU/小鼠的剂量。
用每一个剂量感染15只小鼠，在感染后监控存活率7-10天。在第一测试中，在腹膜内施用细菌后立即通过腹膜内注射使小鼠接受0.5ml的PBS(阴性对照)或包含选择的抗微生物肽的PBS。在第二测试中，静脉内施用金黄色葡萄球菌。在细菌施用后立即使小鼠静脉内接受0.2ml的PBS或包含抗微生物肽的PBS。
结果：发现以0.5mg/kg的剂量腹膜内施用的肽Oreochromicin I和Oreochromicin II使由金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌造成的死亡率从对照组的90-100%下降至利用肽处理的组的5-29%。
对于利用金黄色葡萄球菌的静脉内感染和以2.5mg/kg的剂量进行的肽施用，死亡率从对照组的90-100%下降至利用肽处理的组的18-40%。
实施例6.抗微生物肽抗虹彩病毒感染的活性
将EPC细胞(鲤鱼上皮瘤细胞)在28℃,5%CO2和95%相对湿度下于包含10%胎牛血清、1mM丙酮酸盐、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640中进行温育。使用识别每一个肽的5'和3'末端序列的特异性引物通过PCR扩增本发明的抗微生物肽，将其插入pTargeT载体以产生质粒pTargeT-Oreochromicin I、pTargeT-Oreochromicin II和pTargeT-Oreochromicina III。
将EPC细胞生长至90%的汇合，使用lipofectamine2000，以1μg/mL的DNA浓度利用包含编码抗微生物肽的基因的载体和利用空载体pTargeT瞬时转染所述细胞。通过RT-PCR分析抗微生物肽在转染细胞中的表达。将PCR产物在2%的琼脂糖凝胶上显现，利用溴化乙锭进行染色。在转染后24小时，用PBS洗涤每一个孔3次，利用不同浓度的蛙虹彩病毒(RGV)进行处理。在感染后第48小时，收集每一个孔的上清液，将其冷冻和解冻3次。为了测定RGV滴度，对无血清培养基的上清液进行系列稀释，在EPC上滴定细胞。以一式三份测试每一个稀释度。数据表示为平均值±S.E。使用ANOVA和Dunnett's多重比较测试分析组间差异。
当用105、104、103和102TCID50/ml的RGV感染细胞时，在48小时的温育后在用空载体pTargeT感染的细胞中，相较于其余表达抗微生物肽的细胞，观察到显著的致细胞病变效应。表达抗微生物肽的细胞的病毒滴度显著低于用空载体转染的细胞的滴度(p<0.01)(图3)。
实施例7.抗微生物肽对LPS的中和
除了抗微生物活性和增强疾病抗性的可能性外，我们利用鲎变形细胞溶解物(LAL)测试研究了本发明的抗微生物肽中和LPS的能力。该测定检测未中和的游离LPS的存在。将不同浓度的肽与0.5EU/ml的LPS在37℃一起温育30min。将单独的LPS用作测定的阳性对照。随后，我们将100μL的混合物添加至等体积的LAL试剂中。使用仪器TubeReader ATi-321(Lab Kinetics,UK)测量浊度的动力学。如图4中显示的，本发明的抗微生物肽具有以剂量依赖性的方式中和LPS的能力。Oreochromicin I、Oreochromicin II和Oreochromicin III的EC50分别为1.23μM、1.41μM和2.99μM。
实施例8.抗微生物肽Oreochromicin I、Oreochromicin II和Oreochromicin III用作分子佐剂的用途
形成5个实验组，每组12条罗非鱼(O.niloticus)。用PBS、用福尔马林灭活的嗜水气单胞菌的细胞和用以1μg/鱼的剂量添加了每一种肽的、福尔马林灭活的嗜水气单胞菌的细胞腹膜内注射各自重量50g的罗非鱼。在第0和14天进行注射。在第0和21天从鱼的尾静脉抽取血液，将血清在-20℃贮存直至使用。
在96孔板中通过凝集测定来测定抗嗜水气单胞菌的凝集抗体的滴度。在PBS中进行血清样品的系列稀释(50μL)，将50μL用福尔马林灭活的嗜水气单胞菌细胞(4x109个细胞/ml)添加至每一个孔，充分混合。将板在室温温育过夜，随后检查凝集反应。凝集抗体的滴度表达为产生阳性凝集反应的最高血清稀释度的倒数。
抗嗜水气单胞菌的凝集抗体反应示于图5中。免疫后第3周平均凝集抗体的滴度的观察显示：利用与抗微生物肽共施用的灭活的细菌细胞注射的组的滴度优于利用单独的细菌(p<0.001)或利用PBS(p<0.0001)注射的组。此外，利用PBS注射的组与利用单独的细菌注射的组之间存在显著差异(p<0.001)。
实施例9.利用卵白蛋白(OVA)和抗微生物肽Oreochromicin I、Oreochromicin II和Oreochromicin III的共免疫对小鼠的体液和细胞免疫应答的作用
A)第一免疫方案
我们选择24只体重为20g的BALB/c小鼠，将其分入4个测试组，每组6只动物。在第0和7天，利用剂量为6μg的处于0.2mL PBS中的OVA腹膜内接种阴性对照组(PBS/OVA)。在第0和7天，利用剂量为6μg的OVA+0.5μg的肽(于0.2mL的PBS中)腹膜内接种利用肽(PBS/OVA+肽)处理的组。在免疫方案的第15天，从动物抽取血液，评估总的IgG滴度。
图6显示通过用与每一种肽共施用的OVA免疫小鼠而诱导的总的IgG滴度。组PBS/OVA+肽中的动物显示在统计上优于对照组的抗OVA的特异性总的IgG滴度。对于所有肽该行为得到维持。
B)第二免疫方案
选择64只6周龄的BALB/c雄性小组，将其分入8个实验组，每组8只小鼠。通过以0.1mL的体积腹膜内注射进行免疫原的施用。以等摩尔的量(0.238x1020个分子和2.38x1020个分子)施用抗微生物肽。实验组为：
组1：利用PBS免疫的小鼠。
组2：以5μg/动物的剂量用OVA免疫的小鼠。
组3：用OVA5μg/动物+Oreochromicin I(剂量为0.1μg/动物，相当于0.238x1020个分子/动物)免疫小鼠。
组4：用OVA5μg/动物+Oreochromicin I(剂量为1μg/动物，相当于2.38x1020个分子/动物)免疫小鼠。
组5：用OVA5μg/动物+Oreochromicin II(剂量为0.12μg/动物，相当于0.238x1020个分子/动物)免疫小鼠。
组6：用OVA5μg/动物+Oreochromicin II(剂量为1.2μg/动物，相当于2.38x1020个分子/动物)免疫小鼠。
组7：用OVA5μg/动物+Oreochromicin III(剂量为0.14μg/动物的，相当于0.238x1020个分子/动物)免疫小鼠。
组8：用OVA5μg/动物+Oreochromicin III(剂量为1.4μg/动物，相当于2.38x1020个分子/动物)免疫小鼠。
在第0和14天免疫动物，在第0、14和21天进行血液抽取。将动物的血清用于测定特异性抗体滴度(总的IgG，IgG1和IgG2a)。在从实验开始以来第59天，从小鼠提取脾来测定抗抗原OVA的细胞免疫应答。在无菌条件下提取脾，分离脾细胞，以2x106个细胞/mL的细胞浓度在96孔圆底板中接种2.5x105个细胞。用伴刀豆球蛋白A(5μg/ml)或OVA(10μg/mL)刺激细胞，在37℃,5%CO2温育4天。收集培养物上清液，将其用于通过ELISA分析白细胞介素-4和干扰素-γ的水平。
图7A和B显示通过用与肽Oreochromicin I、II和III共施用的OVA免疫小鼠诱导的总的IgG、IgG1和IgG2a的滴度。组PBS/OVA+Oreochromicin I(以1μg/动物的剂量)中的动物显示在统计上优于阴性对照组的针对OVA特异性总的IgG滴度(p<0.001)(图7A)。组PBS/OVA和PBS/OVA+Oreochromicin III(以1.4μg/动物的剂量)中的动物相较于阴性对照组也显示统计上显著的总的IgG滴度的差异(p<0.05)。同样地，观察到利用剂量为1μg/动物的PBS/OVA+Oreochromicin I免疫的组中的抗OVA的特异性IgG2a的滴度显著大于在第一次免疫后21天用单独的OVA免疫的组中观察到的所述滴度(p<0.05)(图7B)。
通过ELISA分析来自免疫的动物的利用OVA刺激的脾细胞的培养物上清液以测量IFN-γ和IL-4的浓度。如图8中所示，在用与肽Oreochromicin III共施用的OVA免疫的动物中以剂量依赖性的方式获得IFN-γ的最高水平。这些水平显著高于来自利用单独的OVA或PBS免疫的动物的脾细胞中获得的水平(p<0.001)。此外，利用与剂量为1.2μg/动物的肽Oreochromicin II共施用的OVA免疫的动物的IFN-γ分泌水平显著高于来自利用单独的OVA或PBS免疫的动物的脾细胞中获得的水平(p<0.05)(图8)。在所使用的实验条件下任一组中无IL-4分泌。
实施例10.抗原MY32和肽Oreochromicin I的共免疫对罗非鱼的体液免疫应答的作用
为了估量肽作为分子佐剂的能力，在罗非鱼中将先前已知的蛋白MY32(Carpio等人(2011)Vaccine29：2810-2820)用作疫苗抗原。
形成6个实验组，每组10条罗非鱼(O.niloticus)，平均体重45g。施用途径是腹膜内途径，以0.3mL的注射体积施用免疫原。实验组为：
组1：利用PBS免疫的鱼。
组2：以1μg/g的体重的剂量用蛋白MY32免疫的鱼。
组3：利用与剂量为10μg/鱼的肽Oreochromicin I共施用的剂量为1μg/g体重的蛋白MY32免疫鱼。
组4：利用全都以Montanide888为佐剂的与剂量为1μg/鱼的肽Oreochromicin I共施用的剂量为1μg/g体重的蛋白MY32免疫鱼。
组5：利用全都以Montanide888为佐剂的与剂量为10μg/鱼的肽Oreochromicin I共施用的剂量为1μg/g体重的蛋白MY32免疫鱼。
组6：利用以Montanide888为佐剂的剂量为1μg/g体重的蛋白MY32免疫鱼。
在第0和14天免疫动物，在第0、14、21和28天进行血液抽取。将动物的血清用于测定IgM特异性抗体滴度。
图9显示了通过用与肽Oreochromicin I共施用的MY32抗原免疫鱼诱导的IgM的滴度。组MY32+Oreochromicin I(剂量为10μg/动物的剂量，以Montanide888为佐剂)中的动物显示在统计上优于利用PBS、MY32以及与剂量为10μg/鱼的肽Oreochromicina I共施用的MY32免疫的组的抗MY32的特异性IgM滴度(p<0.05)(图9)。在其余实验组之间未观察到显著差异。
Figure IDA0000492207440000011
Figure IDA0000492207440000021

Claims (17)

1.氨基酸序列，其特征在于包含选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的氨基酸序列或与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3具有至少80%的同一性的氨基酸序列。
2.权利要求1的氨基酸序列，其通过从其天然来源分离，通过化学合成或通过重组DNA技术获得。
3.权利要求2的氨基酸序列，其通过在细菌、酵母或高等生物的细胞中表达获得。
4.核酸，其特征在于包含选自SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6的核酸序列。
5.核酸，其编码包含SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的序列或与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3具有至少80%的同一性的氨基酸序列的氨基酸序列。
6.用于控制病原体的组合物，其特征在于包含具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3的序列或与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3具有至少80%的同一性的氨基酸序列的肽。
7.权利要求6的组合物，其中所述肽通过从其天然来源分离，通过化学合成或通过重组DNA技术获得。
8.权利要求6的组合物，其用于控制影响哺乳动物和水生生物的细菌、病毒和真菌病原体，并且被预防性或治疗性地施用。
9.权利要求6的组合物，其通过口服途径、胃肠外途径或通过浸浴来进行施用。
10.肽用于制造用于控制病原体的组合物的用途，所述肽包含选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的氨基酸序列或与SEQID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3具有至少80%的同一性的氨基酸序列。
11.用于控制活生物体中的病原体的方法，其特征在于给所述生物体施用有效量的肽，所述肽包含选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的氨基酸序列或与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ IDNo.3具有至少80%的同一性的氨基酸序列。
12.权利要求11的方法，其中所述肽被预防性或治疗性地施用。
13.权利要求11的方法，其中给哺乳动物和水生生物施用所述肽。
14.权利要求13的方法，其中给鱼施用所述肽，优选通过以0.1至10μg的肽/鱼的浓度定期注射，通过以0.01至0.1mg的肽/升水的浓度浸浴，或以约50-750μg的肽/kg饲料的浓度作为饲料添加剂来施用。
15.包含作为分子佐剂的肽和疫苗抗原的疫苗组合物，所述肽包含选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的氨基酸序列或与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3具有至少80%的同一性的氨基酸序列。
16.权利要求15的疫苗组合物，其中在相同的免疫方案过程中同时、分开地或相继地施用用作疫苗佐剂的肽和抗原。
17.用于增强抗疫苗抗原的免疫应答的方法，其持征在于使用肽作为疫苗的分子佐剂，所述肽包含选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的氨基酸序列或与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ IDNo.3具有至少80%的同一性的氨基酸序列。
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