KR20140070597A

KR20140070597A - 병원균을 조절하기 위한 아미노산 서열

Info

Publication number: KR20140070597A
Application number: KR1020147009805A
Authority: KR
Inventors: 자넬 아코스타 알바; 마리오 파블로 에스트라다 가르시아
Original assignee: 센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테크놀로지아
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2012-10-01
Publication date: 2014-06-10
Also published as: EP2767290B1; RU2014117659A; US20140294871A1; CA2849040C; CA2849040A1; AU2012315083B2; BR112014007491A2; EP2767290A1; AU2012315083A1; ZA201402171B; CN103874502B; CU20110181A7; CN103874502A; WO2013044890A1; ES2600903T3; CL2014000760A1; KR101986358B1; MX348934B; JP6034385B2; BR112014007491B1

Abstract

본 발명은 틸라피아 (Oreochromis niloticus) 아가미 추출물로부터 분리 및 정제된 항미생물성 펩타이드에 관한 것이다. 상기 펩타이드는 화학적 합성 또는 박테리아 및 효모와 같은 이종 시스템 중에서의 발현, 또는 통상적인 분자 생물 공학에 의해서 제조될 수 있다. 이러한 펩타이드들은, 그램 양상 박테리아, 그램 음성 박테리아, 균류 및 바이러스를 포함하는 다양한 생물체들에 대해서 항미생물성 활성을 나타낸다. 본 발명은 또한 이러한 항미생물성 펩타이드들을 포함하는, 병원균 조절용 조성물을 포함한다. 상기 펩타이드들을 분자 아쥬반트로서 백신 제제 중에서 사용하는 것 또한 본 발명의 일부분이다.

Description

병원균을 조절하기 위한 아미노산 서열 {Amino acid sequences for controlling pathogens}

본 발명은 생명공학 분야에 관한 것으로서, 구체적으로는 병원균을 조절하기 위한 항미생물 펩타이드 및 그 용도에 관한 것이다. 항미생물 펩타이드가 가해지면, 이들은 효과적으로 병원균에 의해서 야기되는 질병들을 조절하게 된다. 더 나아가, 이러한 펩타이드는 백신들에 포함된 다양한 항원들에 의해서 야기되는 면역 반응을 강화하는데 기여한다.

어류는 강력한 타고난 면역 체계를 가지며, 이는 다양한 병원균들에 대해서 1차 방어기작으로 작용하지만 (Subramanian et al. (2008) Fish and Shellfish Immunol. 25:625-632), 후천적 면역 체계는 잘 발달되어 있지 않다 (Magnadottir, (2010) Mar Biotechnol.12:361-79). 어류가 병원균과 싸우는 한 가지 방법은 타고난 면역 메커니즘으로서 항미생물 펩타이드 (antimicrobial peptides, AMP)를 분비하는 것이다. AMP는 타고난 면역 체계에서 근원적인 역할을 수행하며, 감염을 야기하는 다양한 박테리아, 균류, 바이러스 및 다른 병원균들로부터 보호한다 (Solomon, (2008) Lancet Neurol. 7:116-118). 일반적으로, AMP는 타액, 점액, 순환계 및 병원균의 표적이 되는 다른 영역들에서 분비된다 (Noga et al. (2010) Comp Biochem Physiol D: Genom Proteom. 6:44-54).

AMP는 그 아미노산 조성 및 구조에 기초하여 5가지 카테고리로 분류된다. 이러한 카테고리들에는, 음이온성 펩타이드, α-나선 양친매성 구조를 갖는 선형 펩타이드, 특정 아미노산들이 풍부한 양이온성 펩타이드, 펩타이드 단편 및 분자내 결합을 형성하는 시스테인 잔기들을 갖는 펩타이드 (Brogden (2005) Nat Rev Microbiol. 3:238-50; Boman (2000) Immunol Rev.173:5-16)가 있다. 음이온성 펩타이드는 밀리몰 농도로 생산되며, 아연을 보조인자로 필요로 하고, 그램-양성 박테리아 및 그램-음성 박테리아에 대해서 항미생물 활성을 나타낸다. 양친매성 α-나선 구조를 갖는 선형 및 양이온성 펩타이드는 40개 미만의 아미노산들을 갖고, 중간 부분에 힌지 (hinge) 영역을 보유한 3차원 구조를 갖는다. 용액 내에서 그 구조는 불규칙적이지만, 막과 접촉할 때에는 2차 α-나선 구조를 갖는다 (Brogden (2005) Nat Rev Microbiol. 3:238-50). 특정 아미노산들이 풍부한 선형 양이온성 펩타이드들로 구성되는 다른 그룹은, 시스테인 잔기를 갖지 않으며, 따라서 용액 내에서 매우 유연한 구조를 갖는다 (Brogden (2005) Nat Rev Microbiol. 3:238-50). 네 번째 그룹은 대전된 펩타이드를 포함하며, 이는 더 큰 단백질들로부터의 단편들이다. 이러한 펩타이드들은 다른 펩타이드 그룹들과 유사한 항미생물 활성 및 구조를 갖는다 (Bellamy et al. (1992) J Appl Bacteriol. 73:472-9; Zanetti et al. (1995) FEBS Lett. 374:1-5). 다섯 번째 펩타이드 그룹은 대략 380개 멤버들로 구성되며, 이는 6개의 보존된 시스테인 잔기들을 포함하고, 이는 내부 결합들 및 β 시트 구조를 형성한다 (Brogden (2005) Nat Rev Microbiol. 3:238-50). 이러한 그룹은 디펜신 (defensins) 및 헵시딘 (hepcidin)을 포함한다 (Boman et al. (2000) Immunol Rev. 173:5-16).

AMP가 통상 구조적 특징들에 있어서의 다양성에 의해서 분류되지만, 이러한 펩타이드들 대부분에 공통되는 일부 특징들이 존재한다. 예를 들어, 그들은 일반적으로 60개 미만의 아미노산을 보유하며, 생리적 조건 하에서 넓은 범위의 항미생물 활성을 가지고, 양전하를 갖는다 (Zasloff (2002) Nature 415:389-395). 대부분의 양친매성 AMP들은, 박테리아 및 외피 바이러스와 같은 병원균들의 지질 세포막과의 상호작용에 기초하여, 이러한 펩타이드들의 활성 메카니즘에 기여하는 구조를 채택하고 있다 (Shai (2002) Biopolymers 66: 236-48; Jelinek and Kolusheva (2005) Curr. Protein Pept. Sci. 6: 103-14). 이러한 상호작용은 병원균 지질막의 신속한 불안정화/투과를 야기한다. 몇몇 보고들은, 구멍 형성 메카니즘과는 별도로, AMP들은 세포벽, 핵산 및 단백질의 합성을 억제할 뿐만 아니라, 심지어 효소 활성을 억제할 수도 있는 것으로 제안하고 있다 (Brogden et al. (2005) Nat. Immunol. 6: 558-64; Campagna et al. (2007) Biochemistry 46: 1771-8).

미생물들이 항생제에 대한 내성을 개발할 수 있는 능력과, 병원균들에 의해서 야기되는 질병들의 존재로 인해서, 적당한 치료법이 존재하지 않으며, 항미생물 활성을 갖는 새로운 분자들을 탐색할 필요성이 있다.

따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 중요한 과제는, 넓은 범위의 병원균들을 효과적으로 조절할 수 있고, 또한 타고난 면역성 및 적응성 면역성에 영향을 주는, 새로운 항미생물성 제품, 특히 단백질 및/또는 펩타이드를 개발하는 것으로서, 이는 인간 의약 및 수중양식을 포함하는 수의 의약에서 매우 중요한 사항이다.

본 발명은, 박테리아, 바이러스 또는 균류에 의해서 야기되는 감염들을 포함하는, 병원균들에 의해서 야기되는 감염들의 조절 및 치료를 위한 새로운 대안을 제공함으로써 전술한 문제점을 해결하고자 한다. 본 발명에서는, 최초로, 서열번호 1, 2 및 3으로 명명되는 항미생물 펩타이드들을 보고한다. 본 발명은 또한, 그 아미노산 서열 중에 서열번호 1, 2 및 3으로 명명되는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열, 또는 서열번호 1, 2 또는 3과 적어도 80%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 제공하는 것을 목적으로 한다.

3가지 펩타이드들은 틸라피아 (Oreochromis niloticus) 아가미 단백질 추출물로부터 분리 및 서열화하였으며, 이들은 Oreochromicin I, Oreochromicin II 및 Oreochromicin III로 명명하였다. 상기 3가지 펩타이드들은 문헌에 보고된 바가 없으며, 본 발명에서 서열번호 1, 2 및 3으로 명명하였다. 이러한 펩타이드들은 그램-양성 박테리아, 그램-음성 박테리아, 바이러스 및 균류에 대해서 항미생물 활성을 보유한다. 본 발명의 펩타이드들은 그 천연 공급원으로부터 분리함으로써 얻어질 수 있다. 그 밖에, 상기 펩타이드들은 화학적 합성 또는 재조합 데옥시리보뉴클레익산 (DNA) 기술에 의해서 얻어질 수도 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 항미생물성 펩타이드들은 박테리아, 효모 또는 고등생물의 세포들에서 재조합 발현시킴으로써 얻어진다. 이러한 항미생물성 펩타이드들은 다른 숙주 시스템들에서 발현되어 그들로부터 분리될 수 있다. 특정 구현예에서, 재조합 DNA 기술에 의한 발현은 Pichia pastoris에서, 바람직하게는 배양 상등액에서 수행된다. 본 발명에 따른 항미생물성 펩타이드들은 박테리아에서 발현될 수도 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 재조합 DNA 기술에 의한 발현은 Escherichia coli에서 수행된다. 본 발명에 따른 펩타이드들은 크로마토그래피 기술, 세척 펠렛 등과 같은 숙주로부터의 단백질 분리 기술에 의해서 얻어질 수도 있는 바, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자에게 널리 알려져 있다.

항미생물성 펩타이드들의 사용은 다른 항미생물성 제제와 비교할 때, 장점들을 제공하는데, 이는 이러한 펩타이드들이 작은 크기 (~5 kDa)를 갖기 때문에, 침지에 의해서 가해지는 경우에 수중 생물들의 피부 및 점막을 통해서 더욱 잘 흡수되는데, 이러한 흡수 경로는 수중양식의 경우 비용면에서 유리하며, 오염 수준이 낮다는 장점을 갖는다. 또 다른 장점은 항미생물성 펩타이드들이 타고난 면역 활성 및 후천적 면역 활성을 자극하고, 병원성 물질들에 의한 감염에 대해서 내성을 증가시킨다는 점이다.

각 펩타이드의 아미노산 서열을 고려하여, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해서 각 성숙 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 증폭하기 위해서, 축퇴 올리고펩타이드 (degenerated oligonucleotides)를 디자인하였다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 4, 5 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1, 2 및 3의 아미노산 서열들, 또는 서열번호 1, 2 또는 3의 펩타이드들과 적어도 80%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드들을 암호화하는 핵산을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 서열번호 1, 2 및 3의 펩타이드들, 또는 서열번호 1, 2 또는 3의 펩타이드들과 적어도 80%의 상동성을 갖는 펩타이드들을 포함하는 병원균을 조절하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 서열을 갖는 항미생물성 펩타이드들 (및 이들을 포함하는 조성물들)은 다양한 종류의 병원균들을 조절하는데 사용될 수 있는 바, 예를 들어 박테리아성 병원균들 (이에 제한되는 것은 아니지만, 아에로모나스 (Aeromonas), 수도모나스 (Pseudomonas), 코리네박테리아 (Corynebacteria), 엔테로박테리아 (Enterobacteria), 헤모필루스 (Haemophilus), 마이코박테리아 (Mycobacteria), 노카디아 (Nocardia), 믹소박테리아 (Myxobacteria), 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 및 비브리오 (Vibrio)); 바이러스성 병원균들 (감염성 조혈 괴사 바이러스 (infectious hematopoietic necrosis virus), 감염성 췌장 괴사 바이러스 (infectious pancreatic necrosis virus), 출혈성 패혈증 바이러스 (hemorrhagic septicemia virus), 이리도바이러스 (iridovirus), 잉어 출혈성 바이러스 (carp hemorrhagic virus), 잉어 바이러스의 봄 바이러스혈증 (spring viremia), 히라메 랍도바이러스 (Hirame rhabdovirus) 또는 스네이크헤드 랍도바이러스 (Snakehead rhabdovirus), 임파낭종 바이러스 (lymphocystis virus), 감염성 연어 빈혈 (infectious salmon anemia)), 균류 및 난균류 (이에 제한되는 것은 아니지만, 사프로레그니아 (Saprolegnia), 아클리아 (Achlya), 이치티오스포리듐 호페리 (Ychthyosporidium hoferi))를 조절하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 펩타이드 Oreochromicin I, Oreochromicin II 및 Oreochromicin III, 또한 이들과 적어도 80%의 서열 상동성을 갖는 펩타이드들은, 조성물로 제제화되며, 이는 포유류 및 수중 생물들을 포함하는 다양한 생물들에서 병원균을 조절하는데 사용된다. 상기 조성물들은 병원균 조절에 있어서, 예방적으로, 또한 치료적으로 투입된다. 투여 경로는 인체에서 약물을 투여하는데 사용되는 모든 경로들이 포함되며, 동물들의 경우 약물 또는 첨가제를 투여하는데 사용되는 모든 경로들이 포함되고, 이들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려져 있다. 일 구현예에서, 병원균의 조절을 위한 본 발명에 따른 조성물은 경구, 비경구 또는 침지 중탕 (immersion baths)에 의해서 투여된다.

본 발명의 또 다른 태양은, 서열번호 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 1, 2 또는 3과 적어도 80%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의, 병원균의 조절을 위한 조성물을 제조하는 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 태양은, 몇몇 생물들을 공격하는 병원균을 조절하기 위한 방법으로서, 상기 생물들에 서열번호 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 1, 2 또는 3과 적어도 80%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따른 펩타이드는 0.1 내지 10 ㎍/어류의 농도로, 주기적 주사에 의해서 어류에 적용되거나; 물 1 리터 당 0.01 내지 0.1 mg의 펩타이드 농도로, 신선수 또는 해수 중에서 1-15일 (연속적 또는 격일)의 간격으로 침지 중탕에 의해서 적용된다. 또한, 상기 펩타이드는, 대략 사료 1 kg 당 50-750 ㎍ 펩타이드의 농도로, 어류용 사료 첨가제로서 적용될 수도 있다. 모든 경우에서, 특히 바이러스, 박테리아 또는 균류와 같은 병원균들에 의해서 야기되는 질병들에 대한 내성이 현저하게 증가되었다.

부가적으로, 본 발명은 백신용 분자 아쥬반트 (adjuvants)로서 유용한 펩타이드를 제공한다. 본 발명에서, "분자 아쥬반트"라는 용어는 백신 항원에 대한 면역 반응을 조절하고, 면역 반응의 증가를 야기할 수 있는 능력을 갖는 단백질성 분자를 의미한다.

따라서, 본 발명은 또한, 분자 아쥬반트로서, 서열번호 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 1, 2 또는 3과 적어도 80%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와, 백신 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 태양은 백신 중 분자 아쥬반트로서, 서열번호 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 1, 2 또는 3과 적어도 80%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 이용하여 백신 항원에 대한 면역 반응을 증가시키기 위한 방법을 제공한다.

도 1은 항미생물성 펩타이드를 E. coli (도 1A) 및 효모 P. pastoris (도 1B)에 대한 발현 벡터들 내로 클로닝하기 위한 전략을 도시한 도면이다.
도 2는 P. pastoris 배양 상등액으로부터 (도 2A), 또한 E. coli 파괴 상등액으로부터 (도 2B) 항미생물성 펩타이드들을 정제하는 도면이다. 레인 1: Oreochromicin I; 레인 2: Oreochromicin II, 레인 3: Oreochromicin III.
도 3은 항미생물성 펩타이드들인 Oreochromicin I, Oreochromicin II 및 Oreochromicin III의 항미생물 활성을 나타낸 그래프이다. 24-웰 플레이트 중에 접종된 혈관내피전구세포 (epithelioma papulosum cyprini, EPC)들을 24시간 동안, 1 ㎍의 pTargeT-Oreochromicin I, pTargeT-Oreochromicin II, pTargeT-Oreochromicin III, 또는 대조군으로서 pTargeT로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션시킨지 24시간이 경과한 후, 다양한 농도의 라나 그릴리오 바이러스 (Rana grylio virus, RGV) (10⁵의 바이러스의 감염성 투여량 50% (TCID50)/ ml, 10⁴ TCID50/ml, 10³ TCID50/ml 및 10² TCID50/ml)를 첨가하였으며, 48시간 후에 배양 상등액을 수집하여 바이러스 역가를 결정하였다.
도 4는 지질다당류 (lipopolysaccharide, LPS)에 결합한 항미생물성 펩타이드 Oreochromicin I, Oreochromicin II, Oreochromicin III의 포화 곡선을 도시한 것이다. 펩타이드 ((Oreochromicina I, Oreochromicina II 및 Oreochromicina III)의 50% 결합을 야기하는 농도 (EC50)는 각각 1.23 μM, 1.41 μM 및 2.99 μM이었다.
도 5는 틸라피아 (n=12)에서 Aeromonas hydrophila에 대한 항체 역가를 도시한 것이다. 수치는 평균 ± 표준편차 (SE)를 나타낸다.
도 6은 OVA와 함께 펩타이드 Oreochromicin I, Oreochromicin II 및 Oreochromicin III를 투여한 면역화에 의해서 마우스에서 유도된 토탈 면역글로불린 G (IgG)의 역가를 나타낸 것이다. 그룹 당 6 마리 동물들로 구성된 4개의 실험군들을 구축하였다. 음대조군 (인산 완충 식염수 (PBS)/OVA)을, 0일째 및 7일째에, 0.2 mL PBS 중 6 ㎍의 OVA 투여량으로, 복강내 접종하였다. 펩타이드도 투여된 군들 (PBS/OVA+펩타이드)는, 0일째 및 7일째에, 0.2 mL PBS 중 6 ㎍의 OVA + O.5 ㎍의 각 펩타이드의 투여량으로, 복강내 접종하였다. 서로 다른 글자는 통계적으로 유의미한 차이들을 나타낸다. 수치는 평균 ± 표준편차 (SE)를 나타낸다 (n = 6).
도 7은 OVA와 함께 펩타이드 Oreochromicin I, Oreochromicin II 및 Oreochromicin III를 투여한 면역화에 의해서 마우스에서 유도된 토탈 면역글로불린 G (IgG) (A), IgG1 및 IgG2a (B)의 역가들을 나타낸다. 수컷 Balb/c 마우스 (8/그룹)들을, 0일째 및 14일째에 OVA 단독 (5 ㎍/동물), 또는 0.238 × 10²⁰ 분자/동물 (각각 Oreochromicina I, II 및 III에 대해서 0.1, 0.12 및 0.14 ㎍/동물에 해당) 및 2.38 × 10²⁰ 분자/동물 (각각 Oreochromicina I, II 및 III에 대해서 1, 1.2 및 1.4 ㎍/동물에 해당)의 투여량의 펩타이드들과 조합하여, 복강내 주사에 의해서 면역화시켰다. 음대조군은 0.1 mL의 PBS로 주사하였다. OVA-특이적 체액성 면역 반응 (토탈 IgG)을 첫 번째 면역화 이후 14 및 21일째에 테스트하였다. IgG1 및 IgG2a 항체 역가들을 첫 번째 면역화 이후 21일째에 분석하였다. OVA-특이적 항체 역가들은 ELISA에 의해서 결정하였다. (A) 토탈 IgG 역가. 막대들은 IgG 역가 ± 표준 오차 (n=8)를 나타낸다. 통계적 분석은 Kruskal-Wallis 테스트 및 Dunn 다중 비교 테스트를 사용하여 수행하였다. 별표는 PBS군과 유의미한 차이들을 나타낸다 (*는 p<0.05를, ***는 p<0.001를 나타낸다). (B) IgG1 및 IgG2a 역가들. 막대들은 항체 역가 ± 표준 오차 (n=8)를 나타낸다. 통계적 분석은 Mann Whitney 테스트를 사용하여 수행하였다 (*는 p<0.05를 나타낸다).
도 8은 면역화된 동물들로부터 분리된 비장 세포들에 의한 IFN-γ 분비를 나타낸다. Y축은 OVA (10 ㎍/ml)로 자극된 비장세포들의 배양 상등액 중 IFN-γ의 농도를 나타낸다. 막대들은 IFN-γ의 농도 ± 표준 편차 (n=5)를 나타낸다. 데이터의 통계적 분석은 ANOVA 테스트 및 Bonferroni's 다중 비교 테스트를 사용하여 수행하였다 (*: p<0.05, ***: p<0.001).
도 9는 항미생물성 펩타이드 Oreochromicin I과 함께 MY32 단백질이 투여된 틸라필라 (O. niloticus)의 면역화에 의해서 유도된 IgM 역가들을 나타낸다. 어류 (10 어류/그룹)들은 0일째 및 14일째에 복강내 주사에 의해서 면역화하였다. 음대조군에는 0.3 mL의 PBS를 주사하였다. MY32에 특이적인 체액성 면역 반응을, 첫 번째 면역화 이후, 14, 21 및 28일째에 분석하였다. MY32에 특이적인 IgM 항체 역가는 ELISA에 의해서 결정하였다. 막대들은 IgM 역가 ± 표준 오차를 나타낸다 (n=10). 데이터의 통계적 분석은 ANOVA 및 Newman-Keuls 다중 비교 테스트를 사용하여 수행하였다 (*는 p<0.05를 나타낸다).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 한다.

실시예

실시예 1. 틸라피아 아가미 추출물로부터 항미생물성 펩타이드들의 분리 및 정제

틸라피아 (Oreochromis niloticus) 아가미 필라멘트들을 액체 질소 중에서 불리고, 결과물인 분말을 100℃에서 10분 동안 가열한 다음 냉각시켰다. 단백질들의 추출은, 150 mL의 HCl 2M, 포름산 10% (v/v), NaCl 2% (w/v) 및 트리클로로아세트산 1% (v/v) 용액을 첨가한 다음, 1-2분 동안 균질화함으로써 수행하였다. 파쇄액 (homogenate)을 20 000 × g로 30분 동안 원심분리한 다음, 상등액을 pH 4.0으로 맞추고 여과하였다. 결과 여과물을 산 추출물로 사용하였으며, Sep-Pak C18 컬럼 (Waters, Milford, MA, USA)에 가하였다. 트리플루오로아세트산 0.1% (v/v)으로 세척한 다음, 펩타이드들에 해당되는 분획을 80% 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로아세트산에서 용출하였다. 용출액을 건조시키고, 아세트산 1M에 용해시킨 다음, SP-Sephadex C-25의 매트릭스에 흡착시켰다. 아세트산 1M, 피리딘 2M 및 피리딘 2M/아세트산 (pH 5.0)로 연속적으로 용출시킴으로써 5개의 분획들을 수득하였다. 각각의 분획들에 대해서 항미생물 활성을 측정하였으며, 분획 2에 대해서 후속 정제 단계들을 수행하였다.

선택된 분획을 동결건조시키고, 트리플루오로아세트산 0.1%를 함유한 아세토니트릴 40% 중에 용해시켰다. 용액의 분취량을 TSKgel G2000SW 컬럼 (겔 여과, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC))에 가하고, 트리플루오로아세트산 0.1%를 함유하는 아세토니트릴 40%로 용출시켰다. 동일한 분획을 반복적으로 컬럼 내로 주사하고, 분자량이 5 kDa 미만이면서 항미생물 활성을 나타내는 결과물 분획을 동결건조시킨 다음, 역상 크로마토그래피 (RP-HPLC) 및 질량 스펙트로메트리 (ESI-MS)를. 수행하였다. 이러한 분획의 분자량을, 트리신-소듐 도데실 설페이트 (16.5% T/3% C) 상에서, 겔 전기영동 (약어로 트리신-SDS-PAGE라 함)에 의해서 측정하였다.

HPLC에 의한 단백질의 분리는 Hewlett-Packard HP1100 시스템 상에서 수행하였다. 용매 A는 트리플루오로아세트산 0.1%를 함유하는 아세토니트릴 5%였으며, 용매 B는 트리플루오로 아세트산 0.085%를 함유하는 아세토니트릴 80%였다. 분획 A는 용매 A로 재구성하였으며, C8-3 컬럼 (4.6×150 mm) 상에서 RP-HPLC를 수행하였다. 농도구배는 0-2 분 0% 용매 B, 2-5 분 0-20% 용매 B, 5-55 분 20-47% 용매 B, 및 55-80 분 47-100% 용매 B였다. 항미생물 활성을 나타내는 결과물 분획들을 동결건조시키고, 아세토니트릴 25%를 함유하는 KH₂PO₄/H₃PO₄ 5mM (pH 3.0) 중에서 재구성하였으며, 폴리설포에틸 아스파타마이드 (PolySulfoethyl Aspartamide) 컬럼 (4.6 × 200 mm) 상으로 로딩하였다.

분획들을 선형 농도구배 KCl로 용출시켰다. 가장 큰 항미생물 활성을 나타내는 분획들의 분자량은 2527.3, 2981.9 및 3654.6 Da이었다. 이러한 펩타이드들은 각각 Oreochromicin I, II 및 III로 명명되었다. 항미생물 활성을 나타내는 각 펩타이드의 아미노산 서열들을 결정하였으며, 이하 각각 서열번호 1, 2 및 3으로 명명한다. 더 나아가, BlastX 프로그램을 사용하여 서열분석을 수행하였으며, 이러한 펩타이드들이 기존에 보고된 바가 없다는 점을 밝혔다.

실시예 2. E. coli 세포 내에서 및 효모 P. pastoris 세포 외에서 항미생물성 펩타이드 발현을 위한 벡터의 구축

틸라필라 (O. niloticus)의 아가미로부터 분리된 리보핵산 (RNA)로부터 역전사 반응에 의해서 상보적 DNA (cDNA)를 수득하였다. 반응은 "Reverse Transcription System" (Promega, USA) 키트에 서술된 사용방법에 따라서 수행하였다. 요약하면, 4 ㎍의 전장 RNA를 핵산가수분해효소 (nuclease)가 존재하지 않는 원심분리 튜브 내에 넣고, 70℃에서 10분 동안 배양하였다. 이후, 나머지 반응 성분들을 첨가하였다 (4 μL의 25 mM MgCl₂, 2 μL의 10mM 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 혼합물 (dNTPs), 2 μL의 역전사 10× 완충용액, 0.5 μL의 리보핵산가수분해효소 저해제, 1 μL의 올리고 (dT) 500 ㎍/mL, 20 유닛의 역전사 효소 및 사전에 디에틸 파이로카르보네이트로 최종 부피 20 μL로 처리된 물). 반응물은 42℃에서 15분 동안 배양하였으며, 95℃에서 5분 동안 중지하였다.

항미생물성 펩타이드들의 성숙 영역을 암호화하는 핵산 서열들을, 수득된 cDNA들로부터, PCR에 의해서, 각 펩타이드의 아미노산 서열로부터 디자인된 축퇴 합성 올리고펩타이드들을 사용하여 증폭하였다. 모든 경우에서, 기대되는 크기의 DNA 밴드를 얻었다. 밴드들을 아가로오즈 겔로부터 정제하였으며, 서열분석을 위해서 상업용 벡터 pGEM-TEasy (Promega) 내로 삽입하였다. 펩타이드들을 암호화하는 DNA 서열들을 서열번호 No. 4, 5 및 6으로 명명하였다.

항미생물성 펩타이드들을 암호화하는 DNA 서열들을 E. coli 발현 벡터 pAR 3040 내로, 제한 부위 NdeI/BamHI를 사용하여 삽입하였다 (도 1A). 각 펩타이드들에 해당되는 밴드를 증폭하기 위해서, 각각의 5' 말단 및 3' 말단 특이적 서열들을 인식하고, 발현 벡터 내로의 클로닝을 용이하게 하는 제한효소 인식 부위들을 갖는 올리고뉴클레오티드들을 사용하였다. 각각의 펩타이드에 대해서, E. coli BL21DE3 균주를 형질전환시키고, 유도원 (inductor)로서 이소프로필-β-D-1-티오갈락토파이라노사이드 (isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG) 1 mM을 사용하여 T7 프로모터의 조절 하에서 유전자 발현을 유도하기 위해서, 재조합 클론들 중의 하나를 선택하였다. 유전자 발현은 37℃에서 6시간 동안 수행하였다. 재조합 펩타이드들의 발현은 Tricine-SDS-PAGE 및 ESI-MS에 의해서 체크하였다.

pPS9 및 pPS10 벡터들 및 각 펩타이드의 5' 및 3' 서열들을 인식하고 제한효소들의 제한 부위들을 갖는 특이적 올리고펩타이드를 사용하여 P. pastoris에서의 항미생물성 펩타이드 발현 벡터를 구축하였다. pPS9 벡터에서의 클로닝을 위해서는, NcoI 및 SpeI 부위들을 사용하였으며, pPS10 벡터 내로의 클로닝을 위해서는, NaeI 및 SpeI 부위들을 사용하였다. 이러한 클로닝 전략들은 관심이 되는 단백질로 아미노산들을 첨가하지 않는다 (도 1 B).

P. pastoris MP36 균주를 형질전환시키기 전에 플라스미드들을 선형화하였다. 형질전환은 전기영동에 의해서 수행하였다. MP36 균주는 his3 영양요구성 변이주 (uxotrophic mutant)로서, 형질전환 이후에 His+ 표현형을 획득하였다.

형질전환된 클론들은 Dot Blot에 의해서 확인하였다. 서던 블랏 기술 (Southern Blot technique)을 사용하여, 이러한 클론들 중에서, P. pastoris 유전자 AOX1이 재조합 플라스미드의 발현 카세트에 의한 치환에 의해서 발생된 통합을 확인하였으며, 이러한 발현 카세트는 Mut^s 표현형 (메탄올의 낮은 사용) 및 His+에 해당되는 것이다. 효모 P. pastoris는 낮은 수준의 자가 단백질들을 분비하며, 그 배양 배지는 단백질 보충을 필요로 하지 않으므로, 세포외 배지로 분비되는 이종 단백질을 기대할 수 있으며, 이는 배지 중 전체 단백질의 대부분을 구성한다 (80% 이상) (Tschopp et al. (1987) Bio/Technology 5:1305-1308).

P. pastoris에서의 펩타이드 발현은 메탄올을 배양 배지에 가함으로써 5 리터 중에서 수행되었다. 재조합 펩타이드들의 발현 및 그 일체성은 Tricine-SDS-PAGE 및 ESI-MS에 의해서 체크하였다.

실시예 3. 항미생물성 펩타이드들의 정제 및 생물학적 활성 분석

재조합으로 얻어진 항미생물성 펩타이드들을 E. coli 파쇄 상등액 또는 P. pastoris 배양 상등액으로부터 정제하였다. 먼저, 기공 크기가 1 kDa인 막을 사용하여, 소듐 아세테이트 25 mM (pH 4.5) 중에서 투석을 수행하였다. 투석 산물을 소듐 아세테이트 25 mM (pH 4.5)로 평형화된 양이온 교환 CM-Sepharose Fast Flow 레진에 가한 다음, 단백질을 소듐 클로라이드 1M, Tris 50 mM (pH 7.6)로 용출하였다. 펩타이드들을 함유하는 분획들을, 기공 크기가 1 kDa인 막을 사용한 한외여과 시스템을 사용하여 수집 및 농축하였다. 검출을 위해서는, 254 nm의 파장을 사용하였다. 정제는 Tricine-SDS-PAGE에 의해서 체크하였으며, 단백질들은 Coomassie Blue 염색을 통해서 가시화하였다 (도 2).

본 발명에 따른 펩타이드는 또한 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자에게 공지된 방법들을 사용하여 화학적 합성에 의해서도 제조하였다. 펩타이드들의 항미생물 활성은 마이크로희석 (microdilution) 방법에 의해서 측정하였다. 최소 저해 농도 (minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정하기 위해서, 각각의 펩타이드를 연속적으로 1:2로 희석하였다. 각각의 희석된 펩타이드 10 밀리리터를 Mueller Hinton 브로스 (박테리아) 또는 Sabouraund 브로스 (균류) 중에서 90 mL의 박테리아 또는 효모 현탁액 (mL 당 5x10⁵ CFU (colony forming units))과 함께 배양하고, 28℃ (어류 병원균 및 균류) 또는 37℃ (포유류 병원균)에서 18 시간 동안 배양하였다. MIC는 박테리아 성장 저해가 발생되는 최저 펩타이드 농도로 정의된다. 모든 분석들은 3중으로 수행하였으며, 배양 배지 (미생물 없음) 및 펩타이드가 첨가되지 않은 미생물을 대조군으로 사용하였다. 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

펩타이드 Oreochromicin I, Oreochromicin II 및 Oreochromicin III의 항미생물 활성

	Oreochromicin I	Oreochromicin II	Oreochromicin III
Staphylococcus aureus (그램 +)	MIC = 5 μM IC50* = 2.8	MIC = 5 μM IC50 = 2.02	저해 없음
Bacillus subtilis (그램 +)	MIC= 3 μM IC50 = 1.37	MIC = 1.7 μM IC50 = 0.5894	MIC = 106 μM IC50 = 19.22
Pseudomonas aeuroginosa (그램 -)	MIC = 35 μM IC50 = 29.36	MIC = 6.67 μM IC50 = 3.75	저해 없음
E. coli (그램 -)	MIC = 6.7 μM IC50 = 2.963	MIC = 5 μM IC50 = 2.289	저해 없음
A. hydrophila (그램 -)	저해 없음	MIC = 160 μM IC50 = 30.41	저해 없음
Edwardsiella tarda (그램 -)	MIC = 160 μM IC50 = 11.11	MIC = 20 μM IC50 = 2.085	MIC = 160 μM IC50 = 37
Vibrio sp . (그램 -)	MIC = 80 μM IC50 = 7.45	MIC = 15 μM IC50 = 2.5	MIC = 106 μM IC50 = 67.41
Candida albicans (균류)	MIC = 20 μM IC50 = 10.28	MIC = 26.7 μM IC50 = 12.92	MIC = 40 μM IC50 = 14.10

*IC50: 박테리아 성장을 50% 저해하는 펩타이드 농도

실시예 4. 항미생물성 펩타이드로 사전 처리된 틸라피아에서 Aeromonas hydrophila에 의한 감염에 대한 내성 측정

복강내 주사에 의한 펩타이드의 투여

인 비보에서의 질병에 대한 내성을 향상시키는 항미생물성 펩타이드들의 유용성을 평가하였다. 제1 테스트에서, 10 g 체중의 130 마리 틸라피아들 (O. niloticus)을 사용하였으며, 이는 그룹 당 10 마리의 동물들로 13개 실험군에 무작위로 분포시켰다. 본 분석은 A. hydrophila에 의한 감염에 대한 어류의 생존성을 증가시키기 위해서 요구되는 최소 처리 시간을 결정하기 위해서 수행되었다. 각각의 펩타이드들은 어류 당 1 ㎍의 농도로 복강 내 주사에 의해서 2, 4, 8 및 15일 동안 투여되었다. PBS를 대조군으로 투여하여 또 다른 그룹들도 테스트하였다. 실험군들은 하기와 같았다:

그룹 1: PBS.

그룹 2: 2일 연속 Oreochromicin I를 투여.

그룹 3: 4일 연속 Oreochromicin I를 투여.

그룹 4: 8일 연속 Oreochromicin I를 투여.

그룹 5: 15일 연속 Oreochromicin I를 투여.

그룹 6: 2일 연속 Oreochromicin II를 투여.

그룹 7: 4일 연속 Oreochromicin II를 투여.

그룹 8: 8일 연속 Oreochromicin II를 투여.

그룹 9: 15일 연속 Oreochromicin II를 투여.

그룹 10: 2일 연속 Oreochromicin III를 투여.

그룹 11: 4일 연속 Oreochromicin III를 투여.

그룹 12: 8일 연속 Oreochromicin III를 투여.

그룹 13: 15일 연속 Oreochromicin III를 투여.

펩타이드 투여 시간 이후에, A. hydrophila를 중간 치사량 (LD50)으로 복강내 주사함으로써 감염 테스트를 수행하였고, 치사율을 7일 동안 기록하였다. 상대 생존율 (relative percent of survival, RPS)은 하기와 같이 계산하였다:

RPS (%) = (% 대조군 치사율 - % 처리군 치사율) / (% 대조군 치사율) × 100

결과로서, Oreochromicin I 및 Oreochromicin III으로 15일 동안 처리된 어류들에서, PBS로 처리된 군에 비해서 45%의 생존율 (RPS로 측정) 증가가 관찰되었다. 반면에, Oreochromicin II로 8일 동안 처리된 군은, PBS로 처리된 군에 비해서 48%의 생존율 (RPS로 측정) 증가가 관찰되었다.

A. hydrophila로 감염시킨 후 어류의 생존을 증가시키기 위해서 요구되는 펩타이드의 최적 투여량을 결정하기 위해서 두 번째 테스트를 수행하였다. 130 마리의 틸라피아들 (O. niloticus)을 사용하였으며, 그 체중은 약 10 g으로서, 이는 각 군 당 10마리의 동물들로 13개 군들에 무작위로 분배하였다. 각각의 펩타이드들은 어류 당 0.5, 1, 5 및 10 ㎍의 농도로 15일 동안 투여하였다. 실험군들은 하기와 같았다:

그룹 1: PBS.

그룹 2: Oreochromicin I 0.5 ㎍/어류.

그룹 3: Oreochromicin I 1 ㎍/어류.

그룹 4: Oreochromicin I 5 ㎍/어류.

그룹 5: Oreochromicin I 10 ㎍/어류.

그룹 6: Oreochromicin II 0.5 ㎍/어류.

그룹 7: Oreochromicin II 1 ㎍/어류.

그룹 8: Oreochromicin II 5 ㎍/어류.

그룹 9: Oreochromicin II 10 ㎍/어류.

그룹 10: Oreochromicin III 0.5 ㎍/어류.

그룹 11: Oreochromicin III 1 ㎍/어류.

그룹 12: Oreochromicin III 5 ㎍/어류.

그룹 13: Oreochromicin III 10 ㎍/어류.

펩타이드 투여 15일 이후에, LD50의 A. hydrophila를 복강내 주사함으로써 감염 테스트를 수행하였으며, 치사율을 7일 동안 기록하였다. RPS는 전술한 바와 같이 계산하였다. 감염 7일 이후 시점에서, 모든 3가지 펩타이드들은 투여량-의존성 효과를 나타내었으며, RPS는 10%의 생존률만을 나타낸 PBS만을 투여한 군에 비해서, 84% 내지 88%의 범위를 나타내었다.

침지 중탕에 의한 펩타이드의 투여

A. hydrophila 감염에 이은 어류 생존성에 대해서, 침지 중탕에 의해서 투여된 각 펩타이드의 효과를 결정하기 위한 테스트를 수행하였다. 부화한지 5일이 경과된 1300 마리의 틸라피아 (O. niloticus) 유충들을 사용하였으며, 이는 각 군 당 100 마리의 유충으로 13개의 실험군들에 무작위로 분배되었다. 각 펩타이드는, 15일 동안 물 1 리터 당 0.01, 0.05, 0.1 및 0.5 mg의 농도로 투여되었다. 실험군들은 하기와 같았다:

그룹 1: PBS.

그룹 2: Oreochromicin I 0.01 mg/L.

그룹 3: Oreochromicin I 0.05 mg/L.

그룹 4: Oreochromicin I 0.1 mg/L.

그룹 5: Oreochromicin I 0.5 mg/L.

그룹 6: Oreochromicin II 0.01 mg/L.

그룹 7: Oreochromicin II 0.05 mg/L.

그룹 8: Oreochromicin II 0.1 mg/L.

그룹 9: Oreochromicin II 0.5 mg/L.

그룹 10: Oreochromicin III 0.01 mg/L.

그룹 11: Oreochromicin III 0.05 mg/L.

그룹 12: Oreochromicin III 0.1 mg/L.

그룹 13: Oreochromicin III 0.5 mg/L.

펩타이드 투여 후 15일 경과한 다음, LD50의 A. hydrophila를 침지 중탕에 의해서 투여함으로써 감염 테스트를 수행하였고, 치사율을 10일 동안 기록하였다. RPS는 전술한 바와 같이 계산하였다. 감염 후 10일 이후 시점에서, 모든 3가지 펩타이드들은 투여량-의존성 효과를 나타내었으며, RPS는 18%의 생존률만을 나타낸 PBS만을 투여한 군에 비해서, 76% 내지 89%의 범위를 나타내었다.

사료 첨가제로서 경구 투여

A. hydrophila 감염에 이은 어류 생존성에 대해서, 사료 첨가제로서 경구 투여된 각 펩타이드의 효과를 결정하기 위한 테스트를 수행하였다. 130 마리의 틸라피아들 (O. niloticus)을 사용하였으며, 그 체중은 약 10 g으로서, 이는 각 군 당 10마리의 동물들로 13개 군들에 무작위로 분배하였다. 각각의 펩타이드들은 사료 1 kg 당 50, 250, 500 및 750 ㎍의 농도로 30일 동안 투여하였다. 실험군들은 하기와 같았다:

그룹 1: PBS.

그룹 2: Oreochromicin I 50 ㎍/Kg.

그룹 3: Oreochromicin I 250 ㎍/Kg.

그룹 4: Oreochromicin I 500 ㎍/Kg.

그룹 5: Oreochromicin I 750 ㎍/Kg.

그룹 6: Oreochromicina II 50 ㎍/Kg.

그룹 7: Oreochromicina II 250 ㎍/Kg.

그룹 8: Oreochromicina II 500 ㎍/Kg.

그룹 9: Oreochromicina II 750 ㎍/Kg.

그룹 10: Oreochromicina III 50 ㎍/Kg.

그룹 11: Oreochromicina III 250 ㎍/Kg.

그룹 12: Oreochromicina III 500 ㎍/Kg.

그룹 13: Oreochromicina III 750 ㎍/Kg.

펩타이드 투여 후 30일 경과한 다음, LD50의 A. hydrophila를 복강내 주사에 의해서 투여함으로써 감염 테스트를 수행하였고, 치사율을 10일 동안 기록하였다. RPS는 전술한 바와 같이 계산하였다. 감염 후 10일 이후 시점에서, 모든 3가지 펩타이드들은 투여량-의존성 효과를 나타내었으며, RPS는 13%의 생존률만을 나타낸 PBS만을 투여한 군에 비해서, 80% 내지 95%의 범위를 나타내었다.

실시예 5. 마우스에서 Staphylococcus aureus 또는 Pseudomonas aeruginosa 에 의한 감염에 대한 내성 측정

S. aureus 및 P. aeruginosa 박테리아의 치사 투여량 감염으로부터 항미생물성 펩타이드 Oreochromicin I 및 Oreochromicin II가 마우스를 보호하는 능력을 조사하였다. 본 분석에서는, 4 주령 및 체중 25 g의 수컷 마우스 (ICR)를 사용하였다. 박테리아는 37℃에서 8시간 동안 대두 성분을 트립톤으로 처리한 배지 (tryptone soy broth)에서 배양하였다.

90 내지 100%의 치사율을 야기하기 위해서 필요한 박테리아의 양은 PBS 중에서 배양물을 희석시킴으로써 제조하였다. 550 nm에서의 흡광도에 기초하여 생존성 군락들의 개수를 계수하였으며, 접종물의 연쇄적 희석액들을 플레이팅함으로써 확인하였다. 테스트되어진 미생물들의 의존성 및 투여 경로에 있어서, 4.5x10⁶ 및 1.4x10⁹ CFU/마우스의 투여량을 사용하였다.

15 마리의 마우스들을 각 투여량으로 감염시켰으며, 생존률을 감염 후 7-10일 동안 모니터링하였다. 첫 번째 테스트에서, 마우스들을 복강 내 박테리아 투여에 의해서 감염시킨 직후에, 0.5 ml의 PBS (음대조군) 또는 선택된 항미생물성 펩타이드를 함유하는 PBS를, 복강내 주사 경로에 의해서 투여하였다. 두 번째 테스트에서, S. aureus를 정맥 주사로 투여하였다. 마우스들에 박테리아를 투여한 직후에, 0.2 ml의 PBS 또는 항미생물성 펩타이드를 함유하는 PBS를, 정맥 주사로 투여하였다.

결과로서, Oreochromicin I 및 Oreochromicin II 펩타이드들은 0.5 mg/kg의 투여량으로 복강내 투여되는 경우에, S. aureus 및 P. aeruginosa에 의한 치사율을 대조군의 90-100%에서, 펩타이드로 처리된 군들에서 5-29%로 감소시키는 것이 확인되었다.

S. aureus에 의한 정맥주사 감염의 경우, 펩타이드를 2.5 mg/kg의 투여량으로 투여하게 되면, 치사율이 대조군의 90-100%에서, 펩타이드로 처리된 군들에서 18-40%로 감소하는 것으로 확인되었다.

실시예 6. 이리도바이러스에 의한 감염에 대한 항미생물성 펩타이드들의 활성

EPC 세포들 (혈관내피전구세포들)을 28℃, 5% CO₂ 및 95% 상대습도로, 10% 우태아혈청, 1 mM 피루브산, 2 mM 글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640 중에서 배양하였다. 본 발명에 따른 항미생물성 펩타이드들을 각각 5' 및 3' 말단 서열들을 인식하는 특정 프라이머들을 사용하여 PCR에 의해서 증폭하였으며, pTargeT 벡터 내로 삽입함으로써, pTargeT-Oreochromicin I, pTargeT-Oreochromicin　II 및　pTargeT-Oreochromicina　III 플라스미드들을 제조하였다.

EPC 세포들을 90%의 컨플루언스 (confluence)로 성장시켰으며, 리포펙타민 2000 (lipofectamine 2000)을 사용하여, 1 ㎍/mL의 DNA 농도로, 항미생물성 펩타이드들을 암호화하는 유전자들을 함유하는 벡터들 및 빈 벡터 pTargeT으로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 세포들에서 항미생물성 펩타이드들의 발현을, RT-PCR에 의해서 분석하였다. PCR 산물들을 에티듐 브로마이드로 염색된 2% 아가로오즈 겔 상에서 가시화하였다. 트랜스펙션 이후 24시간 경과시점에서, 각각의 웰들을 PBS로 3회 세척하고, 다양한 농도의 라나 그릴리오 바이러스 (RGV)로 처리하였다. 감염 48시간 경과시점에서, 각 웰들로부터의 상등액들을 회수하였으며, 냉동 및 해동을 3회 수행하였다. RGV 역가를 결정하기 위해서, 무혈청 배지의 상등액 상에서 연속적 희석을 수행하였으며, 세포들을 EPC 상에서 적정하였다. 각각의 희석액에 대해서 3중으로 테스트를 수행하였다. 데이터는 평균 ± 표준오차로 표시하였다. 그룹들 사이의 차이는 ANOVA 및 Dunnett's 다중 비교 테스트를 사용하여 분석하였다.

세포들을 10⁵, 10⁴, 10³ 및 10² TCID50/ml의 RGV로 감염시키게 되면, 항미생물성 펩타이드들을 발현하는 나머지 세포들과 비교할 때, 빈 벡터 pTargeT으로 트랜스펙션된 세포들에서, 배양 후 48 시간이 경과되면 현저한 세포변성 (cytopathic) 효과들이 관찰되었다. 항미생물성 펩타이드들을 발현하는 세포들의 바이러스 역가는 빈 벡터로 트랜스펙션된 세포들의 역가보다 현저하게 낮았다 (p<0.01) (도　3).

실시예 7. 항미생물성 펩타이드에 의한 LPS의 중화

항미생물 활성 및 질병 내성 증가의 가능성 이외에도, 생물학적 내독소 시험 (Limulus amebocyte lysate test, LAL test)에 의해서, 본 발명에 따른 항미생물성 펩타이드들이 LPS를 중화시키는 능력을 조사하였다. 본 분석은 중화되지 않은 자유 LPS의 존재를 검출한다. 다양한 농도의 펩타이드들을, 37℃에서 30분 동안, 0.5 EU/ml의 LPS와 함께 배양하였다. LPS 단독은 분석의 양대조군으로 사용하였다. 이어서, 동일한 부피의 LAL 시약에 100 mL의 혼합물을 첨가하였다. 탁도의 역학을 Tube Reader ATi-321 (Lab Kinetics, UK) 장치를 사용하여 측정하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 항미생물성 펩타이드들은 LPS를 투여량-의존적인 방식으로 중화시키는 능력을 갖는다. Oreochromicin I, Oreochromicin II 및 Oreochromicin III 펩타이드들의 EC50은 각각 1.23 μM, 1.41 μM 및 2.99 μM이었다.

실시예 8. 분자 아쥬반트로서, Oreochromicin I, Oreochromicin II 및 Oreochromicin III 항미생물성 펩타이드들의 사용

각각 12 마리의 틸라피아들 (O. niloticus)을 사용하여 5개의 실험군들을 마련하였다. 각각 50 g의 체중을 갖는 틸라피아들에 대해서, 복강 내 주사에 의해서, PBS, 포르말린으로 불활성화된 A. hydrophila 세포들 및 각각의 펩타이드를 1 ㎍/어류의 투여량으로 첨가한, 포르말린으로 불활성화된 A. hydrophila 세포들을 투여하였다. 주사는 0일째 및 14일째에 수행하였다. 0일째 및 21일째에 어류의 미정맥 (caudal vein)으로부터 혈액을 채혈하였으며, 혈청을 사용 전까지 -20℃에서 보관하였다.

A. hydrophila에 대한 응집 항체 역가들을, 96-웰 플레이트 중의 응집 분석에 의해서 측정하였다. 혈청 샘플들의 연속적 희석물들 (50 μL)을 PBS 중에서 제조하였으며, 각각의 웰에 포르말린으로 불활성화된 50 μL의 A. hydrophila 세포들 (4x10⁹ 세포들/ml)을 첨가하고, 완전히 혼합하였다. 응집을 검사하기 이전에, 플레이트들을 실온에서 밤새도록 배양하였다. 응집 항체 역가는 양성 응집을 나타내는 가장 높은 혈청 희석의 역수로서 표현하였다.

A. hydrophila에 대한 응집 항체 반응을 도 5에 도시하였다. 면역화 후 3주 시점에서 평균 응집 항체 역가들을 측정한 결과, 불활성화된 박테리아 세포들과,항미생물성 펩타이드들이 함께 주사된 그룹들의 역가가 박테리아만 주사된 그룹들 (p<0.001) 또는 PBS (p<0.0001)로 주사된 그룹들에 비해서 월등하였다. 더 나아가, PBS로 주사된 그룹들과 박테리아만 주사된 그룹들 사이의 항체 역가 차이는 현저하였다 (p<0.001).

실시예 9. 마우스 중의 체액성 및 세포성 면역 반응에 대한 오브알부민 (OVA)과, 항미생물성 펩타이드 Oreochromicin I, Oreochromicin II 및 Oreochromicin III의 공동면역 효과

A) 제1 면역화 스케줄

체중 20 g의 BALB/c 마우스 24 마리를 선택하였으며, 이를 각 그룹 당 6 마리로 이루어진 4개 테스트 그룹들로 분리하였다. 음대조군 (PBS/OVA)을, 0일째 및 7일째에, PBS 0.2 mL 중의 6 ㎍ OVA 투여량으로, 복강 내 주사에 의해서 접종하였다. 펩타이드로 처리된 그룹들 (PBS/OVA + 펩타이드)을, 0일째 및 7일째에, PBS 0.2 mL 중의 6 ㎍ OVA + 0.5 ㎍ 펩타이드의 투여량으로, 복강 내 주사에 의해서 접종하였다. 면역화 프로토콜의 15일째 되는 날에, 동물들로부터 채혈하여 토탈 IgG 역가들을 분석하였다.

도 6은 OVA와, 각각의 펩타이드들로 함께 투여된 마우스의 면역화에 의해서 유도된 토탈 IgG 역가들을 도시한 것이다. PBS/OVA+펩타이드 그룹의 동물들은 대조군에 비해서 통계적으로 우수한, OVA에 대한 특이적 토탈 IgG 역가를 나타내었다. 이러한 양상은 모든 펩타이드들에 대해서 유지되었다.

B) 제2 면역화 스케줄

6주령의, 64 마리의 BALB/c 수컷 마우스들을 선택하였으며, 각 그룹 당 8 마리의 마우스들로 이루어진 8개의 실험군들로 분리하였다. 면역원의 투여는 복강 내 주사에 의해서 0.1 mL의 부피로 수행되었다. 항미생물성 펩타이드들은 동일 몰량의 함량으로 투여되었다 (0.238x10²⁰ 분자들 및 2.38x10²⁰ 분자들). 실험군들은 하기와 같았다:

그룹 1: PBS로 면역화된 마우스.

그룹 2: 5 ㎍/동물의 투여량으로, OVA로 면역화된 마우스.

그룹 3: OVA 5 ㎍/동물 + Oreochromicin I 0.1 ㎍/동물 (0.238x10²⁰ 분자/동물에 해당)의 투여량으로 면역화된 마우스

그룹 4: OVA 5 ㎍/동물 + Oreochromicin I 1 ㎍/동물 (2.38x10²⁰ 분자/동물에 해당)의 투여량으로 면역화된 마우스

그룹 5: OVA 5 ㎍/동물 + Oreochromicin II 0.12 ㎍/동물 (0.238x10²⁰ 분자/동물에 해당)의 투여량으로 면역화된 마우스

그룹 6: OVA 5 ㎍/동물 + Oreochromicin II 1.2 ㎍/동물 (2.38x10²⁰ 분자/동물에 해당)의 투여량으로 면역화된 마우스

그룹 7: OVA 5 ㎍/동물 + Oreochromicin III 0.14 ㎍/동물 (0.238x10²⁰ 분자/동물에 해당)의 투여량으로 면역화된 마우스

그룹 8: OVA 5 ㎍/동물 + Oreochromicin III 1.4 ㎍/동물 (2.38x10²⁰ 분자/동물에 해당)의 투여량으로 면역화된 마우스

동물들을 0일째 및 14일째에 면역화하였으며, 채혈은 0, 14 및 21일째에 수행하였다. 동물들의 혈청은 특이적 항체 역가를 결정하기 위해서 사용하였다 (토탈 IgG, IgG1 및 IgG2a). 실험 개시 59일째에, 마우스로부터 비장을 추출하여 항원 OVA에 대한 세포 면역 반응을 측정하였다. 비장은 무균성 조건 하에서 추출하였으며, 지라세포들 (splenocytes)을 분리하여 2.5x10⁵ 세포들로 배양한 후, 96-웰 원형 바닥 플레이트 중에, 2x10⁶ 세포/mL의 농도로 접종하였다. 세포들을 Concanavalin A (5 ㎍/ml) 또는 OVA (10 ㎍/mL)로 자극한 다음, 37℃에서, 5% CO₂로 4일 동안 배양하였다. 배양 상등액을 수거한 다음, ELISA에 의해서 인터루킨-4 및 인터루킨-γ의 수준을 분석하는데 사용하였다.

도 7A 및 7B는 OVA와 함께, Oreochromicin I, II 및 III 펩타이드가 투여된 마우스 면역화에 의해서 유도된 토탈 IgG, IgG1 및 IgG2a 역가들을 나타낸다. PBS/OVA + Oreochromicin I 그룹 중의 동물들은, 1 ㎍/동물의 투여량에서, OVA에 대한 특이적 토탈 IgG 역가에 있어서, 음대조군보다 통계적으로 월등하였다 (p<0.001) (도 7A). PBS/OVA 및 PBS/OVA + Oreochromicin III 그룹 중의 동물들은, 1.4 ㎍/동물의 투여량에서, 토탈 IgG 역가에 있어서, 음대조군보다 통계적으로 유의미한 차이를 나타내었다 (p<0.05). 유사하게, PBS/OVA + Oreochromicin I으로 면역화된 그룹 중의 동물들은, 1 ㎍/동물의 투여량에서, OVA에 대한 특이적 IgG2a의 역가에 있어서, 첫 번째 면역화 후 21일째에 OVA만으로 면역화된 그룹에서 관찰되는 수치에 비해서 현저하게 큰 값을 나타내었다 (p<0.05) (도 7B).

면역화된 동물들로부터 얻어지고, OVA로 자극된 지라세포들의 배양 상등액을 ELISA에 의해서 분석함으로써 IFN-γ 및 IL-4의 농도를 측정하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, OVA와 함께 Oreochromicin III 펩타이드로 함께 투여하여 면역화된 동물들에서 투여량 의존적인 방식으로 가장 높은 수준의 IFN-γ가 얻어졌다. 이러한 수준들은 OVA 또는 PBS 단독으로 면역화된 동물들의 지라세포들에서 얻어진 수준들보다 현저하게 높은 것이었다 (p<0.001). 더 나아가, 1.2 ㎍/동물의 투여량으로, OVA와 함께 Oreochromicin II 펩타이드가 투여되어 면역화된 동물들에서의 IFN-γ 분비 수준은, OVA 또는 PBS 단독으로 면역화된 동물들의 지라세포들에서 얻어진 수준들보다 현저하게 높은 것이었다 (p<0.05) (도 8). 사용된 실험 조건들 하에서, 두 그룹 어디에서도 IL-4 분비가 관찰되지 않았다.

실시예 10. 틸라피아의 체액성 면역 반응에 대한 항원 MY32 및 Oreochromicin I 펩타이드의 공동-면역화 효과

틸라피아에서 분자 아쥬반트로서 Oreochromicin I 펩타이드의 능력을 분석하기 위해서, 기존에 알려진 MY32 단백질을 백신 항원으로서 사용하였다 (Carpio et al. (2011)　Vaccine　29:　2810-2820).

6개의 실험군들은 10 마리의 틸라피아들 (O. niloticus)로 구성되며, 각각은 평균 체중 45 g이었다. 투여 경로는 복강 내 경로를 통하였으며, 면역원은 0.3 mL의 주사 부피로 적용하였다. 실험군들은 하기와 같았다:

그룹 1: PBS로 면역화된 어류.

그룹 2: 체중 1g 당, MY32 단백질 1 ㎍의 투여량으로 면역화된 어류.

그룹 3: 체중 1g 당, MY32 단백질 1 ㎍과, 10 ㎍/어류의 투여량으로 Oreochromicin I 펩타이드를 함께 투여하여 면역화된 어류.

그룹 4: 체중 1g 당, MY32 단백질 1 ㎍과, 1 ㎍/어류의 투여량으로 Oreochromicin I 펩타이드를 함께 투여하되, 모두 Montanide 888 중에서 아쥬반트화되어 투여함으로써 면역화된 어류.

그룹 5: 체중 1g 당, MY32 단백질 1 ㎍과, 10 ㎍/어류의 투여량으로 Oreochromicin I 펩타이드를 함께 투여하되, 모두 Montanide 888 중에서 아쥬반트화되어 투여함으로써 면역화된 어류.

그룹 6: 체중 1g 당, MY32 단백질 1 ㎍의 투여량으로 투여하되, Montanide 888 중에서 아쥬반트화되어 투여함으로써 면역화된 어류.

동물들은 0일째 및 14일째에 면역화하였으며, 채혈은 0, 14, 21 및 28일째에 수행하였다. IgM 특이적 항체 역가를 결정하기 위해서, 동물들의 혈청을 사용하였다.

도 9는 MY32 항원과, Oreochromicin I 펩타이드가 함께 투여된 어류의 면역화에 의해서 유도된 IgM 역가들을 도시한 것이다. MY32 + Oreochromicin I 그룹의 동물들은, 10 ㎍/동물의 투여량에서, Montanide 888에서 아쥬반트화된 경우, PBS, MY32 및 MY32와, Oreochromicina I 펩타이드가, 10 ㎍/어류의 투여량으로 투여되어 면역화된 그룹들에 비해서, MY32에 대한 특이적 IgM 역가 면에서 통계적으로 월등하였다 (p<0.05) (도 9). 나머지 다른 실험군들에서는 그다지 현저한 차이점들이 관찰되지 않았다.

<110> Center for Genetic Engineering and Biotechnology <120> AMINO ACID SEQUENCES FOR THE CONTROL OF PATHOGENS <130> tilapia antimicrobial peptides <150> CU 2011-0181 <151> 2011-09-30 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Oreochromis niloticus <400> 1 Phe Ile His His Ile Ile Gly Gly Leu Phe Ser Val Gly Lys His Ile 1 5 10 15 His Gly Leu Ile His Gly His 20 <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Oreochromis niloticus <400> 2 Phe Ile His His Ile Ile Gly Gly Leu Phe Ser Ala Gly Lys Ala Ile 1 5 10 15 His Arg Leu Ile Arg Arg Arg Arg Arg 20 25 <210> 3 <211> 32 <212> PRT <213> Oreochromis niloticus <400> 3 Ile Trp Asp Ala Ile Phe His Gly Ala Lys His Phe Leu His Arg Leu 1 5 10 15 Val Asn Pro Gly Gly Lys Asp Ala Val Lys Asp Val Gln Gln Lys Gln 20 25 30 <210> 4 <211> 69 <212> DNA <213> Oreochromis niloticus <400> 4 tttattcacc atattatcgg tggactgttt agtgttggca aacatatcca cggcctcatc 60 cacggacat 69 <210> 5 <211> 75 <212> DNA <213> Oreochromis niloticus <400> 5 tttattcacc atattatcgg tggactgttt agtgctggca aggctatcca tcgcctcata 60 cgacgtagac gaaga 75 <210> 6 <211> 96 <212> DNA <213> Oreochromis niloticus <400> 6 atttgggacg caattttcca tggagccaaa cattttcttc atcggctcgt caatcctggt 60 ggcaaggatg ctgtcaagga tgtccaacaa aagcaa 96

Claims

서열번호 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 1, 2 또는 3의 서열들과 적어도 80%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노산 서열.
제1항에 있어서, 천연 공급원으로부터 분리, 화학적 합성 또는 재조합 데옥시리보뉴클레익산 (DNA) 기술에 의해서 얻어지는 것을 특징으로 하는 아미노산 서열.
제2항에 있어서, 박테리아, 효모 또는 고등생물의 세포들에서의 발현에 의해서 얻어지는 것을 특징으로 하는 아미노산 서열.
서열번호 4, 5 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
서열번호 1, 2 및 3의 서열, 또는 서열번호 1, 2 또는 3의 서열들과 적어도 80%의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산.
서열번호 1, 2 또는 3의 서열, 또는 서열번호 1, 2 또는 3의 서열들과 적어도 80%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 병원균 조절용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 펩타이드는 천연 공급원으로부터 분리, 화학적 합성 또는 재조합 데옥시리보뉴클레익산 (DNA) 기술에 의해서 얻어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제6항에 있어서, 포유류 및 수중 생물들에 영향을 주는 박테리아성, 바이러스성 및 균류성 병원균들을 조절하는데 사용되며, 예방적으로 또는 치료적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제6항에 있어서, 경구, 비경구, 또는 침지 중탕에 의해서 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
서열번호 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 1, 2 또는 3의 서열들과 적어도 80%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의, 병원균 조절용 조성물을 제조하기 위한 용도.
서열번호 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 1, 2 또는 3의 서열들과 적어도 80%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 유효량을 생물체에 투여하는 것을 특징으로 하는 생물체 내의 병원균 조절 방법.
제11항에 있어서, 상기 펩타이드는 예방적으로 또는 치료적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 펩타이드는 포유류 및 수중 생물에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 펩타이드는 어류에 투여되며, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎍ 펩타이드/어류의 농도로 주기적 주사에 의해 투여되거나, 물 1 리터 당 0.01 내지 0.1 mg 펩타이드의 농도로 침지 중탕에 의해서 투여되거나, 또는 사료 1 kg 당 약 50 내지 750 ㎍의 농도로 사료 첨가제로서 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
분자 아쥬반트로서, 서열번호 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 1, 2 또는 3의 서열들과 적어도 80%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 및 백신 항원을 포함하는 백신 조성물.
제15항에 있어서, 백신 아쥬반트로서 사용되는 상기 펩타이드 및 상기 항원은, 동일한 면역화 스케줄 동안, 동시에, 분리되어 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
서열번호 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열번호 1, 2 또는 3의 서열들과 적어도 80%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 백신 중의 분자 아쥬반트로서 이용하는 것을 특징으로 하는, 백신 항원에 대한 면역 반응을 증가시키기 위한 방법.