ES2600903T3

ES2600903T3 - Secuencias de aminoácidos para el control de patógenos

Info

Publication number: ES2600903T3
Application number: ES12783080.0T
Authority: ES
Inventors: Jannel Acosta Alba; Mario Pablo ESTRADA GARCÍA
Original assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Current assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2012-10-01
Publication date: 2017-02-13
Anticipated expiration: 2032-10-01
Also published as: CU24076B1; CA2849040C; CL2014000760A1; AR088176A1; KR101986358B1; MX2014003892A; WO2013044890A1; CA2849040A1; EP2767290A1; KR20140070597A; MX348934B; AU2012315083A1; ZA201402171B; EP2767290B1; CU20110181A7; AU2012315083B2; CN103874502A; RU2636001C2; US20140294871A1; CN103874502B

Abstract

La presente invención se relaciona con péptidos antimicrobianos, aislados y purificados a partir de extractos de branquias de tilapia (Oreochromis niloticus). Dichos péptidos pueden ser producidos por síntesis química o en sistemas de expresión heterólogos, como bacterias y levaduras, por técnicas convencionales de biología molecular. Estos péptidos muestran actividad antimicrobiana contra diversos organismos, entre ellos bacterias Gram positivas, bacterias Gram negativas, hongos y virus. La invención también incluye composiciones para el control de agentes patógenos que comprenden estos péptidos antimicrobianos. El empleo de dichos péptidos en preparaciones vacunales, como adyuvante molecular, es también parte de la invención.

Description

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Secuencias de aminoacidos para el control de patogenos Campo tecnico

La presente invencion se relaciona con el campo de la biotecnologfa, especfficamente con la obtencion de peptidos antimicrobianos y su uso para el control de patogenos. Cuando se aplican los peptidos antimicrobianos, alcanzan efectivamente el control de enfermedades causadas por patogenos. Adicionalmente, estos peptidos contribuyen a potenciar la respuesta inmune inducida por diversos antfgenos incluidos en las vacunas.

Arte anterior

Los peces tienen un sistema inmune innato poderoso que actua como una primera lfnea de defensa contra un amplio espectro de patogenos (Subramanian et al. (2008) Fish and Shellfish Immunol. 25:625-632), y un sistema inmune adaptativo pobremente desarrollado (Magnadottir, (2010) Mar Biotechnol.12:361-379). Una de las maneras en las cuales los peces luchan contra los patogenos es la secrecion de peptidos antimicrobianos (AMP) como un mecanismo de defensa innato. Los AMPs tienen un papel fundamental en el sistema inmune innato y protegen contra una variedad de bacterias, hongos, virus y otros patogenos que causan infecciones (Solomon, (2008) Lancet Neurol. 7:116-118). En general, los AMPs son secretados en la saliva, moco, sistema circulatorio y otras areas que son dianas para los patogenos (Noga et al. (2010) Comp Biochem Physiol D: Genom Proteom. 6:44-54).

Los AMPs se dividen en cinco categorfas, con base en su composicion de aminoacidos y estructura. En estas categorfas se incluyen peptidos anionicos, peptidos lineales con estructura anfifatica a-helicoidal, peptidos cationicos enriquecidos con aminoacidos especfficos, fragmentos de peptidos y peptidos con cistefnas que forman enlaces intramoleculares (Brogden (2005) Nat Rev Microbiol. 3:238-50; Boman (2000) Immunol Rev.173:5-16). Los peptidos anionicos son producidos en concentraciones minimolares, que requieren del zinc como un cofactor, y muestran actividad antimicrobiana contra bacterias Gram-positivas y bacterias Gram-negativas. Los peptidos lineales y cationicos con estructura anfifatica de helice a tiene menos de 40 aminoacidos y poseen una estructura tridimensional con una region bisagra en la porcion media. Mientras que esta estructura es desordenada en solucion, estas moleculas adoptan una estructura de helice a secundaria cuando estan en contacto con las membranas (Brogden (2005) Nat Rev Microbiol. 3:238-50). El otros grupo, que consiste de peptidos cationicos lineales enriquecidos con aminoacidos especfficos, no tiene residuos de cistefna, por lo tanto estos peptidos tienen una estructura muy flexible en solucion (Brogden (2005) Nat Rev Microbiol. 3:238-50). El cuarto grupo comprende partfculas cargadas, que son fragmentos de protefnas mas grandes. Estos peptidos poseen actividad antimicrobiana y estructura similar a los otros grupos de peptidos (Bellamy et al. (1992) J Appl Bacteriol. 73:472-9; Zanetti et al. (1995) FEBS Lett. 374:1-5). El quinto grupo de peptidos consiste de aproximadamente 380 miembros, los cuales contiene seis residuos cistefna conservados, que forman enlaces intramoleculares y una estructura en hoja p (Brogden (2005) Nat Rev Microbiol. 3:238-50). Este grupo comprende defensinas y hepcidina (Boman et al. (2000) Immunol Rev. 173:5-16).

Mientras que los AMPs son clasificados comunmente por las variaciones en caracterfsticas estructurales, hay algunos rasgos que son comunes a la mayorfa de estos peptidos. Por ejemplo, generalmente tienen menos de 60 aminoacidos, tienen un amplio espectro de actividad antimicrobiana bajo condiciones fisiologicas y tienen una carga positiva (Zasloff (2002) Nature 415:389-395). La mayorfa de los AMPs anfifaticos adoptan una estructura que contribuye al mecanismo de accion de estos peptidos, con base en su interaccion con la membrana de celulas lipfdicas de patogenos tales como bacterias y virus envueltos (Shai (2002) Biopolymers 66: 236-48; Jelinek and Kolusheva (2005) Curr. Protein Pept. Sci. 6: 103-14). Esta interaccion produce una rapida

desestabilizacion/permeabilizacion de la membrana lipfdica del patogeno. Varias observaciones sugieren que ademas del mecanismo de formacion de poros, los AMPs pueden inhibir la sfntesis de la pared celular, acidos nucleicos y protefnas e incluso inhiben la actividad enzimatica. (Brogden et al. (2005) Nat. Immunol. 6: 558-64; Campagna et al. (2007) Biochemistry 46: 1771-8).

Debido a la capacidad de los microorganismos para desarrollar resistencia a los antibioticos, y la presencia de enfermedades causadas por patogenos para los cuales no hay tratamientos adecuados, es necesario buscar nuevas moleculas con actividad antimicrobiana.

Por lo tanto, un problema importante por resolver es desarrollar nuevos productos antimicrobianos, especialmente protefnas y/o peptidos, capaces de controlar eficientemente un amplio rango de patogenos y que tambien tengan un impacto sobre la inmunidad innata y adaptativa, aspectos de gran importancia en la medicina humana y veterinaria, incluyendo la acuicultura.

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Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion resuelve el problema antes mencionado proveyendo una nueva alternativa para el control y tratamiento de infecciones producidas por patogenos, incluyendo las causadas por bacterias, virus u hongos. En la presente invencion se reporta, por primera vez, los peptidos antimicrobianos identificados como SEQ ID No. 1, 2 y 3. Tambien es un objeto de la invencion las secuencias de aminoacidos que comprenden en su secuencia de aminoacidos las identificadas como SEQ ID No. 1, 2 y 3, o una secuencia de aminoacidos con una identidad de al menos 80% con los peptidos identificados como SEQ ID No. 1, 2 o 3.

Estos peptidos fueros aislados y secuenciados a partir de extractos de protefna de branquias de tilapia (Oreocromis niloticus), los cuales fueron denominados Oreocromicina I, Oreocromicina II y Oreocromicina III. Estos peptidos no han sido reportados en la literatura y estan denotados en la invencion como SEQ ID No. 1, 2 y 3. Estos peptidos poseen efectos antimicrobianos contra bacterias Gram-positivas, bacterias Gram-negativas, virus y hongos. Los peptidos de la presente invencion pueden ser obtenidos por aislamiento a partir de su fuente natural. Ademas, los peptidos pueden ser obtenidos por sfntesis qufmica o por tecnologfa de acido desoxirribonucleico (ADN) recombinante

En una realizacion de la invencion, los peptidos antimicrobianos son obtenidos por expresion recombinante en bacterias, levaduras o celulas de organismos superiores. Estos peptidos antimicrobianos pueden ser expresados en diferentes sistemas hospederos, y aislados a partir de ellos. En una realizacion particular, los peptidos antimicrobianos pueden ser expresados en levadura. En una realizacion preferida, la expresion por la tecnologfa de ADN recombinante se lleva a cabo en Pichia pastoris, preferiblemente en el sobrenadante del cultivo. Los peptidos antimicrobianos de la invencion tambien pueden ser expresados en bacterias. En otra realizacion preferida, la expresion por la tecnologfa de ADN recombinante se lleva a cabo en Escherichia coli. Los peptidos de la invencion pueden ser obtenidos por tecnicas de aislamiento de protefnas, desde el hospedero, los cuales son ampliamente conocidos por los experimentados en este campo tecnico, tales como tecnicas cromatograficas, pellas lavadas y otros.

El uso de los peptidos antimicrobianos ofrece ventajas en comparacion con otros agentes antimicrobianos, puesto que tienen un tamano pequeno (~5 kDa), de tal manera que son mejor absorbidos a traves de la piel y mucosas de organismos acuaticos cuando se aplican por inmersion, la cual es la ruta de administracion con un costo ventajoso para la acuicultura y con bajos niveles de polucion. Otra ventaja es que los peptidos antimicrobianos estimulan la actividad inmune innata y adaptativa, e incrementa la resistencia a infecciones por agentes patogenicos.

Teniendo en cuenta la secuencia de aminoacidos de cada peptido, se disenaron oligonucleotidos degenerados para amplificar, mediante la reaccion en cadena de polimerasa (PCR), la secuencia de nucleotidos que codifica cada peptido maduro. Por lo tanto, otro objeto de esta invencion es un acido nucleico que comprende una secuencia de acidos nucleicos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 y SEQ ID No. 6.

Otro objeto de la presente invencion es un acido nucleico que codifica los peptidos que comprenden las secuencias de aminoacidos identificados como SEQ ID No. 1, 2 y 3, o una secuencia de aminoacidos con al menos 80% de identidad con los peptidos identificados como SEQ ID No. 1, 2 o 3.

La invencion tambien provee una composicion para el control de patogenos que comprende los peptidos identificados como SEQ ID No.1, 2 y 3, o peptidos con al menos 80% de identidad con los peptidos identificados como SEQ ID No. 1, 2 o 3.

En una realizacion de la invencion, los peptidos antimicrobianos cuyas secuencias se reivindican (y las composiciones que los comprenden) pueden ser utilizados para controlar una amplia variedad de patogenos, tales como patogenos bacterianos (Aeromonas, Pseudomonas, Corynebacteria, Enterobacteria, Haemophilus, Mycobacteria, Nocardia, Myxobacteria, Streptomyces y Vibrio, entre otros); patogenos virales (virus de necrosis hematopoyetica infecciosa, virus de necrosis pancreatica infecciosa, virus de septicemia hemorragica, iridovirus, virus hemorragico de la carpa, virus de irrupcion de la viremia de carpa, rabdovirus Hirame o rabdovirus de cabeza de serpiente, virus linfoqufsticos, anemia infecciosa de salmon, entre otros), hongos y oomicetos (Saprolegnia, Achlya, Ychthyosporidium hoferi, entre otros).

En una realizacion de la invencion los peptidos Oreocromicina I, Oreocromicina II y Oreocromicina III, asf como peptidos que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con ellos, se formulan en composiciones que son utilizadas para controlar patogenos en diferentes organismos, incluyendo mamfferos y organismos acuaticos. Tales composiciones son administradas tanto preventivas como terapeuticamente en el control de patogenos. Las rutas de administracion incluyen aquellas que son utilizadas para la administracion de farmacos en humanos, y para medicina o aditivos en el caso de animales, las cuales son conocidas para los experimentados en este campo tecnico. En una realizacion, las composiciones para el control de patogenos, de la invencion, son administradas oralmente, parenteralmente o por banos de inmersion.

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Tambien es un aspecto de la invencion, el uso de un peptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID No. 1, sEq ID No. 2 y SEQ ID No. 3, o una secuencia de aminoacidos con al menos 80% de identidad con SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 3 para la manufactura de una composicion para el control de patogenos.

Otro aspecto de la misma es proveer un metodo para controlar patogenos que atacan varios organismos, caracterizado por la administracion de una cantidad efectiva de un peptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 3, o una secuencia de aminoacidos con al menos 80% de identidad con SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 3 a dichos organismos.

En una realizacion particular, los peptidos de la invencion son aplicados a los peces mediante inyecciones periodicas, a concentraciones de 0.1 y 10 pg/pez; por banos de inmersion a intervalos de 1-15 dfas (en dfas consecutivos o alternos) en agua dulce o agua de mar, a una concentracion de peptidos entre 0.01 y 0.1 mg/L de agua. Tambien los peptidos podrfan ser aplicados como un aditivo en pienso para peces, a una concentracion de aproximadamente 50-750 pg de peptido/kg de pienso. En todos los casos, se obtiene un incremento significativo en la resistencia a enfermedades causadas por patogenos, tales como virus, bacterias u hongos entre otros.

Adicionalmente, esta invencion provee peptidos que son utiles como adyuvantes moleculares para vacunas. En el contexto de esta invencion el termino “adyuvante molecular” se refiere a una molecula proteinacea capaz de modular la respuesta inmune a un antfgeno de vacuna, produciendo un incremento en la respuesta inmune.

Por lo tanto, la invencion tambien provee una composicion de vacuna que comprende un peptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 3, o una secuencia de aminoacidos con al menos 80% de identidad con SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 3, como adyuvante molecular, y un antfgeno de vacuna.

Otro aspecto de la invencion es proveer un metodo para incrementar la respuesta inmune a un antfgeno de vacuna que emplea un peptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo consistente SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 3, o una secuencia de aminoacidos con al menos 80% de identidad con los peptidos identificados como SEQ ID No. 1, 2 o 3, como un adyuvante molecular en una vacuna.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. Estrategia de clonacion de los peptidos antimicrobianos en los vectores de expresion para E. coli (Figura 1 A) y para la levadura P. pastoris (Figura 1 B).

Figura 2. Purificacion de los peptidos antimicrobianos a partir del sobrenadante del cultivo de P. pastoris (Figura 2A) y del sobrenadante del cultivo de E. coli (Figura 2B). Lfnea 1: Oreocromicina I; Lfnea 2: Oreocromicina II, Lfnea 3: Oreocromicina III.

Figura 3. Actividad antiviral de los peptidos antimicrobianos Oreocromicina I, Oreocromicina II y Oreocromicina III. Celulas EPC (Epithelioma papulosum cyprini) sembradas en placas de 24 pozos fueron transfectadas durante 24 horas con 1 pg de pTargeT-Oreocromicina I, pTargeT-Oreocromicina II, pTargeT-Oreocromicina III o pTargeT como control. A las 24 horas, despues de la transfeccion se agregaron diversas concentraciones de virus Rana grylio (RGV) (105 dosis infecciosa 50% del virus (TCID50)/ml, 104TCID50/ml, 103 TCID50/ml y 102 TCID50/ml), y 48 horas despues los sobrenadantes de cultivo fueron recolectados y se determinaron los tftulos virales.

Figura 4. Curva de saturacion de los peptidos antimicrobianos Oreocromicina I, Oreocromicina II, Oreocromicina III enlazando a lipopolisacaridos (LPS). Las concentraciones que producen 50% de peptido (Oreocromicina I, Oreocromicina II y Oreocromicina III) en el enlazamiento (EC50) fueron 1.23 pM, 1.41 pM y 2.99 pM, respectivamente.

Figura 5. Tftulos de anticuerpos contra Aeromonas hydrophila en tilapias (n=12). Los valores representan la media ± error estandar (SE).

Figura 6. Tftulos de inmunoglobulina G total (IgG) inducida en ratones por la inmunizacion con OVA coadministrado con los peptidos Oreocromicina I, Oreocromicina II y Oreocromicina III. Se establecieron cuatro grupos experimentales con 6 animales por grupo. El grupo de control negativo (solucion salina regulada con fosfato (PBS)/OVA) fue inoculado por via intraperitoneal en los dfas 0 y 7 con una dosis de 6 pg de OVA en 0.2 mL de PBS. Los grupos que tambien recibieron los peptidos (PBS/OVA + peptido) fueron inoculados por via intraperitoneal en los dfas 0 y 7, con una dosis de 6 pg de oVa + 0.5 pg de cada peptido en 0.2 mL de PBS. Letras diferentes indican diferencias estadfsticamente significativas. Los valores representan la media ± SE (n=6).

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Figura 7. Tftulos de inmunoglobulina G total (IgG) (A), IgG1 e IgG2a (B) inducidas por inmunizacion con OVA coadministrada con los peptidos Oreocromicina I, Oreocromicina II y Oreocromicina III. Se inmunizaron ratones Balb/c macho (8/grupo) por inyeccion intraperitoneal en los dfas 0 y 14 con OVA solo (5 pg/animal) o en combinacion con peptidos a las dosis de 0.238x1020 moleculas/animal (equivalente a 0.1, 0.12 y 0.14 pg/animal para Oreocromicina I, II y III, respectivamente) y 2.38x1020 moleculas/animal (equivalente a 1, 1.2 y 1.4 pg/animal para Oreocromicina I, II y III, respectivamente). El grupo de control negativo fue inyectado con 0.1 mL de PBS. La respuesta inmune humoral especffica a OVA (IgG total) fue probada en los dfas 14 y 21 despues de la primera inmunizacion. Los tftulos de los anticuerpos IgG1 e IgG2a fueron analizados a los 21 dfas despues de la primera inmunizacion. Los tftulos de los anticuerpos especfficos para OVA fueron determinados por ELISA. (A) Tftulos de IgG totales. Las barras representan el tftulo IgG ± error estandar (n=8). El analisis estadfstico fue ejecutado utilizando una prueba de Kruskal-Wallis y la prueba de comparacion multiple de Dunn. Los asteriscos representan diferencias con el grupo con PBS (* indica p<0.05, *** indican p<0.001). (B) Tftulos de IgG1 e IgG2a. Las barras representan el tftulo del anticuerpo con ± error estandar (n=8). El analisis estadfstico se llevo a cabo utilizando la prueba de Mann Whitney (* denota p<0.05).

Figura 8. Secrecion de IFN-y por celulas de bazo aisladas a partir de animales inmunizados. El eje Y muestra la concentracion de IFN-y en el sobrenadante del cultivo de esplenocitos estimulados con OVA (10 pg/ml). Las barras representan la concentracion de IFN-y ± desviacion estandar (n=5). El analisis estadfstico de los datos se llevo a cabo mediante la prueba por ANOVA y la prueba de comparacion multiple de Bonferroni (*: p<0.05, ***: p<0.001).

Figura 9. Tftulos IgM inducidos por inmunizacion de tilapia (O. niloticus) con protefna MY32 coadministrada con el peptido antimicrobiano Oreocromicina I. Los peces (10 peces/grupo) fueron inmunizados por inyeccion intraperitoneal en los dfas 0 y 14. El grupo de control negativo fue inyectado con 0.3 mL de PBS. La respuesta inmune humoral especffica para MY32 fue analizada en los dfas 14, 21 y 28 despues de la inmunizacion. Los tftulos del anticuerpo IgM especfficos para MY32 fueron determinados por ELISA. Las barras representan el titulo IgM ± error estandar (n=10). El analisis estadfstico de los datos fue llevado a cabo por ANOVA y la prueba de comparacion multiple de Newman-Keuls (* indica p<0.05).

Ejemplos

Ejemplo 1. Aislamiento y purificacion de los peptidos antimicrobianos a partir de extractos de branquias de tilapia

Se maceraron filamentos de branquia de tilapia (Oreocromis niloticus) en nitrogeno lfquido y el polvo resultante fue calentado a 100°C durante 10 minutos y se dejo enfriar. La extraccion de las protefnas se llevo a cabo agregando 150 mL de solucion de HCl 2M, acido formico al 10% (v/v), NaCl al 2% (p/v) y acido tricloroacetico al 1% (v/v), seguido por homogenizacion durante 1-2 minutos. El homogenizado fue centrifugado a 20000 x g durante 30 minutos, el sobrenadante fue ajustado a pH 4.0 y filtrado. El filtrado resultante fue utilizado como el extracto acido y fue aplicado a una columna Sep-Pak C18 (Waters, Milford, MA, Estados Unidos). Despues de lavar con acido trifluoroacetico al 0.1% (v/v), la fraccion correspondiente a los peptidos fue eluida con acetonitrilo 80%/acido trifluoroacetico 0.1%. El eluido fue secado y disuelto en acido acetico 1 M, y adsorbido a una matriz de SP-Sephadex C-25. Etapas sucesivas de elusiones con acido acetico 1 M, piridina 2M y piridina 2M/acido acetico (pH 5.0) produjeron cinco fracciones. Se determino la actividad antimicrobiana de cada fraccion y se selecciono la fraccion 2 para etapas de purificacion subsecuentes.

La fraccion seleccionada fue liofilizada y disuelta en acetonitrilo al 40%, que contenfa acido trifluoroacetico al 0.1%. Se aplico una alfcuota de la solucion a una columna TSKgel G2000SW (filtracion por gel, cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC)) y se eluyo con acetonitrilo al 40% que contenfa acido trifluoroacetico al 0.1%. La misma fraccion fue inyectada repetidamente en la columna, y la fraccion resultante con un peso molecular inferior a 5 kDa y que mostraba actividad antimicrobiana fue liofilizada y sometida a cromatograffa en fase reversa (RP-HPLC) y espectrometrfa de masas (ESI-MS). El peso molecular de esta fraccion fue determinado por electroforesis en gel sobre tricina-docecil sulfato de sodio (16.5% T/3% C) (abreviado tricina-SDS-PAGE).

La separacion de protefnas por HPLC fue llevada cabo en un sistema Hewlett-Packard HP1100. El solvente A fue acetonitrilo al 5% que contenfa acido trifluoroacetico al 0.1% y el solvente B fue acetonitrilo al 80% que contenfa acido trifluoroacetico al 0.085%. La fraccion A fue reconstituida con el solvente A y sometida a RP-HPLC sobre una columna C8-3 (4.6 x150 mm). El gradiente fue 0-2 minutos 0% de solvente B, 2-5 minutos 0-20% de solvente B, 5-55 minutos 20-47% de solvente B, y 55-80 minutos 47-100% de solvente B. Las fracciones resultantes que mostraron actividad antimicrobiana fueron liofilizadas, reconstituidas en acetonitrilo al 25% que contenfa KH2PO4/H3PO4 5 mM (pH 3.0) y cargada sobre una columna de polisulfoetil aspartamida (4.6 x 200 mm). Las fracciones fueron eluidas con un gradiente lineal de KCI. Los pesos moleculares de las fracciones que mostraron la mayor actividad antimicrobiana fueron 2527.3, 2981.9 y 3654.6 Da. Estos peptidos fueron denominados Oreocromicina I, II y III, respectivamente. Las secuencias de aminoacidos de cada peptido con actividad antimicrobiana fueron determinadas y se identifican de aquf en adelante como SEQ ID No. 1, 2 y 3, respectivamente. Adicionalmente, se hicieron analisis de secuencia utilizando el programa BlastX y se encontro que estos peptidos no habfan sido reportados previamente.

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Ejemplo 2. Construccion de vectores para la expresion del peptido antimicrobiano, intracelularmente en E. coli y extracelularmente en la levadura P.pastoris.

Los ADNs complementarios (ADNc) fueron obtenidos a partir de acido ribonucleico (ARN) aislado a partir de branquias de tilapia (O. niloticus) por reaccion de transcripcion reversa. Las reacciones fueron llevadas a cabo siguiendo las instrucciones descritas en el kit "Reverse Transcription System" (Promega, Estados Unidos). En resumen, se colocaron 4 pg de ARN total en un tubo de microcentrffuga libre de nucleasas y se incubo durante 10 minutos a 70°C. Despues de esto se agrego el resto de los componentes de la reaccion (4 pL de MgCh 25 mM, 2 pL de la mezcla de desoxinucleotido trifosfatos (dNTPs) 10 mM, 2 pL del regulador 10X de transcripcion reversa, 0.5 pL del inhibidor de ribonucleasa, 1 pL de oligo (dT) 500 pg/mL, 20 unidades de transcriptasa reversa y agua previamente tratada con pirocarbonato de dietilo hasta un volumen final de 20 pL). La reaccion fue incubada durante 15 minutos a 42°C y fue detenida a 95°C durante 5 minutos.

Las secuencias de nucleotidos que codifican la region madura de los peptidos antimicrobianos fueron amplificadas a partir de los ADNc obtenidos, por PCR, utilizando oligonucleotidos sinteticos degenerados disenados a partir de la secuencia de aminoacidos de cada peptido. En todos los casos se obtuvo una banda de ADN del tamano esperado las bandas fueron purificadas en gel de agarosa e insertadas en el vector comercial pGEM-TEasy (Promega) para secuenciacion. Las secuencias de ADN que codifican los peptidos son identificadas como SEQ ID No. 4, 5 y 6.

Las secuencias de ADN que codifican peptidos antimicrobianos fueron insertadas en el vector de expresion pAR 3040 de E. coli utilizando los sitios de restriccion Ndel/BamHl (Figura 1A). Para amplificar la banda correspondiente a cada uno de los peptidos, se usaron oligonucleotidos que reconocen secuencias espedficas 5' y 3' en los extremos de cada una, y tienen sitios de reconocimiento de las enzimas de restriccion que facilitan la clonacion en la expresion. Para cada peptido, se selecciono uno de los clones recombinantes para transformar la cepa de E. coli BL21 DE3 y para inducir la expresion del gen bajo la regulacion del promotor T7, utilizando como inductor isopropil- p-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG) 1 mM. La expresion del gen fue llevada a cabo a 37°C durante 6 horas. La expresion de los peptidos recombinantes fue verificada por tricina-SDS-PAGE y ESI-MS.

Los vectores pPS9 y pPS10 y los oligonucleotidos especfficos que reconocen las secuencias 5' y 3' de cada peptido y tienen sitios de reconocimiento de enzimas de restriccion se utilizaron para construir el vector de expresion de peptidos antimicrobianos en P. pastoris. Para la clonacion en los vectores pPS9 se utilizaron los sitios Ncol y Spel, y para la clonacion en el vector pPS10 se utilizaron los sitios Nael y Spel. Estas estrategias de clonacion no agregan aminoacidos a la protefna de interes (Figura 1 B).

Los plasmidos fueron linealizados antes de transformar la cepa MP36 de P. pastoris. La transformacion fue llevada a cabo por electroporacion. La cepa MP36 es un mutante auxotrofico his3 con un fenotipo His+ adquirido despues de la transformacion.

Los clones transformantes fueron identificados por Dot Blot. Utilizando la tecnica de inmunoprecipitacion Southern se determino, en cual de estos clones ocurrio la integracion por el reemplazo del gen AOX1 de P. pastoris por el casete de expresion del plasmido recombinante, que corresponde a un fenotipo Muts (uso bajo de metanol) y His+. La levadura P. pastoris secreta niveles bajos de autoprotefnas y su medio de cultivo no requiere suplementos protefnicos, de tal manera que se puede esperar una protefna heterologa que es secretada a un medio extracelular, que constituye una mayorfa de la protefna total en el medio (mas de un 80%) (Tschopp et al. (1987) Bio/Technology 5:1305-1308).

La expresion de peptidos sobre P. pastoris fue llevada cabo en 5 litros mediante la adicion de metanol al medio de cultivo. La expresion de peptidos recombinantes y su integridad fueron verificadas por tricina-SDS-PAGE y ESI-MS.

Ejemplo 3. Purificacion y ensayo de actividad biologica de los peptidos antimicrobianos

Los peptidos antimicrobianos obtenidos por via recombinante fueron purificados a partir del sobrenadante de ruptura de E. coli o de sobrenadante de cultivo de P. pastoris. Primero, la dialisis se llevo a cabo en acetato de sodio 25 mM (pH 4.5), usando una membrana con un tamano de poro de 1 kDa. El producto de la dialisis fue aplicado a una resina de intercambio cationico CM-Sepharose Fast Flow equilibrada con acetato de sodio 25 mM (pH 4.5), y las protefnas fueron eluidas con cloruro de sodio 1 M, Tris 50 mM (pH 7.6). Las fracciones que contenfan los peptidos fueron recolectadas y concentradas utilizando un sistema de ultrafiltracion usando una membrana con un tamano de poro de 1 kDa. Para su deteccion, se empleo una longitud de onda de 254 nm. La purificacion fue verificada por tricina-SDS-PAGE y las protefnas fueron visualizadas por tincion con azul de Coomassie (Figura 2).

Los peptidos de la invencion fueron obtenidos tambien por sfntesis qufmica utilizando metodos conocidos para los experimentados en este campo tecnico. La actividad antimicrobiana de los peptidos fue determinada por el metodo de microdilucion. Para determinar la concentracion inhibidora minima (MIC), cada peptido fue diluido en serie 1:2. Diez microlitros de cada peptido diluido fueron incubados con 90 pL de la suspension de bacterias o levadura (5x105

CFU (unidades formadoras de colonias) por mL) en caldo Mueller Hinton (bacterias) o caldo Sabouraund (hongo) y se incubo durante 18 horas a 28°C (para patogenos y hongos de peces) o 37°C (para patogenos de mamfferos). La MIC se define como la concentracion de peptidos mas baja a la cual ocurre la inhibicion de crecimiento bacteriano. Todos los ensayos fueron llevados a cabo en triplicado, y se usaron como controles medio de cultivo (sin 5 microorganismos) y microorganismos a los cuales no se agrego peptido. Los resultados se muestran en la Tabla 1

Tabla 1. Actividad antimicrobiana de los peptidos Oreocromicina I, Oreocromicina II y Oreocromicina III.

: Oreocromicina I Oreocromicina II Oreocromicina III

Staphylococcus aureus (Gram +): MIC = 5 pM IC50* = 2.8 MIC = 5 pM IC50 = 2.02 No inhibio

Bacillus subtilis (Gram +): MIC = 3 pM IC50 = 1.37 MIC = 1.7 pM IC50 = 0.5894 MIC = 106 pM IC50 = 19.22

Pseudomonas aeuroginosa (Gram -): MIC = 35 pM IC50 = 29.36 MIC = 6.67 pM IC50 = 3.75 No inhibio

E. coli (Gram -): MIC = 6.7 pM IC50 = 2.963 MIC = 5 pM IC50 = 2.289 No inhibio

A. hydrophila (Gram -): No inhibio MIC = 160 pM IC50 = 30.41 No inhibio

Edwardsiella tarda (Gram -): MIC = 160 pM IC50 = 11.11 MIC = 20 pM IC50 = 2.085 MIC = 160 pM IC50 = 37

Vibrio sp. (Gram -): MIC = 80 pM IC50 = 7. 45 MIC = 15 pM IC50 = 2.5 MIC = 106 pM IC50 = 67.41

Candida albicans (hongos): MIC = 20 pM IC50 = 10.28 MIC = 26.7 pM IC50 = 12.92 MIC = 40 pM IC50 = 14.10

*IC50: La concentracion de peptido que produce 50% de inhibicion de crecimiento bacteriano

Ejemplo 4. Determinacion de resistencia a la infeccion por Aeromonas hydrophila en tilapia tratada previamente con peptidos antimicrobianos

10 Administracion de los peptidos por inyeccion intraperitoneal

Se procedio a evaluar la utilidad de peptidos antimicrobianos para potenciar la resistencia a enfermedades in vivo. En una primera prueba, se usaron 130 tilapias (O. niloticus) con un peso corporal de 10 g, los cuales fueron distribuidos aleatoriamente en 13 grupos experimentales de 10 animales por grupo. Este ensayo fue llevado a cabo con el fin de determinar el tiempo mfnimo de tratamiento requerido para potenciar la supervivencia del pez contra 15 exposicion a A. hydrophila. Cada peptido fue administrado a una concentracion de 1 pg por pez por inyeccion intraperitoneal, durante 2, 4, 8 y 15 dfas. Un grupo adicional fue colocado con PBS el cual fue administrado como control. Los grupos experimentales fueron:

Grupo 1: PBS.

5

10

15

20

25

30

35

Grupo 3: Oreocromicina I administrada durante 4 dfas consecutivos.

Grupo 4: Oreocromicina I administrada durante 8 dfas consecutivos.

Grupo 5: Oreocromicina I administrada durante 15 dfas consecutivos.

Grupo 6: Oreocromicina II administrada durante 2 dfas consecutivos.

Grupo 7: Oreocromicina II administrada durante 4 dfas consecutivos.

Grupo 8: Oreocromicina II administrada durante 8 dfas consecutivos.

Grupo 9: Oreocromicina II administrada durante 15 dfas consecutivos.

Grupo 10: Oreocromicina III administrada durante 2 dfas consecutivos.

Grupo 11: Oreocromicina III administrada durante 4 dfas consecutivos.

Grupo 12: Oreocromicina III administrada durante 8 dfas consecutivos.

Grupo 13: Oreocromicina III administrada durante 15 dfas consecutivos.

Despues del tiempo de administracion de peptido, se llevo a cabo una prueba de exposicion por inyeccion intraperitoneal de la dosis letal media (LD50) de A. hydrophila, y se registro la mortalidad durante 7 dfas. Se calculo el porcentaje relativo de supervivencia (RPS) como:

RPS (%) = (% de mortalidad control - % mortalidad tratado) / (% mortalidad controles) x100. Como resultado, se observo que los peces tratados con la Oreocromicina I y la Oreocromicina III durante 15 dfas, tenfan un incremento en la supervivencia (medida como RPS) del 45% en comparacion con el grupo que recibio PBS. Entre tanto, el grupo tratado con Oreocromicina II durante 8 dfas tuvo un incremento en la supervivencia (RPS) del 48% en comparacion con el grupo que recibio PBS.

Se llevo a cabo una segunda prueba para determinar la dosis optima de peptido requerida para incrementar la supervivencia de los peces despues de la exposicion a A. hydrophila. Se utilizaron 130 tilapias (O. niloticus), con un peso corporal de aproximadamente 10 g, las cuales fueron distribuidas aleatoriamente en 13 grupos experimentales de 10 animales cada uno. Cada peptido fue administrado a una concentracion de 0.5, 1, 5 y 10 pg por pez durante 15 dfas. Los grupos experimentales fueron:

Grupo 1: PBS.

Grupo 2: Oreocromicina I 0.5 pg/pez.

Grupo 3: Oreocromicina I 1 pg/pez.

Grupo 4: Oreocromicina I 5 pg/pez.

Grupo 5: Oreocromicina I 10 pg/pez.

Grupo 6: Oreocromicina II 0.5 pg/pez.

Grupo 7: Oreocromicina II 1 pg/pez.

Grupo 8: Oreocromicina II 5 pg/pez.

Grupo 9: Oreocromicina II 10 pg/pez.

Grupo 10: Oreocromicina III 0.5 pg/pez.

Grupo 11: Oreocromicina III 1 pg/pez.

Grupo 13: Oreocromicina III 10 pg/pez.

Despues de 15 dfas de administracion del peptido, se llevo a cabo una prueba de exposicion por inyeccion intraperitoneal de la LD50 de A. hydrophila, y se registro la mortalidad durante 7 dfas. Se calculo RPS como se 5 describio mas arriba. A los 7 dfas despues de la exposicion todos los tres peptidos mostraron un efecto dependiente de la dosis y tenfan un RPS entre 84% y 88%, en comparacion con el grupo que recibio solo PBS, el cual mostro un 10% de supervivencia.

Administracion de los peptidos por bano de inmersion

Se llevo a cabo una prueba para determinar el efecto de cada peptido administrado por banos de inmersion, sobre la 10 supervivencia de los peces despues de la exposicion a A. hidrophila. Se usaron 1300 larvas de tilapia (O. niloticus) de 5 dfas posteclosion, las cuales fueron distribuidas aleatoriamente en 13 grupos experimentales de 100 larvas cada uno. Cada peptido fue administrado a una concentracion de 0.01, 0.05, 0.1 y 0.5 mg de peptido por litro de agua durante 15 dfas. Los grupos experimentales fueron:

Grupo 1: PBS.

15 Grupo 2: Oreocromicina I 0.01 mg/L.

Grupo 3: Oreocromicina I 0.05 mg/L. - Grupo 4: Oreocromicina I 0.1 mg/L.

Grupo 5: Oreocromicina I 0.5 mg/L.

Grupo 6: Oreocromicina II 0.01 mg/L.

20 Grupo 7: Oreocromicina II 0.05 mg/L.

Grupo 8: Oreocromicina II 0.1 mg/L.

Grupo 9: Oreocromicina II 0.5 mg/L.

Grupo 10: Oreocromicina III 0.01 mg/L.

Grupo 11: Oreocromicina III 0.05 mg/L.

25 Grupo 12: Oreocromicina III 0.1 mg/L.

Grupo 13: Oreocromicina III 0.5 mg/L.

Despues de 15 dfas de administracion de los peptidos, se llevo a cabo una prueba de exposicion por la administracion por bano de inmersion de la LD50 de A. hydrophila, y la mortalidad fue registrada durante 10 dfas. Se calculo el RPS como se describio previamente. A los 10 dfas despues de la exposicion, todos los tres peptidos 30 mostraron un efecto dependiente de la dosis y un RPS entre 76% y 89%, en comparacion con el grupo que recibio solo PBS, que mostro un supervivencia del 18%.

Administracion oral como un aditivo para piensos

Se llevo a cabo una prueba para determinar el efecto de cada peptido administrado oralmente, como un aditivo para piensos, en la supervivencia de los peces despues de exposicion a A. hidrophila. Se usaron 130 tilapias (O. niloticus) 35 con un peso corporal de aproximadamente 10 g, las cuales fueron distribuidas aleatoriamente en 13 grupos experimentales de 10 larvas cada uno. Cada peptido fue administrado a una concentracion de 50, 250, 500 y 750 pg/kg de pienso durante 30 dfas. Los grupos experimentales fueron:

Grupo 1: PBS.

Grupo 2: Oreocromicina I 50 pg/Kg.

5

10

15

20

25

30

35

40

Grupo 4: Oreocromicina I 500 pg/Kg.

Grupo 5: Oreocromicina I 750 pg/Kg.

Grupo 6: Oreocromicina II 50 pg/Kg.

Grupo 7: Oreocromicina II 250 pg/Kg.

Grupo 8: Oreocromicina II 500 pg/Kg.

Grupo 9: Oreocromicina II 750 pg/Kg.

Grupo 10: Oreocromicina III 50 pg/Kg.

Grupo 11: Oreocromicina III 250 pg/Kg.

Grupo 12: Oreocromicina III 500 pg/Kg.

Grupo 13: Oreocromicina III 750 pg/Kg.

Despues de 30 dfas de administracion de los peptidos, se llevo a cabo una prueba de exposicion mediante inyeccion intraperitoneal de la LD50 de A. hydrophila, y se registro la mortalidad durante 10 dfas. Se calculo el RPS. A los 10 dfas despues de la exposicion, todos los tres peptidos mostraron un efecto dependiente de la dosis y un RPS entre 80% y 95%, en comparacion con el grupo que recibio solo PBS, el cual mostro un supervivencia del 13%.

Ejemplo 5. Determinacion de resistencia a la infeccion por Staphyloccoccus aureus o Pseudomonas aeruginosa en ratones

Se estudio la capacidad de los peptidos antimicrobianos Oreocromicina I y Oreocromicina II para proteger ratones frente a dosis letales de infeccion con bacterias S. aureus y P. aeruginosa. En este ensayo se utilizaron ratones macho (ICR) de 4 semanas de edad y con un peso corporal de 25 g. Las bacterias fueron cultivadas en caldo de triptona soja a 37°C durante 8 horas.

La cantidad de bacterias necesarias para producir entre 90 y 100% de mortalidad fue preparada diluyendo los cultivos en PBS. El numero de colonias viables fue estimado con base en la absorbancia a 550 nm y se verifico por diluciones en series sembradas del inoculo. En dependencia del microorganismo probado y la ruta de administracion, se utilizo una dosis de 4.5x106 y 1.4x109 CFU/raton.

Se infectaron 15 ratones para cada dosis y se monitorizo la supervivencia durante 7-10 dfas despues de la infeccion. En una primera prueba, los ratones recibieron 0.5 ml de pBs (control negativo) o PBS que contenfa el peptido antimicrobiano seleccionado, por inyeccion intraperitoneal, inmediatamente despues de la administracion intraperitoneal de bacteria. En una segunda prueba se administro S. aureus por via intravenosa. Inmediatamente despues de la administracion de las bacterias, los ratones recibieron 0.2 ml de PBS o PBS que contenfa peptidos antimicrobianos, por via intravenosa.

Como resultado, se encontro que los peptidos Oreocromicina I y Oreocromicina II, administrados por via intraperitoneal a una dosis de 0.5 mg/kg, reducen la mortalidad por S. aureus y P. aeruginosa de 90-100% en el grupo de control a 5-29% en los grupos tratados con los peptidos.

Para la infeccion intravenosa con S. aureus, y la administracion de peptidos a una dosis de 2.5 mg/kg, la mortalidad fue reducida de 90-100% en el control a 18-40% en los grupos tratados con los peptidos.

Ejemplo 6. Actividad de los peptidos antimicrobianos contra infeccion por un iridovirus

Se incubaron celulas EPC (Epithelioma papulosum cyprini) a 28°C, CO2 al 5% y 95% de humedad relativa, en RPMI- 1640 que contenfa 10% de suero bovino fetal, piruvato 1 mM, glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina. Los peptidos antimicrobianos de la presente invencion fueron amplificados por PCR utilizando cebadores espedficos que reconocen los extremos 5' y 3' de las secuencias de cada uno, y se insertaron en el vector pTargeT para generar plasmidos pTargeT-Oreocromicina I, pTargeT-Oreocromicina II y pTargeT- Oreocromicina III.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Las celulas EPC fueron cultivadas hasta un 90% de confluencia y transfectadas de manera transiente, con los vectores que contenfan los genes que codifican los peptidos antimicrobianos y con el vector vacfo pTargeT a una concentracion de ADN de 1 pg/mL utilizando lipofectamina 2000. La expresion de los peptidos antimicrobianos en celulas transfectadas fue analizada por RT-PCR. Los productos de PCR fueron visualizados sobre un gel de agarosa al 2%, tenidos con bromuro de etidio. A 24 horas despues de la transfeccion, cada pozo fue lavado 3 veces con PBS y tratado con diversas concentraciones de virus Rana grylio (RGV). A 48 horas despues de la infeccion, los sobrenadantes de cada pozo fueron recolectados y congelados y descongelados 3 veces. Para determinar los tftulos de RGV, se llevaron a cabo diluciones seriadas sobre sobrenadantes de medio libre de suero y las celulas fueron tituladas sobre EPC. Cada dilucion fue probada en triplicado. Los datos se representan como media ± S.E. Las diferencias entre grupos fueron analizadas utilizando pruebas de comparacion multiple a ANOVA y Dunnett.

Cuando las celulas fueron infectadas con 105, 104, 103 y 102 TCID50/ml de RGV, se observaron efectos citopaticos despues de 48 horas de incubacion en las celulas transfectadas con el vector vacfo pTargeT en comparacion con el resto de las celulas que expresaban los peptidos antimicrobianos. Los tftulos virales de las celulas que expresaban peptidos antimicrobianos fueron significativamente inferiores a los tftulos de celulas transfectadas con el vector vacfo (p<0.01) (Figura 3).

Ejemplo 7. Neutralizacion de LPS por peptidos antimicrobianos

Ademas de la actividad antimicrobiana y la posibilidad de incrementar la resistencia a la enfermedad, se estudio la capacidad de los peptidos antimicrobianos de la presente invencion para neutralizar el LPS, mediante la prueba con lisado de amebocitos de Limulus (LAL). Este ensayo detecta la presencia de LPS no neutralizado libre. Se incubaron diversas concentraciones de peptidos con 0.5 EU/ml de LPS a 37°C durante 30 minutos. Se utilizo LPS solo como control positivo del ensayo. Subsecuentemente, se agregaron 100 pL de la mezcla para igualar el volumen del reactivo LAL. La cinetica de la turbidez fue medida usando el equipo Tube Reader ATi-321 (Lab Kinetics, Reino Unido). Como se muestra en la Figura 4, los peptidos antimicrobianos de la presente invencion tienen la capacidad de neutralizar el LPS en una forma dependiente de la dosis. La EC50 de los peptidos Oreocromicina I, Oreocromicina II y Oreocromicina III fueron 1.23 pM, 1.41 pM y 2.99 pM, respectivamente.

Ejemplo 8. Uso de los peptidos antimicrobianos Oreocromicina I, Oreocromicina II y Oreocromicina III como adyuvantes moleculares

Se formaron cinco grupos experimentales de 12 tilapias (O. niloticus) cada uno. Las tilapias con peso de 50 g cada una fueron inyectadas por via intraperitoneal con PBS, celulas de A. hydrophila inactivadas con formalina y celulas de A. hydrophila inactivadas con formalina las cuales habfan recibido la adicion de cada peptido a una dosis de 1 pg/pez. Las inyecciones fueron llevadas a cabo en los dfas 0 y 14. Se extrajo sangre de la vena caudal del pez en los dfas 0 y 21 y se almaceno el suero a -20°C hasta el uso.

Los tftulos de anticuerpos aglutinante contra A. hydrophila fueron determinados por el ensayo de aglutinacion en placas de 96 pozos. Se hicieron diluciones seriadas de las muestras de suero (50 pL) en PBS y se agregaron 50 pL de celulas de A. hydrophila inactivadas con formalina (4x109 celulas/ml) a cada pozo y se mezclo exhaustivamente. Las placas fueron incubadas durante la noche a temperatura ambiente, antes de examinar la aglutinacion. Los tftulos de anticuerpo aglutinante fueron expresados como el recfproco de la dilucion de suero mas alta que da una aglutinacion positiva.

La respuesta de anticuerpo aglutinante contra A. hydrophila se muestra en la Figura 5. La observacion de los tftulos de anticuerpo aglutinante promedio a la semana 3 despues de la inmunizacion muestra que los tftulos de los grupos inyectados con celulas bacterianas inactivadas coadministradas con peptidos antimicrobianos fueron superiores a los grupos inyectados con bacterias solas (p<0.001) o con PBS (p<0.0001). Ademas, hubo diferencias significativas en los tftulos de anticuerpos entre grupos inyectados con PBS e inyectados con bacterias solas (p<0.001).

Ejemplo 9. Efecto de coinmunizacion con ovalbumina (OVA) y los peptidos antimicrobianos Oreocromicina I, Oreocromicina II y Oreocromicina III sobre la respuesta humoral e inmune celular en ratones

A) Primera programacion de inmunizacion

Se seleccionaron 24 ratones BALB/c con un peso corporal de 20 g, los cuales fueron separados en 4 grupos de prueba de 6 animales cada uno. El grupo de control negativo (PBS/OVA) fue inoculado por via intraperitoneal, en los dfas 0 y 7, con una dosis de 6 pg de OVA en 0.2 mL de PBS. Los grupos tratados con peptidos (PBS/OVA + peptido) fueron inoculados por via intraperitoneal en los dfas 0 y 7 con una dosis de 6 pg de OVA + 0.5 pg de peptido en 0.2 mL de PBS. En el dfa 15 del protocolo de inmunizacion, se extrajo sangre a los animales y se establecieron los tftulos de IgG totales.

La Figura 6 muestra los tftulos de IgG totales inducidos por inmunizacion de ratones con OVA coadministrado con

5

10

15

20

25

30

35

40

45

cada uno de los peptidos. Los animales en el grupo PBS/OVA + peptido mostraron un tftulo de IgG total especffico contra OVA estadfsticamente superior al grupo de control. El comportamiento se mantuvo para todos los peptidos.

B) Segunda programacion de inmunizacion

Se seleccionaron 64 ratones macho BALB/c, los cuales tenfan 6 semanas de edad, y fueron separados en 8 grupos experimentales de 8 ratones cada uno. La administracion de los inmunogenos fue llevada cabo por inyeccion intraperitoneal en un volumen de 0.1 mL. Los peptidos antimicrobianos fueron administrados en cantidades equimolares (0.238x1020 moleculas y 2.38x1020 moleculas). Los grupos experimentales fueron:

Grupo 1: Ratones inmunizados con PBS.

Grupo 2: Ratones inmunizados con OVA a una dosis de 5 pg/animal.

Grupo 3: Ratones inmunizados con OVA 5 pg/animal + Oreocromicina I a una dosis de 0.1 pg/animal, equivalente a 0.238x1020 moleculas/animal.

Grupo 4: Ratones inmunizados con OVA 5 pg/animal + Oreocromicina I a una dosis de 1 pg/animal, equivalente a 2.38x1020 moleculas/animal.

Grupo 5: Ratones inmunizados con OVA 5 pg/animal + Oreocromicina II a una dosis de 0.12 pg/animal, equivalente a 0.238x1020 moleculas/animal.

Grupo 6: Ratones inmunizados con OVA 5 pg/animal + Oreocromicina II a una dosis de 1.2 pg/animal, equivalente a 2.38x1020 moleculas/animal.

Grupo 7: Ratones inmunizados con OVA 5 pg/animal + Oreocromicina III a una dosis de 0.14 pg/animal, equivalente a 0.238x1020 moleculas/animal.

Grupo 8: Ratones inmunizados con OVA 5 pg/animal + Oreocromicina III a una dosis de 1.4 pg/animal, equivalente a 2.38x1020 moleculas/animal.

Los animales fueron inmunizados en los dfas 0 y 14, y se llevaron a cabo extracciones de sangre en los dfas 0, 14 y 21. Los sueros de los animales fueron usados para la determinacion de tftulos de anticuerpos especfficos (IgG, IgG1 e IgG2a total). A los 59 dfas desde el inicio del experimento se extrajo el bazo de los ratones y se determino la respuesta inmune celular contra el antfgeno OVA. El bazo fue extrafdo bajo condiciones asepticas y los esplenocitos fueron aislados y luego sembradas 2.5x105 celulas, a una concentracion de 2x106 celulas/mL en una placa de fondo redondo de 96 pozos. Las celulas fueron estimuladas con Concanavalina A (5 pg/ml) u OVA (10 pg/mL) y se incubaron a 37°C, CO2 al 5% durante 4 dfas. Los sobrenadantes de los cultivos fueron recolectados y usados para analisis de los niveles de interlecuina-4 e interferon-Y por ELISA.

Las Figuras 7A y B muestran los tftulos totales de IgG, IgG1 e IgG2a inducidos por inmunizacion de los ratones con OVA coadministrado con los peptidos Oreocromicina I, II y III. Los animales en el grupo PBS/OVA + Oreocromicina I, a una dosis de 1 pg/animal mostraron un tftulo de IgG total especffico de OVA estadfsticamente superior al grupo de control negativo (p<0.001) (Figura 7A). Los animales en los grupos PBS/OVA y PBS/OVA + Oreocromicina III a una dosis de 1.4 pg/animal tambien mostraron diferencias estadfsticamente significativas en los tftulos de IgG total en comparacion con el grupo de control negativo (p<0.05). De la misma forma, se observo que los tftulos de la IgG2a especffica contra OVA en el grupo inmunizado con PBS/OVA + Oreocromicina I, a una dosis de 1 pg/animal fueron significativamente mayores que los observado en el grupo inmunizado con OVA solo 21 dfas despues de la primera inmunizacion (p<0.05) (Figura 7B).

Los sobrenadantes del cultivo de esplenocitos estimulados con OVA a partir de animales inmunizados fueron analizados por ELISA para medir la concentracion de IFN-y e IL-4. Como se muestra en la Figura 8, los niveles mas altos de IFN-y se obtienen en animales inmunizados con OVA coadministrada con el peptido Oreocromicina III en una forma dependiente de la dosis. Estos niveles fueron significativamente mas altos que los niveles obtenidos en esplenocitos a partir de animales inmunizados con OVA o PBS solo (p<0.001). Adicionalmente, los niveles de secrecion de IFN-y en animales inmunizados con OVA coadministrado con el peptido Oreocromicina II a una dosis de 1.2 pg/animal fueron significativamente mas altos que los niveles obtenidos en esplenocitos de animales inmunizados con OVA o PBS solos (p<0.05) (Figura 8). No hubo secrecion de IL-4 en ningun grupo bajo las condiciones experimentales empleadas.

Ejemplo 10. Efecto de coinmunizacion del antfgeno MY32 y el peptido Oreocromicina I sobre la respuesta inmune humoral en tilapia

Claims

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15

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30

35

40

45

REIVINDICACIONES

1. Peptido caracterizado por comprender una secuencia de aminoacidos seleccionado del grupo consistente de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 3, o una secuencia de aminoacidos con al menos 80% de identidad con la SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 3 con actividad antimicrobiana.
2. El peptido de acuerdo con la reivindicacion 1 obtenido por aislamiento a partir de su fuente natural, por sfntesis qufmica o por tecnologfa de ADN recombinante.
3. El peptido de acuerdo con la reivindicacion 2 obtenido por expresion en bacterias, levaduras o celulas de organismos superiores.
4. Un acido nucleico caracterizado por comprender una secuencia de acidos nucleicos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 y SEQ ID No. 6.
5. Un acido nucleico que codifica un peptido que tiene una secuencia de aminoacidos que comprende una secuencia identificada como SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 3, o una secuencia de aminoacidos con al menos 80% de identidad con SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 3 con actividad antimicrobiana.
6. Composicion antimicrobiana adecuada para el control de patogenos caracterizada por que comprende un peptido

que tiene una secuencia identificada como SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 3, o una secuencia de

aminoacidos con al menos 80% de identidad con SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 3 con actividad

antimicrobiana.
7. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 6 en donde el peptido es obtenido por aislamiento a partir de su fuente natural, por sfntesis qufmica o por tecnologfa de ADN recombinante.
8. Composicion para uso en el control de patogenos caracterizada porque comprende un peptido que tiene una

secuencia de aminoacidos identificada como SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 o sEq ID No. 3, o una secuencia de

aminoacidos con al menos 80% de identidad con SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 3 con actividad

antimicrobiana.
9. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde dichos patogenos son patogenos bacterianos, virales y fungicos que afectan mamfferos y organismos acuaticos y en donde dicho uso comprende administracion preventiva o terapeutica.
10. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde dicho uso comprende la administracion por ruta oral, ruta parenteral o por banos de inmersion.
11. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde dicho uso comprende la administracion a mamfferos y organismos acuaticos.
12. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en donde el uso comprende la administracion del peptido a peces, preferiblemente por inyecciones periodicas a concentraciones entre 0.1 y 10 pg de peptido/pez, por banos de inmersion a una concentracion entre 0.01 y 0.1 pg de peptido/litro de agua, o como un aditivo para pienso a una concentracion de aproximadamente 50-750 pg de peptido/kg de pienso.
13. Composicion de vacuna que comprende un peptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionado del grupo consistente de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 3, o una secuencia de aminoacidos con al menos 80% de identidad con SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 3, como un adyuvante molecular, y un antfgeno de vacuna.
14. La composicion de vacuna de la reivindicacion 13 para uso en inmunizacion en donde el peptido usado como un adyuvante de vacuna y el antfgeno son administrados simultaneamente, separadamente o secuencialmente durante la misma programacion de inmunizacion.
15. Un peptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo consistente de SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 3 o una secuencia de aminoacidos con al menos 80% de identidad con SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 3, en donde dicho peptido es un adyuvante molecular en una vacuna, para uso en potenciar la respuesta inmune contra un antfgeno de vacuna.