ES2710785T3 - Péptidos antimicrobianos basados en CMAP27 - Google Patents

Abstract

Derivados de CMAP27 que consisten en la secuencia de aminoácidos general RX1GRX2LRKIRRX3X4 en la que X1, X2 y X3 pueden ser independientemente F, L, W o Y y X4 pueden tener 0-9 aminoácidos y en la que además dichos derivados están amidados en terminal C.

Description

DESCRIPCION

Peptidos antimicrobianos basados en CMAP27

La invencion

La invencion se relaciona con el campo de antibioticos, mas espedficamente con peptidos antibioticos, especialmente derivados de CMAP27.

Introduccion

El siempre creciente numero de patogenos resistentes a multiples farmacos ha impulsado la necesidad de nuevos antibioticos. Los cientificos en la ultima decada han colocado mucho esfuerzo en el desarrollo agentes de antibacterianos novedosos, asf como la mejora de los agentes quimioterapeuticos actuales. En forma interesante, muchos mairnferos e insectos tienen destacada resistencia a la infeccion bacteriana, debido a su capacidad de producir peptidos cationicos de tamano pequeno. Esta forma de proteccion, una parte importante del sistema inmunitario innato, proporciona una primera lmea de defensa contra los patogenos invasores. Muchos cientificos han enfocado su atencion en estos peptidos antimicrobianos (AMP) ya que actualmente se consideran un grupo importante de antibioticos potencialmente novedosos.

Hasta ahora, se han aislado muchos tipos de peptidos antimicrobianos y secuencias de diversas fuentes durante decadas pasadas (para resenas seleccionadas, vease: Otvos Jr., L. Cell. Mol. Life Sci. 2002, 59:1138; Otvos, Jr., L. J. Peptide Sci. 2000, 6:497; Tan, Y.-T. et al., Mol. Med. Today 2000, 6:309; Scott, M.G. and Hancock, R.E.W., Crit. Rev. Immunol. 2000, 20:407; Hancock, R.E.W. and Chapple, D.S. Antimicrob. Agents Chemotlzer. 1999, 43:1317; Hetru, C. et al., In: Molecular Mechanisms of Immune Responses in Insects; Brey, P. and Hultmark, D. Ed., Chapman and Hall, London, 1998, pp. 40-66; Hancock, R.E.W. et al., Adv. Microb. Physiol. 199537:135; Vaara, M. Microbiol. Rev. 1992, 395). Dentro de la mayona de peptidos antimicrobianos de marnfferos y aves descubiertos hasta la fecha pertenecen a la superfamilia catelicidina y defensina. Se ha encontrado ampliamente que las catelicidinas se distribuyen entre especies divergentes, es decir, en mamfferos, aves, peces y reptiles, lo que indica su importancia evolutiva, pero su repertorio difiere considerablemente entre especies. Los peptidos antimicrobianos de la familia catelicidina se codifican en el genoma como prepropeptidos y se dividen proteoltticamente para formar peptidos biologicamente activos que vanan de 12 a 97 aminoacidos (Ramanathan, B. et al., 2002, Microbes Infect. 4:361­ 372). Basados en su estructura tfpica primaria y secundaria, los peptidos de terminal C liberados se pueden dividir en cuatro clases principales, a saber 1) peptidos a-helicoidales, peptidos lineales, que adoptan una estructura anfipaticos cuando estan en contacto con entornos que imitan las membranas biologicas (LL-37, Agerberth, B., et al., PⁿA^s 1995, 92:195; SMAP-29, Anderson, R. C., et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2004, 48:673); 2) peptidos phorquilla, peptidos dclicos cortos formados por uno o dos puentes de disulfuro intramoleculares (protegrins, Kokryakov, V. N., et al., FEBS Lett. 1993, 327:231; dodecapeptide, Romeo, D., et al., J. Biol. Chem. 1988, 263:9573); 3) peptidos ricos en triptofano (indolicidina) (Indolicidin, Selsted, M. E., et al., J. Biol. Chem. 1992, 267:4292) y 4) peptidos ricos en prolina/arginina (bactenecins, Gennaro, R., et al., Infect. Immun. 1989, 57:3142; PR39, Agerberth, B., et al., Eur. J. Biochem. 1991, 202:849).

La mayona de catelicidinas muestran una amplia actividad contra diversas bacterias Gram-positivas y Gramnegativas, hongos, protozoarios y virus con envoltura (Zaiou, M. and Gallo, R.L., 2002, J. Mol. Med. 80:549-561). Van Dijk et al., (2005, Vet. Immunol. Immunopath. 106:321-327) que encuentran una nueva protema de la familia catelicidina en pollos. Este pertenece al grupo de peptidos 1 (a-helicoidal) y se han denominado CMAP27, pero tambien se conocen como CATH-2. Al igual que otros miembros de la familia catelicidina el CMAP27 se codifica como un prepropeptido (154 aminoacidos) y despues de procesamiento proteolftico, se libera un peptido de terminal C largo de 27 aminoacidos que ha demostrado potente actividad antimicrobiana de amplio espectro. La secuencia de aminoacidos de este peptido de terminal C, denominado CMAP27, es RFGRFLRKIRRFRPkVt ITIQGSARFG.

Resumen de la invencion

Se ha encontrado sorprendentemente que el terminal C truncado y amidado se deriva del CMAP27 y las variantes del mismo producen peptidos antimicrobianos con igual actividad o actividad antimicrobiana y/o inmunomoduladora mas potente y que, en forma importante, no afectan las celulas sangumeas humanas.

De esta manera la invencion se dirige a derivados CMAP27 novedosos que tienen la secuencia de aminoacidos general RX1GRX2LRKIRRX3X4

En la que X1, X2 y X3 pueden ser independiente F, L, W, o Y, y X4 puede tener de 0-9 aminoacidos, preferiblemente la secuencia de aminoacidos R, RX5K, RX5KVT o RX5KVTITIQ, en el que X5 es P, G o L, preferiblemente P.

Tambien parte de la invencion son los metodos para producir los compuestos antibioticos novedosos mencionados anteriormente.

Parte adicional de la invencion son las composiciones farmaceuticas que comprenden uno o mas de los peptidos de la invencion, sea o no en la presencia de otros compuestos farmaceuticamente activos.

Tambien parte de la invencion es el uso de un peptido de acuerdo con la invencion como un farmaceutico y/o para la preparacion de un medicamento que se puede utilizar como un antibiotico.

En otra realizacion la invencion comprende el uso de CMAP27 y los derivados de CMAP27 como se describio anteriormente para reforzar la respuesta inmunitaria. Preferiblemente dicho uso se logra al utilizarlos como adyuvantes en preparaciones de vacunas.

Descripcion detallada de la invencion

El “CMAP27” como se utiliza aqrn se define como la protema que tiene la secuencia de aminoacidos RFGRFLRKIRRFRPKVTITIQGSARFG, pero tambien la version amidada de terminal C RFGRFLRKIRRFRPKVTITIQGSARF-NH2, tambien denominada como CMAP1-26-NH2, que esta comprendida en esta definicion. Se sugiere que el CMAP1-26-NH2 es la forma activa del peptido, en razon a que este se conoce en las catelicidinas cuya amidacion del residuo de glicina del terminal C agrega funcionalidad (Shinnar, A.E. et al., 2003, Bioorg. Chem. 31:425-436; Tomasinsig, I. And Zanetti, M, 2005, Curr. Prot. Pept. Sci. 6:23-34).

Los inventores han encontrado que las versiones truncadas C amidadas y mutadas del peptido CMAP27 tienen una excelente actividad antimicrobiana, asf como propiedades inmunomoduladoras, que normalmente refuerzan la respuesta inmunitaria y se prefieren como compuestos terapeuticos, debido a que tienen un efecto menos pronunciado en las celulas sangumeas. Como se muestra en la parte experimental, la actividad hemolttica de los nuevos peptidos antimicrobianos de la invencion es menor que la actividad hemolttica del CMAP27. Adicionalmente, los peptidos de la invencion tienen, por lo menos en diversas clases, muestran una mejor actividad inmunomoduladora que el CMAP27. Este ultimo efecto es importante, ya que potencia el efecto antimicrobiano del peptido.

Los peptidos de la presente invencion son formas truncadas del peptido CMAP27 y variantes de los mismos, indicados generalmente aqrn como derivados CMAP27. Los peptidos se truncan en el terminal C del peptido CMAP27 y pueden tener una longitud de 12-21 aminoacidos. Aparentemente de esta manera, la parte rica en arginina del peptido CMAP27 es responsable del efecto antimicrobiano e inmunomodulador.

Adicionalmente, se ha observado que los derivados CMAP27 (con algunos de los aminoacidos sustituidos por otros aminoacidos que aparecen en forma natural), tienen actividad antimicrobiana, e inmunomoduladora alterada y, lo que es importante, en el cual se mantiene baja la actividad hemolftica. Adicionalmente, mientras que el CMAP27 se mantiene activo en bacterias del tipo Gram(-), nuestros experimentos han mostrado que diversos derivados del CMAP27 tambien son efectivos contra bacterias del tipo Gram(+) tal como Streptococcus aureus y Bacillus anthracis. No necesita explicacion adicional darse cuenta de que dicha ampliacion del espectro antibiotico es un hallazgo clmicamente muy importante y relevante.

Las substituciones que han sido probadas todas estan involucradas con cambios en la parte hidrofila del CMAP27 de terminal C truncado (1-15) anfipatico. Se ha mostrado que la sustitucion de uno o mas de los residuos Phe en esta molecula con leucina o triptofano resulta en una molecula con actividad alterada para CMAP27 o su forma truncada. Basado en estas sustituciones es razonable que las sustituciones de triptofano de los otros aminoacidos en el plano hidrofobico del peptido, es decir leucina 6 e isoleucina 9, puedan mejorar en forma similar la actividad antibacteriana e inmunomoduladora del CMAP27 o cualquiera de los derivados CMAP27 presentados.

Las sustituciones de aminoacidos pueden alterar significativamente el intrincado balance entre la anfipaticidad del peptido, carga neta, propension para formacion de helice, parametros que se vinculan con la estabilidad de los peptidos (formacion de autoagregados en soluciones acuosas) y su union a y perturbacion de membranas biologicas. Mas aun, las sustituciones de aminoacidos sencillas o multiples pueden hacer variantes de peptidos menos citotoxicas, aunque mantienen actividades microbicidas y/o inmunomoduladoras. Adicionalmente, las sustituciones de aminoacidos pueden proporcionar proteccion parcial contra enzimas proteoltticas.

De los resultados tambien parece que el residuo arginina en la posicion 1 del CMAP27 es importante para la actividad antimicrobiana, en razon a que todos los peptidos probados en donde se elimina este primer residuo no mostraron o solo mostraron diffcilmente alguna actividad antimicrobiana. La situacion en el extremo del terminal C del peptido truncado parece menos restringida, de esta manera permitina la modificacion adicional del extremo de terminal C del derivado CMAP27. La modificacion de uno o ambos terminales pueden incluir la acetilacion del terminal N y/o la amidacion del terminal, modificaciones que han demostrado proteccion contra exoproteases y en esa forma prolongan significativamente el tiempo de vida util invivo de peptidos pequenos (Brinckerhoff, L.H. et al., In. J. Cancer 1999, 83:326). La modificacion de uno o ambos terminales permite el acoplamiento del peptido u otros grupos funcionales, tal como otras secuencias de aminoacidos (creando por lo tanto posiblemente protemas multimericas), u otras biomoleculas, que pueden funcionar como portadores o etiquetas. En una realizacion espedfica la molecula portadora tambien funciona como una molecula objetivo, que es capaz de localizar la infeccion bacteriana y puede unirse a la bacteria, con el fin de llevar el antibiotico en la vecindad de la celula (bacteria) para atacarla.

El termino “peptido” como se utiliza aqu significa una secuencia de aminoacidos acoplados mediante un enlace de peptidos, en los que los aminoacidos son uno de los veinte aminoacidos que constituyen el peptido naturalmente y en el que los aminoacidos pueden estar en la configuracion L o en la configuracion D, o, para isoleucina y treonina en la configuracion D-allo (solo inversion en uno de los centros quirales). Un peptido de acuerdo con la invencion puede ser lineal, es decir, en el que el primero y ultimo de los aminoacidos de la secuencia tiene un grupo NH2- o COOH respectivamente o tienen terminal N- (acetilacion) y/o terminal C (amidacion) modificadas.

Los peptidos de la invencion se pueden producir sinteticamente o, cuando aplica, recombinantemente mediante metodos convencionales. Las realizaciones espedficas de los peptidos antibioticos derivados de CMAP27 se describen en detalle en la parte experimental adelante. Preferiblemente, los peptidos o derivados de peptidos de la invencion se preparan convencionalmente mediante tecnicas de smtesis qrnmica conocida, tal como, por ejemplo, las que se describen por Merrifield (J. Am. Chem. Soc. (1963) 85:2149-2154).

Alternativamente, los peptidos de la invencion se pueden producir mediante tecnicas de ADN recombinante al clonar y expresar dentro un microorganismo anfitrion o celula un fragmento de ADN que lleva una secuencia de acido nucleico que codifica uno de los peptidos descritos anteriormente. Las secuencias de codificacion de acido nucleico se pueden preparar sinteticamente, o se pueden derivar de secuencias de acido nucleico existentes (por ejemplo, la codificacion de secuencia para CMAP27 tipo silvestre) mediante mutagenesis dirigida al sitio. Estas secuencias de acido nucleico se pueden clonar luego en un vector de expresion adecuado y transformar o transfectar en una celula huesped adecuada, tal como E. coli, Bacillus, Lactobacillus, Streptomyces, celulas de marnfferos (tal como celulas CHO, HEK o COS-1), levaduras (por ejemplo Saccharomyces, Schizophyllum), celulas de insectos o sistemas de expresion vmcos, tal como sistemas baculovirus, o celulas vegetales. Un experto en la tecnica tendra el conocimiento de las tecnicas de construccion de secuencias de acidos nucleicos y proporcionara medios para permitir su expresion.

Espedficamente se pueden utilizar celulas de vegetales ventajosamente para expresion de los peptidos de la invencion, en razon a que el peptido en dicho caso se puede administrar directamente a un humano o animal, es decir, sin ninguna purificacion adicional.

Posteriormente, el peptido se puede aislar del cultivo de las celulas anfitrionas. Esto se puede lograr mediante tecnicas de aislamiento y purificacion de protema comunes, que estan disponibles en la tecnica. Dichas tecnicas pueden por ejemplo implicar immunoadsorcion o cromatograffa. Tambien es posible proporcionar los peptidos con una etiqueta (tal como etiqueta histidina) durante la smtesis, lo que permite una rapida union y purificacion, despues de lo cual la etiqueta se retira enzimaticamente para obtener el peptido activo.

Alternativamente, los peptidos se pueden producir en sistemas libres de celulas, tal como el sistema libre de celulas Expressway™ de Invitrogen.

Algunos resumenes abreviados de metodos que se pueden aplicar en la preparacion de peptidos se describen en: W. F. Anderson, Nature 392 Supp., 30 April 1998, p. 25-30; Pharmaceutical Biotechnology, Ed. D. J. A. Crommelin and R. D. Sindelar, Harwood Academic Publishers, 1997, p. 53-70, 167-180, 123-152, 8-20; Protein Synthesis: Methods and Protocols, Ed. R. Martin, Humana Press, 1998, p. 1-442; Solid-Phase Peptide Synthesis, Ed. G. B. Fields, Academic Press, 1997, p. 1-780; Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press, 1997, p. 1-89.

Peptidos novedosos de acuerdo con la formula de la reivindicacion 1 se pueden preparar facilmente por el experto en la tecnica.

Los derivados CMAP27 de la invencion se pueden utilizar solos o en combinacion en la forma de multfmeros. Combinaciones de peptidos adecuadas de la invencion comprenden concatemeros de peptidos de la invencion acoplados en serie a cada uno a traves de separadores, por ejemplo en la forma de un dfmero peptido, un tnmero peptido, etc., en el que los peptidos individuales se alinean posteriormente. Los peptidos sencillos o cadenas peptidomimeticas se pueden acoplar a una protema biocompatible, tal como albumina de suero humana, anticuerpo humanizado, liposoma, micelas, polfmeros sinteticos, nanopartfculas, y fagos. Alternativamente, multimeros de peptidos individualmente combinados de la invencion se pueden preparar en la forma de dendnmeros, o grupos, en el que se ligan tres o mas peptidos a un centro comun.

Aun otras combinaciones en la forma de multfmeros se pueden formar mediante perlas sobre el sustrato del cual se exponen los peptidos de la invencion. Las perlas pueden funcionar luego como un portador para los peptidos y pueden funcionar de manera similar como una etiqueta detectable. Los multfmeros pueden, por ejemplo, ser preparados al biotinilar el terminal N de las cadenas de peptidos y posterior formacion de complejos con estreptavidina. En razon a que la estreptavidina es capaz de unirse a las moleculas 4 biotina o conjugados con alta afinidad, se pueden formar complejos de peptidos tetramericos muy estables mediante este metodo. Los multfmeros se pueden componer de peptidos identicos o diferentes o peptidomimeticos de acuerdo con la invencion. Preferiblemente, sin embargo, los multfmeros de la invencion estan compuestos de dos o mas peptidos o peptidomimeticos, en los que cada componente constituye un activo de la actividad biocida total (focalizacion, actividad antimicrobiana, barrido).

Una composicion farmaceutica de la invencion comprende una cantidad terapeuticamente efectiva de uno o mas derivados de CMAP27 de la presente invencion. Una vez formuladas, las composiciones farmaceuticas de la invencion se pueden administrar directamente al sujeto en un metodo para tratar infeccion bacteriana que comprende administrar a un sujeto en necesidad de este una cantidad terapeuticamente efectiva de la composicion de la invencion.

Suministro directo de las composiciones en general se lograra mediante la aplicacion topica u otras formas de administracion, ya sea oralmente, parenteralmente, subcutaneamente, sublingualmente, intralesionalmente, intraperitonealmente, intravenosamente o intramuscularmente, pulmonarmente, o suministrada al espacio intersticial de un tejido.

La composicion farmaceutica tambien puede comprender un portador farmaceuticamente adecuado aceptable o diluyente y puede estar en la forma de una capsula, comprimido, pastilla, gragea, pfldora, gotica, supositorio, polvo, aerosol, vacuna, unguento, pasta, crema, inhalante, parche, aerosol, y similares. Como portador farmaceuticamente aceptable, se pueden utilizar cualquier disolvente, diluyente u otro vehfculo lfquido, auxiliar de dispersion o suspension, agente activo de superficie, agente isotonico, agente espesante o emulsificante, conservante, agente de encapsulacion, aglutinante solido o lubricante lo que sea mas adecuado para una forma de dosificacion particular y que es compatible con el peptido o conjugado del peptido.

Una composicion farmaceutica puede contener de esta manera un portador farmaceuticamente aceptable. El termino “portador farmaceuticamente aceptable” tambien incluye un portador para administracion de un agente terapeutico, tal como anticuerpos o un polipeptido, genes, y otros agentes terapeuticos. El termino se refiere a cualquier portador farmaceutico que no induce por sf mismo la produccion de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composicion, y que se puede administrar sin exceso de toxicidad. Los portadores adecuados pueden ser moleculas grandes, lentamente metabolizadas tal como protemas, polisacaridos, acidos polilacticos, acidos poliglicolicos, aminoacidos polfmericos, copolfmeros de aminoacidos y partfculas inactivas de virus. Dichos portadores son bien conocidos por los expertos en la tecnica.

Las sales de los peptidos o equivalentes funcionales se preparan mediante metodos conocidos, que normalmente implican la mezcla del peptido con un acido farmaceuticamente aceptable para formar una sal de adicion acida o con una base farmaceuticamente aceptable para formar una sal de adicion basica. El experto en la tecnica puede decidir facilmente si un acido o una base es farmaceuticamente aceptable despues de tomar en consideracion el uso pretendido espedfico del compuesto. Por ejemplo, no todos los acidos y bases que son aceptables para aplicaciones exvivo se pueden utilizar para composiciones terapeuticas. Dependiendo del uso pretendido, los acidos farmaceuticamente aceptables incluyen acidos organicos e inorganicos tal como acido formico, acido acetico, acido propionico, acido lactico, acido glicolico, acido oxalico, acido piruvico, acido sucdnico, acido maleico, acido malonico, acido cinamico, acido sulfurico, acido clorddrico, acido bromddrico, acido dtrico, acido perclorico, acido fosforico, y acido tiocianico, que forman sales de amonio con grupos amino libres de peptidos y equivalentes funcionales. Bases farmaceuticamente aceptables, que forman sales de carboxilato con grupos de peptidos carboxflicos libres y equivalentes funcionales, incluyen etilamina, metilamina, dimetilamina, trietilamina, isopropilamina, Diisopropilamina, y otras mono-, di y trialquilaminas, asf como arilaminas. Mas aun, tambien se abarcan solvatos farmaceuticamente aceptables.

Se pueden utilizar aqrn sales farmaceuticamente aceptables, por ejemplo, sales acidas minerales tal como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de acidos organicos tal como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Se encuentra disponible una discusion a fondo de los excipientes farmaceuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).

Portadores farmaceuticamente aceptables en composiciones terapeuticas pueden contener lfquidos tal como agua, solucion salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, sustancias auxiliares, tal como agentes humectantes o emulsificantes, sustancias reguladoras del pH y similares, pueden estar presentes en dichos vedculos. Normalmente, tambien se pueden preparar composiciones terapeuticas como soluciones o suspensiones inyectables como lfquidos; formas solidas adecuadas para solucion en, o suspension en, vedculos lfquidos antes de inyeccion.

Para tratamiento terapeutico, se puede producir el peptido o peptido-conjugado como se describio anteriormente y aplicar al sujeto en necesidad del mismo. El peptido o peptido conjugado se puede administrar a un sujeto mediante cualquier ruta adecuada, preferiblemente en la forma de una composicion farmaceutica adaptada a dicha ruta y en una dosificacion que es efectiva para el tratamiento pretendido.

Las composiciones farmaceuticas de esta invencion pueden contener otros agentes activos, tal como antibioticos convencionales (como por ejemplo, vancomicina, estreptomicina, tetraciclina, penicilina) u otros compuestos antimicrobianos, tal como antifungicos, por ejemplo itraconazol o miconazol. Tambien se pueden agregar compuestos que alivian otros sfntomas de infeccion, tal como fiebre (por ejemplo, acido salidlico) o erupcion cutanea.

Las dosificaciones terapeuticamente efectivas del peptido o conjugado de peptido requerido para tratamiento de una infeccion bacteriana en el cuerpo de un sujeto humano o animal, pueden ser determinadas facilmente por el experto en la tecnica, por ejemplo al utilizar modelos animales.

El termino “cantidad terapeuticamente efectiva” como se utiliza aqrn se refiere a una cantidad de un terapeutico, viz. un peptido o conjugado de peptido de acuerdo con la presente invencion, para reducir o evitar el crecimiento y colonizacion de bacterias, o exhibir un efecto terapeutico o profilactico detectable. El efecto se puede detectar, por ejemplo, al cultivar biopsias y ensayar la actividad bacteriana o mediante cualquier otro metodo adecuado para evaluar el progreso o severidad de la infeccion bacteriana. La cantidad efectiva precisa para un sujeto dependera de la salud y el tamano del sujeto, la naturaleza y alcance de la afeccion, y los terapeuticos o combinacion de terapeuticos seleccionados para administracion. De esta manera, no es util especificar por adelantado una cantidad efectiva exacta. Sin embargo, la cantidad efectiva para una situacion dada se puede determinar mediante experimentacion de rutina y esta dentro del juicio del medico o experimentador. Espedficamente, las composiciones de la presente invencion se pueden utilizar para reducir o evitar la infeccion bacteriana y/o acompanar manifestaciones ffsicas o biologicas, tal como la reduccion de la fiebre. Los metodos que permiten al medico establecer las dosificaciones iniciales son conocidos en la tecnica. Las dosificaciones determinadas que se van a administrar deben ser seguras y eficaces.

Para los propositos de la presente invencion, una dosis efectiva sera de aproximadamente 0.01 pg/kg a 50 mg/kg, preferiblemente 0.5 pg/kg a aproximadamente 10 mg/kg del peptido o conjugado de peptido en el individuo al que se administra. El experto puede determinar facilmente las dosificaciones para alcanzar los efectos terapeuticos de la composicion farmaceutica descrita aquf

Aun en otra realizacion alterna, el peptido o conjugado de peptido o composiciones de la invencion se pueden administrar a partir de una matriz de liberacion controlada o sostenida insertada en el cuerpo del sujeto.

Tambien puede ser ventajoso administrar un compuesto de la invencion en una forma de dosificacion de transmucosa. Esta ruta de administracion no es invasiva y es amigable con el paciente; al mismo tiempo puede conducir a una biodisponibilidad mejorada del compuesto en comparacion con administracion oral, espedficamente si el compuesto no es estable en los fluidos del sistema digestivo, o si es muy grande para ser absorbida desde el intestino en forma efectiva. La administracion por transmucosa es posible, por ejemplo, por via nasal, bucal, sublingual, gingival o formas de dosificacion vaginal. Estas formas de dosificacion se pueden preparar mediante tecnicas conocidas; se pueden formular para representar gotas nasales o pulverizaciones, insertos, pelfculas, parches, geles, unguentos o comprimidos. Preferiblemente, los excipientes utilizados para la forma de dosificacion de transmucosa incluyen una o mas sustancias que proporcionan mucoadhesion, prolongando de esta manera el tiempo de contacto de la forma de dosificacion con el sitio de absorcion y por lo tanto aumentar potencialmente el grado de absorcion.

En una realizacion adicional, los compuestos se administran a traves de la ruta pulmonar, utilizando un inhalador de dosis medida, un nebulizador, un pulverizador de aerosol o un inhalador de polvo seco. Se pueden preparar formulaciones adecuadas mediante metodos y tecnicas conocidos. En algunos casos tambien puede ser factible la administracion transdermica, rectal, u ocular.

Puede ser ventajoso utilizar metodos dirigidos o de suministro de farmacos por adelantado para suministrar un compuesto de la invencion en forma mas efectiva. Por ejemplo, si se selecciona una ruta de administracion no parenteral, una forma de dosificacion adecuada puede contener un agente mejorador de la biodisponibilidad, que puede ser cualquier sustancia o mezcla de sustancias que aumenta la disponibilidad del compuesto. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la proteccion de la degradacion del compuesto, tal como mediante un inhibidor de enzimas o un antioxidante. Mas preferiblemente, el agente mejorador aumenta la biodisponibilidad del compuesto aumentando la permeabilidad de la barrera de absorcion, normalmente es una mucosa. Los mejoradores de permeacion pueden activarse a traves de diversos mecanismos; en algunos casos la fluidez de las membranas de mucosas, mientras que otros abren o amplfan el espacio de las uniones entre las celulas de la mucosa. Todavfa otros reducen la viscosidad de la mucosa que cubre la capa de celula de mucosa. Entre los mejoradores de biodisponibilidad preferidos estan las sustancias anfifflicas tal como derivados de acido colico, fosfolfpidos, etanol, acidos grasos, acido oleico, derivados de acido graso, EDTA, carbomeros, policarbofilos y quitosano.

Indicadores para los cuales los derivados CMAP27 de la invencion se pueden utilizar son infecciones bacterianas mediante bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, tal como E. coli, Agrobacterium tumefaciens, Salmonella typhimurum, Erwinia carotovora, E. herbicola, E. chrysanthemi, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae, Francisella tularensis, Bacillus anthracis, Bacillus megaterium, Clostridium botulinum, Vibria cholerae, Bacillus anthracis, Brucella spp., Coxiella burnetii, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis, Pasteurella aeruginosa, Pneumococcus spp., Salmonella spp., Streptococcus spp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyrogenes, Micrococcus luteus, Moraxella, Neisseria ghonnorhoea, Aerobacter, Borellia.

Y luego del uso terapeutico para el tratamiento de infecciones, tambien en armas biologicas, tambien es posible utilizar los peptidos antibioticos de la invencion en una composicion bactericida que se puede utilizar para limpiar las superficies y/o equipo. Otro campo de aplicacion es en el empaque, en donde los peptidos se pueden vincular o incorporar en el material de empaque para el empaque de alimentos u otro material que es facilmente degradable por microorganismos. Los derivados CMAP27 de la invencion se pueden utilizar espedficamente para empaque, ya que no son toxicos luego de contacto o ingestion.

En otra realizacion de la invencion, los derivados CMAP27, tambien el CMAP27 de longitud completa o su version amidada CMAP1-26-NH2, se pueden utilizar para reforzar el sistema inmunitario. En este aspecto pueden ser parte de las composiciones inmunologicas, especialmente composiciones de vacuna, en la que pueden actuar como coadyuvantes. Un adyuvante es una sustancia que mejora la respuesta inmunitaria estimulada mediante un antfgeno cuando se administra con el antfgeno. De acuerdo con lo anterior, parte de la invencion son las composiciones inmunologicas que comprenden un antfgeno y uno o mas peptidos CMAP27 seleccionados del grupo que consiste de derivados de CMAP27 como se describe aqrn, el CMAP27 de longitud completa y su version amidada CMAP1-26-NH2. De manera similar tambien las composiciones de vacuna que comprenden un antfgeno y uno o mas peptidos CMAP27 seleccionados del grupo que consiste de derivados CMAP27 como se describe aqm, el CMAP27 de longitud completa y su version amidada CMAP1 -26-NH2 hacen parte de la presente invencion, debido al uso de los compuestos mencionados anteriormente como adyuvante.

Ejemplos

Ejemplo 1 Actividad antimicrobiana

Aislados de bacterias de por ejemplo Vibrio cholerae (BM301), Staphylococcus aureus (BM253), Bacillus anthracis (BM233) y Yersinia pestis (BM360) se sembraron en un medio de agar soya Triptico (TSA). Para cada uno de estos cultivos celulares se utilizo una colonia que se va sembrar en medio del fluido de infusion de cerebro corazon (BHI). Los cultivos bacterianos se cultivaron durante la noche a 35°C bajo condiciones aerobicas. Se realizaron ensayos antibacterianos en placas de 100 pozos de panal (Labsystems 2 placas, con cubierta de 100 pcs, art. N° 9502550) con un volumen final de 100 pl BHI por pozo. Se diluyeron peptidos de prueba en BHI para dar una concentracion inicial de 250 pg/ml y se diluyo adicionalmente en serie. El cultivo bacteriano fue diluido 1:10 en HBI y despues de 2 horas de cultivo adicional se diluyo a una concentracion de aproximadamente 106 CFU/mL y se inoculo en pozos de placa de micro tftulo (10 pL). Las placas se incubaron mientras se agito gentilmente a 37°C durante 16 h y durante este tiempo se midio el crecimiento bacteriano en 600 nm, utilizando a BioScreen C MB R. Despues de 16 horas, se calculo la densidad celular exacta al cultivar en placas series de dilucion (100 pL) en placas de TSA (por duplicado). El porcentaje de crecimiento se calculo mediante la relacion del mdice de crecimiento de las bacterias de control y el mdice de crecimiento de las bacterias tratadas con peptido.

La secuencia de aminoacidos de los peptidos ensayados y la calificacion de su actividad antimicrobiana se presentan en la Tabla 1.

Ejemplo 2 Actividad hemolttica

Se recolectaron eritrocitos de individuos humanos saludables y pollos mediante centrifugacion a 75*g durante 15 min. Las celulas se lavaron tres veces en PBS, se complementaron con 287 mM de glucosa como osmoprotector. La suspension celular se normalizo a un valor de hemoglobina de 2 mmol/l en PBS o regulador de fosfato de glucosa isotonico. En una placa de microtttulo (Greiner) de fondo V de 96 pozos, se agrego 100 pl de esta suspension por triplicado a 100 pl de series de dilucion de peptidos en el mismo regulador, iniciando con una concentracion de 100 pM. Despues de 1 h de incubacion a 37°C, las placas de microtftulo se centrifugaron a 550*g durante 5 min y se midio la absorbancia en el sobrenadante en 450 nm. Se alcanzo hemolisis completa mediante la adicion de Tween-20 al 1%. Se calculo el porcentaje de hemolisis como sigue: [(A450 del peptido tratado muestra-A450 de la muestra tratada con regulador)/(A450 de Tween-20 tratado muestra-A450 de muestra tratada con regulador)] * 100%. Los resultados se dan en las Tablas 1 y 2 de acuerdo con el siguiente esquema:

Clasificacion de hemolisis

> 75% de muertes celulares +

> 50% de muertes celulares

> 25% de muertes celulares /-

< 25% de muertes celulares

< 5% de muertes celulares

Ejemplo 3 Actividad inmunomoduladora: Neutralizacion de LPS

Luego de seleccion de la actividad hemolttica y antimicrobiana, los derivados CMAP27 de la invencion tambien se han ensayado para detectar sus actividades inmunomoduladoras.

Una de las propiedades inmunomoduladores probadas es la capacidad neutralizante dirigida contra una respuesta inmunitaria abundante y perjudicial contra endotoxinas, tal como LPS (lipopolisacaridos). Se realizo un ensayo que permitio determinar la capacidad neutralizante LPS del CMAP27 y derivados del CMAP27 en la presencia de celulas humanas primarias (PBMC: celulas mononucleares de sangre periferica), una estirpe de celula humana (THP-1: estirpe de celula de leucemia monodtica aguda humana) y una estirpe de celulas de pollo (HD11: estirpe de celula macrofaga de pollo).

Las celulas PBMC y THP-1 se cultivaron en placas de 96 pozos (1 * 106 celulas/pozos). Se cultivaron celulas HD11 en placas de 96 pozos en una concentracion 3x105 celulas/pozo. Posteriormente se estimularon con LPS en la presencia o ausencia del compuesto de prueba durante 5 o 24 horas. Despues de estimulacion de las celulas PBMC y THP-1, se ensayo el sobrenadante para determinar la cantidad de de citoquinas proinflamatorias (TNF, IL-6), IL-8 y citoquina antiinflamatoria IL-10 con ELISA. Despues de estimulacion de celulas HD11, las celulas se sometieron a lisis, despues de lo cual se utilizo ARN transcrito para determinar los niveles de transcripcion de las citoquinas IL-1p inflamatoria, IL-8 y quimoquinas MCP-3 (protema-3 quimiotactica de monocitos) y RANTES mediante PCR en tiempo real. En la Tabla 1 y 2 se resumen los datos de estos experimentos, en los cuales la inhibicion del LPS evoca la respuesta que se da en comparacion con la respuesta en celulas de control (100%) de acuerdo con el siguiente esquema:

> 95% de inhibicion +

> 75% de inhibicion

> 25% de inhibicion /-

< 25% de inhibicion

Tambien se realizo un ensayo de migracion, en placas de 96 pozos del ChemoTx System (Neuro Probe, Inc). El peptido se aplica al componente inferior de las placas y este se cubre con un filtro. 50.000 THP-1 etiquetadas AM de calceina se aplicaron por pozo al filtro. Despues de incubacion durante 2 horas se puede determinar la cantidad de celulas que han migrado a traves del filtro por medio de medicion de fluorescencia. Los resultados se dan en la Tabla 1 de acuerdo con el siguiente esquema:

> 6000 celulas migradas +

> 2000 celulas migradas

> 1000 celulas migradas /-

< 1000 celulas migradas -

Ejemplo 4 Actividad de inmunomodulacion: Produccion de citoquinas inducidas por peptidos

Ademas de detectar de la capacidad neutralizante en la produccion de citoquinas inducidas por LPS, tambien se han ensayado los derivados CMAP27 por sus efectos directos inducidos por peptidos en celulas inmunitarias.

Para este proposito, se cultivaron PBMC humano en placas de 96 pozos (1 x106 celulas/pozo) y se cultivaron celulas HD11 en placas de 96 pozos a una concentracion 3 x105 celulas/pozo. Posteriormente se estimularon con medio de cultivo celular en presencia o ausencia de derivados CMAP27 durante 4 (HD11), 5 (PBMC) o 24 horas. Despues de estimulacion de PBMC, se ensayo el sobrenadante para determinar la cantidad de quimiocinas MCP-1 (protemaquimiotactica monocitos-1) con ELISA. Despues de estimulacion de celulas HD11, las celulas se sometieron a lisis, despues de lo cual se utilizo el ARN transcrito para determinar los niveles de transcripcion de IL-1p, IL-8, MCP-3 y RANTES mediante PCR en tiempo real.

En Tabla 1 y 2 se resumen los datos de estos experiments, en los que la respuesta inducida por peptidos se da en comparacion con la respuesta en celulas de control (100%) de acuerdo con el siguiente esquema:

Produccion de MCP-1 inducida por peptidos como se determina por ELISA:

>480% De produccion de MCP-1 (>95% de max.) +

>400% De produccion de MCP-1 (>75% de max.)

>200% De produccion de MCP-1 (>25% de max.) /-

<200% De produccion de MCP-1 (<25% de max.) -

Produccion de citoquinas inducida por peptidos como se determina por PCR en tiempo real:

> aumento de 8 veces en niveles de expresion genica +

> aumento de 4 veces en niveles de expresion genica

> aumento de 2 veces en niveles de expresion genica /-

< aumento de 2 veces en niveles de expresion genica

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Derivados de CMAP27 que consisten en la secuencia de aminoacidos general

RX1GRX2LRKIRRX3X4

en la que X1, X2 y X3 pueden ser independientemente F, L, W o Y y X4 pueden tener 0-9 aminoacidos y en la que ademas dichos derivados estan amidados en terminal C.

2. Derivado deCMAP27 de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que uno deXi, X2 y X3 es F.

3. Derivado de CMAP27 de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que dos o tres de Xi, X2 y X3 son F.

4. Derivado de CMAP27 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que X4 son 0 aminoacidos.

5. Derivado de CMAP27 de acuerdo cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que X4 es R.

6. Derivado de CMAP27 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que X4 es RX5K, RX5KVT, o RX5KVTITIQ en el que X5 es P, G o L.

7. Derivado de CMAP27 de acuerdo con la reivindicacion 6 , en el que X5 es P.

8. Derivado de CMAP27 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para uso como un medicamento.

9. Derivado CMAP27 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para uso como antibiotico.

10. Composicion farmaceutica que comprende por lo menos un derivado CMAP27 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

11. Uso de un derivado CMAP27 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de infecciones bacterianas.

12. Uso de un derivado CMAP27 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en la preparacion de un antibiotico.

13. Composicion inmunologica, preferiblemente una composicion de vacuna, que comprende un peptido CMAP27 seleccionado del grupo de derivados CMAP27 de acuerdo con la reivindicacion 1.

14. Uso de un peptido CMAP27 seleccionado del grupo de derivados CMAP27 de acuerdo con la reivindicacion 1, como adyuvante.