ES2613266T3 - Péptidos antimicrobianos basados en CMAP27 - Google Patents

Abstract

Derivados de CAP27 que consisten de la secuencia de aminoácidos general RX1GRX2LRKIRRX3X4 en la que X1, X2 y X3 pueden ser independientemente F, L, W o Y y X4 pueden tener 0-9 aminoácidos.

Description

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su versión amidada CMAP1-26-NH2 hacen parte de la presente invención, debido al uso de los compuestos mencionados anteriormente como adyuvante.

Ejemplos

Ejemplo 1 Actividad antimicrobiana

Aislados de bacterias de por ejemplo Vibrio cholerae (BM301), Staphylococcus aureus (BM253), Bacillus anthracis (BM233) y Yersinia pestis (BM360) se sembraron en un medio de agar soya Triptico (TSA). Para cada uno de estos cultivos celulares se utilizó una colonia que se va sembrar en medio del fluido de infusión de cerebro corazón (BHI). Los cultivos bacterianos se cultivaron durante la noche a 35°C bajo condiciones aeróbicas. Se realizaron ensayos antibacterianos en placas de 100 pozos de panal (Labsystems 2 placas, con cubierta de 100 pcs, art. Nº 9502550) con un volumen final de 100 μl BHI por pozo. Se diluyeron péptidos de prueba en BHI para dar una concentración inicial de 250 μg/ml y se diluyó adicionalmente en serie. El cultivo bacteriano fue diluido 1:10 en HBI y después de 2 horas de cultivo adicional se diluyo a una concentración de aproximadamente 106 CFU/mL y se inoculo en pozos de placa de micro título (10 μL). Las placas se incubaron mientras se agitó gentilmente a 37°C durante 16 h y durante este tiempo se midió el crecimiento bacteriano en 600 nm, utilizando a BioScreen C MB R. Después de 16 horas, se calculó la densidad celular exacta al cultivar en placas series de dilución (100 μL) en placas de TSA (por duplicado). El porcentaje de crecimiento se calculó mediante la relación del índice de crecimiento de las bacterias de control y el índice de crecimiento de las bacterias tratadas con péptido.

La secuencia de aminoácidos de los péptidos ensayados y la calificación de su actividad antimicrobiana se presentan en la Tabla 1.

Ejemplo 2 Actividad hemolítica

Se recolectaron eritrocitos de individuos humanos saludables y pollos mediante centrifugación a 75×g durante 15 min. Las células se lavaron tres veces en PBS, se complementaron con 287 mM de glucosa como osmoprotector. La suspensión celular se normalizó a un valor de hemoglobina de 2 mmol/l en PBS o regulador de fosfato de glucosa isotónico. En una placa de microtítulo (Greiner) de fondo V de 96 pozos, se agregó 100 μl de esta suspensión por triplicado a 100 μl de series de dilución de péptidos en el mismo regulador, iniciando con una concentración de 100 μM. Después de 1 h de incubación a 37°C, las placas de microtítulo se centrifugaron a 550×g durante 5 min y se midió la absorbancia en el sobrenadante en 450 nm. Se alcanzó hemólisis completa mediante la adición de Tween-20 al 1%. Se calculó el porcentaje de hemólisis como sigue: [(A450 del péptido tratado muestra-A450 de la muestra tratada con regulador)/(A450 de Tween-20 tratado muestra-A450 de muestra tratada con regulador)] × 100%. Los resultados se dan en las Tablas 1 y 2 de acuerdo con el siguiente esquema:

Clasificación de hemólisis

> 75% de muertes celulares ++

> 50% de muertes celulares +

> 25% de muertes celulares +/

< 25% de muertes celulares

< 5% de muertes celulares --

Ejemplo 3 Actividad inmunomoduladora: Neutralización de LPS

Luego de selección de la actividad hemolítica y antimicrobiana, los derivados CMAP27 de la invención también se han ensayado para detectar sus actividades inmunomoduladoras.

Una de las propiedades inmunomoduladores probadas es la capacidad neutralizante dirigida contra una respuesta inmunitaria abundante y perjudicial contra endotoxinas, tal como LPS (lipopolisacáridos). Se realizó un ensayo que permitió determinar la capacidad neutralizante LPS del CMAP27 y derivados del CMAP27 en la presencia de células humanas primarias (PBMC: células mononucleares de sangre periférica), una estirpe de célula humana (THP-1: estirpe de célula de leucemia monocítica aguda humana) y una estirpe de células de pollo (HD11: estirpe de célula macrófaga de pollo).

Las células PBMC y THP-1 se cultivaron en placas de 96 pozos (1 × 106 células/pozos). Se cultivaron células HD11 en placas de 96 pozos en una concentración 3x105 células/pozo. Posteriormente se estimularon con LPS en la presencia o ausencia del compuesto de prueba durante 5 o 24 horas. Después de estimulación de las células PBMC y THP-1, se ensayó el sobrenadante para determinar la cantidad de de citoquinas proinflamatorias (TNF, IL-6), IL-8 y citoquina antiinflamatoria IL-10 con ELISA. Después de estimulación de células HD11, las células se sometieron a lisis, después de lo cual se utilizó ARN transcrito para determinar los niveles de transcripción de las citoquinas IL-1β inflamatoria, IL-8 y quimoquinas MCP-3 (proteína-3 quimiotáctica de monocitos) y RANTES mediante PCR en tiempo real. En la Tabla 1 y

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2 se resumen los datos de estos experimentos, en los cuales la inhibición del LPS evoca la respuesta que se da en comparación con la respuesta en células de control (100%) de acuerdo con el siguiente esquema: > 95% de inhibición ++ > 75% de inhibición + > 25% de inhibición +/

< 25% de inhibición -También se realizó un ensayo de migración, en placas de 96 pozos del ChemoTx System (Neuro Probe, Inc). El péptido se aplica al componente inferior de las placas y este se cubre con un filtro. 50.000 THP-1 etiquetadas AM de calceina se aplicaron por pozo al filtro. Después de incubación durante 2 horas se puede determinar la cantidad de células que han migrado a través del filtro por medio de medición de fluorescencia. Los resultados se dan en la Tabla 1 de acuerdo con el siguiente esquema:

> 6000 células migradas ++ > 2000 células migradas + > 1000 células migradas +/< 1000 células migradas -Ejemplo 4 Actividad de inmunomodulación: Producción de citoquinas inducidas por péptidos Además de detectar de la capacidad neutralizante en la producción de citoquinas inducidas por LPS, también se han

ensayado los derivados CMAP27 por sus efectos directos inducidos por péptidos en células inmunitarias. Para este propósito, se cultivaron PBMC humano en placas de 96 pozos (1 x106 células/pozo) y se cultivaron células HD11 en placas de 96 pozos a una concentración 3 x105 células/pozo. Posteriormente se estimularon con medio de cultivo celular en presencia o ausencia de derivados CMAP27 durante 4 (HD11), 5 (PBMC) o 24 horas. Después de estimulación de PBMC, se ensayó el sobrenadante para determinar la cantidad de quimiocinas MCP-1 (proteínaquimiotáctica monocitos-1) con ELISA. Después de estimulación de células HD11, las células se sometieron a

lisis, después de lo cual se utilizó el ARN transcrito para determinar los niveles de transcripción de IL-1β, IL-8, MCP-3 y RANTES mediante PCR en tiempo real. En Tabla 1 y 2 se resumen los datos de estos experimentos, en los que la respuesta inducida por péptidos se da en

comparación con la respuesta en células de control (100%) de acuerdo con el siguiente esquema: Producción de MCP-1 inducida por péptidos como se determina por ELISA: >480% De producción de MCP-1 (>95% de máx.) ++ >400% De producción de MCP-1 (>75% de máx.) + >200% De producción de MCP-1 (>25% de máx.) +/<200% De producción de MCP-1 (<25% de máx.) -Producción de citoquinas inducida por péptidos como se determina por PCR en tiempo real: > aumento de 8 veces en niveles de expresión génica ++ > aumento de 4 veces en niveles de expresión génica + > aumento de 2 veces en niveles de expresión génica +/< aumento de 2 veces en niveles de expresión génica

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