CN107043428A - 一种α螺旋结构的抗炎杂合抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种α螺旋结构的抗炎杂合抗菌肽及其制备方法和应用，其序列如SEQID No.1所示。本发明的方法根据原肽和杂合肽的主要物理化学参数以及结构与功能关系，将具有抗炎作用的天然抗菌肽的活性中心片段CA与FO杂合，通过化学方法合成杂合肽CA‑FO。然后通过一系列的体外实验验证原肽CA和FO以及杂合抗菌肽CA‑FO的抗菌活性。对比发现CA‑FO在抗菌活性方面有较大的提高，同时又具有较低的细胞毒性并且具有抗炎活性。说明通过功能性片段杂合可增强抗菌肽的抗菌活性，提高细胞选择性，进一步验证了其抗菌机理，为抗菌肽的应用提供了理论的基础。

Description

一种α螺旋结构的抗炎杂合抗菌肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体设计一种α螺旋结构的抗炎杂合抗菌肽及其制备方法和应用。
背景技术
尽管抗生素一直是人类治疗由病原菌感染引起的各种疾病的有力武器。但是随着传统抗生素的大量使用，致病菌的耐药性逐渐增强，抗生素时代正逐渐走到尽头。目前最好的抗生素也逐渐失去效果，所以寻找新的抗菌药物已成为备受关注的焦点。尤其是近年来关于超级细菌的报道，更为人们敲响了警钟。寻找一种新型绿色的饲料添加剂以替代抗生素，已经成为一个紧迫的任务。抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)存在于多种生物的先天性免疫系统中，具有广谱的抗菌活性，具有发展为新型抗菌药物的巨大潜力。而且不同于抗生素的作用机制使细菌不易对其产生耐药性。可是，一些不足之处例如易被蛋白酶降解，较高的溶血活性和较低的抗菌活性却限制了抗菌肽作为理想抗菌剂的应用前景。
对已有的天然抗菌肽进行分子改造是高效抗菌制剂发展的有效途径之一。抗菌肽的改造大多数以天然抗菌肽为母肽，达到设计要求后，将有治疗性或预防性的肽片段会用于肽源机体，以保持机体健康。杂合设计是一种很好的策略用来优化这些抗菌肽分子。这种方法能够很好的保留所需片段的生物学活性，而不被某一种参数的改变而影响。此外，由于只保留活性中心，因此这种方法能够明显的缩短肽链长度，降低化学合成成本。
发明内容
基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种α螺旋结构的抗炎杂合抗菌肽及其制备方法和应用，以提高其抗菌活性。
本发明通过如下技术实现：一种α螺旋结构的抗炎杂合抗菌肽，其序列如序列表SEQID No.1所示。
本发明还具有如下技术特征：
1、一种α螺旋结构的抗炎杂合抗菌肽的制备方法如下：
(1)选取天蚕素抗菌肽Cecropin A的第1-8氨基酸功能序列CA及抗菌肽Fowlicidin-2的第1-15氨基酸功能序列FO进行杂合，获得杂合肽CA-FO；
(2)将设计得到的抗菌肽通过多肽合成仪，采用固相化学合成法进行合成，即完成多肽的制备，序列如SEQ ID No.1所示。
2、如上所述的一种α螺旋结构的抗炎杂合抗菌肽，在制备治疗细菌及真菌感染性疾病药物中的应用。
本发明得到的杂合抗菌肽CA-FO只保留了原肽CA及FO的活性中心片段，没因参数的改变而影响其活性，缩短了肽链长度，降低了化学合成的成本。同时得到的杂合抗菌肽具有广谱抗菌性，并具有开发成抗细菌生物膜药物的潜力。说明通过功能性片段杂合可增强抗菌肽的抗菌活性，提高细胞选择性，进一步验证了其抗菌机理，为抗菌肽的应用提供了理论的基础。
附图说明
图1是原肽CA和杂合肽CA-FO的螺旋轮预测图。
图2是原肽CA和杂合肽CA-FO的细胞毒性对比图。
具体实施方式
实施例1
抗菌肽的设计合成
CA：天蚕素抗菌肽Cecropin A的第1-8氨基酸功能序列，此片段为富含阳离子的两亲性螺旋结构的肽链。被认定为具有抗菌和抗炎活性的最短序列，能够有效的与细菌细胞膜的阴离子磷脂结合并且呈现出了较好选择性。
FO：抗菌肽Fowlicidin-2的第1-15氨基酸功能序列，此片段为富含阳离子的两亲性螺旋结构的肽链，具有较好的抗菌活性。
将α-螺旋结构抗菌肽CA和FO杂合，获得杂合抗菌肽CA-FO。杂合肽CA-FO的螺旋轮预测图如图1所示。使用多肽合成仪，利用固相合成法合成上述三条抗菌肽。三条肽的序列及理化参数如表1所示。
表1 CA、FO与CA-FO的序列及理化参数
实施例2
抗菌肽的理化指标分析
通过CD光谱对抗菌肽的二级结构进行分析，结果表明，发现在水环境中杂合肽与原肽均呈现无规则卷曲结构，而在模拟微生物膜的疏水环境(50％TFE)和带负电荷的原核细胞膜环境(30mM SDS)中，原肽CA,FO与杂合肽CA-FO均表现出一定的α-螺旋结构。
通过对抗菌肽的稳定性分析表明，在不同盐离子的生理浓度下，杂合肽CA-FO对革兰氏阳性菌具有理想的抗性，其抗菌活性出现小幅度的降低。
实施例3
抗菌肽的抑菌活性、细胞毒性和中和内毒素活性
1抑菌活性
将肽配置成为2.56mM/L储存液备用。利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养18h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。结果如表2所示。
表2 CA、FO与CA-FO的抗菌活性
注：1最低抑制浓度是抗菌肽可以抑制细菌生长的最低浓度。测试至少进行三次重复。
2细胞毒性
抗菌肽的细胞毒性可以通过噻唑蓝(MTT)比色法进行检测，主要方法如下：在96孔板中每孔加入1.0-2.0×104个细胞，然后用抗菌肽进行处理，抗菌肽的浓度从1-128μM变化。在37℃下，培养18-24h，然后再与MTT(50μl,0.5mg/ml)培育4小时，然后再1,000×g条件下离心5分钟。上清弃去。随后，用150μl的二甲基亚砜去溶解孔底的甲瓒，细胞毒性可以通过酶标仪在492nm的吸光值进行检测。
3中和内毒素
将巨噬细胞RAW264.7在96孔板上进行铺板，每孔密度达到1-2×105cell/mL。在抗菌肽存在条件下，37℃下将LPS(200ng/mL)与巨噬细胞进行孵育18小时。抗菌肽的浓度在1-128μM幅度变化，没有LPS组和只有LPS组分别作为阳性和阴性空白对照。NO的释放量可以通过其稳定形式亚硝酸盐在上清中的含量来判断，亚硝酸盐可以通过格里斯试剂的说明来检测。在540nm下测定其吸光值。亚硝酸盐的浓度可以通过其吸光值的标准曲线求出。
＜110＞ 东北农业大学
＜120＞一种α螺旋结构的抗炎杂合抗菌肽及其制备方法和应用
＜160＞ 1
＜210＞ 1
＜211＞ 23
＜212＞ PRT
＜213＞ 人工序列
＜400＞ 1
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Arg Phe Gly Arg Phe Leu Arg Lys Ile Arg Arg Phe Arg Pro Lys
1 5 10 15 20

Claims (3)

1.一种α螺旋结构的抗炎杂合抗菌肽，其特征在于，其序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种α螺旋结构的抗炎杂合抗菌肽的制备方法，其特征在于，方法如下：
(1)选取天蚕素抗菌肽Cecropin A的第1-8氨基酸功能序列CA及抗菌肽Fowlicidin-2的第1-15氨基酸功能序列FO进行杂合，获得杂合肽CA-FO；
(2)将设计得到的抗菌肽通过多肽合成仪，采用固相化学合成法进行合成，即完成多肽的制备，其序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的一种α螺旋结构的抗炎杂合抗菌肽，在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
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