CN112625108A - 一种绿海龟抗菌肽的改造体抗菌肽c-cm5及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种绿海龟抗菌肽的改造体抗菌肽C‑CM5及其制备方法和应用，其中，所述改造体抗菌肽的N端为α螺旋，C端为无规则结构的多肽，含有23个氨基酸残基，分子量2915.45Da，等电点12.78。本发明提供是改造体抗菌肽C‑CM5具有广谱高效的抗菌活性和极强的抗炎活性，此外具有分子量小、结构简单、溶血活性低、制备方法简单等有益特点，有望成为一种新型的高效的抗菌药物，具有广阔的开发应用前景，尤其是用于制备抗菌药物或组合物、抑制细菌生长药物或组合物、抗炎药物或组合物、防腐剂、动物饲料添加剂或化妆品添加剂中。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种绿海龟(Chelonia mydas)抗菌肽Cm-CATH2的改造体抗菌肽C-CM5及其制备方法和应用。
背景技术
近年来传统抗生素的大规模滥用导致越来越严重的病原微生物耐药问题，给人类健康带来巨大的威胁。临床上应对耐药微生物感染的措施是使用对耐药微生物尚未使用过的新的或者替代性的抗生素，因此这就需要持续开发新的抗微生物药物。
抗菌肽是生物体基因编码的一种天然小分子多肽，是生物体免疫系统的一种重要分子，对细菌、真菌、病毒甚至原虫均具有直接的杀灭作用。抗菌肽具有分子量小、结构简单、抗菌活性强、杀菌机制独特、毒性低和不易引起耐药性等优点，因此自发现之日起就被认为是具有极大开发潜力的新一代抗生素。到目前为止，已从不同生物体中发现超过2600多种不同的抗菌肽，而且其数目还在增加。
发明内容
本发明的目的是为了解决传统抗生素滥用导致越来越严重的病原微生物耐药的问题，提供一种绿海龟(Chelonia mydas)抗菌肽Cm-CATH2的改造体抗菌肽C-CM5及其制备方法和应用。
第一方面，一种绿海龟抗菌肽Cm-CATH2的改造体抗菌肽C-CM5，其N端为α螺旋，C端为无规则结构的多肽，含有23个氨基酸残基，分子量2915.45Da，等电点12.78。
所述改造体抗菌肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示Arg Arg Ser ArgPhe Gly Arg Phe Phe Lys Lys Val Arg Lys1Gln Leu Gly Arg Val Lys Arg His Ser。
第二方面，提供绿海龟抗菌肽Cm-CATH2的改造体抗菌肽C-CM5的制备方法：根据绿海龟抗菌肽Cm-CATH2的氨基酸序列，利用分子改造方法设计获得了改造体C-CM5的氨基酸序列，并利用多肽固相合成的方法对其进行了化学合成。
具体为：根据所述改造体C-CM5的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列，利用HPLC反相柱层析脱盐。
其分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。
纯化的C-CM5用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
第三方面，提供绿海龟抗菌肽Cm-CATH2的改造体抗菌肽C-CM5的应用，用于制备抗菌药物或组合物、抑制细菌生长药物或组合物、抗炎药物或组合物、防腐剂、动物饲料添加剂或化妆品添加剂中。
本发明的有益效果在于：
1、本发明根据绿海龟抗菌肽的氨基酸序列，利用分子改造方法设计改造体C-CM5，该改造体具有广谱高效的抗菌活性和极强的抗炎活性，此外具有分子量小、结构简单、溶血活性低、制备方法简单等有益特点，有望成为一种新型的高效的抗菌药物，具有广阔的开发应用前景；
2、与抗菌肽Cm-CATH2相比，氨基酸残基数量相对较少，易于合成，且合成成本降低。
附图说明
图1是改造体抗菌肽C-CM5抑制小鼠腹腔巨噬细胞中LPS诱导的促炎因子IL-6表达的实验结果示意图；
图2是改造体抗菌肽C-CM5抑制小鼠腹腔巨噬细胞中LPS诱导的促炎因子TNF-α表达的实验结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
绿海龟抗菌肽Cm-CATH2是基因编码的一种多肽，含有33个氨基酸残基，分子量4089.9Da，等电点12.96。
绿海龟抗菌肽Cm-CATH2全序列为：Arg Arg Ser Arg Phe Gly Arg Phe Phe LysLys Val Arg Lys1Gln Leu Gly Arg Val Lys Arg His Ser Arg Ile Thr Val Gly GlyArg Met Arg Phe。
实施例一：
绿海龟抗菌肽Cm-CATH2的改造体抗菌肽C-CM5的化学合成如下。
根据绿海龟抗菌肽Cm-CATH2的氨基酸序列和二级结构，利用序列剪切的分子改造方法，截取其N端23个氨基酸的片段，完全保留其N端α螺旋区域，部分保留其C端无规则结构，从而设计获得了改造体抗菌肽C-CM5，并利用多肽固相合成的方法对其进行了化学合成，具体制备方法如下：
Ⅰ、根据设计获得的改造体抗菌肽C-CM5的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成其全序列，利用HPLC反相柱层析脱盐纯化。
Ⅱ、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。
Ⅲ、纯化的改造体抗菌肽C-CM5用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
测定结果为：
改造体抗菌肽C-CM5是绿海龟抗菌肽Cm-CATH2的一种改造体。
改造体抗菌肽C-CM5是一种N端为α螺旋，C端为无规则结构的多肽，含有23个氨基酸残基，分子量2915.45Da，等电点12.78。
C-CM5全序列如序列表SEQ ID NO：1所示Arg Arg Ser Arg Phe Gly Arg Phe PheLys Lys Val Arg Lys1Gln Leu Gly Arg Val Lys Arg His Ser。
实施例二：
改造体抗菌肽C-CM5的抗菌活性测定：
分别挑取保存于斜面上的试验菌株，均匀涂布于MH固体培养基(北京索莱宝科技有限公司)平板上，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加溶解于灭菌去离子水的2mg/ml的抗菌肽C-CM5样品溶液10μl，于37℃倒置培养18－20小时，观察抑菌圈形成与否。
若样品具有抗菌活性，则会在滤纸片周围形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明样品抗菌活性越强。
(2)抗菌肽C-CM5最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration)测定(2倍稀释法)：
选择上步实验中具有抑菌圈的菌株进行MIC测定实验。试验菌株接种到MH液体培养基(北京索莱宝科技有限公司)中，37℃振荡培养到对数生长期，而后用新鲜MH液体培养基将培养至对数生长期的培养液稀释到2×105cfu/ml待用。
在无菌96孔板各孔中预先加入100μl MH液体培养基，然后在第一孔中加入100μl用MH液体培养基稀释到一定浓度的经0.22μm孔滤膜过滤的的抗菌肽C-CM5样品溶液，混匀后取100μl加入第2孔，依次倍比稀释(参见表1)，自第9孔吸出100μl弃去，第10孔系对照管。
表1稀释方法
将上述各管混匀后放置37℃缓慢振荡培养18小时，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。结果如表2所示。
由表2可见，抗菌肽C-CM5对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均表现出很强的抗菌活性，其中包括大量临床分离致病菌，MIC值处于1.17-10μg/ml的范围。
表2抗菌肽C-CM5抗菌活性
| 试验菌株 | MIC(μg/ml) |
| 大肠杆菌ATCC 25922 | 4.69 |
| 大肠杆菌CMCC 44102 | 4.69 |
| 鲍曼不动杆菌ATCC 19606 | 4.69 |
| 鲍曼不动杆菌2 | 4.69 |
| 鲍曼不动杆菌6 | 2.34 |
| 鲍曼不动杆菌16 | 9.38 |
| 铜绿假单胞菌ATCC 25923 | 4.69 |
| 铜绿假单胞菌CMCC 10104 | 4.69 |
| 志贺痢疾杆菌CMATCC 12022 | 2.34 |
| 金黄色葡萄球菌CMCC 26003 | 4.69 |
| MASR ATCC 43300 | 9.38 |
| 产气假单胞菌ATCC 12324 | 4.69 |
| 枯草芽孢杆菌CMCC 63501 | 2.34 |
| 粪肠球菌ATCC 29217 | 1.17 |
| 屎肠球菌ATCC 29212 | 1.17 |
MIC：最小抑菌浓度，以上结果为三次独立重复实验平均值。
实施例三：
改造体抗菌肽C-CM5的溶血活性测定：
将采集的兔血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成107-108cell/ml的悬浮液。
上述稀释好的红细胞悬液与溶解于生理盐水的改造体抗菌肽C-CM5样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用10％Triton X-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H％＝A样品-A阴性对照/A阳性对照×100％。
结果表明样品浓度为100μg/ml，改造体抗菌肽C-CM5的溶血百分比为1.34％。说明改造体抗菌肽C-CM5具有较低的溶血活性，不易引起哺乳动物红细胞破裂溶解。尤其抗菌活性范围内，安全性高。
实施例四：
造体抗菌肽C-CM5抗炎活性测定：
提取6-8周龄C57小鼠腹腔巨噬细胞，用含10％血清的1640培养基培养过夜，次日换成含2％血清的1640培养基，然后用终浓度为100ng/mL的大肠杆菌LPS(Sigma,美国)刺激细胞，同时给改造体抗菌肽C-CM5，终浓度为20μg/mL，设不给改造体抗菌肽C-CM5和LPS的空白对照组与仅给LPS的阳性对照组，共孵育6h，取上清，用ELISA试剂盒(Takara，日本)检测上清液中促炎因子IL-6和TNF-α的含量。每个做三个平行。
结果如图1和图2所示，改造体抗菌肽C-CM5能够显著抑制小鼠腹腔巨噬细胞中LPS诱导的促炎因子IL-6和TNF-α表达，表明改造体抗菌肽C-CM5具有极强的抗炎活性。
通过上述实施例，本发明根据绿海龟抗菌肽的氨基酸序列，利用分子改造方法设计改造体C-CM5具有广谱高效的抗菌活性和极强的抗炎活性，此外具有分子量小、结构简单、溶血活性低、制备方法简单等有益特点，有望成为一种新型的高效的抗菌药物，具有广阔的开发应用前景，尤其是用于制备抗菌药物或组合物、抑制细菌生长药物或组合物、抗炎药物或组合物、防腐剂、动物饲料添加剂或化妆品添加剂中。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解。其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 宜肌坊（厦门）生物科技有限公司
<120> 一种绿海龟抗菌肽的改造体抗菌肽C-CM5及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> 绿海龟(Chelonia mydas)
<400> 1
Arg Arg Ser Arg Phe Gly Arg Phe Phe Lys Lys Val Arg Lys Gln Leu
1 5 10 15
Gly Arg Val Lys Arg His Ser
20
Claims (5)
1.一种绿海龟抗菌肽的改造体抗菌肽C-CM5,其特征在于，所述改造体抗菌肽的N端为α螺旋，C端为无规则结构的多肽，含有23个氨基酸残基，分子量2915.45Da，等电点12.78。
2.根据权利要求1所述的一种绿海龟抗菌肽的改造体抗菌肽C-CM5,其特征在于，所述改造体抗菌肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
3.如权利要求1或2中一种绿海龟抗菌肽的改造体抗菌肽C-CM5的制备方法,其特征在于，根据绿海龟抗菌肽Cm-CATH2的氨基酸序列，利用分子改造方法设计获得了改造体C-CM5的氨基酸序列，并利用多肽固相合成的方法对其进行了化学合成。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，根据所述改造体C-CM5的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列，利用HPLC反相柱层析脱盐。
5.如权利要求1或2中一种绿海龟抗菌肽的改造体抗菌肽C-CM5的应用，其特征在于，所述改造体抗菌肽用于制备抗菌药物或组合物、抑制细菌生长药物或组合物、抗炎药物或组合物、防腐剂、动物饲料添加剂或化妆品添加剂中的应用。
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